Ang ilang mga paksa sa pag-troubleshoot ng LC ay hindi kailanman luma, dahil may mga isyu sa pagsasanay sa LC, kahit na bumubuti ang teknolohiya ng instrumento sa paglipas ng panahon. Maraming paraan kung saan maaaring magkaroon ng mga problema sa isang LC system at mauwi sa hindi magandang hugis.
Nakakatuwang isulat ang column na "LC Troubleshooting" na ito at nag-iisip tungkol sa mga paksa bawat buwan, dahil ang ilang paksa ay hindi nauubusan ng istilo. Habang nasa larangan ng chromatography, magsaliksik ng ilang paksa o ideya dahil napapalitan sila ng mas bago at mas mahuhusay na ideya, sa larangan ng pag-troubleshoot, dahil ang unang artikulo sa pag-troubleshoot ay lumabas sa journal na ito (ang LC Journal ay may kaugnayan pa rin sa panahong iyon)19 (mula nang may kaugnayan pa rin ang ilang paksa sa LC) noong panahong iyon). sa nakalipas na ilang taon, nag-focus ako sa ilang seksyon ng LC Troubleshooting sa mga kontemporaryong trend na nakakaapekto sa liquid chromatography (LC) (halimbawa, ang relatibong paghahambing ng aming pag-unawa sa epekto ng pressure sa retention [2] New Advances) Ang aming interpretasyon ng mga resulta ng LC at kung paano mag-troubleshoot gamit ang modernong LC instruments. Ang mga paksang "buhay at kamatayan" ng pag-troubleshoot ng LC — ang mga elemento na mahusay para sa anumang troubleshooter ay mahalaga, anuman ang edad ng system na ginagamit namin. Ang pangunahing paksa ng seryeng ito ay lubos na nauugnay sa sikat na "LC Troubleshooting Guide" na wall chart (4) ng LCGC na nakabitin sa maraming laboratoryo. Para sa ikatlong bahagi ng seryeng ito, pinili kong tumuon sa mga isyung may kaugnayan sa peak4, peak na listahan4. iba't ibang mga potensyal na sanhi ng mahinang hugis ng peak!Hindi namin maaaring isaalang-alang ang lahat ng mga isyung ito nang detalyado sa isang artikulo, kaya sa unang yugto na ito sa paksa, tututukan ko ang ilan sa mga madalas kong nakikita. Sana ang mga bata at matatandang gumagamit ng LC ay makahanap ng ilang kapaki-pakinabang na tip at paalala sa mahalagang paksang ito.
Nakikita ko ang aking sarili na lalong sumasagot sa mga tanong sa pag-troubleshoot gamit ang "kahit ano ay posible". Ang tugon na ito ay maaaring mukhang madali kapag isinasaalang-alang ang mga obserbasyon na mahirap bigyang-kahulugan, ngunit sa tingin ko ito ay madalas na naaangkop. Sa maraming posibleng dahilan ng mahinang hugis ng peak, mahalagang panatilihing bukas ang isip kapag isinasaalang-alang kung ano ang maaaring maging problema, at upang mabigyang-priyoridad ang mga potensyal na dahilan upang simulan ang aming mga pagsusumikap sa pag-troubleshoot, na tumutuon sa mga pinakamahalagang bagay, posible.
Ang isang mahalagang hakbang sa anumang ehersisyo sa pag-troubleshoot — ngunit ang isa na sa tingin ko ay minamaliit — ay ang pagkilala na may problemang kailangang lutasin. Ang pagkilala na may problema ay kadalasang nangangahulugan ng pagkilala na ang nangyayari sa tool ay iba sa aming mga inaasahan, na hinubog ng teorya, empirical na kaalaman, at karanasan (5). makinis, mahimulmol, nangunguna sa gilid, tailing, atbp.), ngunit gayundin sa lapad. Ang aming mga inaasahan para sa aktwal na hugis ng peak ay simple. Ang teorya (6) ay lubos na sumusuporta sa pag-asa sa aklat-aralin na, sa karamihan ng mga kaso, ang mga chromatographic peak ay dapat na simetriko at umaayon sa hugis ng isang Gaussian distribution, tulad ng ipinapakita sa Figure 1a. Ang inaasahan namin sa hinaharap na isyu at isang mas kumplikadong paksa ay isang mas kumplikadong paksa na tatalakayin namin mula sa isang peak sa hinaharap. artikulo. Ang iba pang mga peak na hugis sa Figure 1 ay nagpapakita ng ilan sa iba pang mga posibilidad na maaaring maobserbahan—sa madaling salita, ang ilan sa mga paraan na maaaring magkamali.
