Salamat sa pagbisita sa Nature.com. Ang bersyon ng browser na iyong ginagamit ay may limitadong suporta para sa CSS. Para sa pinakamahusay na karanasan, inirerekomenda namin na gumamit ka ng na-update na browser (o i-off ang compatibility mode sa Internet Explorer). Pansamantala, upang matiyak ang patuloy na suporta, ipapakita namin ang site nang walang mga istilo at JavaScript.
Ang human gut morphogenesis ay nagtatatag ng mga tampok na crypt-villus ng 3D epithelial microarchitecture at spatial na organisasyon. Ang natatanging istrukturang ito ay kinakailangan upang mapanatili ang gut homeostasis sa pamamagitan ng pagprotekta sa stem cell niche sa basal crypt mula sa mga exogenous microbial antigens at ang kanilang mga metabolite. mineral, ang muling paglikha ng 3D epithelial structures ay napakahalaga para sa pagbuo ng in vitro gut models. Kapansin-pansin, ang organic mimetic gut-on-a-chip ay maaaring mag-udyok ng spontaneous na 3D morphogenesis ng intestinal epithelium na may pinahusay na physiological function at biomechanics. Dito, nagbibigay kami ng reproducible na gut-on-a-chip bilang induce ng mahusay na gut-utos na protocol sa intestinal epithelium bilang isang mahusay na reproducible na gut-test na protocol sa intestinal na gut. isang Transwell embedded hybrid chip. Inilalarawan namin ang mga detalyadong pamamaraan para sa paggawa ng device, pag-culture ng Caco-2 o intestinal organoid epithelial cells sa conventional settings pati na rin sa microfluidic platform, induction ng 3D morphogenesis, at characterization ng itinatag na 3D epithelia gamit ang maramihang imaging modalities . Ang protocol na ito ay nakakamit ng microfluidic na platform, induction ng 3D morphogenesis, at characterization ng itinatag na 3D epithelia gamit ang maramihang imaging modalities. Gumagamit ang paraan ng ogenesis na may kaugnayan sa physiologically shear stress at mechanical motion at hindi nangangailangan ng kumplikadong cell engineering o manipulasyon, na maaaring mas mahusay kaysa sa iba pang umiiral na mga diskarte. Naiisip namin na ang aming iminungkahing protocol ay maaaring magkaroon ng malawak na implikasyon para sa biomedical research community, na nagbibigay ng paraan upang muling buuin ang 3D intestinal epithelial layers sa vitro para sa biomedical, clinical, at pharmaceutical application.
Ipinakikita ng mga eksperimento na ang mga intestinal epithelial Caco-2 cells na naka-culture sa gut-on-a-chip1,2,3,4,5 o bilayer microfluidic device6,7 ay maaaring sumailalim sa spontaneous 3D morphogenesis in vitro nang walang malinaw na pag-unawa sa pinagbabatayan na mekanismo. in vitro, na ipinakita ng Caco-2 at mga organoids ng bituka na nagmula sa pasyente.Na-validate ang mga epithelial cells. Sa pag-aaral na ito, partikular kaming nakatutok sa paggawa ng cell at pamamahagi ng konsentrasyon ng isang makapangyarihang Wnt antagonist, Dickkopf-1 (DKK-1), sa gut-on-a-chip at binagong microfluidic device na naglalaman ng mga Transwell insert, na tinatawag na "Hybrid Chip". Ipinakita namin na ang pagdaragdag ng exogenous Wnt-related na mga antagonist, Wnt-repress na DKK-1 bilang mga lihim na antagonist, na may kaugnayan sa WNT1. 1, o Soggy-1) sa on-chip gut ay pumipigil sa morphogenesis o nakakagambala sa prestructured na 3D epithelial layer , na nagmumungkahi na ang antagonistic na stress sa panahon ng kultura ay responsable para sa intestinal morphogenesis in vitro. Samakatuwid, ang isang praktikal na diskarte upang makamit ang matatag na morphogenesis sa epithelial interface ay ang alisin o minimally na mapanatili ang mga antas ng basogogenesis sa pamamagitan ng pag-antas ng mga basogogenesis sa pamamagitan ng mga aktibong antagonist sa pamamagitan ng pag-aalis o minimally antagon. -on-a-chip o hybrid-on-a-chip platform) o diffusion .Basolateral media (hal., mula sa Transwell inserts sa malalaking basolateral reservoir sa mga balon).
Sa protocol na ito, nagbibigay kami ng detalyadong paraan para sa paggawa ng gut-on-a-chip microdevices at Transwell-insertable hybrid chips (hakbang 1-5) para ikultura ang mga bituka na epithelial cell sa polydimethylsiloxane (PDMS) na nakabatay sa porous membranes (mga hakbang 6A, 7A, 8, 9) o polyesterBsndus, 8, 9) o polyesterBsndu, 8, 9) o polyesterBsndu, 8, 7 ced 3D morphogenesis in vitro (hakbang 10). Natukoy din namin ang mga tampok na cellular at molekular na nagpapahiwatig ng histogenesis na tukoy sa tissue at pagkakaiba-iba ng cellular na umaasa sa linya sa pamamagitan ng paglalapat ng maramihang mga modalidad ng imaging (hakbang 11-24). Hinikayat namin ang morphogenesis gamit ang mga selula ng epithelial ng bituka ng tao, tulad ng Caco-2 o intestinal na mga detalye ng organoids, na may mga detalye ng paglikha ng mga teknikal na organo sa ibabaw, sa pamamagitan ng mga detalye ng Caco-2 o intestinal na ibabaw. 2D monolayer, at bituka biochemical at Reproduction ng biomechanical microenvironment.in vitro.Upang mahikayat ang 3D morphogenesis mula sa 2D epithelial monolayer, inalis namin ang mga morphogen antagonist sa parehong kultura sa pamamagitan ng pagdaloy ng medium sa basolateral compartment ng kultura. Sa wakas, nagbibigay kami ng isang representasyon ng 3D na magagamit na utility na maaaring magamit na 3. epithelial growth, longitudinal host-microbiome co-cultures, pathogen infection, inflammatory injury, epithelial barrier dysfunction, at probiotic-based therapies Example.influences.
