Ang ilang mga paksa sa pag-troubleshoot ng LC ay hindi kailanman luma, dahil may mga isyu sa pagsasanay sa LC, kahit na bumubuti ang teknolohiya ng instrumento sa paglipas ng panahon. Maraming mga paraan kung saan maaaring magkaroon ng mga problema sa isang LC system at mauwi sa hindi magandang hugis.
Nakakatuwang isulat ang column na "LC Troubleshooting" na ito at nag-iisip tungkol sa mga paksa bawat buwan, dahil ang ilang mga paksa ay hindi nawawala sa istilo. Habang nasa larangan ng chromatography, magsaliksik ng ilang paksa o ideya dahil napapalitan sila ng mas bago at mas mahuhusay na ideya, sa larangan ng pag-troubleshoot, dahil ang unang artikulo sa pag-troubleshoot ay lumabas sa journal na ito (ang ilang mga paksa sa nakaraang taon19)O (mula nang may kaugnayan ang ilang paksa sa mga nakaraang taon19)O(ang ilang mga paksa sa nakaraang taon)O ay may kaugnayan pa rin. Nakatuon ako ng ilang seksyon ng LC Troubleshooting sa mga kontemporaryong trend na nakakaapekto sa liquid chromatography (LC) (halimbawa, ang relatibong paghahambing ng aming pag-unawa sa epekto ng pressure sa retention [2] New Advances) Ang aming interpretasyon sa mga resulta ng LC at kung paano mag-troubleshoot gamit ang mga modernong instrumento ng LC. pag-troubleshoot — ang mga elemento na mahusay para sa anumang troubleshooter ay mahalaga, anuman ang edad ng system na ginagamit namin. Ang pangunahing paksa ng seryeng ito ay lubos na nauugnay sa sikat na “LC Troubleshooting Guide” ng LCGC na wall chart (4) na nakasabit sa maraming laboratoryo. Para sa ikatlong bahagi ng seryeng ito, pinili kong tumuon sa mga isyu na may kaugnayan sa peak shape o peak na katangian, ang 4 ay maaaring isaalang-alang ang iba't ibang listahan ng peak! ng mga isyung ito nang detalyado sa isang artikulo, kaya sa unang yugto na ito sa paksa, tututukan ko ang ilan sa mga madalas kong nakikita. Umaasa ako na ang mga bata at matatandang gumagamit ng LC ay makakahanap ng ilang kapaki-pakinabang na tip at paalala sa mahalagang paksang ito.
Nakikita ko ang aking sarili na lalong sumasagot sa mga tanong sa pag-troubleshoot gamit ang "kahit ano ay posible". Ang tugon na ito ay maaaring mukhang madali kapag isinasaalang-alang ang mga obserbasyon na mahirap bigyang-kahulugan, ngunit sa tingin ko ito ay madalas na naaangkop. Sa maraming posibleng dahilan ng mahinang hugis ng peak, mahalagang panatilihing bukas ang isip kapag isinasaalang-alang kung ano ang maaaring maging problema, at upang mabigyang-priyoridad ang mga potensyal na dahilan upang simulan ang aming mga pagsusumikap sa pag-troubleshoot, na tumutuon sa mga pinakamahalagang bagay, posible.
Ang isang mahalagang hakbang sa anumang ehersisyo sa pag-troubleshoot — ngunit ang isa na sa tingin ko ay minamaliit — ay ang pagkilala na may problemang kailangang lutasin. Ang pagkilala na may problema ay kadalasang nangangahulugan ng pagkilala na ang nangyayari sa tool ay iba sa aming mga inaasahan, na hinubog ng teorya, empirical na kaalaman, at karanasan (5). , nangungunang gilid, tailing, atbp.), ngunit gayundin sa lapad.Ang aming mga inaasahan para sa aktwal na hugis ng peak ay simple.Ang teorya (6) ay lubos na sumusuporta sa inaasahan sa aklat-aralin na, sa karamihan ng mga kaso, ang mga chromatographic peak ay dapat na simetriko at umaayon sa hugis ng isang Gaussian distribution, tulad ng ipinapakita sa Figure 1a. Ano ang inaasahan namin mula sa peak width ng iba pang tatalakayin sa artikulong ito sa hinaharap. e 1 ay nagpapakita ng ilan sa iba pang mga posibilidad na maaaring obserbahan—sa madaling salita, ang ilan sa mga paraan na maaaring magkamali.
