Nature.com-a gireniňiz üçin sag boluň.Ulanylýan brauzer wersiýaňyzyň çäkli CSS goldawy bar.Iň oňat tejribe üçin täzelenen brauzeri ulanmagy maslahat berýäris (ýa-da Internet Explorer-de Gabat geliş tertibini öçüriň).Şol aralykda, dowamly goldawy üpjün etmek üçin sahypany stil we JavaScript bolmazdan hödürläris.
Suwuk biopsiýa (LB), biomedikal ugurda çalt meşhurlyk gazanan düşünje.Bu düşünje, esasan, dürli dokumalarda öýjük ölenden soň ownuk bölekler hökmünde bölünip çykýan öýjükli DNK (ccfDNA) bölekleriniň tapylmagyna esaslanýar.Bu bölekleriň az bölegi daşary ýurt (daşary ýurt) dokumalardan ýa-da organizmlerden gelip çykýar.Häzirki işimizde, bu düşünjäni deňiz suwlarynyň süzgüç kuwwaty bilen tanalýan garawul görnüşi bolan midýalara ulandyk.Midiýalaryň deňiz kenarýaka ekosistemalarynyň biodürlüligi barada maglumat bermek üçin dürli çeşmelerden daşky gurşaw DNK böleklerini almak üçin tebigy süzgüç hökmünde hereket etmek ukybyny ulanýarys.Netijelerimiz, midiýa gemolimfynyň ululygy 1-den 5 kb-a çenli üýtgeýän DNK bölekleriniň bardygyny görkezýär.Atylan ýaragyň yzygiderliligi, köp sanly DNK bölekleriniň daşary ýurt mikroblardan gelip çykandygyny görkezdi.Olaryň arasynda bakteriýalardan, arhaýalardan we wiruslardan DNK böleklerini, şol sanda kenarýaka deňiz ekosistemalarynda köplenç duş gelýän dürli öý eýelerine ýokaşýan belli wiruslary tapdyk.Sözümiziň ahyrynda, midiýalara ulanylýan LB düşünjesiniň deňiz kenarýaka ekosistemalarynda mikroblaryň dürlüligi barada baý, ýöne entek öwrenilmedik bilim çeşmesini görkezýändigini görkezýär.
Howanyň üýtgemeginiň (CC) deňiz ekosistemalarynyň biodürlüligine täsiri çalt ösýän gözleg meýdanydyr.Global ýylylyk diňe bir möhüm fiziologiki streslere sebäp bolman, eýsem deňiz jandarlarynyň ýylylyk durnuklylygynyň ewolýusiýa çäklerini hem öňe sürýär, birnäçe görnüşiň ýaşaýan ýerine täsir edýär we has amatly şertleri gözlemäge mejbur edýär [1, 2].CC metazoanlaryň biodürlüligine täsir etmekden başga-da, öý-mikrob täsirleriniň näzik deňagramlylygyny bozýar.Bu mikrob disbakterioz deňiz ekosistemalaryna çynlakaý howp döredýär, sebäbi deňiz organizmlerini ýokanç patogenlere has sezewar edýär [3, 4].Global deňiz ekosistemalaryny dolandyrmak üçin çynlakaý mesele bolan köpçülikleýin ölümlerde SS möhüm rol oýnaýar diýip hasaplanýar [5, 6].Bu köp deňiz görnüşleriniň ykdysady, ekologiki we iýmitleniş täsirini göz öňünde tutup möhüm mesele.Bu, esasanam, CK-nyň täsiri has çalt we agyr bolan polýar sebitlerde ýaşaýan gapma-garşylara degişlidir [6, 7].Aslynda Mytilus spp ýaly gapma-garşylyklar.CC-iň deňiz ekosistemalaryna edýän täsirine gözegçilik etmek üçin giňden ulanylýar.Saglyklaryna gözegçilik etmek üçin has köp biomarkeriň döredilendigi geň däldir, köplenç ferment işjeňligine ýa-da öýjükleriň ýaşaýyş ukyby we fagositiki işjeňlik ýaly öýjükli funksiýalara esaslanýan funksional biomarkerleri öz içine alýan iki derejeli çemeleşme ulanylýar [8].Bu usullar, şeýle hem köp mukdarda deňiz suwunyň siňdirilmeginden soň ýumşak dokumalarda ýygnanýan belli bir basyş görkezijileriniň konsentrasiýasyny ölçemegi öz içine alýar.Şeýle-de bolsa, ýokary süzgüç kuwwaty we ýarym açyk gan aýlanyş ulgamy, hassalary dolandyrmak üçin ýönekeý we minimal invaziv çemeleşme bolan suwuk biopsiýa (LB) düşünjesini ulanyp, täze gemolimf biomarkerlerini ösdürmäge mümkinçilik berýär.gan nusgalary [9, 10].Adam LB-de aýlanylýan molekulalaryň birnäçe görnüşini tapyp bolýandygyna garamazdan, bu düşünje, esasan, plazmadaky öýjükden daşary DNK (ccfDNA) bölekleriniň DNK yzygiderli derňewine esaslanýar.Aslynda, adam plazmasynda aýlanylýan DNK-nyň barlygy 20-nji asyryň ortalaryndan bäri mälimdir [11], ýöne soňky ýyllarda ýokary geçiş yzygiderliliginiň peýda bolmagy ccfDNA esasly kliniki diagnozyň döremegine sebäp boldy.Bu aýlanýan DNK bölekleriniň bolmagy, öýjük ölenden soň genom DNK-nyň (ýadro we mitohondrial) passiw çykmagyna baglydyr. Sagdyn adamlarda ccfDNA-nyň konsentrasiýasy adatça pesdir (<10 ng / mL), ýöne dürli patologiýalardan ejir çekýän ýa-da streslere sezewar bolan hassalarda 5-10 esse ýokarlanyp, dokumalaryň zeperlenmegine sebäp bolýar. Sagdyn adamlarda ccfDNA-nyň konsentrasiýasy adatça pesdir (<10 ng / mL), ýöne dürli patologiýalardan ejir çekýän ýa-da streslere sezewar bolan hassalarda 5-10 esse ýokarlanyp, dokumalaryň zeperlenmegine sebäp bolýar. У здоровых людей маран вккДНК в земме низкая (<10 нг / гир), но может повишаться в 5-10 раз у больных с различной патолиией ​​или подвергающихся лаву, при провящему к повреждению Sagdyn adamlarda cccDNA-nyň konsentrasiýasy adatça pesdir (<10 ng / mL), ýöne dürli patologiýaly näsaglarda ýa-da dokumanyň zeperlenmegine sebäp bolýan stresde 5-10 esse artyp biler.在 健康 个体 c ccfDNA 10 10 10 ng / mL） 但 在 -10 -10 -10 -10 -10 -10 -10 -10 -10在 健康 个体 c ccfdna 的 浓度 较 10 10 10 10 ng / mlКонцентрации ccfDNA обикно низкие (<10 нг / зир) у здоровых людей, ноябрь могут быть увеличены в 5-10 раз у удов с различными пидологиями или чисом, что при имитит к повреждению тканей. ccfDNA konsentrasiýalary adatça sagdyn adamlarda pesdir (<10 ng / ml), ýöne dürli patologiýa ýa-da stresli näsaglarda dokumanyň zeperlenmegine 5-10 esse köpelip biler.CcfDNA bölekleriniň ululygy dürli-dürli bolýar, ýöne adatça 150-den 200 bp aralygynda bolýar.[12].Öz-özünden alnan ccfDNA-ny seljermek, adaty ýa-da üýtgedilen öýjüklerden ccfDNA, ýadro we / ýa-da mitokondrial genomda bar bolan genetiki we epigenetiki üýtgeşmeleri ýüze çykarmak üçin ulanylyp bilner we şeýlelik bilen kliniki lukmanlara belli bir molekulýar maksatly bejeriş usullaryny saýlamaga kömek eder [13].Şeýle-de bolsa, ccfDNA göwrelilik döwründe düwünçegiň öýjüklerinden ýa-da göçürilen organlardan ccfDNA ýaly daşary ýurt çeşmelerinden alnyp bilner [14,15,16,17].ccfDNA ýokanç agentiň (daşary ýurtly) nuklein kislotalarynyň bardygyny anyklamak üçin möhüm maglumat çeşmesidir, bu gan medeniýeti tarapyndan kesgitlenmedik giň ýaýran ýokanç keselleri invaziv däl tapmaga mümkinçilik berýär, ýokaşan dokumalaryň invaziv biopsiýasyndan gaça durýar [18].Soňky gözlegler hakykatdanam adam ganynda wirus we bakterial patogenleri kesgitlemek üçin ulanyp boljak baý maglumat çeşmesiniň bardygyny we adam plazmasynda tapylan ccfDNA-nyň takmynan 1% -iniň daşary ýurtlydygyny görkezdi [19].Bu gözlegler, organizmiň aýlanýan mikrobiomasynyň biodürlüligine ccfDNA derňewi arkaly baha berip boljakdygyny görkezýär.Şeýle-de bolsa, soňky wagta çenli bu düşünje diňe adamlarda we az derejede beýleki oňurgaly haýwanlarda ulanyldy [20, 21].
