Salamat sa pagbisita sa Nature.com.Ang bersyon ng browser na iyong ginagamit ay may limitadong suporta sa CSS.Para sa pinakamagandang karanasan, inirerekomenda namin na gumamit ka ng na-update na browser (o huwag paganahin ang Compatibility Mode sa Internet Explorer).Pansamantala, upang matiyak ang patuloy na suporta, ire-render namin ang site nang walang mga istilo at JavaScript.
Ang Liquid biopsy (LB) ay isang konsepto na mabilis na nagiging popular sa larangan ng biomedical.Ang konsepto ay pangunahing batay sa pagtuklas ng mga fragment ng nagpapalipat-lipat na extracellular DNA (ccfDNA), na pangunahing inilabas bilang maliliit na fragment pagkatapos ng pagkamatay ng cell sa iba't ibang mga tisyu.Ang isang maliit na proporsyon ng mga fragment na ito ay nagmula sa mga dayuhang (dayuhan) na tisyu o organismo.Sa kasalukuyang gawain, inilapat namin ang konseptong ito sa mga tahong, isang sentinel species na kilala sa kanilang mataas na kapasidad sa pagsasala ng tubig-dagat.Ginagamit namin ang kakayahan ng mga tahong na kumilos bilang mga natural na filter upang makuha ang mga fragment ng DNA sa kapaligiran mula sa iba't ibang mapagkukunan upang magbigay ng impormasyon tungkol sa biodiversity ng mga marine coastal ecosystem.Ipinapakita ng aming mga resulta na ang mussel hemolymph ay naglalaman ng mga fragment ng DNA na malaki ang pagkakaiba sa laki, mula 1 hanggang 5 kb.Ipinakita ng pagkakasunud-sunod ng baril na ang isang malaking bilang ng mga fragment ng DNA ay mula sa dayuhang pinagmulan ng microbial.Kabilang sa mga ito, nakakita kami ng mga fragment ng DNA mula sa bacteria, archaea, at mga virus, kabilang ang mga virus na kilala na nakakahawa sa iba't ibang host na karaniwang matatagpuan sa coastal marine ecosystem.Sa konklusyon, ipinapakita ng aming pag-aaral na ang konsepto ng LB na inilapat sa mga tahong ay kumakatawan sa isang mayaman ngunit hindi pa natutuklasang mapagkukunan ng kaalaman tungkol sa pagkakaiba-iba ng microbial sa marine coastal ecosystem.
Ang epekto ng pagbabago ng klima (CC) sa biodiversity ng marine ecosystem ay isang mabilis na lumalagong lugar ng pananaliksik.Ang pag-init ng mundo ay hindi lamang nagdudulot ng mahahalagang pisyolohikal na stress, ngunit itinutulak din ang mga limitasyon ng ebolusyon ng thermal stability ng mga organismo sa dagat, na nakakaapekto sa tirahan ng isang bilang ng mga species, na nag-udyok sa kanila na maghanap para sa mas kanais-nais na mga kondisyon [1, 2].Bilang karagdagan sa nakakaapekto sa biodiversity ng metazoans, sinisira ng CC ang maselan na balanse ng mga pakikipag-ugnayan ng host-microbial.Ang microbial dysbacteriosis na ito ay nagdudulot ng malubhang banta sa marine ecosystem dahil ginagawa nitong mas madaling kapitan ang mga marine organism sa mga nakakahawang pathogen [3, 4].Ito ay pinaniniwalaan na ang SS ay may mahalagang papel sa mass deaths, na isang seryosong problema para sa pamamahala ng mga global marine ecosystem [5, 6].Ito ay isang mahalagang isyu dahil sa pang-ekonomiya, ekolohikal at nutritional na epekto ng maraming marine species.Ito ay totoo lalo na para sa mga bivalve na naninirahan sa mga polar na rehiyon, kung saan ang mga epekto ng CK ay mas agaran at malala [6, 7].Sa katunayan, ang mga bivalve tulad ng Mytilus spp.ay malawakang ginagamit upang subaybayan ang mga epekto ng CC sa marine ecosystem.Hindi kataka-taka, ang isang medyo malaking bilang ng mga biomarker ay binuo upang masubaybayan ang kanilang kalusugan, madalas na gumagamit ng isang two-tier na diskarte na kinasasangkutan ng mga functional biomarker batay sa aktibidad ng enzymatic o cellular function tulad ng cell viability at phagocytic na aktibidad [8].Kasama rin sa mga pamamaraang ito ang pagsukat ng konsentrasyon ng mga tiyak na tagapagpahiwatig ng presyon na naipon sa malambot na mga tisyu pagkatapos ng pagsipsip ng malalaking halaga ng tubig dagat.Gayunpaman, ang mataas na kapasidad ng pagsasala at semi-open circulatory system ng bivalves ay nagbibigay ng pagkakataon na bumuo ng mga bagong hemolymph biomarker gamit ang konsepto ng liquid biopsy (LB), isang simple at minimally invasive na diskarte sa pamamahala ng pasyente.mga sample ng dugo [9, 10].Bagama't maraming uri ng mga nagpapalipat-lipat na molekula ay matatagpuan sa LB ng tao, ang konseptong ito ay pangunahing batay sa pagsusuri ng pagkakasunud-sunod ng DNA ng mga nagpapalipat-lipat na extracellular DNA (ccfDNA) na mga fragment sa plasma.Sa katunayan, ang pagkakaroon ng nagpapalipat-lipat na DNA sa plasma ng tao ay kilala mula noong kalagitnaan ng ika-20 siglo [11], ngunit nitong mga nakaraang taon lamang na ang pagdating ng mga pamamaraan ng high-throughput na pagkakasunud-sunod ay humantong sa klinikal na pagsusuri batay sa ccfDNA.Ang pagkakaroon ng mga nagpapalipat-lipat na mga fragment ng DNA na ito ay dahil sa bahagi ng passive release ng genomic DNA (nuclear at mitochondrial) pagkatapos ng cell death. Sa mga malulusog na indibidwal, ang konsentrasyon ng ccfDNA ay karaniwang mababa (<10 ng/mL) ngunit maaaring tumaas ng 5-10 beses sa mga pasyenteng dumaranas ng iba't ibang mga pathology o napapailalim sa stress, na nagreresulta sa pagkasira ng tissue. Sa mga malulusog na indibidwal, ang konsentrasyon ng ccfDNA ay karaniwang mababa (<10 ng/mL) ngunit maaaring tumaas ng 5-10 beses sa mga pasyenteng dumaranas ng iba't ibang mga pathology o napapailalim sa stress, na nagreresulta sa pagkasira ng tissue. У здоровых людей концентрация вккДНК в норме низкая (<10 нг/мл), но может повышаться в 5–10 раз ухленой или подвергающихся стрессу, приводящему к повреждению тканей. Sa malusog na tao, ang konsentrasyon ng cccDNA ay karaniwang mababa (<10 ng/mL), ngunit maaari itong tumaas ng 5-10 beses sa mga pasyente na may iba't ibang mga pathologies o sa ilalim ng stress na humahantong sa pinsala sa tissue.在健康个体中，ccfDNA 的浓度通常较低（<10 ng/mL），但在患有各种病理或承受压受受压加1倍，从而导致组织损伤。在 健康 个体 中 ， ccfdna 的 浓度 较 低 （（<10 ng/ml） 但 在 各 种 病理 或 承叛 或 承叛加 5-10 倍 ， 从而 组织。。 损伤 损伤 损伤 损伤 损伤 损伤 损伤 损伤 损伤Концентрации ccfDNA обычно низкие (<10 нг/мл) у здоровых людей, но могут быть увеличены в 5-10 раз у млица ями или стрессом, что приводит к повреждению тканей. Ang mga konsentrasyon ng ccfDNA ay karaniwang mababa (<10 ng/ml) sa mga malulusog na indibidwal, ngunit maaaring tumaas ng 5-10 beses sa mga pasyente na may iba't ibang mga pathologies o stress, na nagreresulta sa pagkasira ng tissue.Ang laki ng mga fragment ng ccfDNA ay malawak na nag-iiba, ngunit kadalasan ay umaabot mula 150 hanggang 200 bp.[12].Ang pagsusuri ng self-derived na ccfDNA, ibig sabihin, ccfDNA mula sa normal o transformed host cells, ay maaaring gamitin upang makita ang genetic at epigenetic na mga pagbabago na naroroon sa nuclear at/o mitochondrial genome, sa gayon ay tinutulungan ang mga clinician na pumili ng mga partikular na molekular na naka-target na mga therapies [13].Gayunpaman, ang ccfDNA ay maaaring makuha mula sa mga dayuhang mapagkukunan tulad ng ccfDNA mula sa mga selula ng pangsanggol sa panahon ng pagbubuntis o mula sa mga transplanted na organo [14,15,16,17].Ang ccfDNA ay isa ring mahalagang mapagkukunan ng impormasyon para sa pag-detect ng pagkakaroon ng mga nucleic acid ng isang nakakahawang ahente (dayuhan), na nagbibigay-daan sa non-invasive na pagtuklas ng mga malawakang impeksiyon na hindi kinilala ng mga kultura ng dugo, pag-iwas sa invasive biopsy ng nahawaang tissue [18].Ipinakita nga ng mga kamakailang pag-aaral na ang dugo ng tao ay naglalaman ng isang mayamang mapagkukunan ng impormasyon na maaaring magamit upang makilala ang mga viral at bacterial pathogens, at ang tungkol sa 1% ng ccfDNA na matatagpuan sa plasma ng tao ay mula sa ibang bansa [19].Ang mga pag-aaral na ito ay nagpapakita na ang biodiversity ng circulating microbiome ng isang organismo ay maaaring masuri gamit ang ccfDNA analysis.Gayunpaman, hanggang kamakailan lamang, ang konsepto na ito ay ginamit nang eksklusibo sa mga tao at, sa isang mas mababang lawak, sa iba pang mga vertebrates [20, 21].
