Nature.com-a gireniňiz üçin sag boluň.Ulanylýan brauzer wersiýaňyzyň çäkli CSS goldawy bar.Iň oňat tejribe üçin täzelenen brauzeri ulanmagy maslahat berýäris (ýa-da Internet Explorer-de Gabat geliş tertibini öçüriň).Şol aralykda, dowamly goldawy üpjün etmek üçin sahypany stil we JavaScript bolmazdan hödürläris.
Neşe serişdelerini barlamak üçin ýüregiň fiziologiki gurşawyny takyk köpeldip biljek ygtybarly in vitro ulgamyna zerurlyk bar.Adam ýürek dokumalarynyň medeni ulgamlarynyň çäkli bolmagy, ýürek dermanlarynyň täsirlerini nädogry düşündirmäge sebäp boldy.Bu ýerde, ýürek dokumalarynyň medeniýet modelini (CTCM) taýýarladyk, ýürek böleklerini elektromehaniki taýdan höweslendirýär we ýürek sikliniň sistolik we diastolik döwürlerinde fiziologiki uzalmany başdan geçirýär.12 günlük medeniýetden soň, bu çemeleşme ýürek bölümleriniň ýaşaýyş ukyplylygyny bölekleýin gowulaşdyrdy, ýöne gurluş bitewiligini doly gorap bilmedi.Şonuň üçin kiçi molekulalaryň barlagyndan soň, ortaça 100 nM triiodotironiniň (T3) we 1 μM deksametazonyň (Dex) goşulmagynyň 12 günüň dowamynda bölümleriň mikrostrukturasyny saklandygyny gördük.TTC / Dex bejergisi bilen bilelikde CTCM ulgamy transkripsiýa profilini, ýaşaýyş ukyplylygyny, metabolik işjeňligini we gurluş bitewiligini 12 günüň dowamynda täze ýürek dokumasy bilen deň derejede saklady.Mundan başga-da, medeniýetde ýürek dokumalarynyň aşa uzalmagy gipertrofiki ýürek signalyny döredýär, bu bolsa CTCM-iň ýürek uzalmagy bilen ýüze çykan gipertrofiki şertleri meňzeş edip biljekdigini subut edýär.Sözümiň ahyrynda, CTCM ýüregiň fiziologiýasyny we patofiziologiýasyny uzak wagtyň dowamynda medeniýetde modelleşdirip biler, bu bolsa neşe serişdeleriniň ygtybarly barlanmagyna mümkinçilik döreder.
Kliniki gözleglerden ozal adam ýüreginiň fiziologiki gurşawyny takyk köpeldip biljek ygtybarly in vitro ulgamlary zerurdyr.Şeýle ulgamlar üýtgedilen mehaniki uzalmany, ýürek urmasyny we elektrofiziologiki häsiýetleri takyklamalydyr.Haýwanlaryň modelleri, neşe serişdeleriniň adam ýüregine täsirini görkezmekde çäkli ygtybarlylygy bolan ýürek fiziologiýasyny barlamak üçin platforma hökmünde ulanylýar1,2.Netijede, “Ideal ýürek dokumasy medeniýeti” synag synag modeli (CTCM), adam ýüreginiň fiziologiýasyny we patofiziologiýasyny takyk görkezýän dürli bejeriş we farmakologiki çärelere gaty duýgur we mahsus modeldir.Şeýle ulgamyň ýoklugy, ýürek ýetmezçiligi üçin täze bejergileriň tapylmagyny çäklendirýär4,5 we bazardan çykmagyň esasy sebäbi hökmünde neşe kardiotoksikligine sebäp boldy6.
Soňky on ýylda ýürek-damar däl sekiz derman, kliniki aritmiýa we duýdansyz ölüme sebäp bolýan QT aralyk uzalmagyna sebäp bolýandygy sebäpli kliniki ulanmakdan çykaryldy7.Şeýlelik bilen, ýürek-damar täsirliligini we zäherliligini bahalandyrmak üçin ygtybarly kliniki barlag strategiýalaryna zerurlyk bar.Drugakynda neşe barlagynda we zäherlilik synagynda adam tarapyndan döredilen pluripotent kök öýjüklerden alnan kardiomiositleriň (hiPS-CM) ulanylmagy bu meseläniň bölekleýin çözgüdini üpjün edýär.Şeýle-de bolsa, hiPS-CM-leriň ýetişmedik tebigaty we ýürek dokumalarynyň köp öýjükli çylşyrymlylygynyň ýoklugy bu usulyň esasy çäklendirmeleridir.Soňky gözlegler, bu çäklendirmäniň irki hiPS-CM ulanyp, öz-özünden gysylmagy başlandan gysga wagtyň içinde ýürek dokumalarynyň gidrogellerini emele getirip we wagtyň geçmegi bilen elektrik stimulyny kem-kemden ýokarlandyryp boljakdygyny görkezdi.Şeýle-de bolsa, bu hiPS-CM mikrotissiýalarynda ulularyň miokardynyň ýetişen elektrofiziologiki we kontraktiki aýratynlyklary ýok.Mundan başga-da, adam ýürek dokumasy dürli öýjük görnüşleriniň, şol sanda endotel öýjüklerini, neýronlary we stromal fibroblastlary öz içine alýan, öýjükli öýjükli matrisa beloklarynyň belli bir toplumy bilen biri-birine bagly bolan birmeňzeş garyndydan ybarat has çylşyrymly gurluşa eýe.Uly süýdemdirijilerdäki kardiomiosit däl ilatyň bu birmeňzeşligi11,12,13, aýry öýjük görnüşlerini ulanyp ýürek dokumalaryny modellemekde esasy päsgelçilikdir.Bu esasy çäklendirmeler fiziologiki we patologiki şertlerde bitewi miokard dokumasyny ösdürmegiň usullaryny ösdürmegiň möhümdigini nygtaýar.
Adam ýüreginiň ösdürilip ýetişdirilen inçe (300 µm) bölümleri, adam miokardynyň geljegi uly nusgasydygyny subut etdi.Bu usul, adam ýürek dokumalaryna meňzeş doly 3D köp öýjükli ulgamyň elýeterliligini üpjün edýär.Şeýle-de bolsa, 2019-njy ýyla çenli medeniýetli ýürek bölümleriniň ulanylmagy gysga (24 sag) medeniýetiň ýaşamagy bilen çäklendirildi.Munuň sebäbi fiziki-mehaniki uzalmanyň ýoklugy, howa-suwuk interfeýs we ýürek dokumasynyň zerurlyklaryny goldamaýan ýönekeý metbugatyň ulanylmagy ýaly birnäçe faktor bilen baglanyşykly.2019-njy ýylda birnäçe gözleg toparlary mehaniki faktorlary ýürek dokumalarynyň medeniýet ulgamlaryna goşmagyň medeniýetiň ömrüni uzaldyp biljekdigini, ýürek aňlatmasyny gowulaşdyryp we ýürek patologiýasyna meňzeýändigini görkezdi.17 we 18-nji iki sany ajaýyp gözleg, birkemsiz mehaniki ýüküň medeniýet döwründe ýürek fenotipine oňyn täsir edýändigini görkezýär.Şeýle-de bolsa, bu gözlegler ýürek sikliniň dinamiki üç ölçegli fiziki-mehaniki ýüklemesini ulanmady, sebäbi ýürek bölümlerine izometrik dartyş güýji 17 ýa-da çyzykly aksotoniki ýük 18 bilen ýüklenýärdi.Dokumalary uzatmagyň bu usullary köp ýürek genleriniň basylmagyna ýa-da adaty bolmadyk uzalma jogaplary bilen baglanyşykly genleriň çakdanaşa gysylmagyna sebäp boldy.Aýratynam, Pitoulis we başgalar.19 güýç geçiriji seslenme we dartyş hereketlendirijilerini ulanyp, ýürek siklini täzeden gurmak üçin dinamiki ýürek dilim medeniýeti hammamyny döretdi.Bu ulgam in vitro ýürek siklini has takyklaşdyrmaga mümkinçilik berýän hem bolsa, usulyň çylşyrymlylygy we pes geçirijiligi bu ulgamyň ulanylmagyny çäklendirýär.Laboratoriýamyz ýaňy-ýakynda elektrik gyjyndyrmasy we doňuz we adam ýürek dokumalarynyň bölümleriniň ýaşaýyş ukyplylygyny 6 güne çenli dowam etdirmek üçin optimallaşdyrylan gurşaw ulanyp, ýönekeýleşdirilen medeniýet ulgamyny döretdi.
Häzirki golýazmada, ýürek dokumasynyň medeniýeti modelini (CTCM), ýürek siklinde üç ölçegli ýürek fiziologiýasyny we patofiziologiki üýtgemeleri gaýtalamak üçin gülkünç duýgulary öz içine alýan doňuz ýüreginiň bölümlerini suratlandyrýarys.Bu CTCM, kliniki deslapky neşe barlagynyň takyklygyny kliniki taýdan synagdan geçirmek üçin süýdemdirijileriň ýüreginiň fiziologiýasyny / patofiziologiýasyny meňzeýän, tygşytly, orta geçiş ýürek ulgamyny üpjün etmek arkaly hiç haçan gazanylmadyk derejä çenli ýokarlandyryp biler.
Gemodinamiki mehaniki signallar vitro 22,23,24-de kardiomositleriň işlemeginde möhüm rol oýnaýar.Häzirki golýazmada, fiziologiki ýygylyklarda elektrik we mehaniki gyjyndyrma (minutda 1,2 Hz, 72 urgy) arkaly ulularyň ýürek gurşawyna öýkünip bilýän CTCM (1a surat) taýýarladyk.Diastol wagtynda dokumanyň aşa köpelmeginiň öňüni almak üçin dokumanyň ululygyny 25% ýokarlandyrmak üçin 3D çap enjamy ulanyldy (1-nji surat).C-PACE ulgamy tarapyndan döredilen elektrik aralygy, ýürek siklini doly köpeltmek üçin maglumat ýygnamak ulgamyny ulanyp, sistoldan 100 ms öň başlamalydy.Dokuma medeniýet ulgamy, ýokarky otagda ýürek dilimleriniň giňelmegine sebäp bolmak üçin çeýe silikon membranany tigirli giňeltmek üçin programmirläp bolýan pnewmatik hereketlendirijini (LB Engineering, Germaniýa) ulanýar.Ulgam basyşy (± 1 mmHg) we wagty (± 1 ms) takyk sazlamaga mümkinçilik berýän basyş geçiriji arkaly daşarky howa liniýasyna birikdirildi (1-nji surat).
dokma bölümini enjamyň medeni kamerasynyň içinde gök reňkde görkezilen 7 mm goldaw halkasyna dakyň.Medeniýet kamerasy howa kamerasyndan inçe çeýe silikon membranasy bilen bölünýär.Syzdyrmazlyk üçin her kameranyň arasynda bir gapjyk goýuň.Enjamyň gapagynda elektrik gyjyndyrmasyny üpjün edýän grafit elektrodlary bar.b Uly dokuma enjamynyň, gollanma halkasynyň we goldaw halkasynyň shematiki görnüşi.Dokuma bölümleri (goňur) ululykdaky enjamda, enjamyň daşky gyrasyndaky truba ýerleşdirilen gollanma halkasy bilen ýerleşdirilýär.Gollanmany ulanyp, dokuma akril ýelimi bilen örtülen goldaw halkasyny ýürek dokumasynyň bölegine üns bilen ýerleşdiriň.c Programma düzülip bilýän pnewmatiki herekete getiriji (PPD) tarapyndan dolandyrylýan howa kamerasynyň basyşynyň funksiýasy hökmünde elektrik gyjyndyrmasynyň wagtyny görkezýän grafik.Maglumat ýygnamak enjamy basyş datçiklerini ulanyp elektrik gyjyndyrmasyny sinhronlamak üçin ulanyldy.Medeniýet kamerasyndaky basyş kesgitlenen çäklere ýetende, elektrik gyjyndyrmasyny başlatmak üçin C-PACE-EM impuls signaly iberilýär.d Inkubator tekjesinde ýerleşdirilen dört sany CTCM-iň suraty.Dört enjam pnewmatik zynjyryň üsti bilen bir PPD-e birikdirilýär we pnewmatik zynjyryň basyşyna gözegçilik etmek üçin gemostatiki klapana basyş datçikleri girizilýär.Her enjamda alty dokuma bölümi bar.
