Nature.com-a gireniňiz üçin sag boluň. Ulanylýan brauzer wersiýaňyzda CSS-iň çäkli goldawy bar. Iň oňat tejribe üçin täzelenen brauzeri ulanmagy maslahat berýäris (ýa-da Internet Explorer-de gabat geliş tertibini öçüriň). Şol aralykda, dowamly goldawy üpjün etmek üçin sahypany stil we JavaScript-de görkezeris.
Kistiki fibroz öýken keselini bejermek üçin gen wektorlary geçiriji howa ýollaryny nyşana almalydyr, sebäbi periferiýa öýken transduksiýasy terapewtiki peýdany üpjün etmeýär. Wirus geçirijiliginiň netijeliligi wektoryň ýaşaýyş wagty bilen gönüden-göni baglanyşyklydyr. Şeýle-de bolsa, gen göterijiler ýaly gowşuryş suwuklyklary ylham wagtynda alweolalara ýaýraýar we magnitli ulagda magnitli ulaglar bilen üpjün edilýär. Howa ýollarynyň ýüzüne gönükdirilip bilinjek bölejikler sebitleýin nyşany gowulaşdyryp biler. Wivo wizuallaşdyrmagyň kynçylyklary sebäpli, ulanylýan magnit meýdanynyň barlygynda howa ýolundaky şeýle kiçijik magnit bölejikleriniň özüni alyp barşyna gowy düşünilmeýär. Bu gözlegiň maksady, bir topar magnit bölejikleriniň wivo hereketini göz öňüne getirmek üçin, anestizirlenen syçanlaryň trahaýasynda we köp sanly bölejikleriň trawhaýasynda. Magnit meýdanynyň barlygynda ysly magnit bölejikleri, syçanyň trahaýasynda geçirijilik netijeliligini ýokarlandyrar. Sinhrotron rentgen şekillendirişi magnit bölejikleriniň vitro we wivo stasionar we hereket edýän magnit meýdanlarynda özüni alyp barşyny görkezýär. Bölek bölekleri magnit bilen janly howa ýolunyň üstünde aňsatlyk bilen süýräp bolmaýar, ýöne ulag wagtynda, magnit meýdanynyň iň güýçli bolan ýerinde ýataklar jemlenýär. Magnit meýdany. Bilelikde, bu netijeler merkezi wirus magnit bölejikleriniň we magnit meýdanlarynyň gen wektoryny nyşana almak we wivo arkaly howa ýollaryny geçirmekde transduksiýa derejesini ýokarlandyrmak üçin gymmatly çemeleşmeler bolup biljekdigini görkezýär.
Kistiki fibroz (CF) CF transmembranany geçiriji sazlaýjy (CFTR) diýilýän bir geniň üýtgemegi bilen ýüze çykýar. CFTR belogy bedeniň köp epitel öýjüklerinde bar bolan ion kanalydyr, CF patogeneziniň esasy ýeri. CFTR kemçilikleri adaty bolmadyk suw transportyna sebäp bolýar, howa ýolunyň çuňlugyny peseldýär. dem alýan bölejikleri we patogenleri howa ýollaryndan arassalamak üçin mukusly transport (MCT) ulgamy. Biziň maksadymyz, CFTR geniniň dogry göçürmesini bermek we ASL, MCT we öýken saglygyny gowulandyrmak üçin merkezi (LV) gen terapiýasyny ösdürmek we vivo1-de bu parametrleri ölçemäge ukyply täze tehnologiýalary ösdürmegi dowam etdirmek.
LV wektorlary, esasan, bejeriş genini howa ýollarynyň bazal öýjüklerine (howa ýollarynyň baldak öýjüklerine) hemişelik birleşdirip bilýändikleri üçin öňdebaryjy kandidatlaryň biridir .Bu möhüm zat, gen bilen düzedilen CF bilen baglanyşykly howa ýollarynyň öýjüklerini tapawutlandyryp, ömürboýy peýdalara sebäp bolýar. alveolýar transduksiýa sebäp bolup biler, ýöne munuň CF-de hiç hili bejeriş peýdasy ýok. Şeýle-de bolsa, gen göterijiler ýaly suwuklyklar ylhamdan soň tebigy ýagdaýda alveolalara göçýär we terapewtiki bölejikler MCT.LV geçiriş netijeliligi öýjükli öýjükleriň ýanynda galýan wagtynyň dowamlylygy bilen gönüden-göni baglanyşyklydyr. CF, howa ýolunyň içinde LV-iň ýaşamak möhletini uzaltmak ukyby bu sebitde ýokary geçiş derejesine ýetmek üçin möhümdir, emma şu wagta çenli kyn.