Sa kasalukuyang papel, ginagamit namin ang potensyal ng LB upang pag-aralan ang ccfDNA ng Aulacomya atra, isang southern species na karaniwang matatagpuan sa subantarctic Kerguelen Islands, isang pangkat ng mga isla sa ibabaw ng isang malaking talampas na nabuo 35 milyong taon na ang nakalilipas.pagsabog ng bulkan.Gamit ang isang in vitro experimental system, nalaman namin na ang mga fragment ng DNA sa tubig-dagat ay mabilis na nakukuha ng mga tahong at pumapasok sa hemolymph compartment.Ipinakita ng pagkakasunud-sunod ng shotgun na ang mussel hemolymph ccfDNA ay naglalaman ng mga fragment ng DNA ng sarili nitong pinagmulan at hindi sarili, kabilang ang mga symbiotic bacteria at mga fragment ng DNA mula sa mga biome na tipikal ng malamig na volcanic marine coastal ecosystem.Naglalaman din ang Hemolymph ccfDNA ng mga viral sequence na nagmula sa mga virus na may iba't ibang hanay ng host.Natagpuan din namin ang mga fragment ng DNA mula sa mga multicellular na hayop tulad ng bony fish, sea anemone, algae at mga insekto.Sa konklusyon, ipinapakita ng aming pag-aaral na ang konsepto ng LB ay maaaring matagumpay na mailapat sa mga marine invertebrates upang makabuo ng isang mayamang genomic repertoire sa marine ecosystem.
Ang mga nasa hustong gulang (55-70 mm ang haba) Mytilus platensis (M. platensis) at Aulacomya atra (A. atra) ay nakolekta mula sa intertidal na mabatong baybayin ng Port-au-France (049°21.235 S, 070°13.490 E.).Kerguelen Islands noong Disyembre 2018. Ang iba pang adult blue mussels (Mytilus spp.) ay nakuha mula sa isang komersyal na supplier (PEI Mussel King Inc., Prince Edward Island, Canada) at inilagay sa isang temperature controlled (4°C) aerated tank na naglalaman ng 10–20 L ng 32‰ artificial brine.(artipisyal na sea salt Reef Crystal, Instant Ocean, Virginia, USA).Para sa bawat eksperimento, ang haba at bigat ng mga indibidwal na shell ay sinusukat.
Available online ang isang libreng open access protocol para sa program na ito (https://doi.org/10.17504/protocols.io.81wgb6z9olpk/v1).Sa madaling sabi, ang LB hemolymph ay nakolekta mula sa mga kalamnan ng abductor tulad ng inilarawan [22].Ang hemolymph ay nilinaw sa pamamagitan ng centrifugation sa 1200×g sa loob ng 3 minuto, ang supernatant ay nagyelo (-20°C) hanggang gamitin.Para sa paghihiwalay at paglilinis ng cfDNA, ang mga sample (1.5-2.0 ml) ay lasaw at naproseso gamit ang NucleoSnap cfDNA kit (Macherey-Nagel, Bethlehen, PA) ayon sa mga tagubilin ng tagagawa.Ang ccfDNA ay nakaimbak sa -80 ° C hanggang sa karagdagang pagsusuri.Sa ilang mga eksperimento, ang ccfDNA ay nahiwalay at na-purify gamit ang QIAamp DNA Investigator Kit (QIAGEN, Toronto, Ontario, Canada).Na-quantified ang purified DNA gamit ang isang standard na PicoGreen assay.Ang pamamahagi ng fragment ng nakahiwalay na ccfDNA ay nasuri ng capillary electrophoresis gamit ang isang Agilent 2100 bioanalyzer (Agilent Technologies Inc., Santa Clara, CA) gamit ang isang High Sensitivity DNA Kit.Ang assay ay isinagawa gamit ang 1 µl ng sample ng ccfDNA ayon sa mga tagubilin ng tagagawa.