Häzirki kagyzda, subantarktik Kerguelen adalarynda, 35 million ýyl ozal emele gelen uly platoda adalaryň topary bolan Aulacomya atranyň ccfDNA-ny seljermek üçin LB potensialyny ulanýarys.wulkan atmagy.In vitro synag synag ulgamyny ulanyp, deňiz suwundaky DNK bölekleriniň midiýalar tarapyndan çalt alynýandygyny we gemolimf bölümine girýändigini gördük.Tüpeňiň yzygiderliligi midiýa gemolimf ccfDNA-nyň simbiotik bakteriýalary we sowuk wulkan deňiz kenarýaka ekosistemalaryna mahsus biomlardan DNK böleklerini öz içine alýan we özbaşdak däl DNK bölekleriniň bardygyny görkezdi.Gemolimf ccfDNA-da dürli host aralygyndaky wiruslardan alnan wirus yzygiderliligi bar.Şeýle hem süňkli balyk, deňiz anemonlary, suwotulary we mör-möjekler ýaly köp öýjükli haýwanlardan DNK böleklerini tapdyk.Sözümiziň ahyrynda, LB düşünjesiniň deňiz oňurgasyz haýwanlaryna deňiz ekosistemalarynda baý genom repertuaryny döretmek üçin üstünlikli ulanylyp bilinjekdigini görkezýär.
Ulular (uzynlygy 55-70 mm) Mytilus platensis (M. platensis) we Aulacomya atra (A. atra) Port-au-Fransiýanyň (049 ° 21.235 S, 070 ° 13.490 E.) Aralyk gaýa kenarlaryndan ýygnaldy.Kerguelen adalary 2018-nji ýylyň dekabrynda. Beýleki uly gök midiýalar (Mytilus spp.) Söwda üpjün edijisinden (PEI Mussel King Inc., Şazada Edward adasy, Kanada) alyndy we 32 ‰ emeli şor 10–20 L bolan temperatura gözegçilik edilýän (4 ° C) gazly tankda ýerleşdirildi.(emeli deňiz duzy Reef Kristal, Derrew Okean, Wirjiniýa, ABŞ).Her synag üçin aýratyn gabyklaryň uzynlygy we agramy ölçeldi.
Bu programma üçin mugt açyk giriş protokoly onlaýn (https://doi.org/10.17504/protocols.io.81wgb6z9olpk/v1) elýeterlidir.Gysgaça, LB gemolimfi alnyp gaçylan myşsalardan ýygnaldy [22].Gemolimf 1200 × g 3 minutda sentrifugasiýa bilen aýdyňlaşdyryldy, adatdan daşary tebigat ulanylýança doňdy (-20 ° C).CFDNA-ny izolirlemek we arassalamak üçin, öndürijiniň görkezmesine laýyklykda NucleoSnap cfDNA toplumy (Macherey-Nagel, Bethlehen, PA) ulanylyp, nusgalar (1,5-2.0 ml) eritildi we gaýtadan işlenildi.ccfDNA has giňişleýin derňew geçirilýänçä -80 ° C derejesinde saklandy.Käbir synaglarda, QIAamp DNK derňewçi toplumy (QIAGEN, Toronto, Ontario, Kanada) ulanylyp, ccfDNA izolirlendi we arassalandy.Arassalanan DNK, adaty PicoGreen barlagy arkaly kesgitlenildi.Izolirlenen ccfDNA-nyň bölek paýlanyşy, ýokary duýgurlyk DNK toplumyny ulanyp, Agilent 2100 bioanalizeri (Agilent Technologies Inc., Santa Klara, CA) ulanyp, kapilýar elektroforez bilen seljerildi.Derňew öndürijiniň görkezmesine laýyklykda 1 cl ccfDNA nusgasy bilen geçirildi.
Gemolimf ccfDNA bölekleriniň yzygiderliligi üçin Genom Kwebek (Monreal, Kwebek, Kanada) Illumina MiSeq PE75 toplumynyň Illumina DNA Mix toplumyny ulanyp, tüpeň kitaphanalaryny taýýarlady.Adaty adapter (BioO) ulanyldy.Çig maglumatlar faýllary NCBI yzygiderliligini okamak arhiwinden (SRR8924808 we SRR8924809) elýeterlidir.Esasy okamagyň hiline FastQC [23] ulanyldy.Trimmomatik [24] adapterleri kesmek we pes hilli okamak üçin ulanyldy.Jübüt uçlar bilen ok oklary, biri-birine gabat gelmezlik üçin iň az 20 at güýji bilen has uzyn okalýan FLASH birleşdirildi [25]. Birleşdirilen okalmalar, iki taraplaýyn NCBI taksonomiýa maglumatlar bazasyny (e bahasy <1e - 3 we 90% gomologiýa) ulanyp, BLASTN bilen düşündirildi we pes çylşyrymly yzygiderliligi DUST ulanyp ýerine ýetirildi [26]. Birleşdirilen okalmalar, iki taraplaýyn NCBI taksonomiýa maglumatlar bazasyny (e bahasy <1e - 3 we 90% gomologiýa) ulanyp, BLASTN bilen düşündirildi we pes çylşyrymly yzygiderliligi DUST ulanyp ýerine ýetirildi [26]. Объединенные чтения были аннотированя с помощью BLASTN с использованием басйных так такомии двустворч чатх моллюсков NCBI (значение e <1e-3 и 90% tutологии) зованием DUST [26]. Howuzlanan okalmalar, NCBI bivalve taksonomiýa maglumatlar bazasyny (e bahasy <1e-3 we 90% gomologiýa) ulanyp, BLASTN bilen düşündirildi we pes çylşyrymlylyk yzygiderliligi DUST ulanyp geçirildi [26].使用 双壳类 NCBI 分类 数据库 （e 值 <1e-3 和 90% 同源 性 AS BLASTN 注释 合并 的 读数 ， UST UST使用 双 壳 ncbi 分类 （1 <1e-3 和 90% 同源） 使用 使用 使用 使用 使用 使用 使用 使用 使用 使用 使用 使用 使用 使用 使用 使用 使用 使用Объединенные чтения были аннотированя с помощью BLASTN с использованием так консомической басы чырых двустворч чатх моллюсков NCBI (значение e <1e-3 и 90% «Продологиоми») пользованием DUST [26]. Poolirlenen okaýyşlar, NCBI bivalve taksonomiki maglumatlar binýadyny (e bahasy <1e-3 we 90% gomologiýa) ulanyp, BLASTN bilen düşündirildi we pes çylşyrymlylyk yzygiderliligi DUST ulanyp geçirildi [26].Okalmalar iki topara bölündi: gapma-garşylyk yzygiderliligi bilen baglanyşykly (bu ýerde öz-özüňi okamak diýilýär) we baglanyşyksyz (öz-özüňi okamaýar).Iki topar topar döredip, MEGAHIT ulanyp aýratyn ýygnandy [27].Bu aralykda, keseki mikrobioma okalýanlaryň taksonomiki paýlanyşy Kraken2 [28] ulanylyp, Galaxy-da Krona pirog diagrammasy bilen grafiki görnüşde görkezilýär [29, 30].Iň amatly kmers deslapky synaglarymyzdan kmers-59 diýip kesgitlenildi. Soňra öz-özüňi görkezýänler, soňky düşündiriş üçin BLASTN (bivalve NCBI maglumatlar bazasy, e bahasy <1e - 10 we 60% gomologiýa) bilen deňleşmek arkaly kesgitlenildi. Soňra öz-özüňi görkezýänler, soňky düşündiriş üçin BLASTN (bivalve NCBI maglumatlar bazasy, e bahasy <1e - 10 we 60% gomologiýa) bilen deňleşmek arkaly kesgitlenildi. ЗАТЕМ собственные бастиги были идентифицирован путем сопоставления с BLASTN (База чанных двустворч чех моллюсков NCBI, значение e <1e-10 ижидология 60%) для окончательной аннотации. Soňra öz-özüňi görkezýänler, soňky düşündiriş üçin BLASTN (NCBI bivalve maglumatlar bazasy, e bahasy <1e-10 we 60% gomologiýa) bilen gabat gelmek arkaly kesgitlenildi.