Kung minsan, ang mga taluktok ay hindi naoobserbahan sa chromatogram kung saan ang mga ito ay inaasahang ma-eluted. Ang wall chart sa itaas ay nagpapahiwatig na ang kawalan ng peak (ipagpalagay na ang sample ay aktwal na naglalaman ng target analyte sa isang konsentrasyon na dapat gawin ang pagtugon ng detector na sapat upang makita ito sa itaas ng ingay) ay karaniwang nauugnay sa ilang isyu sa instrumento o hindi tamang mga kondisyon ng mobile phase (kung naobserbahan man).mga taluktok, kadalasan ay masyadong "mahina"). Ang isang maikling listahan ng mga potensyal na problema at solusyon sa kategoryang ito ay makikita sa Talahanayan I.
Gaya ng nabanggit sa itaas, ang tanong kung gaano karaming peak broadening ang dapat tiisin bago bigyang-pansin at subukang ayusin ito ay isang kumplikadong paksa na tatalakayin ko sa isang artikulo sa hinaharap. Ang aking karanasan ay ang makabuluhang paglawak ng peak ay kadalasang sinasamahan ng isang makabuluhang pagbabago sa peak na hugis, at ang peak tailing ay mas karaniwan kaysa sa pre-peak o splitting. Gayunpaman, ang mga nominally simetriko na mga peak ay maaaring sanhi din ng ilang iba't ibang mga dahilan:
Ang bawat isa sa mga isyung ito ay tinalakay nang detalyado sa mga nakaraang isyu ng Troubleshooting LC, at ang mga mambabasang interesado sa mga paksang ito ay maaaring sumangguni sa mga nakaraang artikulo para sa impormasyon sa mga ugat na sanhi at mga potensyal na solusyon sa mga isyung ito.Higit pang mga detalye.
Ang peak tailing, peak fronting, at splitting ay maaaring lahat ay sanhi ng kemikal o pisikal na phenomena, at ang listahan ng mga potensyal na solusyon sa mga problemang ito ay malawak na nag-iiba, depende sa kung tayo ay nakikitungo sa isang kemikal o pisikal na problema.Kadalasan, sa pamamagitan ng paghahambing ng iba't ibang mga taluktok sa isang chromatogram, mahahanap mo ang mahahalagang pahiwatig kung alin ang may kasalanan. Kung ang lahat ng peak ay malamang na magkapareho ang hugis o hindi isang chromatogram. apektado, ngunit ang iba ay mukhang maayos, ang sanhi ay malamang na kemikal.
Ang mga kemikal na sanhi ng peak tailing ay masyadong kumplikado upang talakayin sa madaling sabi dito. Ang interesadong mambabasa ay tinutukoy ang kamakailang isyu ng "LC Troubleshooting" para sa isang mas malalim na talakayan (10). Gayunpaman, ang isang madaling bagay na subukan ay upang bawasan ang masa ng injected analyte at tingnan kung ang peak shape ay bumubuti. Kung gayon, ito ay isang magandang palatandaan na ang problema ay napakaliit, ang problema ay dapat na maliit na pahiwatig na ang problema." o dapat baguhin ang mga kundisyon ng chromatographic upang makakuha ng magagandang peak na hugis kahit na may mas malaking masa na iniksyon.
Mayroon ding maraming potensyal na pisikal na dahilan para sa peak tailing. Ang mga mambabasa na interesado sa isang detalyadong talakayan ng mga posibilidad ay tinutukoy sa isa pang kamakailang isyu ng "LC Troubleshooting" (11). Isa sa mga mas karaniwang pisikal na sanhi ng peak tailing ay ang mahinang koneksyon sa isang punto sa pagitan ng injector at detector (12). Isang matinding halimbawa ang ipinapakita sa Figure 1d na ito, na hindi namin ginamit sa isang bagong sistema ng pag-injection noong nakaraang linggo. dati, at nag-install ng maliit na volume injection loop na may ferrule na hinulma sa stainless steel na capillary.Pagkatapos ng ilang paunang eksperimento sa pag-troubleshoot, napagtanto namin na ang lalim ng port sa stator ng injection valve ay mas malalim kaysa nakasanayan namin, na nagreresulta sa malaking dead volume sa ilalim ng port.