Para sa pagkakasunud-sunod ng mga fragment ng hemolymph ccfDNA, naghanda si Génome Québec (Montreal, Quebec, Canada) ng mga library ng shotgun gamit ang Illumina DNA Mix kit ng Illumina MiSeq PE75 kit.Isang karaniwang adaptor (BioO) ang ginamit.Ang mga raw data file ay makukuha mula sa NCBI Sequence Read Archive (SRR8924808 at SRR8924809).Ang pangunahing kalidad ng pagbasa ay tinasa gamit ang FastQC [23].Ginamit ang Trimmomatic [24] para sa mga clipping adapter at mahinang kalidad ng mga pagbabasa.Ang mga nabasang shotgun na may magkapares na dulo ay pinagsama ang FLASH sa mas mahabang single read na may minimum na overlap na 20 bp upang maiwasan ang mga mismatch [25]. Ang mga pinagsama-samang pagbabasa ay na-annotate ng BLASTN gamit ang isang bivalve NCBI Taxonomy database (e value <1e−3 at 90% homology), at ang pag-mask ng mga low-complexity na pagkakasunud-sunod ay isinagawa gamit ang DUST [26]. Ang mga pinagsama-samang pagbabasa ay na-annotate ng BLASTN gamit ang isang bivalve NCBI Taxonomy database (e value <1e−3 at 90% homology), at ang pag-mask ng mga low-complexity na pagkakasunud-sunod ay isinagawa gamit ang DUST [26]. Объединенные чтения были аннотированы с помощью BLASTN с использованием базы данных таксономии двустворчорчозлылюм 3 at 90% гомологии), а маскирование последовательностей низкой сложности было выполнено с использованием DUST [26]. Ang mga pinagsama-samang pagbabasa ay na-annotate ng BLASTN gamit ang NCBI bivalve taxonomy database (e value <1e-3 at 90% homology), at ang mababang complexity sequence masking ay isinagawa gamit ang DUST [26].使用双壳类NCBI 分类数据库（e 值< 1e-3 和90% 同源性）用BLASTN 注释合并的读敽的读敽，2广使盻性）用BLASTN 注释合并的读敽，读数，使用读数，使用双壳类复杂度序列的掩蔽。使用 双 壳类 ncbi 分类 （（（<1e-3 和 90% 同源） 用 用 用 注释 合并 读数 ， 蛻数 ， 读数 ，复杂度 序列 的。。。 掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽.蔽Объединенные чтения были аннотированы с помощью BLASTN с использованием таксономической базы данных двуствочслмчат <1e-3 и 90% гомологии), а маскирование последовательностей низкой сложности было выполнено с использованием DUST [26]. Ang mga pinagsama-samang pagbabasa ay na-annotate ng BLASTN gamit ang NCBI bivalve taxonomic database (e value <1e-3 at 90% homology), at ang mababang complexity sequence masking ay isinagawa gamit ang DUST [26].Ang mga nabasa ay nahahati sa dalawang pangkat: nauugnay sa mga pagkakasunud-sunod ng bivalve (dito tinatawag na self-reads) at hindi nauugnay (non-self-reads).Dalawang grupo ang hiwalay na natipon gamit ang MEGAHIT upang makabuo ng contigs [27].Samantala, ang taxonomic distribution ng alien microbiome reads ay inuri gamit ang Kraken2 [28] at graphical na kinakatawan ng isang Krona pie chart sa Galaxy [29, 30].Ang pinakamainam na kmer ay natukoy na kmers-59 mula sa aming mga paunang eksperimento. Ang mga self contig ay pagkatapos ay nakilala sa pamamagitan ng pagkakahanay sa BLASTN (bivalve NCBI database, e value <1e−10 at 60% homology) para sa isang panghuling anotasyon. Ang mga self contig ay pagkatapos ay nakilala sa pamamagitan ng pagkakahanay sa BLASTN (bivalve NCBI database, e value <1e−10 at 60% homology) para sa isang panghuling anotasyon. Затем собственные контиги были идентифицированы путем сопоставления с BLASTN (база данных двустворчатых моллюбиск, 1 ология 60%) для окончательной аннотации. Ang mga self-contig ay pagkatapos ay nakilala sa pamamagitan ng pagtutugma laban sa BLASTN (NCBI bivalve database, e value <1e-10 at 60% homology) para sa panghuling anotasyon.然后通过与BLASTN（双壳贝类NCBI 数据库，e 值< 1e-10 和60% 同源性）对齐来识庫釿自终注释。然后通过与BLASTN（双壳贝类NCBI 数据库，e 值< 1e-10 和60% Затем были идентифицированы собственные контиги для окончательной аннотации путем сопоставления с BLASTN (базал хдмун оллюсков, значение e <1e-10 и гомология 60%). Ang mga self-contig ay pagkatapos ay nakilala para sa panghuling annotation sa pamamagitan ng pagtutugma laban sa BLASTN (NCBI bivalve database, e value <1e-10 at 60% homology). Kaayon, ang nonself group contigs ay na-annotate ng BLASTN (nt NCBI database, e value <1e−10 at 60% homology). Kaayon, ang nonself group contigs ay na-annotate ng BLASTN (nt NCBI database, e value <1e−10 at 60% homology). Параллельно чужеродные групповые контиги были аннотированы с помощью BLASTN (база данных nt NCBI, значение e <1e-10 мио. Kaayon, ang mga dayuhang contigs ng grupo ay na-annotate ng BLASTN (NT NCBI database, e value <1e-10 at 60% homology).平行地，用BLASTN（nt NCBI 数据库，e 值< 1e-10 和60% 同源性）注释非自身组重叠群。平行地，用BLASTN（nt NCBI 数据库，e 值< 1e-10 和60% 同源性）注释非自身组重叠群。 Параллельно контиги, не относящиеся к собственной группе, были аннотированы с помощью BLASTN (база данныгых nt 1 огия 60%). Kaayon, ang non-self group contigs ay na-annotate ng BLASTN (nt NCBI database, e value <1e-10 at 60% homology). Ang BLASTX ay isinagawa din sa mga nonself contigs gamit ang nr at RefSeq protein NCBI databases (e value <1e−10 at 60% homology). Ang BLASTX ay isinagawa din sa mga nonself contigs gamit ang nr at RefSeq protein NCBI databases (e value <1e−10 at 60% homology). BLASTX также был проведен на несамостоятельных контигах с использованием баз данных белка nr и RefSeq NCBI (значогение e <1e%) Ang BLASTX ay isinagawa din sa mga non-self contigs gamit ang nr at RefSeq NCBI protein database (e value <1e-10 at 60% homology).还使用nr 和RefSeq 蛋白NCBI 数据库对非自身重叠群进行了BLASTX（e 值< 1e-10 和） 同60% 。还使用nr 和RefSeq 蛋白NCBI 数据库对非自身重叠群进行了BLASTX（e 值< 1e-10 和） 同60% 。 BLASTX также выполняли на несамостоятельных контигах с использованием баз данных белка nr и RefSeq NCBI (значение e <1e-10 %) Ang BLASTX ay isinagawa din sa mga non-self contigs gamit ang nr at RefSeq NCBI protein database (e value <1e-10 at 60% homology).Ang BLASTN at BLASTX pool ng mga non-self-contigs ay kumakatawan sa mga huling contigs (tingnan ang Karagdagang file).
Ang mga panimulang aklat na ginamit para sa PCR ay nakalista sa Talahanayan S1.Ang Taq DNA polymerase (Bio Basic Canada, Markham, ON) ay ginamit upang palakasin ang mga target na gen ng ccfDNA.Ang mga sumusunod na kondisyon ng reaksyon ay ginamit: denaturation sa 95°C sa loob ng 3 minuto, 95°C sa loob ng 1 minuto, itakda ang annealing temperature sa loob ng 1 minuto, elongation sa 72°C sa loob ng 1 minuto, 35 cycle, at sa wakas ay 72°C sa loob ng 10 minuto..Ang mga produkto ng PCR ay pinaghiwalay ng electrophoresis sa agarose gels (1.5%) na naglalaman ng SYBRTM Safe DNA Gel Stain (Invitrogen, Burlington, ON, Canada) sa 95 V.
Ang mga tahong (Mytilus spp.) ay na-acclimatize sa 500 ML oxygenated seawater (32 PSU) sa loob ng 24 na oras sa 4°C.Ang Plasmid DNA na naglalaman ng isang insert na pag-encode ng human galectin-7 cDNA sequence (NCBI accession number L07769) ay idinagdag sa vial sa isang pangwakas na konsentrasyon ng 190 μg / μl.Ang mga tahong na incubated sa ilalim ng parehong mga kondisyon na walang pagdaragdag ng DNA ay ang kontrol.Ang ikatlong control tank ay naglalaman ng DNA na walang tahong.Upang masubaybayan ang kalidad ng DNA sa tubig-dagat, ang mga sample ng tubig-dagat (20 μl; tatlong pag-uulit) ay kinuha mula sa bawat tangke sa ipinahiwatig na oras.Para sa traceability ng plasmid DNA, ang mga mussel ng LB ay na-ani sa mga ipinahiwatig na oras at sinuri ng qPCR at ddPCR.Dahil sa mataas na nilalaman ng asin ng tubig-dagat, ang mga aliquot ay natunaw sa kalidad ng tubig ng PCR (1:10) bago ang lahat ng pagsusuri sa PCR.
