Nature.com-a gireniňiz üçin sag boluň. Çäkli CSS goldawy bilen brauzer wersiýasyny ulanýarsyňyz. Iň oňat tejribe üçin täzelenen brauzeri ulanmagy maslahat berýäris (ýa-da Internet Explorer-de Gabat geliş tertibini öçüriň). Mundan başga-da, dowamly goldawy üpjün etmek üçin sahypany stil we JavaScript-de görkezýäris.
Birbada üç slaýdyň karuselini görkezýär. Bir gezekde üç slaýddan geçmek üçin Öňki we Indiki düwmelerini ulanyň ýa-da bir gezekde üç slaýddan geçmek üçin slaýder düwmelerini ulanyň.
Öz-özünden ýygnanýan nerw organelleri, adamyň ösüşini we kesellerini modellemek üçin geljegi uly in vitro platformasyny görkezýär. Şeýle-de bolsa, organoidleriň kämillik derejesini çäklendirýän we özüni alyp barşyna gözegçilik edýän beýleki zynjyrlar bilen integrasiýanyň öňüni alýan “vivo” -de bar bolan baglanyşyk ýok. Bu ýerde, täze döreýän ýalaňaç alakalaryň somatosensor korteksine göçürilen adam öýjüklerinden emele gelen kortikal organoidleriň duýgur we höweslendiriş zynjyrlaryna birleşýän ýetişen öýjük görnüşlerini ösdürýändigini görkezýäris. MRI birnäçe öýjük çyzyklarynda we haýwanlarda transplantasiýadan soňky organoid ösüşini ýüze çykardy, bir ýadroly derňew kortikogeneziň ösüşini we işjeňlige bagly transkripsiýa programmasynyň ýüze çykandygyny ýüze çykardy. Hakykatdanam, göçürilen kortikal neýronlar, vitro kärdeşlerine garanyňda has çylşyrymly morfologiki, sinaptiki we içki membrananyň häsiýetlerini görkezýär, bu bolsa Timoteos sindromly näsaglarda neýron kemçiliklerini ýüze çykarmaga mümkinçilik berýär. Anatomiki we funksional gözleg, göçürilen organellleriň talamokortiki we kortikokortiki girişleri alýandygyny görkezdi we nerw işjeňliginiň wivo ýazgylary bu girişleriň adam öýjüklerinde duýgur seslenme döredip biljekdigini görkezýär. Netijede, kortikal organoidler aksonlary syçanyň beýnisine uzadýar we olaryň optogenetiki işjeňleşmegi sylag gözleýän hereketlere sebäp bolýar. Şeýlelik bilen, göçürilen adam korteks neýronlary ýetişýär we özüni alyp barşyna gözegçilik edýän öý eýesiniň zynjyrlaryna gatnaşýar. Bu usul, başga usullar bilen kesgitlenip bilmeýän näsaglardan emele gelen öýjüklerde derejeli fenotipleri tapmagy aňsatlaşdyrar diýip garaşýarys.
Ösüp barýan adam beýnisi, öýjükleriň köpelmegi, tapawutlanmagy, göçmegi we duýgur tejribe arkaly hasam kämilleşdirilen funksional neýron zynjyrlaryny emele getirmek üçin ajaýyp öz-özüni guramak prosesi. Adam beýnisiniň ösüşine düşünmekde esasy mesele, esasanam kesel kontekstinde beýni dokumalaryna elýeterliligiň bolmazlygydyr. Adam korteks organoidlerini (hCO; adam korteks sferasy diýlip hem bilinýär) öz içine alýan organeller 2,3,4,5,6 öndürip biler. Şeýle-de bolsa, birnäçe çäklendirmeler, nerw zynjyrlarynyň ösüşine we işleýşine düşünmek üçin has giň ulanylmagyny çäklendirýär. Hususan-da, “vivo” -de bar bolan käbir mikro-daşky gurşaw we duýgur girişleriň ýoklugy bilen hCO ýetişmeginiň çäklendirilendigi belli däl. Mundan başga-da, hCO-laryň özüni alyp barşyň netijelerini döredip biljek zynjyrlara birleşdirilmändigi sebäpli, genetiki taýdan çylşyrymly we özüni alyp barşyň newropsihiatrik bozulmalaryny modellemekde peýdasy häzirki wagtda çäklidir.
HCO-nyň bitewi janly beýnine transplantasiýasy bu çäklendirmeleri ýeňip biler. Öňki gözlegler gemrijiniň korteksine göçürilen adam neýronlarynyň 7,8,9,10,11,12 ýaşap, taslama we aragatnaşyk gurup biljekdigini görkezdi. Şeýle-de bolsa, bu synaglar adatça uly ýaşly haýwanlarda geçirilýär, bu sinaptiki we aksonal integrasiýany çäklendirip biler. Bu ýerde, hiPS öýjüklerinden alnan 3D hCO-ny plastmassa ösüşiniň irki döwründe immun ýetmezçiligi bolan syçanlaryň esasy somatosensor korteksine (S1) göçüren transplantasiýa paradigmasyny suratlandyrýarys. Transplantasiýa edilen hCO (t-hCO) neýronlary ep-esli ýetişýär, duýgur jogaplary döredýän talamokortiki we kortikal-kortikal girişleri alýar we sylag gözleýän özüni alyp barmak üçin syçanyň beýnisine aksonal proýeksiýalary uzadýar. T-hCO-nyň giňelmegi, Timotio sindromy (TS) näsaglarda nerw kemçiliklerini ýüze çykardy, naprýatageeniýa duýgur L görnüşli CaV1.2 kalsiý kanalynda (CACNA1C kodlanan) mutasiýa sebäpli ýüze çykýan agyr genetiki näsazlyk.
Adamyň kortikal neýronlaryny wivo arkaly öwrenmek üçin, dogrumdan soňky atimiki syçanlaryň (dogrumdan soňky 3-7 gün) S1-e stereotaktiki usulda göçürdik (1a surat we 1a-c suratyň giňeldilen maglumatlary). Bu pursatda talamokortiki we kortikokortiki akson proýeksiýalary S1 innerwasiýasyny entek tamamlamady (13-nji ser.). Şeýlelik bilen, bu çemeleşme endogen zynjyrlara täsirini azaltmak bilen t-hCO integrasiýasyny ýokarlandyrmak üçin döredildi. T-hCO-nyň janly haýwanlarda ýerleşişini göz öňüne getirmek üçin, göçürilenden 2-3 aý soň syçanlaryň T2 agramly MRI beýni rekonstruksiýasyny etdik (1b surat we giňeldilen maglumatlar, 1d surat). t-hCO aňsatlyk bilen syn edildi we t-hCO-nyň göwrüm ölçegleri kesgitlenen dilimlerden hasaplananlara meňzeýärdi (Giňeldilen maglumatlar 1d surat, e; P> 0.05). t-hCO aňsatlyk bilen syn edildi we t-hCO-nyň göwrüm ölçegleri kesgitlenen dilimlerden hasaplananlara meňzeýärdi (Giňeldilen maglumatlar 1d surat, e; P> 0.05). t-hCO легко наблюдались, а оемемнее измерения t-hCO былы аналогичны рассчитанным для фик чивованных срезов (расширенные кснейе, рис. 1d, e; P> 0,05). t-hCO aňsatlyk bilen syn edilýärdi we göwrümli t-hCO ölçegleri kesgitlenen bölümler üçin hasaplananlara meňzeýärdi (giňeldilen maglumatlar, 1d surat, e; P> 0.05).很容易观察到 t-hCO ，并且 t-hCO 的体积测量值与从固定切片计算的测量值相似（扩展数据图 1d 、 e ； P> 0.05 ）。很容易观察到 t-hCO ，并且 t-hCO t-hCO легко наблюдался, а оемемные измерения t-hCO были аналогичны рассчитанным для фик човованных срезов (расширенные кснейе, рис. 1d, e; P> 0,05). t-hCO aňsatlyk bilen syn edilýärdi we göwrümli t-hCO ölçegleri kesgitlenen bölümler üçin hasaplananlara meňzeýärdi (giňeldilen maglumatlar, 1d surat, e; P> 0.05).Transplantasiýa edilenden takmynan 2 aý soň göçürilen haýwanlaryň 81% -inde t-hCO kesgitledik (n = 72 haýwan; 10 hiPS öýjük liniýasyndan hCO; Goşmaça tablisadaky hiPS öýjük çyzyklary). Bulardan 87% -i beýni korteksinde ýerleşýär (1-nji surat). Şol bir göçürilen syçanda birnäçe gezek MRI skanerlerini ýerine ýetirip, 3 aýyň içinde t-hCO göwrüminiň dokuz esse ýokarlanandygyny gördük (1-nji surat we giňeldilen maglumatlar, 1f surat). Transplantasiýa edilen haýwanlar transplantasiýadan soňky 12 aýda ýokary ýaşamak derejesine eýe boldular (giňeldilen maglumatlar, 1g surat we goşmaça tablisa 2), motor ýa-da ýadyň bozulmagy, glioz ýa-da elektroensefalogramma (EEG) tapylmady. Maglumat 1g surat we goşmaça tablisa 2). 1h - m we 3e).
a, Synag dizaýnynyň shemasy. HiPS öýjüklerinden alnan hCO, 30-60 günüň dowamynda täze doglan ýalaňaç syçanlaryň S1-e geçirildi. b, göçürilenden 2 aý soň S1-de t-hCO görkezýän T2 agramly koronal we gorizontal MRI şekilleri. Tereziniň çyzgysy, 2 mm. c, Her hiPS öýjük çyzygy üçin görkezilen üstünlik üstünlikleriniň mukdary (n = 108, barlaryň içindäki sanlar hIPS öýjük setirine t-hCO mukdaryny görkezýär) we kortikal ýa-da subkortikal ýerleşiş (n = 88). d, koronar arteriýanyň MRI şekili (çep; şkala, 3 mm) we 3 aýyň içinde t-hCO-nyň artandygyny görkezýän degişli 3D göwrümli rekonstruksiýa (şkala, 3 mm). e, syçanyň beýni korteksinde t-hCO nagyşlaryna syn. Tereziniň çyzgysy, 1 mm. f, t-hCO-nyň ýokarky çepden saga görkezilen (tapawutlandyryş wagtynda) immunositokimiki şekilleri: PPP1R17 (4 aýlyk), NeuN (8 aýlyk), SOX9 we GFAP (8 aýlyk), PDGFRα; (8 aý), MAP2 (8 aý) we IBA1 (8 aý). Tereziniň çyzgysy, 20 µm. HNA-nyň bilelikde görkezilmegi adamdan gelip çykýan öýjükleri görkezýär. g, snRNA-seq: Seurat integrasiýasyndan soň (n = 3 t-hCO nusgalary, n = 2 hiPS öýjük çyzyklary) ýokary hilli t-hCO ýadrolarynyň birleşdirilen köpugurly we proýeksiýa (UMAP) ölçeg derejesini peseltmek. Astrositler, astrositler çyzygynyň öýjükleri; sik prog, aýlanýan nesiller; GluN DL, çuň glutamatergiki neýronlar; GluN DL / SP, çuň we sublamellar glutamatergiki neýronlar; GluN UL, ýokarky gatlak glutamatergiki neýronlar; oligodendrositler, oligodendrositler; OPC, oligodendrosit nesil öýjükleri; RELN, reelin neýronlary. h, gen Ontologiýasy (GO) termini baýlaşdyrmak derňewi, hCO glutamatergiki neýronlar bilen deňeşdirilende t-hCO glutamatergiki neýronlarda ep-esli tertipleşdirilen (düzedilen P <0.05, ep-esli üýtgeşme> 2, ýadrolaryň azyndan 10% -de aňladylýar). h, gen Ontologiýasy (GO) termini baýlaşdyrmak derňewi, hCO glutamatergiki neýronlar bilen deňeşdirilende t-hCO glutamatergiki neýronlarda ep-esli tertipleşdirilen (düzedilen P <0.05, ep-esli üýtgeşme> 2, ýadrolaryň azyndan 10% -de aňladylýar). h, Аня обогщения анов Генов Онтологиясе (GO) для занов со значительной активяей (скорр секированный П <0,05, кратность изменения> 2, кряней мере в 10% ядер) в глута верергических снеч с Нейронамисc. h, t-hCO glutamatergiki neýronlarda ep-esli işjeňleşýän genler üçin gen Ontologiýasy (GO) termin baýlaşdyryş derňewi (sazlanan P <0.05, ep-esli üýtgeşme> 2, azyndan 10% ýadroda aňlatma) hCO glutamatergiki neýronlar bilen deňeşdirilende. h ，与 hCO 谷氨酸能神经元相比， t-hCO 谷氨酸能神经元中基因显着上调（调整后 P <0.05 ，倍数变化> 2 ，在至少 10% 的细胞核中表达）的基因本体论 (GO) 术语富集分析。 h ， co hco 谷氨酸 能---<<<<0.05 ， 变化 变化> 2 ， 至少 10% 的% GO GO GO GO GO GO GO GO GO GO GO sag . h, genler baýlaşdyryş möhletiniň hCO glutamatergiki neýronlary Ontologiki (GO) derňewi bilen deňeşdirilende t-hCO glutamaterjik neýronlarda ep-esli tertipleşdirildi (düzedilen P <0.05, ep-esli üýtgeşme> 2, ýadrolaryň azyndan 10% -de aňladylýar).Punktir çyzyk aq bahasyny 0.05 görkezýär. i, 22 snRNA-seq ulularyň motor korteks maglumatlar bazasyndan bellik geçirişini ulanyp, t-hCO-da GluN öýjük görnüşleriniň UMAP şekillendirişi. KT - kortikotalamik öýjükler, ET - öýjükden daşary öýjükler, IT - içerki telensalfal öýjükler, NP - proýeksiýanyň golaýynda.