Bu päsgelçiligi ýeňip geçmek üçin LV magnit bölejikleriniň (MP) iki goşmaça usulda kömek edip biljekdigini maslahat berýäris. Ilki bilen, nyşana almagy gowulandyrmak we gen daşaýjy bölejikleriň islenýän howa sebitinde ýaşamagyna kömek etmek üçin magnit taýdan howa ýoluna ugrukdyrylyp bilner; we ASL) öýjük gatlagyna geçmek üçin 6.MP antikorlara, himoterapewtiki dermanlara ýa-da öýjük membranalaryna birikdirilen ýa-da degişli öýjük üstündäki reseptorlara baglanýan we statiki elektrik barlygynda çiş ýerlerinde ýygnanan beýleki derman molekulalary hökmünde giňden ulanylýar. Düwnük keselini bejermek üçin magnit meýdanlary 7. Beýleki “gipertermal” usullar, yrgyldama magnit meýdanlaryna sezewar bolanda deputatlary gyzdyrmagy maksat edinýär we şeýlelik bilen çiş öýjüklerini ýok edýär. Magnit transfeksiýasynyň prinsipi, DNK-nyň öýjüklere geçmegini güýçlendirmek üçin ulanylýar, witroda wirus däl we wirusly gen wektorlary LV-den ýokaşýar. LV-MP-leriň statiki magnit meýdanynyň barlygynda adam bronhial epitel öýjük liniýasyna, diňe LV wektory bilen deňeşdirilende geçiriş netijeliligini 186 esse ýokarlandyrýar. LV-MP in vitro CF modelinde hem ulanyldy, bu ýerde magnit transfeksiýa howa-suwuk interfeýs medeniýetlerinde LV transduksiýasyny 20 esse ýokarlandyrdy, ýöne wivo magnetotransfeksiýa az baha berildi. gözlegler11,12,13,14,15, esasanam öýkenlerde 16,17. Şeýle-de bolsa, CF öýken terapiýasynda magnit transfeksiýasynyň mümkinçilikleri aýdyňdyr. Tan we başg. (2020) “netijeli magnit nanopartikul öýken gowşuryşyny konsepsiýa taýdan öwrenmek, CFTR hassalarynyň kliniki netijelerini gowulandyrmak üçin CFTR dem alyş strategiýalaryna ýol açar” 6.
Ulanylýan magnit meýdanynyň barlygynda howa magnit bölejikleriniň özüni alyp barşyny göz öňüne getirmek we öwrenmek kyn, şonuň üçin gaty gowy düşünilmeýär. Beýleki gözleglerde, ASL çuňlugynda wivo üýtgemelerinde minudy ölçemek üçin sinhrotron-köpeliş esasly faza kontrastly rentgen şekillendiriş (PB-PCXI) usulyny işledipdik. Alýuminden ýa-da ýokary refraktiw görkeziji aýnadan düzülen 10–35 µm diametrli bölejikleri, PB-PCXI21 ulanyp görünýän MCT markerleri hökmünde ulanýar. Iki usul hem MP ýaly bölejik görnüşleriniň bir toparyny görmek üçin amatly.
Highokary giňişlik we wagtlaýyn çözgüdi sebäpli, PB-PCXI esasly ASL we MCT derňew usullarymyz, MP gen gowşuryş usullaryna düşünmäge we optimizirlemäge kömek etmek üçin “vivo” -de bir we köp bölejik bölejikleriniň hereketiniň dinamikasyny we nagyşlaryny barlamak üçin amatlydyr. Bu ýerde ulanýan çemeleşmämiz, burun wektorynyň syçanjygynyň burun damarlarynyň genini düşündirmek üçin suwuk hereketini göz öňüne getirýäris. gen göterijimiziň dozasynda haýwanlary öwrenmek 3,4.
Bu gözlegiň maksady, sinhrotron PB-PCXI ulanmak, bir topar deputatyň janly çybyklaryň trahaýasyndaky wivo hereketlerini göz öňüne getirmekdi. Bu PB-PCXI şekillendiriş gözlegleri, MP-iň hereketine täsirini kesgitlemek üçin bir topar deputaty, magnit meýdanynyň güýçlerini we ýerlerini barlamak üçin döredildi. çökdürilenden soň trahahiýada saklanýan bölejikleriň sany. Ikinji tapgyrda, LV-MP-leriň howa ýoluna gönükdirilen kontekstinde LV-MP-leriň gowşurylyşynyň LV transduksiýa netijeliliginiň ýokarlanjakdygyna esaslanýan çaklama esasynda LV-MP-leriň wivo gowşurylyşynyň netijesinde transduksiýa nagşyny görkezmek üçin bu optimal konfigurasiýany ulanmaga synanyşdyk.
Animalhli haýwanlary öwrenmek Adelaýd uniwersiteti (M-2019-060 we M-2020-022) we SPring-8 sinhrotron haýwan etikasy komiteti tarapyndan tassyklanan teswirnamalara laýyklykda geçirildi. Synaglar ARRIVE görkezmelerine laýyklykda geçirildi.
Xhli rentgen şekillendiriş Japanaponiýadaky SPring-8 sinhrotronynda BL20XU şöhlelenmesinde ýerine ýetirilip, öň beýan edilen 21222-e meňzeş gurnama ulanyldy. Gysgaça, synag gutusy sinhrotron saklaýyş halkasyndan 245 m uzaklykda ýerleşýär. Bölek bölejik şekillendiriş barlaglary üçin 0,6 m aralyk-detektor aralygy ulanylýar. ýokary çözgütli rentgen öwrüjisi (SPring-8 BM3) sCMOS detektoryna birikdirildi. Öwrüji rentgen şöhlelerini 10 µm galyňlyk sintilýator (Gd3Al2Ga3O12) ulanyp, ýagtylyga öwürýär, soňra × 10 mikroskop obýekti (NA 0.3). ululygy 2048 × 2048 piksel we çig piksel ululygy 6,5 × 6.5 mkm. Bu gurnama täsirli izotrop piksel ölçegi 0,51 mkm we takmynan 1,1 mm × 1,1 mm meýdany görkezýär. 100 ms uzynlykdaky täsir uzynlygy magnit bölejikleriniň signal-ses sesini ulaltmak üçin, howa giňişliginde şöhlelendirilen hereketlendiriji artif. Täsirleriň arasynda rentgen şöhlesini blokirlemek arkaly radiasiýa dozasyny çäklendirmek üçin rentgen ýoly.