Ang digital droplet PCR (ddPCR) ay isinagawa gamit ang BioRad QX200 protocol (Mississauga, Ontario, Canada).Gamitin ang profile ng temperatura upang matukoy ang pinakamabuting kalagayan na temperatura (Talahanayan S1).Ang mga patak ay nabuo gamit ang isang QX200 drop generator (BioRad).Ang ddPCR ay isinagawa tulad ng sumusunod: 95 ° C para sa 5 min, 50 cycle ng 95 ° C para sa 30 s at isang ibinigay na temperatura ng pagsusubo para sa 1 min at 72 ° C para sa 30 s, 4 ° C para sa 5 min at 90 ° C sa loob ng 5 minuto.Ang bilang ng mga patak at positibong reaksyon (bilang ng mga kopya/µl) ay sinusukat gamit ang isang QX200 drop reader (BioRad).Ang mga sample na may mas mababa sa 10,000 droplets ay tinanggihan.Ang kontrol ng pattern ay hindi ginanap sa tuwing tatakbo ang ddPCR.
Ang qPCR ay isinagawa gamit ang Rotor-Gene® 3000 (Corbett Research, Sydney, Australia) at mga tukoy na primer ng LGALS7.Ang lahat ng quantitative PCR ay isinagawa sa 20 µl gamit ang QuantiFast SYBR Green PCR Kit (QIAGEN).Sinimulan ang qPCR sa isang 15 min incubation sa 95°C na sinundan ng 40 cycle sa 95°C sa loob ng 10 segundo at sa 60°C sa loob ng 60 segundo na may isang koleksyon ng data.Ang mga natutunaw na curve ay nabuo gamit ang sunud-sunod na mga sukat sa 95°C para sa 5 s, 65°C para sa 60 s, at 97°C sa dulo ng qPCR.Ang bawat qPCR ay isinagawa sa triplicate, maliban sa mga control sample.
Dahil kilala ang tahong sa kanilang mataas na rate ng pagsasala, sinisiyasat muna namin kung maaari nilang i-filter at mapanatili ang mga fragment ng DNA na nasa tubig-dagat.Interesado din kami kung ang mga fragment na ito ay naipon sa kanilang semi-open lymphatic system.Nalutas namin ang isyung ito sa pamamagitan ng pag-eksperimento sa pamamagitan ng pagsubaybay sa kapalaran ng natutunaw na mga fragment ng DNA na idinagdag sa mga tangke ng asul na mussel.Upang mapadali ang pagsubaybay sa mga fragment ng DNA, gumamit kami ng dayuhang (hindi sarili) na plasmid DNA na naglalaman ng gene ng human galectin-7.Sinusubaybayan ng ddPCR ang mga fragment ng plasmid DNA sa tubig-dagat at tahong.Ang aming mga resulta ay nagpapakita na kung ang dami ng mga fragment ng DNA sa tubig dagat ay nanatiling medyo pare-pareho sa paglipas ng panahon (hanggang sa 7 araw) sa kawalan ng mga tahong, kung gayon sa pagkakaroon ng mga tahong ang antas na ito ay halos ganap na nawala sa loob ng 8 oras (Larawan 1a, b).Ang mga fragment ng exogenous DNA ay madaling nakita sa loob ng 15 min sa intravalvular fluid at hemolymph (Fig. 1c).Ang mga fragment na ito ay maaari pa ring matukoy hanggang 4 na oras pagkatapos ng pagkakalantad.Ang aktibidad ng pagsala na ito na may paggalang sa mga fragment ng DNA ay maihahambing sa aktibidad ng pagsala ng bakterya at algae [31].Iminumungkahi ng mga resultang ito na ang mga tahong ay maaaring mag-filter at mag-ipon ng dayuhang DNA sa kanilang mga fluid compartment.
Mga kamag-anak na konsentrasyon ng plasmid DNA sa tubig-dagat sa presensya (A) o kawalan (B) ng mga tahong, sinusukat ng ddPCR.Sa A, ang mga resulta ay ipinahayag bilang mga porsyento, na ang mga hangganan ng mga kahon ay kumakatawan sa ika-75 at ika-25 na porsyento.Ang fitted logarithmic curve ay ipinapakita sa pula, at ang lugar na may shade na gray ay kumakatawan sa 95% confidence interval.Sa B, ang pulang linya ay kumakatawan sa mean at ang asul na linya ay kumakatawan sa 95% na agwat ng kumpiyansa para sa konsentrasyon.C Ang akumulasyon ng plasmid DNA sa hemolymph at valvular fluid ng mussels sa iba't ibang oras pagkatapos ng pagdaragdag ng plasmid DNA.Ang mga resulta ay ipinakita bilang ganap na mga kopya na nakita/mL (±SE).
Susunod, sinisiyasat namin ang pinagmulan ng ccfDNA sa mga mussel na nakolekta mula sa mga mussel bed sa Kerguelen Islands, isang malayong grupo ng mga isla na may limitadong impluwensyang anthropogenic.Para sa layuning ito, ang cccDNA mula sa mussel hemolymphs ay nahiwalay at nalinis ng mga pamamaraan na karaniwang ginagamit upang linisin ang cccDNA ng tao [32, 33].Natagpuan namin na ang average na hemolymph ccfDNA na konsentrasyon sa mga mussel ay nasa mababang micrograms bawat ml na hanay ng hemolymph (tingnan ang Talahanayan S2, Karagdagang Impormasyon).Ang hanay ng mga konsentrasyon na ito ay mas malaki kaysa sa mga malulusog na tao (mababang nanograms bawat milliliter), ngunit sa mga bihirang kaso, sa mga pasyente ng cancer, ang antas ng ccfDNA ay maaaring umabot ng ilang micrograms bawat milliliter [34, 35].Ang isang pagsusuri sa laki ng pamamahagi ng hemolymph ccfDNA ay nagpakita na ang mga fragment na ito ay nag-iiba nang malaki sa laki, mula 1000 bp hanggang 1000 bp.hanggang 5000 bp (Larawan 2).Ang mga katulad na resulta ay nakuha gamit ang QIAamp Investigator Kit na nakabatay sa silica, isang paraan na karaniwang ginagamit sa forensic science upang mabilis na ihiwalay at linisin ang genomic DNA mula sa mababang konsentrasyon ng mga sample ng DNA, kabilang ang ccfDNA [36].
Kinatawan ng ccfDNA electrophoregram ng mussel hemolymph.Na-extract gamit ang NucleoSnap Plasma Kit (itaas) at QIAamp DNA Investigator Kit.B Violin plot na nagpapakita ng distribusyon ng hemolymph ccfDNA concentrations (±SE) sa tahong.Ang mga itim at pulang linya ay kumakatawan sa median at ang una at ikatlong kuwartil, ayon sa pagkakabanggit.
Humigit-kumulang 1% ng ccfDNA sa mga tao at primata ay may dayuhang mapagkukunan [21, 37].Dahil sa semi-open circulatory system ng bivalves, microbial-rich seawater, at ang laki ng distribution ng mussel ccfDNA, na-hypothesize namin na ang mussel hemolymph ccfDNA ay maaaring maglaman ng mayaman at magkakaibang pool ng microbial DNA.Upang subukan ang hypothesis na ito, pinagsunod-sunod namin ang hemolymph ccfDNA mula sa mga sample ng Aulacomya atra na nakolekta mula sa Kerguelen Islands, na nagbunga ng mahigit 10 milyong nabasa, 97.6% nito ang pumasa sa kontrol sa kalidad.Ang mga pagbabasa ay pagkatapos ay inuri ayon sa sarili at hindi sarili na mga mapagkukunan gamit ang BLASTN at NCBI bivalve database (Fig. S1, Karagdagang Impormasyon).