Ang mga peak fronts tulad ng mga ipinakita sa Figure 1e ay maaari ding sanhi ng mga pisikal o kemikal na problema.a karaniwang pisikal na sanhi ng nangungunang gilid ay ang butil na kama ng haligi ay hindi maayos na nakaimpake, o na ang mga particle ay muling naayos sa paglipas ng panahon.as na may rurok na tailing sanhi ng pisikal na kababalaghan na ito, ang pinakamahusay na paraan upang ayusin ito ay madalas na mapalitan ang haligi at tinawag natin na hindi tinatawag na pag-iwas "na may kemikal na nagmula sa kung ano ang tinawag natin" na tinatawag na ". (linear) mga kondisyon, ang halaga ng analyte na pinanatili ng nakatigil na yugto (samakatuwid, ang kadahilanan ng pagpapanatili) ay magkakasamang nauugnay sa konsentrasyon ng analyte sa haligi.Chromatographically, nangangahulugan ito na habang ang masa ng analyte na na-injected sa pagtaas ng haligi, ang rurok ay nagiging mas mataas, ngunit hindi mas malawak. Ang mga linear na hugis ay tumutukoy sa hugis ng mga chromatographic peaks, na nagreresulta sa mga nangunguna o trailing mga gilid.as na may labis na labis na labis na labis na sanhi ng rurok na tailing (10), ang rurok na nangunguna na sanhi ng hindi pagpapanatili ng nonlinear ay maaari ring masuri sa pamamagitan ng pagbabawas ng iniksyon na pag -iniksyon ng mass.if ang nangungunang gilid, o ang mga kundisyon ay hindi mababago upang mabawasan ang pag -uugali na ito na nagiging sanhi ng nangungunang gilid, o ang mga kundisyon ng chromatographic ay dapat na mabago upang mabawasan ang pag -uugali na ito.
Minsan ay napapansin natin kung ano ang lumilitaw na isang "split" na peak, tulad ng ipinapakita sa Figure 1f. Ang unang hakbang sa paglutas ng problemang ito ay upang matukoy kung ang tuktok na hugis ay dahil sa bahagyang co-elution (ibig sabihin, ang pagkakaroon ng dalawang magkaibang ngunit malapit na eluting compounds). Ang mga ks ay nauugnay sa pisikal na Pagganap ay walang kinalaman sa mismong column.Kadalasan, ang pinakamahalagang clue sa desisyong ito ay kung ang lahat ng peak sa chromatogram ay nagpapakita ng mga split shape, o isa o dalawa lang. Kung isa o dalawa lang ito, malamang na ito ay isang co-elution na isyu;kung ang lahat ng mga taluktok ay nahati, malamang na ito ay isang pisikal na isyu, malamang na nauugnay sa mismong column.
Ang mga split peak na nauugnay sa mga pisikal na katangian ng mismong column ay kadalasang dahil sa bahagyang naka-block na inlet o outlet frits, o muling pagsasaayos ng mga particle sa column, na nagbibigay-daan sa mobile phase na dumaloy nang mas mabilis kaysa sa mobile phase sa ilang partikular na lugar ng column channel formation .sa ibang mga rehiyon (11). Ang bahagyang barado na frit ay minsan ay maaaring i-clear sa pamamagitan ng pag-reverse ng daloy sa column;gayunpaman, sa aking karanasan, ito ay karaniwang isang panandalian sa halip na isang pangmatagalang solusyon. Ito ay kadalasang nakamamatay sa mga modernong column kung ang mga particle ay muling pinagsama sa loob ng column. Sa puntong ito, pinakamahusay na palitan ang column at magpatuloy.
Ang peak sa Figure 1g, mula rin sa isang kamakailang instance sa sarili kong lab, ay kadalasang nagpapahiwatig na ang signal ay napakataas na umabot na ito sa mataas na dulo ng response range. Para sa mga optical absorbance detector (UV-vis sa kasong ito), kapag ang analyte concentration ay napakataas, ang analyte ay sumisipsip ng halos lahat ng liwanag na dumadaan sa detector flow cell, na nag-iiwan ng napakakaunting liwanag mula sa mga impluwensyang ito ng mga de-koryenteng mga kondisyon, ang walang natukoy na impluwensya ng mga de-koryenteng impluwensyang ito. ise, tulad ng stray light at "dark current", na ginagawang masyadong "fuzzy" ang signal sa hitsura at independiyente sa konsentrasyon ng analyte.Kapag nangyari ito, kadalasang madaling maresolba ang problema sa pamamagitan ng pagbabawas ng dami ng iniksyon ng analyte—pagbabawas ng dami ng iniksyon, pagtunaw ng sample, o pareho.