Soňra sitoarhitektura we t-hCO-nyň umumy öýjükli düzümine baha berdik. Düwürtik endotel öýjükleriniň antikor boýagy t-hCO bilen damarlaşmagy ýüze çykardy, IBA1 boýagy bolsa tutuşlygyna alakalarda mikroglýanyň bardygyny ýüze çykardy (1f surat we giňeldilen maglumatlar, 3c surat, d). Immunostasiýa etmek, PPP1R17 (kortikal progenitorlar), NeuN (neýronlar), SOX9 we GFAP (glial öýjükler) ýa-da PDGFRα (oligodendrosit progenitorlary) bilelikde görkezýän adam ýadro antigenini (HNA) pozitiw öýjükleri ýüze çykardy. T-hCO-nyň öýjükli düzümini bir öýjük çözgüdi boýunça öwrenmek üçin takmynan 8 aý tapawutlandan soň bir ýadroly RNK yzygiderliligini (snRNA-seq) ýerine ýetirdik. Syçanyň ýadrolarynyň köpüsini süzmek we aýyrmak 21,500 ýokary hilli adam monon ýadro kartasyny berdi (1g surat we giňeldilen maglumatlar, 4a surat, b). Adaty öýjükli görnüşli markerleriň aňlatma nagyşlary, çuň we ýüzleý glutamatergiki neýronlary, aýlanyş nesillerini, oligodendrositleri we astrosit nesillerini öz içine alýan esasy kortikal öýjük synplarynyň toparlaryny kesgitledi (1g surat, giňeldilen maglumatlar, 4c surat we goşmaça tablisa 3). SATB2 we CTIP2 üçin immunizasiýa, kortikal görnüşleriň bardygyna garamazdan, t-hCO anyk anatomiki gatlak görkezmändigini görkezdi (giňeldilen maglumatlar, 3a surat). tapgyrlaýyn gabat gelýän snRNA-seq hCO, oligodendrositleriň ýoklugyny we gapdal nesil öýjükleri üçin vitro şertlerinde öň habar berlen amatly GABAergic neýronlaryny öz içine alýan birnäçe kadadan çykma bilen giňden meňzeş öýjük synplaryny öndürdi15 (giňeldilen maglumatlar, 4f surat - i we goşmaça tablisa 4). Differensial gen aňlatma derňewi, t-hCO bilen hCO (Goşmaça 5-nji tablisa) arasynda glýutamateriki neýronlarda ep-esli tapawutlary ýüze çykardy, sinaptiki signalizasiýa, dendrit lokalizasiýasy we naprýatageeniýe kanal işjeňligi ýaly neýron kämillik bilen baglanyşykly genleriň toplumyny işjeňleşdirmek (1-nji surat we goşmaça tablisa 5). tablisa 6). Şoňa laýyklykda kortikal glutamaterjik t-hCO neýronlary çalt transkripsiýa ýetişmegini görkezdi.
T-hCO-daky bu transkripsiýa üýtgeşmeleriň in vitro we t-hCO in vivo bilen morfologik tapawutlar bilen baglanyşyklydygyny ýa-da ýokdugyny anyklamak üçin, 7-8 aý tapawutlandan soň, basgançakly gabat gelýän biositin bilen doldurylan hCO we hCO-ny ýiti bölümlerde täzeden gurduk. hCO neýronlary (2a surat). t-hCO neýronlary ep-esli uludy, soma diametri 1,5 esse, dendritlerden iki esse köpdi we vitro hCO bilen deňeşdirilende umumy dendrit uzynlygynyň umumy mukdary alty esse ýokarlandy (2b surat). Mundan başga-da, t-hCO neýronlarynda dendrit oňurgalarynyň hCO neýronlaryna garanyňda ep-esli ýokary dykyzlygyny gördük (2-nji surat). Bu, t-hCO neýronlarynyň giň dendrit uzalmagyna we şahalanmagyna sezewar bolýandygyny görkezýär, bu öýjükleriň köpelmegi bilen bilelikde transplantasiýadan soň t-hCO-nyň intensiw ösmegine goşant goşup biler (1-nji surat we giňeldilen maglumatlar 1-nji surat). Bu, elektrofiziologiki aýratynlyklary derňemäge itergi berdi. Membrananyň sygymlylygy sekiz esse ýokarydy (giňeldilen maglumatlar, 8-nji surat), dynç alýan membrananyň potensialy has giperpolýarlaşdy (takmynan 20 mV) we häzirki sanjym t-hCO neýronlarynda hCO neýronlaryna garanyňda has ýokary tolgunma derejesini döretdi. in-vitro (2-nji surat), e), t-hCO-nyň has uly we çylşyrymly morfologiki aýratynlyklaryna laýyk gelýär. Mundan başga-da, t-hCO neýronlarynda öz-özünden tolgundyryjy postinaptiki häzirki hadysalaryň (EPSC) ýygylygy ep-esli ýokarydy (2-nji surat), bu t-hCO neýronlarynda görülýän dendrit oňurgalarynyň dykyzlygynyň ýokarlanmagynyň funksional tolgunma bilen baglanyşyklydygyny görkezýär. jynsy synaps. Glutamatergiki neýronlary bellige almak arkaly vitrodaky hCO neýronlarynyň ýetişmedik häsiýetini tassykladyk (giňeldilen maglumatlar, 6a-c surat).
a, biositin bilen doldurylan hCO we t-hCO neýronlaryny 8 aý tapawutlandan soň 3D rekonstruksiýa. b, Morfologiki aýratynlyklaryň mukdary (n = 8 hCO neýron, n = 6 t-hCO neýron; ** P = 0.0084, * P = 0.0179 we *** P <0.0001). b, Morfologiki aýratynlyklaryň mukdary (n = 8 hCO neýron, n = 6 t-hCO neýron; ** P = 0.0084, * P = 0.0179 we *** P <0.0001). б. b, morfologiki aýratynlyklaryň mukdary (n = 8 hCO neýron, n = 6 t-hCO neýron; ** P = 0.0084, * P = 0.0179, we *** P <0.0001). b ，形态学特征的量化（ n = 8 个 hCO 神经元， n = 6 个 t-hCO 神经元； ** P = 0.0084 ， * P = 0.0179 和 *** P <0.0001 ）。 b ，形态学特征的量化（ n = 8 个 hCO 神经元， n = 6 个 t-hCO 神经元； ** P = 0.0084 ， * P = 0.0179 和 *** P <0.0001 ）。 б. b, morfologiki aýratynlyklaryň mukdary (n = 8 hCO neýron, n = 6 t-hCO neýron; ** P = 0.0084, * P = 0.0179, we *** P <0.0001).c, 8 aýlyk tapawutlandyryşdan soň hCO we t-hCO dendrit şahalarynyň 3D rekonstruksiýasy. Gyzyl ýyldyzjyklar, dendrit keselini görkezýär. Dendrit oňurga dykyzlygynyň mukdary (n = 8 hCO neýron, n = 6 t-hCO neýron; ** P = 0.0092). d, Dynç alýan membrananyň potensialynyň mukdary (n = 25 hCO neýron, n = 16 t-hCO neýron; *** P <0.0001). d, Dynç alýan membrananyň potensialynyň mukdary (n = 25 hCO neýron, n = 16 t-hCO neýron; *** P <0.0001). d, количественная оценка мембранного ацициала покоя (n = 25 Кронронов hCO, n = 16 Кронронов t-hCO; *** P <0,0001). d, membrananyň potensial mukdaryny kesgitlemek (n = 25 hCO neýron, n = 16 t-hCO neýron; *** P <0.0001). d ，静息膜电位的量化（ n = 25 hCO 神经元， n = 16 t-hCO 神经元； *** P <0.0001 ）。 d ，静息膜电位的量化（ n = 25 hCO 神经元， n = 16 t-hCO 神经元； *** P <0.0001 ）。 d, количественная оценка мембранного ацициала покоя (n = 25 Кронронов hCO, n = 16 Кронронов t-hCO; *** P <0,0001). d, membrananyň potensial mukdaryny kesgitlemek (n = 25 hCO neýron, n = 16 t-hCO neýron; *** P <0.0001). e, häzirki sanjymlaryň köpelmegi we iň ýokary atyş tizliginiň mukdary (n = 25 hCO neýronlary, n = 16 t-hCO neýronlary; *** P <0.0001) netijesinde ýüze çykýan hCO we t-hCO-da gaýtalanýan hereket potensialy. e, häzirki sanjymlaryň köpelmegi we iň ýokary atyş tizliginiň mukdary (n = 25 hCO neýronlary, n = 16 t-hCO neýronlary; *** P <0.0001) netijesinde ýüze çykýan hCO we t-hCO-da gaýtalanýan hereket potensialy. e, повторное возбуждение Касциала действия в hCO и t-hCO, в чванное увеличением тока, һәм количественная ожека чинной скорости возбуждения (n = 25 tutронов hCO, n = 16 karronов t-hCO *** P; e, iň ýokary atyş tizliginiň (n = 25 hCO neýronlary, n = 16 t-hCO neýronlary; *** P <0.0001) ýokarlanmagy we mukdary bilen ýüze çykan hCO we t-hCO-da täzeden potensial atyş. e ，通过增加电流注入诱导的 hCO 和 t-hCO 重复动作电位放电，以及最大放电率的量化（ n = 25 个 hCO 神经元， n = 16 个 t-hCO 神经元； *** P <0.0001 ）。 E ， 通过 增加 co co co hco 和 t-hco 重复 电位 放电 = = = （（ = = n = 25 个 hco 神经 = n = 16 个 t-hco 神经 ； *** p <0.0001）。 , e, häzirki üpjünçiligiň ýokarlanmagy we iň ýokary atyş tizliginiň mukdary (n = 25 hCO neýronlary, n = 16 t-hCO neýronlary; *** P <0.0001) netijesinde hCO we t-hCO hereket potensialynyň gaýtalanýan atylmagy. f, 8 aýlyk tapawutlandyryşda hCO we t-hCO neýronlarynda öz-özünden dörän EPSC-ler (sEPSCs) we sinaptiki hadysalaryň ýygylygynyň mukdary (n = 25 hCO neýronlary, n = 17 t-hCO neýronlary; *** P <0.0001). f, 8 aýlyk tapawutlandyryşda hCO we t-hCO neýronlarynda öz-özünden dörän EPSC-ler (sEPSCs) we sinaptiki hadysalaryň ýygylygynyň mukdary (n = 25 hCO neýronlary, n = 17 t-hCO neýronlary; *** P <0.0001). f. f, sinaptiki hadysanyň derejesini (n = 25 hCO neýronlary, n = 17 t-hCO neýronlary; *** P <0.0001) 8 aýlyk tapawutlandyryş we mukdarda hCO we t-hCO neýronlarynda öz-özünden EPSC (sEPSCs). f ，分化 8 个月时 hCO 和 t-hCO 神经元中的自发性 EPSCs (sEPSCs) ，以及突触事件频率的量化（ n = 25 hCO 神经元， n = 17 t-hCO 神经元； *** P <0.0001）. f ，分化 8 个月时 hCO 和 t-hCO 神经元中的自发性 EPSCs (sEPSCs) ，以及突触事件频率的量匼（ n = 25 hCO 神率的量匼（ n = 25 hCO 神率的量匼（ n = 25hCO P <0.0001）. f. f, sinaptiki hadysanyň derejesini (n = 25 hCO neýronlary, n = 17 t-hCO neýronlary; *** P <0.0001) 8 aýlyk tapawutlandyryş we mukdarda hCO we t-hCO neýronlarynda öz-özünden EPSC (sEPSCs).Bf üçin, hCO we t-hCO 1208-2 setirde paralel saklanýan şol bir tapawutlandyryş toparyndan alyndy. g, genleri baýlaşdyrmak derňewi (bir taraply Fişeriň takyk synagy) t-hCO glutamatergiki neýronlarda t-hCO glutamaterjik neýronlary bilen deňeşdirilende ep-esli tertipleşdirilen (düzedilen P <0.05, ep-esli üýtgeşme> 2) genleriň baýlaşdyryş derňewi we giç jogap jogap (LRG) işjeňlik bagly vitro neýronlary bilen kesgitlenýär. g, genleri baýlaşdyrmak derňewi (bir taraply Fişeriň takyk synagy) t-hCO glutamatergiki neýronlarda t-hCO glutamaterjik neýronlary bilen deňeşdirilende ep-esli tertipleşdirilen (düzedilen P <0.05, ep-esli üýtgeşme> 2) genleriň baýlaşdyryş derňewi we giç jogap jogap (LRG) işjeňlik bagly vitro neýronlary bilen kesgitlenýär. g, ما об обогщения набора занов (односторонний точный критерий Фисаа) чанов со значительной активяей (скорркированный П <0,05, кратность изменения> 2, «гарим по пеньшей мере в 10% ядер)» сравнению с глута пуергическм адронами hCO наб на башов как раннего (ERG), tak и позднего (LRG) чанов, чисисящих от активности, идентифицированных в исследовании на м мыха выч вч vitro17. g, t-hCO glutamaterjik neýronlarynda ep-esli işjeňleşdirilen (sazlanan P <0.05, ep-esli üýtgeşme> 2, genleriň baýlaşdyrylmagy (bir guýrukly Fişeriň takyk synagy), wivo syçanlarda ýüze çykarylan irki (ERG) we giç (LRG) işjeňlige bagly genler bilen deňeşdirilende genleriň baýlaşdyrylmagyny seljermek. g ， t-hCO 谷氨酸能神经元与 hCO 谷氨酸能神经元相比， t-hCO 谷氨酸能神经元显着上调（调整后 P <0.05 ，倍数变化> 2 ，在至少 10% 的细胞核中表达）的基因集富集分析（单侧 Balykçy 精确检验）从体内小鼠研究中鉴定的早期反应 (ERG) 和晚期反应 (LRG) 活性依赖性基因的基因组 16 和体外神经元 17 中的人类特异性 LRG。 g ， t-hco 谷氨酸 神经 co co co--

2 ， 至少% 10% isher 细胞 表达） isher isher （单侧 isher 反应 r基因组 16 和 神经元 神经元 17 中 中 17 中 17 的人类特异性 LRG。 , Ти Фиөра) раннего ответа (ERG) и позднего зы, зависящие от активности ответа (LRG), идентифицированные в исследованиях на мшахах виво16 һәм витро17да LрG, специфичнее длячове. g, t-hCO glutamatergiki neýronlar hCO glutamatergiki neýronlar bilen deňeşdirilende ep-esli tertipleşdirildi (düzedilen P <0.05, ep-esli üýtgeşme> 2, iň azyndan 10% irki jogap (ERG) we giç jogap genini baýlaşdyrmak derňewi (bir guýrukly Fişeriň takyk synagy) jogap işjeňligine bagly genler (LRGs) wivo syçanlarda we vitro neýronlarynda kesgitlenýär.Punktir çyzyk Bonferroni bilen düzedilen P bahasyny 0.05 görkezýär. h, GluN gen aňlatmasy (pseudo-paket we her geniň ulalmagy) t-hCO glutamatergiki neýronlarda LRG genleriniň snRNA-seq nusgalarynda ep-esli tertipleşdirildi. i, t-hCO (ýokarky) we hCO (aşaky) neýronlarda SCG2 aňlatmasyny görkezýän immunizasiýa. Ak oklar SCG2 + öýjüklerini görkezýär. Tereziniň çyzgysy, 25 µm. Maglumatlar ortaça ± standart gyşarma hökmünde aňladylýar.