LV göterijisi haýsydyr bir SPring-8 PB-PCXI şekillendiriş gözleginde ulanylmady, sebäbi BL20XU şekillendiriş kamerasy Biosafety Level 2 kepillendirilmedi. Munuň ýerine, magnit meýdanlarynyň aýna kapilýallaryň içinde MP hereketine nähili täsir edýändigine düşünmek üçin iki sany täjirçilik üpjünçisinden bir topar gowy häsiýetli deputat saýladyk. üstünde.MP-leriň ululygy 0,25-18 mμ aralygynda bolup, dürli materiallardan ýasalýar (1-nji tablisa serediň), ýöne MP-iň içindäki magnit bölejikleriniň ululygyny hem öz içine alýan her bir nusganyň düzümi belli däl. 19, 20, 21, 23, 24 giňişleýin MCT gözleglerimiziň esasynda, trakeal howa ýolunyň üstünde yzygiderli 5 μm ululykdaky hereketleri görüp bileris. μm ölçegli MP şekillendiriş enjamynyň ölçeginden has kiçi, ýöne PB-PCXI olaryň göwrüminiň kontrastyny ​​we depozitden soň goýlan ýerüsti suwuklygyň hereketini kesgitlär diýlip garaşylýar.
1-nji tablisadaky her bir MP üçin nusgalar içki diametri 0,63 mm bolan 20 μl aýna kapilýallarda (Drummond Microcaps, PA, ABŞ) taýýarlandy. Korpuskulýar bölejikleri suwda bar, CombiMag bölejikleri öndürijiniň eýeçiligindäki suwuklykda bar. Her turba ýarym suwuklyk bilen doldurylýar we nusga eýesiniň üstünde goýulýar (1-nji surata serediň). suwuklygyň gyralaryny ýerleşdirdi. 19 mm diametri (uzynlygy 28 mm) nikel gabygy seýrek ýer neodiý demir bor (NdFeB) magnit (N35, pişik no LM1652, Jaýkar Elektronik, Awstraliýa) 1,17 galyndy magnitleşmesi bilen Tesla aýratyn terjime etabyna birikdirildi we surata düşürilende takmynan 30 mm ululykda şekillendirilýär. sekuntda kadrlar. Surata düşürilende, magnit aýna kapilýar turbasyna (takmynan 1 mm uzaklykda) getirildi we meýdan güýjüniň we ýagdaýynyň täsirine baha bermek üçin turba boýunça terjime edildi.
Xy terjime etabynda aýna kapilýallarda MP nusgalaryny öz içine alýan in vitro şekillendiriş gurnama. Rentgen şöhlesiniň ýoly gyzyl çyzyk bilen bellendi.
Deputatlaryň in vitro görnükliligi kesgitlenenden soň, olaryň bir bölegi ýabany görnüşli aýal albino Wistar alakalarynda (weeks 12 hepde, ~ 200 g) wivo görnüşinde synag edildi .0.24 mg / kg medetomidin (Domitor®, Zenoaq, Japanaponiýa), 3,2 mg / kg midazolam (Dormicum®, Astellas Pharma, Japan) Pharmanyň garyndysy bilen anesteziýa) Japanaponiýa) içerki sanjym arkaly. Anesteziýadan soň, trahýanyň töweregindäki sütükleri aýyrmak, endotracheal turba (ET; 16 Ga iv kanula, Terumo BCT) goýmak we bedeniň temperaturasyny saklamak üçin termiki sumkany öz içine alýan adaty şekillendiriş plastinkasynda terminaly surata düşürmek üçin terminaly sumkany öz içine alýan adaty şekillendiriş plastinkasynda termini üýtgetmek üçin surata düşürildi. 2a suratda görkezilişi ýaly rentgen şekilinde trahiýa keseligine.
(a) SPring-8 şekillendiriş gutusynda wivo şekillendiriş gurnamasynda rentgen şöhlesiniň ýoly gyzyl çyzykly çyzyk bilen bellendi. (b, c) Trahaýada magnit lokalizasiýasy iki sany ortogonally IP kamerasy arkaly uzakdan ýerine ýetirildi. Ekranyň suratynyň çep tarapynda, kelläni saklaýan sim aýlawy we ET turbasynyň içindäki gowşuryş kannuny görüp bolýar.
