Salamat sa pagbisita sa Nature.com.Gumagamit ka ng bersyon ng browser na may limitadong suporta sa CSS.Para sa pinakamagandang karanasan, inirerekomenda namin na gumamit ka ng na-update na browser (o huwag paganahin ang Compatibility Mode sa Internet Explorer).Bilang karagdagan, upang matiyak ang patuloy na suporta, ipinapakita namin ang site na walang mga istilo at JavaScript.
Nagpapakita ng carousel ng tatlong slide nang sabay-sabay.Gamitin ang Nakaraang at Susunod na mga pindutan upang lumipat sa tatlong mga slide sa isang pagkakataon, o gamitin ang mga pindutan ng slider sa dulo upang lumipat sa tatlong mga slide sa isang pagkakataon.
Pinipigilan ng blood-brain barrier at blood-brain barrier ang mga biotherapeutic agent na maabot ang kanilang mga target sa central nervous system, at sa gayon ay humahadlang sa epektibong paggamot sa mga sakit na neurological.Para tumuklas ng mga novel brain transporter sa vivo, ipinakilala namin ang isang T7 phage peptide library at serially collected blood at cerebrospinal fluid (CSF) gamit ang cannulated conscious large pool model ng mga daga.Ang mga partikular na phage clone ay lubos na pinayaman sa CSF pagkatapos ng apat na round ng pagpili.Ang pagsubok ng mga indibidwal na kandidato na peptides ay nagsiwalat ng higit sa 1000-tiklop na pagpapayaman sa CSF.Ang bioactivity ng paghahatid ng peptide-mediated sa utak ay nakumpirma ng isang 40% na pagbawas sa antas ng amyloid-β sa cerebrospinal fluid gamit ang isang BACE1 peptide inhibitor na naka-link sa natukoy na nobelang transit peptide.Iminumungkahi ng mga resultang ito na ang mga peptide na kinilala ng mga pamamaraan sa pagpili ng vivo phage ay maaaring maging kapaki-pakinabang na mga sasakyan para sa systemic na paghahatid ng mga macromolecule sa utak na may therapeutic effect.
Ang pananaliksik sa therapy na naka-target sa central nervous system (CNS) ay higit na nakatuon sa pagtukoy ng mga na-optimize na gamot at ahente na nagpapakita ng mga katangian ng CNS-targeting, na may kaunting pagsisikap sa pagtuklas ng mga mekanismo na nagtutulak ng aktibong paghahatid ng gamot sa utak.Nagsisimula na itong magbago dahil ang paghahatid ng gamot, lalo na ang malalaking molekula, ay isang mahalagang bahagi ng modernong neuroscience na pag-unlad ng gamot.Ang kapaligiran ng gitnang sistema ng nerbiyos ay mahusay na protektado ng cerebrovascular barrier system, na binubuo ng blood-brain barrier (BBB) ​​​​at ang blood-brain barrier (BCBB)1, na ginagawang mahirap maghatid ng mga gamot sa utak1,2.Tinatayang halos lahat ng malalaking molekula na gamot at higit sa 98% ng maliliit na molekula na gamot ay inalis mula sa utak3.Iyon ang dahilan kung bakit napakahalaga na makilala ang mga bagong sistema ng transportasyon ng utak na nagbibigay ng mahusay at tiyak na paghahatid ng mga therapeutic na gamot sa CNS 4,5.Gayunpaman, ang BBB at BCSFB ay nagpapakita rin ng isang mahusay na pagkakataon para sa paghahatid ng gamot habang sila ay tumagos at pumapasok sa lahat ng mga istruktura ng utak sa pamamagitan ng malawak na vasculature nito.Kaya, ang kasalukuyang mga pagsisikap na gumamit ng mga di-nagsasalakay na paraan ng paghahatid sa utak ay higit sa lahat batay sa mekanismo ng receptor-mediated transport (PMT) gamit ang endogenous BBB6 receptor.Sa kabila ng kamakailang mga pangunahing pagsulong gamit ang transferrin receptor pathway7,8, kinakailangan ang karagdagang pag-unlad ng mga bagong sistema ng paghahatid na may pinabuting mga katangian.Sa layuning ito, ang aming layunin ay kilalanin ang mga peptide na may kakayahang mamagitan sa transportasyon ng CSF, dahil maaari silang sa prinsipyo ay magamit upang maghatid ng mga macromolecule sa CNS o upang magbukas ng mga bagong receptor pathway.Sa partikular, ang mga partikular na receptor at transporter ng cerebrovascular system (BBB at BSCFB) ay maaaring magsilbi bilang mga potensyal na target para sa aktibo at tiyak na paghahatid ng mga biotherapeutic na gamot.Ang cerebrospinal fluid (CSF) ay isang secretory product ng choroid plexus (CS) at direktang nakikipag-ugnayan sa interstitial fluid ng utak sa pamamagitan ng subarachnoid space at ventricular space4.Kamakailan lamang ay ipinakita na ang subarachnoid cerebrospinal fluid ay labis na nagkakalat sa interstitium ng utak9.Umaasa kaming ma-access ang parenchymal space gamit ang subarachnoid inflow tract na ito o direkta sa pamamagitan ng BBB.Upang makamit ito, nagpatupad kami ng isang matatag na diskarte sa pagpili ng vivo phage na perpektong kinikilala ang mga peptide na dinadala ng alinman sa dalawang natatanging mga landas na ito.
Inilalarawan namin ngayon ang isang sequential sa vivo phage display screening method na may CSF sampling na kasama ng high throughput sequencing (HTS) upang masubaybayan ang mga paunang round ng pagpili na may pinakamataas na pagkakaiba-iba ng library.Ang screening ay isinagawa sa mga may malay na daga na may permanenteng nakatanim na malaking cisterna (CM) cannula upang maiwasan ang kontaminasyon ng dugo.Mahalaga, pinipili ng diskarteng ito ang parehong pag-target sa utak at mga peptide na may aktibidad sa transportasyon sa buong cerebrovascular barrier.Gumamit kami ng T7 phages dahil sa kanilang maliit na sukat (~ 60 nm) 10 at iminungkahi na ang mga ito ay angkop para sa transportasyon ng mga vesicle na nagpapahintulot sa transcellular crossing ng endothelial at/o epithelial-medulla barrier.Pagkatapos ng apat na round ng panning, ang mga populasyon ng phage ay nahiwalay na nagpapakita ng malakas sa vivo CSF ​​​​enrichment at cerebral microvessel association.Mahalaga, nakumpirma namin ang aming mga natuklasan sa pamamagitan ng pagpapakita na ang ginustong at chemically synthesized na pinakamahusay na mga peptide ng kandidato ay nakapagdala ng kargamento ng protina sa cerebrospinal fluid.Una, ang mga pharmacodynamic effect ng CNS ay itinatag sa pamamagitan ng pagsasama ng isang nangungunang transit peptide na may isang inhibitor ng BACE1 peptide.Bilang karagdagan sa pagpapakita na sa vivo functional na mga diskarte sa screening ay maaaring makilala ang nobelang utak transport peptides bilang epektibong mga carrier ng kargamento ng protina, inaasahan namin na ang mga katulad na diskarte sa pagpili ng pagganap ay magiging mahalaga din sa pagtukoy ng mga nobelang mga landas ng transportasyon ng utak.
Batay sa mga unit na bumubuo ng plaka (PFU), pagkatapos ng hakbang sa pag-package ng phage, isang library ng random na 12-mer linear T7 phage peptides na may pagkakaiba-iba na humigit-kumulang 109 ay idinisenyo at nilikha (tingnan ang Mga Materyales at Paraan).Mahalagang tandaan na maingat naming sinuri ang library na ito bago sa vivo panning.Ang PCR amplification ng mga sample ng phage library gamit ang mga binagong primer ay nakabuo ng mga amplicon na direktang naaangkop sa HTS (Karagdagang Fig. 1a).Dahil sa a) mga error sa pagkakasunud-sunod ng HTS11, b) epekto sa kalidad ng mga primer (NNK)1-12, at c) ang pagkakaroon ng wild-type (wt) phage (skeleton inserts) sa standby library, ipinatupad ang isang sequence filtering procedure upang kunin lamang ang na-verify na impormasyon ng sequence (Karagdagang Fig. 1b).Ang mga hakbang sa pag-filter na ito ay nalalapat sa lahat ng HTS sequencing library.Para sa karaniwang silid-aklatan, isang kabuuang 233,868 na pagbabasa ang nakuha, kung saan 39% ang pumasa sa pamantayan ng filter at ginamit para sa pagsusuri at pagpili ng library para sa mga kasunod na pag-ikot (Karagdagang Larawan 1c-e).Ang mga nabasa ay higit sa lahat na multiple ng 3 base pairs ang haba na may peak sa 36 nucleotides (Karagdagang Fig. 1c), na nagpapatunay sa disenyo ng library (NNK) 1-12.Kapansin-pansin, humigit-kumulang 11% ng mga miyembro ng library ang naglalaman ng 12-dimensional wild-type (wt) backbone na PAGISRELVDKL insert, at halos kalahati ng mga sequence (49%) ay naglalaman ng mga insertion o pagtanggal.Kinumpirma ng HTS ng library library ang mataas na pagkakaiba-iba ng mga peptide sa library: higit sa 81% ng mga sequence ng peptide ay isang beses lamang natagpuan at 1.5% lamang ang naganap sa ≥4 na kopya (Karagdagang Fig. 2a).Ang mga frequency ng amino acids (aa) sa lahat ng 12 na posisyon sa repertoire ay mahusay na nakakaugnay sa mga frequency na inaasahan para sa bilang ng mga codon na nabuo ng degenerate NKK repertoire (Karagdagang Fig. 2b).Ang naobserbahang dalas ng mga nalalabi ng aa na naka-encode ng mga pagsingit na ito ay mahusay na nakakaugnay sa kinakalkula na dalas (r = 0.893) (Karagdagang Fig. 2c).Ang paghahanda ng mga aklatan ng phage para sa iniksyon ay kinabibilangan ng mga hakbang ng pagpapalakas at pagtanggal ng endotoxin.Ito ay dati nang ipinakita na potensyal na mabawasan ang pagkakaiba-iba ng mga aklatan ng phage12,13.Samakatuwid, inayos namin ang isang plate-amplified phage library na sumailalim sa pag-alis ng endotoxin at inihambing ito sa orihinal na aklatan upang matantya ang dalas ng AA.Ang isang malakas na ugnayan (r = 0.995) ay na-obserbahan sa pagitan ng orihinal na pool at ang amplified at purified pool (Karagdagang Fig. 2d), na nagpapahiwatig na ang kumpetisyon sa pagitan ng mga clone na pinalaki sa mga plato gamit ang T7 phage ay hindi naging sanhi ng malaking bias.Ang paghahambing na ito ay batay sa dalas ng mga tripeptide motif sa bawat aklatan, dahil ang pagkakaiba-iba ng mga aklatan (~109) ay hindi maaaring ganap na makuha kahit na may HTS.Ang pagsusuri ng dalas ng aa sa bawat posisyon ay nagsiwalat ng isang maliit na bias na umaasa sa posisyon sa huling tatlong posisyon ng ipinasok na repertoire (Karagdagang Fig. 2e).Sa konklusyon, napagpasyahan namin na ang kalidad at pagkakaiba-iba ng silid-aklatan ay katanggap-tanggap at ang mga maliliit na pagbabago lamang sa pagkakaiba-iba ay naobserbahan dahil sa pagpapalakas at paghahanda ng mga aklatan ng phage sa pagitan ng ilang mga pag-ikot ng pagpili.