Öňki wivo dilimlerinde synlanan t-hCO-nyň işjeňliginiň artmagyna esaslanyp, snRNA-seq vitro-daky hCO bilen deňeşdirilende t-hCO-da gen ýazgylarynyň işjeňlige bagly tertipleşdirilişini ýüze çykardy. Glutamatergiki t-hCO neýronlary, syçan we adam neýronlarynda geçirilen öňki gözleglerde tapylan giç jogap işjeňligini kadalaşdyrýan genleriň has ýokary derejesini görkezdi (2g surat, h). Mysal üçin, BDNF18, SCG2 we OSTN, başlangyç işjeňligi kadalaşdyrýan gen, t-hCO neýronlarynda hCO neýronlary bilen deňeşdirilende artýandygyny görkezdi (2g-i surat). Şeýlelik bilen, t-hCO neýronlary transkripsiýa, morfologiki we funksional derňewler arkaly hCO neýronlary bilen deňeşdirilende ösen kämillik aýratynlyklaryny görkezdi.
T-hCO ýetişmeginiň adam beýnisiniň ösüşi bilen baglanyşygyna has giňişleýin baha bermek üçin düwünçegiň we ulularyň kortikal öýjük görnüşleriniň transkriptomiki deňeşdirmelerini 19,20 we ulular21,22, şeýle hem ösüş döwründe kortikal gen aňlatmasy23 barada giňişleýin maglumatlary geçirdik (giňeldilen maglumatlar, 5-nji surat). ). Öňki iş 24 bilen, 7-8 aýlyk tapawutlandyryşda global hCO we t-hCO transkriptom kämillik ýagdaýy wivo ösüş wagty bilen giňden gabat gelýär we düwünçegiň giçki durmuşyna has deňdir (Giňeldilen maglumatlar 5a surat). Ablyeri gelende aýtsak, t-hCO-da transkriptom kämillik ýaşyna laýyk hCO bilen deňeşdirilende, synaptogenez, astrogenez we miýelinasiýa bilen baglanyşykly transkriptom işjeňleşmesini gördük (giňeldilen maglumatlar, 5b-d surat). Öýjük derejesinde, t-hCO-da inçe korteks görnüşiniň bardygyny gördük, glutamaterjik neýronlaryň toparlary ulularyň L2 / 3, L5 we L6 neýron görnüşleri bilen gabat gelýär (1i surat). Munuň tersine, göwreliligiň ortalarynda glutamaterjik t-hCO neýronlary bilen düwünçegiň kortikal neýronlarynyň arasyndaky toparlaýyn gapma-garşylyk has çäklidi (giňeldilen maglumatlar, 5e-j surat). T-hCO neýronlarynyň adamdan soňky neokortiki neýronlara funksional meňzeşligini ýa-da ýokdugyny anyklamak üçin, adamdan soňky korteksiň ýiti bölümlerinde elektrofiziologiki ýazgylary we adam L2 / 3 piramidal neýronlaryny anatomiki rekonstruksiýa etdik (giňeldilen maglumatlar, 7a surat). L2 / 3 piramidal neýronlaryň elektrofiziologiki aýratynlyklary t-hCO piramidal neýronlaryna meňzeýärdi (giňeldilen maglumatlar, 7e surat). Morfologiki taýdan, dogrumdan soňky adam nusgalaryndan L2 / 3 neýronlary t-hCO-a has meňzeýärdi, L2 / 3 öýjükleri has uzyn bolsa, umumy şahalary köp we oňurga dykyzlygy has ýokarydy (3g surat we giňeldilen maglumatlar, 7b- surat). G).
a, gözegçilik we TS hiPS öýjük çyzyklary bilen öndürilen hCO-ny neonatal alakalara geçirmek. b, 8 aý tapawutlandyrylandan soň biositin bilen doldurylan t-hCO neýronlaryny 3D rekonstruksiýa. c, orta dendrit uzynlygynyň mukdary (n = 19 gözegçilik neýronlary, n = 21 TS neýronlary; ** P = 0.0041). d, 8 aýlyk tapawutlandyryşda we TS t-hCO-dan 3D rekonstruksiýa edilen dendrit şahalary, we dendrit oňurga dykyzlygynyň mukdary (n = 16 gözegçilik neýronlary, n = 21 TS neýronlary, *** P <0.0001). d, 8 aýlyk tapawutlandyryşda we TS t-hCO-dan 3D rekonstruksiýa edilen dendrit şahalary, we dendrit oňurga dykyzlygynyň mukdary (n = 16 gözegçilik neýronlary, n = 21 TS neýronlary, *** P <0.0001). , d d, 8 aýlyk tapawutlandyryş we dendrit oňurga dykyzlygynyň mukdary boýunça gözegçilik we t-hCO TS-den dendrit şahalarynyň 3D rekonstruksiýasy (n = 16 gözegçilik neýronlary, n = 21 TS neýronlary, *** P <0.0001). d ，分化 8 个月时对照和 TS t-hCO 的 3D 重建树突分支，以及树突棘密度的量化（ n = 16 个对照神经元， n = 21 个 TS 神经元， *** P <0.0001 ）。 d ， 分化 8 个 时 s ts t-hco 的 3d 重建 分支 分支 = = = n = 16 个 神经 元 = n = 21 个 ts 神经 p *** p <0.0001 ）。 , d d, 8 aýlyk tapawutlandyryşda we dendrit oňurga dykyzlygynyň mukdarynda gözegçilik dendrit şahalarynyň we TS t-hCO-nyň 3D rekonstruksiýasy (n = 16 gözegçilik neýronlary, n = 21 TS neýronlary, *** P <0.0001).Gyzyl ýyldyzjyklar, dendrit keselini görkezýär. e, gözegçilikde özbaşdak EPSC we TS t-hCO neýronlary 8 aý tapawutlandan soň. f, jemlenen ýygylyk sýu ploteti we sinaptiki hadysalaryň ýygylygynyň we amplitudasynyň mukdary (n = 32 gözegçilik neýronlary, n = 26 TS neýronlary; ** P = 0.0076 we P = 0.8102). g, TS-iň Scholl derňewi we hCO we t-hCO-da neýronlara gözegçilik. Çyzylan çyzyklar deňeşdirmek üçin adam L2 / 3 postnatal piramidal neýronlary görkezýär (n = 24 gözegçilik t-hCO neýronlary, n = 21 TS t-hCO neýronlary, n = 8 gözegçilik hCO neýronlary we n = 7 TS hCO neýronlary). Maglumatlar ortaça ± standart gyşarma hökmünde aňladylýar
T-hCO-nyň adam korteks neýronlarynyň morfologiki we funksional aýratynlyklaryny ýokary derejede köpeltmek ukyby, t-hCO-nyň kesel fenotiplerini ýüze çykarmak üçin ulanylyp bilinjekdigini öwrenmäge itergi berdi. Neýronlarda işjeňlige bagly gen transkripsiýasyny başlaýan CaV1.2 gen kodlaýyş funksiýasynyň üýtgemegi netijesinde ýüze çykýan agyr neýro-ösüş bozulmasy TS-e ünsi jemledik. Iň köp ýaýran çalyşma (p.G406R) we üç gözegçilik (3a surat) göterýän üç TS hassasyndan hCO aldyk. Transplantasiýa geçirilenden soň, esasy dendritleriň sany iki esse köpeldi we dendrit uzynlygynyň ortaça we umumy azalmagy bilen (3-nji surat we giňeldilen maglumatlar, 8-nji surat) TS neýronlarynda gözegçilik (3b surat we giňeldilen maglumatlar, 8a surat, b) bilen deňeşdirilende üýtgedilendigini gördük. Bu oňurgalaryň dykyzlygynyň ýokarlanmagy we gözegçilik neýronlary bilen deňeşdirilende TS-de öz-özünden EPSC-leriň ýygylygynyň ýokarlanmagy bilen baglanyşyklydy (3d - f we giňeldilen maglumatlar, 8g surat). Goşmaça derňewler, gözegçilikler bilen deňeşdirilende t-hCO TS-de adaty bolmadyk dendrit şahasynyň nagyşlaryny ýüze çykardy, ýöne şuňa meňzeş tapawutlandyryş tapgyrynda vitro TS hCO-da däl (3g surat). Bu, TS-de işjeňlige bagly dendritiň gysylmagy baradaky öňki habarlarymyza gabat gelýär we bu transplantasiýa platformasynyň wivo kesel fenotiplerini ýüze çykarmak ukybyny görkezýär.
Soňra t-hCO öýjükleriniň S1 syçanjygyna nä derejede işleýändigini soradyk. Gemrijilerdäki S1 ipsilatar ventral bazal we yzky talam ýadrolaryndan güýçli sinaptiki girişleri, şeýle hem ipsilatar hereketlendiriji we ikinji derejeli somatosensor korteksleri we gapma-garşylykly S1 alýar (4a surat). Düwürtik görnüşini dikeltmek üçin hCO-ny guduz wirusy-dG-GFP / AAV-G ýokaşdyrdyk we 3 günden soň HCO-ny S1 syçanjygyna geçirdik. Transplantasiýadan 7–14 gün soň ipsilatar S1 we ventral bazal ganglýanyň neýronlarynda dykyz GFP aňlatmasyny gördük (4b surat, c). Mundan başga-da, talam marker netrin G1-iň antikor boýagy t-hCO-da talamiki uçlaryň bardygyny ýüze çykardy (4d surat, e). Bu afferent çaklamalaryň t-hCO öýjüklerinde sinaptiki jogaplary döredip biljekdigine baha bermek üçin, talamokortiki gatlagyň ýiti bölümlerinde adam öýjüklerinden tutuş öýjük ýazgylaryny ýerine ýetirdik. Düwürtik S1-iň elektrik gyjyndyrmasy, içki kapsulalar, ak maddalar, t-hCO-nyň golaýyndaky süýümler ýa-da AMPA reseptor antagonisti NBQX-e sezewar bolan t-hCO neýronlarynda opsini aňladýan talamiki uçlaryň optogenetiki işjeňleşdirilmegi. (4f surat, g we giňeldilen maglumatlar, 9a - g). Bu maglumatlar, t-hCO-nyň syçanyň beýnisine anatomiki taýdan goşulandygyny we syçanjygyň dokumasy bilen işjeňleşip biljekdigini görkezýär.