Ang aming protocol ay maaaring maging kapaki-pakinabang sa isang malawak na hanay ng mga siyentipiko sa pangunahing (hal., intestinal mucosal biology, stem cell biology, at developmental biology) at inilapat na pananaliksik (hal., preclinical drug testing, pagmomodelo ng sakit, tissue engineering, at gastroenterology) malawak na epekto. Dahil sa reproducibility at tibay ng aming protocol na mahikayat ang 3D na morphinal vision, ang aming diskarte sa pagbuo ng teknikal na morphinalogenesis ibinibigay sa mga audience na nag-aaral ng dynamics ng cell signaling sa panahon ng intestinal development, regeneration o homeostasis . Bukod pa rito, ang aming protocol ay kapaki-pakinabang para sa interogasyon ng impeksyon sa ilalim ng iba't ibang nakakahawang ahente gaya ng Norovirus 8, Severe Acute Respiratory Syndrome Coronavirus 2 (SARS-CoV-2), Clostridium difficile, Salmonella Typhimuorium, Salmonella Typhimuorium.Kapaki-pakinabang din ang mga audience ng pathology at pathogenesis ng sakit. Ang paggamit ng on-chip gut microphysiology system ay maaaring magbigay-daan sa longitudinal co-culture 10 at kasunod na pagtatasa ng host defense, immune responses at pathogen-related injury repair sa gastrointestinal (GI) tract 11 .Iba pang mga GI disorder na nauugnay sa leaky gut syndrome, celiac disease, Crohn's disease na maaaring maging simula ng sakit na Crohn, ulsertest bowelt, Crohn's colitis, o ulcerative bowelt syndrome. Ang mga inal epithelial layer ay inihahanda gamit ang 3D intestinal epithelial layer ng pasyente, ang mga sakit na ito ay kinabibilangan ng villous atrophy, crypt shortening, mucosal damage, o impaired epithelial barrier.Biopsy o stem cell-derived intestinal organoids12,13. Para mas mahusay na modelo ang mas mataas na pagkakumplikado ng sakit-cell na kapaligiran ay maaaring isaalang-alang ang mga selula ng sakit na monoclear, mga uri ng cell. PBMCs), sa mga modelong naglalaman ng 3D intestinal villus-crypt microarchitectures.immune cells na partikular sa tissue, 5.
Dahil ang 3D epithelial microstructure ay maaaring maayos at mailarawan nang walang proseso ng sectioning, ang mga manonood na nagtatrabaho sa spatial transcriptomics at high-resolution o super-resolution na imaging ay maaaring maging interesado sa aming pagmamapa ng spatiotemporal dynamics ng mga gene at protina sa mga epithelial niches.Interesado sa teknolohiya.Tugon sa microbial o immune stimuli.Higit pa rito, ang longitudinal host-microbiome crosstalk 10, 14 na nagko-coordinate ng gut homeostasis ay maaaring maitatag sa 3D intestinal mucosal layer sa pamamagitan ng co-culturing ng iba't ibang microbial species, microbial community o fecal microbiota-on-a-chip-, lalo na sa gut.sa platform.Ang diskarte na ito ay partikular na kaakit-akit sa mga madla na nag-aaral ng mucosal immunology, gastroenterology, microbiome ng tao, culturomics at clinical microbiology na naglalayong linangin ang dati nang hindi na-culture na gut microbiota sa laboratoryo. Kung ang aming in vitro morphogenesis protocol ay maaaring iakma sa mga scalable na format ng kultura, tulad ng multiwell inserts sa 24, 496 na patuloy na baso, 496 na rin ang tuluy-tuloy na paglalagay ng baso, 496 ipinakalat sa mga bumubuo ng pharmaceutical, biomedical O high-throughput na screening o validation platform para sa industriya ng pagkain. Bilang patunay ng prinsipyo, ipinakita namin kamakailan ang pagiging posible ng isang multiplex na high-throughput na morphogenesis system na nasusukat sa 24-well plate na format. Bilang karagdagan, ang maramihang organ-on-a-chip na mga produkto ay na-komersyal na,18 na na-komersyal ang pamamaraan,16 na na-komersyal,18,16,16,16 na na-komersyal ang pamamaraan ng vi. pinabilis at potensyal na pinagtibay ng maraming laboratoryo ng pananaliksik, industriya o gobyerno at mga ahensya ng regulasyon upang maunawaan ang cellular reprogramming ng in vitro gut morphogenesis sa antas ng transcriptomic upang subukan ang mga gamot o biotherapeutics Ang pagsipsip at transportasyon ng mga kandidato sa droga ay tinasa gamit ang 3D gut surrogates o paggamit ng custom o komersyal na organ-on-a-chip reproducibility ng proseso ng reproducibility ng gut.
Ang isang limitadong bilang ng mga modelong pang-eksperimentong nauugnay sa tao ay ginamit upang pag-aralan ang intestinal epithelial morphogenesis, pangunahin dahil sa kakulangan ng mga maipapatupad na protocol upang mahikayat ang 3D morphogenesis sa vitro. Sa katunayan, karamihan sa kasalukuyang kaalaman tungkol sa gut morphogenesis ay batay sa mga pag-aaral ng hayop (hal., zebrafish20, mice21 o pinakamahalagang mga manok22). Sa totoo lang, hindi tiyak na tinutukoy ang mga proseso ng pag-unlad ng tao. Ang mga modelong ito ay napakalimitado din sa kanilang kakayahang masuri sa isang multi-way na scalable na paraan. Samakatuwid, ang aming protocol para sa pagbabagong-buhay ng 3D tissue structures sa vitro ay higit na gumaganap sa vivo na mga modelo ng hayop pati na rin ang iba pang tradisyonal na static na 2D cell culture models. Gaya ng naunang inilarawan, sa paggamit ng 3D epithelial structures ng mga epithelial na estruktura sa mga lokal na estruktura ng epitelisasyon sa iba't ibang 3D na mga cell. -villus axis bilang tugon sa iba't ibang mucosal o immune stimuli. Ang 3D epithelial layer ay maaaring magbigay ng puwang upang pag-aralan kung paano nakikipagkumpitensya ang mga microbial cell upang bumuo ng spatial niches at ecological evolution bilang tugon sa host factor (hal., panloob laban sa panlabas na mucus layer, pagtatago ng IgA at antimicrobial peptides). gumagawa ng mga microbial metabolites (hal., short-chain fatty acids) na humuhubog sa cellular organization at stem cell niches sa basal crypts. Ang mga feature na ito ay maipapakita lamang kapag ang 3D epithelial layers ay naitatag sa vitro.