Ang serial cerebrospinal fluid sampling ay maaaring isagawa sa pamamagitan ng surgically implanting ng cannula sa CM ng mga conscious na daga upang mapadali ang pagkilala sa T7 phage na na-inject sa intravenously (iv) sa pamamagitan ng BBB at/o BCSFB (Fig. 1a-b).Gumamit kami ng dalawang independiyenteng mga armas sa pagpili (mga armas A at B) sa unang tatlong pag-ikot ng pagpili sa vivo (Larawan 1c).Unti-unti naming nadagdagan ang stringency ng pagpili sa pamamagitan ng pagbabawas ng kabuuang halaga ng phage na ipinakilala sa unang tatlong round ng pagpili.Para sa ika-apat na round ng panning, pinagsama namin ang mga sample mula sa mga branch A at B at nagsagawa ng tatlong karagdagang independiyenteng mga seleksyon.Upang pag-aralan ang mga katangian ng vivo ng mga particle ng T7 phage sa modelong ito, ang wild-type na phage (PAGISRELVDKL master insert) ay na-injected sa mga daga sa pamamagitan ng tail vein.Ang pagbawi ng mga phage mula sa cerebrospinal fluid at dugo sa iba't ibang mga punto ng oras ay nagpakita na ang medyo maliit na T7 icosahedral phages ay may mabilis na paunang clearance phase mula sa kompartimento ng dugo (Karagdagang Fig. 3).Batay sa mga titer na ibinibigay at ang dami ng dugo ng mga daga, kinakalkula namin na humigit-kumulang 1% wt lamang.Ang phage mula sa ibinibigay na dosis ay nakita sa dugo 10 minuto pagkatapos ng intravenous injection.Pagkatapos ng paunang mabilis na pagbaba na ito, ang isang mas mabagal na pangunahing clearance ay nasusukat na may kalahating buhay na 27.7 minuto.Mahalaga, kakaunti lamang ang mga phage na nakuha mula sa kompartamento ng CSF, na nagpapahiwatig ng mababang background para sa paglilipat ng wild-type na phage sa kompartamento ng CSF (Karagdagang Fig. 3).Sa karaniwan, halos 1 x 10-3% titers lamang ng T7 phage sa dugo at 4 x 10-8% ng mga unang na-infuse na phage ang nakita sa cerebrospinal fluid sa buong panahon ng sampling (0-250 min).Kapansin-pansin, ang kalahating buhay (25.7 min) ng wild-type na phage sa cerebrospinal fluid ay katulad ng naobserbahan sa dugo.Ang mga datos na ito ay nagpapakita na ang hadlang na naghihiwalay sa CSF compartment mula sa dugo ay buo sa CM-cannulated rats, na nagpapahintulot sa in vivo na pagpili ng mga phage library na makilala ang mga clone na madaling dinadala mula sa dugo papunta sa CSF compartment.
(a) Pag-set up ng paraan para sa muling pag-sampling ng cerebrospinal fluid (CSF) mula sa isang malaking pool.(b) Diagram na nagpapakita ng cellular na lokasyon ng central nervous system (CNS) barrier at ang diskarte sa pagpili na ginamit upang matukoy ang mga peptide na tumatawid sa blood-brain barrier (BBB) ​​​​at ang blood-brain barrier.(c) In vivo phage display screening flowchart.Sa bawat pag-ikot ng pagpili, ang mga phage (mga identifier ng hayop sa loob ng mga arrow) ay na-injected sa intravenously.Dalawang independiyenteng alternatibong sangay (A, B) ang pinananatiling hiwalay hanggang sa ika-4 na round ng pagpili.Para sa mga round ng pagpili 3 at 4, ang bawat clone ng phage na nakuha mula sa CSF ay manu-manong na-sequence.(d) Kinetics ng phage na nakahiwalay sa dugo (pulang bilog) at cerebrospinal fluid (berdeng tatsulok) sa unang round ng pagpili sa dalawang cannulated na daga pagkatapos ng intravenous injection ng T7 peptide library (2 x 1012 phages/hayop).Ang mga asul na parisukat ay nagpapahiwatig ng average na paunang konsentrasyon ng phage sa dugo, na kinakalkula mula sa dami ng na-injected na phage, na isinasaalang-alang ang kabuuang dami ng dugo.Ang mga itim na parisukat ay nagpapahiwatig ng punto ng intersection ng y line na na-extrapolated mula sa mga konsentrasyon ng phage ng dugo.(e, f) Ipakita ang kamag-anak na dalas at pamamahagi ng lahat ng posibleng magkakapatong na mga motif ng tripeptide na matatagpuan sa peptide.Ang bilang ng mga motif na makikita sa 1000 pagbabasa ay ipinapakita.Makabuluhang (p <0.001) ang mga enriched motif ay minarkahan ng mga pulang tuldok.(e) Correlation scatterplot na naghahambing ng relatibong dalas ng tripeptide motif ng injected library na may blood-derived phage mula sa mga hayop #1.1 at #1.2.(f) Correlation scatterplot na naghahambing sa mga kamag-anak na frequency ng animal phage tripeptide motifs #1.1 at #1.2 na nakahiwalay sa dugo at cerebrospinal fluid.(g, h) Sequence ID representasyon ng phage enriched sa dugo (g) versus injected library at phage enriched sa CSF (h) versus blood pagkatapos ng isang round ng in vivo selection sa parehong hayop.Ang laki ng isang letrang code ay nagpapahiwatig kung gaano kadalas nangyayari ang amino acid na iyon sa posisyong iyon.Berde = polar, lila = neutral, asul = basic, pula = acidic at itim = hydrophobic amino acids.Ang Figure 1a, b ay dinisenyo at ginawa ni Eduard Urich.
Nag-inject kami ng isang phage peptide library sa dalawang CM instrument rats (clades A at B) at nakahiwalay na phage mula sa cerebrospinal fluid at dugo (Larawan 1d).Ang paunang mabilis na clearance ng library ay hindi gaanong binibigkas kumpara sa wild-type phage.Ang ibig sabihin ng kalahating buhay ng injected library sa parehong mga hayop ay 24.8 minuto sa dugo, katulad ng wild-type phage, at 38.5 minuto sa CSF.Ang mga sample ng dugo at cerebrospinal fluid phage mula sa bawat hayop ay sumailalim sa HTS at lahat ng natukoy na peptides ay nasuri para sa pagkakaroon ng isang maikling tripeptide motif.Napili ang mga motif ng tripeptide dahil nagbibigay sila ng kaunting batayan para sa pagbuo ng istraktura at pakikipag-ugnayan ng peptide-protein14, 15.Natagpuan namin ang isang magandang ugnayan sa pamamahagi ng mga motif sa pagitan ng injected phage library at mga clone na nakuha mula sa dugo ng parehong mga hayop (Fig. 1e).Ang data ay nagpapahiwatig na ang komposisyon ng aklatan ay bahagyang pinayaman sa kompartimento ng dugo.Ang mga dalas ng amino acid at mga pagkakasunud-sunod ng pinagkasunduan ay higit pang nasuri sa bawat posisyon gamit ang isang adaptasyon ng Weblogo16 software.Kapansin-pansin, natagpuan namin ang isang malakas na pagpapayaman sa mga residu ng glycine ng dugo (Fig. 1g).Kapag ang dugo ay inihambing sa mga clone na pinili mula sa CSF, ang malakas na pagpili at ilang pagtanggal ng mga motif ay naobserbahan (Larawan 1f), at ang ilang mga amino acid ay mas gusto na naroroon sa mga paunang natukoy na posisyon sa 12-miyembro (Larawan 1h).Kapansin-pansin, ang mga indibidwal na hayop ay naiiba nang malaki sa cerebrospinal fluid, samantalang ang pagpapayaman ng glycine ng dugo ay naobserbahan sa parehong mga hayop (Karagdagang Fig. 4a-j).Matapos ang mahigpit na pag-filter ng data ng pagkakasunud-sunod sa cerebrospinal fluid ng mga hayop #1.1 at #1.2, isang kabuuang 964 at 420 natatanging 12-mer peptides ang nakuha (Karagdagang Fig. 1d–e).Ang mga nakahiwalay na phage clone ay pinalaki at sumailalim sa pangalawang pag-ikot ng pagpili sa vivo.Ang Phage na nakuha mula sa ikalawang round ng pagpili ay sumailalim sa HTS sa bawat hayop at lahat ng natukoy na peptides ay ginamit bilang input sa isang programa sa pagkilala sa motif upang pag-aralan ang paglitaw ng mga tripeptide motif (Larawan 2a, b, ef).Kung ikukumpara sa unang cycle ng phage na nakuhang muli mula sa CSF, napansin namin ang karagdagang pagpili at pagtanggal ng maraming motif sa CSF sa mga sanga A at B (Larawan 2).Isang network identification algorithm ang inilapat upang matukoy kung ang mga ito ay kumakatawan sa iba't ibang mga pattern ng pare-parehong pagkakasunud-sunod.Ang isang malinaw na pagkakapareho ay naobserbahan sa pagitan ng 12-dimensional na pagkakasunud-sunod na nakuhang muli ng CSF sa alternatibong clade A (Larawan 2c, d) at clade B (Larawan 2g, h).Ang pinagsama-samang pagsusuri sa bawat sangay ay nagsiwalat ng iba't ibang mga profile ng pagpili para sa 12-mer peptides (Karagdagang Fig. 5c, d) at isang pagtaas sa ratio ng CSF/blood titer sa paglipas ng panahon para sa mga pooled clone pagkatapos ng ikalawang round ng pagpili kumpara sa unang round ng pagpili (Karagdagang Fig. 5e).).