a, Guduzlama yzarlaýyş synagynyň shemasy. b, GFP we t-hCO bilen syçanyň beýni korteksiniň (ýokarky panel) arasyndaky adama mahsus STEM121 aňlatmasy. Şeýle hem, syçanyň ipsilatar ventral bazal ýadrosynda (VB) (aşaky çepde) we ipsilatar S1 (aşaky sagda) GFP aňlatmasy görkezilýär. Tereziniň çyzgysy, 50 µm. Gyzyl kwadratlar beýniniň şekilleriň alnan ýerlerini görkezýär. c, GFP-ni aňladýan öýjükleriň mukdary (n = 4 syçan). d, e - t-hCO-da Netrin G1 + talam terminallary. d t-hCO we VB ýadrolaryny öz içine alýan koronal bölümi görkezýär. Tereziniň çyzgysy, 2 mm. e Net-G1 we STEM121 aňlatmalaryny t-hCO (çepde) we VB (sag) neýronlarda görkezýär. Tereziniň çyzgysy, 50 µm. Mämişi punktir çyzyk t-hCO serhedini görkezýär. f, g, S1 rat (f) ýa-da içki kapsulada (g) elektrik gyjyndyrmasyndan soň (gyrmyzy) ýa-da (gara) NBQX (çepde) t-hCO neýronlarynyň häzirki yzlary. NBQX (n = 6 S1 neýron, * P = 0.0119; we n = 6 içki kapsulanyň neýronlary, ** P = 0.0022) (ortada) EPSC amplitudalary. Syçanyň S1 (f) ýa-da içki kapsulanyň (g) (sagda) elektrik gyjyndyrmasy hökmünde EPSC görkezýän t-hCO neýronlarynyň göterimi. aCSF, emeli serebrospinal suwuklyk. h, 2P şekillendiriş synagynyň shemasy (çepde). GCaMP6-laryň t-hCO-da (ortada) beýany. Tereziniň çyzgysy, 100 µm. GCaMP6-laryň floresan wagty (sagda). i, öz-özünden işjeňlik floresanlygynyň Z-bal. j, murt gyjyndyrmasynyň shematiki şekili. k, z-ball 2P floresan traýektoriýalary, mysal üçin öýjüklerde nol (çyzykly çyzyk) wagtynda pyşyrdanyň gyşarmagy bilen deňleşýär. l, nol (çyzykly çyzyk) (gyzyl) ýa-da tötänleýin döredilen wagt bellikleri (çal) wagtynda pyşyrdanyň gyşarmagy bilen deňleşdirilen ähli öýjükleriň ortaça z-bal jogaplary. m. Optiki bellikde synagyň shemasy. n, gök lazeriň gyjyndyrylmagy ýa-da pyşyrdyň gaçmagy wagtynda t-hCO öýjüginden çig naprýa .eniýe egrileri. Gyzyl oklar ýagtylygyň (ýokarda) ýa-da pyşyrdyň gaçmagy netijesinde (aşaky) ilkinji tüpeňleri görkezýär. Çal reňk, pyşyrdyň gaçýan döwürlerini görkezýär. o, Peak ýeňil tolkun formalary we pyşyrdyk deflýasiýa jogaplary. p, mysalyň öýjüklerindäki pyçaklaryň gyşarmasy bilen sazlanan ýekeje synanyşyk. 0 pyşyrdanyň gyşarmagyny görkezýär (çyzylan çyzyk). q, nol (çyzykly) (gyzyl) ýa-da tötänleýin döredilen wagt bellikleri (çal) bilen pyşyrdyň gyşarmagy bilen sazlanan ähli fotosensiw öýjükler üçin ortaça z-ball atyş derejesi. r, Pyşyrdyň gyşarmagy (n = 3 syçan) (çepde) ep-esli modulirlenen fotosensiw birlikleriň paýy. Iň ýokary z-ball gijikdirilişi (n = 3 syçan; n = 5 (açyk ýaşyl), n = 4 (goýy ýaşyl), we n = 4 (sian) pyşyrdanyň deflýasiýa modulýasiýa birligi) (sagda). Maglumatlar ortaça ± standart gyşarma hökmünde aňladylýar
Soňra t-hCO-ny wivo-de duýgur gyjyndyrmalar bilen işjeňleşdirip boljakdygyny soradyk. Genetiki kodlanan kalsiý görkezijilerini GCaMP6-ny S1 syçanjygyna görkezýän hCO-ny göçürdik. 150 günden soň süýümli fotometriýa ýa-da iki fotonly kalsiý şekillendirişini etdik (4-nji surat we giňeldilen maglumatlar, 10a surat). T-hCO öýjükleriniň sinhron ritmiki işjeňligini görkezýändigine göz ýetirdik (4i surat, giňeldilen maglumatlar, 10b surat we goşmaça wideo 1). Iň ýokary t-hCO işjeňligini häsiýetlendirmek üçin, anestizirlenen transplantasiýa syçanlarynda öýjükden daşary elektrofiziologiki ýazgylary etdik (giňeldilen maglumatlar, 10c-f surat). MRI şekillerinden stereotaksiki koordinatlary döretdik; Şeýlelik bilen, bu ýazylan bölümler adam neýronlaryny aňladýar, ýöne diňe elektrofiziologiýa gelip çykyş görnüşleriniň kesgitlenmegine rugsat bermeýär. Sinhronlaşdyrylan işjeňliklere syn etdik (giňeldilen maglumatlar, 10-njy surat). Partlamalar takmynan 460 ms dowam edip, takmynan 2 s dymmak döwri bilen bölünipdi (giňeldilen maglumatlar, 10d surat, e). Aýry-aýry bölümler partlama üçin ortaça üç gezek ok atdy, bu partlama üçin hasaba alnan bölümleriň takmynan 73% -ini düzýär. Aýry-aýry bölümleriň işi ýokary baglanyşykda bolup, bu baglanyşyklar sanjym edilmedik haýwanlarda şol bir şertlerde hasaba alnan bölümlerden has ýokarydy (giňeldilen maglumatlar, 10f surat). Adamdan alnan neýronlaryň ýokary seslenmelerini has-da häsiýetlendirmek üçin, gök ýagtylyk stimullaryna jogap hökmünde t-hCO neýronlarynyň gysga möhletli tanalmagy (10 m-den az) hCO bilen göçürilen anestizirlenen syçanlarda ýeňil bellik synaglaryny geçirdik (4m - o). t-hCO neýronlary, kalsiý şekillendirişine meňzeş ýygylyklarda öz-özünden işjeňligi, şeýle hem t-hCO-da ýagtylyk belgisi bolmadyk ýagdaýynda ýerine ýetirilen elektrofiziologiki ýazgylary görkezdi (giňeldilen maglumatlar, 10c-g surat). Witroda ýazylan hCO-nyň degişli tapgyrlarynda öz-özünden işjeňlik bolmady. T-hCO-ny duýgur gyjyndyrmalar bilen işjeňleşdirip boljakdygyny kesgitlemek üçin, gysga wagtyň içinde syçanyň pyçaklaryny t-hCO-dan uzaklaşdyrdyk (4j-nji surat, m we giňeldilen maglumatlar, 10-njy surat, k). Öňki gözlegleriň 8,10-a görä, t-hCO öýjükleriniň bir bölegi pyşyrdyň deflýasiýasyna jogap hökmünde işjeňligi ýokarlandyrdy, maglumatlar tötänleýin wagt markalary bilen deňeşdirilende syn edilmedi (4k - q surat we giňeldilen maglumatlar, 10h - q). Hakykatdanam, opto belgili ýeke birlikleriň takmynan 54% -i pyşyrdy gyjyndyrmasyndan soň takmynan 650 ms ýokary derejä ýetdi (4r-nji surat). Bu maglumatlar bilelikde alnanda, t-hCO-nyň degişli funksional girişleri alýandygyny we daşky gurşaw stimullary arkaly işjeňleşdirilip bilinjekdigini görkezýär.
Soňra t-hCO-nyň özüni alyp barşyna gözegçilik etmek üçin syçanlarda zynjyrlary işjeňleşdirip biljekdigini anykladyk. Ilki bilen t-hCO neýronlarynyň aksonlarynyň syçanyň daş dokumalaryna proýekt edýändigini ýa-da ýokdugyny anykladyk. HCO-ny EYFP (hChR2-EYFP) birleşdirilen mekgejöwen kodlaýjy hChR2 bilen ýokaşdyrdyk. 110 günden soň, eşidiş, motor we somatosensor korteksleri, şeýle hem striatum, gippokamp we talamus ýaly subkortikal sebitlerde EYFP aňlatmasyny gördük (5a surat). Bu täsirli proýeksiýalaryň syçan öýjüklerinde sinaptiki jogaplary döredip biljekdigini ýa-da ýokdugyny kesgitlemek üçin, hChR2-EYFP-ni aňladýan t-hCO öýjüklerini beýniniň ýiti bölümlerinde syçanyň beýni korteks öýjüklerini ýazga geçirip optiki işjeňleşdirdik. NBQX (5b - g suratlar) tarapyndan petiklenen syçanyň piramidal korteks neýronlarynda gök yşyk bilen t-hCO aksonlarynyň işjeňleşdirilmegi. Mundan başga-da, bu jogaplar tetrodotoksin (TTX) bilen ýapylyp, monosinaptiki baglanyşyklar sebäpli ýüze çykandygyny görkezýän 4-aminopiridin (4-AP) bilen dikeldilip bilner (5e-nji surat).
a, akson yzarlamagyň shemasy (çepde). t-hCO EYFP aňlatmasy (sagda). Tereziniň çyzgysy, 100 µm. A1, eşidiş korteksi, ACC, öňdäki kingulatasiýa korteks, d. striatum, dorsal striatum, HPC, gippokampus; Diafragma, gapdal septum, mPFC, orta prefrontal korteks, piri, piriform korteks, striatum, ventral striatum, VPM, talamusyň ventropostomedial ýadrosy, VTA, ventral tegmental sebiti. Gyzyl kwadratlar beýniniň şekilleriň alnan ýerlerini görkezýär. b, höweslendiriş synagynyň shemasy. c, d, Adam (c) EYFP + t-hCO ýa-da syçan (d) EYFP- öýjüklerinde gök ýagtylyk bilen öçürilen fotokurrentiň (ýokarky) we naprýatageeniýeniň (aşaky) täsirine mysallar. e, f, TTX we 4-AR (ýaşyl), TTX (çal) ýa-da aCSF (gara) (e), (gyrmyzy) ýa-da (gara)) NBQX (e) bilen t-hCO aksonlarynyň gök ýagtylyk gyjyndyrmasyndan soň syçan neýronlarynyň häzirki yzlary. g, syçanyň öýjüklerinde (n = 16 öýjük) gök yşyk bilen döredilen jogaplaryň gijä galmagy; keseligine çyzyklar ortaça gijä galmagy görkezýär (7.13 ms) (çepde). NBQX (n = 7 öýjük; *** P <0.0001) (ortada) bilen ýazylan ýa-da bolmazdan ýazylan ýagtylykly EPSC amplitudasy. NBQX (n = 7 öýjük; *** P <0.0001) (ortada) bilen ýazylan ýa-da bolmazdan ýazylan ýagtylykly EPSC amplitudasy. Амплитуда в лавванных светом EPSC, марегистрированных с или ди NBQX (n = 7 клеток; *** P <0,0001) (в центре). NBQX (n = 7 öýjük; *** P <0.0001) (ortada) bilen ýazylan ýa-da bolmazdan ýazylan yşyklandyryjy EPSC amplitudasy.使用或不使用 NBQX 记录的光诱发 EPSC 的振幅（ n = 7 个细胞； *** P <0.0001 ）（中）。使用或不使用 NBQX 记录的光诱发 EPSC 的振幅（ n = 7 个细胞； *** P <0.0001 ）（中）。 Амплитуда в лавванных светом EPSC, марегистрированных с или ди NBQX (n = 7 клеток; *** P <0,0001) (в центре). NBQX (n = 7 öýjük; *** P <0.0001) (ortada) bilen ýazylan ýa-da bolmazdan ýazylan yşyklandyryjy EPSC amplitudasy.Gök ýagtylyga (sagda) jogap berýän EPSC-leri görkezýän syçan öýjükleriniň göterimi. h, özüni alyp baryş meselesiniň shemasy. d0, 0-njy gün. Mysal üçin haýwanlaryň 1-nji (çepde) ýa-da 15-nji gün (sagda) okuwy. 1-nji (çepde) ýa-da 15-nji gün (sag merkezde) (n = 150 gök çyra synaglary, n = 150 gyzyl yşyk synaglary; *** P <0.0001) ýerine ýetirilen ortaça sany. 1-nji (çepde) ýa-da 15-nji gün (sag merkezde) (n = 150 gök çyra synaglary, n = 150 gyzyl yşyk synaglary; *** P <0.0001) ýerine ýetirilen ortaça sany. Среднее количесто облизываний, выполненных в день 1 (слева) или день 15 (в центре справа) (n = 150 испытаний с синим светом, n = 150 испытаний с красным светом; *** P <0,0001). 1-nji (çepde) ýa-da 15-nji gün (ortada sagda) ýerine ýetirilen ortaça sany (n = 150 gök çyra synaglary, n = 150 gyzyl çyra synaglary; *** P <0.0001).第 1 天（左）或第 15 天（右中）执行的平均舔次数（ n = 150 次蓝光试验， n = 150 次红光试验； *** P <0.0001 ）。第 1 天（左）或第 15 天（右中）执行的平均舔次数（ n = 150 次蓝光试验， n = 150 次红光试验； *** P <0,001 Среднее количесто облизываний, выполненных в день 1 (слева) или день 15 (в центре справа) (n = 150 испытаний с синим светом, n = 150 испытаний с красным светом; *** P <0,0001). 1-nji (çepde) ýa-da 15-nji gün (ortada sagda) ýerine ýetirilen ortaça sany (n = 150 gök çyra synaglary, n = 150 gyzyl çyra synaglary; *** P <0.0001).Gyzyl we gök açyk synaglar üçin 1-nji gün (ortada çep) ýa-da 15-nji gün (sagda) jemlenýär. NS, möhüm däl. j, k, 1-nji ýa-da 15-nji günde hChR2-EYFP (j) ýa-da gözegçilik floroforyny (k) aňladýan t-hCO bilen göçürilen ähli haýwanlaryň özüni alyp barş aýratynlyklary (hChR2-EYFP: n = 9 syçan, ** P = 0.0049; gözegçilik: n = 9, P = 0.1497). l, ileri tutulýan balyň ewolýusiýasy (n = 9 hChR2, n = 9 gözegçilik; ** P <0,001, *** P <0.0001). l, ileri tutulýan balyň ewolýusiýasy (n = 9 hChR2, n = 9 gözegçilik; ** P <0,001, *** P <0.0001). , l, ileri tutulýan balyň ewolýusiýasy (n = 9 hChR2, n = 9 dolandyryş; ** P <0,001, *** P <0.0001). l ，偏好评分的演变（ n = 9 hChR2 ， n = 9 对照； ** P <0,001 ， *** P <0.0001 ）。 l ，偏好评分的演变（ n = 9 hChR2 ， n = 9 对照； ** P <0,001 ， *** P <0.0001 ）。 , l, ileri tutulýan ballaryň ewolýusiýasy (n = 9 hChR2, n = 9 dolandyryş; ** P <0,001, *** P <0.0001).m, S1-de t-hCO-nyň optogenetiki işjeňleşmegine jogap hökmünde FOS aňlatmasy. FOS aňlatmasy (çepde) we mukdary (topar üçin n = 3; * P <0.05, ** P <0.01 we *** P <0,001) (sagda) suratlar görkezilýär. FOS aňlatmasy (çepde) we mukdary (topar üçin n = 3; * P <0.05, ** P <0.01 we *** P <0,001) (sagda) suratlar görkezilýär. Показнан изображения Кресрессии FOS (слева) һәм количественного определения (n = 3 на группу; * P <0,05, ** P <0,01 и *** P <0,001) (справа). FOS aňlatmasy (çepde) we mukdary (topar üçin n = 3; * P <0.05, ** P <0.01, we *** P <0,001) şekilleri görkezilýär (sagda).显示了 FOS 表达（左）和量化（每组 n = 3 ； * P <0.05 、 ** P <0.01 和 *** P <0,001 ）（右）的图像。显示了 FOS 表达（左）和量化（每组 n = 3 ； * P <0.05 、 ** P <0.01 和 *** P <0,001 ）（右）的图像。 Показнан изображения Кресрессии FOS (слева) һәм количественного определения (n = 3 на группу; * P <0,05, ** P <0,01 и *** P <0,001) (справа). FOS aňlatmasy (çepde) we mukdary (topar üçin n = 3; * P <0.05, ** P <0.01, we *** P <0,001) şekilleri görkezilýär (sagda).Tereziniň çyzgysy, 100 µm. Maglumatlar BLA-nyň ortaça ± adaty ýalňyşlygy, esasy tonzil, MDT, dorsomedial talam ýadrosy, PAG, periaqueductal çal görnüşinde aňladylýar.