Bilang karagdagan sa aming paraan ng paglikha ng 3D intestinal epithelial structures, mayroong ilang mga in vitro na pamamaraan.Ang bituka organoid culture ay isang state-of-the-art na tissue engineering technique batay sa paglilinang ng mga bituka stem cell sa ilalim ng mga partikular na kondisyon ng morphogen23,24,25.Gayunpaman, ang paggamit ng 3D organoid na mga modelo-microbiging analysis ay kadalasang ginagamit sa pagtatasa ng host ng organoid-microbi sa transporting lumen o pag-aaral ay nakapaloob sa loob ng organoid at, samakatuwid, ang pagpapakilala ng mga luminal na bahagi tulad ng mga microbial cells o exogenous antigens ay limitado.Ang pag-access sa mga organoid lumen ay maaaring mapabuti gamit ang isang microinjector,26,27 ngunit ang pamamaraang ito ay invasive at labor-intensive at nangangailangan ng espesyal na kaalaman upang maisagawa. Higit pa rito, ang mga tradisyonal na organoid na kultura na pinananatili sa hydrogel scaffolds sa ilalim ng mga static na kondisyon ay hindi tumpak na nagpapakita ng aktibo sa vivo biomechanics.
Ang iba pang mga diskarte na ginagamit ng ilang grupo ng pananaliksik ay gumagamit ng prestructured 3D hydrogel scaffolds upang gayahin ang gut epithelial structure sa pamamagitan ng pag-culture ng mga nakahiwalay na selula ng bituka ng tao sa ibabaw ng gel. Fabricate hydrogel scaffolds gamit ang 3D-printed, micro-milled, o lithographically fabricated molds. Ipinapakita ng paraang ito ang self-physiological intestinal na mga cell na may kaugnayan sa isologenital na vitroorgan na mga cell. gradients, na nagtatatag ng mataas na aspect ratio na epithelial structure at stroma-epithelial crosstalk sa pamamagitan ng pagsasama ng stromal cells sa scaffold.Gayunpaman, ang likas na katangian ng prestructured scaffolds ay maaaring pumigil sa pagpapakita mismo ng spontaneous morphogenetic na proseso. Gumamit ang pag-aaral ng mga hydrogel scaffold sa isang microfluidic platform at may pattern na mga istruktura ng epithelial ng bituka gamit ang mga pamamaraan ng laser-etching. Ang mga organoid ng bituka ng mouse ay sumusunod sa mga nakaukit na pattern upang bumuo ng mga istrukturang tubular ng bituka, at ang daloy ng intraluminal fluid ay maaaring i-recapitulate gamit ang isang microfluidics module. Gayunpaman, ang modelong ito ay hindi nagpapakita ng mga spontaneous na proseso ng pag-print mula sa modelong ito. ang parehong grupo ay nakagawa ng mga miniature na gut tube na may kusang morphogenetic na proseso. Sa kabila ng kumplikadong paggawa ng iba't ibang gut segment sa loob ng tube, ang modelong ito ay kulang din sa luminal fluid flow at mechanical deformation. Bukod pa rito, maaaring limitado ang operability ng modelo, lalo na pagkatapos makumpleto ang proseso ng bioprinting, nakakagambala sa mga eksperimentong kondisyon o cell-to-cell na pakikipag-ugnayan. gayahin ang motility ng gat, accessibility ng mga independiyenteng apical at basolateral compartments, at muling paglikha ng mga kumplikadong biological microenvironment ng modularity. Samakatuwid, ang aming in vitro 3D morphogenesis protocol ay maaaring magbigay ng isang pantulong na diskarte upang mapagtagumpayan ang mga hamon ng mga umiiral na pamamaraan.
Ang aming protocol ay ganap na nakatuon sa 3D epithelial morphogenesis, na may mga epithelial cell lamang sa kultura at walang iba pang mga uri ng nakapalibot na mga cell tulad ng mga mesenchymal cells, endothelial cells, at immune cells. Gaya ng naunang inilarawan, ang core ng aming protocol ay ang induction ng epithelial morphogenesis sa pamamagitan ng pag-alis ng mga morphogen inhibitors na itinago sa basolateral na bahagi ng ating hybrid-gut at bahaging bahagi ng basolateral na hybrid-gut. -on-a-chip ay nagbibigay-daan sa amin na muling likhain ang undulating 3D epithelial layer, karagdagang biological complexities tulad ng epithelial-mesenchymal interactions33,34, extracellular Matrix (ECM) deposition 35 at, sa aming modelo, ang crypt-villus features na naghahatid ng mga stem cell niches sa basal crypts ay nananatiling isasaalang-alang pa. s at regulasyon ng intestinal morphogenesis sa vivo35,37,38. Ang pagdaragdag ng mga mesenchymal cells sa aming modelo ay nagpahusay sa morphogenetic na proseso at kahusayan sa pag-attach ng cell. Ang endothelial layer (ibig sabihin, mga capillary o lymphatics) ay gumaganap ng isang mahalagang papel sa pag-regulate ng molekular na transportasyon39 at immune cell recruitment40 sa mas maraming mga sangkap na maaaring konektado sa pagitan ng mga microorganism. quisite kapag ang mga modelo ng tissue ay idinisenyo upang magpakita ng mga multi-organ na pakikipag-ugnayan. Samakatuwid, ang mga endothelial cell ay maaaring kailangang isama upang mag-modelo ng mas tumpak na mga tampok na physiological na may resolusyon sa antas ng organ. Ang mga immune cell na nakuha ng pasyente ay mahalaga din para sa pagpapakita ng mga likas na tugon sa immune, pagtatanghal ng antigen, likas na adaptive immune crosstalk, at kaligtasan sa sakit na partikular sa tissue sa konteksto ng mimimi.
Ang paggamit ng hybrid chips ay mas prangka kaysa sa gut-on-a-chip dahil mas simple ang pag-setup ng device at ang paggamit ng Transwell inserts ay nagbibigay-daan para sa scalable culture ng gut epithelium. Gayunpaman, ang mga transwell insert na may polyester membrane na may polyester membrane ay hindi nababanat at hindi maaaring gayahin ang mga paggalaw na parang peristaltic. Higit pa rito, sa hybrid na bahagi ng gilid na bahagi ng Transwell ay nananatiling walang stress na bahagi na may nakalagay sa apical na bahaging bahagi ng estress. . Malinaw, ang mga static na katangian sa apical compartment ay bihirang nagbibigay-daan sa pangmatagalang bacterial co-culture sa hybrid chips. Bagama't maaari nating mabuo ang 3D morphogenesis sa mga pagsingit ng Transwell kapag gumagamit ng hybrid chips, ang kakulangan ng biomechanics na nauugnay sa physiologically at daloy ng apical fluid ay maaaring limitahan ang pagiging posible ng mga hybrid chip platform para sa mga potensyal na aplikasyon.