100 μl aýna şpris ulanyp, uzakdan dolandyrylýan şpris nasos ulgamy (UMP2, Dünýä takyk gurallary, Sarasota, FL) 30 Ga iňňe arkaly PE10 turbasyna (OD 0.61 mm, ID 0.28 mm) birikdirildi. gowşurylan MP nusgasynda. loadüklenen gowşuryş turbasy soň garaşylýan magnit meýdanymyzyň iň güýçli bölegine ýerleşdirilip, endotracheal turba salnypdyr. Surat almak, Arduino esasly gutujymyza birikdirilen dem alyş detektorynyň kömegi bilen gözegçilik edilipdi we ähli signallar (mysal üçin temperatura, dem alyş, ýapyk açylyş / ýapylmak we şekil almak) Powerlab we LabChart (AD Instrumentler). .
Magnit şekillendiriş jaýynyň daşyndan uzakda ýerleşip bilýän ikinji tapgyra birikdirilýär. Dürli magnit pozisiýalary we konfigurasiýalary synagdan geçirildi, şol sanda: Trahaýanyň takmynan 30 ° burçunda oturdyldy (2a we 3a suratlarda görkezilen konfigurasiýalar); bir haýwanyň üstünde, beýlekisi aşakda, özüne çekmek üçin polýuslar bar (3b surat); bir haýwanyň üstünde, beýlekisi aşakda, polýuslar yza çekilmeli (3-nji surat); ýokarda we trahaýa perpendikulýar bolan bir magnit (3d surat) .Haýwan we magnit düzülenden we synagdan geçiriljek MP şpris nasosyna ýüklenenden soň, suratlar alanyňyzda 4 μl / sek tizlik bilen 50 μl dozany gowşuryň. Magnit soňra suratlary dowam etdirýär.
Wivo şekillendiriş üçin magnit konfigurasiýasy (a) takmynan 30 ° burçda trakeýanyň üstündäki ýekeje magnit, (b) özüne çekmek üçin iki sany magnit, (c) yza çekilmek üçin iki magnit, (d) trakeýada ýokarda bir magnit. Gözegçi agzyň aşagyndan trakeýanyň üsti bilen öýkenine geçdi we rentgen şöhlesi sag tarapyň üstünden geçdi. howa ýoly ýa-da trakeýanyň ýokarsynda rentgen şöhlesiniň ugrunda.
Şeýle hem, dem alyş we ýürek hereketi bolmadyk ýagdaýynda howa ýollaryndaky bölejikleriň görnükliligini we özüni alyp barşyny kesgitlemäge synanyşdyk. Şonuň üçin surata düşüriş döwrüniň ahyrynda pentobarbital dozasy sebäpli haýwanlar adam öldürildi (Somnopentil, Pitman-Mur, Waşington kesişmesi, ABŞ; ~ 65 mg / kg ip. Deputat howa ýolunyň üstünde görünýärdi.
Alnan suratlar tekiz meýdan we garaňky meýdan düzedilip, soňra MATLAB (R2020a, The Mathworks) -da ýazylan adaty skript ulanyp, filme (sekuntda 20 kadr; dem alyş tizligine baglylykda 15-25 × adaty tizlik) ýygnandy.
LV gen wektoryny gowşurmagyň ähli barlaglary Adelaýd uniwersitetiniň Laboratoriýa haýwanlary öwreniş desgasynda geçirildi we magnit meýdanynyň barlygynda LV-MP gowşurylyşynyň wivo arkaly gen geçirişini güýçlendirip biljekdigini kesgitlemek üçin SPring-8 synagynyň netijelerini ulanmak maksat edinildi. MP we magnit meýdanynyň täsirine baha bermek üçin iki topar haýwan bejerildi: bir topara magnitli LV-MP berildi, beýlekisi bolsa magnitli LV-MP berildi.
LV gen wektorlary öň beýan edilen 25, 26 usullary ulanyp döredildi .LacZ wektory, öýken dokumalarynyň öňlerinde we dokuma bölümlerinde görünýän öýjük reaksiýa önümini öndürýän MPSV esaslandyryjy (LV-LacZ) tarapyndan dolandyrylýan ýadro-lokal beta-galaktozida genini aňladýar. TU / ml.Karýerler -80 ° C derejesinde saklanýar, ulanmazdan ozal ereýär we 1: 1 nisbatynda garyşyp, eltmezden azyndan 30 minut öň buzda inkubasiýa edip, CombiMag bilen baglanyşdyrylýar.
Adaty Sprague Dawli alakalary (n = 3 / topar, ~ 2-3) 0,4 mg / kg medetomidiniň (Domitor, Ilium, Awstraliýa) we 60 mg / kg ketamin (Ilium, Awstraliýa) ip) sanjymy we 16 Ga iv kannulasy bilen hirurgiki däl agyz kanulýasiýasynyň garyndysy bilen anestizasiýa edildi. tracheal howa ýolunyň sim sim bilen (N-Circle, Nitinol Tipless Stone Extractor NTSE-022115) -UDH, Cook Medical, ABŞ) 30 s28. perturbasiýa protokoly, perburbasiýadan takmynan 10 minut soň biologiki howpsuzlyk kabinetinde geçirildi.