Kung minsan, ang mga taluktok ay hindi naoobserbahan sa chromatogram kung saan ang mga ito ay inaasahang ma-eluted. Ang wall chart sa itaas ay nagpapahiwatig na ang kawalan ng peak (ipagpalagay na ang sample ay aktwal na naglalaman ng target analyte sa isang konsentrasyon na dapat gawin ang pagtugon ng detector na sapat upang makita ito sa itaas ng ingay) ay karaniwang nauugnay sa ilang isyu sa instrumento o hindi tamang mga kondisyon ng mobile phase (kung naobserbahan man). mga taluktok, kadalasan ay masyadong "mahina"). Ang isang maikling listahan ng mga potensyal na problema at solusyon sa kategoryang ito ay makikita sa Talahanayan I.
Gaya ng nabanggit sa itaas, ang tanong kung gaano karaming peak broadening ang dapat tiisin bago bigyang pansin at subukang ayusin ito ay isang kumplikadong paksa na tatalakayin ko sa isang artikulo sa hinaharap. Ang aking karanasan ay ang makabuluhang paglawak ng peak ay kadalasang sinasamahan ng isang makabuluhang pagbabago sa peak na hugis, at ang peak tailing ay mas karaniwan kaysa sa pre-peak o splitting. Gayunpaman, ang mga nominally simetriko na mga peak ay maaaring sanhi din ng ilang mga iba't ibang dahilan:
Ang bawat isa sa mga isyung ito ay tinalakay nang detalyado sa mga nakaraang isyu ng Troubleshooting LC, at ang mga mambabasang interesado sa mga paksang ito ay maaaring sumangguni sa mga nakaraang artikulo para sa impormasyon sa mga ugat na sanhi at mga potensyal na solusyon sa mga isyung ito. Higit pang mga detalye.
Ang peak tailing, peak fronting, at splitting ay maaaring lahat ay sanhi ng kemikal o pisikal na phenomena, at ang listahan ng mga potensyal na solusyon sa mga problemang ito ay malawak na nag-iiba, depende sa kung tayo ay nakikitungo sa isang kemikal o pisikal na problema.Kadalasan, sa pamamagitan ng paghahambing ng iba't ibang mga taluktok sa isang chromatogram, mahahanap mo ang mahahalagang pahiwatig kung alin ang may kasalanan. Kung ang lahat ng mga peak ay malamang na magkapareho ang hugis o hindi chromatogram. ang ilang mga taluktok ay apektado, ngunit ang iba ay mukhang maayos, ang sanhi ay malamang na kemikal.
Ang mga kemikal na sanhi ng peak tailing ay masyadong kumplikado upang talakayin sa madaling sabi dito. Ang interesadong mambabasa ay tinutukoy ang kamakailang isyu ng "LC Troubleshooting" para sa isang mas malalim na talakayan (10). Gayunpaman, ang isang madaling bagay na subukan ay upang bawasan ang mass ng injected analyte at tingnan kung ang tuktok na hugis ay bumubuti. Kung gayon, kung gayon ito ay isang magandang pahiwatig na ito ay isang maliit na kaso, ang paraan ay dapat na limitado ang problema." ang mga masa ng analyte, o ang mga kundisyon ng chromatographic ay dapat na baguhin upang makakuha ng magandang peak na mga hugis kahit na may mas malaking masa na iniksyon.
Marami ring potensyal na pisikal na dahilan para sa peak tailing. Ang mga mambabasa na interesado sa isang detalyadong talakayan ng mga posibilidad ay tinutukoy sa isa pang kamakailang isyu ng "LC Troubleshooting" (11). Isa sa mga mas karaniwang pisikal na sanhi ng peak tailing ay ang mahinang koneksyon sa isang punto sa pagitan ng injector at detector (12). Isang matinding halimbawa ang ipinapakita sa Figure 1d na ito, na nakuha namin sa isang bagong sistema ng pag-injection noong nakaraang linggo. na hindi pa namin nagamit noon, at nag-install ng maliit na volume injection loop na may ferrule na hinulma sa stainless steel na capillary. Pagkatapos ng ilang paunang pag-troubleshoot na mga eksperimento, napagtanto namin na ang lalim ng port sa injection valve stator ay mas malalim kaysa sa nakasanayan namin, na nagreresulta sa isang malaking dead volume sa ilalim ng port. Ang problemang ito ay madaling malutas sa pamamagitan ng pag-aayos ng isang tube ferru na posisyon, madaling malutas ang problemang ito sa pamamagitan ng pagpapalit ng tamang posisyon ng tubeferru. dead volume sa ilalim ng port.