Hindi pa ganap na naitatag ang mga full-scale na reconstruction ng human crypt-villus axis sa gut-on-a-chip at hybrid-on-a-chip culture. Dahil ang morphogenesis ay nagsisimula sa isang epithelial monolayer, ang 3D microarchitectures ay hindi kinakailangang magbigay ng morphological na pagkakatulad sa mga crypt sa vivo. thelium, ang crypt at villous regions ay hindi malinaw na na-demarcated. Bagama't ang mas mataas na itaas na channel sa chip ay humantong sa pagtaas ng taas ng microengineered epithelium, ang maximum na taas ay limitado pa rin sa ~300–400 µm. ay ~600 µm41.
Mula sa pananaw ng imaging, ang in situ na super-resolution na imaging ng 3D microarchitectures ay maaaring limitado sa bituka sa isang chip, dahil ang kinakailangang working distance mula sa objective lens hanggang sa epithelial layer ay nasa pagkakasunud-sunod ng ilang milimetro. Ang layer-by-layer na microfabrication ng bituka sa isang chip ay nagsasangkot ng permanenteng pagdirikit sa pagitan ng bawat layer, napakahirap na buksan o alisin ang itaas na layer upang suriin ang istraktura sa ibabaw ng epithelial layer. Halimbawa, sa pamamagitan ng paggamit ng scanning electron microscope (SEM).
Ang hydrophobicity ng PDMS ay naging isang limiting factor sa microfluidic-based na mga pag-aaral na tumatalakay sa hydrophobic small molecules, dahil ang PDMS ay maaaring hindi partikular na i-adsorb ang naturang hydrophobic molecules. Ang mga alternatibo sa PDMS ay maaaring isaalang-alang kasama ng iba pang polymeric na materyales. Bilang kahalili, ang pagbabago sa ibabaw ng PDMS (hal. tion ng mga hydrophobic molecule.
Sa wakas, ang aming pamamaraan ay hindi mahusay na nailalarawan sa mga tuntunin ng pagbibigay ng isang high-throughput na screening o "one-size-fits-all" na user-friendly na pang-eksperimentong platform. Ang kasalukuyang protocol ay nangangailangan ng isang syringe pump bawat microdevice, na kumukuha ng espasyo sa isang CO2 incubator at pumipigil sa mga malalaking eksperimento. Ang limitasyong ito ay maaaring makabuluhang mapabuti sa pamamagitan ng scalability ng mga makabagong, 48 well-culture-36 formats (well-well, 8, 2009) pagsingit na nagpapahintulot sa tuluy-tuloy na muling pagdadagdag at pag-alis ng basolateral media).
Para ma-induce ang 3D morphogenesis ng human intestinal epithelium in vitro, gumamit kami ng microfluidic chip intestinal device na naglalaman ng dalawang parallel microchannels at isang elastic porous membrane sa pagitan upang lumikha ng lumen-capillary interface. Ipinapakita rin namin ang paggamit ng single-channel microfluidic device (isang hybrid chip) na nagbibigay ng tuluy-tuloy na basolarized na epithel na platform sa ilalim ng powell na layer na lumalagong platform sa ilalim ng powell na layer ng transogenesis. ng iba't ibang mga selula ng epithelial ng bituka ng tao ay maaaring maipakita sa pamamagitan ng paglalapat ng direksyon na pagmamanipula ng daloy upang alisin ang mga morphogen antagonist mula sa basolateral compartment. Ang buong eksperimentong pamamaraan (Figure 1) ay binubuo ng limang bahagi: (i) microfabrication ng gut chip o Transwell insertable chip (mga hakbang 1-5; Box 1 ng mga selula ng intestinal o intestinal) organo ng intestinal (itestinai) oids;mga kahon 2-5), (iii) kultura ng mga bituka epithelial cell sa bituka chips o hybrid chips (hakbang 6-9), (iv) induction ng 3D morphogenesis sa vitro (hakbang 10) at (v) ) upang makilala ang 3D epithelial microstructure (hakbang 11-24). sa pamamagitan ng paghahambing ng epithelial morphogenesis sa spatial, temporal, conditional, o procedural na mga kontrol.
Gumamit kami ng dalawang magkaibang platform ng kultura: gut-on-a-chip na may mga tuwid na channel o nonlinear convoluted channel, o hybrid chips na naglalaman ng Transwell (TW) inserts sa isang microfluidic device, na gawa tulad ng inilalarawan sa Box 1, at hakbang 1 -5."Device Fabrication" ay nagpapakita ng mga pangunahing hakbang sa paggawa ng isang chip o hybrid chip."Culture of Human Intestinal Cellules" organoids) at pamamaraan ng kultura na ginamit sa protocol na ito."In vitro morphogenesis" ay nagpapakita ng mga pangkalahatang hakbang kung saan ang Caco-2 o organoid-derived epithelial cells ay ni-culture sa bituka chip o sa Transwell inserts ng hybrid chip, na sinusundan ng induction ng 3D morphogenesis at ang pagbuo ng isang characterized na epithelial structure. Ang program step application sa ibaba ng bawat halimbawa ng box number ay maaaring ipakita. ginamit, halimbawa, sa characterization ng cell differentiation, pag-aaral ng gut physiology, pagtatatag ng mga host-microbiome ecosystem, at pagmomodelo ng sakit. Immunofluorescence images sa "Cell Differentiation" na nagpapakita ng nuclei, F-actin at MUC2 na ipinahayag sa 3D Caco-2 epithelial layer na nabuo sa surface na lihim na gutt ng muC2 na mga cell na nabuo sa muC2 na senyales ng muco. Ang mga orescent na larawan sa Gut Physiology ay nagpapakita ng mucus na ginawa sa pamamagitan ng paglamlam para sa sialic acid at N-acetylglucosamine residues gamit ang fluorescent wheat germ agglutinin. Ang dalawang magkasanib na larawan sa "Host-Microbe Co-Cultures" ay nagpapakita ng kinatawan ng host-microbiome co-cultures sa gut sa isang chip. Ang kaliwang panel ay nagpapakita ng co-culture ng Ca.G.co. -2 epithelial cells. Ipinapakita ng kanang panel ang localization ng GFP E. coli na co-cultured na may 3D Caco-2 epithelial cells, na sinusundan ng immunofluorescence staining na may F-actin (pula) at nuclei (asul). PBMC;berde). Ang mga cell ng Caco-2 ay na-culture upang magtatag ng isang 3D epithelial layer. Scale bar, 50 µm. Mga larawan sa ibabang hilera: "Differentiation ng mga cell" na inangkop nang may pahintulot mula sa sanggunian.2.Oxford university press;Na-reproduce nang may pahintulot mula sa Ref.5.NAS;“Host-Microbe Co-Culture” na inangkop nang may pahintulot mula sa ref.3.NAS;"Pagmomodelo ng Sakit" na iniangkop nang may pahintulot mula sa sanggunian.5.NAS.