Ahyrynda, t-hCO syçanyň özüni alyp barşyny modulirläp bilermi diýip soradyk. Muny barlamak üçin hChR2-EYFP-aňlatýan hCO-ny S1-e göçürdik we 90 günden soň optiki süýümleri ýagtylyk üçin t-hCO-a ýerleşdirdik. Soňra syçanlary üýtgedilen operatiw kondisioner paradigmasy bilen taýýarladyk (5-nji surat). Haýwanlary özüni alyp baryş synag kamerasyna ýerleşdirdik we tötänleýin 5 sekunt gök (473 nm) we gyzyl (635 nm) lazer stimullaryny tötänleýin ulandyk. Haýwanlar gök çyra gyjyndyrmasy wagtynda ýalan bolsa, ýöne gyzyl çyranyň gyjyndyrylmagy wagtynda ýalanmasa suw baýragyny alardy. Okuwyň ilkinji gününde haýwanlar gök ýa-da gyzyl yşyk bilen gyjyndyrylanda ýalamakda hiç hili tapawut görkezmediler. Şeýle-de bolsa, 15-nji günde hChR2-EYFP aňladýan hCO bilen göçürilen haýwanlar, gyzyl yşyk stimulýasiýasy bilen deňeşdirilende gök yşyk bilen gyjyndyrylanda has işjeň ýalandygyny görkezdi. Ylalamak häsiýetindäki bu üýtgeşmeler, gözegçilik floroforyny aňladýan hCO bilen göçürilen haýwanlarda gözegçilik edilmedi (okuwyň üstünlik derejesi: hChR2 89%, EYFP 0%, 5i-1 surat we goşmaça wideo 2). Bu maglumatlar, t-hCO öýjükleriniň sylag gözleýän gylyk-häsiýeti höweslendirmek üçin syçan neýronlaryny işjeňleşdirip biljekdigini görkezýär. Bu häsiýet üýtgemelerine haýsy syçanyň t-hCO nerw zynjyrlarynyň gatnaşyp biljekdigini bilmek üçin, 90 minutdan soň tälim alýan haýwanlarda we ýygnan dokumalarda t-hCO optogenetiki taýdan işjeňleşdirdik. Immunohistohimiýa, hereketsiz hereketlere gatnaşýan birnäçe beýniniň sebitlerinde, şol sanda gözegçilik edilmedik gözegçilik haýwanlarynda ýa-da haýwanlarda ýüze çykýan orta prefrontal korteks, medial talamus we periaqueductal çal madda ýaly işjeňlige bagly FOS belogynyň ýüze çykarylyşyny ýüze çykardy. tüwi. 5m). Bu maglumatlar bilelikde alnanda, t-hCO-nyň özüni alyp barşyny herekete getirmek üçin syçanyň neýron işjeňligini modulirläp biljekdigini görkezýär.
Nerw organoidleri vitro ösüşinde adamyň ösüşini we keselini öwrenmek üçin geljegi uly ulgamy aňladýar, ýöne wivo bar bolan zynjyrlaryň arasynda baglanyşyk ýoklugy bilen çäklenýär. Adam öýjüginiň ösüşini we “vivo” -de işlemegini öwrenmek üçin hCO-ny immunokompromirlenen irki dogrumdan soňky syçanlaryň S1-e geçirdik. T-hCO-nyň vitro28-de görülmedik ýetişen öýjük görnüşlerini ösdürýändigini we t-hCO-nyň gemrijileriň beýnisine anatomiki we funksional taýdan goşulandygyny görkezdik. T-hCO-nyň gemriji nerw zynjyrlaryna birleşmegi, adam öýjükli işjeňligi bilen haýwanlaryň özüni alyp barşyny öwrenip, t-hCO neýronlarynyň özüni alyp barşyna jogap bermek üçin syçanyň neýron işjeňligini modulirläp biljekdigini görkezip, baglanyşyk gurmaga mümkinçilik berdi.
Biziň beýan edýän platformamyz, adam öýjüklerini gemrijiler beýnisine geçirmek boýunça geçirilen öňki gözleglerden birnäçe artykmaçlyga eýedir. Ilki bilen, anatomiki we funksional birleşmegi ýeňilleşdirip biljek irki dogrumdan soňky alakalaryň ösýän korteksine hCO göçürdik. Ikinjiden, t-hCO MRI gözegçiligi, uzak möhletli köp haýwan gözleglerini geçirmäge we birnäçe hiPS öýjük liniýalarynyň ygtybarlylygyny kesgitlemäge mümkinçilik berýän diri haýwanlaryň gornuş ýagdaýyny we ösüşini öwrenmäge mümkinçilik berdi. Ahyrynda, adam öýjüklerine az zyýan berýän we adam korteks neýronlarynyň syçanyň beýnisine birleşmegine we döremegine kömek edip biljek izolirlenen bir öýjükli süspansiýany däl-de, bitewi organoidleri göçürdik.
Bu platformadaky öňegidişliklere garamazdan, wagtlaýyn, giňişlik we dürli görnüşli çäklendirmeler ösüşiň irki döwründe göçürilenden soň hem ýokary wepalylyk bilen adam nerw zynjyrlarynyň döremeginiň öňüni alýarys. Mysal üçin, t-hCO-da syn edilýän öz-özünden hereketiň kortikal ösüş döwründe syn edilýän ritmiki işjeňlige meňzeş ösüş fenotipini aňladýandygy ýa-da t-hCO-da bar bolan basyş ediji öýjük görnüşleriniň ýoklugy bilen baglanyşykly däl. Şonuň ýaly-da, t-hCO-da laminasiýanyň ýoklugynyň zynjyr birikmesine nä derejede täsir edýändigi belli däl30. Geljekki işler, adam mikrogliýasy, adam endotel öýjükleri we beýleki GABAergic interneuronlarynyň vitroda 6 gurnama ulanylyşy ýaly dürli görnüşleri birleşdirmäge, üýtgän t-hCO-da nerw integrasiýasynyň we gaýtadan işlenişiniň bolup biljekdigine düşünmäge gönükdiriler. näsaglardan alnan öýjüklerde transkripsiýa, sinaptiki we özüni alyp baryş derejeleri.
Umuman aýdanyňda, bu “vivo” platformasy adam beýnisiniň ösüşini we kesel gözleglerini dolduryp biljek güýçli çeşmäni aňladýar. Bu platforma, başgaça näsaglardan emele gelen öýjüklerde täze derejeli fenotipleri tapmaga we täze bejeriş strategiýalaryny synagdan geçirmäge mümkinçilik berer diýip garaşýarys.
Öň düşündirilişi ýaly HiPS öýjüklerinden hCO2.5 öndürdik. Iýmitlendiriji gatlaklarda ösdürilip ýetişdirilen hiPS öýjüklerinden hCO önümçiligini ýola goýmak üçin, hiPS öýjükleriniň bitewi koloniýalary dispase (0,35 mg / mL) ulanyp, medeni tagamlardan aýryldy we hiPS öýjük medeniýeti bolan gap-gaçlary öz içine alýan aşa pes plastmassa medeniýetlerine geçirildi. (Corning) iki sany SMAD inhibitory dorsomorfin (5 μM; P5499, Sigma-Aldrih) we SB-431542 (10 μM; 1614, Tokris) we ROCK inhibitory Y-27632 (10 μM; S1049, Selleckchem) bilen üsti ýetirildi. Ilkinji 5 günüň dowamynda hiPS öýjük serişdesi her gün üýtgedildi we dorsomorfin we SB-431542 goşuldy. Asmanyň altynjy gününde neýrobasal-A (10888, Durmuş tehnologiýalary), B-27 goşundysy bolan A-witamin (12587, Durmuş tehnologiýalary), GlutaMax (1: 100, Durmuş tehnologiýalary), penisillin we streptomisin (1: 100, Durmuş tehnologiýalary) we nerw ösümligi ösýär; 24-nji güne çenli. Asmanyň altynjy gününde neýrobasal-A (10888, Durmuş tehnologiýalary), B-27 goşundysy bolan A-witamin (12587, Durmuş tehnologiýalary), GlutaMax (1: 100, Durmuş tehnologiýalary), penisillin we streptomisin (1: 100, Durmuş tehnologiýalary) we nerw ösümligi ösýär; 24-nji güne çenli.Asmanyň altynjy gününde nerw sferoidleri Neurobasal-A (10888, Life Technologies), A witamini (B 12587, Life Technologies), GlutaMax (1: 100, Life Technologies), penisillini öz içine alýan nerw gurşawyna geçirildi.и ст кромомицин (1: 100, Life Technologies) и дополнены эпидер конным ромом роста (EGF; 20 нг / г; we streptomisin (1: 100, Durmuş tehnologiýalary) we epidermal ösüş faktory (EGF; 20 ng / ml; R&D Systems) we fibroblast ösüş faktory 2 (FGF2; 20 ng / ml; R&D Systems) bilen doldurylýar.25-den 42-nji güne çenli beýniden emele gelen neýrotrofiki faktor (BDNF; 20 ng ml-1, Peprotech) we neýrotrofin 3 (NT3; 20 ng ml-1, Peprotech) ortaça goşuldy, gurşawy her gün üýtgedýärdi.8Oba ob 的 第 第 天 含有 含有 含有 含有 含有 含有 含有 含有 ob 含有 88 ob ob 88 88 88 88 88 88 88 88 88 88 88 88-----8-8 8 8 8 8 8 8 8 8 8 8 8 8 （（（ 20 ng ml-1 ； r & d ulgamlary） 成 纤维 细胞 生长 2 （fgf2 ； 20 ng ml- 1 ； R&D ulgamlary ）直至第 24 天。 На 6-й день суспензии ацросферы были переведены на добавку, содержащую надробазал-А (10888, Durmuş tehnologiýalary), добавку В-27 витамина А (12587, Durmuş Tehnologiýalary), GlutaMax (1: 100, Durmuş Tehnologiýalary) . 6-njy gün neýrosfera süspansiýalary neýrobazal-A (10888, Durmuş tehnologiýalary), A witamini (B 12587, Durmuş tehnologiýalary), GlutaMax (1: 100, Durmuş tehnologiýalary), penisillini zyýansyzlandyrýan streptomisin (1: 100, Durmuş tehnologiýalary) epidermal ösüş faktory (2 EGF) ösýär; (FGF2; 20 ng ml-1) 1; Gözleg we gözleg ulgamlary) 24-нче дня. R&D ulgamlary) 24-nji güne çenli.25-den 42-nji güne çenli beýniden alnan neýrotrofiki faktor (BDNF; 20 ng ml-1, Peprotech) we neýrotrofiki faktor 3 (NT3; 20 ng ml-1, Peprotech) her gün medeniýet gurşawyna goşuldy. Orta bir gezek üýtgeýär.43-nji günden başlap, hCO 4-6 günden bir gezek üýtgäp durýan neýrobazal-A gurşawynda (NM; 1088022, Termo Fişer) saklandy. Iýmitlenmeýän şertlerde ösdürilip ýetişdirilen hiPS öýjüklerinden hCO almak üçin, hiPS öýjükleri Accutase (AT-104, Öýjük tehnologiýalaryny täzeläň) 37 ° C-de 7 minutlap inkubasiýa edildi, bir öýjüklere bölünip, AggreWell 800 plastinka (34815, STEMCELL Technologies) dykyzlygynda 3 × 106 ýeke öýjük, Essential ROCK 10 YK-da 10 × 106 ýekeje öýjükde goýuldy; Selleckchem). 24 sagatdan soň guýulardaky metbugat dorsomorfin (2,5 μM; P5499, Sigma-Aldrih) we SB-431542 (10 μM; 1614) bilen doldurylan Essential 6 media (A1516401, Life Technologies) öz içine alýan mediýa iberildi. , Tokrida). 2-nji günden 6-njy güne çenli Essential 6 serişdesi her gün dorsomorfin bilen çalşylýar we SB-431542 goşundysy bolýar. Altynjy günden başlap, neýrosfera süspansiýalary neýrobazal gurşawyna geçirildi we ýokarda görkezilişi ýaly saklandy.
Animalhli haýwan amallary, Stenford uniwersitetiniň laboratoriýa haýwanlara ideg dolandyryş komiteti (APLAC) tarapyndan tassyklanan haýwanlara ideg görkezmelerine laýyklykda geçirildi. Göwreli eýtimiki RNU (rnu / +) syçanlar satyn alyndy (Çarlz derýasynyň barlaghanalary) ýa-da ýerleşdirildi. Haýwanlar iýmit we suw mahabaty bilen 12 sagatlyk garaňky aýlawda saklandy. -Alaňaç (FOXN1 - / -) üç-ýedi gün aralygyndaky syçan çagalary, kesilmezden ozal ýetişmedik pyçaklaryň köpelmegi bilen kesgitlenildi. Güýjükler (erkek we aýal) 2-3% izofluran bilen anestizasiýa edildi we stereotaksiki çarçuwada ýerleşdirildi. Dura materiniň bitewiligini saklamak bilen, S1-den takmynan 2-3 mm diametri bolan kelläniň gysylmagy amala aşyryldy. Soňra dura deşmek üçin kraniotomiýanyň daşynda 30-G iňňe (takmynan 0,3 mm) ulanyň. Soňra HCO-ny inçe 3 × 3 sm parafilm bilen çalyň we artykmaç serişdäni aýyryň. 23 G, 45 ° iňňe dakylýan Hamilton şprisini ulanyp, iňňäniň iň uzak ujuna hCO-ny ýuwaşlyk bilen çekiň. Soňra şpris stereotaksiki enjama birikdirilen şpris nasosyna guruň. Soňra iňňäniň ujuny dura (z = 0 mm) öň 0,3 mm giňlikdäki deşik deşiginiň üstünde goýuň we iňňäni dura materiniň arasynda bolýança iňňe 1-2 mm (z = takmynan –1.5 mm) daralyň, dykyz möhür emele gelýär. Soňra şprisi kortikal üstüň merkezine z = -0.5 mm çenli galdyryň we minutda 1-2 µl tizlik bilen hCO sanjym ediň. HCO sanjymy gutarandan soň, iňňe minutda 0,2-0,5 mm tizlik bilen yza çekilýär, derisi tikilýär we güjük doly dikelýänçä derrew ýyly ýyladyş paneline ýerleşdirilýär. Käbir haýwanlar ikitaraplaýyn göçürildi.
Animalhli haýwan amallary, Stenford uniwersiteti APLAC tarapyndan tassyklanan haýwanlara ideg görkezmelerine laýyklykda geçirildi. Alakalar (transplantasiýadan 60 günden gowrak) 5% izofluran anestezi bilen ýüze çykaryldy we surata düşürilende 1-3% izofluran bilen anestizasiýa edildi. Görkezmek üçin, halkara elektrik kompaniýasy (IECO) gradient sürüjisi bilen 7 sany Tesla işjeň goragly gorizontal çukur skaneri Bruker (Bruker Corp.), AVANCE ulanyp, içki diametri 120 mm (600 mT / m, 1000 T / m / s) goragly gradient goýumy ulanyldy. III, sekiz kanally köp rulonly RF we köp ýadroly mümkinçilikler we oňa goşulan Paravision 6.0.1 platformasy. Ordingazgy, içerki diametri 86 mm bolan işjeň bölünen göwrümli RF rulony we diňe almak üçin dört kanally krio-sowadylan RF rulony bilen ýerine ýetirildi. Axial 2D Turbo-RARE (gaýtalama wagty = 2500 ms, eho wagty = 33 ms, ortaça 2) 16 dilim surata düşürilen, 256 × 256 nusga bolan dilimiň galyňlygy 0,6–0,8 mm. Signallar içerki diametri 2 sm bolan kwadratura geçiriji göwrümli RF rulonynyň kömegi bilen alyndy (Rapid MR International, LLC). Ahyrynda, 3D görkezmek we ses derňewi üçin gurlan Imaris (BitPlane) ýerüsti bahalandyryş funksiýalaryny ulanyň. Üstünlikli göçürme, göçürilen ýarym şarda üznüksiz T2 agramly MRI signalynyň dörän ýerleri hökmünde kesgitlenildi. Graftdan ýüz öwürmek, göçürilen ýarym şarda T2 agramly MRI signalynyň ýerlerini öndürmeýän grafika hökmünde kesgitlenildi. Subkortikal t-hCO indiki derňewden aýryldy.