Bu synagda ulanylan magnit meýdany, distilýasiýa stent kliplerini ulanyp, trahýanyň üstünde saklanýan magnitler bilen, wivo rentgen şekillendiriş barlagyna meňzeş görnüşde düzüldi. LV-MP-iň 50 μl göwrümi (2 × 25 alikot) trakeýa (n = 3 haýwan) öň berlen LV gözegçilik toparyny alýan turbany ulanyp, L = MP gözegçilik toparyny aldy. Magnit. Infuziýa gutarandan soň, kanula ET turbasyndan aýrylýar we haýwan köpelýär. Magnit 10 minutlap ýerinde galýar, soň bolsa aýrylýar. Syçanlar meloksikamyň (1 ml / kg) (Ilium, Awstraliýa) subkutan dozasyny aldylar, soň bolsa 1 mg / kg atipamazol gidroklorid (antipamazol) anesteziýadan doly gutulýança.
Biologiki howpsuzlyk kabinetinde LV-MP gowşuryş enjamy. ET turbasynyň açyk çal Luer merkeziniň agzyndan çykýandygyny görmek bolýar we suratda görkezilen turbanyň jel ujy ET turbasynyň üsti bilen trahiýa gerekli çuňluga girizilýär.
LV-MP dozalaşdyryş amallaryndan bir hepde soň, haýwanlar 100% CO2 dem almagy bilen adam öldürildi we L-Z aňlatmasy adaty X-gal bejergimiz arkaly baha berildi. Üç sany kaudal köp kıkyrtyk halka, seljerişiň içine girmeýän mehaniki zeper ýetmeginiň ýa-da suwuklygyň saklanmagynyň öňüni aldy. Dow Inc) luminiki ýüzüni göz öňüne getirmek üçin Minutien iňňesini (Gözel ylym gurallary) ulanmak. Geçirilen öýjükleriň paýlanyşy we nagşy, DigiLite kamerasy we TCapture programma üpjünçiligi (Tucsen Photonics, Hytaý) bilen Nikon mikroskopy (SMZ1500) ulanyp, göni surata düşürmek bilen tassyklandy. şekiliň “tikilmegine” mümkinçilik bermek üçin her bir suratyň arasynda ýeterlik bir-birine gabat gelmegini üpjün etmek. Her trahaýadan alnan şekiller, planar hereket algoritmini ulanyp, “Image Composite Editor v2.0.3” (Microsoft Research) ulanyp, bir bitewi şekile ýygnandy. 0,58, doýma> 0.15 we bahasy <0.7. Dokumanyň konturyny yzarlamak bilen, dokumanyň meýdanyny kesgitlemek we trakeal dokumanyň daşyndan ýalňyş tapylmagynyň öňüni almak üçin GIMP v2.10.24-de el bilen maska ​​döredildi.
Her bir trahaýa parafin içine salnyp, 5 μm bölüm kesildi. Bölümler 5 minutlap bitarap çalt gyzyl reňk bilen garşylandy we Nikon Eclipse E400 mikroskopy, DS-Fi3 kamerasy we NIS elementini ele almak programma üpjünçiligi (5.20.00 wersiýa) ulanyldy.
Allhli statistiki derňewler GraphPad Prism v9 (GraphPad Software, Inc.) -De geçirildi. Statistik ähmiýet p ≤ 0.05 derejesinde kesgitlenildi. Şapiro-Wilk synagyndan peýdalanyp, kadalylyk barlandy we LacZ boýagynyň tapawudy deňleşdirilmedik t-synag arkaly bahalandyryldy.
1-nji tablisada beýan edilen alty deputat PCXI ulanyp gözden geçirildi we görnükliligi 2-nji tablisada beýan edilýär. Iki polistirol MP (degişlilikde MP1 we MP2; 18 μm we 0,25 μm) PCXI astynda görünmeýärdi, ýöne galan nusgalary kesgitläp bolýardy (mysallar 5-nji suratda görkezilýär) .MP3 we MP4 (10-15% Fe3O4 görünýär). Synag edilen iň kiçi bölejikler, MP5 (98% Fe3O4; 0,25 mk) iň aýdyň boldy. CombiMag önümi MP6-ny görmek kyn. Caseshli ýagdaýlarda MP-ni kapilýara paralel terjime etmek arkaly MP-ni ýüze çykarmak ukybymyz ep-esli ýokarlandy. Magnitler kapilýardan uzaklaşanda, bölejikler uzyn bolansoň, bölejikler ulaldy we bölejikler ulaldy. kapilýaryň ýokarky ýüzüne (Goşmaça wideo S1: MP4 serediň), bölejikleriň dykyzlygyny ýokarlandyrýar. Tersine, magnit kapilýardan aýrylanda meýdan güýji azalýar we deputatlar kapilýaryň ýokarky ýüzünden uzyn setirlere tertipleşdirilýär (Goşmaça wideo S2: MP4 serediň). kapilýaryň ýokarky ýüzünden uzakda, magnit bölejikleri galyndylary suwuklyk arkaly süýrär.
PCXI astynda MP-iň görnükliligi nusgalaryň arasynda ep-esli üýtgeýär. (A) MP3, (b) MP4, (c) MP5 we (d) MP6. Bu ýerde görkezilen suratlaryň hemmesi kapilýardan takmynan 10 mm uzaklykda ýerleşýän magnit bilen düşürildi. Görnüşi ýaly, uly tegelekler kapilýallarda gabalan howa köpürjikleri bolup, fazanyň kontrast şekillendirişiniň ululygyny görkezýär. ähli sanlardaky shematika masştablanmaly däldir we görkezilişinden takmynan 100 esse uludyr.