Pnewmatik hereketlendirijini ulanyp, hersi 6 dokuma bölümini saklap bilýän 4 sany CTCM enjamyna gözegçilik edip bildik (1-nji surat).CTCM-de howa kamerasyndaky howa basyşy suwuk kameradaky sinhron basyşa öwrülýär we ýürek diliminiň fiziologiki giňelmegine itergi berýär (2a surat we goşmaça film 1).Dokumanyň bahasy 80 mm Hg.Sungat.dokuma bölümleriniň 25% uzalýandygyny görkezdi (2-nji surat).Bu göterim uzalmasy, adaty ýürek bölüminiň sazlaşyklylygy üçin 2,2–2.3 mk fiziologiki sarkomeriň uzynlygyna laýyk gelýändigi görkezildi17,19,25.Dokumanyň hereketi, ýörite kamera sazlamalary arkaly bahalandyryldy (Goşmaça 1-nji surat).Dokumalaryň hereketiniň amplitudasy we tizligi (2-nji surat, d) ýürek siklinde we sistol we diastol döwründe uzalmaga laýyk gelýär (2-nji surat).Dartyş we dynç alyş wagtynda ýürek dokumalarynyň uzalmagy we tizligi medeniýetde 12 gün hemişelik galdy (2-nji surat).Elektrik gyjyndyrmasynyň medeniýet döwründe kontraktillige täsirini bahalandyrmak üçin, kölegeli algoritmi (Goşmaça 2a, b) ulanyp, işjeň deformasiýany kesgitlemegiň usulyny taýýarladyk we deformasiýalary elektrik gyjyndyrmasy bilen we tapawutlandyrmagy başardyk.Heartüregiň şol bir bölümi (2-nji surat).Kesileniň hereket edýän sebitinde (R6-9), elektrik gyjyndyrmasyndaky naprýa .eniýe elektrik gyjyndyrmasynyň ýoklugyndan 20% ýokarydy, bu elektrik gyjyndyrmasynyň kontrakt işine goşant goşýandygyny görkezýär.
Howa kamerasynyň basyşynyň, suwuk kameranyň basyşynyň we dokumalaryň hereketiniň ölçeg yzlary, kamera basyşynyň suwuk kameranyň basyşyny üýtgedip, dokumanyň diliminiň degişli hereketine sebäp bolýandygyny tassyklaýar.b Dokma bölümleriniň göterim uzalmagyna (mämişi) göterim uzynlygynyň (gök) wekilçilikli yzlary.c iürek diliminiň ölçenen hereketi, ölçenen tizlige laýyk gelýär.d) ticüregiň bir böleginde siklik hereketiň (gök çyzyk) we tizligiň (mämişi punktir çyzyk) wekilçilikli traýektoriýalary.e Sikl wagtynyň mukdary (toparlara n = 19 dilim, dürli doňuzlardan), gysylma wagty (her topara n = 19 dilim), dynç alyş wagty (her topara n = 19 dilim, dürli doňuzlardan), dokumanyň hereketi (n = 25).dilimler) / dürli doňuzlardan topar), iň ýokary sistolik tizlik (n = 24 (D0), 25 (D12) dilim / dürli doňuzdan topar) we dynç alyş derejesi (n = 24 (D0), 25 (D12) dilim / dürli doňuzdan topar).Iki guýrukly Talyp synagy hiç bir parametrde düýpli tapawudy görkezmedi.f (gyzyl) we (gök) elektrik gyjyndyrmasyz dokuma bölümleriniň wekilçilikli ştamm derňew yzlary, şol bir bölümden dokuma bölümleriniň on sebit sebiti.Aşakdaky paneller, dürli bölümlerden on ugurda elektrik gyjyndyrmasyz we dokuma bölümlerindäki ştammdaky göterim tapawudynyň mukdaryny görkezýär. (n = dürli doňuzlardan 8 dilim / topar, Iki guýrukly T-synagy geçirilýär; **** p <0.0001, ** p <0.01, * p <0.05). (n = dürli doňuzlardan 8 dilim / topar, Iki guýrukly T-synagy geçirilýär; **** p <0.0001, ** p <0.01, * p <0.05). . (n = dürli doňuzlardan 8 bölüm / topar, iki guýrukly T-synagy; **** p <0.0001, ** p <0.01, * p <0.05). （N = 8 片 / 组 ， ** ** ** ** ** **** p <0.0001 ， ** p <0.01 ， * p <0.05）。 （N = 8 片 / 组 ， ** ** ** ** ** **** p <0.0001 ， ** p <0.01 ， * p <0.05）。 (n = 8 срезов / группу, от разных свиней, дву зононний критерий Стьюдента; **** p <0,0001, ** p <0,01, * p <0,05). (n = 8 bölüm / topar, dürli doňuzlardan, iki guýrukly T-synagy; **** p <0.0001, ** p <0.01, * p <0.05).Roralňyşlyklar çyzgylary ortaça ± standart gyşarmany aňladýar.
Öňki statiki biomimetiki ýürek dilim medeniýeti ulgamymyzda [20, 21], elektrik gyjyndyrmasyny ulanmak we orta kompozisiýany optimizirlemek bilen 6 günüň dowamynda ýürek dilimleriniň ýaşaýyş ukyplylygyny, işleýşini we gurluş bitewiligini sakladyk.Şeýle-de bolsa, 10 günden soň bu sanlar birden azaldy.Öňki statiki biomimetiki medeniýet ulgamymyzda 20, 21 gözegçilik şertlerinde (Ctrl) ösdürilip ýetişdirilen bölümlere ýüzleneris we bir wagtyň özünde mehaniki we elektrik gyjyndyrmasy (CTCM) astynda optimallaşdyrylan gurşawymyzy MC şertleri we medeniýeti hökmünde ulanarys.diýilýär.Ilki bilen, 6 günüň dowamynda dokumanyň ýaşaýyş ukyplylygyny saklamak üçin elektrik gyjyndyrmasyz mehaniki gyjyndyrmanyň ýeterlik däldigini kesgitledik (Goşmaça 3a surat, b).Gyzykly tarapy, STCM ulanyp, fizio-mehaniki we elektrik gyjyndyrmasynyň girizilmegi bilen, 12 günlük ýürek bölümleriniň ýaşaýyş ukyby, MT şertlerinde däl-de, Ctrl şertlerinde däl-de, täze ýürek bölümlerinde bolşy ýaly galdy (1-nji surat).3a).Bu, ýürek sikliniň mehaniki gyjyndyrylmagynyň we simulýasiýasynyň dokuma bölümlerini öňki statiki medeniýet ulgamymyzda habar berlişi ýaly iki esse uzak saklap biljekdigini görkezýär.Şeýle-de bolsa, ýürek troponin T we 43-nji konnexin immunolabelirlemek arkaly dokuma bölümleriniň gurluş bitewiligine baha bermek, konnexin 43 aňlatmasynyň 12-nji gün MC dokumalarynda şol bir günüň gözegçiliginden ep-esli ýokarydygyny görkezdi.Şeýle-de bolsa, 43-nji bitewi konnexin aňlatmasy we Z-disk emele gelmegi doly saklanmady (3-nji surat).Dokumanyň gurluş bitewiligini kesgitlemek üçin emeli intellekt (AI) çarçuwasyny ulanýarys, lokalizasiýa güýji nukdaýnazaryndan troponin-T we konnexin reňkleýişine esaslanýan şekil esasly çuňňur öwreniş turbasy.Bu usul, salgylanmada görkezilişi ýaly, ýürek dokumalarynyň gurluş bitewiligini ygtybarly kesgitlemek üçin “Convolutional Neural Network” (CNN) we çuňňur öwreniş çarçuwasyny ulanýar.26. MC dokumasy, statiki gözegçilik bölümleri bilen deňeşdirilende 0-njy güne gowulaşan gurluş meňzeşligini görkezdi.Mundan başga-da, Massonyň trihrom boýagy, MS şertlerinde fibrozyň medeniýetiň 12-nji günündäki gözegçilik şertleri bilen deňeşdirilende ep-esli pes göterimini ýüze çykardy (3-nji surat).CTCM 12-nji günde ýürek dokumalarynyň ýaşaýyş ukyplylygyny täze ýürek dokumalaryna meňzeş derejä ýetiren hem bolsa, ýürek bölümleriniň gurluş bitewiligini ep-esli gowulaşdyrmady.