Pagpapayaman ng mga motif at peptides sa cerebrospinal fluid sa pamamagitan ng dalawang sunud-sunod na round ng in vivo functional phage display selection.
Ang lahat ng cerebrospinal fluid phage na nakuhang muli mula sa unang pag-ikot ng bawat hayop (hayop #1.1 at #1.2) ay pinagsama-sama, pinalakas, HT-sequenced at muling na-inject nang sama-sama (2 x 1010 phages/hayop) 2 SM cannulated rats (#1.1 → #).2.1 at 2.2, 1.2 → 2.3 at 2.4).( a, b, e, f ) Mga scatterplot ng ugnayan na naghahambing sa kamag-anak na dalas ng mga tripeptide motif ng lahat ng mga phage na nagmula sa CSF sa una at pangalawang round ng pagpili.Kamag-anak na dalas at pamamahagi ng mga motif na kumakatawan sa lahat ng posibleng magkakapatong na mga tripeptide na matatagpuan sa mga peptide sa parehong oryentasyon.Ang bilang ng mga motif na makikita sa 1000 pagbabasa ay ipinapakita.Ang mga motif na makabuluhang napili o ibinukod (p <0.001) sa isa sa mga inihambing na aklatan ay na-highlight ng mga pulang tuldok.(c, d, g, h) Sequence logo representation ng lahat ng CSF-rich 12 amino acid long sequence batay sa rounds 2 at 1 ng in vivo selection.Ang laki ng isang letrang code ay nagpapahiwatig kung gaano kadalas nangyayari ang amino acid na iyon sa posisyong iyon.Upang kumatawan sa logo, ang dalas ng mga sequence ng CSF na nakuha mula sa mga indibidwal na hayop sa pagitan ng dalawang round ng pagpili ay inihambing at ang mga enriched sequence sa ikalawang round ay ipinapakita: (c) #1.1–#2.1 (d) #1.1–#2.2 (g) #1.2–#2.3 at (h) #1.2–#2.4.Ang pinaka-pinayaman na amino acid sa isang naibigay na posisyon sa (c, d) mga hayop blg.2.1 at hindi.2.2 o (g, h) sa mga hayop blg.2.3 at hindi.2.4 ay ipinapakita sa kulay.Berde = polar, lila = neutral, asul = basic, pula = acidic at itim = hydrophobic amino acids.
Matapos ang ikatlong pag-ikot ng pagpili, nakilala namin ang 124 na natatanging pagkakasunud-sunod ng peptide (#3.1 at #3.2) mula sa 332 CSF-reconstituted phage clones na nakahiwalay sa dalawang hayop (Karagdagang Fig. 6a).Ang pagkakasunud-sunod na LGSVS (18.7%) ay may pinakamataas na kamag-anak na proporsyon, na sinusundan ng mga wild-type na pagsingit na PAGISRELVDKL (8.2%), MRWFFSHASQGR (3%), DVAKVS (3%), TWLFSLG (2.2%), at SARGSWREIVSLS (2.2%).Sa huling ikaapat na round, pinagsama namin ang dalawang independiyenteng piniling mga sanga mula sa tatlong magkakahiwalay na hayop (Larawan 1c).Sa 925 sequenced phage clone na nakuhang muli mula sa CSF, sa ika-apat na round nakita namin ang 64 na natatanging peptide sequence (Karagdagang Fig. 6b), kung saan ang kamag-anak na proporsyon ng wild-type na phage ay bumaba sa 0.8%.Ang pinakakaraniwang mga clone ng CSF sa ika-apat na round ay ang LYVLHSRGLWGFKLAAALE (18%), LGSVS (17%), GFVRFRLSNTR (14%), KVAWRVFSLFWK (7%), SVHGV (5%), GRPQKINGARVC (3.6%) at RLSSVDSDLSGC (3, 2%).%)).Ang haba ng hanay ng mga napiling peptide ay dahil sa mga pagpasok/pagtanggal ng nucleotide o premature stop codon sa mga primer ng library kapag gumagamit ng mga degenerate na codon para sa disenyo ng library ng NNK.Ang mga premature stop codon ay bumubuo ng mas maiikling peptide at pinili dahil naglalaman ang mga ito ng paborableng motif na aa.Maaaring magresulta ang mas mahahabang peptide mula sa mga pagpapasok/pagtanggal sa mga panimulang aklat ng mga sintetikong aklatan.Ipinoposisyon nito ang idinisenyong stop codon sa labas ng frame at binabasa ito hanggang sa lumitaw ang isang bagong stop codon sa ibaba ng agos.Sa pangkalahatan, kinakalkula namin ang mga kadahilanan ng pagpapayaman para sa lahat ng apat na round ng pagpili sa pamamagitan ng paghahambing ng data ng input sa data ng sample na output.Para sa unang round ng screening, gumamit kami ng wild-type na phage titers bilang isang hindi partikular na sanggunian sa background.Kapansin-pansin, ang pagpili ng negatibong phage ay napakalakas sa unang CSF cycle, ngunit hindi sa dugo (Larawan 3a), na maaaring dahil sa mababang posibilidad ng passive diffusion ng karamihan sa mga miyembro ng peptide library sa kompartamento ng CSF o mga kamag-anak na phage ay may posibilidad na mas mahusay na mapanatili o maalis mula sa daloy ng dugo kaysa sa mga bacteriophage.Gayunpaman, sa ikalawang pag-ikot ng pag-pan, ang malakas na pagpili ng mga phage sa CSF ay naobserbahan sa parehong mga clades, na nagmumungkahi na ang nakaraang pag-ikot ay pinayaman sa mga phage na nagpapakita ng mga peptide na nagsusulong ng CSF uptake (Fig. 3a).Muli, nang walang makabuluhang pagpapayaman ng dugo.Gayundin sa ikatlo at ikaapat na pag-ikot, ang mga phage clone ay makabuluhang pinayaman sa CSF.Ang paghahambing ng kamag-anak na dalas ng bawat natatanging pagkakasunud-sunod ng peptide sa pagitan ng huling dalawang pag-ikot ng pagpili, nalaman namin na ang mga pagkakasunud-sunod ay mas pinayaman sa ika-apat na pag-ikot ng pagpili (Fig. 3b).Isang kabuuan ng 931 tripeptide motifs ang nakuha mula sa lahat ng 64 na natatanging peptide sequence gamit ang parehong peptide orientation.Ang pinaka-pinayaman na mga motif sa ika-apat na round ay mas malapit na sinuri para sa kanilang mga enrichment profile sa lahat ng round kumpara sa injected library (cut-off: 10% enrichment) (Karagdagang Fig. 6c).Ang mga pangkalahatang pattern ng pagpili ay nagpakita na ang karamihan sa mga pinag-aralan na motibo ay pinayaman sa lahat ng nakaraang round ng parehong mga sangay ng pagpili.Gayunpaman, ang ilang mga motif (hal. SGL, VSG, LGS GSV) ay nakararami mula sa alternatibong clade A, habang ang iba (hal. FGW, RTN, WGF, NTR) ay pinayaman sa alternatibong clade B.
Pagpapatunay ng CSF transport ng CSF-enriched phage-displayed peptides at biotinylated leader peptides na pinagsama sa mga streptavidin payload.