然后 通过 与 BLASTN （双 壳 贝类 NCBI 数据库 ， e 值 <1e-10 和 60% 同源 性） 对齐 来。。。。然后 通过 与 BLASTN （双 壳 贝类 NCBI 数据库 ， e 值 <1e-10 和 60% Затем были идентифицированя собственные бартиги для окончательной аннотации путем сопоставления с BLASTN (Баса чәннех NCBI длу двустворч чех моллюсксков, значение e <1e-10 и чингология 60%). Soňra öz-özüňi görkezýänler, BLASTN (NCBI bivalve maglumatlar bazasy, e bahasy <1e-10 we 60% gomologiýa) bilen deňeşdirip, soňky düşündiriş üçin kesgitlenildi. Muňa ugurdaşlykda, topar däl toparlara BLASTN (nt NCBI maglumatlar bazasy, e bahasy <1e - 10 we 60% gomologiýa) bilen düşündiriş berildi. Muňa ugurdaşlykda, topar däl toparlara BLASTN (nt NCBI maglumatlar bazasy, e bahasy <1e - 10 we 60% gomologiýa) bilen düşündiriş berildi. Параллельно чужеродные групповые бастиги были аннотированя с помощью BLASTN (База чныных nt NCBI, значение e <1e-10 идология 60%). Muňa ugurdaşlykda, daşary ýurt toparlary BLASTN (NT NCBI maglumatlar bazasy, e bahasy <1e-10 we 60% gomologiýa) bilen düşündirildi.平行 地 ， AS BLASTN （nt NCBI 数据库 ， e 值 <1e-10 和 60% 同源 性） 注释 非 自身。。。平行 地 ， AS BLASTN （nt NCBI 数据库 ， e 值 <1e-10 和 60% 同源 性） 注释 非 自身。。。 Параллельно кстиги, не относящиеся к собственной группе, были аннотирован с помощю BLASTN (База чныных NCBI, значение e <1e-10 и Идология 60%). Muňa ugurdaşlykda, öz-özüne degişli bolmadyk toparlar BLASTN (nt NCBI maglumatlar bazasy, e bahasy <1e-10 we 60% gomologiýa) bilen düşündirildi. Şeýle hem, BLASTX nr we RefSeq belok NCBI maglumat bazalaryny (e bahasy <1e - 10 we 60% gomologiýa) ulanyp, öz-özünden ýokaşdy. Şeýle hem, BLASTX nr we RefSeq belok NCBI maglumat bazalaryny (e bahasy <1e - 10 we 60% gomologiýa) ulanyp, öz-özünden ýokaşdy. BLASTX также был проведен на امамостоятельных абтитигах с использованием басных белка nr RefSeq NCBI (значение e <1e-10 и идология 60%). BLASTX, şeýle hem, nr we RefSeq NCBI belok bazalaryny (e bahasy <1e-10 we 60% gomologiýa) ulanyp, öz-özüne bagly bolmadyk enjamlarda ýerine ýetirildi.还 使用 nr 和 RefSeq 蛋白 NCBI 数据库 对 非 自身 了 AS BLASTX （e 值 <1e-10 和 60% 同源 性）。还 使用 nr 和 RefSeq 蛋白 NCBI 数据库 对 非 自身 了 AS BLASTX （e 值 <1e-10 和 60% 同源 性）。 BLASTX также виполняли на амамостоятельных атитигах с использованием басных белка nr RefSeq NCBI (значение e <1e-10 и идология 60%). BLASTX, şeýle hem, nr we RefSeq NCBI belok bazalaryny (e bahasy <1e-10 we 60% gomologiýa) ulanyp, öz-özüne bagly bolmadyk enjamlarda ýerine ýetirildi.Öz-özünden bolmadyk “BLASTN” we “BLASTX” howuzlary soňky bölümleri görkezýär (Goşmaça faýla serediň).
PCR üçin ulanylýan desgalar S1-nji tablisada görkezilýär.Taq DNK polimeraza (Bio Basic Canada, Markham, ON) ccfDNA maksatly genleri güýçlendirmek üçin ulanyldy.Aşakdaky reaksiýa şertleri ulanyldy: 95 minutda 3 minutda denatasiýa, 1 minutda 95 ° C, 1 minutlap gyzdyryjy temperaturany, 72 minutda 1 minutda uzalmagy, 35 aýlaw we 10 minutyň içinde 72 ° C..PCR önümleri, SYBRTM Howpsuz DNK Gel tegmili (Invitrogen, Burlington, ON, Kanada) bolan agarose jellerinde (1,5%) elektroforez bilen bölünipdi.
Musseller (Mytilus spp.) 500 ml kislorodly deňiz suwunda (32 PSU) 4 ° C-de 24 sagatlap aklimatizasiýa edildi.Adamyň galektin-7 cDNA yzygiderliligini kodlaýan (NCBI goşulma belgisi L07769) öz içine alýan plazmid DNK, iň soňky konsentrasiýasynda 190 μg / μl goşuldy.DNK goşmazdan şol bir şertlerde inkubirlenen midiýalar gözegçilikdi.Üçünji dolandyryş tankynda midýa ýok DNK bar.Deňiz suwundaky DNK-nyň hiline gözegçilik etmek üçin görkezilen wagtda her tankdan deňiz suwunyň nusgalary (20 μl; üç gezek gaýtalanýar) alyndy.Plazmid DNK yzarlamak üçin LB midiýalary görkezilen wagtlarda ýygnaldy we qPCR we ddPCR tarapyndan analiz edildi.Deňiz suwunyň duzunyň köp bolmagy sebäpli, alikotlar PCR barlaglaryndan öň PCR hil suwunda (1:10) suwuklandyryldy.
Sanly damja PCR (ddPCR) BioRad QX200 protokolyny (Mississauga, Ontario, Kanada) ulanyp ýerine ýetirildi.Iň amatly temperaturany kesgitlemek üçin temperatura profilini ulanyň (S1-nji tablisa).Damjalar QX200 damja generatoryny (BioRad) ulanyp döredildi.ddPCR aşakdaky ýaly geçirildi: 5 minut üçin 95 ° C, 30 s üçin 50 ° aýlaw we 30 minut üçin 72 ° C, 5 minutda 4 ° C we 5 minutda 90 ° C.Damjalaryň we polo positiveitel reaksiýalaryň sany (nusgalaryň sany / µl) QX200 damja okyjy (BioRad) ulanylyp ölçenildi.10,000 damjadan az bolan nusgalar ret edildi.Her gezek ddPCR işledilende nagyş gözegçiligi ýerine ýetirilmedi.
qPCR Rotor-Gene® 3000 (Corbett Research, Sidneý, Awstraliýa) we LGALS7 ýörite primerleri ulanyp ýerine ýetirildi.Quanthli mukdar PCR-ler “QuantiFast SYBR Green PCR Kit” (QIAGEN) ulanyp 20 µl ýerine ýetirildi.qPCR 95 ° C-de 15 minut inkubasiýa bilen başlandy, 40 sekuntda 95 ° C-de 10 sekuntda we 60 ° C-de 60 sekuntda bir maglumat ýygnamak bilen başlandy.Ereýän egriler 95 ° C-den 5 s, 65 ° C-den 60 s we qPCR-iň soňunda 97 ° C-den yzygiderli ölçegler arkaly döredildi.Her bir qPCR gözegçilik nusgalaryndan başga üçlükde ýerine ýetirildi.