Ang parehong gut-on-chip at hybrid chips ay ginawa gamit ang PDMS replicas na na-demold mula sa silicon molds sa pamamagitan ng soft lithography1,44 at naka-pattern sa SU-8. Ang disenyo ng microchannels sa bawat chip ay tinutukoy sa pamamagitan ng pagsasaalang-alang sa hydrodynamics tulad ng shear stress at hydrodynamic pressure1,4,12. microchannels, ay nag-evolve sa isang kumplikadong gut-on-a-chip (Extended Data Fig. 1b) na kinabibilangan ng isang pares ng curved microchannels para mahikayat ang Tumaas na fluid residence time, nonlinear flow patterns, at multiaxial deformation ng cultured cells (Fig. 2a–f) 12. Kapag mas kumplikado ang gut-chip, kailangan nating maging kumplikadong gut-chip. ipinakita na ang convoluted Gut-Chip ay malakas ding nag-uudyok ng 3D morphogenesis sa isang katulad na time frame na may katulad na antas ng epithelial growth kumpara sa orihinal na Gut-Chip, anuman ang uri ng kulturang cell. Samakatuwid, upang ma-induce ang 3D morphogenesis, linear at kumplikadong on-chip gut na mga disenyo ay maaaring palitan. Ang mga replika ng PDMS ay na-demolding na may mga pattern ng PDMS na na-cured na may mga negatibong pattern ng SUSG.2a) .Upang i-fabricate ang bituka sa isang chip, ang inihandang itaas na layer ng PDMS ay sunud-sunod na naka-bonding sa isang porous na PDMS film at pagkatapos ay nakahanay sa mas mababang layer ng PDMS sa pamamagitan ng irreversible bonding gamit ang isang corona treater (Fig. 2b–f). at Extended Data Fig. 2). Ang proseso ng pagbubuklod ay isinasagawa sa pamamagitan ng pagtrato sa ibabaw ng PDMS replica at salamin na may oxygen plasma o corona treatment.Pagkatapos ng isterilisasyon ng microfabricated na device na nakakabit sa silicone tube, handa na ang pag-setup ng device para magsagawa ng 3D morphogenesis ng intestinal epithelium (Figure 2g).
a, Ilustrasyon ng eskematiko ng paghahanda ng mga bahagi ng PDMS mula sa SU-8 na may pattern na silicon molds. Ang uncured na PDMS solution ay ibinuhos sa isang silicon mold (kaliwa), cured sa 60 °C (gitna) at demolded (kanan). porous membrane.d, Isang serye ng mga larawan ng upper at lower PDMS component at ang naka-assemble na on-chip intestinal device.e, Schematic of the alignment ng upper, membrane, at lower PDMS components. Bawat layer ay hindi na mababawi ng plasma o corona treatment.f, Schematic of the fabricated gut-on-a-chip device at vated gut-on-a-chip na device na may superim gut- gut na device na may superim- gut na convolug- -a-chip para sa microfluidic cell culture.Ang fabricated gut sa isang chip na binuo gamit ang silicone tube at syringe ay inilagay sa isang coverslip.Ang chip device ay inilagay sa takip ng 150 mm Petri dish para sa pagproseso.Ang binder ay ginagamit upang isara ang silicone tube.h, Visual snapshots ng hybrid chip fabrication at 3D morphogenes gamit ang mga hybrid na chips na inihanda sa mga independiyenteng kultura2DTranslays. ay ipinasok sa hybrid chip upang mahikayat ang 3D morphogenesis ng bituka. Ang medium ay na-perfuse sa pamamagitan ng mga microchannel sa ilalim ng cell layer na itinatag sa Transwell insert. Scale bar, 1 cm.h Na-reprint nang may pahintulot mula sa sanggunian.4.Elsevier.
Sa protocol na ito, ang Caco-2 cell line at intestinal organoids ay ginamit bilang epithelial sources (Fig. 3a). Ang parehong uri ng mga cell ay independiyenteng na-culture (Kahon 2 at Box 5) at ginamit upang i-seed ang ECM-coated microchannels ng on-chip gut o Transwell inserts. Kapag ang mga cell ay confluent (>95% na naka-floored na mga cell, at regular na pumasa sa mga cell na nasa 95% na na-flated na mga cell. 50) sa T-flasks ay inaani upang maghanda ng mga dissociated cell suspension sa pamamagitan ng trypsinization fluid (kahon 2). Ang mga organoid ng bituka ng tao mula sa mga biopsies ng bituka o surgical resection ay na-culture sa Matrigel scaffold domes sa 24-well plates upang suportahan ang structural microenvironment, at Nomorph-well na naglalaman ng microenvironment. at ang mga growth factor na inihanda gaya ng inilarawan sa Kahon 3 ay dinadagdagan bawat ibang araw hanggang ang mga organoid ay lumaki sa ~500 µm ang lapad. Ang mga ganap na lumaki na organoids ay inaani at hinihiwalay sa mga solong selula para sa pagpupuno sa gat o Transwell na pagsingit sa isang chip (Kahon 5). Gaya ng nauna nating iniulat, maaari itong maiiba ayon sa sakit na 12, 13, cancer, o crolitis. donor), lugar ng lesyon (hal., lesion versus non-lesioned area) at gastrointestinal na lokasyon sa tract (hal., duodenum, jejunum, ileum, cecum, colon, o rectum). Nagbibigay kami ng naka-optimize na protocol sa Kahon 5 para sa pag-culture ng mga colonic organoid (coloids) na karaniwang nangangailangan ng mas mataas na konsentrasyon ng morphogenl organoids kaysa sa maliliit na organoids.