Magnit kapilýaryň ýokarsy boýunça çepe we saga terjime edilende, MP setiriniň burçy magnit bilen deňleşmek üçin üýtgeýär (6-njy surata serediň), şeýlelik bilen magnit meýdan çyzyklaryny kesgitleýär. MP3-5 üçin akord bosaganyň burçuna ýetenden soň bölejikler kapilýaryň ýokarky ýüzüne süýşürilýär. Deputatlaryň suwuk-howa interfeýsinde jemlenmegine we jemlenmegine sebäp bolýan kapilýar ujuna ýakyn surata düşürilende has aýdyň görünýär. MP3-5-den tapawutlandyrmak has kyn bolan MP6-daky bölekler, magnit kapilýar boýunça hereket edilende süýrülmedi, ýöne MP setirleri bölünip aýryldy, bölejikleriň hereket edýän ýerinden uzaklaşdy. galan deputatlar setirde galyp, agyrlyk güýji bilen turbanyň aşaky ýüzüne ýuwaş-ýuwaşdan düşdüler (Goşmaça wideo S5: MP3 serediň).
MP setiriniň burçy üýtgeýär, magnit kapilýaryň ýokarsyndaky sag tarapa terjime edilende.
Synaglarymyz, magnitiň trakeýa boýunça haýal yza we yza süýşürilmegi, wivo-de çylşyrymly hereketiň çäginde MP-ni görmegi aňsatlaşdyrýandygyny görkezdi. Wivo synagynda kapilýarda polistirol monjuklar (MP1 we MP2) görünmeýänligi sebäpli galan dört deputatyň her biri wivo görnüşinde synag edildi we traktanyň üstünde takmynan 30 ° burçlydy. Magnit konfigurasiýasy bes edileninden has täsirli. MP3, MP4 we MP6 haýsydyr bir janly haýwanlaryň trahahasynda tapylmady. Haýwanlar adam öldürilenden soň, syçanyň howa ýollary şekillendirilende, şpris nasosy bilen goşmaça ses goşulanda bölejikler görünmeýärdi.
Deputat gowşurylyşynda magnitiň trahaýanyň üstünde goýulmagy, deputatlaryň köpüsiniň üns merkezinde jemlenmegine sebäp boldy. Trahaýa girýän bölekler adam gurban berlen haýwanlarda has gowy görülýär. 7-nji surat we goşmaça wideo S6: MP5 çalt magnitli tutulmagy we ventral trahahiniň üstündäki bölejikleriň deňleşmegini görkezýär. Deputatlar karina has ýakyn tapyldy, suwuklyk döwründe magnit meýdanynyň kuwwatynyň iň ýokary sebiti arkaly iberilendigi sebäpli, ähli deputatlary ýygnamak we saklamak üçin magnit meýdanynyň güýjüniň ýeterlik däldigini öňe sürdi. Şeýle-de bolsa, dogrumdan soňky MP konsentrasiýalary şekillendirilen meýdanyň töwereginde has ýokarydy, bu köp sanly deputatyň ulanylýan magnit meýdanynyň güýji iň ýokary bolan howa ýollarynda galýandygyny görkezýär.
(A) öň we (b) MP5 gowşurylandan soň, magnit bilen göni şekillendirilen meýdanyň trahaýasyna düşürilen suratlar. Görkezilen ýer iki kıkyrtyk halkanyň arasynda ýerleşýär. Deputat gowşurylmazyndan ozal howa ýolunda suwuklyk bar. Gyzyl gutuda kontrast güýçlendiriji ulaldyldy.
Magnitiň trahahýa boýunça terjime edilmegi MP zynjyrynyň howa ýollarynyň üstündäki burçlary kapilýallarda görkezilişi ýaly üýtgetmegine sebäp boldy (8-nji surata we goşmaça wideo S7: MP5 serediň) .Hogsa-da, biziň gözlegimizde deputatlary janly howa ýolunyň üstünde süýräp bolmaýardy, käbir ýagdaýlarda MP zynjyrynyň üýtgemegi mümkin. Magnit trahiýa boýunça uzynlygyna süýşürilende we magnit göni üstünden süýşürilende we bölejik simleri dikligine aýlananda giňelýär (Goşmaça wideo S7 serediň). . Aýna kapilýarda ulanylýan magnit meýdanynda syn eden MP hereketimize laýyk gelýär.
Janly anestizirlenen syçanyň trahaýasynda MP5 görkezýän mysal şekilleri. (A) Magnit trahýanyň ýokarsynda we çep tarapynda şekil almak üçin, soň bolsa (b) magnit sag tarapa geçirilenden soň ulanylýar. Gyzyl gutuda kontrast güýçlendiriji ulaldyldy. Bu suratlar goşmaça wideo S7: MP5-de görkezilen wideodandyr.