(a) Ang mga ratio ng pagpapayaman na kinakalkula sa lahat ng apat na round (R1-R4) batay sa mga na-injected (input = I) phage (PFU) titers at natukoy na CSF phage titers (output = O).Ang mga kadahilanan ng pagpapayaman para sa huling tatlong round (R2-R4) ay kinakalkula sa pamamagitan ng paghahambing sa nakaraang round at sa unang round (R1) na may data ng timbang.Ang mga bukas na bar ay cerebrospinal fluid, ang mga shaded bar ay plasma.(***p<0.001, batay sa t-test ng Mag-aaral).(b) Listahan ng pinaka-masaganang phage peptides, na niraranggo ayon sa kanilang kamag-anak na proporsyon sa lahat ng mga phage na nakolekta sa CSF pagkatapos ng round 4 ng pagpili.Ang anim na pinakakaraniwang phage clone ay naka-highlight sa kulay, bilang at kanilang mga kadahilanan sa pagpapayaman sa pagitan ng mga round 3 at 4 ng pagpili (inset).( c, d ) Ang anim na pinaka-enriched phage clone, walang laman na phage at parental phage peptide library mula sa round 4 ay nasuri nang paisa-isa sa isang modelo ng sampling ng CSF.Ang mga sample ng CSF at dugo ay nakolekta sa ipinahiwatig na mga punto ng oras.(c) Pantay-pantay na halaga ng 6 na kandidatong phage clone (2 x 1010 phage/hayop), walang laman na phage (#1779) (2 x 1010 phage/hayop) at stock phage peptide na library (2 x 1012 phage/hayop) Mag-iniksyon ng hindi bababa sa 3 CM sa pamamagitan ng hiwalay na latang hayop.Ang CSF pharmacokinetics ng bawat injected phage clone at phage peptide library sa paglipas ng panahon ay ipinapakita.(d) ay nagpapakita ng average na ratio ng CSF/dugo para sa lahat ng mga na-recover na phage/mL sa oras ng sampling.(e) Apat na synthetic leader na peptides at isang scrambled control ay na-link sa biotin sa streptavidin sa pamamagitan ng kanilang N-terminus (tetramer display) na sinusundan ng iniksyon (tail vein iv, 10 mg streptavidin/kg).Hindi bababa sa tatlong intubated na daga (N = 3).).Ang mga sample ng CSF ay nakolekta sa ipinahiwatig na mga punto ng oras at ang mga konsentrasyon ng streptavidin ay sinusukat ng CSF anti-streptavidin ELISA (nd = hindi nakita).(*p<0.05, **p<0.01, ***p<0.001, batay sa ANOVA test).(f) Paghahambing ng pagkakasunud-sunod ng amino acid ng pinaka-enriched na phage peptide clone #2002 (purple) sa iba pang napiling phage peptide clone mula sa ika-4 na round ng pagpili.Ang magkapareho at magkatulad na mga fragment ng amino acid ay color-coded.
Sa lahat ng mga enriched phage sa ika-apat na round (Larawan 3b), anim na clone ng kandidato ang napili para sa karagdagang indibidwal na pagsusuri sa CSF sampling model.Ang pantay na halaga ng anim na kandidatong phage, walang laman na phage (walang insert) at prophage peptide na mga aklatan ay na-inject sa tatlong cannulated CM na hayop, at ang mga pharmacokinetics ay tinutukoy sa CSF (Fig. 3c) at dugo (Karagdagang Fig. 7) assays.Ang lahat ng phage clone na nasubok ay naka-target sa CSF compartment sa antas na 10-1000 beses na mas mataas kaysa sa walang laman na control phage (#1779).Halimbawa, ang mga clone #2020 at #2077 ay may humigit-kumulang 1000 beses na mas mataas na titer ng CSF kaysa sa control phage.Ang pharmacokinetic profile ng bawat napiling peptide ay iba, ngunit lahat ng mga ito ay may mataas na CSF homing kakayahan.Napansin namin ang patuloy na pagbaba sa paglipas ng panahon para sa mga clone #1903 at #2011, habang para sa mga clone #2077, #2002 at #2009 ang pagtaas sa loob ng unang 10 minuto ay maaaring magpahiwatig ng aktibong transportasyon ngunit kailangang ma-verify.Nag-stabilize ang mga clone #2020, #2002, at #2077 sa matataas na antas, habang dahan-dahang bumaba ang konsentrasyon ng CSF ng clone #2009 pagkatapos ng unang pagtaas.Pagkatapos ay inihambing namin ang kamag-anak na dalas ng bawat kandidato ng CSF sa konsentrasyon ng dugo nito (Larawan 3d).Ang ugnayan ng ibig sabihin ng titer ng bawat kandidato ng CSF kasama ang titer ng dugo nito sa lahat ng oras ng sampling ay nagpakita na tatlo sa anim na kandidato ay makabuluhang pinayaman sa CSF ng dugo.Kapansin-pansin, ang clone #2077 ay nagpakita ng mas mataas na katatagan ng dugo (Karagdagang Larawan 7).Upang kumpirmahin na ang mga peptide mismo ay may kakayahang aktibong maghatid ng mga kargamento maliban sa mga particle ng phage sa kompartamento ng CSF, nag-synthesize kami ng apat na pinuno na peptides na hinango sa biotin sa N-terminus kung saan nakakabit ang mga peptide sa particle ng phage.Ang mga biotinylated peptides (nos. 2002, 2009, 2020 at 2077) ay pinagsama sa streptavidin (SA) upang makakuha ng mga multimeric na form na medyo ginagaya ang phage geometry.Ang format na ito ay nagpapahintulot din sa amin na sukatin ang pagkakalantad ng SA sa dugo at cerebrospinal fluid bilang cargo-transporting protein peptides.Mahalaga, ang data ng phage ay kadalasang maaaring kopyahin kapag ang mga sintetikong peptide ay pinangangasiwaan sa format na SA-conjugated na ito (Fig. 3e).Ang mga scrambled peptides ay may mas kaunting paunang pagkakalantad at mas mabilis na CSF clearance na may hindi matukoy na antas sa loob ng 48 oras.Upang makakuha ng pananaw sa mga daanan ng paghahatid ng mga peptide phage clone na ito sa espasyo ng CSF, sinuri namin ang lokalisasyon ng mga indibidwal na phage peptide hits gamit ang immunohistochemistry (IHC) upang direktang makita ang mga particle ng phage 1 oras pagkatapos ng intravenous injection sa vivo.Kapansin-pansin, ang mga clone #2002, #2077, at #2009 ay maaaring makita sa pamamagitan ng malakas na paglamlam sa mga capillary ng utak, habang ang control phage (#1779) at clone #2020 ay hindi nakita (Karagdagang Larawan 8).Ito ay nagpapahiwatig na ang mga peptides na ito ay nag-aambag sa epekto sa utak nang tumpak sa pamamagitan ng pagtawid sa BBB.Ang karagdagang detalyadong pagsusuri ay kinakailangan upang subukan ang hypothesis na ito, dahil ang ruta ng BSCFB ay maaari ding kasangkot.Kapag inihambing ang pagkakasunud-sunod ng amino acid ng pinaka-enriched na clone (#2002) sa iba pang mga napiling peptides, nabanggit na ang ilan sa kanila ay may katulad na mga extension ng amino acid, na maaaring magpahiwatig ng isang katulad na mekanismo ng transportasyon (Fig. 3f).
Dahil sa natatanging plasma profile nito at makabuluhang pagtaas sa CSF sa paglipas ng panahon, ang phage display clone #2077 ay higit pang ginalugad sa loob ng mas mahabang 48-oras na panahon at nagawang kopyahin ang mabilis na pagtaas ng CSF na naobserbahan kasabay ng napapanatiling antas ng SA (Fig. 4a).Tungkol sa iba pang natukoy na mga clone ng phage, ang #2077 ay nabahiran nang husto para sa mga capillary ng utak at nagpakita ng makabuluhang colocalization na may capillary marker lectin kapag tiningnan sa mas mataas na resolution at posibleng ilang paglamlam sa parenchymal space (Larawan 4b).Upang siyasatin kung ang peptide-mediated na mga pharmacological effect ay maaaring makuha sa CNS, nagsagawa kami ng isang eksperimento kung saan ang mga biotinylated na bersyon ng i) ang #2077 transit peptide at ii) ang BACE1 inhibitor peptide ay pinaghalo sa SA sa dalawang magkaibang ratios.Para sa isang kumbinasyon ginamit lang namin ang BACE1 peptide inhibitor at para sa isa ay gumamit kami ng 1:3 ratio ng BACE1 peptide inhibitor sa #2077 peptide.Ang parehong mga sample ay pinangangasiwaan ng intravenously at ang mga antas ng dugo at cerebrospinal fluid ng beta-amyloid peptide 40 (Abeta40) ay sinusukat sa paglipas ng panahon.Ang Abeta40 ay sinusukat sa CSF dahil sinasalamin nito ang pagsugpo sa BACE1 sa parenchyma ng utak.Tulad ng inaasahan, ang parehong mga complex ay makabuluhang nabawasan ang mga antas ng dugo ng Abeta40 (Larawan 4c, d).Gayunpaman, ang mga sample lamang na naglalaman ng pinaghalong peptide no.2077 at isang inhibitor ng BACE1 peptide na pinagsama sa SA ay nagdulot ng makabuluhang pagbaba sa Abeta40 sa cerebrospinal fluid (Fig. 4c).Ipinapakita ng data na ang peptide no.Nagagawa ng 2077 na i-transport ang 60 kDa SA protein sa CNS at nag-uudyok din ng mga pharmacological effect na may SA-conjugated inhibitors ng BACE1 peptide.