Midiýalar ýokary süzgüç derejesi bilen belli bolansoň, ilki bilen deňiz suwlarynda bar bolan DNK böleklerini süzüp we saklap biljekdigini anykladyk.Şeýle hem bu bölekleriň ýarym açyk limfa ulgamynda jemlenýändigi bilen gyzyklandyk.Bu meseläni gök midýa baklaryna goşulan erän DNK bölekleriniň ykbalyny yzarlamak arkaly synagdan geçirdik.DNK böleklerini yzarlamagy aňsatlaşdyrmak üçin, adam galektin-7 genini öz içine alýan daşary ýurt (özi däl) plazmid DNK ulandyk.ddPCR deňiz suwlarynda we midiýalarda plazmid DNK böleklerini yzarlaýar.Netijelerimiz, deňiz suwundaky DNK bölekleriniň mukdary wagtyň geçmegi bilen (7 güne çenli) üýtgemän galsa, midiýa ýok bolsa, bu derejäniň 8 sagadyň içinde düýbünden ýok bolandygyny görkezýär (1a surat, b).Ekzogen DNK-nyň bölekleri içerki damar suwuklygynda we gemolimfda 15 minudyň içinde aňsatlyk bilen tapyldy (1-nji surat).Bu bölekleri täsir edenden 4 sagat soňam tapyp bolýar.DNK bölekleri bilen baglanyşykly bu süzgüç işjeňligi bakteriýalaryň we suwotularyň süzgüç işjeňligi bilen deňeşdirilýär [31].Bu netijeler midýalaryň suwuk bölümlerinde daşary ýurt DNK-laryny süzüp we toplap biljekdigini görkezýär.
DdPCR bilen ölçelýän midýalaryň (A) ýa-da ýoklugynda (B) deňiz suwundaky plazmid DNK-nyň otnositel konsentrasiýalary.A-da, netijeler göterim hökmünde görkezilýär, gutularyň araçäkleri 75-nji we 25-nji göterimleri görkezýär.Gurnalan logarifmiki egrilik gyzyl reňkde we çal reňkdäki meýdan 95% ynam aralygyny görkezýär.B-de gyzyl çyzyk ortaça, gök çyzyk konsentrasiýa üçin 95% ynam aralygyny görkezýär.C Plazmid DNK goşulandan soň dürli döwürlerde midiýalaryň gemolimfda we walwul suwuklygynda plazmid DNK-nyň toplanmagy.Netijeler ýüze çykarylan / mL (± SE) mutlak nusgalar hökmünde görkezilýär.
Soň bolsa, antropogen täsiri çäkli adalaryň uzak topary bolan Kerguelen adalarynda midýa düşeklerinden ýygnanan midiýalarda ccfDNA-nyň gelip çykyşyny derňedik.Bu maksat bilen midiýa gemolimflaryndan cccDNA izolirlendi we adam cccDNA-ny arassalamak üçin köplenç ulanylýan usullar bilen arassalandy [32, 33].Erişlerdäki ortaça gemolimf ccfDNA konsentrasiýalarynyň her ml gemolimf diapazony üçin pes mikrogramlarda bolandygyny gördük (S2 Tablisa, Goşmaça maglumatlar).Bu konsentrasiýa diapazony sagdyn adamlara garanyňda has uludyr (millilitr üçin pes nanogram), ýöne seýrek ýagdaýlarda, rak kesellerinde ccfDNA derejesi millilitr üçin birnäçe mikrogramma ýetip biler [34, 35].Gemolimf ccfDNA-nyň ululygynyň paýlanyşynyň seljermesi bu bölekleriň 1000 at güýjünden 1000 at güýjüne çenli ululykda üýtgeýändigini görkezdi.5000 bp çenli (2-nji surat).Şuňa meňzeş netijeler, kremniý esasly QIAamp Derňewçi Kitiň kömegi bilen, genom DNK-syny pes konsentrasiýaly DNK nusgalaryndan, şol sanda ccfDNA-dan çalt izolirlemek we arassalamak üçin ulanylýan usuldyr [36].
Mussel gemolimfiniň wekili ccfDNA elektroforegramy.NucleoSnap plazma toplumy (ýokarda) we QIAamp DNK derňewçi toplumy bilen alyndy.B gemolimf ccfDNA konsentrasiýalarynyň (± SE) midýalarda paýlanyşyny görkezýän skripka çyzgysy.Gara we gyzyl çyzyklar degişlilikde orta we birinji we üçünji kwartallary aňladýar.
Adamlarda we primatlarda ccfDNA-nyň takmynan 1% -iniň daşary ýurt çeşmesi bar [21, 37].Bivallaryň ýarym açyk gan aýlanyş ulgamyny, mikroblara baý deňiz suwuny we midýa ccfDNA-nyň ululygynyň paýlanyşyny göz öňünde tutup, midiýa gemolimf ccfDNA-da mikrob DNK-nyň baý we dürli howuzynyň bolup biljekdigini çakladyk.Bu çaklamany barlamak üçin, Kerguelen adalaryndan ýygnan Aulacomya atra nusgalaryndan gemolimf ccfDNA-ny yzygiderlilik etdik, 10 milliondan gowrak okaldy, 97,6% -i hil gözegçiliginden geçdi.Soňra okalanlar, BLASTN we NCBI bivalve maglumat bazalaryny ulanyp, öz-özüne we özbaşdak däl çeşmelere görä klassifikasiýa edildi (S1-nji surat, goşmaça maglumatlar).
Adamlarda ýadro we mitohondrial DNK hem gana çykyp biler [38].Şeýle-de bolsa, häzirki gözlegde, A. atra geniniň yzygiderli ýa-da beýan edilmändigini göz öňünde tutup, midýalaryň ýadro genom DNK-syny jikme-jik beýan etmek mümkin däldi.Şeýle-de bolsa, bivalve kitaphanasyny ulanyp, öz gelip çykyşymyzyň birnäçe ccfDNA böleklerini kesgitläp bildik (S2-nji surat, goşmaça maglumatlar).Şeýle hem, yzygiderli A. A. atra genleriniň PCR güýçlendirilmegi arkaly öz gelip çykyşymyzyň DNK bölekleriniň bardygyny tassykladyk (3-nji surat).Edil şonuň ýaly-da, A. atranyň mitokondrial genomynyň jemgyýetçilik maglumatlar bazalarynda bardygyny göz öňünde tutup, A. atranyň gemolimfasynda mitohondrial ccfDNA bölekleriniň bardygyny subut edip bolar.Mitokondrial DNK bölekleriniň barlygy PCR güýçlendirilmegi bilen tassyklandy (3-nji surat).
A. atranyň gemolimfasynda (gyzyl nokatlar - aksiýa belgisi: SRX5705969) we PCR tarapyndan güýçlendirilen M. platensis (gök nokatlar - aksiýa belgisi: SRX5705968) dürli mitokondrial genler bardy.Surat Breton we başg.PCR garyndysyny öz içine alýan PCR turbasyna gönüden-göni goşmak üçin 3 mm zarba ulanyň.