çyzgyda grafiki täze ýürek dilimleriniň (D0) ýa-da ýürek dilimleriniň medeniýetiniň 12 günüň dowamynda statiki medeniýetde (D12 Ctrl) ýa-da CTCM (D12 MC) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl), 12 (D12 MC) dilimler / toparlar dürli doňuzlardan D0 D we D1 bilen deňeşdirilýär; l). çyzgyda grafiki täze ýürek dilimleriniň (D0) ýa-da ýürek dilimleriniň medeniýetiniň 12 günüň dowamynda statiki medeniýetde (D12 Ctrl) ýa-da CTCM (D12 MC) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl), 12 (D12 MC) dilimler / toparlar dürli doňuzlardan D0 D we D1 bilen deňeşdirilýär; l).gistogramma, MTT täze ýürek bölümleriniň (D0) ýa-da ýürek bölümleriniň medeniýetiniň statiki medeniýetde (D12 gözegçilik) ýa-da CTCM (D12 MC) (n = 18 (D0), 15 (D12 gözegçilik).)), 12 (D12 MC) bölümleri / topary dürli doňuzlardan toparlaýyn, bir taraplaýyn ANOVA synagy geçirilýär;#### p <0,0001 по сравнению с D0 и ** p <0,01 по сравненюю с D12 Ctrl). #### p <0.0001 D0 bilen deňeşdirilende we ** p <0.01 D12 Ctrl bilen deňeşdirilende). a 条形图 显示 在 D D (D12 Ctrl) 或 CTCM (D12 MC) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl) 中 新鲜 心脏 D (D0) 或， #### p <0.0001 ， 与 D12 Ctrl 相比 ， ** p <0.01)。 a 条形图 显示 在 静态 (D12 Ctrl) 或 CTCM (D12 MC) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl) 中 新鲜 心脏 D (D0) ， 来自 不同 的 的 12 (D12 MC) 切片 / 组 ， ， ** p。)Täze ýürek bölümlerinde (D0) ýa-da statiki medeniýetde (D12 gözegçilik) ýa-da CTCM (D12 MC) (n = 18 (D0), 15 (D12 MC)), 12 (D12 MC) bölüm / toparda MTT ýaşaýyş ukyplylygynyň mukdaryny görkezýän gistogramma, bir taraplaýyn ANOVA synagy;#### p <0,0001 по сравнению с D0, ** p <0,01 по сравнению с D12 Ctrl). #### p <0.0001 D0 bilen deňeşdirilende, ** p <0.01 D12 Ctrl bilen deňeşdirilende).b Troponin-T (ýaşyl), konnexin 43 (gyzyl) we DAPI (gök) täze izolirlenen ýürek bölümlerinde (D0) ýa-da statiki şertlerde (Ctrl) ýa-da CTCM şertlerinde (MC) 12 günüň dowamynda döredilen immunofloresensiýa şekilleriniň (boş şkalasy = 100 µm). Heartürek dokumalarynyň gurluş bitewiliginiň emeli intellektual mukdary (n = 7 (D0), 7 (D12 Ctrl), 5 (D12 MC) dilim / topar her dürli doňuzdan, bir taraplaýyn ANOVA synagy geçirilýär; #### p <0.0001 D0 we **** p <0.0001 D12 Ctrl bilen deňeşdirilende). Heartürek dokumasynyň gurluş bitewiliginiň emeli intellektual mukdary (n = 7 (D0), 7 (D12 Ctrl), 5 (D12 MC) dilim / topar her dürli doňuzdan, bir taraplaýyn ANOVA synagy geçirilýär; D0 we **** p <0.0001 D12 Ctrl bilen deňeşdirilende #### p <0.0001). Й Тат читтинт Сц зысст констусны БА серды зирся мовный течат Газик ## p <0 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0,4,4,4,01-5 s <0,0001, читнею dж ". Artificialürek dokumalarynyň gurluş bitewiligini emeli intellekt (n = 7 (D0), 7 (D12 Ctrl), 5 (D12 MC) bölüm / topar dürli doňuzlardan toparlara bölmek, bir taraplaýyn ANOVA synagy geçirildi; #### p <0.0001 vs. D0 we **** p <0.0001 D12 Ctrl bilen deňeşdirilende).人工智能 量化 心脏 组织 完整性 = n = 7 (D0), 7 (D12 Ctrl), 5 (D12 MC) dilim / dürli doňuzyň hersi, bir taraplaýyn ANOVA synagy; #### p <0.0001 与 D0 相比 ， **** p <0.0001 与 D12 Ctrl 相比）。。。人工智能 量化 心脏 组织 结构 （= n = 7 (D0), 7 (D12 Ctrl), 5 (D12 MC) dilim / dürli doňuzlaryň hersi, bir taraplaýyn ANOVA synagy; #### p <0.0001 与 D0 相比 ， **** p <0.0001 与 D12 Ctrl 相比）。。 Искусственный интеллект для количественной озенки адной целостности сердечной ткани (n = 7 (D0), 7 (D12 Ctrl), 5 (D12 MC) срезов / группу каждой из разных снев, односторний снев, одностороны <0,0001 по сравнению с D12 Ctrl). Cardürek dokumalarynyň (n = 7 (D0), 7 (D12 Ctrl), 5 (D12 MC) bölümleri / toparlary / dürli doňuzlaryň hersini toparlamak, bir taraplaýyn ANOVA synagy; #### p <0.0001 vs .D0 Deňeşdirmek üçin **** p <0.0001 D12 Ctrl). c Massonyň trihrom tegmili (Tereziniň ýalaňaç = 500 µm) (n = 10 dilim / topar her dürli doňuzdan 10 sany dilim / topar), bir taraplaýyn ANOVA synagy geçirilýär; D12 Ctrl bilen deňeşdirilende #### p <0.0001). c Massonyň trihrom tegmili (Tereziniň ýalaňaç = 500 µm) (n = 10 dilim / topar dürli doňuzlardan 10 sany dilim / topar), bir taraplaýyn ANOVA synagy geçirilýär; D12 bilen deňeşdirilende #### p <0.0001) D0 we *** p <0,001). c Репрезент Канные изображения (слева) һәм количественная оценка (справа) срезов сердца, окрашенных трихромным красителем Масонаа (чи покрития = 500 мкм) ### p <0,0001 по сравнению с D0 и *** p <0,001 по сравнению с D12 Ctrl). c Massonyň trihrom tegmili (örtülmedik şkalasy = 500 µm) bilen reňklenen ýürek bölümleriniň şekilleri (çepde) we mukdary (sagda) (n = 10 bölüm / dürli doňuzlardan topar, bir taraplaýyn ANOVA synagy geçirildi; #### p <0 .0001 D0 we *** p <0,001 D12 Ctrl bilen deňeşdirilende). c 用 Masson 三 色 染料 500 500 500 500 500 500 500 = 500 µm） （n = 10 个 切片 / 组 每组 单向 OV OV ANOVA ）。 C 用 masson 三 色 染料 500 500 500 500 500 500 500 500 500 500 500 500 500 500 500 500 500 500 500 500 500 500 500 500 500 500 500 500 500 500 500 500 500 500 500 500 500 500 500 500 500 500 500 500 500 500 500 500 500 500 500 500 500 500 500 500 500 500 500 500 trl 相比）。 c Репрезент kныны изображения (слева) һәм количественный мат (справа) срезов сердца, окрашенных трихромным красителем Масона (чя шкала = 500 мкм) с кагного мата; ### #p <0,0001 по сравнению с D0, *** p <0,001 по сравнению с D12 Ctrl). c Massonyň trihrom tegmili (boş = 500 µm) bilen reňklenen ýürek bölümleriniň şekilleri (çepde) we mukdary (sagda) (n = 10 bölüm / topar, hersi dürli doňuzdan, dürli taraplaýyn seljerme arkaly synag edildi; ### # p <0.0001 D0, *** p <0,001 D12 Ctrl bilen deňeşdirilende).Roralňyşlyklar çyzgylary ortaça ± standart gyşarmany aňladýar.
Medeniýet gurşawyna ownuk molekulalary goşmak bilen, kardiomositleriň bitewiligini gowulaşdyryp, CTCM medeniýeti döwründe fibrozyň ösüşi peselip biler diýip çakladyk.Şonuň üçin bulaşyk faktorlaryň azlygy sebäpli statiki dolandyryş medeniýetlerimizi ulanyp, ownuk molekulalary 20,21 barladyk.Bu ekran üçin Dexametazon (Dex), triiodotironin (T3) we SB431542 (SB) saýlandy.Bu kiçi molekulalar öň sarkomeriň uzynlygyny, T-turbalaryny we geçirijilik tizligini ýokarlandyrmak arkaly kardiomiositleriň ýetişmegine itergi bermek üçin hiPSC-CM medeniýetlerinde ulanylýar.Mundan başga-da, Dex (glýukokortikoid) we SB ikisi hem çişmegi basyp ýatyrýar 29,30.Şonuň üçin bu kiçijik molekulalaryň biriniň ýa-da birleşmesiniň goşulmagy, ýürek bölümleriniň gurluş bitewiligini ýokarlandyrjakdygyny barladyk.Ilkinji barlag üçin, her birleşmäniň dozasy öýjük medeniýeti modellerinde (1 μM Dex27, 100 nM T327 we 2,5 μM SB31) ulanylýan konsentrasiýalara esaslanyp saýlandy.12 gün dowam eden medeniýetden soň, T3 we Dex-iň utgaşmasy optimal kardiomiositleriň gurluş bitewiligine we süýümli minimal remont edilmegine getirdi (4-nji we 5-nji goşmaça suratlar).Mundan başga-da, T3 we Dex bu konsentrasiýalaryny iki ýa-da iki esse ulanmak adaty konsentrasiýalar bilen deňeşdirilende ýok ediji täsirleri döretdi (Goşmaça 6a surat, b).
Ilkinji gözden geçirilenden soň, 4 medeniýet şertini deňeşdirip ýerine ýetirdik (4a surat): Ctrl: optimallaşdyrylan gurşawymyzy ulanyp, ozal beýan edilen statiki medeniýetimizde ösdürilip ýetişdirilen ýürek bölümleri;20.21 TD: T3 we Ctrl s Çarşenbe güni Dex goşuldy;MC: öň optimallaşdyrylan serişdäni ulanyp, CTCM-de ösdürilip ýetişdirilen ýürek bölümleri;we MT: T3 we Dex bilen CTCM ortaça goşuldy.12 gün ösdürip ýetişdirilenden soň, MS we MT dokumalarynyň ýaşaýyş ukyplylygy MTT barlagy bilen bahalandyrylan täze dokumalarda bolşy ýaly galdy (4b surat).Gyzykly tarapy, T3 we Dex-iň transwell medeniýetlerine (TD) goşulmagy, Ctrl şertleri bilen deňeşdirilende ýaşaýyş ukyplylygynyň ep-esli gowulaşmagyna getirmedi, bu ýürek bölümleriniň ýaşaýyş ukyplylygyny saklamakda mehaniki gyjyndyrmanyň möhüm roluny görkezýär.
12 günüň dowamynda mehaniki gyjyndyrmanyň we T3 / Dex goşundysynyň täsirine baha bermek üçin ulanylýan dört medeni şerti şekillendirýän synag synag çyzgysy. b Çyzgy grafigi, täze ýürek dilimleri (D0) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl, D12 TD we D12 MT), 12 (D12 MC) dilimler / toparlar bilen deňeşdirilende, 4 medeniýet şertlerinde (Ctrl, TD, MC we MT) 12 günlük post medeniýetiniň ýaşaýyş derejesini görkezýär, bir taraplaýyn ANOVA synagy # 0 D12 Ctrl). b Çyzgy grafigi, täze ýürek dilimleri (D0) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl, D12 TD we D12 MT), 12 (D12 MC) dilimler / toparlar bilen deňeşdirilende, 4 medeniýet şertlerinde (Ctrl, TD, MC we MT) 12 günlük post medeniýetiniň ýaşaýyş derejesini görkezýär, bir taraplaýyn ANOVA synagy # 0 D12 ctrl). b Гистограмма показывает количественную озенку жизнеспособности через 12 дней после митингированя восех 4 условиях мцитервированя (dar, TD, MC we MT) по сравнению со свежим срезами срджа с MT), 12. b Çyzgy grafigi, täze ýürek bölümleri (D0) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl, D12 TD, we D12 MT), 12 (D12 MC) bölüm / topar bilen deňeşdirilende, 12 günlük post medeniýetinde 12 günlük post medeniýetinde ýaşaýyş ukybynyň mukdaryny görkezýär, bir taraplaýyn ANOVA synagy # p # 0.001 # p rl). b 条形图 显示 所有 4 种 培养 t （Ctrl 、 TD 、 MC 和 MT） 与 新鲜 D D (D0) 0.001 与 D0 相比 ， ** p <0.01 与 D12 控制）。b 4 12 (D12 MC) b Гистограмма, показывающая все 4 условия консервированя (كان, TD, MC we MT) по сравнению со свежим срезами сердца (D0) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl, D12 TD we D12 MT) OVA; # ## b Täze ýürek bölümleri (D0) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl, D12 TD we D12 MT), dürli doňuz 12 (D12 MC) bölüm / topar, bir taraplaýyn ANOVA synagy; #### p <0.0001, ### p <0.001 vs. c Bar grafigi, täze ýürek dilimleri (D0) (n = 6 dilim / topar, dürli doňuzlardan bir bölek ANOVA synagy geçirilýär; D12 we *** p <0,001 bilen deňeşdirilende, 4 medeni şertleriň hemmesinde (Ctrl, TD, MC we MT) 12 günlük post medeniýetiniň mukdary görkezilýär. c Bar grafigi, täze ýürek dilimleri (D0) (n = 6 dilim / topar, dürli doňuzlardan bir bölek ANOVA synagy geçirilýär; D12 we *** p <0,001 bilen deňeşdirilende, 4 medeni şertleriň hemmesinde (Ctrl, TD, MC we MT) 12 günlük post medeniýetiniň mukdary görkezilýär. c Гистограмма показывает количественную оценку потока глюкозы через 12 дней после митингированя восех 4 условиях мцитервированя (дар, TD, MC we MT) по сравнению со свежм срезам ср с ср с оронний Выполняется то ANOVA; ### p <0,001 по сравнению с D0 и *** p <0,001 по сравнению с D12 Ctrl). c Gistogramma, täze ýürek bölümleri (D0) (n = 6 bölüm / topar dürli doňuzlardan topar, bir taraplaýyn ANOVA synagy geçirildi) bilen deňeşdirilende, 4 medeniýet şertinde (gözegçilik, TD, MC we MT) 12 günüň dowamynda glýukoza akymynyň mukdaryny görkezýär, D12 Ctrl bilen deňeşdirilende ### p <0,001). c 条形图 显示 所有 4 种 培养 条件 （Ctrl 、 TD 、 MC 和 MT） 与 新鲜 D (D0) 相比 ， 后 后 = = n = 6 片 / 组 ， 不同 不同 执行 OV OV OV l 相比）。 C 条形图 显示 所有 4 种 条件 t t t t 后 = = = = = = = = = 0.00 0.00 0.00 0.00 0.00 0.00 0.00 0.00 0.00 0.00 0.00 0 相比 ， *** p <0,001 与 D12 Ctrl 相比）。 c Гистограмма, показывающая количественную оценку потока глюкозы через 12 дней после мгитерированя для всех 4 условий митервированя (ис, TD, MC we MT) по сравнению со свеж с с ср см ср , односторонний Были проведены ТСы ANOVA; ### p <0,001 по сравнению с D0, *** p <0,001 по сравнению с D12 (бар). c Täze ýürek bölümleri (D0) (n = 6 bölüm / topar, dürli doňuzlardan, bir taraplaýyn ANOVA synaglary geçirildi, D12 bilen deňeşdirilende ### p <0,001, D12 (gözegçilik) bilen deňeşdirilende, 4 medeniýet şertlerinden (gözegçilik, TD, MC we MT) 12 günüň dowamynda glýukoza akymynyň mukdaryny görkezýän histogram.d On sebitleýin dokuma bölüminiň (n = 4 dilim / topar, bir taraplaýyn ANOVA synagy; toparlaryň arasynda düýpli tapawut ýokdy) täze (gök), 12-nji gün MC (ýaşyl) we 12-nji gün (gyzyl) dokumalaryň dartyş derňew ýerleri.e Statik şertlerde (Ctrl) ýa-da MT şertlerinde (MT) 10-12 günüň dowamynda ösdürilip ýetişdirilen ýürek bölümleri bilen deňeşdirilende täze ýürek bölümlerinde (D0) diferensial beýan edilen genleri görkezýän wulkan meýilnamasy.f Medeniýet şertleriniň hersinde ösdürilip ýetişdirilen ýürek bölümleri üçin sarkomer genleriniň ýylylyk kartasy.Roralňyşlyklar çyzgylary ortaça ± standart gyşarmany aňladýar.