(a) Clonal injection (2 × 10 phages/hayop) ng T7 phage na nagpapakita ng mga pangmatagalang pharmacokinetic profile ng CSF peptide #2077 (RLSSVDSDLLSGC) at uninjected control phage (#1779) sa hindi bababa sa tatlong CM-intubated na daga.(b) Confocal microscopic na imahe ng kinatawan ng cortical microvessels sa phage-injected rats (2 × 10 10 phages/hayop) na nagpapakita ng counterstaining ng peptide #2077 at mga sisidlan (lectin).Ang mga phage clone na ito ay ibinibigay sa 3 daga at pinahintulutan na mag-circulate ng 1 oras bago ang perfusion.Ang mga utak ay na-section at nabahiran ng polyclonal FITC-labeled antibodies laban sa T7 phage capsid.Sampung minuto bago ang perfusion at kasunod na pag-aayos, ang DyLight594 na may label na lectin ay ibinibigay sa intravenously.Mga larawang fluorescent na nagpapakita ng paglamlam ng lectin (pula) ng luminal na bahagi ng microvessels at phages (berde) sa lumen ng mga capillary at perivascular na tisyu ng utak.Ang scale bar ay tumutugma sa 10 µm.( c, d ) Ang Biotinylated BACE1 inhibitory peptide lamang o kasabay ng biotinylated transit peptide #2077 ay isinama sa streptavidin na sinundan ng intravenous injection ng hindi bababa sa tatlong cannulated CM rats (10 mg streptavidin/kg).Ang BACE1 peptide inhibitor-mediated reduction sa Aβ40 ay sinusukat ng Aβ1-40 ELISA sa dugo (pula) at cerebrospinal fluid (orange) sa ipinahiwatig na mga punto ng oras.Para sa mas mahusay na kalinawan, ang isang tuldok na linya ay iginuhit sa graph sa sukat na 100%.(c) Ang pagbawas ng porsyento sa Aβ40 sa dugo (pulang tatsulok) at cerebrospinal fluid (orange triangles) sa mga daga na ginagamot ng streptavidin na pinagsama sa transit peptide #2077 at BACE1 inhibitory peptide sa isang 3:1 ratio.(d) Ang pagbawas ng porsyento sa dugo Aβ40 (mga pulang bilog) at cerebrospinal fluid (orange na bilog) ng mga daga na ginagamot ng streptavidin na isinama sa isang BACE1 inhibitory peptide lamang.Ang konsentrasyon ng Aβ sa kontrol ay 420 pg/ml (standard deviation = 101 pg/ml).
Ang pagpapakita ng Phage ay matagumpay na nailapat sa ilang mga lugar ng biomedical na pananaliksik17.Ang pamamaraang ito ay ginamit para sa mga pag-aaral sa vivo vascular diversity18,19 pati na rin sa mga pag-aaral na nagta-target sa mga cerebral vessels20,21,22,23,24,25,26.Sa pag-aaral na ito, pinalawak namin ang aplikasyon ng paraan ng pagpili na ito hindi lamang sa direktang pagkakakilanlan ng mga peptides na nagta-target sa mga cerebral vessel, kundi pati na rin sa pagtuklas ng mga kandidato na may aktibong mga katangian ng transportasyon upang tumawid sa hadlang ng dugo-utak.Inilalarawan namin ngayon ang pagbuo ng isang in vivo na pamamaraan ng pagpili sa mga intubated na daga ng CM at ipinapakita ang potensyal nito na makilala ang mga peptide na may mga katangian ng pag-uwi ng CSF.Gamit ang T7 phage na nagpapakita ng isang library ng 12-mer random peptides, naipakita namin na ang T7 phage ay sapat na maliit (humigit-kumulang 60 nm ang lapad)10 upang maiangkop sa hadlang ng dugo-utak, at sa gayon ay direktang tumatawid sa hadlang ng dugo-utak o choroid plexus.Napansin namin na ang pag-aani ng CSF mula sa mga cannulated CM rats ay isang mahusay na kontrolado sa vivo functional screening na pamamaraan, at ang nakuhang phage ay hindi lamang nakagapos sa vasculature ngunit gumana rin bilang isang transporter sa buong blood-brain barrier.Higit pa rito, sa pamamagitan ng sabay-sabay na pagkolekta ng dugo at paglalapat ng HTS sa CSF ​​at mga phage na nagmula sa dugo, kinumpirma namin na ang aming pagpili ng CSF ay hindi naiimpluwensyahan ng pagpapayaman ng dugo o fitness para sa pagpapalawak sa pagitan ng mga round ng pagpili.Gayunpaman, ang kompartimento ng dugo ay bahagi ng pamamaraan ng pagpili, dahil ang mga phage na may kakayahang maabot ang kompartamento ng CSF ay dapat na mabuhay at umikot sa daloy ng dugo nang sapat na mahabang panahon upang pagyamanin ang kanilang sarili sa utak.Upang makakuha ng maaasahang impormasyon ng sequence mula sa raw HTS data, nagpatupad kami ng mga filter na inangkop sa mga error sa sequencing na partikular sa platform sa workflow ng pagsusuri.Sa pamamagitan ng pagsasama ng mga kinetic na parameter sa pamamaraan ng screening, nakumpirma namin ang mabilis na mga pharmacokinetics ng wild-type na T7 phages (t½ ~ 28 min) sa dugo24, 27, 28 at natukoy din ang kanilang kalahating buhay sa cerebrospinal fluid (t½ ~ 26 min) bawat minuto).Sa kabila ng magkatulad na mga profile ng pharmacokinetic sa dugo at CSF, 0.001% lamang ng konsentrasyon ng dugo ng phage ang maaaring makita sa CSF, na nagpapahiwatig ng mababang background na kadaliang mapakilos ng wild-type na T7 phage sa buong blood-brain barrier.Itinatampok ng gawaing ito ang kahalagahan ng unang pag-ikot ng pagpili kapag gumagamit ng mga diskarte sa pag-pan sa vivo, lalo na para sa mga sistema ng phage na mabilis na naalis mula sa sirkulasyon, dahil kakaunti ang mga clone na nakakaabot sa kompartamento ng CNS.Kaya, sa unang pag-ikot, ang pagbawas sa pagkakaiba-iba ng aklatan ay napakalaki, dahil isang limitadong bilang lamang ng mga clone ang kalaunan ay nakolekta sa napakahigpit na modelong CSF na ito.Kasama sa in vivo panning strategy na ito ang ilang hakbang sa pagpili tulad ng aktibong akumulasyon sa CSF compartment, clone survival sa blood compartment, at mabilis na pag-alis ng T7 phage clones mula sa dugo sa loob ng unang 10 minuto (Fig. 1d at Pandagdag na Fig. 4M).).Kaya, pagkatapos ng unang pag-ikot, ang iba't ibang mga clone ng phage ay nakilala sa CSF, bagaman ang parehong paunang pool ay ginamit para sa mga indibidwal na hayop.Iminumungkahi nito na ang maramihang mahigpit na hakbang sa pagpili para sa mga pinagmulang aklatan na may malaking bilang ng mga miyembro ng aklatan ay nagreresulta sa isang makabuluhang pagbawas sa pagkakaiba-iba.Samakatuwid, ang mga random na kaganapan ay magiging isang mahalagang bahagi ng paunang proseso ng pagpili, na lubos na nakakaimpluwensya sa resulta.Malamang na marami sa mga clone sa orihinal na aklatan ay may katulad na hilig sa pagpapayaman ng CSF.Gayunpaman, kahit sa ilalim ng parehong mga pang-eksperimentong kundisyon, maaaring mag-iba ang mga resulta ng pagpili dahil sa maliit na bilang ng bawat partikular na clone sa paunang pool.
Ang mga motif na pinayaman sa CSF ay naiiba sa mga nasa dugo.Kapansin-pansin, napansin namin ang unang paglilipat patungo sa mga peptide na mayaman sa glycine sa dugo ng mga indibidwal na hayop.(Larawan 1g, Mga Karagdagang Larawan 4e, 4f).Ang Phage na naglalaman ng glycine peptides ay maaaring maging mas matatag at mas malamang na maalis sa sirkulasyon.Gayunpaman, ang mga peptide na mayaman sa glycine na ito ay hindi nakita sa mga sample ng cerebrospinal fluid, na nagmumungkahi na ang mga na-curate na aklatan ay dumaan sa dalawang magkakaibang hakbang sa pagpili: isa sa dugo at isa pa ay pinapayagang maipon sa cerebrospinal fluid.Ang mga clone na pinayaman ng CSF na nagreresulta mula sa ika-apat na round ng pagpili ay malawakang nasubok.Halos lahat ng mga indibidwal na nasubok na mga clone ay nakumpirma na pinayaman sa CSF kumpara sa blangkong control phage.Isang peptide hit (#2077) ang sinuri nang mas detalyado.Nagpakita ito ng mas mahabang kalahating buhay ng plasma kumpara sa iba pang mga hit (Larawan 3d at Karagdagang Larawan 7), at kawili-wili, ang peptide na ito ay naglalaman ng cysteine ​​​​residue sa C-terminus.Ipinakita kamakailan na ang pagdaragdag ng cysteine ​​​​sa peptides ay maaaring mapabuti ang kanilang mga pharmacokinetic na katangian sa pamamagitan ng pagbubuklod sa albumin 29 .Ito ay kasalukuyang hindi kilala para sa peptide #2077 at nangangailangan ng karagdagang pag-aaral.Ang ilang mga peptides ay nagpakita ng isang valence-dependency sa pagpapayaman ng CSF (hindi ipinakita ang data), na maaaring nauugnay sa ipinakita na geometry sa ibabaw ng T7 capsid.Ang T7 system na ginamit namin ay nagpakita ng 5-15 na kopya ng bawat peptide bawat phage particle.Ang IHC ay isinagawa sa mga kandidatong lead phage clone na iniksyon nang intravenously sa cerebral cortex ng mga daga (Karagdagang Fig. 8).Ipinakita ng data na hindi bababa sa tatlong clone (No. 2002, No. 2009 at No. 2077) ang nakipag-ugnayan sa BBB.Ito ay nananatiling matukoy kung ang pakikipag-ugnayan ng BBB na ito ay nagreresulta sa akumulasyon ng CSF o ang paggalaw ng mga clone na ito nang direkta sa BCSFB.Mahalaga, ipinapakita namin na ang mga napiling peptide ay nagpapanatili ng kanilang kapasidad sa transportasyon ng CSF kapag na-synthesize at nakatali sa kargamento ng protina.Ang pagbubuklod ng N-terminal biotinylated peptides sa SA ay mahalagang inuulit ang mga resultang nakuha sa kani-kanilang mga phage clone sa dugo at cerebrospinal fluid (Fig. 3e).Sa wakas, ipinapakita namin na ang lead peptide #2077 ay nakapag-promote ng pagkilos ng utak ng isang biotinylated peptide inhibitor ng BACE1 conjugated sa SA, na nagiging sanhi ng binibigkas na mga pharmacodynamic effect sa CNS sa pamamagitan ng makabuluhang pagbabawas ng mga antas ng Abeta40 sa CSF (Fig. 4).Hindi namin natukoy ang anumang mga homologue sa database sa pamamagitan ng pagsasagawa ng peptide sequence homology search ng lahat ng hit.Mahalagang tandaan na ang laki ng T7 library ay humigit-kumulang 109, habang ang theoretical na laki ng library para sa 12-mers ay 4 x 1015. Samakatuwid, pumili lamang kami ng isang maliit na bahagi ng diversity space ng 12-mer peptide library, na maaaring mangahulugan na mas maraming na-optimize na peptide ang maaaring matukoy sa pamamagitan ng pagsusuri sa mga natukoy na espasyo ng mga natukoy na hit na ito.Sa hypothetically, ang isa sa mga dahilan kung bakit wala kaming nakitang anumang natural na homologue ng mga peptide na ito ay maaaring hindi pagkakapili sa panahon ng ebolusyon upang maiwasan ang hindi makontrol na pagpasok ng ilang mga motif ng peptide sa utak.