Deňiz suwundaky mikroblaryň köpdügini göz öňünde tutup, ilki bilen gemolimfda mikrob DNK yzygiderliliginiň häsiýetine ünsi jemledik.Munuň üçin iki dürli strategiýany ulanýarys.Ilkinji strategiýada, BLAST we beýleki gurallar bilen deňeşdirip boljak takyklyk bilen mikrob yzygiderliligini kesgitläp bilýän algoritm esasly yzygiderlilik klassifikasiýa programmasy Kraken2 ulanyldy [28].6719-dan gowrak okalyşyň bakteriýalardan gelip çykandygy, 124 we 64-si degişlilikde arhaýa we wiruslardan bolandygy kesgitlenildi (4-nji surat).Iň köp bakterial DNK bölekleri Firmicutes (46%), Proteobacteria (27%) we Bakteroidetes (17%) boldy (4a surat).Bu paýlanyş, deňiz gök midiýa mikrobiomynyň öňki gözleglerine laýyk gelýär [39, 40].Gammaproteobakteriýalar, köp Wibrionallary öz içine alýan Proteobakteriýalaryň (44%) esasy synpydy (4b surat).DdPCR usuly, A. atra gemolimfyň ccfDNA-da Vibrio DNK bölekleriniň bardygyny tassyklady (4-nji surat) [41].CcfDNA-nyň bakterial gelip çykyşy barada has giňişleýin maglumat almak üçin goşmaça çemeleşildi (S2-nji surat, goşmaça maglumatlar). Bu ýagdaýda, biri-birine gabat gelýän jübüt okalýan görnüşde ýygnalandygyny we BLASTN ulanyp, öz bahasy (1) - 3 bahasy we> 90% gomologiýa bilen kesilmegi ýaly toparlara bölünýändigi okalýar. Bu ýagdaýda, biri-birine gabat gelýän jübüt okalýan görnüşde ýygnalandygyny we BLASTN ulanyp, öz bahasy (1) - 3 bahasy we> 90% gomologiýa bilen kesilmegi ýaly toparlara bölünýändigi okalýar. В этом случае перекрывающиеся чтения были собраня как чентия с парными концами и были мсифицированя как собственные (двустворчяе моллюски) или чужие по происхождению с сспользовы %. Bu ýagdaýda bir-birine gabat gelýän okalmalar jübüt okalýan görnüşde ýygnaldy we BLASTN we ee bahasy 1e-3 ulanyp, ýerli (bivalve) ýa-da asyl däl toparlara bölünip, 90% gomologiýa bilen kesildi.在 这种 情况 使用 使用 使用 使用 使用 AST BLASTN 和 1e-3 的 e 值> 90% 同源 性 90 90 90。。。使用 这 种 使用 使用 使用 使用 使用 使用 使用 使用 使用 90 90 90 90 90 90 90 90 90 90 90 90 90 90 90 90 Вот слечтиров арәмова Соро kaawigasiýa мовога осоги> 90%. Bu ýagdaýda bir-birine gabat gelýän okalmalar jübüt gutarýan okalmalar hökmünde ýygnalyp, e BLASTN we 1e-3 bahalary we gomologiýa çäkleri> 90% ulanyp, özbaşdak (deňeşdirilen) ýa-da asyl däl toparlara bölünýär.A. atra genomy entek yzygiderlilikli bolmansoň, MEGAHIT Next Generation Sequencing (NGS) ýygnaýjysynyň de-nowo ýygnamak strategiýasyny ulandyk.Jemi 147,188 kontig gelip çykyşyna garaşly (bäsdeş) hökmünde kesgitlenildi.Soňra bu enjamlar, BLASTN we BLASTX ulanyp, 1e-10 elektron bahalary bilen partladyldy.Bu strategiýa, A. atra ccfDNA-da bar bolan 482 sany gapma-garşylykly bölekleri kesgitlemäge mümkinçilik berdi.Bu DNK bölekleriniň ýarysyndan gowragy (57%) bakteriýalardan, esasan, gil simbionlaryndan, şol sanda sulfotrofik simbionlardan we gill simbionlaryndan Solemya velumyndan alyndy (5-nji surat).
Görnüş derejesinde otnositel bollyk.B Iki esasy filanyň mikrob dürlüligi (Firmicutes we Proteobacteria).DdPCR C Vibrio spp-iň wekil güýçlendirilmegi.A. Üç atra gemolimfda 16S rRNA geniniň (gök) bölekleri.
Jemi 482 ýygnalan kontig analiz edildi.Metagenomiki kontig bellikleriň (prokaryotlar we eukariotlar) taksonomiki paýlanyşynyň umumy tertibi.B BLASTN we BLASTX tarapyndan kesgitlenen bakterial DNK bölekleriniň jikme-jik paýlanyşy.
Kraken2 seljermesi, midýa ccfDNA-da Euryarhaeota (65%), Crenarchaeota (24%) we Thaurmarcheota (11%) ýaly arheal DNK bölekleriniň bardygyny görkezdi (6a surat).Kaliforniýa midiýalarynyň mikrob jemgyýetinde öň tapylan Euryarchaeota we Crenarchaeota-dan alnan DNK bölekleriniň bolmagy geň galdyrmaly däldir [42].“Euryarchaeota” köplenç aşa şertler bilen baglanyşykly bolsa-da, “Euryarchaeota” bilen “Crenarcheota” -nyň deňiz kriogen gurşawynda iň köp ýaýran prokaryotlaryň hataryndadygy indi ykrar edildi [43, 44].Eriklerde metanogen mikroorganizmleriň bolmagy geň däldir, soňky döwürde Kerguelen platosynyň aşaky syzyşlaryndan giň metanyň syzmagy we Kerguelen adalarynyň kenarlarynda bolup biläýjek mikrob metanyň öndürilmegi [46].
Soňra ünsümiz DNK wiruslaryndan okaldy.Biziň bilşimize görä, midiýa wirusynyň mazmunyny ilkinji maksatlaýyn öwrenmek.Garaşylyşy ýaly, bakteriofaglaryň (Caudovirales) DNK böleklerini tapdyk (6b surat).Şeýle-de bolsa, iň köp ýaýran wirus DNK, islendik wirusyň iň uly genomy bolan ýadro sitoplazmatiki uly DNK wirusy (NCLDV) diýlip hem atlandyrylýan nukleositowiruslardan ybaratdyr.Bu phylumyň içinde DNK yzygiderliliginiň köpüsi oňurgaly haýwanlary we artropodlary öz içine alýan Mimimidoviridae (58%) we Poxviridae (21%) maşgalalaryna degişlidir, bu DNK yzygiderliliginiň az bölegi belli wirologiki suwotulara degişlidir.Deňiz eukariotik suwotularyna ýokaşýar.Bu yzygiderlilik, belli bir wirus görnüşiniň iň uly genom ululygyndaky äpet wirus Pandora wirusyndan hem alyndy.Gyzykly tarapy, gemolimf ccfDNA yzygiderliligi bilen kesgitlenişi ýaly wirusa ýokaşan öý eýeleriniň diapazony birneme uludy (S3-nji surat, Goşmaça maglumatlar).Oňa Baculoviridae we Iridoviridae ýaly mör-möjeklere ýokaşýan wiruslar, amyeba, suwotulary we oňurgaly haýwanlary ýokaşdyrýan wiruslar girýär.Şeýle hem, Pithovirus sibericum genomyna gabat gelýän yzygiderliligi tapdyk.Pitowiruslar (“zombi wiruslary” diýlip hem atlandyrylýar) ilkinji gezek Sibirdäki 30,000 ýyllyk permafrostdan izolirlendi [47].Şeýlelik bilen, netijelerimiz bu wiruslaryň häzirki zaman görnüşleriniň hemmesiniň ýok bolup bilmeýändigini we bu wiruslaryň uzakdaky subarktik deňiz ekosistemalarynda bolup biljekdigini görkezýän öňki habarlara laýyk gelýär.
Ahyrynda, beýleki köp öýjükli haýwanlardan DNK böleklerini tapyp biljekdigimizi barladyk.Jemi 482 daşary ýurtly kontakt BLASTN we BLASTX tarapyndan nt, nr we RefSeq kitaphanalary (genom we belok) bilen kesgitlenildi.Netijelerimiz, köp öýjükli haýwanlaryň ccfDNA-nyň keseki bölekleriniň arasynda süňk süňkleriniň DNK-synyň agdyklyk edýändigini görkezýär (5-nji surat).Mör-möjeklerden we beýleki görnüşlerden DNK bölekleri hem tapyldy.DNK bölekleriniň ep-esli bölegi, ýerüsti görnüşler bilen deňeşdirilende genom maglumatlar bazalarynda köp sanly deňiz görnüşiniň az görkezilmegi sebäpli ýüze çykarylmady [49].