Acidag kislotasynyň okislenmeginden glikoliziň geçişine metabolik garaşlylyk kardiomiositleriň bölünmeginiň alamatydyr.Matetişmedik kardiomiositler, esasan, ATP öndürmek üçin glýukozany ulanýarlar we az sanly kristae5,32 bolan gipoplastiki mitokondriýa bar.Glýukozany ulanmagyň derňewi, MC we MT şertlerinde glýukozanyň ulanylyşynyň 0 dokumadaky gününe meňzeýändigini görkezdi (4c surat).Şeýle-de bolsa, Ctrl nusgalary täze dokuma bilen deňeşdirilende glýukozany ulanmagyň ep-esli ýokarlanandygyny görkezdi.Bu, CTCM we T3 / Dex birleşmesiniň dokumanyň ýaşaýyş ukyplylygyny ýokarlandyrýandygyny we 12 günlük medeniýetli ýürek bölümleriniň metabolik fenotipini saklaýandygyny görkezýär.Mundan başga-da, ştamm derňewi, ştamm derejeleriniň MT we MS şertlerinde 12 günüň dowamynda täze ýürek dokumalarynda bolşy ýaly bolandygyny görkezdi (4d-nji surat).
CTCM we T3 / Dex-iň ýürek dilim dokumasynyň global transkripsiýa landşaftyna edýän täsirini seljermek üçin, dört dürli medeni şertlerden ýürek dilimlerinde RNAseq ýerine ýetirdik (Goşmaça maglumatlar 1).Gyzykly tarapy, MT bölümleri täze ýürek dokumalaryna ýokary transkripsiýa meňzeşligini görkezdi, 13 642 geniň arasynda diňe 16 diferensial beýan edildi.Şeýle-de bolsa, öň görkezişimiz ýaly, Ctrl dilimleri medeniýetde 10–12 günden soň 1229 dürli görnüşli genleri görkezdi (4e-nji surat).Bu maglumatlar ýürek we fibroblast genleriniň qRT-PCR tarapyndan tassyklandy (Goşmaça 7a-c).Gyzykly tarapy, Ctrl bölümlerinde ýürek we öýjük sikl genleriniň kadalaşdyrylmagy we çişme gen programmalarynyň işjeňleşmegi görkezildi.Bu maglumatlar, adatça uzak möhletli medeniýetden soň ýüze çykýan bölünişigiň MT şertlerinde doly gabat gelýändigini görkezýär (Goşmaça 8a surat, b).Sarkomer genlerini üns bilen öwrenmek, diňe MT şertlerinde sarkomeri kodlaýan genleriň (4-nji surat) we ion kanalynyň (goşmaça 9-njy surat) Ctrl, TD we MC şertlerinde basyşdan goraýandygyny görkezdi.Bu maglumatlar, mehaniki we gülkünç gyjyndyrmanyň (T3 / Dex) utgaşmasy bilen ýürek diliminiň transkriptomasynyň medeniýetde 12 günden soň täze ýürek dilimlerine meňzeş bolup biljekdigini görkezýär.
Bu transkripsiýa tapyndylary, ýürek bölümlerindäki kardiomiyositleriň gurluş bitewiliginiň MT şertlerinde 12 günüň dowamynda iň oňat saklanmagy bilen tassyklanýar, 43-nji surat (5a surat).Mundan başga-da, MT şertlerinde ýürek bölümlerindäki fibroz, Ctrl bilen deňeşdirilende ep-esli azaldy we täze ýürek bölümlerine meňzeýär (5b surat).Bu maglumatlar, mehaniki gyjyndyrma we T3 / Dex bejergisiniň utgaşmasynyň medeniýetde ýürek bölümlerinde ýürek gurluşyny netijeli saklaýandygyny görkezýär.
Täze izolirlenen ýürek bölümlerinde (D0) troponin-T (ýaşyl), konnexin 43 (gyzyl) we DAPI (gök) immunofloresensiýa şekilleri ýa-da dört ýürek bölüminiň medeni şertlerinde (şkala bar = 100 µm) 12 günüň dowamynda ösdürilip ýetişdirilýär.). Heartürek dokumasynyň gurluş bitewiliginiň emeli intellektual mukdary (n = 7 (D0 we D12 Ctrl), 5 (D12 TD, D12 MC we D12 MT) dürli doňuzlardan dilim / topar, bir taraplaýyn ANOVA synagy geçirilýär; #### p <0.0001 D0 we * p <0.05, ýa-da **** p <0.0001) D12 Ctrl. Heartürek dokumasynyň gurluş bitewiliginiň emeli intellektual mukdary (n = 7 (D0 we D12 Ctrl), 5 (D12 TD, D12 MC we D12 MT) dürli doňuzlardan dilim / topar, bir taraplaýyn ANOVA synagy geçirilýär; #### p <0.0001 D0 we * p <0.05, ýa-da **** p <0.0001) D12 Ctrl. Йенист Серkст rus-летуре отуре от MÜRE ра 5 (DAB2 MC INTR Ростоезau-Awa иowa save <<0, 0,0001 и Сра Бамин d12 CTRL). Emeli intellekt (n = 7 (D0 we D12 Ctrl), 5 (D12 TD, D12 MC we D12 MT) bölümleri / toparlary, dürli doňuzlardan bir topar ANOVA synagy ulanyp, ýürek dokumalarynyň gurluş bitewiliginiň mukdary; D0 we * p <0.05 ýa-da **** p <0.0001) D12 Ctrl bilen deňeşdirilende.对 不同 猪 的 = 结构 完整性 n = 7 （D0 和 D12 Ctrl） 、 5 （D12 TD 、 D12 MC 和 D12 MT） 切片 / 组 进行 人工智能 人工智能 单向 OV ANOVA 测试 # #### p <0.0001 与 D0 **相比）。对 不同 猪 的 心脏 完整性 = = n = 7 （d0 和 d12 ctrl） （5 （d12 td 、 d12 mc 和 d12 mt） 组） 量 # # # # # # # # # # # # # # # Ctrl 相比）。Bir taraplaýyn ANOVA synagy bilen dürli doňuzlarda (n = 7 (D0 we D12 Ctrl), 5 (D12 TD, D12 MC we D12 MT) bölümlerde / toparda emeli intellekt ulanyp, ýürek dokumalarynyň gurluş bitewiliginiň mukdary;#### p <0,0001 по сравнению с D0 и * p <0,05 или **** p <0,0001 по сравнению с D12 Ctrl). #### p <0.0001 D0 bilen deňeşdirilende we * p <0.05 ýa-da D12 Ctrl bilen deňeşdirilende **** p <0.0001). b wekiliniň şekilleri we dj görnüşlerinden alnan ýürek dilmeleriniň mukdary we d12 mt) (on2 t 01 D12 CTRL bilen deňeşdirilende). b wekiliniň şekilleri we dj görnüşlerinden alnan ýürek dilmeleriniň mukdary we d12 mt) (on2 t 01 D12 CTRL bilen deňeşdirilende). b Репрезент Канные изображения һәм количественная оценка срезов сердца, окрашенных трихромным красителем Масона (чиная чейейка = 500 мкм) (n = 10 (D0, D12 Ctrl, D12 TD һәм D12 MC) я односторонний тест ANOVA; #### p <0,0001 по сравнению с D0 и *** p <0,001 или **** p <0,0001 по сравнению с D12 Ctrl). b Massonyň trihrom tegmili (şkalada bar = 500 µm) (n = 10 (D0, D12 Ctrl, D12 TD we D12 MC), dürli doňuzlardan 9 (D12 MT) bölüm / topar, bir taraplaýyn ANOVA ýerine ýetirildi; #### p <0.0001 vs. D0 we *** p <0.001 b 用 Masson 三 色 染料 染色 500 500 500 500 = 500 µm） = n = 10 （D0 、 D12 Ctrl 、 D12 TD 和 D12 MC） ， 12 的 的 个 12 12 12 000 000 000 000 000 000 000 ， *** p <0,001 ， 或 **** p <0.0001 与 D12 Ctrl 相比）。 b 用 masson 三 色 染料 500 500 500 500 500 500 500 500 500 500 500 500 500 500 500 500 500 500 500 500 500 500 500 500组 ， 进行 # # # #### p <0.0001 与 D0 相比 ， *** p <0,001 ， 或 **** p <0.0001 与 D12 Ctrl 相比）。 b Репрезент Канные изображения һәм количественная оценка срезов сердца, окрашенных трихромом Масона (чиная чейейка = 500 мкм) (n = 10 (D0, D12 Ctrl, D12 TD & D12 MC), 9 (D12 MT рин) ## p <0,0001 по сравнению с D0, *** p <0,001 или **** p <0,0001 по сравнению с D12 Ctrl). b Massonyň trihromy (şkalada bar = 500 µm) (n = 10 (D0, D12 Ctrl, D12 TD we D12 MC), dürli doňuz / toparlardan 9 (D12 MT) bölüm, bir ANOVA usuly;Roralňyşlyklar çyzgylary ortaça ± standart gyşarmany aňladýar.
Netijede, CTCM-iň ýürek gipertrofiýasyna meňzeş ukyby ýürek dokumalarynyň uzalmagy bilen bahalandyryldy.CTCM-de iň ýokary howa kamerasynyň basyşy 80 mmHg-den 80 mmHg-a çenli ýokarlandy.Sungat.(adaty uzalma) 140 mmHg çenli sungat.(6a surat).Bu, gipertrofiýada görkezilişi ýaly sarkomer uzynlygyna ýetmek üçin ýürek bölümleri üçin zerur göterim uzalmasy hökmünde görkezilen uzalmanyň 32% ýokarlanmagyna gabat gelýär (6b surat).Alty günüň dowamynda medeniýetiň gysylmagy we dynç almagy wagtynda ýürek dokumalarynyň uzalmagy we tizligi hemişelik galdy (6-njy surat).MT şertlerinden ýürek dokumalary alty günüň dowamynda adaty uzalma (MT (Normal)) ýa-da artykmaç şertlere (MT (OS)) sezewar edildi.Medeniýetde dört gün geçensoň, MT (OS) şertlerinde MT (adaty) şertler bilen deňeşdirilende gipertrofik biomarker NT-ProBNP ortaça ýokarlandy (7a surat).Mundan başga-da, alty gün dowam eden medeniýetden soň, MT (OS) (7b surat) öýjükleriniň ululygy MT ýüreginiň (adaty) bölümleri bilen deňeşdirilende ep-esli ýokarlandy.Mundan başga-da, aşa köp dokumalarda NFATC4 ýadro translokasiýasy ep-esli ýokarlandy (7-nji surat).Bu netijeler, giperdistensiýadan soň patologiki täzelenişiň yzygiderli ösüşini görkezýär we CTCM enjamynyň uzaldylan ýürek gipertrofiýasy signalyny öwrenmek üçin platforma hökmünde ulanylyp bilinjekdigi baradaky düşünjäni goldaýar.