Ang mga peak front tulad ng ipinapakita sa Figure 1e ay maaari ding sanhi ng pisikal o kemikal na mga problema. Ang isang karaniwang pisikal na sanhi ng nangungunang gilid ay ang particle bed ng column ay hindi maayos na nakaimpake, o ang mga particle ay muling naayos sa paglipas ng panahon. Gaya ng peak tailing na dulot ng pisikal na phenomenon na ito, ang pinakamahusay na paraan upang ayusin ito ay ang palitan ang column at magpatuloy. "non-linear" na mga kondisyon sa pagpapanatili. Sa ilalim ng perpektong (linear) na mga kondisyon, ang dami ng analyte na napanatili ng nakatigil na yugto (kaya, ang retention factor) ay linear na nauugnay sa konsentrasyon ng analyte sa column. Chromatographically, nangangahulugan ito na habang ang mass ng analyte na na-inject sa column ay tumataas, ang peak ay nagiging mas mataas ang peak, ngunit hindi mas malawak ang retention na ito, ngunit hindi mas malawak ang retention na ito. hindi lamang nagiging mas matangkad ngunit mas lumalawak din habang mas maraming masa ang ini-inject. Dagdag pa rito, ang mga nonlinear na hugis ay tumutukoy sa hugis ng mga chromatographic peak, na nagreresulta sa leading o trailing edges. Gaya ng mass overload na nagdudulot ng peak tailing (10), ang peak leading na dulot ng nonlinear retention ay maaari ding masuri sa pamamagitan ng pagbabawas ng injected na sanhi ng pag-analyte ay dapat na pagbutihin ang kalidad ng mass. gilid, o dapat baguhin ang mga kundisyon ng chromatographic upang mabawasan ang pag-uugaling ito.
Minsan ay napapansin natin kung ano ang tila "split" na peak, tulad ng ipinapakita sa Figure 1f. Ang unang hakbang sa paglutas ng problemang ito ay upang matukoy kung ang tuktok na hugis ay dahil sa bahagyang co-elution (ibig sabihin, ang pagkakaroon ng dalawang magkaibang ngunit malapit na eluting compound). Ang mga "split" na peak ay nauugnay sa pisikal na Performance ay walang kinalaman sa mismong column.Kadalasan, ang pinakamahalagang clue sa desisyong ito ay kung ang lahat ng peak sa chromatogram ay nagpapakita ng mga split shape, o isa o dalawa lang. Kung isa o dalawa lang ito, malamang na ito ay isang co-elution na isyu; kung ang lahat ng mga taluktok ay nahati, malamang na ito ay isang pisikal na isyu, malamang na nauugnay sa mismong column.
Ang mga split peak na nauugnay sa mga pisikal na katangian ng mismong column ay kadalasang dahil sa bahagyang naka-block na inlet o outlet frits, o muling pagsasaayos ng mga particle sa column, na nagbibigay-daan sa mobile phase na dumaloy nang mas mabilis kaysa sa mobile phase sa ilang partikular na lugar ng column channel formation .sa ibang mga rehiyon (11). Ang bahagyang barado na frit ay minsan ay maaaring i-clear sa pamamagitan ng pag-reverse ng daloy sa column; gayunpaman, sa aking karanasan, ito ay karaniwang isang panandalian sa halip na isang pangmatagalang solusyon. Ito ay kadalasang nakamamatay sa mga modernong column kung ang mga particle ay muling pinagsama sa loob ng column. Sa puntong ito, pinakamahusay na palitan ang column at magpatuloy.
Ang peak sa Figure 1g, mula rin sa isang kamakailang instance sa sarili kong lab, ay kadalasang nagpapahiwatig na ang signal ay napakataas na umabot na ito sa mataas na dulo ng response range. Para sa mga optical absorbance detector (UV-vis sa kasong ito), kapag ang analyte concentration ay napakataas, ang analyte ay sumisipsip ng halos lahat ng liwanag na dumadaan sa detector flow cell, na nag-iiwan ng napakakaunting liwanag mula sa mga de-koryenteng kondisyong ito na nade-detect, ang UV-vis sa kasong ito, kapag ang analyte concentration ay napakataas, ang analyte ay sumisipsip ng karamihan sa liwanag na dumadaan sa detector flow cell, na nag-iiwan ng napakakaunting liwanag mula sa mga kundisyong ito ng de-koryenteng natutukoy. sa pamamagitan ng iba't ibang pinagmumulan ng ingay, tulad ng ligaw na liwanag at "dark current", na ginagawang "malabo" ang signal sa hitsura at hindi nakasalalay sa konsentrasyon ng analyte. Kapag nangyari ito, kadalasang madaling maresolba ang problema sa pamamagitan ng pagbabawas ng dami ng iniksyon ng analyte—pagbabawas ng dami ng iniksyon, pagtunaw ng sample, o pareho.