Sa paaralan ng chromatography, ginagamit namin ang signal ng detector (ibig sabihin, ang y-axis sa chromatogram) bilang indicator ng konsentrasyon ng analyte sa sample. Kaya parang kakaiba na makakita ng chromatogram na may signal na mas mababa sa zero, dahil ang simpleng interpretasyon ay nagpapahiwatig ito ng negatibong analyte na konsentrasyon - na siyempre ay hindi pisikal na posible. Sa aking karanasan, ang mga negatibong peak ay madalas na na-detect kapag gumagamit ng optical-visors.
Sa kasong ito, ang negatibong peak ay nangangahulugan lamang na ang mga molekula na lumalabas mula sa column ay sumisipsip ng mas kaunting liwanag kaysa sa mismong mobile phase kaagad bago at pagkatapos ng peak. Ito ay maaaring mangyari, halimbawa, kapag gumagamit ng medyo mababa ang detection na wavelength (<230 nm) at mga mobile phase additives na sumisipsip ng karamihan ng liwanag sa mga wavelength na ito. Ang mga naturang additives ay maaaring maging mobile phase na solvent na mga bahagi o peak na maaaring gumamit ng mga bahaging actual na solvent gaya ng O pea. libration curve at makakuha ng tumpak na dami ng impormasyon, kaya walang pangunahing dahilan upang maiwasan ang mga ito sa bawat isa (ang paraang ito ay tinutukoy kung minsan bilang "hindi direktang UV detection") (13). Gayunpaman, kung talagang gusto nating maiwasan ang mga negatibong peak sa kabuuan, sa kaso ng absorbance detection, ang pinakamahusay na solusyon ay gumamit ng ibang wavelength ng detection upang ang analyte ng phase ay sumisipsip o mas mababa sa mobile phase kaysa sa bahaging iyon ng mobile.
Ang mga negatibong peak ay maaari ding lumabas kapag gumagamit ng refractive index (RI) detection kapag ang refractive index ng mga bahagi maliban sa analyte sa sample, gaya ng solvent matrix, ay iba sa refractive index ng mobile phase. Nangyayari din ito sa UV-vis detection, ngunit ang epektong ito ay may posibilidad na mapahina kumpara sa RI detection. Sa parehong mga kaso, ang mga matrix na mas malapit sa matrix ay maaaring i-minimize ng mga bahagi ng sample.
Sa ikatlong bahagi ng pangunahing paksa ng pag-troubleshoot ng LC, tinalakay ko ang mga sitwasyon kung saan ang naobserbahang peak shape ay naiiba sa inaasahan o normal na peak shape. Ang epektibong pag-troubleshoot ng mga naturang problema ay nagsisimula sa kaalaman sa inaasahang peak shapes (batay sa teorya o naunang karanasan sa mga kasalukuyang pamamaraan), kaya ang mga deviations mula sa mga expectations na ito ay kitang-kita. Peak shape problems have many different potential reasons, I discussed this edge, etc. madalas.Ang pag-alam sa mga detalyeng ito ay nagbibigay ng magandang lugar upang simulan ang pag-troubleshoot, ngunit hindi nakukuha ang lahat ng posibilidad. Ang mga mambabasa na interesado sa isang mas malalim na listahan ng mga sanhi at solusyon ay maaaring sumangguni sa wall chart ng LCGC na “LC Troubleshooting Guide”.
(4) Wall chart na “LC Troubleshooting Guide” ng LCGC.https://www.chromatographyonline.com/view/troubleshooting-wallchart (2021).
(6) A. Felinger, Pagsusuri ng Data at Pagproseso ng Signal sa Chromatography (Elsevier, New York, NY, 1998), pp. 43-96.
(8) Wahab MF, Dasgupta PK, Kadjo AF at Armstrong DW, Anal.Chim.Journal.Rev.907, 31–44 (2016).https://doi.org/10.1016/j.aca.2015.11.043.