Häzirki kagyzda, gemolimf ccfDNA atyş yzygiderliliginiň deňiz kenarýaka ekosistemalarynyň düzümi barada düşünje berip biljekdigini öňe sürüp, midiýalara LB düşünjesini ulanýarys.Hususan-da, 1) midýa gemolimfynyň aýlanylýan DNK bölekleriniň deňeşdirilende uly (~ 1-5 kb) ýokary konsentrasiýalarynyň (mikrogram derejesi) bardygyny gördük;2) bu DNK bölekleri hem garaşsyz, hem garaşsyz däl 3) Bu DNK bölekleriniň daşary ýurt çeşmeleriniň arasynda bakterial, arheal we wirus DNK-ny, şeýle hem beýleki köp öýjükli haýwanlaryň DNK-syny tapdyk;4) Gemolimfda bu daşary ýurt ccfDNA bölekleriniň toplanmagy çalt ýüze çykýar we midiýalaryň içki süzgüç işjeňligine goşant goşýar.Sözümiziň ahyrynda, gözlegimiz şu wagta çenli esasan biomedisina pudagynda ulanylýan LB düşünjesiniň, garawul görnüşleriniň we olaryň daşky gurşawynyň arasyndaky täsire has gowy düşünmek üçin ulanyp boljak baý, ýöne öwrenilmedik bilim çeşmesini kodlaýandygyny görkezýär.
Primatlardan başga-da, süýdemdirijilerde, şol sanda syçanlarda, itlerde, pişiklerde we atlarda ccfDNA izolýasiýasynyň bardygy habar berildi [50, 51, 52].Şeýle-de bolsa, biziň bilşimize görä, açyk dolanyşyk ulgamy bolan deňiz görnüşlerinde ccfDNA-nyň tapylandygyny we yzygiderliligini ilkinji bolup habar berýän gözlegimizdir.Midiýalaryň bu anatomiki aýratynlygy we süzgüç ukyby, iň bolmanda bölekleýin DNK bölekleriniň beýleki görnüşler bilen deňeşdirilende dürli ölçeg aýratynlyklaryny düşündirip biler.Adamlarda ganda aýlanýan DNK bölekleriniň köpüsi 150-den 200 at güýji aralygyndaky ownuk böleklerdir.iň ýokary derejesi 167 bp [34, 53].DNK bölekleriniň kiçi, ýöne ähmiýetli bölegi 300 bilen 500 bp aralygynda, takmynan 5% 900 bp-den uzyn.[54].Bu ululygyň paýlanmagynyň sebäbi, plazmadaky ccfDNA-nyň esasy çeşmesiniň, öýjügiň ölmegi ýa-da sagdyn adamlarda aýlanylýan gematopoetiki öýjükleriň nekrozy ýa-da rak keselindäki çiş öýjükleriniň apoptozy sebäpli ýüze çykmagydyr (aýlanylýan çiş DNK diýilýär)., ctDNA).Midiýalarda tapylan gemolimf ccfDNA-nyň ululygy 1000-den 5000 at aralygynda bolup, midýa ccfDNA-nyň başga bir gelip çykyşyny görkezýär.Bu logiki çaklama, sebäbi midýalarda ýarym açyk damar ulgamy bar we mikrob genom DNK-nyň ýokary konsentrasiýasyny öz içine alýan deňiz suw şertlerinde ýaşaýar.Aslynda, ekzogen DNK-ny ulanmak bilen geçirilen laboratoriýa synaglarymyz midiýalaryň deňiz suwlarynda DNK böleklerini ýygnaýandygyny, iň azyndan birnäçe sagatdan soň öýjükli öýjükli we / ýa-da dürli guramalarda saklanandan soň zaýalanýandygyny görkezdi.Öýjükleriň seýrek bolandygyny (prokaryotik we eukariotik) göz öňünde tutup, içerki damar bölekleriniň ulanylmagy öz-özünden we daşary ýurt çeşmelerinden ccfDNA mukdaryny azaldar.Bivalve dogabitdi immunitetiň we köp sanly aýlanýan fagositleriň ähmiýetini göz öňünde tutup, hatda mikroorganizmler we / ýa-da öýjükli galyndylar iýilenden soň daşary ýurt DNK-laryny ýygnaýan fagositler bilen daşary ýurt ccfDNA-nyň baýlaşdyrylandygyny çakladyk.Netijelerimiz bilelikde alnanda, bivalve gemolimf ccfDNA-nyň molekulýar maglumatlaryň özboluşly ammarydygyny we olaryň garawul görnüşi statusyny güýçlendirýändigini görkezýär.
Maglumatlarymyz, bakteriýalardan alnan gemolimf ccfDNA bölekleriniň yzygiderliliginiň we seljermesiniň, bakterial ösümlik dünýäsi we töwerekdäki deňiz ekosistemasynda bar bolan bakteriýalar barada möhüm maglumatlary berip biljekdigini görkezýär.Atyş yzygiderliliginiň usullary, adaty 16S rRNA kesgitleýiş usullary ulanylan bolsa, bölekleýin salgylanma kitaphanasynyň ikitaraplaýynlygy sebäpli ýitirilen A. A. atra gill bakteriýalarynyň yzygiderliligini ýüze çykardy.Aslynda, M. platensisden Kergueleniň şol bir midýa gatlagynda toplanan LB maglumatlary ulanmagymyz, gill bilen baglanyşykly bakterial simbionlaryň düzüminiň iki midýa görnüşi üçin birmeňzeşdigini görkezdi (S4-nji surat, Goşmaça maglumatlar).Genetiki taýdan dürli iki midýanyň bu meňzeşligi Kergueleniň sowuk, kükürt we wulkan ýataklarynda bakteriýa jemgyýetleriniň düzümini görkezip biler [55, 56, 57, 58].Kükürdi azaldýan mikroorganizmleriň has ýokary derejesi, Port-au-Fransiýanyň kenary ýaly bioturbasiýa edilen kenarýaka sebitlerinden midýa ýygnalanda gowy suratlandyrylýar.Anotherene bir ähtimallyk, midiýa ösümlik dünýäsine keseligine täsir edip biler [60, 61].Deňiz gurşawynyň, deňiz düýbüniň we midiýadaky simbiotik bakteriýalaryň arasyndaky baglanyşygy kesgitlemek üçin has köp gözleg gerek.Bu gözlegler häzirki wagtda dowam edýär.
Gemolimf ccfDNA-nyň uzynlygy we konsentrasiýasy, arassalanmagy aňsatlygy we ýaragyň çalt yzygiderliligini üpjün etmek üçin ýokary hilli, deňiz kenarýaka ekosistemalarynda biodürlülige baha bermek üçin midýa ccfDNA-ny ulanmagyň köp artykmaçlygydyr.Bu çemeleşme, belli bir ekosistemada wirus jemgyýetlerini (wiruslary) häsiýetlendirmek üçin has täsirli [62, 63].Bakteriýalardan, arhaýalardan we eukariotlardan tapawutlylykda wirus genomlarynda 16S yzygiderliligi ýaly filogenetiki taýdan goralýan genler ýok.Netijelerimiz, midiýa ýaly görkeziji görnüşlerden suwuk biopsiýalaryň, adatça kenarýaka deňiz ekosistemalarynda ýaşaýan ýer eýelerine ýokaşýan belli bir mukdarda ccfDNA wirus böleklerini kesgitlemek üçin ulanylyp bilinjekdigini görkezýär.Bu protozoa, artropodlara, mör-möjeklere, ösümliklere we bakteriýa wiruslaryna (meselem, bakteriofaglara) ýokaşýan wiruslary öz içine alýar.Kergueleniň şol bir midýa gatlagynda ýygnan gök midiýalaryň gemolimf ccfDNA wirusyny (M. platensis) gözden geçirenimizde şuňa meňzeş paýlama tapyldy (S2 Tablisa, Goşmaça maglumatlar).CcfDNA-nyň tüpeň yzygiderliligi hakykatdanam adamlaryň ýa-da beýleki görnüşleriň wirusyny öwrenmekde güýçlenýän täze çemeleşme [21, 37, 64].Bu çemeleşme, iki hatar DNK wiruslaryny öwrenmek üçin has peýdalydyr, sebäbi Baltimorda wiruslaryň iň köp we giň toparyny görkezýän iki hatar DNK wiruslarynyň arasynda ýekeje gen hem saklanmaýar [65].Bu wiruslaryň köpüsi gizlin saklanýandygyna we wirus dünýäsiniň düýbünden näbelli bir ýerinden wiruslary öz içine alyp biljekdigine garamazdan [66], A. atra we M. platensis midiýalarynyň wiruslarynyň we öý eýeleriniň iki görnüşiň arasynda bolandygyny gördük.meňzeş (S3 surata, goşmaça maglumatlara serediň).Bu meňzeşlik geň galdyryjy däl, sebäbi daşky gurşawda bar bolan DNK-nyň kabul edilmeginde saýlamanyň ýoklugyny görkezip biler.Arassalanan RNK-ny ulanmak bilen geljekki gözlegler häzirki wagtda RNK wirusyny häsiýetlendirmek üçin zerurdyr.