Iki fotonly kalsiý şekillendirişi üçin GCaMP6-lary durnukly aňlatmak üçin hiPS öýjüklerine pLV [Exp] -EF1a :: GcaMP6s-WPRE-Puro ýokaşdy, soň bolsa antibiotikler saýlandy. Gysgaça, öýjükler EDTA bilen bölünip, polibren (5 μg / ml) we 15 μl wirus bar bolan takmynan 300,000 öýjük dykyzlygynda 1 ml Essential 8 gurşawynda saklandy. Öýjükler 60 minutlap asma ýagdaýda saklandy we her guýyda 50,000 öýjük dykyzlygynda tohumlandy. Birleşenden soň, öýjükler 5-10 günüň dowamynda ýa-da durnukly koloniýalar ýüze çykýança 5-10 μg ml-1 puromisin bilen bejerildi. Uteiti hCO ýokaşmasy käbir üýtgeşmeler bilen öň beýan edilişi ýaly geçirildi. Gysgaça, 30-45 hCO gününi 100 ml nerw gurşawyny öz içine alýan 1,5 ml Eppendorf mikrosentrifuge turbalaryna geçiriň. Soňra takmynan 90 µl serişdesi aýrylýar, turba 3-6 µl ýokary derejeli ysly wirus (0,5 x 108-den 1,2 x 109) goşulýar we hCO 30 minutlap inkubatorda geçirilýär. Soňra her turba 90–100 µl orta goşuň we turbalary bir gije inkubatorda gaýtaryň. Ertesi gün, pes birikdirilen tabaklarda hCO-ny täze nerw gurşawyna geçiriň. 7 günden soň, hCO infeksiýanyň hilini görmek we bahalandyrmak üçin 24 guýy aýna aşaky plitalara geçirildi. pLV [Exp] -SYN1 :: EYFP-WPRE we pLV [Exp] -SYN1 :: hChR2-EYFP-WPRE VectorBuilder tarapyndan döredildi. Lentivirus, synaglaryň köpüsinde ulanylýar, sebäbi ýokaşan öýjük setirlerinde habarçy genini görkezmäge mümkinçilik berýän genom bilen birleşdirilýär. Guduzlamany yzarlamak üçin 30-45 gün hCO guduz-ΔG-eGFP we AAV-DJ-EF1a-CVS-G-WPRE-pGHpA (plazma # 67528, Addgene) bilen bilelikde ýokaşdy, 3 gün düýpli ýuwuldy we S1-de syçanlara göçürildi we 7-14 gün dowam etdi.
Immunositokimiýa üçin haýwanlar anestizasiýa edildi we transkardial görnüşde PBS bilen 4% paraformaldegid bilen arassalandy (PBS-de PFA; Elektron mikroskopiýa ylymlary). Beýni 4% PFA-da 2 sagat ýa-da bir gije 4 ° C-de düzüldi, PBS-de 30% sakrozada 48-72 sagat saklandy we 1: 1, 30% sukrozada ýerleşdirildi: OCT (Tissue-Tek OCT Compound 4583, Sakura Finetek) we koronal bölümler kristostat (Leika) bilen 30 µm-da ýasaldy. Galyň bölümleriň immunohistohimiýasy üçin haýwanlar PBS bilen kämilleşdirildi we beýni titrän (Leica) ulanyp 300–400 mk aralykda bölünip aýryldy we bölümler 30% 4% PFA bilen düzüldi. Soňra kriozeksiýalar ýa-da galyň bölekler PBS bilen ýuwuldy, otag temperaturasynda 1 sagatlap ýapyldy (10% adaty eşek serumu (NDS) we PBS-de 0,3% Triton X-100) we 4 ° C-de blokirleýji ergin bilen ýapyldy. - Inkubasiýa krioseksiýalary bir gije inkubasiýa edildi, galyň bölümler 5 gün inkubasiýa edildi. Ulanylan esasy antikorlar: anti-NeuN (syçan, 1: 500; ab104224, abcam) anti-CTIP2 (syçan, 1: 300; ab18465, abcam), anti-GFAP (towşan, 1: 1000; Z0334, Dako), anti-GFP (towuk, 1: 1000; GTX13970, GeneTex); anti-NeuN (towşan, 1: 500; ABN78, Millipore), PDGFRA (towşan, 1: 200; sc-338, Santa Cruz), anti-PPP1R17 (towşan, 1: 200; HPA047819, Atlas antikorlary), RECA-1 (syçanjyk, 1:50, abc774, abc774, abc); 203571. 1: 400; ABN904, Millipore) we anti-IBA1 (geçi, 1: 100; ab5076, abcam). Ulanylan esasy antikorlar: anti-NeuN (syçanjyk, 1: 500; ab104224, abcam) anti-CTIP2 (syçan, 1: 300; ab18465, abcam), anti-GFAP (towşan, 1: 1000; Z0334, Dako), anti -GFP (towuk, 1: 1000; GTX13970, GeneTex); anti-NeuN (towşan, 1: 500; ABN78, Millipore), PDGFRA (towşan, 1: 200; sc-338, Santa Cruz), anti-PPP1R17 (towşan, 1: 200; HPA047819, Atlas antikorlary), RECA-1 (syçanjyk, 1:50, abc774, abc774, abc); 203571. 1: 400; ABN904, Millipore) we anti-IBA1 (geçi, 1: 100; ab5076, abcam). Использовались следующие первичные антитела: କାନ-NeuN (мшиные, 1: 500; ab104224, abcam), k-CTIP2 (крисиные, 1: 300; ab18465, abcam), tut-GFAP (кроличчи, 1: 1000); 1: 1000; Antikor) 1: 200. Ulanylan esasy antikorlar: anti-NeuN (syçanjyk, 1: 500; ab104224, abcam), anti-CTIP2 (syçan, 1: 300; ab18465, abcam), anti-GFAP (towşan, 1: 1000; Z0334, Dako), anti-GFP (towuk, 1: 1000; GTX13970, GeneTex); abcam), anti-NeuN (towşan, 1: 500; ABN78, Millipore), anti-PDGFRA (towşan, 1: 200; sc-338, Santa Cruz), anti-PPP1R17 (towşan, 1: 200; HPA047819, Atlas antikorlary), RECA-1 (towşan, 1:50 abb); 20387 1: 400; ABN904, Millipore) we anti-IBA1 (geçi, 1: 100; ab5076, abkam).使用的一抗是：抗 NeuN （小鼠， 1: 500 ； ab104224 ， abcam ）抗 CTIP2 （大鼠， 1: 300 ； ab18465 ， abcam ），抗 GFAP （兔， 1: 1000 ； Z0334 ， Dako ），抗 -GF P （鸡， 1: 1000 ； GTX13970 ， GeneTex ），抗 HNA （小鼠， 1: 200 ； ab191181 ， abcam ），抗 NeuN （兔， 1: 500 ； ABN78 ， Millipore ），抗 PDGFRA （兔， 1: 200 ； sc-338 ， Santa Cruz ），抗 PPP1R17 （兔， 1: 200 ； HPA047819 ， Atlas 抗体），抗 RECA-1 （小鼠， 1: 50 ； ab9774 ， abcam ），抗 SCG2 （兔）, 1: 100 ； 20357-1-AP ， Proteintech ），抗 SOX9 （山羊， 1 G1a （山羊， 1: 100 ； AF1166 ， R&D ulgamlary ），抗 STEM121 （小鼠, 1: 200;使用的一抗是：抗 NeuN （小鼠， 1: 500 ； ab104224 ， abcam ）抗 CTIP2 （大鼠， 1: 300 ； ab18465 ， abcam ），抗 GFAP （兔， 1: 1000 ； Z0334 ， Dako ），抗-GFP （鸡， 1: 1000 ； GTX13970 ， GeneTex ），抗 HNA （小鼠， 1: 200 ； ab191181 ， abcam ），抗 NeuN （兔， 1: 500 ； ABN78 ， Millipore ％弔，抗 1: 200 ； sc-338 ， Santa Cruz ），抗 PPP1R17 （兔， 1: 200 ； HPA047819 ， Atlas 抗体），抗 RECA-1 （小鼠， 1: 50 ； ab9774 ， abcam ），抗 SCG2 100 ； 20357-1-AP ， Proteintech ），抗 SOX9 （山羊， 1: 500 ； AF3075 ， R G1a （山羊， 1: 100 ； AF1166 ， Gözleg we barlag ulgamlary ）頏 1:20 ,;Y40410, Takara Bio), anti-SATB2 (syçan, 1:50; ab51502, abcam), anti-GAD65 / 67 (towşan, 1: 400; ABN904, Millipore) we anti-IBA1 (geçi, 1: 100; ab5076, abcam)。Ulanylan esasy antikorlar: anti-NeuN (syçan, 1: 500; ab104224, abcam), anti-CTIP2 (syçan, 1: 300; ab18465, abcam), anti-GFAP (towşan, 1: 1000; Z0334, Dako). , anti-GFP (towuk, 1: 1000; GTX13970, GeneTex), anti-HNA (syçanjyk, 1: 200; ab191181, abcam), NeuN garşy (towşan, 1: 500; ABN78, Millipore), PDGFRA garşy (towşan, 1: 200; sc-338, Santa Cruz): 200 PPP1; antikor), anti-RECA-1 (syçan, 1:50; ab9774, abcam), anti-SCG2 (towşan), 1: 100;20357-1-AP. . 203571. 1: 400; ABN904, Millipore) we anti-IBA1 (geçi, 1: 100; ab5076, abkam).Bölümler soňra PBS bilen ýuwuldy we ikinji derejeli antikor bilen otag temperaturasynda (doňdurylan bölümler) ýa-da bir gije 4 ° C (galyň bölümler) bilen inkubasiýa edildi. Blokirleme ergininde 1: 1000 suwuklandyrylan “Alexa Fluor” ikinji derejeli antikor (Life Technologies) ulanyldy. PBS bilen ýuwlandan soň, ýadrolar Hoechst 33258 (Life Technologies) bilen şekillendirildi. Ahyrynda, slaýdlar Aquamount (Polysciences) ulanyp, örtükli (Fisher Scientific) mikroskopda ýerleşdirildi we Keyence floresan mikroskopynda (BZ-X analizator) ýa-da Leica TCS SP8 konokok mikroskopynda (Las-X) analiz edildi. Suratlar ImageJ programmasy (Fiji) arkaly gaýtadan işlenildi. T-hCO-da we syçanyň korteksinde adam neýronlarynyň paýyny kesgitlemek üçin, t-hCO merkezinde, syçanyň korteksiniň gyrasynda ýa-da gyrasynda 387,5 m giňlikdäki gönüburçly suratlar alyndy. Graft çäkleri dokumanyň aç-açanlygynyň, HNA + ýadrolarynyň we / ýa-da dokumanyň awtofloresensiýasynyň üýtgemegine baha bermek arkaly kesgitlenildi. Her suratda NeuN + we HNA + öýjükleriniň umumy sany, şol bir sebitdäki NeuN + öýjükleriniň umumy sanyna bölünýärdi. Diňe şekil tekizligindäki ýadroly öýjükleriň sanalmagyny üpjün etmek üçin hasaplamada diňe Hoechst + öýjükleri hem bar. Statistik ýalňyşlygy azaltmak üçin azyndan 1 mm bilen bölünen iki sany surat ortaça boldy.
Nusga ýygnamagyndan bir hepde öň, hCO göçürilen haýwanlary (takmynan 8 aý tapawutlandyrmak), duýgur gyjyndyrmany azaltmak üçin pyçaklar bilen kesilen garaňky otaga ýerleşdiriň. Nucadrolaryň izolýasiýasy, käbir üýtgeşmeler bilen öň beýan edilişi ýaly ýerine ýetirildi. Gysgaça, t-hCO we hCO ýuwujy-mehaniki öýjük lizisi we 2 ml aýna dokma ýylmaýjy (D8938, Sigma-Aldrih / KIMBLE) ulanyp ýok edildi. Soňra çig ýadrolar 40 mkm süzgüç bilen süzüldi we sakroza dykyzlygy gradiýentini ýerine ýetirmezden ozal 420 ° C-de 10 minut üçin merkezden gaçyryldy. Merkezden gaçyryş ädiminden soň (4 ° C-de 20 minut üçin 320 g), nusgalar 0,4 birlik µl-1 RNase inhibitory (40 u µl-1, AM2682, Ambion) goşmak bilen 0.04% BSA / PBS görnüşinde üýtgedildi we 40 µm akym süzgüçinden geçdi. Bölünen ýadrolar soňra 0,02% BSA bolan PBS-de gaýtadan ýerleşdirildi we Hrom Single Cell 3 ′ çipine ýüklendi (bir zolakda 8000 öýjük dikeldilýär). snRNA-seq kitaphanalary Hrom Single öýjük 3 ′ GEM, Kitaphana we Gel Bead Kit v3 (10x Genomics) bilen taýýarlandy. snRNA-seq kitaphanalary Hrom Single öýjük 3 ′ GEM, Kitaphana we Gel Bead Kit v3 (10x Genomics) bilen taýýarlandy. Библиотеки snRNA-seq были приготовлены с помощью Hrom Bir öýjük 3 ′ GEM, Kitaphana we Gel monjuk toplumy v3 (10x Genomika). SnRNA-seq kitaphanalary Chromium Single cell 3 ′ GEM, Library & Gel Bead Kit v3 (10x Genomics) ulanyp taýýarlandy. snRNA-seq 文库是使用 Hrom ýeke öýjük 3 ′ GEM 、 Kitaphana we gel monjuk toplumy v3 (10x Genomika) 制备的。 snRNA-seq 文库是使用 Hrom ýeke öýjük 3 ′ GEM 、 Kitaphana we gel monjuk toplumy v3 (10x Genomika) 制备的。 Библиотеку snRNA-seq готовили с использованием Хром ýeke öýjük 3 ′ GEM, kitaphana we gel monjuk toplumy v3 (10x Genomika). SnRNA-seq kitaphanasy Chromium Single Cell 3 ′ GEM, Library & Gel Bead Kit v3 (10x Genomics) ulanyp taýýarlandy.Dürli nusgalardaky kitaphanalar “NovaSeq S4” (Illumina) -da “Admera Health” tarapyndan tertipleşdirildi.