Kung sama-sama, ang aming mga resulta ay nagbibigay ng batayan para sa hinaharap na trabaho upang matukoy at makilala ang mga sistema ng transportasyon ng cerebrovascular barrier sa vivo nang mas detalyado.Ang pangunahing pag-setup ng pamamaraang ito ay batay sa isang functional na diskarte sa pagpili na hindi lamang kinikilala ang mga clone na may mga katangian ng pagbubuklod ng cerebral vascular, ngunit kasama rin ang isang kritikal na hakbang kung saan ang mga matagumpay na clone ay may intrinsic na aktibidad upang tumawid sa mga biological na hadlang sa vivo papunta sa kompartamento ng CNS.ay upang linawin ang mekanismo ng transportasyon ng mga peptides na ito at ang kanilang kagustuhan para sa pagbubuklod sa microvasculature na tiyak sa rehiyon ng utak.Ito ay maaaring humantong sa pagtuklas ng mga bagong landas para sa transportasyon ng BBB at mga receptor.Inaasahan namin na ang mga natukoy na peptide ay maaaring direktang magbigkis sa mga cerebrovascular receptor o sa mga nagpapalipat-lipat na ligand na dinadala sa pamamagitan ng BBB o BCSFB.Ang mga peptide vector na may aktibidad sa transportasyon ng CSF na natuklasan sa gawaing ito ay higit pang iimbestigahan.Kasalukuyan naming sinisiyasat ang pagiging tiyak ng utak ng mga peptide na ito para sa kanilang kakayahang tumawid sa BBB at/o BCSFB.Ang mga bagong peptide na ito ay magiging lubhang mahalagang kasangkapan para sa potensyal na pagtuklas ng mga bagong receptor o landas at para sa pagbuo ng mga bagong napakahusay na platform para sa paghahatid ng mga macromolecule, tulad ng biologics, sa utak.
I-cannulate ang malaking cisterna (CM) gamit ang pagbabago ng naunang inilarawan na paraan.Ang mga anesthetized Wistar rats (200-350 g) ay inilagay sa isang stereotaxic apparatus at isang median incision ang ginawa sa ibabaw ng shaved at aseptically prepared na anit upang malantad ang bungo.Mag-drill ng dalawang butas sa lugar ng itaas na sintas at i-fasten ang pag-aayos ng mga turnilyo sa mga butas.Isang karagdagang butas ang na-drill sa lateral occipital crest para sa stereotactic na gabay ng isang stainless steel cannula papunta sa CM.Lagyan ng semento ng ngipin ang paligid ng cannula at i-secure gamit ang mga turnilyo.Pagkatapos ng photo-curing at pagpapatigas ng semento, ang sugat sa balat ay sarado na may 4/0 supramid suture.Ang wastong paglalagay ng cannula ay kinumpirma ng kusang pagtagas ng cerebrospinal fluid (CSF).Alisin ang daga mula sa stereotaxic apparatus, tumanggap ng angkop na pangangalaga pagkatapos ng operasyon at pamamahala sa pananakit, at hayaan itong gumaling nang hindi bababa sa isang linggo hanggang sa makita ang mga palatandaan ng dugo sa cerebrospinal fluid.Ang mga daga ng Wistar (Crl:WI/Han) ay nakuha mula sa Charles River (France).Ang lahat ng mga daga ay pinananatili sa ilalim ng mga tiyak na kondisyon na walang pathogen.Ang lahat ng mga eksperimento sa hayop ay inaprubahan ng Veterinary Office ng Lungsod ng Basel, Switzerland, at isinagawa alinsunod sa Animal License No. 2474 (Assessment of Active Brain Transport by Measuring Levels of Therapeutic Candidates in the Cerebrospinal Fluid and Brain of Rat).
Dahan-dahang panatilihing may kamalayan ang daga na may hawak na CM cannula.Alisin ang Datura sa cannula at kolektahin ang 10 µl ng kusang dumadaloy na cerebrospinal fluid.Dahil ang patency ng cannula ay sa huli ay nakompromiso, tanging ang mga malinaw na cerebrospinal fluid sample na walang katibayan ng kontaminasyon ng dugo o pagkawalan ng kulay ang kasama sa pag-aaral na ito.Sa kahanay, humigit-kumulang 10-20 μl ng dugo ang kinuha mula sa isang maliit na paghiwa sa dulo ng buntot sa mga tubo na may heparin (Sigma-Aldrich).Ang CSF at dugo ay nakolekta sa iba't ibang mga oras ng oras pagkatapos ng intravenous injection ng T7 phage.Humigit-kumulang 5-10 μl ng likido ang itinapon bago ang bawat sample ng CSF ay nakolekta, na tumutugma sa patay na dami ng catheter.
Ang mga aklatan ay nabuo gamit ang T7Select 10-3b vector gaya ng inilarawan sa T7Select system manual (Novagen, Rosenberg et al., InNovations 6, 1-6, 1996).Sa madaling sabi, isang random na 12-mer DNA insert ang na-synthesize sa sumusunod na format:
Ang NNK codon ay ginamit upang maiwasan ang double stop codons at amino acid overexpression sa insert.Ang N ay isang manu-manong halo-halong equimolar ratio ng bawat nucleotide, at ang K ay isang manu-manong halo-halong equimolar ratio ng adenine at cytosine nucleotides.Ang mga solong stranded na rehiyon ay na-convert sa double stranded DNA sa pamamagitan ng karagdagang pagpapapisa ng itlog sa dNTP (Novagen) at Klenow enzyme (New England Biolabs) sa Klenow buffer (New England Biolabs) sa loob ng 3 oras sa 37 ° C.Matapos ang reaksyon, ang double-stranded na DNA ay nakuhang muli ng EtOH precipitation.Ang nagresultang DNA ay hinukay gamit ang mga restriction enzyme na EcoRI at HindIII (parehong mula sa Roche).Ang cleaved at purified (QIAquick, Qiagen) insert (T4 ligase, New England Biolabs) ay pagkatapos ay na-ligated in-frame sa isang pre-cleaved T7 vector pagkatapos ng amino acid 348 ng 10B capsid gene.Ang mga reaksyon ng ligation ay incubated sa 16° C. sa loob ng 18 oras bago ang in vitro packaging.Ang Phage packaging in vitro ay isinagawa ayon sa mga tagubilin na ibinigay kasama ang T7Select 10-3b cloning kit (Novagen) at ang packaging solution ay pinalaki nang isang beses sa lysis gamit ang Escherichia coli (BLT5615, Novagen).Ang lysates ay centrifuged, titrated at frozen sa -80° C. bilang isang stock solusyon ng gliserol.
Direktang PCR amplification ng phage variable regions na pinalaki sa sabaw o plato gamit ang proprietary 454/Roche-amplicon fusion primers.Ang forward fusion primer ay naglalaman ng mga pagkakasunud-sunod na sumasaklaw sa variable na rehiyon (NNK) 12 (template-specific), GS FLX Titanium Adapter A, at isang four-base library key sequence (TCAG) (Karagdagang Larawan 1a):
Ang reverse fusion primer ay naglalaman din ng biotin na nakakabit upang makuha ang mga kuwintas at ang GS FLX Titanium Adapter B na kinakailangan para sa clonal amplification sa panahon ng emulsion PCR:
Ang mga amplicon ay isinailalim sa 454/Roche pyrosequencing ayon sa 454 GS-FLX Titanium protocol.Para sa manu-manong Sanger sequencing (Applied Biosystems Hitachi 3730 xl DNA Analyzer), ang T7 phage DNA ay pinalaki ng PCR at na-sequence sa mga sumusunod na pares ng primer:
Ang mga pagsingit mula sa mga indibidwal na plake ay sumailalim sa PCR amplification gamit ang Roche Fast Start DNA Polymerase Kit (ayon sa mga tagubilin ng tagagawa).Magsagawa ng mainit na pagsisimula (10 min sa 95 °C) at 35 boost cycle (50 s sa 95 °C, 1 min sa 50 °C, at 1 min sa 72 °C).