Sa paaralan ng chromatography, ginagamit namin ang signal ng detector (ibig sabihin, ang y-axis sa chromatogram) bilang indicator ng konsentrasyon ng analyte sa sample. Kaya parang kakaiba na makakita ng chromatogram na may signal na mas mababa sa zero, dahil ang simpleng interpretasyon ay nagpapahiwatig ito ng negatibong analyte na konsentrasyon - na siyempre ay hindi pisikal na posible. Sa aking karanasan, ang mga negatibong peak ay madalas na na-detect kapag gumagamit ng optical-visors.
Sa kasong ito, ang negatibong peak ay nangangahulugan lamang na ang mga molekula na lumalabas mula sa column ay sumisipsip ng mas kaunting liwanag kaysa sa mismong mobile phase kaagad bago at pagkatapos ng peak. Ito ay maaaring mangyari, halimbawa, kapag gumagamit ng medyo mababa ang detection na wavelength (<230 nm) at mga mobile phase additives na sumisipsip ng karamihan ng liwanag sa mga wavelength na ito. Ang mga naturang additives ay maaaring aktwal na gumamit ng mga bahagi ng solvent na bahagi ng mobile tulad ng mga negatibong bahagi ng methanol. mga taluktok upang maghanda ng isang curve ng pagkakalibrate at makakuha ng tumpak na dami ng impormasyon, kaya walang pangunahing dahilan upang maiwasan ang mga ito sa bawat isa (ang pamamaraang ito ay minsan ay tinutukoy bilang "hindi direktang pagtuklas ng UV") (13). Gayunpaman, kung talagang gusto nating maiwasan ang mga negatibong taluktok nang buo, sa kaso ng pag-detect ng absorbance, ang pinakamahusay na solusyon ay ang gumamit ng ibang wavelength ng pagtuklas, upang mas mababago ang bahagi ng mobile na iyon kaysa sa bahagi ng mobile na sumisipsip ng mas kaunting bahagi kaysa sa mobile phase. magaan kaysa sa mga analyte.
Ang mga negatibong peak ay maaari ding lumitaw kapag gumagamit ng refractive index (RI) detection kapag ang refractive index ng mga bahagi maliban sa analyte sa sample, tulad ng solvent matrix, ay iba sa refractive index ng mobile phase. Nangyayari rin ito sa UV-vis detection, ngunit ang epektong ito ay may posibilidad na mapahina kumpara sa RI detection. Sa parehong mga kaso, ang pagtutugma ng mga negatibong peak ng sample ay maaaring mas malapit sa mas malapit na komposisyon. ang mobile phase.
Sa ikatlong bahagi sa pangunahing paksa ng pag-troubleshoot ng LC, tinalakay ko ang mga sitwasyon kung saan ang naobserbahang hugis ng peak ay naiiba sa inaasahan o normal na peak shape. Ang epektibong pag-troubleshoot ng mga naturang problema ay nagsisimula sa kaalaman sa mga inaasahang peak shapes (batay sa teorya o naunang karanasan sa mga umiiral na pamamaraan), kaya ang mga paglihis mula sa mga inaasahan na ito ay kitang-kita. Ang mga problema sa peak shape ay may maraming iba't ibang mga potensyal na dahilan, nangunguna ako sa ilang mga potensyal na dahilan (nangunguna sa malawak na bahagi, atbp. ang mga dahilan na madalas kong nakikita. Ang pag-alam sa mga detalyeng ito ay nagbibigay ng magandang lugar upang simulan ang pag-troubleshoot, ngunit hindi nakukuha ang lahat ng posibilidad. Ang mga mambabasa na interesado sa isang mas malalim na listahan ng mga sanhi at solusyon ay maaaring sumangguni sa LCGC “LC Troubleshooting Guide” wall chart.
(4) Wall chart na “LC Troubleshooting Guide” ng LCGC.https://www.chromatographyonline.com/view/troubleshooting-wallchart (2021).
(6) A. Felinger, Pagsusuri ng Data at Pagproseso ng Signal sa Chromatography (Elsevier, New York, NY, 1998), pp. 43-96.
(8) Wahab MF, Dasgupta PK, Kadjo AF at Armstrong DW, Anal.Chim.Journal.Rev. 907, 31–44 (2016).https://doi.org/10.1016/j.aca.2015.11.043.