Iki polýus trahýanyň ýokarsynda we aşagynda (ýagny özüne çekiji; 3b surat) demirgazyk-günorta ugrukdyrylanda düzülende, MP akkordlary has uzyn peýda bolup, dykyz trakeal üstünde däl-de, trahaýanyň gyrasynda ýerleşýärdi (goşmaça wideo S9: MP5 serediň). Şeýle-de bolsa, bir ýerde bir bölejik bölejikleriň ýokary konsentrasiýasy ýüze çykaryldy. ulanylýar, adatça bir magnitli enjam ulanylanda ýüze çykýar. Soňra polýuslary tersine gaýtarmak üçin bir magnit düzülende (3c-nji surat), meýdançada görünýän bölejikleriň sany gowşurylandan soň köpelmeýärdi. Iki magnitli konfigurasiýany gurmak, magnit meýdanynyň üstünden geçýän ýa-da itekleýän ýokary magnit meýdanynyň güýçliligi sebäpli kyn boldy. çyzyklar trakeal diwary ortogonally kesip geçdiler (3-nji surat), gapdal diwardaky bölejikleriň jemlenişini synlap boljakdygyny kesgitlemek üçin döredilen ugur .Höne muňa garamazdan, bu konfigurasiýada MP ýygnamagynyň ýa-da magnit hereketiniň kesgitlenýän hereketi ýokdy.
Haçan-da haýwan adam öldürilenden soň derrew birnäçe gezek şekillendirilende, bulaşyk dokumanyň hereketiniň ýoklugy, magnitiň terjime hereketine laýyklykda has oňat we gysga bölejik çyzyklarynyň açyk interkondral meýdanda ýüze çykyp biljekdigini aňladýardy. Muňa garamazdan, MP6 bölejikleriniň bardygyny we hereketini henizem görüp bilemok.
LV-LacZ titresi 1.8 × 108 TU / ml boldy, we CombiMag MP (MP6) bilen 1: 1 garylandan soň, haýwanlar 9 × 107 TU / ml LV ulagyň 50 μl trakeal dozasyny aldylar (ýagny 4,5 × 106 TU / rat). ) .Bu gözleglerde, magnit meýdanynyň ýoklugynda wektor gowşurylyşy bilen deňeşdirilende LV transduksiýasynyň (a) gowulaşyp boljakdygyny ýa-da ýok edilip bilinjekdigini kesgitlemek üçin magniti bir ýagdaýda kesgitledik we (b) howa ýollarynyň öýjükleri ýokarky howa ýolunyň magnit maksatly sebitlerine geçirilip bilner.
Magnitleriň bolmagy we LV wektorlary bilen birleşdirilen CombiMag-yň ulanylmagy, adaty LV wektor gowşuryş protokolymyz ýaly haýwanlaryň saglygyna ýaramaz täsir etmedi. Mehaniki perturbasiýa sezewar bolan trakeal sebitiň öňdäki suratlary, magnit az mukdarda LV-MP bolan LV-MP bilen bejerilen haýwanlar toparynda transduksiýanyň ep-esli ýokarydygyny görkezýär (9-njy surat). dolandyryş topary (9b surat). Adatylaşdyrylan X-Gal reňklenen ýerleriň mukdary, LV-MP-ni magnit meýdany bolan ýagdaýynda dolandyrmagyň takmynan 6 esse gowulaşandygyny görkezdi (9-njy surat).
LV-MP (a) magnit meýdanynyň barlygynda we (b) magnitiň ýoklugynda trakeal transduksiýany görkezýän birleşdirilen şekillere mysal. (C) Magnit ulanylanda trahahanyň içinde kadalaşdyrylan LacZ geçiş meýdanynyň statistiki taýdan gowulaşmagy (* p = 0.029, t-test, n = 3, ortaça ± SEM).
Bitarap çalt gyzyl reňkli bölümler (Goşmaça 2-nji suratda görkezilen mysal) öň habar berlişi ýaly meňzeş görnüşde we ýerde ýerleşýän LacZ reňkli öýjükleri görkezdi.
Howa ýollary gen terapiýasy üçin esasy kynçylyk, daşaýan bölejikleriň gyzyklanýan sebitlere takyk lokalizasiýasy bolup, howa akymynyň we işjeň mukam arassalanyşynyň barlygynda hereket edýän öýkeniň ýokary geçiş netijeliligini gazanmak bolup durýar. CF howa ýollarynyň keselini bejermek üçin döredilen LV göterijiler üçin howa ýollarynyň içinde daşaýjy bölejikleriň ýaşaýyş wagtyny köpeltmek, Castellani we beýlekileriň magnit ulanylyşy ýaly beýleki artykmaçlyklary görkezýär. elektroporasiýa, ýönekeýligi, tygşytlylygy, gowşuryş lokalizasiýasyny, netijeliligi ýokarlandyrmagy we inkubasiýa wagtyny we has kiçi göterijiniň dozasyny birleşdirip bilýänligi sebäpli, daşarky magnit güýçleriniň täsiri astynda howa ýollarynda magnit bölejikleriniň wivo çökmegi we hereketi hiç haçan beýan edilmedi, ýa-da aslynda bu usulyň durnukly ýaşaýyş howa ýollarynda gen aňlatma derejesini ýokarlandyrmak üçin wivo görkezilmedi.