Sa mga tao, parehong nuclear at mitochondrial DNA ay maaaring ilabas sa daluyan ng dugo [38].Gayunpaman, sa kasalukuyang pag-aaral, hindi posibleng ilarawan nang detalyado ang nuclear genomic DNA ng mga tahong, dahil hindi pa nasequence o inilarawan ang A. atra genome.Gayunpaman, natukoy namin ang isang bilang ng mga fragment ng ccfDNA ng aming sariling pinagmulan gamit ang bivalve library (Fig. S2, Karagdagang Impormasyon).Kinumpirma rin namin ang pagkakaroon ng mga fragment ng DNA ng sarili naming pinanggalingan sa pamamagitan ng direktang PCR amplification ng mga A. atra gene na na-sequence (Larawan 3).Katulad nito, dahil ang mitochondrial genome ng A. atra ay magagamit sa mga pampublikong database, ang isa ay makakahanap ng ebidensya para sa pagkakaroon ng mitochondrial ccfDNA fragment sa hemolymph ng A. atra.Ang pagkakaroon ng mga fragment ng mitochondrial DNA ay nakumpirma ng PCR amplification (Larawan 3).
Ang iba't ibang mitochondrial genes ay naroroon sa hemolymph ng A. atra (mga pulang tuldok - numero ng stock: SRX5705969) at M. platensis (mga asul na tuldok - numero ng stock: SRX5705968) na pinalaki ng PCR.Figure na hinango mula sa Breton et al., 2011 B Amplification ng hemolymph supernatant mula sa A. atra Naka-imbak sa FTA na papel.Gumamit ng 3 mm na suntok upang direktang idagdag sa PCR tube na naglalaman ng PCR mix.
Dahil sa masaganang nilalaman ng microbial sa tubig-dagat, una kaming nakatuon sa pagkilala sa mga pagkakasunud-sunod ng microbial DNA sa hemolymph.Para magawa ito, gumagamit kami ng dalawang magkaibang estratehiya.Ang unang diskarte ay gumamit ng Kraken2, isang algorithm-based na sequence classification program na maaaring makilala ang mga microbial sequence na may katumpakan na maihahambing sa BLAST at iba pang mga tool [28].Higit sa 6719 na mga nabasa ang natukoy na nagmula sa bacterial, habang 124 at 64 ay mula sa archaea at mga virus, ayon sa pagkakabanggit (Larawan 4).Ang pinaka-masaganang bacterial DNA fragment ay Firmicutes (46%), Proteobacteria (27%), at Bacteroidetes (17%) (Fig. 4a).Ang pamamahagi na ito ay naaayon sa mga nakaraang pag-aaral ng marine blue mussel microbiome [39, 40].Ang Gammaproteobacteria ay ang pangunahing klase ng Proteobacteria (44%), kabilang ang maraming Vibrionales (Larawan 4b).Kinumpirma ng paraan ng ddPCR ang pagkakaroon ng mga fragment ng Vibrio DNA sa ccfDNA ng A. atra hemolymph (Fig. 4c) [41].Upang makakuha ng karagdagang impormasyon tungkol sa bacterial na pinagmulan ng ccfDNA, isang karagdagang diskarte ang kinuha (Fig. S2, Karagdagang Impormasyon). Sa kasong ito, ang mga nabasa na nag-overlap ay pinagsama-sama bilang mga paired-end read at inuri bilang ng sarili (bivalves) o nonself na pinagmulan gamit ang BLASTN at isang e value na 1e−3 at isang cutoff na may >90% homology. Sa kasong ito, ang mga nabasa na nag-overlap ay pinagsama-sama bilang mga paired-end read at inuri bilang ng sarili (bivalves) o nonself na pinagmulan gamit ang BLASTN at isang e value na 1e−3 at isang cutoff na may >90% homology. В этом случае перекрывающиеся чтения были собраны как чтения с парными концами и были классифицированысто каквланыстер юски) или чужие по происхождению с использованием BLASTN at значения e 1e-3 и отсечения с гомологией> 90%. Sa kasong ito, ang mga overlapping na pagbabasa ay kinolekta bilang mga paired-ended reads at inuri bilang native (bivalve) o hindi orihinal gamit ang BLASTN at e value ng 1e-3 at cutoff na may >90% homology.在这种情况下，重叠的读数组装为配对末端读数，并使用BLASTN 和1e-3 的e 值咐>90% 我們和>90%为自身（双壳类）或非自身来源。在 这 种 情况 下 ， 重叠 读数 组装 为 配 末端 读数 ， 使用 使用 使用 的 9 % 和 的 和 1% 和同源性 的 分类 自身 （双 壳类） 非 自身。。。。。。。。 В этом случае перекрывающиеся чтения были собраны как чтения с парными концами и классифицированы как собстовленский и) или несобственные по происхождению с использованием значений e BLASTN и 1e-3 и порога гомологии> 90%. Sa kasong ito, ang mga overlapping na pagbabasa ay kinolekta bilang mga pinagpares na natapos na mga pagbabasa at inuri bilang sariling (bivalves) o hindi orihinal gamit ang mga halaga ng e BLASTN at 1e-3 at isang threshold ng homology >90%.Dahil hindi pa nasequence ang A. atra genome, ginamit namin ang de novo assembly strategy ng MEGAHIT Next Generation Sequencing (NGS) assembler.Isang kabuuan ng 147,188 contigs ang natukoy bilang umaasa (bivalves) ng pinagmulan.Ang mga contig na ito ay sumabog pagkatapos ng mga e-values ​​​​ng 1e-10 gamit ang BLASTN at BLASTX.Ang diskarteng ito ay nagbigay-daan sa amin na matukoy ang 482 non-bivalve fragment na nasa A. atra ccfDNA.Mahigit sa kalahati (57%) ng mga fragment ng DNA na ito ay nakuha mula sa bakterya, pangunahin mula sa mga gill symbionts, kabilang ang sulfotrophic symbionts, at mula sa gill symbionts na Solemya velum (Fig. 5).
Relatibong kasaganaan sa antas ng uri.B Microbial diversity ng dalawang pangunahing phyla (Firmicutes at Proteobacteria).Kinatawan ng amplification ng ddPCR C Vibrio spp.A. Mga fragment ng 16S rRNA gene (asul) sa tatlong atra hemolymph.
Isang kabuuan ng 482 na nakolektang contigs ang nasuri.Pangkalahatang profile ng taxonomic distribution ng metagenomic contig annotation (prokaryotes at eukaryotes).B Detalyadong pamamahagi ng mga bacterial DNA fragment na kinilala ng BLASTN at BLASTX.
Ipinakita din ng pagsusuri ng Kraken2 na ang mussel ccfDNA ay naglalaman ng mga archaeal DNA fragment, kabilang ang mga fragment ng DNA ng Euryarchaeota (65%), Crenarchaeota (24%), at Thaurmarcheota (11%) (Fig. 6a).Ang pagkakaroon ng mga fragment ng DNA na nagmula sa Euryarchaeota at Crenarchaeota, na dating natagpuan sa microbial community ng Californian mussels, ay hindi dapat maging isang sorpresa [42].Kahit na ang Euryarchaeota ay madalas na nauugnay sa matinding mga kondisyon, kinikilala na ngayon na ang parehong Euryarchaeota at Crenarcheota ay kabilang sa mga pinaka-karaniwang prokaryotes sa marine cryogenic na kapaligiran [43, 44].Ang pagkakaroon ng mga methanogenic microorganism sa tahong ay hindi nakakagulat, dahil sa kamakailang mga ulat ng malawak na pagtagas ng methane mula sa ilalim na pagtagas sa Kerguelen Plateau [45] at posibleng microbial methane production na naobserbahan sa baybayin ng Kerguelen Islands [46].