Howa kamerasynyň basyşynyň, suwuk kameranyň basyşynyň we dokumalaryň hereketiniň ölçeg yzlary, kamera basyşynyň suwuk kameranyň basyşyny üýtgedip, dokumanyň diliminiň degişli hereketine sebäp bolýandygyny tassyklaýar.b Adatça uzaldylan (mämişi) we artykmaç (gök) dokuma bölümleri üçin uzalma göterimi we uzalma derejesi.c Sikl wagtyny (dürli doňuzlardan her topara n = 19 dilim), gysylma wagty (her topar üçin n = 18-19 dilim, dürli doňuzlardan), dynç alyş wagty (toparlara n = 19 dilim, dürli doňuzlardan)), dokumanyň hereketiniň amplitudasy (n = 14 dilim / topar, dürli doňuzlardan), iň ýokary sistolik tizlik (n = 14 dürli D) ) bölümler / toparlar) dürli doňuzlardan), iki guýrukly T-synagy hiç bir parametrde düýpli tapawudy görkezmedi, bu parametrleriň aşa güýçli wolt bilen 6 günüň dowamynda hemişelik bolandygyny görkezýär.Roralňyşlyklar çyzgylary ortaça ± standart gyşarmany aňladýar.
MT adaty uzalma (Norm) ýa-da aşa köp (OS) şertlerinde ösdürilip ýetişdirilen ýürek dilimlerinden NT-ProBNP konsentrasiýasynyň bar grafiki mukdary, dürli doňuzlardan iki topar ANOVA ýerine ýetirilýär, ** p <0.01; MT adaty uzalma (Norm) ýa-da aşa köp (OS) şertlerinde ösdürilip ýetişdirilen ýürek dilimlerinden NT-ProBNP konsentrasiýasynyň bar grafiki mukdary, dürli doňuzlardan iki topar ANOVA ýerine ýetirilýär, ** p <0.01;Adaty MT uzalmagy (kadasy) ýa-da aşa uzalmagy (OS) (n = 4 (D2 MTNorm), 3 (D2 MTOS, D4 MTNorm, we D4) şertlerinde ösdürilip ýetişdirilen ýürek dilimlerinden NT-ProBNP konsentrasiýasynyň mukdar gistogrammasy, dürli doňuzlardan iki faktor seljermesi geçirilýär;** p <0,01 по сравнению с кәкныным раст адением). ** p <0.01 adaty uzalma bilen deňeşdirilende). a 在 MT 正常 Norm (Norm) 或 OS OS (OS) 中 下 中 中 中 NT-ProBNP 浓度 的 条形图 （= n = 4 (D2 MTNorm) 、 3 （D2 MTOS 、 D4 MTNorm 和 4 ； ； ； ； ； ； ； ； ； ； p <0.01）。 MT adaty uzalma (Norm) ýa-da artykmaç (OS) şertlerinde (n = 4 (D2 MTNorm), 3 (D2 MTOS, D4 MTNorm 和 D4 MTOS), adaty uzalma bilen deňeşdirilende, ýürek dilimlerinde NT-ProBNP konsentrasiýasynyň mukdary, 0.01 normal p **gistogramma Adaty MT uzalmagy (kadasy) ýa-da aşa uzalmagy (OS) (n = 4 (D2 MTNorm), 3 (D2 MTOS, D4 MTNorm) we D4 MTOS) dilimleriniň / toparlarynyň dürli doňuzlardan bölünen ýürek dilimlerinde NT-ProBNP konsentrasiýalarynyň mukdary, tapawudyň iki taraplaýyn derňewi;** p <0,01 по сравнению с кәкныным раст адением). ** p <0.01 adaty uzalma bilen deňeşdirilende). b Troponin-T we WGA (çepde) we öýjük ululygynyň mukdary (sagda) (n = 330 (D6 MTOS), 369 (D6 MTNorm) öýjük / topar bilen dürli doňuzlaryň 10 dürli diliminden, iki sany guýrukly talyp synagy geçirilýär; adaty uzalma bilen deňeşdirilende **** p <0.0001). b Troponin-T we WGA (çepde) we öýjük ululygynyň mukdary (sagda) (n = 330 (D6 MTOS), 369 (D6 MTNorm) öýjük / topar bilen dürli doňuzlardan 10 dürli bölekden, iki sany guýrukly talyp synagy geçirilýär; adaty uzalma bilen deňeşdirilende **** p <0.0001). b Репрезент Канные изображения срезов сердца, окрашенных тропонином-Т и АЗП (слева) һәм количественного определения размера клеток (справа) (n = 330 (D6 MTOS), 369 водится хвостовой т-критерий Стьюдента; **** p <0,0001 по сравнению с чанныны раст зенением). b Troponin-T we AZP (çepde) we öýjük ululygynyň mukdary (sagda) (n = 330 (D6 MTOS), 369 (D6 MTNorm) öýjük / topar bilen dürli doňuzlardan 10 dürli bölümden, iki sany guýrukly T synagy geçirildi, adaty dartyş bilen deňeşdirilende **** p <0.0001). b 用 肌钙蛋白 -T 和 WGA （左） = = = = 330 （D6 MTOS） ， 来自 9 的 个 9 的 6 6 ** p <0.0001）。 b kalsarein-T we WGA (çepde) we öýjük ululygy (sagda) (n = 330 (D6 MTOS)), 10 dürli dilimden 369 (D6 MTNorm)) öýjükler / 组 ， 两 方法 test test synagy normal **** p <0.0001) bilen reňklenen ýürek dilimleriniň şekilleri. b Репрезент Канные изображения срезов сердца, окрашенных тропонином-Т и АЗП (слева) һәм количественная оценка размера клеток (справа) (n = 330 (D6 MTOS), 369 (D6 MTNorm) из 10 рсиклов нит критерий Стьюдента; **** p <0,0001 по сравнению с канныны раст ченением). b Troponin-T we AZP (çepde) we öýjük ululygynyň mukdary (sag) (n = 330 (D6 MTOS), 369 (D6 MTNorm) dürli doňuzlardan 10 dürli bölümden) ýürek bölümleriniň şekillendiriş şekilleri Öýjükler / topar, iki guýruk ölçegi Talyp;**** p <0.0001 adaty dartyş bilen deňeşdirilende). c 0-njy we 6-njy gün üçin wekilçilikli suratlar, troponin-T we NFATC4 üçin immunolabelirlenen we NFATC4-iň CM-leriň ýadrosyna (n = 4 (D0), 3 (D6 MTOS) dilimleriň / toparlaryň, iki guýrukly T-synagy geçirilýär) * p <0.05); c 0-njy we 6-njy gün üçin wekilçilikli suratlar, troponin-T we NFATC4 üçin immunolabelirlenen we NFATC4-iň CM-leriň ýadrosyna (n = 4 (D0), 3 (D6 MTOS) dilimleriň / toparlaryň, iki guýrukly T-synagy geçirilýär) * p <0.05); c Репрезент Кансные изображения для срезов сердца 0 и 6 дней MTOS, им адомеченых для тропонина-Т и NFATC4, и количественная оценка числокации NFATC4 в ядра kaвернозных клеток (n = 4) выполняется дву зононний t-критерий Стьюдента; * p <0,05). c 0 we 6 günüň dowamynda ýürek bölümleri üçin şekillendirilen şekiller, troponin-T we NFATC4 üçin immunolabelirlenen, we kavernoz öýjükleriň ýadrosynda NFATC4 translokasiýasynyň mukdary (dürli doňuzlardan topar (n = 4 (D0), 3 (D6 MTOS)) iki guýrukly T synagyny geçirdi;* p <0.05). c 用于 肌钙蛋白 -T 和 NFATC4 免疫 标记 的 第 0 天和 第 6 天 MTOS 心脏 切片 的 的 的 NFATC4 易位 至 CM 细胞核 的 （n = 4 (D0) 、 3 (D6 MTOS) 切片 / 组, 0.05 c Kalkanin-T we NFATC4 immunolabeling 第 0 天和 第 6 天 MTOS ýürek dilimleri, we dürli NFATC4 易位 至 CM öýjük ýadrosy 的 mukdaryndan NFATC4 şekilleri 化 (n = 4 (D0), 3 (D6 MTOS) 切 礼 / 组, 时间 双 p p 0.05) c Репрезент Кансные изображения срезов сердца MTOS на 0 и 6 день для Им имомомарировки тропонином-Т и NFATC4 и количественная оценка чолокации NFATC4 в ядра CM от разных свей (n = 4 (Др) ерий Стьюдента; * p <0,05). c Troponin-T we NFATC4 immunolabelirlemek we dürli doňuzlardan (n = 4 (D0), 3 (D6 MTOS) dilimlerden / topar, iki guýrukly T-kriteriýa üçin 0 we 6-njy gün MTOS ýürek dilimleriniň şekilleri;Roralňyşlyk setirleri ortaça ± standart gyşarmany aňladýar.
Terjime edilýän ýürek-damar gözlegleri, ýürek gurşawyny takyk köpeldýän öýjükli modelleri talap edýär.Bu gözlegde, ýüregiň ultratin bölümlerini höweslendirip bilýän CTCM enjamy işlenip düzüldi we häsiýetlendirildi.CTCM ulgamy fiziologiki taýdan sinhronlaşdyrylan elektromehaniki gyjyndyrmany we T3 we Dex suwuklygyny baýlaşdyrmagy öz içine alýar.Düwürtik ýürek bölümleri bu faktorlara sezewar bolanda, olaryň ýaşaýyş ukyby, gurluş bitewiligi, metabolik işjeňligi we transkripsiýa aňlatmasy 12 günlük medeniýetden soň täze ýürek dokumalarynda bolşy ýaly galypdy.Mundan başga-da, ýürek dokumalarynyň aşa uzalmagy giperextensiýa sebäpli ýüregiň gipertrofiýasyna sebäp bolup biler.Umuman aýdanyňda, bu netijeler adaty ýürek fenotipini saklamakda we neşe barlagy üçin platforma üpjün etmekde fiziologiki medeniýet şertleriniň möhüm roluny goldaýar.
Kardiomositleriň işlemegi we ýaşamagy üçin amatly şert döretmäge köp faktorlar goşant goşýar.Bu faktorlaryň iň göze görnüp duran zady (1) öýjükli täsirler, (2) elektromehaniki gyjyndyrma, (3) gülkünç faktorlar we (4) metabolik substratlar bilen baglanyşykly.Fiziologiki öýjükden öýjügiň özara täsiri, öýjükli öýjükli matrisa bilen goldanýan köp öýjükli görnüşli çylşyrymly üç ölçegli torlary talap edýär.Şeýle çylşyrymly öýjükli täsirleri, öýjükleriň aýry-aýry görnüşleriniň bilelikde medeniýeti bilen in vitroda täzeden gurmak kyn, ýöne ýürek bölümleriniň organotip häsiýetini ulanmak arkaly aňsatlyk bilen gazanyp bolýar.
Kardiomiositleriň mehaniki uzalmagy we elektrik gyjyndyrmasy ýürek fenotipini saklamak üçin möhümdir33,34,35.Mehaniki gyjyndyrma hiPSC-CM sowadyş we kämillik üçin giňden ulanylsa-da, birnäçe ajaýyp gözlegler ýakynda uniaxial ýüklemek arkaly ýürek dilimlerini medeniýetde mehaniki höweslendirmäge synanyşdy.Bu gözlegler, 2D uniaxial mehaniki ýüküň, medeniýetiň dowamynda ýüregiň fenotipine oňyn täsir edýändigini görkezýär.Bu gözleglerde ýüregiň bölümlerine ýa-da izometrik dartyş güýçleri17, çyzykly aksotoniki ýüklemek 18 ýa-da ýürek sikli güýç geçiriji seslenme we dartyş hereketlendirijileri arkaly döredildi.Şeýle-de bolsa, bu usullar daşky gurşawy optimizasiýa etmezden uniaxial dokumanyň uzalmagyny ulanýarlar, netijede köp ýürek genleriniň basylmagyna ýa-da adaty bolmadyk jogap jogaplary bilen baglanyşykly genleriň aşa aşa gysylmagyna sebäp bolýar.Bu ýerde beýan edilen CTCM, tebigy ýürek siklini sikl wagty we fiziologiki uzalma (25% uzalma, 40% sistol, 60% diastol we minutda 72 urgy) taýdan takyklaýan 3D elektromehaniki stimul berýär.Dokumanyň bitewiligini saklamak üçin diňe üç ölçegli mehaniki gyjyndyrma ýeterlik bolmasa-da, dokumanyň ýaşaýyş ukyplylygyny, işleýşini we bitewiligini ýeterlik derejede saklamak üçin T3 / Dex ulanyp gülkünç we mehaniki gyjyndyrmanyň utgaşmasy zerurdyr.