a, Workflow para sa induction ng gut morphogenesis sa gut chip.Caco-2 human intestinal epithelium at intestinal organoids ay ginagamit sa protocol na ito upang ipakita ang 3D morphogenesis.Ang mga nakahiwalay na epithelial cells ay na-seed sa inihandang gut-on-a-chip device (chip preparation). Ang daloy ng cal (AP) ay sinisimulan at pinapanatili sa unang 2 araw (daloy, AP, D0-D2). Sinisimulan din ang daloy ng Basolateral (BL) kasama ng mga cyclic stretching motions (stretch, flow, AP at BL) kapag nabuo ang isang kumpletong 2D monolayer. Ang intestinal 3D morphogenesis ay kusang naganap pagkatapos ng 5 araw na pagpapakita ng mga Cmorphomorphic na mga cell ng C,morphophlucogenesis. sa bawat pang-eksperimentong hakbang o time point (bar graph, 100 µm). Apat na schematic diagram na naglalarawan ng kaukulang mga cascades ng gut morphogenesis (kanang itaas). Ang mga dashed arrow sa schematic ay kumakatawan sa direksyon ng daloy ng fluid.b, SEM image na nagpapakita ng topology sa ibabaw ng itinatag na 3D Caco-2 epithelium (sa kaliwang bahagi ng maggeneshed) ay nagpapakita ng in-highlight na lugar sa kaliwa ang magli-generate na kahon. ang 3D Caco-2 layer (kanan).c, Horizontal frontal view ng itinatag na Caco-2 3D, claudin (ZO-1, red) at tuloy-tuloy na brush border membranes na may label na F-actin (berde) at nuclei (asul) Immunofluorescence confocal visualization ng mga epithelial cell sa bituka chips. Ang mga arrow na nakaturo sa direksyon ng plan ng kurso ay nakaturo sa gitnang schematic na lokasyon ng plane ng oras. mga pagbabago sa morphological sa mga organoid na na-culture sa isang chip na nakuha sa pamamagitan ng phase contrast microscopy sa mga araw na 3, 7, 9, 11, at 13. Ipinapakita ng inset (kanan sa itaas) ang mataas na pag-magnify ng ibinigay na imahe.e, DIC photomicrograph ng organoid 3D epithelium na itinatag sa gut sa slice na kinunan noong araw 7.f, Overlaid na mga immunofluers na mga imahe;magenta), mga goblet cell (MUC2; berde), F-actin (grey) at nuclei (cyan) na lumaki sa gut chips sa loob ng 3 araw, ayon sa pagkakabanggit (Kaliwa) at 13-araw (gitna) na mga organoid sa epithelial layer. Tingnan din ang Extended Data Figure 3, na nagha-highlight ng LGR5 na pag-sign ng right signaling (Larawan ng F na structural ng MUC2schelial) nang walang pag-sign ng mga imahe ng MUC3orence ng micro-Epithelial. organoid epithelium na itinatag sa bituka sa isang chip sa pamamagitan ng paglamlam sa plasma membrane ng CellMask dye (kanan) sa ika-13 araw ng kultura. Ang scale bar ay 50 μm maliban kung iba ang sinabi.b Muling na-print nang may pahintulot mula sa sanggunian.2.Oxford university press;c Iniangkop nang may pahintulot mula sa Sanggunian.2.Oxford university press;inangkop ang e at f nang may pahintulot sa pamamagitan ng sanggunian.12 Sa ilalim ng Lisensya ng Creative Commons CC BY 4.0.
Sa gat sa isang chip, kinakailangang baguhin ang hydrophobic surface ng PDMS porous membrane para sa matagumpay na ECM coating. Sa protocol na ito, nag-aaplay kami ng dalawang magkaibang pamamaraan para baguhin ang hydrophobicity ng PDMS membranes. Para sa pag-culture ng Caco-2 cells, ang surface activation sa pamamagitan ng UV/ozone treatment lamang ay sapat na upang bawasan ang hydrophobicity ng PDMS-Hofluc, coating na mga cell, at surface. Ang idic culture ng organoid epithelium ay nangangailangan ng chemical-based surface functionalization upang makamit ang mahusay na deposition ng ECM proteins sa pamamagitan ng sunud-sunod na paglalapat ng polyethyleneimine (PEI) at glutaraldehyde sa PDMS microchannels.Pagkatapos ng pagbabago sa ibabaw, ang mga ECM proteins ay idineposito upang masakop ang functionalized na PDMS surface at pagkatapos ay ipinasok sa epithelium na nakadikit na mga cell ng microfluid.After surface modification. Ang medium lang ang pinapasok sa itaas na microchannel hanggang ang mga cell ay bumuo ng isang kumpletong monolayer, habang ang mas mababang microchannel ay nagpapanatili ng mga static na kondisyon. Ang na-optimize na paraan para sa surface activation at ECM coating ay nagbibigay-daan sa attachment ng organoid epithelium upang mahikayat ang 3D morphogenesis sa ibabaw ng PDMS.
Ang mga kultura ng Transwell ay nangangailangan din ng ECM coating bago ang cell seeding;gayunpaman, ang mga kultura ng Transwell ay hindi nangangailangan ng mga kumplikadong hakbang sa pretreatment upang i-activate ang ibabaw ng mga porous na pagsingit. Para sa lumalaking Caco-2 na mga cell sa mga Transwell insert, ang ECM coating sa mga porous na insert ay nagpapabilis sa pagdikit ng mga dissociated na Caco-2 cells (<1 oras) at tight junction barrier formation (<1-2 araw). nakakabit sa ibabaw ng lamad (<3 h) at pinananatili hanggang ang mga organoid ay bumuo ng isang kumpletong monolayer na may integridad ng hadlang . Ang mga kultura ng Transwell ay ginagawa sa 24-well plates nang hindi gumagamit ng hybrid chips.