Ang Phage mula sa mga aklatan, wild-type na phage, phage na nailigtas mula sa CSF at dugo, o mga indibidwal na clone ay pinalaki sa Escherichia coli BL5615 sa sabaw ng TB (Sigma Aldrich) o sa 500 cm2 na pinggan (Thermo Scientific) sa loob ng 4 na oras sa 37°C.Ang Phage ay nakuha mula sa mga plato sa pamamagitan ng paghuhugas ng mga plato gamit ang Tris-EDTA buffer (Fluka Analytical) o sa pamamagitan ng pagkolekta ng mga plake na may sterile pipette tip.Ang Phage ay nahiwalay sa culture supernatant o extraction buffer na may isang round ng polyethylene glycol (PEG 8000) precipitation (Promega) at muling nasuspinde sa Tris-EDTA buffer.
Ang amplified phage ay sumailalim sa 2-3 round ng endotoxin removal gamit ang endotoxin removal beads (Miltenyi Biotec) bago ang intravenous (IV) injection (500 μl/hayop).Sa unang round, ipinakilala ang 2×1012 phages;sa pangalawa, 2×1010 phages;sa ikatlo at ikaapat na round ng pagpili, 2×109 phages bawat hayop.Ang nilalaman ng Phage sa CSF at mga sample ng dugo na nakolekta sa ipinahiwatig na mga punto ng oras ay natukoy sa pamamagitan ng pagbibilang ng plaka ayon sa mga tagubilin ng tagagawa (T7Select system manual).Ang pagpili ng Phage ay isinagawa sa pamamagitan ng intravenous injection ng mga purified library sa tail vein o sa pamamagitan ng muling pag-iniksyon ng phage na nakuha mula sa CSF mula sa nakaraang round ng pagpili, at ang mga kasunod na pag-aani ay isinagawa sa 10 min, 30 min, 60 min, 90 min, 120 min, 180 min, at 240 min sample ng dugo ayon sa pagkakabanggit.Isang kabuuang apat na round ng in vivo panning ang isinagawa kung saan ang dalawang napiling branch ay hiwalay na inimbak at sinuri sa unang tatlong round ng pagpili.Ang lahat ng mga pagsingit ng phage na nakuha mula sa CSF mula sa unang dalawang pag-ikot ng pagpili ay sumailalim sa 454/Roche pyrosequencing, habang ang lahat ng mga clone na nakuha mula sa CSF mula sa huling dalawang pag-ikot ng pagpili ay manu-manong na-sequence.Ang lahat ng mga phage ng dugo mula sa unang pag-ikot ng pagpili ay sumailalim din sa 454/Roche pyrosequencing.Para sa pag-iniksyon ng mga phage clone, ang mga napiling phage ay pinalaki sa E. coli (BL5615) sa 500 cm2 na mga plato sa 37 ° C sa loob ng 4 na oras.Ang mga indibidwal na pinili at manu-manong sunud-sunod na mga clone ay pinalaganap sa daluyan ng TB.Pagkatapos ng phage extraction, purification at pagtanggal ng endotoxin (tulad ng inilarawan sa itaas), 2×1010 phages/hayop sa 300 μl ay na-injected intravenously sa isang tail vein.
Preprocessing at qualitative filtering ng sequence data.Ang Raw 454/Roche na data ay na-convert mula sa binary standard stream map format (sff) sa isang Pearson human readable format (fasta) gamit ang vendor software.Ang karagdagang pagproseso ng pagkakasunud-sunod ng nucleotide ay isinagawa gamit ang proprietary C programs at scripts (unreleased software package) tulad ng inilarawan sa ibaba.Kasama sa pagsusuri ng pangunahing data ang mahigpit na multi-stage na mga pamamaraan sa pag-filter.Upang i-filter ang mga nabasa na hindi naglalaman ng wastong 12mer insert DNA sequence, ang mga nabasa ay sunud-sunod na inihanay upang simulan ang label (GTGATGTCGGGGATCCGAATTCT), stop label (TAAGCTTGCGGCCGCACTCGAGTA) at background insert (CCCTGCAGGGATATCCCGGGAGCTCGTCGAC) gamit ang global Needleman-Wunsch test.alignment na nagbibigay-daan sa hanggang 2 inconsistencies bawat alignment31.Samakatuwid, ang mga pagbabasa nang walang panimula at hinto na mga tag at mga pagbabasa na naglalaman ng mga pagsingit sa background, ibig sabihin, mga pagkakahanay na lumampas sa pinapayagang bilang ng mga hindi pagkakatugma, ay inalis sa library.Tulad ng para sa natitirang mga pagbabasa, ang N-mer DNA sequence na umaabot mula sa simulang marka at nagtatapos bago ang stop mark ay natanggal mula sa orihinal na read sequence at higit pang naproseso (mula dito ay tinutukoy bilang "insert").Pagkatapos ng pagsasalin ng insert, ang bahagi pagkatapos ng first stop codon sa 5′ dulo ng primer ay aalisin sa insert.Bilang karagdagan, ang mga nucleotide na humahantong sa hindi kumpletong mga codon sa 3′ dulo ng panimulang aklat ay tinanggal din.Upang ibukod ang mga pagsingit na naglalaman lamang ng mga pagkakasunud-sunod ng background, inalis din ang mga isinaling pagsingit na nagsisimula sa pattern ng amino acid na "PAG".Ang mga peptide na may post-translational na haba na mas mababa sa 3 amino acid ay inalis mula sa library.Panghuli, alisin ang redundancy sa insert pool at tukuyin ang dalas ng bawat natatanging insert.Ang mga resulta ng pagsusuri na ito ay nagsasama ng isang listahan ng mga pagkakasunud-sunod ng nucleotide (pagsingit) at ang kanilang (basahin) na mga frequency (Mga Karagdagang Larawan 1c at 2).
Ipangkat ang N-mer DNA insert ayon sa pagkakapareho ng pagkakasunud-sunod: Upang alisin ang 454/Roche-specific na sequencing error (tulad ng mga problema sa sequencing homopolymer extension) at alisin ang hindi gaanong mahalagang mga redundancies, ang mga naunang na-filter na N-mer DNA sequence insert (inserts) ay pinagbubukod-bukod ayon sa pagkakapareho.mga pagpapasok (hanggang sa 2 hindi tugmang base na pinapayagan) gamit ang isang umuulit na algorithm na tinukoy bilang mga sumusunod: ang mga pagpapasok ay pinagbubukod-bukod muna ayon sa kanilang dalas (pinakamataas hanggang pinakamababa), at kung pareho sila, ayon sa kanilang pangalawang pag-uuri ayon sa haba (pinakamahaba hanggang pinakamaikling) ).Kaya, ang pinakamadalas at pinakamahabang pagpapasok ay tumutukoy sa unang "grupo".Ang dalas ng pangkat ay nakatakda sa pangunahing dalas.Pagkatapos, ang bawat insertion na natitira sa pinagsunod-sunod na listahan ay sinubukang idagdag sa grupo sa pamamagitan ng pairwise Needleman-Wunsch alignment.Kung ang bilang ng mga hindi pagtutugma, pagpapasok, o pagtanggal sa isang alignment ay hindi lalampas sa isang threshold na 2, isang pagpapasok ay idaragdag sa grupo, at ang pangkalahatang dalas ng pangkat ay tataas ng kung gaano kadalas idinagdag ang pagpapasok.Ang mga pagsingit na idinagdag sa isang pangkat ay minarkahan bilang ginamit at hindi kasama sa karagdagang pagproseso.Kung ang insert sequence ay hindi maidaragdag sa isang umiiral nang grupo, ang insert sequence ay ginagamit upang lumikha ng bagong grupo na may naaangkop na insert frequency at minarkahan bilang ginamit.Ang pag-ulit ay nagtatapos kapag ang bawat insertion sequence ay ginamit upang bumuo ng isang bagong grupo o maaaring isama sa isang umiiral nang grupo.Pagkatapos ng lahat, ang mga pinagsama-samang pagsingit na binubuo ng mga nucleotides ay kalaunan ay isinalin sa mga peptide sequence (peptide library).Ang resulta ng pagsusuring ito ay isang set ng mga insertion at ang mga kaukulang frequency nito na bumubuo sa bilang ng magkakasunod na pagbabasa (Karagdagang Fig. 2).
Pagbuo ng Motif: Batay sa isang listahan ng mga natatanging peptide, nilikha ang isang library na naglalaman ng lahat ng posibleng pattern ng amino acid (aa) tulad ng ipinapakita sa ibaba.Ang bawat posibleng pattern ng haba 3 ay nakuha mula sa peptide at ang kabaligtaran na pattern nito ay idinagdag kasama ang isang karaniwang motif library na naglalaman ng lahat ng mga pattern (tripeptides).Ang mga aklatan ng mga paulit-ulit na motif ay pinagsunod-sunod at inalis ang redundancy.Pagkatapos, para sa bawat tripeptide sa motif library, sinuri namin ang presensya nito sa library gamit ang mga computational tool.Sa kasong ito, ang dalas ng peptide na naglalaman ng nahanap na motif na tripeptide ay idinaragdag at itinalaga sa motif sa motif library ("bilang ng mga motif").Ang resulta ng pagbuo ng motif ay isang two-dimensional array na naglalaman ng lahat ng paglitaw ng mga tripeptide (motif) at ang kani-kanilang mga value, na kung saan ay ang bilang ng mga sequencing read na nagreresulta sa kaukulang motif kapag ang mga nabasa ay na-filter, nakapangkat, at isinalin.Mga sukatan gaya ng inilarawan nang detalyado sa itaas.