Her bir ýadro ştrih-kod üçin gen aňlatma derejeleri 10x Genomics CellRanger derňew programma üpjünçiligi bukjasy (6.1.2 wersiýa) ulanylyp kesgitlenildi. Hususan-da, okalanlar mkref buýrugy bilen döredilen we sanlara “incinclude-introns = TRUE” buýrugy bilen sanlary ulanyp, adam (GRCh38, Ensemble, 98 wersiýa) we rat (Rnor_6.0, Ensemble, 100 wersiýa) birleşmesine gabat geldi. T-hCO nusgalary üçin adam ýadrolary, kartalaşdyrylan okalýanlaryň azyndan 95% -iniň adam genomyna laýyk gelmegini talap edýän konserwatiw talap esasynda kesgitlenildi. Ondan soňky ähli derňewler R paketini (4.1.2 wersiýa) Seurat (4.1.1 wersiýa) 32 ulanyp, CellRanger-den süzülen ştrih-kod massiwinde geçirildi.
Soňky derňewlere diňe ýokary hilli ýadrolaryň goşulmagyny üpjün etmek üçin her nusga üçin iteratiw süzgüç prosesi geçirildi. Ilki bilen, 1000-den az üýtgeşik gen tapylan we umumy mitokondriýanyň 20% -den gowragy pes hilli ýadrolar kesgitlenýär we aýrylýar. Netijede, çig gen san matrisasy sctransform (vst.flavor = ”v2 ″) funksiýasyny ulanyp, yzygiderli negatiw binomial regressiýa bilen kadalaşdyryldy, bu hem üýtgeýän parametrleri ulanyp 3000 üýtgeýän geni kesgitledi. Esasy komponent seljermesini (PCA) ulanyp, ýokarky üýtgeýän genlerde ölçegi peseltmek ýerine ýetirildi we dyzlaryň 30-syny kesgitledik. genleri adaty bolmadyk pes sanlara (ortaça 10 göterimden pes), adaty bolmadyk ýokary mitohondrial gen sanlaryna (ortaça 95 göterimden ýokary) genleri toparlara bölmek üçin iteratiw toparlanyşyk (DoubletFinder33 bukjasy (3-den ýokary) aboveokardaky parametrler bilen IntegrateData funksiýasyny ulanyp, ýokarda görkezilişi ýaly integral maglumatlar toplumynyň hil taýdan süzgüçiniň ýene bir tapgyry geçirildi.
Pes hilli ýadrolary aýyrandan soň, integrirlenen maglumat toplumy toparlandy (çözgüdi = 0,5) we UMAP34 wizuallaşdyrmak maksady bilen ýerleşdirildi. Her bir topar üçin marker genleri, adaty gen aňlatma maglumatlaryndan hasaplanan deslapky parametrler bilen FindMarkers funksiýasyny ulanyp kesgitlenildi. Düwünçegiň we ulularyň kortikal salgylanma maglumat bazalaryny 19,20,21,35 marker gen aňlatmasy we düşündiriş bilen birleşdirip, esasy öýjük synplaryny kesgitleýäris we toparlara bölýäris. Hususan-da, aýlanýan prekursorlar MKI67 we TOP2A aňlatmalary bilen kesgitlenildi. Nesil toparlary mitotik ýazgylaryň ýoklugy, giçki metafaza düwünçegiň korteksinde beýan edilen köpugurly glial progenitor toparlary bilen ýokary gabat gelmegi we EGFR we OLIG1 aňlatmasy bilen kesgitlenildi. Astrosit adalgasyny, giçki radial glýadan başlap, astrositleriň ýetişmegine çenli astrositleriň tapawudynyň birnäçe ýagdaýyny öz içine almak üçin ulanýarys. Astrosit toparlary SLC1A3 we AQP4-iň ýokary derejesini görkezýär we düwünçegiň radial glýasynyň we / ýa-da uly ýaşly astrositleriň görnüşleri bilen kartada görkezilendigi görkezildi. OPC-ler PDGFRA we SOX10, oligodendrositler bolsa myelinasiýa belliklerini (MOG we MYRF) aňladýar. Glutamatergiki neýronlar neýron ýazgylarynyň (SYT1 we SNAP25), GABAergic markerleriniň (GAD2) ýoklugy we NEUROD6, SLC17A7, BCL11B ýa-da SATB2 bilen kesgitlenildi. GluN neýronlary has ýokarky (SATB2 aňlatma we BCL11B ýitgisi) we çuň (BCL11B aňlatma) kiçi toparlara bölündi. Düwürtik subplate (SP) neýronlar, çuňňur GluN markerlerinden başga-da, ST18 we SORCS1 ýaly belli SP18 markerlerini görkezýär. Horoid pleksusa meňzeş öýjükler TTR aňlatmasy bilen kesgitlenildi we meningeal ýaly öýjükler fibroblast bilen baglanyşykly genleri we salgylanmalar toplumynyň pial / damar öýjüklerini kartalaşdyrdy.
T-hCO we hCO kiçi toparlarynyň arasyndaky gen aňlatmasynyň diferensial derňewi, Libra R bukjasynyň (1.0.0 wersiýasy) ulanylan nusgalarda köpeldilen täze döredilen pseudo-partiýa usuly bilen geçirildi. Hususan-da, her nusga köpeltmek üçin belli bir öýjük synpy üçin öýjüklerdäki genleriň sanyny jemläp, toparlar üçin edgeR log-ähtimallyk synaglary (3.36.0 wersiýa, R paket) geçirildi. Heatylylyk kartasyny wizuallaşdyrmak üçin, her million (CPM) bahasy kadalaşdyrylan edgeR (cpm () funksiýasy) bilen hasaplanýar we ulalýar (ortaça = 0, standart gyşarmak = 1). Gen Ontologiýasy (GO) ep-esli tertipleşdirilen t-hCO GluN genleriniň baýlaşdyryş derňewi geçirildi (Benjamini-Hochberg, t-hCO GluN öýjükleriniň azyndan 10% -de görkezilen 0,05-den pes P bahasyny düzdi we azyndan 2 gezek üýtgemegiň iki esse ýokarlanmagy). ToppGene Suite (https://toppgene.cchmc.org/)37 ulanyp ýerine ýetirildi. “ToppFun” programmasyny deslapky parametrleri bilen ulanýarys we GO-bellikli gipergeometrik synaglardan hasaplanan Benjamini-Hochberg bilen düzedilen P-bahalaryny habar berýäris.
SnRNA-seq toparlarymyzy başlangyç bir öýjükli RNA-seq ýa-da uly ýaşly snRNA-seq19,20,21,22 gözleg işleriniň düşündirişli öýjükli toparlary bilen deňeşdirmek üçin jübüt maglumat toplumy integrasiýa çemeleşmesini ulandyk. Seuratdaky SCTransform (v2) kadalaşdyryş işini maglumat bazalarynyň arasynda toparlaýyn gabat gelişleri birleşdirmek we deňeşdirmek üçin (ýokardaky ýaly parametrleri ulanyp) ulandyk. Aýry-aýry maglumatlar bazalary, hasaplaýyş netijeliligi üçin asyl klaster üçin 500 öýjüge ýa-da ýadro tötänleýin bölünipdi. Öň düşündirilişi ýaly şuňa meňzeş çemeleşmäni ulanyp, toparlaryň bir-birine gabat gelmegi, salgylanma toparynyň belligi bilen örtülen her bir toplanan toparda öýjükleriň ýa-da ýadrolaryň paýy hökmünde kesgitlenildi. GluN-leri hasam klassifikasiýa etmek üçin, GluN öýjüklerimize salgylanma maglumatlar belliklerini bellemek üçin GluN kiçi maglumatlary üçin Seuratyň TransferData iş prosesini ulandyk.
T-hCO we hCO nusgalarynyň global transkriptomasynyň kämillik ýagdaýyna baha bermek üçin, pseudo-köp nusgalarymyzy adam beýnisiniň ösüşini öz içine alýan uly RNK yzygiderliliginden ybarat BrainSpan / psychENCODE23 bilen deňeşdirdik. Göwrelilikden 10 hepde soň, kortikal nusgalardan birleşdirilen nagyş kadalaşdyrylan gen aňlatma matrisasynda PCA ýerine ýetirdik, öň BrainSpan kortikal nusgalarynda işjeň diýlip kesgitlenen 5567 gende (kub modelini ulanyp ýaş bilen düşündirilýän ösüş üýtgeýşinde 50% -den köp kesgitlenýär) 38. Mundan başga-da, öň beýan edilişi ýaly negatiw däl matrisa faktorizasiýasyny ulanyp, neýro ösüşiniň esasy transkriptor gollary bilen baglanyşykly genleri aldyk. Negativearamaz däl matrisa faktorlaşdyrma prosedurasy bilen hasaplanan nusga agramlary injirde ýerleşdirildi. Zhu we al.38 tarapyndan beýan edilen bäş goluň her biri üçin giňeldilen maglumatlar bilen. Againene-de, işjeňlige bagly transkripsiýa bellikleri öň neşir edilen gözleglerden alyndy. Hususan-da, 3-nji goşmaça tablisa Hrvatin we başg. Adam bilen baýlaşdyrylan LRG-ler, KCl bilen işjeňleşdirilen düwünçegiň beýni medeniýetlerinden alyndy we gyjyndyrmadan soň 6 sagat ýygnaldy we süzülen genler adamlarda ep-esli tertipleşdirildi, ýöne gemrijilerde däl (Goşmaça tablisa 4). Bu gen toplumlaryny ulanyp, gen toplumyny baýlaşdyrmagyň derňewi Fişeriň takyk synagyndan peýdalanyldy.
Alakalary izofluran bilen anestizirläň, beýnini aýyryň we sowukda (takmynan 4 ° C) kislorodlaşdyrylan (95% O2 we 5% CO2) sakroza ergini: 234 mM sukroz, 11 m glýukoza, 26 m NaHCO3, 2,5 mM KCl, 1,25 mM. NaH2PO4, 10 mM MgSO4 we 0,5 mM CaCl2 (takmynan 310 mOsm). T-hCO-ny öz içine alýan syçanyň beýni koronal bölümleri (300–400 µm), öň beýan edilişi ýaly Leica VT1200 titremesi bilen ýasaldy. Soňra bölümler: 10 mM glýukoza, 26 mM NaHCO3, 2,5 m KCl, 1,25 mM NaHPO4, 1 mM MgSO4, 2 mM CaCl2 we 126 mM NaCl (298 mOsm) taýýarlanan aCSF bolan üznüksiz otag temperatura kislorodly bölüm bölümine geçirildi. ýazgydan azyndan 45 minut öň. Bölümler aCSF (95% O2 we 5% CO2 flakon) bilen yzygiderli kämilleşdirilen çümdürilen kamerada ýazga alyndy. Datahli maglumatlar otag temperaturasynda hasaba alyndy. t-hCO neýronlary 127 m kaliý glýukonaty, 8 mM NaCl, 4 m magniý ATP, 0,3 m natriý GTP, 10 mM HEPES we 0,6 mM EGTA, pH 7.2, KOH (290 mOsm) bolan ergin bilen doldurylan borosilikat aýna turbasy bilen bes edildi. Dikeltmek üçin ýazgy erginine biositin (0,2%) goşuldy.
Maglumatlar MultiClamp 700B güýçlendiriji (Molekulýar enjamlar) we Digidata 1550B sanlylaşdyryjy (Molekulýar enjamlar) ulanylyp, 2 kHz tizlikli süzülen, 20 kHz tizleşdirilen we Clampfit (Molekulýar enjamlar), gelip çykyşy (OriginPro) arkaly analiz edildi. 2021b, OriginLab). we adaty MATLAB funksiýalary (Mathworks). Birleşme potensialy JPCalc ulanyp hasaplandy we ýazgylar -14 mV hasaplanan bahasyna düzüldi. IV operasiýa, -250-den 750 pA çenli 10-25 pA ädimdäki häzirki ädimleriň tapgyryndan durýar.
Talamus, ak maddalar we S1 afferentleri, öň aýdylyşy ýaly, hCO neýronlarynyň patch-gysgy ýazgysy wagtynda talamokortiki dilimlerde elektrik bilen gyjyndyryldy. Gysgaça, beýni 10 ° burçda egilen 3D çap stoluna ýerleşdirildi we beýniniň öň tarapy 35 ° burçda kesildi. Soňra beýni kesilen ýüzüne ýelmeşdi we talamokortiki uzalýan aksonlary gorap saklady. Bipolýar wolfram elektrodlary (0,5 MΩ) ikinji mikromanipulýatorda oturdyldy we öýjükde dört sebiti (içki kapsula, ak madda, S1 we hCO) höweslendirmek üçin strategiki taýdan ýerleşdirildi. Sinaptiki jogaplary 300 µA faziki gyjyndyrmadan soň 0.03–0.1 Hz-de ýazga alyň.
hChR2 aňladýan hCO neýronlary 480 nm-de işjeňleşdirildi we öýjükleriň ýanynda hChR2 aňlatmasyny ýazmak üçin LED (Prizmatix) tarapyndan döredilen ýeňil impulslar × 40 maksat (0.9 NA; Olimp) ulanyldy. Inatedagtylandyrylan meýdanyň diametri takmynan 0,5 mm, umumy güýji 10-20 mWt. Impulsyň ini 10 ms düzüldi, bu özüni alyp barşyň öwreniş synagynda berlen impulsa gabat gelýär. 1-den 20 Hz-a çenli dürli gyjyndyrma ýygylyklary ulanyldy, ýöne mukdar üçin diňe seriýanyň ilkinji impulsy ulanyldy. Sinaptiki inhibitasiýa ýa-da ýollary ýeňilleşdirmek üçin otlylaryň arasyndaky aralyklar, adatça 30 s-den uzyn bolýar. HChR2 jogabynyň monosynaptiki bolandygyny barlamak üçin, EPSC reaksiýasy ýitýänçä TTX (1 μM) hammama dakdyk, soň bolsa 4-aminopiridini (4-AP; 100 μM) ulandyk. Adatça, LED ot açmagy bilen EPSC öndürilişiniň arasynda birneme uzaga çekip, birnäçe minutyň içinde jogap gaýtarylýar. NBQX (10 μM) jogabyň AMPA reseptorlary tarapyndan dolandyrylandygyny ýa-da ýokdugyny barlamak üçin ulanyldy.