Ang aming atensyon pagkatapos ay lumipat sa mga pagbabasa mula sa mga virus ng DNA.Sa abot ng aming kaalaman, ito ang unang di-target na pag-aaral ng nilalaman ng virus ng mga tahong.Tulad ng inaasahan, natagpuan namin ang mga fragment ng DNA ng mga bacteriophage (Caudovirales) (Larawan 6b).Gayunpaman, ang pinakakaraniwang viral DNA ay nagmumula sa isang phylum ng mga nucleocytovirus, na kilala rin bilang nuclear cytoplasmic large DNA virus (NCLDV), na may pinakamalaking genome sa anumang virus.Sa loob ng phylum na ito, karamihan sa mga sequence ng DNA ay nabibilang sa mga pamilyang Mimimidoviridae (58%) at Poxviridae (21%), na ang mga natural na host ay kinabibilangan ng mga vertebrates at arthropod, habang ang isang maliit na proporsyon ng mga sequence ng DNA na ito ay nabibilang sa kilalang virological algae.Nakakahawa sa marine eukaryotic algae.Ang mga pagkakasunud-sunod ay nakuha din mula sa Pandora virus, ang higanteng virus na may pinakamalaking laki ng genome ng anumang kilalang viral genera.Kapansin-pansin, ang hanay ng mga host na kilala na nahawaan ng virus, tulad ng tinutukoy ng pagkakasunud-sunod ng hemolymph ccfDNA, ay medyo malaki (Larawan S3, Karagdagang Impormasyon).Kabilang dito ang mga virus na nakahahawa sa mga insekto tulad ng Baculoviridae at Iridoviridae, pati na rin ang mga virus na nakahahawa sa amoeba, algae at vertebrates.Nakakita rin kami ng mga sequence na tumutugma sa Pithovirus sibericum genome.Ang mga Pitovirus (kilala rin bilang "mga virus ng zombie") ay unang nahiwalay sa 30,000 taong gulang na permafrost sa Siberia [47].Kaya, ang aming mga resulta ay naaayon sa mga nakaraang ulat na nagpapakita na hindi lahat ng modernong species ng mga virus na ito ay wala na [48] at ang mga virus na ito ay maaaring naroroon sa malayong subarctic marine ecosystem.
Sa wakas, sinubukan namin upang makita kung makakahanap kami ng mga fragment ng DNA mula sa iba pang mga multicellular na hayop.Isang kabuuan ng 482 na mga dayuhang contig ang nakilala ng BLASTN at BLASTX na may mga aklatan ng nt, nr at RefSeq (genomic at protina).Ipinapakita ng aming mga resulta na kabilang sa mga dayuhang fragment ng ccfDNA ng mga multicellular na hayop, ang DNA ng mga buto ng buto ay nangingibabaw (Fig. 5).Ang mga fragment ng DNA mula sa mga insekto at iba pang mga species ay natagpuan din.Ang isang medyo malaking bahagi ng mga fragment ng DNA ay hindi natukoy, marahil dahil sa hindi gaanong representasyon ng isang malaking bilang ng mga marine species sa genomic database kumpara sa mga terrestrial species [49].
Sa kasalukuyang papel, inilalapat namin ang konsepto ng LB sa mga tahong, na pinagtatalunan na ang hemolymph ccfDNA shot sequencing ay maaaring magbigay ng pananaw sa komposisyon ng mga marine coastal ecosystem.Sa partikular, nalaman namin na ang 1) mussel hemolymph ay naglalaman ng medyo mataas na konsentrasyon (microgram level) ng medyo malaki (~1-5 kb) na nagpapalipat-lipat na mga fragment ng DNA;2) ang mga fragment ng DNA na ito ay parehong independiyente at hindi independyente 3) Kabilang sa mga dayuhang pinagmumulan ng mga fragment ng DNA na ito, nakita namin ang bacterial, archaeal at viral DNA, pati na rin ang DNA ng iba pang multicellular na hayop;4) Ang akumulasyon ng mga banyagang ccfDNA fragment na ito sa hemolymph ay mabilis na nangyayari at nag-aambag sa panloob na aktibidad ng pagsasala ng mga tahong.Sa konklusyon, ipinapakita ng aming pag-aaral na ang konsepto ng LB, na sa ngayon ay inilapat pangunahin sa larangan ng biomedicine, ay nag-encode ng isang mayaman ngunit hindi pa natutuklasang mapagkukunan ng kaalaman na maaaring magamit upang mas maunawaan ang pakikipag-ugnayan sa pagitan ng mga species ng sentinel at kanilang kapaligiran.
Bilang karagdagan sa mga primata, ang paghihiwalay ng ccfDNA ay naiulat sa mga mammal, kabilang ang mga daga, aso, pusa, at kabayo [50, 51, 52].Gayunpaman, sa aming kaalaman, ang aming pag-aaral ang unang nag-ulat ng pagtuklas at pagkakasunud-sunod ng ccfDNA sa mga marine species na may bukas na sistema ng sirkulasyon.Ang anatomical feature na ito at kakayahan sa pag-filter ng mga tahong ay maaaring, kahit sa isang bahagi, ay ipaliwanag ang iba't ibang laki ng mga katangian ng nagpapalipat-lipat na mga fragment ng DNA kumpara sa ibang mga species.Sa mga tao, karamihan sa mga fragment ng DNA na umiikot sa dugo ay maliliit na fragment na may sukat mula 150 hanggang 200 bp.na may pinakamataas na peak na 167 bp [34, 53].Ang isang maliit ngunit makabuluhang bahagi ng mga fragment ng DNA ay nasa pagitan ng 300 at 500 bp ang laki, at humigit-kumulang 5% ay mas mahaba sa 900 bp.[54].Ang dahilan ng pamamahagi ng laki na ito ay ang pangunahing pinagmumulan ng ccfDNA sa plasma bilang resulta ng pagkamatay ng cell, alinman dahil sa pagkamatay ng cell o dahil sa nekrosis ng nagpapalipat-lipat na mga hematopoietic na selula sa malulusog na indibidwal o dahil sa apoptosis ng mga tumor cells sa mga pasyente ng cancer (kilala bilang circulating tumor DNA)., ctDNA).Ang laki ng distribusyon ng hemolymph ccfDNA na nakita namin sa mussels ay mula 1000 hanggang 5000 bp, na nagmumungkahi na ang mussel ccfDNA ay may ibang pinagmulan.Ito ay isang lohikal na hypothesis, dahil ang mga mussel ay may semi-open vascular system at nakatira sa mga marine aquatic na kapaligiran na naglalaman ng mataas na konsentrasyon ng microbial genomic DNA.Sa katunayan, ipinakita ng aming mga eksperimento sa laboratoryo na gumagamit ng exogenous DNA na ang mga mussel ay nag-iipon ng mga fragment ng DNA sa tubig-dagat, hindi bababa sa pagkalipas ng ilang oras ay nasira ang mga ito pagkatapos ng cellular uptake at/o inilabas at/o nakaimbak sa iba't ibang organisasyon.Dahil sa pambihira ng mga cell (parehong prokaryotic at eukaryotic), ang paggamit ng mga intravalvular compartment ay magbabawas sa dami ng ccfDNA mula sa mga self-source gayundin mula sa mga dayuhang pinagmumulan.Isinasaalang-alang ang kahalagahan ng bivalve innate immunity at ang malaking bilang ng mga nagpapalipat-lipat na phagocytes, lalo naming na-hypothesize na kahit na ang dayuhang ccfDNA ay pinayaman sa mga nagpapalipat-lipat na phagocytes na nag-iipon ng dayuhang DNA sa paglunok ng mga microorganism at/o cellular debris.Kung sama-sama, ipinapakita ng aming mga resulta na ang bivalve hemolymph ccfDNA ay isang natatanging repositoryo ng molekular na impormasyon at pinapalakas ang kanilang katayuan bilang isang sentinel species.