Ang in vitro 3D morphogenesis ay maaaring simulan sa pamamagitan ng paglalapat ng daloy ng likido sa basolateral na aspeto ng isang itinatag na epithelial layer. Sa gut sa isang chip, nagsimula ang epithelial morphogenesis kapag ang medium ay na-perfused sa upper at lower microchannels (Fig. 3a). Gaya ng naunang inilarawan, kritikal na ipakilala ang tuluy-tuloy na daloy ng fluid sa inferior. nutrients at serum sa mga cell na nakagapos sa mga porous na lamad at bumubuo ng luminal shear stress, karaniwan naming inilalapat ang dalawahang daloy sa gat sa isang chip. Sa hybrid chips, ang mga pagsingit ng Transwell na naglalaman ng mga epithelial monolayer ay ipinasok sa mga hybrid chips. Pagkatapos, ang medium ay inilapat sa ilalim ng basolateral na bahagi ng porous Transwell insert sa pamamagitan ng microchannel. Ang mga pagsingit ng Transwell na naglalaman ng mga epithelial monolayer ay ipinasok sa mga hybrid chip.
Ang mga morphological feature ng microengineered 3D epithelial layers ay maaaring masuri sa pamamagitan ng paglalapat ng iba't ibang imaging modalities, kabilang ang phase contrast microscopy, differential interference contrast (DIC) microscopy, SEM, o immunofluorescence confocal microscopy (Figures 3 at 4).Phase contrast o DIC na pag-imaging ay madaling maisagawa sa anumang oras ng protrusion ng DIC layer at protrusion na pag-monitor ng epidemya ng DIC. sa optical transparency ng PDMS at polyester films, ang parehong gut-on-a-chip at hybrid chip platform ay makakapagbigay ng real-time in situ imaging nang hindi nangangailangan ng sectioning o disassembly ng device. Kapag nagsasagawa ng immunofluorescence imaging (Mga Figures 1, 3c, f at 4b, c), ang mga cell ay karaniwang sinusundan ng Xton/hyl0, ang mga cell ay sinusundan ng Xton/hyl0% . ) indole, DAPI) o F-actin (hal., fluorescently na may label na phalloidin). Ang fluorescence-based na live imaging ay maaari ding isagawa sa situ upang makita ang produksyon ng mucus (Fig.1, “Cell differentiation” at “Gut physiology”), random na kolonisasyon ng microbial cells (Fig. 1, “Host-microbe co-culture”), ang recruitment ng immune cells (Fig. 1, 'Disease Modeling') o ang mga contour ng 3D epithelial morphology (Fig. 3c, the lower na layer ng micro, at ang hiwalay na layer ng Wcha. nnel layer, tulad ng inilarawan sa ref. Gaya ng ipinapakita sa Fig. 2, ang 3D epithelial morphology pati na rin ang microvilli sa apical brush border ay maaaring makita ng SEM (Fig. 3b). Ang pagpapahayag ng mga differentiation marker ay maaaring masuri sa pamamagitan ng pagsasagawa ng quantitative PCR5 o single-cell RNA sequencing. ization at pagkatapos ay ginagamit para sa molecular o genetic analysis.
a, Workflow para sa induction ng bituka morphogenesis sa isang hybrid chip. Caco-2 at bituka organoids ay ginagamit sa protocol na ito upang ipakita ang 3D morphogenesis sa isang hybrid chip platform. Ang mga dissociated epithelial cell ay seeded sa inihandang Transwell pagsingit (TW prep; tingnan ang figure sa ibaba). Kapag ang mga cell ay seeded (seeded TW) at naka-attach sa ilalim ng mga cell na may polyethylene (seeded) at naka-attach na mga cell sa ilalim ng static na mga kondisyon. Pagkalipas ng 7 araw, ang isang Transwell insert na naglalaman ng 2D monolayer ng mga epithelial cell ay isinama sa isang hybrid chip para ipakilala ang isang basolateral flow (Flow, BL), na sa huli ay humantong sa pagbuo ng isang 3D epithelial layer (morphogenesis).Phase contrast micrographs na nagpapakita ng mga morphological feature ng organ ng tao na epithelial cell na hinango mula sa normal na colon na mga cell ng organ ng tao sa bawat eksperimento na schematic lineor (C10 schematic lineor). s sa itaas na mga layer ay naglalarawan ng eksperimental na configuration para sa bawat hakbang.b, Hybrid chips (kaliwang schematic) ay maaaring humantong sa 3D morphogenesis ng organoid epithelial cells na may top-down confocal microscopy view na kinukuha sa iba't ibang Z na posisyon (itaas, gitna, at ibaba;tingnan ang tamang eskematiko at kaukulang mga tuldok na linya).nagpakita ng mga halatang morphological na katangian.F-actin (cyan), nucleus (grey).c, Fluorescence confocal micrographs (3D angled view) ng organoid-derived epithelial cells na naka-culture sa static na Transwell (TW; inset sa loob ng puting dashed box) kumpara sa hybrid chip (pinakamalaking full shot) na naghahambing ng 2D versus 3D na vertical na morphology, ayon sa pagkakasunod-sunod ng mga cut-right na view ng 3D na crossset sa static na Transwell (TW; inset sa loob ng puting dashed box) kumpara sa hybrid chip (pinakamalaking full shot) Z”) ay nagpapakita rin ng 2D at 3D na mga feature.Scale bar, 100 µm.c Reprinted na may pahintulot mula sa reference.4.Elsevier.
Ang mga kontrol ay maaaring ihanda sa pamamagitan ng pag-culture ng parehong mga cell (Caco-2 o intestinal organoid epithelial cells) sa dalawang-dimensional na monolayer sa ilalim ng conventional static culture conditions.
Ang proseso ng malambot na lithography ay dapat gawin sa isang malinis na silid. Para sa bawat layer sa chip (itaas at ibabang mga layer at lamad) at hybrid chips, iba't ibang mga photomask ang ginamit at ginawa sa magkahiwalay na mga wafer ng silicon dahil ang taas ng mga microchannel ay magkaiba. Ang mga target na taas ng upper at lower microchannels ng gut sa chip ay 500 µm .0µm, at 2. µm.
Maglagay ng 3-pulgadang silicon na wafer sa isang dish na may acetone. Dahan-dahang paikutin ang plato sa loob ng 30 segundo, pagkatapos ay tuyo sa hangin ang wafer. Ilipat ang wafer sa isang plato na may IPA, pagkatapos ay paikutin ang plato nang 30 s upang linisin.
Ang solusyon ng piranha (pinaghalong hydrogen peroxide at concentrated sulfuric acid, 1:3 (vol/vol)) ay maaaring opsyonal na gamitin upang i-maximize ang pag-alis ng mga organikong residue mula sa ibabaw ng silicon wafer.