Witro sinhrotron PCXI synaglarymyz, polistirol MP-den başga ähli synag eden bölejiklerimiziň ulanylan şekillendiriş gurnamasynda görünýändigini görkezdi. Magnit meýdanynyň barlygynda deputatlar uzynlygy bölejikleriň görnüşi we magnit meýdanynyň güýji (ýagny magnitiň ýakynlygy we hereketi). 10-njy suratda görkezilişi ýaly, her bir aýratyn meýdanda magnit emele gelýär. bölejikler, beýleki bölejikleriň ýerli özüne çekiji we özüne çekiji güýçlerinden ýerli güýçler sebäpli toparlaýyn simli hereketler bilen jemlenmek we birikmek üçin.
Suwuklyk bilen doldurylan kapilýilleriň we (c, d) howa bilen doldurylan trakeýanyň içinde emele gelen shematiki görkeziş. Kapilýallaryň we trahahiýanyň göwrümine çekilmeýändigini belläň. Panel (a) setirlerde ýerleşdirilen Fe3O4 bölejiklerini öz içine alýan MP-iň beýanyny hem öz içine alýar.
Magnit kapilýaryň üstünden süýşürilende, bölejikleriň siminiň burçy Fe3O4 bolan MP3-5 üçin kritiki çäklere ýetdi, şondan soň bölejik simleri öňki ýagdaýynda galmady, üstesine-de täze pozisiýa geçdi. Bu täsiriň ýüze çykmagy ähtimal, aýna kapilýar üstü bu hereketiň ýüze çykmagyna ýol açar ýaly däldi. ýerüsti zarýadlar ýa-da eýeçilik göterijisi suwuklygy olaryň hereket etmek ukybyna täsir etdi. CombiMag bölejikleriniň şekil kontrasty hem has gowşak bolup, suwuklygyň we bölejikleriň meňzeş dykyzlygynyň bolup biljekdigini we şonuň üçin biri-birine aňsatlyk bilen hereket edip bilmejekdigini görkezýär. Magnit meýdanynyň güýji hemişe suwuklykdaky bölejikleriň arasyndaky sürtülmäni ýeňip geçip bilmejekdigini görkezýär. Magnitleriň maksat meýdanyndan akýan köp sanly deputaty ele alyp biljekdigine garamazdan, CombiMag bölejiklerini trahaýanyň üstünde herekete getirip bolmajakdygynyň mümkindigini öňe sürýäris. Şol sebäpden, “Vivo LV-MP” barlaglarynda howa ýolunyň agajynyň belli sebitlerini fiziki taýdan nyşana almak üçin statiki magnit meýdanlaryny ulanmaly diýen netijä gelýäris.
Bölejikler bedene eltilende, çylşyrymly hereket edýän beden dokumalarynyň kontekstinde kesgitlemek kyn, ýöne olary tapmak ukyby, magnitleri trahýanyň üstünden keseligine MP setirlerini “silkmek” arkaly terjime etmek arkaly güýçlendirildi. Janly şekillendiriş mümkin bolsa-da, haýwan adam öldürilenden soň bölejikleriň hereketini kesgitlemek has aňsatdy. in vitro gözleglerine, bölejikleri magnit terjime edip trahaýa boýunda süýräp bolmaýar. Bu tapyndy, trahahýanyň ýüzüni örtýän mukusyň adatça dem alýan bölejikleri gaýtadan işlemegine, mukusda duzagyna düşmegine we soňundan arassalanyş mehanizmi bilen arassalanmagyna laýyk gelýär.
Trahýanyň ýokarsynda we aşagynda çekmek üçin magnitleriň ulanylmagy (3b-nji surat) bir nokatda ýokary konsentrirlenen, bölejikleriň has birmeňzeş paýlanmagyna sebäp bolup biljek magnit meýdany däl-de, has birmeňzeş magnit meýdanynyň döremegine sebäp bolup biljekdigini çakladyk. Şeýle-de bolsa, deslapky gözlegimiz bu çaklamany tassyklaýan subutnama tapmady. goşa magnitli sazlamanyň MP nyşana alynmagyna ýerli gözegçiligi ep-esli gowulaşdyrmaýandygyny we netijede güýçli magnit güýçlerini düzmek kyn bolýandygyny, bu çemeleşmäni has amatly edýändigini görkezýär. Şonuň ýaly-da, magnitiň ýokarsyna we trahaha arkaly gönükdirilmegi (3d-nji surat) şekillendirilen meýdanda saklanýan bölejikleriň sanyny köpeltmedi. 3a) wivo synagynda iň aňsat we iň täsirli usul hasaplanýar.
LV-MP gözleginde, LV wektorlary CombiMag bilen birleşdirilip, magnit meýdanynyň barlygynda fiziki perturbasiýadan soň gowşurylandan soň, trahahiýada gözegçilik bilen deňeşdirilende transduksiýa derejesi ep-esli ýokarlandy. Sinhrotron şekillendiriş gözlegleri we LacZ netijeleri esasynda magnit meýdany trakeýanyň içindäki LV-ni gorap saklamaga ukyply bolup, öýkeniň çuňlugyna girip bilýän wektor bölejikleriniň sanyny azaldyp biler. maksatlaýyn transduksiýa, çişme we immun täsirleri we gen göterijiniň çykdajylary. Möhüm zat, öndürijiniň pikiriçe, CombiMag beýleki gen geçiriş usullary, şol sanda beýleki wirus wektorlary (AAV) we nuklein kislotalar bilen bilelikde ulanylyp bilner.