Ang aming data ay nagpapahiwatig na ang pagkakasunud-sunod at pagsusuri ng mga fragment ng hemolymph ccfDNA na nagmula sa bacterial ay maaaring magbigay ng pangunahing impormasyon tungkol sa host bacterial flora at ang bacteria na naroroon sa nakapalibot na marine ecosystem.Ang mga diskarte sa pagkakasunud-sunod ng pagbaril ay nagsiwalat ng mga pagkakasunud-sunod ng commensal bacteria na A. atra gill na napalampas sana kung ginamit ang maginoo na paraan ng pagkilala sa 16S rRNA, dahil sa isang bahagi ng bias ng reference library.Sa katunayan, ang aming paggamit ng data ng LB na nakolekta mula sa M. platensis sa parehong layer ng mussel sa Kerguelen ay nagpakita na ang komposisyon ng mga gill-associated bacterial symbionts ay pareho para sa parehong species ng mussel (Fig. S4, Karagdagang Impormasyon).Ang pagkakatulad na ito ng dalawang genetically different mussels ay maaaring sumasalamin sa komposisyon ng bacterial community sa malamig, sulfurous, at volcanic na deposito ng Kerguelen [55, 56, 57, 58].Ang mas mataas na antas ng sulfur-reducing microorganism ay mahusay na inilarawan kapag nag-aani ng mga tahong mula sa bioturbated coastal areas [59], tulad ng baybayin ng Port-au-France.Ang isa pang posibilidad ay ang commensal mussel flora ay maaaring maapektuhan ng pahalang na paghahatid [60, 61].Higit pang pananaliksik ang kailangan upang matukoy ang ugnayan sa pagitan ng marine environment, seafloor surface, at ang komposisyon ng symbiotic bacteria sa mussels.Ang mga pag-aaral na ito ay kasalukuyang nagpapatuloy.
Ang haba at konsentrasyon ng hemolymph ccfDNA, ang kadalian ng paglilinis nito, at mataas na kalidad upang payagan ang mabilis na pagkakasunud-sunod ng shotgun ay ilan sa maraming pakinabang ng paggamit ng mussel ccfDNA upang masuri ang biodiversity sa marine coastal ecosystem.Ang pamamaraang ito ay lalong epektibo para sa pagkilala sa mga viral na komunidad (mga virome) sa isang ibinigay na ekosistema [62, 63].Hindi tulad ng bacteria, archaea, at eukaryotes, ang mga viral genome ay hindi naglalaman ng phylogenetically conserved genes gaya ng 16S sequence.Ang aming mga resulta ay nagpapahiwatig na ang mga likidong biopsies mula sa mga species ng tagapagpahiwatig tulad ng mga mussel ay maaaring magamit upang matukoy ang medyo malaking bilang ng mga fragment ng ccfDNA virus na kilala na nakakahawa sa mga host na karaniwang naninirahan sa mga coastal marine ecosystem.Kabilang dito ang mga virus na kilala na nakakahawa sa protozoa, arthropod, insekto, halaman, at bacterial virus (hal., bacteriophage).Ang isang katulad na pamamahagi ay natagpuan nang suriin namin ang hemolymph ccfDNA virome ng mga asul na tahong (M. platensis) na nakolekta sa parehong layer ng mussel sa Kerguelen (Talahanayan S2, Karagdagang Impormasyon).Ang pagkakasunud-sunod ng shotgun ng ccfDNA ay talagang isang bagong diskarte na nakakakuha ng momentum sa pag-aaral ng virome ng mga tao o iba pang mga species [21, 37, 64].Ang diskarte na ito ay partikular na kapaki-pakinabang para sa pag-aaral ng mga double-stranded na DNA virus, dahil walang solong gene ang naka-conserve sa lahat ng double-stranded na DNA virus, na kumakatawan sa pinaka-magkakaibang at malawak na klase ng mga virus sa Baltimore [65].Bagama't ang karamihan sa mga virus na ito ay nananatiling hindi nauuri at maaaring kabilang ang mga virus mula sa isang ganap na hindi kilalang bahagi ng viral na mundo [66], nalaman namin na ang mga virome at host range ng mussels A. atra at M. platensis ay nasa pagitan ng dalawang species.katulad nito (tingnan ang figure S3, karagdagang impormasyon).Ang pagkakatulad na ito ay hindi nakakagulat, dahil ito ay maaaring sumasalamin sa isang kakulangan ng selectivity sa uptake ng DNA na naroroon sa kapaligiran.Ang mga pag-aaral sa hinaharap gamit ang purified RNA ay kasalukuyang kinakailangan upang makilala ang RNA virome.
Sa aming pag-aaral, gumamit kami ng napakahigpit na pipeline na inangkop mula sa gawain ni Kowarski at mga kasamahan [37], na gumamit ng dalawang hakbang na pagtanggal ng mga naka-pool na reads at contigs bago at pagkatapos ng pagpupulong ng katutubong ccfDNA, na nagreresulta sa isang mataas na proporsyon ng mga hindi naka-map na nabasa.Samakatuwid, hindi namin maitatapon na ang ilan sa mga hindi nakamapang babasahin na ito ay maaaring may sariling pinagmulan, pangunahin na dahil wala kaming reference na genome para sa species ng mussel na ito.Ginamit din namin ang pipeline na ito dahil nag-aalala kami tungkol sa mga chimera sa pagitan ng self at non-self reads at ang mga haba ng read na nabuo ng Illumina MiSeq PE75.Ang isa pang dahilan para sa karamihan ng mga hindi pa nababasang pagbabasa ay ang karamihan sa mga marine microbes, lalo na sa mga malalayong lugar tulad ng Kerguelen, ay hindi na-annotate.Gumamit kami ng Illumina MiSeq PE75, sa pag-aakalang ang haba ng fragment ng ccfDNA ay katulad ng ccfDNA ng tao.Para sa mga pag-aaral sa hinaharap, dahil sa aming mga resulta na nagpapakita na ang hemolymph ccfDNA ay may mas mahabang pagbabasa kaysa sa mga tao at/o mammal, inirerekomenda namin ang paggamit ng sequencing platform na mas angkop para sa mas mahabang ccfDNA fragment.Ang kasanayang ito ay magiging mas madali upang matukoy ang higit pang mga indikasyon para sa mas malalim na pagsusuri.Ang pagkuha ng kasalukuyang hindi magagamit na kumpletong A. atra nuclear genome sequence ay lubos ding magpapadali sa diskriminasyon ng ccfDNA mula sa sarili at hindi sarili na mga mapagkukunan.Dahil ang aming pananaliksik ay nakatuon sa posibilidad ng paglalapat ng konsepto ng likidong biopsy sa mga tahong, umaasa kami na habang ginagamit ang konseptong ito sa hinaharap na pananaliksik, ang mga bagong tool at pipeline ay bubuo upang mapataas ang potensyal ng pamamaraang ito upang pag-aralan ang pagkakaiba-iba ng microbial ng mga tahong.marine ecosystem.