Kesgitli hCO bölümleri öň beýan edilişi ýaly döredildi. Gysgaça aýdanyňda, hCO bölümleri 4% agaroza siňdirilip, 126 mM NaCl, 2,5 mM KCl, 1,25 mM NaH2PO4, 1 mM MgSO4, 2 mM CaCl2, 26 mM NaHCO3 we 10 mM d - (+) - glýukoza bölümlerinde 200–300 µm temperaturada saklanýar. Soňra gönüden-göni SliceScope mikroskopy (Scientifica) astynda hCO bölümlerinde tutuş öýjükleriň patch-lager ýazgysy geçirildi. Bölümler aCSF (95% O2 we 5% CO2) bilen kämilleşdirildi we öýjük signallary otag temperaturasynda ýazga alyndy. hCO neýronlary 127 m kaliý glýukonaty, 8 m NaCl, 4 mM magniý ATP, 0,3 m natriý GTP, 10 mM HEPES we 0,6 mM EGTA, içki pH 7, 2, KOH (osmolarity 290) bolan ergin bilen doldurylan borosilikat aýna turbany ulanyp ulanyldy. Dikeldiş maksatlary üçin içerki ergine 0,2% biositin goşuň.
Maglumatlar Clampex (Clampex 11.1, Molekulýar enjamlar) MultiClamp 700B güýçlendiriji (Molekulýar enjamlar) we Digidata 1550B sanlaşdyryjy (Molekulýar enjamlar), 2 kHz-da pes süzgüçli, 20 kHz sanly we MATLAB funksiýalary, MATLAB funksiýalary (MATLABB), MATLAB funksiýalary (MATLAB funksiýalary) we analiz etmek üçin Clampfit (10.6 wersiýa) ulanyp seljerildi. Birleşme potensialy JPCalc ulanyp hasaplandy we ýazgylar -14 mV hasaplanan çatryk potensialyna düzüldi. IV operasiýa -50-den 250 pA-a çenli 5-10 pA ädimdäki häzirki ädimleriň tapgyryndan durýar.
Berkidilen neýronlary morfologiki taýdan täzeden gurmak üçin içerki ergine 0,2% biositin (Sigma-Aldrih) goşuldy. Öýjükler hakerden soň azyndan 15 minutlap asylýar. Soňra turba, hasaba alnan membrana doly möhürlenýänçä 1-2 minutlap çekilýär. Bölüm fiziologiýa prosedurasy, bölümler 4% PFA-da 4 ° C derejesinde bir gije düzedildi, PBS X3 bilen ýuwuldy we streptawidin-konýugirlenen DyLight 549 ýa-da DyLight 405 (Vektor laboratoriýasy) bilen 1: 1000 suwuklandyryldy. Biositin bilen doldurylan öýjükler (2%; Sigma-Aldrih) 2 sagat otag temperaturasynda patch gysgy ýazgy wagtynda bellik edildi. Soňra bölümler Aquamount (Thermo Scientific) ulanyp mikroskopiýa slaýdlaryna gurnaldy we ertesi gün Leica TCS SP8 konokok mikroskopynda × 40 1.3, ulaldylyşy × 0.9-1.0, xy bilen ýag çümdürmek maksady bilen şekillendirildi. Nusga almagyň derejesi mikron üçin takmynan 7 piksel. 1 µm aralykda Z-stackler yzygiderli alyndy we her neýronyň ähli dendrit agajyny ýapmak üçin z-stack mozaikalary we Leica esasly awtomatik tikiş işleri geçirildi. Soňra neýronlar neuTube 40 interfeýsini ulanyp ýarym el bilen yzarlandy we SWC faýllary döredildi. Soňra faýllar SimpleNeuriteTracer41 Fiji pluginine ýüklendi (ImageJ, 2.1.0 wersiýa; NIH).
Adam kortikal dokumasy, Stenford uniwersitetiniň institusional gözden geçiriş geňeşi tarapyndan tassyklanan teswirnama laýyklykda habarly razylyk bilen alyndy. Adam dogrumdan soňky dokumanyň iki nusgasy (3 we 18 ýaş), refrakter epilepsiýa operasiýasynyň çäginde frontal korteksiň (orta frontal girus) rezeksiýasy arkaly alyndy. Kesgitlenenden soň, buzly sowuk NMDG-aCSF-de dokma dokumasy bar: 92 mM NMDG, 2,5 m KCl, 1,25 mM NaH2PO4, 30 mM NaHCO3, 20 mM HEPES, 25 mM glýukoza, 2 mM tiourea, 5 mM natriý askorbat, 3 mM natriý piruwat, 0,5 mH2 CaCl Konsentrirlenen gidroklor turşusy bilen pH 7.3-7.4 titrläň. Dokumalar 30 minudyň içinde laboratoriýa eltildi we ýokarda görkezilen tertibe laýyklykda koronal bölümler alyndy.
Animalhli haýwan amallary, Stenford uniwersiteti APLAC tarapyndan tassyklanan haýwanlara ideg görkezmelerine laýyklykda geçirildi. Alakalar (transplantasiýadan soňky 140 günden uly) 5% izofluran anestezi bilen ýüze çykaryldy we 1-3% izofluran bilen operasiýa edildi. Haýwanlar stereotaksiki çarçuwada (Kopf) ýerleşdirildi we dowamly goýberilýän buprenorfine (SR) subkutan sanjym edildi. Kellesi açylýar, arassalanýar we 3-5 sany süňk nurbatlary goýulýar. T-hCO-ny nyşana almak üçin MRI şekillerinden stereotaksiki koordinatlar döretdik. Gyzyklanýan ýerde buraw çukury burawlandy we süýümler (diametri 400 µm, NA 0.48, Doric) hCO ýüzüniň aşagyndan 100 µm aşak düşürildi we UV bejergisi bolan diş sementi (Relyx) bilen kellä berkidildi.
Süýümli fotometrik ýazgylar öň beýan edilişi ýaly ýerine ýetirildi42. Öz-özünden işjeňligi ýazga almak üçin, alakalar arassa kapasa ýerleşdirildi we süýümli optiki fotometrik maglumatlary almak ulgamyna birikdirilen 400 m diametrli süýümli optiki patch kabeli (Doric) oturdylan süýüm optiki kabeline birikdirildi. Motor hereketiniň 10 minutlyk ýazgysynda haýwanlar kapasany gözden geçirip bildiler. Göçürilen işjeňligi ýazga almak üçin alakalar (transplantasiýadan 140 günden gowrak wagt) induksiýa üçin 5% izofluran we tehniki hyzmat üçin 1-3% izofluran bilen anestizasiýa edildi. Haýwany stereotaktiki çarçuwada (Kopf) ýerleşdiriň we t-hCO-nyň ters tarapyndaky pyçaklar takmynan 2 santimetre çenli kesilýär we piezoelektrik herekete getirijisine (PI) birikdirilen meshden geçýär. 400 mkm süýümli optiki patch kabeli (Doric) oturdylan süýüme birikdirildi we maglumatlary ýygnamak ulgamyna birikdirildi. T-hCO-nyň ters tarapyndaky pyçaklar, 20 minutlyk ýazgy döwründe piezoelektrik sürüjisi tarapyndan tötänleýin 50 gezek (20 Hz-de 2 mm, görkeziş üçin 2 s) defekt edildi. Customörite MATLAB kody bilen deflýasiýa wagtyny gözegçilikde saklamak üçin Arduino MATLAB goldaw paketini ulanyň. Wakalar tranzistor-tranzistor logikasy (TTL) impulslaryny ulanyp, maglumat almak programma üpjünçiligi bilen sinhronlaşdyrylýar.
Alakalar (transplantasiýadan soňky 140 günden uly) 5% izofluran anestezi bilen ýüze çykaryldy we 1-3% izofluran bilen operasiýa edildi. Haýwanlar stereotaksiki çarçuwada (Kopf) ýerleşdirildi we buprenorfin SR we deksametazon subkutan sanjym edildi. Kellesi açylýar, arassalanýar we 3-5 sany süňk nurbatlary goýulýar. T-hCO-ny nyşana almak üçin MRI şekillerinden stereotaksiki koordinatlar döretdik. Göçürilen hCO-nyň üstünden ýokary tizlikli buraw bilen tegelek kraniotomiýa (diametri takmynan 1 sm) geçirildi. Süňk mümkin boldugyça inçe bolansoň, ýöne tutuş süňküň üstünden burawlamazdan ozal, t-hCO-ny ýüze çykarmak üçin galan çanak diskini aýyrmak üçin forseps ulanyň. Kraniotomiýa steril duz bilen dolduryldy we kellesine UV bejergisi bolan diş sementi (Relyx) bilen örtük we ýörite kelle berkidildi.
Iki fotonly surat, Nikon LWD (× 16, 0.8 NA) maksady bolan Bruker multipoton mikroskopy arkaly geçirildi. GCaMP6 şekillendiriş 920 nm-de 1,4x ýeke z-tekiz ulaldylyşy we ortaça 8x ortaça 7,5 fps bilen ýerine ýetirildi. Alakalar 5% izofluran anestezi bilen ýüze çykypdyr we 1-3% izofluran bilen saklanýar. Alakalar adaty ýasalan armatura ýerleşdirilip, obýektiwiň aşagynda ýerleşdirildi. Motor hereketiniň 3 minutlyk fon ýazgysy alyndy. 20 minutlyk ýazgynyň dowamynda, picospricer ulanyp, t-hCO-nyň garşysyndaky pyşyrdama 50 puff (her prezentasiýa 100 ms uzynlykda) tötänleýin gowşuryldy. Customörite MATLAB kody bilen ýarylan wagty dolandyrmak üçin Arduino MATLAB goldaw paketini ulanyň. Wakalary TTL impulslaryny ulanyp, maglumat almak programma üpjünçiligi (PrairieView 5.5) bilen sinhronlaň. Derňew üçin, suratlar Fijide başlanan MoCo programmasynda affin düzedişini ulanyp, xy hereketi üçin düzedildi. CNMF-E43 ulanyp, aýry öýjüklerden floresan yzlary çykarmak. Gyzyklanýan her sebit üçin floresan çykaryldy, dF / F egrilerine öwrüldi we soňra z-ballara öwrüldi.
Alakalar (transplantasiýadan soňky 140 günden uly) 5% izofluran anestezi bilen ýüze çykaryldy we 1-3% izofluran bilen operasiýa edildi. Haýwanlar stereotaksiki çarçuwada (Kopf) ýerleşdirildi we buprenorfin SR we deksametazon subkutan sanjym edildi. T-hCO-nyň ters tarapyndaky pyçaklar takmynan 2 santimetre çenli kesildi we piezoelektrik hereketlendirijisine birikdirilen tor arkaly sapak edildi. Kellesi açylýar we arassalanýar. Kellä poslamaýan polatdan ýasalan nurbat dakylýar. T-hCO-ny nyşana almak üçin MRI şekillerinden stereotaksiki koordinatlar döretdik. T-hCO-nyň ýokarsynda ýokary tizlikli buraw bilen tegelek kraniotomiýa (diametri takmynan 1 sm) ýerine ýetiriň. Süňk mümkin boldugyça inçe bolansoň, ýöne tutuş süňküň üstünden burawlamazdan ozal, t-hCO-ny ýüze çykarmak üçin galan çanak diskini aýyrmak üçin forseps ulanyň. Aýry öýjükler ýer nurbatlaryna ýerleşdirilen we RHD güýçlendirijileri (Intan) bilen güýçlendirilen 32 kanally ýa-da 64 kanally ýokary dykyzlykly kremniy zondlary (Kembrij Neurotech) ulanylyp ýazga alyndy. Steril duzly doldurylan kraniotomiýa arkaly elektrodlary maksatly ýere düşürmek üçin manipulýatory ulanyň. Maglumat ýygnamak “Open Ephys” maglumatlary almak ulgamyny ulanyp 30 kHz ýygylykda geçirildi. Onlyazgy diňe 10-dan gowrak kanalda ýokary korrelirlenen ritmiki öz-özünden işjeňligi kesgitlänimizde, elektrodlaryň grafada ýerleşendigini (iki fotonly kalsiý şekillendiriş maglumatlaryna esaslanyp) ýüze çykanymyzda dowam etdi. Motor hereketiniň 10 minutlyk fon ýazgysy alyndy. T-hCO-nyň ters tarapyndaky pyçaklar, 20 minutlyk ýazgy döwründe piezoelektrik sürüjisi tarapyndan tötänleýin 50 gezek (20 Hz-de 2 mm, görkeziş üçin 2 s) defekt edildi. Arduino (MATLAB 2019b) üçin MATLAB goldaw paketini ulanyp, adaty MATLAB kody bilen deflýasiýa wagtyny dolandyryň. Wakalary maglumatlary ýygnamak programma üpjünçiligi bilen sinhronlamak üçin TTL impulslaryny ulanyň.
Optiki bellik synaglary üçin, 473 nm lazere (Omicron) birikdirilen 200 µm optiki patch şnury (Doric) kraniotomiýanyň üstünde goýlan 200 m optiki süýüme birikdirildi. Munuň öňüsyrasynda jumper güýjüni 20 mWt sazlaň. Steril duzly doldurylan kraniotomiýa arkaly elektrodlary maksatly ýere düşürmek üçin manipulýatory ulanyň. Ordingazgynyň başynda 473 nm ýagtylygyň on impulsy (ýygylygy 2 Hz, impulsyň dowamlylygy 10 ms) çykdy. Duýgur öýjükler, synaglaryň 70% -inde ýa-da ondanam köpüsinde 10 ms ýagtylygyň içinde ýokary seslenmäni görkezýän öýjükler hökmünde kesgitlenildi.