Uly ýaşly ýürek fenotipini modulirlemekde gülkünç faktorlar möhüm rol oýnaýar.Bu, HiPS-CM gözleglerinde, öýjügiň ýetişmegini çaltlaşdyrmak üçin T3 we Dex-iň medeni mediýa goşulandygyny görkezdi.T3 aminokislotalaryň, şekerleriň we kalsiniň öýjük membranalaryna daşalmagyna täsir edip biler36.Mundan başga-da, T3 düwünçegiň CM-de haýal egilmek miýofibrilleri bilen deňeşdirilende, ýetişen kardiomositlerde çalt gysylýan miýofibrilleriň döremegine kömek edip, MHC-α aňlatmasyny we MHC-β düzgünleşdirilmegini öňe sürýär.Gipotireoz hassalarynda T3 ýetmezçiligi, miýofibrilleriň zolaklarynyň ýitmegine we sesiň ösüşiniň peselmegine getirýär37.Dex glýukokortikoid reseptorlarynda hereket edýär we izolirlenen atyrlanan ýüreklerde miokardyň sazlaşygyny ýokarlandyrýandygy görkezildi;38 bu gowulaşma, kalsiý goýumlary bilen dolandyrylýan (SOCE) 39,40 täsiri bilen baglanyşyklydyr öýdülýär.Mundan başga-da, Dex reseptorlary bilen baglanyşýar, immun funksiýasyny we çişmegi basyp ýatyrýan giň öýjükli jogap döredýär30.
Netijelerimiz, fiziki mehaniki gyjyndyrmanyň (MS) Ctrl bilen deňeşdirilende umumy medeniýet öndürijiligini gowulaşdyrandygyny, ýöne medeniýetde 12 günüň dowamynda ýaşaýyş ukyplylygyny, gurluş bitewiligini we ýürek aňlatmasyny saklap bilmedigini görkezýär.Ctrl bilen deňeşdirilende, T3 we Dex-iň CTCM (MT) medeniýetlerine goşulmagy ýaşaýyş ukyplylygyny ýokarlandyrdy we 12 günüň dowamynda täze ýürek dokumalary bilen şuňa meňzeş transkripsiýa profilini, gurluş bitewiligini we metabolik işjeňligini saklady.Mundan başga-da, dokumanyň uzalma derejesine gözegçilik etmek bilen, STCM ulgamynyň köp taraplydygyny görkezýän STCM ulanyp, giperekstensiýa bilen örtülen ýürek gipertrofiýasy modeli döredildi.Cardüregiň täzelenmegi we fibrozyň, adatça aýlanyş öýjükleriniň degişli sitokinleri, fagositoz we beýleki bejeriş faktorlaryny üpjün edip bilýän bitewi organlary öz içine alýandygyna garamazdan, ýüregiň bölümleri stres we trawma sebäpli fibrotik prosese öýkünip biljekdigini bellemelidiris.miýofibroblastlara.Mundan ozal bu ýürek dilim modelinde baha berildi.Taxikardiýa, bradikardiýa we mehaniki gan aýlanyş goldawy (mehaniki düşürilmedik ýürek) ýaly köp şertleri simulirlemek üçin CTCM parametrleriniň basyşy / elektrik amplitudasyny we ýygylygyny üýtgedip modulirläp boljakdygyny bellemelidiris.Bu ulgamy neşe barlagy üçin orta geçişe öwürýär.CTCM-iň çakdanaşa aşa ýürek gipertrofiýasyny modellemek ukyby bu ulgamy şahsy bejeriş üçin synagdan geçirmäge ýol açýar.Sözümiň ahyrynda, bu gözleg, ýürek dokumalarynyň bölümleriniň medeniýetini saklamak üçin mehaniki uzalma we gülkünç gyjyndyrmanyň möhümdigini görkezýär.
Bu ýerde hödürlenen maglumatlar, CTCM-iň bitewi miokardy modellemek üçin geljegi uly platforma bolandygyny görkezýän hem bolsa, bu medeniýet usulynyň käbir çäklendirmeleri bar.CTCM medeniýetiniň esasy çäklendirmesi, her sikliň dowamynda ýürek dilimleriniň gysylmagyna işjeň gözegçilik etmek ukybynyň öňüni alýan dilimlere üznüksiz dinamiki mehaniki stresleri girizmekdir.Mundan başga-da, ýürek bölümleriniň kiçi göwrümi (7 mm) sebäpli, adaty güýç datçiklerini ulanyp, medeniýet ulgamlarynyň daşyndaky sistolik funksiýa baha bermek ukyby çäklidir.Häzirki golýazmada optiki naprýa .eniýäni şertnama funksiýasynyň görkezijisi hökmünde bahalandyryp, bu çäklendirmäni bölekleýin ýeňýäris.Şeýle-de bolsa, bu çäklendirme has köp işlemegi talap eder we geljekde kalsiý we naprýatageeniýa duýgur boýaglary ulanyp optiki kartalaşdyrmak ýaly medeniýetde ýürek dilimleriniň işine optiki gözegçilik etmegiň usullaryny girizmek arkaly çözülip bilner.CTCM-iň başga bir çäklendirmesi, iş modeliniň fiziologiki stresleri dolandyrmazlygydyr (ýüklemek we ýüklemek).CTCM-de diastolda (doly uzalma) we sistolda (elektrik gyjyndyrmasy wagtynda gysylma uzynlygy) 25% fiziologiki uzalmany köpeltmek üçin ters tarapa basyş edildi.Bu çäklendirme geljekki CTCM dizaýnlarynda iki tarapdan ýürek dokumalaryna ýeterlik basyş we ýürek otaglarynda ýüze çykýan takyk basyş göwrümli gatnaşyklary ulanmak arkaly aýrylmalydyr.
Bu golýazmada habar berlen artykmaç uzaldylan remont, gipertrofiki giperstret signallaryny meňzeş etmek bilen çäklenýär.Şeýlelik bilen, bu model gülkünç ýa-da nerw faktorlaryna zerurlyk bolmazdan (bu ulgamda ýok) uzaldylan gipertrofiki duýduryşy öwrenmäge kömek edip biler.CTCM-iň köpelmegini ýokarlandyrmak üçin goşmaça barlaglar zerurdyr, mysal üçin, immun öýjükleri bilen bilelikde ösdürip ýetişdirmek, plazma gülkünç faktorlary aýlamak we neýron öýjükleri bilen bilelikde ösdürip ýetişdirmek, CTCM bilen kesel modellemegiň mümkinçiliklerini gowulandyrar.
Bu gözlegde 13 doňuz ulanyldy.Animalhli haýwan amallary institusional görkezmelere laýyklykda ýerine ýetirildi we Luizwil uniwersitetiniň haýwanlara ideg we ulanyş instituty tarapyndan tassyklandy.Aorta arkasy gysyldy we ýürek 1 L steril kardioplegiýa (110 mM NaCl, 1,2 m CaCl2, 16 mM KCl, 16 mMgCl2, 10 mM NaHCO3, 5 U / mL heparin, pH 7,4 çenli) bilen arassalandy; ýürekler buzda sowuk kardiopolgiki erginde, adatça <10 min bolan buzda laboratoriýa äkidilýänçä saklandy. ýürekler buzda sowuk kardiopolgiki erginde, adatça <10 min bolan buzda laboratoriýa äkidilýänçä saklandy. сердца хранили в ледяном кардиоп огиическом растворе до сировировки в лабораторию на льду, что обонно занимает <10 мин. ýürekler buzda sowuk kardioplegiki erginde buzda barlaghana äkidilýänçä saklanýar, adatça <10 min.10 心脏 10 10 10 10 10 10 10 10 10 1010 心脏 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 Держите сердца в ледяной кардиопгии до зировировки в лаборатораторю на льду, обикно <10 мин. Buzda barlaghana äkidilýänçä ýürekleri buz kardioplegiýasynda saklaň, adatça <10 min.
CTCM enjamy SolidWorks kompýuter kömegi bilen dizaýn (CAD) programma üpjünçiliginde işlenip düzüldi.Medeniýet otaglary, bölüjiler we howa otaglary CNC arassa akril plastmassadan ýasaldy.7 mm diametrli ätiýaçlyk halka merkezdäki ýokary dykyzlykly polietilenden (HDPE) ýasalýar we aşagyndaky metbugaty möhürlemek üçin ulanylýan silikon o-halkany ýerleşdirmek üçin o-halka çukury bar.Inçe kremniniň membranasy medeni kamerany aýralyk plastinkasyndan aýyrýar.Silikon membranasy 0,02 ″ galyň silikon listden lazer bilen kesilýär we gatylygy 35A.Aşaky we ýokarky silikon gaplar, 1/16 ″ galyň silikon listden lazer bilen kesilen we gatylygy 50A.Bloky berkitmek we howa geçirmeýän möhür döretmek üçin 316L poslamaýan polat nurbatlar we ganat hozlary ulanylýar.
Printedörite çap edilen zynjyr tagtasy (PCB), C-PACE-EM ulgamy bilen birleşdirilmäge niýetlenendir.PCB-de swiss maşyn birleşdiriji rozetkalary grafit elektrodlara kümüşden ýasalan mis simler we elektrodlara nurbatlanan bürünç 0-60 nurbatlar bilen birikdirilýär.Çap edilen zynjyr tagtasy 3D printeriň gapagynda ýerleşdirildi.
CTCM enjamy, ýürek sikline meňzeş gözegçilik edilýän gan aýlanyş basyşyny döredýän programmirläp bolýan pnewmatik hereketlendiriji (PPD) tarapyndan dolandyrylýar.Howa kamerasynyň içindäki basyş artdygyça, çeýe silikon membranasy ýokaryk giňelýär we dokumanyň aşagyndaky serişdäni mejbur edýär.Soňra dokumanyň meýdany, diastol wagtynda ýüregiň fiziologiki giňelişine meňzeş suwuklygyň çykarylmagy bilen uzalar.Dynç almagyň iň ýokary derejesinde, howa kamerasyndaky basyşy peseldýän we dokuma bölümleriniň gysylmagyna sebäp bolan grafit elektrodlar arkaly elektrik gyjyndyrmasy ulanyldy.Turbanyň içinde howa ulgamyndaky basyşy kesgitlemek üçin basyş datçigi bolan gemostatiki klapan bar.Basyş datçigi tarapyndan duýulýan basyş, noutbuga birikdirilen maglumat ýygnaýjyda ulanylýar.Bu, gaz kamerasynyň içindäki basyşy yzygiderli gözegçilik etmäge mümkinçilik berýär.Kameranyň iň ýokary basyşy (standart 80 mmHg, 140 mmHg OS) ýetilende, maglumatlary alýan enjam 4 C-e çenli 2 ms üçin bipaziki naprýa signaleniýe signalyny döretmek üçin C-PACE-EM ulgamyna signal ibermek tabşyryldy.