Ang solusyon ng Piranha ay lubhang kinakaing unti-unti at nagdudulot ng init. Kinakailangan ang mga karagdagang pag-iingat sa kaligtasan. Para sa pagtatapon ng basura, hayaang lumamig ang solusyon at ilipat sa isang malinis at tuyo na lalagyan ng basura. Gumamit ng mga pangalawang lalagyan at wastong lagyan ng label ang mga lalagyan ng basura. Mangyaring sundin ang mga alituntunin sa kaligtasan ng pasilidad para sa mas detalyadong mga pamamaraan.
I-dehydrate ang mga wafer sa pamamagitan ng paglalagay sa kanila sa isang 200 °C na mainit na plato sa loob ng 10 min. Pagkatapos ma-dehydrate, ang wafer ay inalog ng limang beses sa hangin upang lumamig.
Ibuhos ang ~10 g ng photoresist SU-8 2100 sa gitna ng nilinis na silicon na wafer.Gumamit ng mga sipit para pantay-pantay na ikalat ang photoresist sa wafer. Paminsan-minsan ay ilagay ang wafer sa isang 65°C na hot plate upang hindi gaanong malagkit at madaling kumalat ang photoresist. Huwag ilagay ang wafer nang direkta sa hot plate.
Ang SU-8 ay pantay na ibinahagi sa wafer sa pamamagitan ng pagpapatakbo ng spin coating. I-program ang isang papasok na pag-ikot ng SU-8 sa loob ng 5–10 s upang magpalaganap sa 500 rpm sa isang acceleration na 100 rpm/s. Itakda ang main spin para sa 200 µm thickness patterning sa 1,500 rpm µm 50 (makamit ang kapal ng isang µmµm 50 m, o mak ang itaas na layer ng bituka sa chip; tingnan ang "Mga kritikal na hakbang" sa ibaba) na nakatakda sa acceleration na 300 rpm/s 30 segundo sa 1,200 rpm.
Ang pangunahing bilis ng pag-ikot ay maaaring iakma ayon sa target na kapal ng SU-8 pattern sa silicon wafer.
Upang gumawa ng mga pattern ng SU-8 na may taas na 500 µm para sa itaas na layer ng bituka sa chip, ang spin coating at soft bake steps ng Kahong ito (mga hakbang 7 at 8) ay sunud-sunod na inulit (tingnan ang hakbang 9) upang makabuo ng dalawang layer na 250 µm Isang makapal na layer ng SU-8, na maaaring i-layer at dugtungan ng 10 µm na layer ng UV na ito, na mataas ang exposure box na ito.
Soft bake ang SU-8 coated wafers sa pamamagitan ng maingat na paglalagay ng mga wafer sa isang hot plate sa 65 °C sa loob ng 5 min, pagkatapos ay ilipat ang setting sa 95 °C at i-incubate para sa karagdagang 40 min.
Upang makamit ang 500 μm na taas ng SU-8 pattern sa itaas na microchannel, ulitin ang mga hakbang 7 at 8 upang makabuo ng dalawang 250 μm na kapal ng SU-8 na layer.
Gamit ang UV Mask Aligner, magsagawa ng lamp test ayon sa mga tagubilin ng tagagawa para kalkulahin ang oras ng pagkakalantad ng wafer.(tagal ng pagkakalantad, ms) = (dosis ng pagkakalantad, mJ/cm2)/(lakas ng lampara, mW/cm2).
Pagkatapos matukoy ang oras ng pagkakalantad, ilagay ang photomask sa mask holder ng UV mask aligner at ilagay ang photomask sa SU-8 coated wafer.
Ilagay ang naka-print na ibabaw ng photomask nang direkta sa SU-8 na pinahiran na gilid ng silicon wafer upang mabawasan ang UV ​​dispersion.
Ilantad ang SU-8 coated wafer at photomask nang patayo sa 260 mJ/cm2 ng UV light para sa paunang natukoy na oras ng pagkakalantad (tingnan ang hakbang 10 ng kahon na ito).
Pagkatapos ng UV exposure, ang SU-8-coated na silicon wafers ay inihurnong sa 65°C sa loob ng 5 min at 95°C sa loob ng 15 min sa bawat hot plate upang makagawa ng mga pattern na may taas na 200 μm. Patagalin ang post-bake time sa 95 °C hanggang 30 min upang makagawa ng mga pattern na may taas na 500 μm.
Ang developer ay ibinubuhos sa isang glass dish, at ang baked wafer ay inilalagay sa dish.Ang volume ng SU-8 developer ay maaaring mag-iba depende sa laki ng glass plate.Siguraduhing gumamit ng sapat na SU-8 developer upang ganap na maalis ang hindi nakalantad na SU-8.Halimbawa, kapag gumagamit ng 150 mm diameter na glass dish na may kapasidad na 1 L, gumamit ng ~300 mL ng 5 minutong rotation na may pag-develop.
Banlawan ang nabuong amag na may ~10 mL ng sariwang developer na sinusundan ng IPA sa pamamagitan ng pag-spray ng solusyon gamit ang pipette.
Ilagay ang wafer sa isang plasma cleaner at ilantad sa oxygen plasma (atmospheric gas, target pressure 1 × 10−5 Torr, power 125 W) sa loob ng 1.5 min.
Ilagay ang wafer sa vacuum desiccator na may glass slide sa loob. Ang mga wafer at slide ay maaaring ilagay nang magkatabi. Kung ang vacuum desiccator ay nahahati sa ilang layer sa pamamagitan ng isang plato, ilagay ang mga slide sa lower chamber at ang mga wafer sa upper chamber. Maghulog ng 100 μL ng trichloro(1H, 1H, 2H, 2H, 2H) at slide solution sa glass solution. isasyon.
I-thaw ang vial ng frozen Caco-2 cells sa 37°C water bath, pagkatapos ay ilipat ang mga natunaw na cell sa T75 flask na naglalaman ng 15 mL ng 37°C na prewarmed Caco-2 medium.
Upang maipasa ang mga Caco-2 cells sa ~90% na pagkakatagpo, unang mainit na Caco-2 medium, PBS, at 0.25% trypsin/1 mM EDTA sa isang 37°C na paliguan ng tubig.
I-aspirate ang medium sa pamamagitan ng vacuum aspiration. Hugasan ang mga cell nang dalawang beses gamit ang 5 mL ng mainit na PBS sa pamamagitan ng pag-uulit ng vacuum aspiration at pagdaragdag ng sariwang PBS.