Geçirilen işimizde, Kowarskiniň we kärdeşleriniň [37] işinden uýgunlaşdyrylan gaty berk turbany ulandyk, ýerli ccfDNA gurulmazdan ozal we soň ýygnalan okalýanlary we ýazgylary iki basgançakly pozmak, netijede kartasyz okalýanlaryň köp bölegi.Şol sebäpden, bu kartasyz okalýanlaryň käbiri henizem öz gelip çykyşynyň bolup biljekdigini aradan aýyryp bilmeris, esasanam bu midýa görnüşleri üçin salgylanma genomymyz ýok.Şeýle hem bu turbany ulandyk, sebäbi öz-özüňi okamaýan we Illumina MiSeq PE75 tarapyndan döredilen okalýan uzynlyklaryň arasyndaky wagtlar barada alada edýärdik.Düzedilmedik okalmalaryň köpüsiniň başga bir sebäbi deňiz mikroblarynyň köpüsiniň, esasanam Kerguelen ýaly uzak sebitlerde düşündiriş berilmezligi.Adamyň ccfDNA meňzeş ccfDNA bölekleriniň uzynlygyny göz öňünde tutup, Illumina MiSeq PE75 ulandyk.Geljekki gözlegler üçin, gemolimf ccfDNA-nyň adamlara we / ýa-da süýdemdirijilere garanyňda has köp okalýandygyny görkezýän netijelerimizi göz öňünde tutup, has uzyn ccfDNA bölekleri üçin has laýyk yzygiderlilik platformasyny ulanmagy maslahat berýäris.Bu tejribe has çuňňur derňew üçin has köp görkezijini kesgitlemegi has aňsatlaşdyrar.Häzirki wagtda elýeterli däl A. atra ýadro genomynyň yzygiderliligini almak, ccfDNA-nyň öz-özüne we özbaşdak däl çeşmelerden diskriminasiýasyna ep-esli kömek eder.Gözleglerimiziň suwuk biopsiýa düşünjesini midiýalara ulanmak mümkinçiligine gönükdirilendigini göz öňünde tutup, bu düşünjäniň geljekki gözleglerde ulanylýandygy sebäpli midýalaryň mikrob dürlüligini öwrenmek üçin bu usulyň mümkinçiligini ýokarlandyrmak üçin täze gurallar we turbageçirijiler dörediler diýip umyt edýäris.deňiz ekosistemasy.
Çekip bolmaýan kliniki biomarker hökmünde, ccfDNA-nyň adam plazma derejesiniň ýokarlanmagy dürli keseller, dokumalaryň zeperlenmegi we stres ýagdaýlary bilen baglanyşyklydyr [67,68,69].Bu ýokarlanma dokumanyň zeperlenmeginden soň öz gelip çykyşyndaky DNK bölekleriniň çykmagy bilen baglanyşyklydyr.Midiýa 30 ° C temperaturada gysga wagtyň içinde ýiti ýylylyk stresini ulanyp bu meseläni çözdük.Bu derňewi üç sany garaşsyz synagda üç dürli midýa görnüşinde amala aşyrdyk.Şeýle-de bolsa, ýiti ýylylyk stresinden soň ccfDNA derejesinde hiç hili üýtgeşme tapmadyk (S5 surata, goşmaça maglumatlara serediň).Bu açyş, midiýalaryň ýarym açyk gan aýlanyş ulgamynyň bardygyny we ýokary süzgüç işjeňligi sebäpli köp mukdarda daşary ýurt DNK-synyň toplanmagyny düşündirip biler.Beýleki tarapdan, midiýalar, oňurgasyzlaryň köpüsi ýaly, stresli dokumalaryň zeperlenmegine has çydamly bolup biler we şeýlelik bilen gemolimfda ccfDNA-nyň çykmagyny çäklendirer [70, 71].
Şu güne çenli suw ekosistemalarynda biodürlüligiň DNK seljermesi esasan daşky gurşaw DNK (eDNA) metabarkodirlemegine gönükdirildi.Şeýle-de bolsa, bu usul adatça primer ulanylanda biodürlüligiň derňewinde çäklidir.Tüpeň yzygiderliliginiň ulanylmagy PCR-iň çäklendirmelerinden we başlangyç toplumlaryň ikitaraplaýyn saýlanmagyndan geçýär.Şeýlelik bilen, belli bir derejede böleklere bölünen DNK-ny gönüden-göni yzygiderliligi we ähli organizmleri derňemegi başarýan ýokary ulanylýan eDNA atyş tüpeňiniň yzygiderliligine has ýakyn [72, 73].Şeýle-de bolsa, LB-ni adaty eDNA usullaryndan tapawutlandyrýan birnäçe möhüm meseleler bar.Elbetde, eDNA bilen LB-iň esasy tapawudy tebigy süzgüç eýeleriniň ulanylmagydyr.EDNA-ny öwrenmek üçin tebigy süzgüç hökmünde gubkalar we baldaklar (Dresseina spp.) Marinealy deňiz görnüşleriniň ulanylandygy habar berildi [74, 75].Şeýle-de bolsa, Dreissenanyň gözleginde DNK çykarylan dokuma biopsiýasy ulanyldy.LB-den ccfDNA-ny seljermek, eDNA ýa-da dokuma biopsiýasy bilen baglanyşykly dokuma biopsiýasyny, ýöriteleşdirilen we käwagt gymmat enjamlary we logistikany talap etmeýär.Aslynda, LB-den ccfDNA-nyň sowuk zynjyry saklamazdan FTA goldawy bilen saklanyp we analiz edilip bilinjekdigini habar berdik, bu uzak sebitlerde gözleg üçin esasy kynçylykdyr [76].CcfDNA-ny suwuk biopsiýalardan çykarmak hem ýönekeý we tüpeň yzygiderliligi we PCR derňewi üçin ýokary hilli DNK üpjün edýär.EDNA derňewi bilen baglanyşykly käbir tehniki çäklendirmeleri göz öňünde tutup, bu uly artykmaçlykdyr [77].Nusga almagyň usulynyň ýönekeýligi we arzan bahasy uzak möhletleýin gözegçilik programmalary üçin aýratyn amatlydyr.Highokary süzgüç ukybyna goşmaça, gapma-garşylyklaryň ýene bir belli aýratynlygy, wiruslaryň siňmegine kömek edýän mukamynyň himiki mukopolisakarid düzümi bolup durýar [78, 79].Bu, biodürlüligi we howanyň üýtgemeginiň belli bir suw ekosistemasyndaky täsirini häsiýetlendirmek üçin ideal tebigy süzgüç edýär.Öý eýesinden alnan DNK bölekleriniň bardygyny, eDNA bilen deňeşdirilende usulyň çäklendirilmegi hökmünde görmek mümkin bolsa-da, eDNA bilen deňeşdirilende şeýle ýerli ccfDNA bolmagy bilen baglanyşykly çykdajylar saglyk gözlegleri üçin elýeterli maglumatlaryň köp bolmagy üçin bir wagtyň özünde düşnüklidir.ofset öý eýesi.Bu, öý eýesiniň genomyna integrirlenen wirus yzygiderliliginiň bardygyny öz içine alýar.Aýlawlarda keseligine geçýän leýkoz retrowiruslarynyň bardygyny göz öňünde tutup, midýa üçin bu aýratyn möhümdir [80, 81].LB-iň eDNA-dan başga bir artykmaçlygy, mikroorganizmleri (we olaryň genomlaryny) gurşap alýan gemolimfda gan öýjükleriniň aýlanyşynyň fagositiki işjeňliginden peýdalanmagydyr.Fagositoz, gan öýjükleriniň esasy işidir [82].Netijede, bu usul midiýalaryň ýokary süzgüç kuwwatyndan (deňiz suwunyň ortaça 1,5 l / sag) we deňiz suwunyň dürli gatlaklarynyň garyşmagyny ýokarlandyrýan, heterologiki eDNA-ny ele almaga mümkinçilik berýän iki günlük aýlanyşykdan peýdalanýar.