6ürek bölümleri alyndy we 6 guýyda medeni şertler aşakdaky ýaly ýerine ýetirildi: Harvestygnan ýürekleri geçiriji gämiden sowuk (4 ° C) kardioplegiýany öz içine alýan tarelka geçiriň.Çep mäkäm steril pyçak bilen izolirlenip, 1-2 sm3 böleklere bölünipdi.Bu dokuma bloklary dokuma ýelimleri bilen dokuma direglerine berkidilip, Tyrodyň erginini öz içine alýan we yzygiderli kislorodlaşdyrylan (3 g / L 2,3-butanedion monoksim (BDM), 140 mM NaCl (8.18 g), 6 mM KCl (0.447 g), 10 mM D-glýukoza (1,86 g), 10 mM D-glýukoza (1,86 gM) mM CaCl2 (1.8 ml 1 M ergin), 1 L ddH2O çenli).Wibrasiýa edýän mikrotoma 80 Hz ýygylykda 300 µm galyňlykdaky dilimleri, gorizontal yrgyldy amplitudasyny 2 mm we öňünden 0.03 mm / s tizlikde kesmeli boldy.Dokum wannasy ergini sowuk saklamak üçin buz bilen gurşalan we temperatura 4 ° C derejesinde saklanýar.Dokma bölümlerini mikrotome hammamyndan buzda üznüksiz kislorodlanan Tirod erginini öz içine alýan inkubasiýa wannasyna geçiriň, bir medeni plastinka üçin ýeterlik bölüm alynýança.Transwell medeniýetleri üçin dokuma bölümleri steril 6 mm giňlikdäki poliuretan direglerine birikdirildi we 6 ml optimallaşdyrylan orta (199 orta, 1x ITS goşundy, 10% FBS, 5 ng / ml VEGF, 10 ng / ml FGF-aşgar we 2X antibiotik-antifungal) ýerleşdirildi.Elektrik gyjyndyrmasy (10 V, ýygylygy 1,2 Hz) C-Pace arkaly dokuma bölümlerine ulanyldy.TD şertleri üçin, her orta üýtgemede 100 nM we 1 MM-de täze T3 we Dex goşuldy.Günde 3 gezek çalşylmazdan ozal, kislorod bilen doýýar.Dokma bölümleri 37 ° C we 5% CO2 inkubatorda ösdürilip ýetişdirildi.
CTCM medeniýetleri üçin dokuma bölümleri üýtgedilen Tirodyň erginini öz içine alýan Petri tagamynda ýörite öndürilen 3D printerde ýerleşdirildi.Enjam ýüregiň diliminiň ululygyny goldaw halkasynyň meýdanynyň 25% -ine çenli ýokarlandyrmak üçin niýetlenendir.Bu, Tirodyň ergininden orta we diastol wagtynda geçirilenden soň ýüregiň bölekleri uzalmazlygy üçin edilýär.Gistoakril ýelim ulanyp, galyňlygy 300 µm bolan diametri 7 mm bolan goldaw halkasyna berkidildi.Dokuma bölümlerini goldaw halkasyna dakanyňyzdan soň, artykmaç dokuma bölümlerini kesiň we birikdirilen dokuma bölümlerini bir enjam üçin ýeterlik bölüm taýýarlanýança buzda (4 ° C) Tirod ergininiň hammamyna goýuň.Deviceshli enjamlar üçin gaýtadan işlemegiň wagty 2 sagatdan köp bolmaly däldir.Goldaw halkalaryna 6 dokuma bölümi birikdirilenden soň, CTCM enjamy ýygnandy.CTCM medeniýet kamerasy 21 ml öňünden kislorodlaşdyrylan gurşaw bilen dolduryldy.Dokuma bölümlerini medeniýet kamerasyna geçiriň we turba bilen howa köpürjiklerini seresaplylyk bilen aýyryň.Dokuma bölümi soňra deşige ugrukdyrylýar we ýuwaşlyk bilen ýerine basylýar.Ahyrynda, elektrod gapagyny enjamyň üstünde goýuň we enjamy inkubatorlara geçiriň.Soňra CTCM-i howa turbasyna we C-PACE-EM ulgamyna birikdiriň.Pnewmatiki hereketlendiriji açylýar we howa klapan CTCM açýar.C-PACE-EM ulgamy, 2 ms aralykda bipaziki aralykda 4 V 1,2 Hz-a ýetirmek üçin düzüldi.Günde iki gezek gurşaw üýtgedildi we elektrodlarda grafit ýygnanmazlygy üçin elektrodlar günde bir gezek üýtgedildi.Zerur bolsa, aşagyna düşen howa köpürjiklerini kowmak üçin dokma bölümlerini medeni guýularyndan aýryp bolýar.MT bejergisi şertleri üçin 100 nM T3 we 1 μM Dex bilen her orta üýtgeşiklik bilen T3 / Dex täze goşuldy.CTCM enjamlary 37 ° C we 5% CO2 inkubatorda ösdürilip ýetişdirildi.
Heartürek dilimleriniň uzalýan traýektoriýalaryny almak üçin ýörite kamera ulgamy döredildi.SLR kamerasy (Canon Rebel T7i, Canon, Tokio, Japanaponiýa) Navitar Zoom 7000 18-108mm makro linzasy (Navitar, San-Fransisko, CA) ulanyldy.Wizuallaşdyrma gurşawy täze gurşaw bilen çalşandan soň otag temperaturasynda geçirildi.Kamera 51 ° burçda ýerleşýär we wideo sekuntda 30 kadrda ýazga alynýar.Ilki bilen ýürek dilimleriniň hereketini kesgitlemek üçin Image-J bilen açyk çeşme programma üpjünçiligi (MUSCLEMOTION43) ulanyldy.Maska MATLAB (MathWorks, Natick, MA, ABŞ) ulanyp, sesiň öňüni almak üçin ýürek dilimlerini urmak üçin gyzyklanýan sebitleri kesgitlemek üçin döredildi.El bilen bölünen maskalar çarçuwaly yzygiderlilikde ähli suratlara ulanylýar we soňra MUSCLEMOTION plaginine geçirilýär.Muscle Motion, her çarçuwadaky pikselleriň ortaça intensiwligini salgylanma çarçuwasyna görä hereketini kesgitlemek üçin ulanýar.Maglumatlar ýazga alyndy, süzüldi we sikl wagtyny kesgitlemek we ýürek siklinde dokumalaryň uzalmagyna baha bermek üçin ulanyldy..Azga alnan wideo birinji tertipli nol fazaly sanly süzgüç bilen gaýtadan işlenildi.Dokumanyň uzalmagyny (pik-to-pik) kesgitlemek üçin, ýazylan signaldaky pikler bilen çukurlary tapawutlandyrmak üçin pik-to-pik analiz edildi.Mundan başga-da, signalyň süýşmegini ýok etmek üçin 6-njy tertipli polinomial ulanmak arkaly peselmek amala aşyrylýar.Programma kody MATLAB-da global dokumanyň hereketini, sikl wagtyny, dynç alyş wagtyny we gysylma wagtyny kesgitlemek üçin işlenip düzüldi (Goşmaça programma kody 44).
Dartyş derňewi üçin, mehaniki uzalmany bahalandyrmak üçin döredilen şol bir wideolary ulanyp, ilki bilen MUSCLEMOTION programma üpjünçiligine laýyklykda hereketiň iň ýokary (iň ýokary) we iň pes (aşaky) nokatlaryny görkezýän iki sany suraty yzarladyk.Soňra dokumanyň sebitlerini böldük we segmentli dokuma kölegeli algoritm görnüşini ulandyk (Goşmaça 2a surat).Bölünen dokuma soňra on ýerasty bölege bölündi we her üstündäki stres aşakdaky deňlemäniň kömegi bilen hasaplandy: Strain = (Sup-Sdown) / Sdown, bu ýerde Sup we Sdown degişlilikde matanyň ýokarky we aşaky kölegelerinden şekiliň aralyklarydyr (Goşmaça surat .2b).
Heartürek bölümleri 48% paraformaldegidde 4% düzüldi.Kesgitlenen dokumalar 1 sagatda 10% we 20% sukrozda, soň bolsa bir gije 30% sukrozda suwsuzlandyryldy.Soňra bölümler optimal kesiş temperatura birleşmesine (OCT birleşmesi) ýerleşdirildi we izopentan / gury buz wannasynda kem-kemden doňdy.OCT goýma bloklaryny bölünýänçä -80 ° C derejesinde saklaň.Slaýdlar galyňlygy 8 μm bolan bölümler hökmünde taýýarlandy.
OCT-ni ýürek bölümlerinden aýyrmak üçin slaýdlary 95 ° C-de 5 minut gyzdyryň.Her slaýda 1 ml PBS goşuň we otag temperaturasynda 30 minut inkubasiýa ediň, soňra otag temperaturasynda 15 minut PBS-de 0,1% Triton-X goýup, bölümlere aralaşyň.Aýratyn däl antikorlaryň nusga bilen baglanyşmagynyň öňüni almak üçin, slaýdlara 1 ml 3% BSA erginini goşuň we otag temperaturasynda 1 sagat inkubasiýa ediň.Soňra BSA aýryldy we slaýdlar PBS bilen ýuwuldy.Her nusgany galam bilen belläň.Esasy antikorlar (1% BSA-da 1: 200 suwuklandyryldy) (43-nji konnexin (Abcam; # AB11370), NFATC4 (Abcam; # AB99431) we troponin-T (Termo Scientific; # MA5-12960) 90 minutdan soň goşuldy, soňra ikinji antikorlar (1% BSA-da 1% BSA) Alya Alexa Fluor; 594 (Termo Scientific; # T6391) goşmaça 90 minut üçin PBS bilen 3 gezek ýuwuldy Maksatly reňkleri fonda tapawutlandyrmak üçin diňe ikinji derejeli antikorlary gözegçilik hökmünde ulanýardyk. Netijede, DAPI ýadro tegmili goşuldy we slaýdlar wektashilde (Vektor Laboratories) ýerleşdirildi we dyrnak lak bilen ulaldyldy we -x ulaldyldy.
PGA-da 5 μg / ml bolan WGA-Alexa Fluor 555 (Termo Scientific; # W32464) WGA reňklemek üçin ulanyldy we otag temperaturasynda 30 minutlap kesgitlenen bölümlere ulanyldy.Soňra slaýdlar PBS bilen ýuwuldy we her slaýda Sudanyň gara goşuldy we 30 minut inkubasiýa edildi.Soňra slaýdlar PBS bilen ýuwuldy we wektaşild goýulýan gurşaw goşuldy.Slaýdlar 40x ulalanda Keyence mikroskopynda şekillendirildi.
OCT ýokarda görkezilişi ýaly nusgalardan aýryldy.OCT aýrylandan soň, slaýdlary Bouin erginine bir gije çümdüriň.Soňra slaýdlar distillirlenen suw bilen 1 sagat ýuwuldy we 10 minutlap Bibrih aloe kislotasy fuksin erginine ýerleşdirildi.Soňra slaýdlar distillendirilen suw bilen ýuwuldy we 5 minut fosfolibden / 5% fosfotungstik kislotasynyň erginine 10 minut goýuldy..Uwmazdan, slaýdlary göni anilin gök erginine 15 minut geçiriň.Soňra slaýdlar distillendirilen suw bilen ýuwuldy we 1 minut sirke kislotasynyň erginine 2 minut goýuldy.Slaýdlar 200 N etanolda guradyldy we ksilene geçirildi.Dokalanan slaýdlar 10x maksatly Keyence mikroskopy arkaly şekillendirildi.Fibroz meýdanynyň göterimi Keyence Analyzer programma üpjünçiligi arkaly kesgitlenildi.
CyQUANT ™ MTT öýjükleriň ýaşaýyş ukyplylygy barlagy (Invitrogen, Carlsbad, CA), käbir üýtgetmeler bilen öndürijiniň teswirnamasyna laýyklykda katalog belgisi V13154.Hususan-da, MTT derňewi wagtynda dokumanyň birmeňzeş ululygyny üpjün etmek üçin diametri 6 mm bolan hirurgiki zarba ulanyldy.Dokumalar öndürijiniň teswirnamasyna laýyklykda MTT substratyny öz içine alýan 12 guýy plastinkanyň guýularyna aýratynlykda örtüldi.Bölümler 37 ° C-de 3 sagatlap inkubasiýa edilýär we janly dokumalar MTT substratyny çalşyp, gyrmyzy formazan birleşmesini emele getirýär.MTT erginini 1 ml DMSO bilen çalyşyň we ýürek bölümlerinden gyrmyzy formazany çykarmak üçin 37 ° C-de 15 minut inkubasiýa ediň.Nusgalar DMSO-da 1: 10-da 96 sany arassa aşaky aşaky plastinkalarda we Cytation plastinka okyjysy (BioTek) ulanyp 570 nm ölçenen gyrmyzy reňk intensiwliginde garyndy.Readüregiň her diliminiň agramyna çenli okaldy.