Normalization ng bilang ng mga motif at kaukulang scatterplot: Ang bilang ng mga motif para sa bawat sample ay na-normalize gamit ang
kung saan ang ni ay ang bilang ng mga binasa na naglalaman ng paksa i.Kaya, kinakatawan ng vi ang porsyento ng dalas ng mga pagbabasa (o mga peptide) na naglalaman ng motif i sa sample.Ang mga P-value para sa hindi normal na bilang ng mga motif ay kinakalkula gamit ang eksaktong pagsubok ni Fisher.Tungkol sa correlograms ng bilang ng mga motibo, ang mga ugnayan ni Spearman ay kinakalkula gamit ang normalized na bilang ng mga motibo na may R.
Upang mailarawan ang nilalaman ng mga amino acid sa bawat posisyon sa peptide library, ang mga web logograms 32, 33 (http://weblogo.threeplusone.com) ay nilikha.Una, ang nilalaman ng mga amino acid sa bawat posisyon ng 12-mer peptide ay naka-imbak sa isang 20 × 12 matrix.Pagkatapos, ang isang set ng 1000 peptides na naglalaman ng parehong kamag-anak na nilalaman ng amino acid sa bawat posisyon ay nabuo sa fasta-sequence na format at ibinigay bilang input sa web-logo 3, na bumubuo ng isang graphical na representasyon ng kamag-anak na nilalaman ng amino acid sa bawat posisyon.para sa isang ibinigay na peptide library.Upang mailarawan ang mga multidimensional na dataset, ginawa ang mga heat map gamit ang isang internal na binuo na tool sa R ​​(biosHeatmap, isang pa-release na R package).Ang mga dendrogram na ipinakita sa mga mapa ng init ay kinakalkula gamit ang hierarchical clustering method ng Ward gamit ang Euclidean distance metric.Para sa istatistikal na pagsusuri ng data ng pagmamarka ng motif, ang mga halaga ng P para sa hindi normal na pagmamarka ay kinakalkula gamit ang eksaktong pagsubok ni Fisher.Ang mga P-value para sa iba pang mga dataset ay kinakalkula sa R ​​gamit ang Student's t-test o ANOVA.
Ang mga napiling phage clone at phage na walang mga pagsingit ay na-injected sa intravenously sa pamamagitan ng tail vein (2×1010 phages/hayop sa 300 μl PBS).Sampung minuto bago ang perfusion at kasunod na pag-aayos, ang parehong mga hayop ay intravenously injected na may 100 μl ng DyLight594-label na lectin (Vector Laboratories Inc., DL-1177).60 minuto pagkatapos ng phage injection, ang mga daga ay pinahiran sa puso na may 50 ml PBS na sinusundan ng 50 ml 4% PFA/PBS.Ang mga sample ng utak ay karagdagang naayos magdamag sa 4% PFA/PBS at babad sa 30% sucrose magdamag sa 4°C.Ang mga sample ay flash frozen sa OCT mixture.Ang immunohistochemical analysis ng mga frozen na sample ay isinagawa sa temperatura ng silid sa 30 µm cryosections na hinarangan ng 1% BSA at incubated na may polyclonal FITC-labeled antibodies laban sa T7 phage (Novus NB 600-376A) sa 4 °C.Incubate magdamag.Sa wakas, ang mga seksyon ay hugasan ng 3 beses sa PBS at sinuri gamit ang isang confocal laser microscope (Leica TCS SP5).
Ang lahat ng mga peptides na may pinakamababang kadalisayan ng 98% ay na-synthesize ng GenScript USA, biotinylated at lyophilized.Ang biotin ay nakatali sa pamamagitan ng karagdagang triple glycine spacer sa N-terminus.Suriin ang lahat ng peptides gamit ang mass spectrometry.
Ang Streptavidin (Sigma S0677) ay hinaluan ng 5-fold equimolar excess ng biotinylated peptide, biotinylated BACE1 inhibitory peptide, o isang kumbinasyon (3:1 ratio) ng biotinylated BACE1 inhibitory peptide at BACE1 inhibitory peptide sa 5-10% DMSO/incubated sa PBSO.1 oras sa temperatura ng kuwarto bago iniksyon.Ang Streptavidin-conjugated peptides ay na-injected sa intravenously sa isang dosis na 10 mg/kg sa isa sa mga tail veins ng mga daga na may cerebral cavity.
Ang konsentrasyon ng mga streptavidin-peptide complex ay nasuri ng ELISA.Ang Nunc Maxisorp microtiter plates (Sigma) ay pinahiran ng magdamag sa 4°C na may 1.5 μg/ml mouse anti-streptavidin antibody (Thermo, MA1-20011).Pagkatapos ng pagharang (pagharang sa buffer: 140 nM NaCL, 5 mM EDTA, 0.05% NP40, 0.25% gelatin, 1% BSA) sa temperatura ng silid sa loob ng 2 oras, hugasan ang plato na may 0.05% Tween-20/PBS (wash buffer) sa loob ng 3 Segundo, idinagdag ang mga sample ng CSF at plasma00 na may mahusay na buffer: 0. CSF 1:115).Ang plato ay pagkatapos ay incubated magdamag sa 4 ° C na may detection antibody (1 μg / ml, anti-streptavidin-HRP, Novus NB120-7239).Matapos ang tatlong hakbang sa paghuhugas, ang streptavidin ay nakita sa pamamagitan ng pagpapapisa ng itlog sa TMB substrate solution (Roche) hanggang 20 min.Pagkatapos ihinto ang pagbuo ng kulay na may 1M H2SO4, sukatin ang absorbance sa 450 nm.
Ang pag-andar ng streptavidin-peptide-BACE1 inhibitor complex ay nasuri ng Aβ(1-40) ELISA ayon sa protocol ng tagagawa (Wako, 294-64701).Sa madaling sabi, ang mga sample ng CSF ay natunaw sa karaniwang diluent (1:23) at natupok nang magdamag sa 4°C sa 96-well plate na pinahiran ng BNT77 capture antibody.Pagkatapos ng limang hakbang sa paghuhugas, ang HRP-conjugated na BA27 na antibody ay idinagdag at incubated sa loob ng 2 oras sa 4° C., na sinusundan ng limang hakbang sa paghuhugas.Ang Aβ (1–40) ay nakita sa pamamagitan ng pagpapapisa ng itlog sa TMB solution sa loob ng 30 minuto sa temperatura ng silid.Matapos ihinto ang pagbuo ng kulay gamit ang stop solution, sukatin ang absorbance sa 450 nm.Ang mga sample ng plasma ay sumailalim sa solid phase extraction bago ang Aβ(1–40) ELISA.Ang plasma ay idinagdag sa 0.2% DEA (Sigma) sa 96-well plate at natupok sa temperatura ng silid sa loob ng 30 minuto.Matapos ang sunud-sunod na paghuhugas ng mga plato ng SPE (Oasis, 186000679) ng tubig at 100% methanol, ang mga sample ng plasma ay idinagdag sa mga plato ng SPE at tinanggal ang lahat ng likido.Ang mga sample ay hinugasan (una gamit ang 5% methanol pagkatapos ay 30% methanol) at pinahiran ng 2% NH4OH/90% methanol.Matapos matuyo ang eluate sa 55 ° C para sa 99 min sa pare-pareho ang kasalukuyang N2, ang mga sample ay nabawasan sa mga karaniwang diluent at ang Aβ (1–40) ay sinusukat tulad ng inilarawan sa itaas.
Paano mabanggit ang artikulong ito: Urich, E. et al.Ang paghahatid ng kargamento sa utak gamit ang mga transit peptides na natukoy sa vivo.ang agham.5, 14104;doi:10.1038/srep14104 (2015).
Likhota J., Skjorringe T., Thomsen LB at Moos T. Paghahatid ng mga macromolecular na gamot sa utak gamit ang naka-target na therapy.Journal of Neurochemistry 113, 1–13, 10.1111/j.1471-4159.2009.06544.x (2010).
Brasnjevic, I., Steinbusch, HW, Schmitz, C., at Martinez-Martinez, P. Paghahatid ng mga peptide at protina na gamot sa barrier ng dugo-utak.Prog Neurobiol 87, 212–251, 10.1016/j.pneurobio.2008.12.002 (2009).
Pardridge, WM Ang hadlang sa dugo-utak: isang bottleneck sa pagbuo ng gamot sa utak.NeuroRx 2, 3–14, 10.1602/neurorx.2.1.3 (2005).
Johanson, KE, Duncan, JA, Stopa, EG, at Byrd, A. Mga prospect para sa pinahusay na paghahatid ng gamot at pag-target sa utak sa pamamagitan ng choroid plexus-CSF pathway.Pharmaceutical Research 22, 1011–1037, 10.1007/s11095-005-6039-0 (2005).
Pardridge, WM Modernization ng biopharmaceuticals na may molekular na Trojan horse para sa paghahatid ng utak.Bioconjug Chem 19, 1327–1338, 10.1021/bc800148t (2008).
Pardridge, WM receptor-mediated peptide transport sa buong blood-brain barrier.Endocr Rev. 7, 314–330 (1986).
Niewoehner, J. et al.Palakihin ang pagtagos sa utak at pagiging epektibo ng mga therapeutic antibodies gamit ang mga monovalent molecular shuttle.Neuron 81, 49–60, 10.1016/j.neuron.2013.10.061 (2014).
Bien-Lee, N. et al.Tinutukoy ng transportasyon ng transferrin receptor (TfR) ang brain uptake ng mga variant ng affinity ng TfR antibodies.J Exp Med 211, 233–244, 10.1084/jem.20131660 (2014).