[83, 84].Şeýlelik bilen, midýa ccfDNA derňewi midiýalaryň iýmitlenişine, ykdysady we daşky gurşawa ýetirýän täsirlerini göz öňünde tutup, gyzykly bir ýol.Adamlardan ýygnan LB derňewine meňzeş bu usul, ekzogen maddalara jogap hökmünde DNK-da genetiki we epigenetiki üýtgemeleri ölçemek mümkinçiligini açýar.Mysal üçin, nanopore yzygiderliligini ulanyp, ýerli ccfDNA-da genom giň metilizasiýa derňewini geçirmek üçin üçünji nesil yzygiderlilik tehnologiýalary göz öňünde tutulyp bilner.Bu amal, midiýa ccfDNA bölekleriniň uzynlygynyň, himiki üýtgemeleriň zerurlygy bolmazdan bir yzygiderlilikde genom boýunça DNK metilizasiýasynyň derňewine mümkinçilik berýän uzak okalýan yzygiderli platformalar bilen iň oňat gabat gelýändigi bilen aňsatlaşdyrylmalydyr.85,86] Bu gyzykly bir mümkinçilik, sebäbi DNK metilizasiýa nagyşlarynyň daşky gurşaw stresine täsirini görkezýändigi we köp nesillerde dowam edýändigi görkezildi.Şol sebäpden, howanyň üýtgemegine ýa-da hapalaýjy maddalara sezewar bolandan soň täsiri dolandyrýan esasy mehanizmler barada gymmatly düşünje berip biler [87].Şeýle-de bolsa, LB-ni ulanmak çäklendirmesiz däldir.Elbetde, munuň ekosistemada görkeziji görnüşleriniň bolmagyny talap edýär.Aboveokarda belläp geçişimiz ýaly, berlen ekosistemanyň biodürlüligini bahalandyrmak üçin LB-ni ulanmak, çeşmeden DNK bölekleriniň bardygyny göz öňünde tutýan berk bioinformatika turbageçirijisini hem talap edýär.Anotherene bir esasy mesele, deňiz görnüşleri üçin salgylanma genomlarynyň bolmagydyr.Deňiz süýdemdirijileriniň genomlary taslamasy we ýakynda döredilen Fish10k taslamasy [88] ýaly başlangyçlar geljekde şeýle derňewi ýeňilleşdirer diýip umyt edýäris.LB düşünjesiniň deňiz süzgüçli iýmitlendiriji organizmlere ulanylmagy, yzygiderlilik tehnologiýasynyň soňky gazananlaryna laýyk gelýär we daşky gurşawyň streslerine garşy deňiz ýaşaýyş ýerleriniň saglygy barada möhüm maglumatlary bermek üçin köp ohm biomarkerleriň ösmegine laýyk gelýär.
Genom yzygiderliligi maglumatlary, Bioprojects SRR8924808 astynda NCBI yzygiderliligini okamak arhiwinde saklandy https://www.ncbi.nlm.nih.gov/sra/SRR8924808
Brierli AS, Kingsford MJ Howanyň üýtgemeginiň deňiz durmuşyna we ekosistemalara täsiri.Kol biologiýasy.2009;19: P602 - P614.
Gissi E, Manea E, Mazaris AD, Frashetti S, Almpanidou V, Bewilakua S we ş.m.Howanyň üýtgemeginiň we beýleki ýerli stresleriň deňiz gurşawyna edýän täsirlerine serediň.umumy ylmy gurşaw.2021; 755: 142564.
Carella F, Antuofermo E, Farina S, Salati F, Mandas D, Prado P we ş.m.).Mart aýynyň birinji güni.2020; 7: 48.
Seront L, Nikastro CR, Zardi GI, Goberwil E. Gaýtalanýan ýylylyk stres şertlerinde ýylylyga çydamlylygyň peselmegi gök midiýalaryň tomusky ölüminiň ýokarydygyny düşündirýär.Ylmy hasabat 2019;9: 17498.
Fey SB, Siepielski AM, Nussle S, Serwantes-Yoshoşida K, Hwan JL, Huber ER we ş.m.Haýwanlaryň ölüminiň ýygylygynyň, sebäpleriniň we derejesindäki soňky üýtgeşmeler.Pros Natl Acad Sci ABŞ.2015; 112: 1083-8.
Skarpa F, Sanna D, Azzena I, Mughetti D, Cerruti F, Hosseini S we ş.m.Birnäçe görnüşe mahsus däl patogenler Pinna nobilisiň köpçülikleýin ölümine sebäp bolup biler.Durmuş.2020; 10: 238.
Bredli M, Koutts SJ, Jenkins E, O'Hara TM.Howanyň üýtgemeginiň Arktikanyň zoonotik kesellerine bolup biljek täsiri.Int J aýlaw saglygy.2005;64: 468–77.
Baýer J., Grein NW, Bruks S., Allan IJ, Ruus A., Gomez T. we ş.m.Gök midiýalar (Mytilus edulis spp.) Kenarýaka hapalanmagyna gözegçilik etmekde signal organizmleri hökmünde: syn.“Mar Environ Res 2017”;130: 338-65.
Siravegna G, Marsoni S, Siena S, Bardelli A. Suwuk biopsiýanyň rak keselini bejermekde birleşmegi.Nat Rev Arassa Onkol.2017;14: 531–48.
Wan JCM, Massie C, Garsiýa-Korbaço J, Mouliere F, Brenton JD, Caldas C we ş.m.Suwuk biopsiýa ýetişmegi: Çiş DNK-nyň aýlanmagyna mümkinçilik berýär.Nat Rev keseli.2017; 17: 223–38.
Mandel P., Metais P. Adam plazmasyndaky nuklein kislotalary.“Soc Biol” golçur kärhanalarynyň ýygnak teswirleri.1948;142: 241-3.
Bronkhorst AJ, Ungerer W, Holdenrieder S. Öýjüksiz DNK üçin rak keselini bejermekde molekulýar bellik hökmünde täze rol.Biomolar derňewiniň mukdary.2019; 17: 100087.
Ignatiadis M., Sledge GW, Jeffri SS Suwuk biopsiýa klinika girýär - durmuşa geçirmek we geljekdäki kynçylyklar.Nat Rev Klin Onkol.2021;18: 297-312.
Lo YM, Corbetta N., Çemberleýn PF, Rai W., Sargent IL, Redman CW we başgalar.Düwünçegiň DNK-sy ene plazmasynda we serumda bolýar.Lancet.1997;350: 485-7.
Mufarray MN, Wong RJ, Shaw GM, Stiwenson DK, Quake SR Göwrelilik döwrüni we göwrelilik döwründe aýallaryň ganynda öýjükden daşary RNK aýlanyşyny ulanmak bilen ýüze çykýan kynçylyklary öwrenmek.Dopediatrika.2020; 8: 605219.
Olleriç M, Şerwud K, Keown P, Schütz E, Bek J, Stegbauer J we ş.m.Suwuk biopsiýa: donor öýjüksiz DNK, böwrek gornusindäki allogen zeperleri ýüze çykarmak üçin ulanylýar.Nat Rev Nefrol.2021;17: 591–603.
Huan FC, Lo YM Göwreliligiň diagnostikasyndaky täzelikler: enäniň plazma genomynyň yzygiderliligi.Anna MD2016; 67: 419-32.
Gu W, Deng X, Li M, Sucu YD, Arevalo S, Stryke D we ş.m.Infectedokanç beden suwuklyklarynyň indiki nesli metagenomiki yzygiderliligi bilen çalt patogen tapylmagy.Nat lukmançylygy.2021; 27: 115-24.