Heartürek dilim mediasy, öň beýan edilişi ýaly glýukozany ulanmak barlagy üçin 1 μCi / ml [5-3H] -glukoza (Moravek Biohimiki, Brea, CA, ABŞ) bolan media bilen çalşyryldy.4 sagat inkubasiýa edilenden soň, 100 µl 0,2 N HCl bolan açyk mikrosentrifuga turbasyna 100 µl orta goşuň.Soňra turba 37 ° C-de 72 sagatlap bugarmak üçin [3H] 2O 500 μl dH2O bolan sintilýasiýa turbasyna ýerleşdirildi.Soňra sintilýasiýa turbasyndan mikrosentrifuge turbasyny aýyryň we 10 ml sintilýasiýa suwuklygyny goşuň.Sintilýasiýa hasaplamalary Tri-Carb 2900TR suwuk sintilýasiýa analizatorynyň kömegi bilen geçirildi (Packard Bioscience Company, Meriden, CT, ABŞ).Soňra glýukozany ulanmak [5-3H] - glýukozanyň aýratyn işjeňligini, doly däl deňagramlylygy we fonuny, [5-3H] belgisiz glýukozany eritmegi we sintilýasiýa garşy netijeliligini göz öňünde tutup hasaplandy.Maglumatlar ýüregiň bölümleriniň massasyna kadalaşdyrylýar.
Trizolda dokumalaryň birmeňzeşleşmeginden soň, RNK öndürijiniň teswirnamasyna laýyklykda Qiagen miRNeasy Micro Kit # 210874 ulanyp, ýürek bölümlerinden izolirlendi.RNAsec kitaphanasyny taýýarlamak, yzygiderlilik we maglumatlar derňewi aşakdaky ýaly geçirildi:
RNK kitaphanasyny taýýarlamak üçin başlangyç material hökmünde her nusga üçin 1 μg RN ulanyldy.Yzygiderli kitaphanalar öndürijiniň tekliplerinden soň NEBNext UltraTM RNA kitaphanasynyň Illumina üçin taýýarlaýyş toplumy (NEB, ABŞ) ulanylyp döredildi we her nusga üçin atribut yzygiderliligine indeks kodlary goşuldy.Gysgaça, mRNA poli-T oligonukleotidler bilen birikdirilen magnit monjuklary ulanyp, umumy RNK-dan arassalandy.Bölünmek, NEBNext Birinji Strand Sintez Reaksiýa Buferinde (5X) ýokary temperaturada bölünen kationlar arkaly amala aşyrylýar.Ilkinji setir cDNA tötänleýin geksamer primerleri we M-MuLV ters transkriptaz (RNase H-) ulanyp sintez edildi.Ikinji hatar cDNA soňra DNK polimeraza I we RNase H. ulanyp sintez edilýär. Galan galyndylar ekzonukleýz / polimeraza işjeňligi bilen gödek uçlara öwrülýär.DNK böleginiň 3 ′ ujy adenilýasiýa edilenden soň, gibridizasiýa taýýarlamak üçin oňa saçly aýlawly gurluşly NEBNext adapter dakylýar.Iň oňat uzynlygy 150-200 bp bolan CDNA böleklerini saýlamak üçin.kitaphananyň bölekleri AMPure XP ulgamy bilen arassalandy (Bekman Kulter, Bewerli, ABŞ).Soňra, adapter bilen baglanyşdyrylan ululykda saýlanan CDNA bilen 3 μl USER fermenti (NEB, ABŞ) 37 minutda 15 minut, PCR-den öň 95 ° C-de 5 minut ulanyldy.PCR soňra Phusion High-Fidelity DNA polimeraza, uniwersal PCR primerleri we Index (X) primerleri arkaly ýerine ýetirildi.Ahyrynda PCR önümleri arassalandy (AMPure XP ulgamy) we Agilent Bioanalyzer 2100 ulgamynda kitaphananyň hiline baha berildi.Soňra CDNA kitaphanasy “Nowaseq” yzygiderliligi bilen yzygiderlidi.Illuminadan çig şekil faýllary CASAVA Base Calling ulanyp çig okama öwrüldi.Çig maglumatlar okalýan yzygiderliligi we degişli esasy häsiýetleri öz içine alýan FASTQ (fq) format faýllarynda saklanýar.Sscrofa11.1 salgylanma genomyna süzülen yzygiderliligi okamak üçin HISAT2 saýlaň.Umuman alanyňda, HISAT2 4 milliarddan uly genomlary goşmak bilen islendik ululykdaky genomlary goldaýar we parametrleriň köpüsi üçin deslapky bahalar kesgitlenýär.RNA Seq maglumatlaryndan okalýan bölekler, beýleki usullara meňzeş ýa-da has takyklygy bilen häzirki wagtda bar bolan iň çalt ulgam HISAT2 ulanyp, netijeli deňleşdirilip bilner.
Transazgylaryň köp bolmagy gen aňlatmagyň derejesini gönüden-göni görkezýär.Gen aňlatmagyň derejeleri gen ýa-da eksonlar bilen baglanyşykly ýazgylaryň köplügi (yzygiderlilik sany) bilen bahalandyrylýar.Okalýanlaryň sany gen aňlatma derejelerine, gen uzynlygyna we yzygiderlilik çuňlugyna proporsionaldyr.FPKM (million esasy jübüt üçin yzygiderli müň jübüt jübütiň bölekleri) hasaplandy we DESeq2 bukjasynyň kömegi bilen diferensial aňlatmanyň P-bahalary kesgitlenildi.Soňra gurlan R-funksiýa “p.adjust” esasynda Benjamini-Hochberg usuly9 ulanyp, her P bahasy üçin ýalňyş açyş tizligini (FDR) hasapladyk.
Heartürek bölümlerinden izolirlenen RNK, Termodan SuperScript IV Vilo Master garyndysyny ulanyp, 200 ng / μl konsentrasiýasynda CDNA öwrüldi (Termo, pişik no 11756050).Mukdar RT-PCR amaly biosistemalar Endura plastinka Microamp 384 gowy aýdyň reaksiýa plastinkasy (Termo, pişik. 4483319) we mikroamp optiki ýelim (Termo, pişik 43 4311971) ulanylyp ýerine ýetirildi.Reaksiýa garyndysy 5 µl Taqman Fast Advanced Master garyndysyndan (Termo, pişik 44 4444557), 0,5 µl Taqman Primer we guýy üçin 3,5 µl H2O garyndysyndan ybaratdy.Adaty qPCR siklleri işledildi we CT bahalary amaly biosistemalar Quantstudio 5 real wagt PCR guraly (384 guýy modul; önüm # A28135) bilen ölçeldi.Taqman desgalary Termodan (GAPDH (Ss03375629_u1), PARP12 (Ss06908795_m1), PKDCC (Ss06903874_m1), CYGB (Ss06900188_m1), RGL1 (Ss06868890_N1) 3383805_u1), GJA1 (Ss03374839_u1), COL1A2 (Ss03375009_u1), COL3A1 (Ss04323794_m1), ACTA2 (Ss04245588_m1) homehli nusgalaryň CT bahalary öý hyzmaty genine kadalaşdyryldy.
NT-ProBNP-iň köpçülikleýin habar beriş serişdesi öndürijiniň teswirnamasyna laýyklykda NT-ProBNP toplumy (doňuz) (Cat. MBS2086979, MyBioSource) ulanylyp baha berildi.Gysgaça, her guýynyň nusgasynda her nusgadan we standartdan 250 µl goşuldy.Nusga goşanyňyzdan soň, her guýa 50 µl Assay Reagent A goşuň.Tabagy ýuwaşlyk bilen silkip, möhürleýji bilen möhürläň.Soňra planşetler 37 ° C-de 1 sagatlap inkubasiýa edildi.Soňra ergini isläň we guýulary 4 gezek 350 µl 1X ýuwujy ergin bilen ýuwuň, her gezek 1-2 minut ýuwuň.Soňra her guýy üçin 100 µl Assay Reagent B goşuň we plastinka möhürleýji bilen möhürläň.Planşet ýuwaşlyk bilen silkindi we 37 ° C-de 30 minut inkubasiýa edildi.Ergini isläň we guýulary 350 µl 1X ýuwujy ergin bilen 5 gezek ýuwuň.Her guýa 90 µl substrat ergin goşuň we tabagy möhürläň.Tabagy 37 ° C-de 10-20 minutlap goýuň.Her guýa 50 µl Stop Solution goşuň.Tabak 450 nm-de düzülen Cytation (BioTek) plastinka okyjy bilen derrew ölçenildi.
Topar ululyklaryny saýlamak üçin güýç analizleri geçirildi, 5% I ýalňyşlyk derejesi bilen parametrdäki 10% mutlak üýtgemäni ýüze çykarmak üçin> 80% güýç berer. Topar ululyklaryny saýlamak üçin güýç analizleri geçirildi, 5% I ýalňyşlyk derejesi bilen parametrdäki 10% mutlak üýtgemäni ýüze çykarmak üçin> 80% güýç berer. Аназ мощности был выполнен для выбора размеров группасы, кот че обеспечат> 80% мощности для обнаружения 10% абсолтного изменения Параметра с 5% частотой сихибок чипа I. Kuwwat derňewi, 5% I ýalňyşlyk derejesi bilen 10% mutlak parametr üýtgemesini kesgitlemek üçin> 80% güýç berjek topar ululyklaryny saýlamak üçin geçirildi.进行 功效 分析 80 提供 80> 80 ％ 功效 以 中 中 中 ％ ％ ％ 5 ％ I 型 错误。。。进行 功效 分析 80 提供 80> 80 ％ 功效 以 中 中 中 ％ ％ ％ 5 ％ I 型 错误。。。 Был проекты 10% mutlak parametr üýtgemesini we 5% I ýalňyşlyk derejesini kesgitlemek üçin> 80% güýç berjek topar ululygyny saýlamak üçin güýç derňewi geçirildi.Dokum bölümleri synagdan öň tötänleýin saýlandy.Analyhli derňewler kör bolupdy we nusgalar diňe ähli maglumatlar seljerilenden soň kodlandy.GraphPad Prism programma üpjünçiligi (San Diego, CA) ähli statistiki derňewleri geçirmek üçin ulanyldy. Allhli statistika üçin p-bahalar <0.05 bahalarynda möhüm hasaplandy. Allhli statistika üçin p-bahalar <0.05 bahalarynda möhüm hasaplandy. Для всей стати пи-значения сититались значимыми при значениях <0,05. Allhli statistika üçin p-bahalar <0.05 bahalarynda möhüm hasaplandy.对于 所有 统计 ， p 值 0.05 <0.05 时 被 认为 是。。。对于 所有 统计 ， p 值 0.05 <0.05 时 被 认为 是。。。 Для всей стати пи-значения сититались значимыми при значениях <0,05. Allhli statistika üçin p-bahalar <0.05 bahalarynda möhüm hasaplandy.Iki guýrukly T-synagy maglumatlarda bary-ýogy 2 deňeşdirme bilen geçirildi.Birnäçe toparyň arasyndaky ähmiýeti kesgitlemek üçin bir taraplaýyn ýa-da iki taraplaýyn ANOVA ulanyldy.Soňky synaglar geçirilende, birnäçe deňeşdirme üçin Tukiniň düzedişi ulanyldy.RNAsec maglumatlary, usullar bölüminde beýan edilişi ýaly FDR we p.adjust hasaplanylanda aýratyn statistik pikirlere eýe.
Okuw dizaýny barada has giňişleýin maglumat üçin bu makala bilen baglanyşykly Tebigat gözleg hasabatyna serediň.