Bilang isang non-invasive clinical biomarker, ang mataas na antas ng plasma ng tao ng ccfDNA ay nauugnay sa iba't ibang mga sakit, pinsala sa tissue, at mga kondisyon ng stress [67,68,69].Ang pagtaas na ito ay nauugnay sa paglabas ng mga fragment ng DNA ng sarili nitong pinagmulan pagkatapos ng pinsala sa tissue.Tinutugunan namin ang isyung ito gamit ang matinding heat stress, kung saan ang mga tahong ay panandaliang nalantad sa temperatura na 30 °C.Ginawa namin ang pagsusuring ito sa tatlong magkakaibang uri ng tahong sa tatlong independyenteng mga eksperimento.Gayunpaman, wala kaming nakitang anumang pagbabago sa mga antas ng ccfDNA pagkatapos ng matinding init ng stress (tingnan ang Larawan S5, karagdagang impormasyon).Ang pagtuklas na ito ay maaaring ipaliwanag, hindi bababa sa isang bahagi, ang katotohanan na ang mga mussel ay may semi-open circulatory system at nag-iipon ng malaking halaga ng dayuhang DNA dahil sa kanilang mataas na aktibidad sa pagsala.Sa kabilang banda, ang mga mussel, tulad ng maraming mga invertebrates, ay maaaring mas lumalaban sa pinsala sa tissue na dulot ng stress, at sa gayon ay nililimitahan ang paglabas ng ccfDNA sa kanilang hemolymph [70, 71].
Sa ngayon, ang pagsusuri ng DNA ng biodiversity sa aquatic ecosystem ay pangunahing nakatuon sa environmental DNA (eDNA) metabarcoding.Gayunpaman, ang pamamaraang ito ay karaniwang limitado sa pagsusuri ng biodiversity kapag ginamit ang mga panimulang aklat.Ang paggamit ng shotgun sequencing ay umiiwas sa mga limitasyon ng PCR at ang bias na pagpili ng mga primer set.Kaya, sa isang kahulugan, ang aming pamamaraan ay mas malapit sa kamakailang ginamit na high-throughput na eDNA Shotgun na paraan ng pagkakasunud-sunod, na maaaring direktang mag-sequence ng fragmented DNA at pag-aralan ang halos lahat ng mga organismo [72, 73].Gayunpaman, mayroong isang bilang ng mga pangunahing isyu na nagpapakilala sa LB mula sa mga karaniwang pamamaraan ng eDNA.Siyempre, ang pangunahing pagkakaiba sa pagitan ng eDNA at LB ay ang paggamit ng mga natural na host ng filter.Ang paggamit ng mga marine species tulad ng sponges at bivalves (Dresseina spp.) bilang natural na filter para sa pag-aaral ng eDNA ay naiulat [74, 75].Gayunpaman, ang pag-aaral ni Dreissena ay gumamit ng tissue biopsy kung saan kinuha ang DNA.Ang pagsusuri sa ccfDNA mula sa LB ay hindi nangangailangan ng tissue biopsy, dalubhasa at kung minsan ay mamahaling kagamitan at logistik na nauugnay sa eDNA o tissue biopsy.Sa katunayan, iniulat namin kamakailan na ang ccfDNA mula sa LB ay maaaring maimbak at masuri sa suporta ng FTA nang hindi pinapanatili ang isang malamig na kadena, na isang malaking hamon para sa pananaliksik sa mga malalayong lugar [76].Ang pagkuha ng ccfDNA mula sa mga likidong biopsy ay simple din at nagbibigay ng mataas na kalidad na DNA para sa shotgun sequencing at pagsusuri ng PCR.Ito ay isang mahusay na kalamangan dahil sa ilan sa mga teknikal na limitasyon na nauugnay sa pagsusuri ng eDNA [77].Ang pagiging simple at mababang halaga ng paraan ng sampling ay partikular ding angkop para sa mga pangmatagalang programa sa pagsubaybay.Bilang karagdagan sa kanilang mataas na kakayahan sa pag-filter, ang isa pang kilalang tampok ng bivalves ay ang kemikal na mucopolysaccharide na komposisyon ng kanilang mucus, na nagtataguyod ng pagsipsip ng mga virus [78, 79].Ginagawa nitong mainam na natural na filter ang mga bivalve para sa pagkilala sa biodiversity at ang epekto ng pagbabago ng klima sa isang partikular na aquatic ecosystem.Bagaman ang pagkakaroon ng mga fragment ng DNA na nagmula sa host ay makikita bilang isang limitasyon ng pamamaraan kumpara sa eDNA, ang gastos na nauugnay sa pagkakaroon ng naturang katutubong ccfDNA kumpara sa eDNA ay sabay na mauunawaan para sa malawak na halaga ng impormasyon na magagamit para sa mga pag-aaral sa kalusugan.offset host.Kabilang dito ang pagkakaroon ng mga viral sequence na isinama sa genome ng host host.Ito ay lalong mahalaga para sa mga tahong, dahil sa pagkakaroon ng pahalang na naililipat na leukemic retrovirus sa mga bivalve [80, 81].Ang isa pang bentahe ng LB sa eDNA ay ang pagsasamantala nito sa phagocytic na aktibidad ng nagpapalipat-lipat na mga selula ng dugo sa hemolymph, na lumalamon sa mga mikroorganismo (at ang kanilang mga genome).Ang phagocytosis ay ang pangunahing pag-andar ng mga selula ng dugo sa bivalves [82].Sa wakas, sinasamantala ng pamamaraan ang mataas na kapasidad sa pagsala ng mga tahong (average na 1.5 l/h ng tubig-dagat) at dalawang araw na sirkulasyon, na nagpapataas ng paghahalo ng iba't ibang layer ng tubig-dagat, na nagpapahintulot sa pagkuha ng heterologous na eDNA.[83, 84].Kaya, ang pagsusuri ng mussel ccfDNA ay isang kawili-wiling paraan dahil sa mga epekto sa nutrisyon, pang-ekonomiya, at kapaligiran ng mga tahong.Katulad ng pagsusuri ng LB na nakolekta mula sa mga tao, ang pamamaraang ito ay nagbubukas din ng posibilidad ng pagsukat ng genetic at epigenetic na pagbabago sa host DNA bilang tugon sa mga exogenous substance.Halimbawa, ang mga teknolohiya ng pagkakasunud-sunod ng ikatlong henerasyon ay maaaring maisip na magsagawa ng pagsusuri sa genome-wide methylation sa katutubong ccfDNA gamit ang pagkakasunud-sunod ng nanopore.Ang prosesong ito ay dapat na mapadali sa pamamagitan ng katotohanan na ang haba ng mga fragment ng mussel ccfDNA ay perpektong katugma sa matagal nang nabasa na mga sequencing platform na nagpapahintulot sa genome-wide DNA methylation analysis mula sa isang solong sequencing run nang hindi nangangailangan ng mga pagbabagong kemikal.85,86] Ito ay isang kawili-wiling posibilidad, dahil ipinakita na ang DNA methylation pattern at patuloy na sumasalamin sa isang tugon sa madaming stress gene ng kapaligiran.Samakatuwid, maaari itong magbigay ng mahalagang pananaw sa mga pinagbabatayan na mekanismo na namamahala sa pagtugon pagkatapos ng pagkakalantad sa pagbabago ng klima o mga pollutant [87].Gayunpaman, ang paggamit ng LB ay hindi walang limitasyon.Hindi na kailangang sabihin, nangangailangan ito ng pagkakaroon ng indicator species sa ecosystem.Tulad ng nabanggit sa itaas, ang paggamit ng LB upang masuri ang biodiversity ng isang partikular na ecosystem ay nangangailangan din ng mahigpit na bioinformatics pipeline na isinasaalang-alang ang pagkakaroon ng mga fragment ng DNA mula sa pinagmulan.Ang isa pang malaking problema ay ang pagkakaroon ng mga sangguniang genome para sa mga marine species.Inaasahan na ang mga inisyatiba tulad ng Marine Mammal Genomes Project at ang kamakailang itinatag na Fish10k na proyekto [88] ay magpapadali sa naturang pagsusuri sa hinaharap.Ang aplikasyon ng konsepto ng LB sa marine filter-feeding organism ay katugma din sa pinakabagong mga pag-unlad sa sequencing technology, na ginagawang angkop para sa pagbuo ng multi-ohm biomarker upang magbigay ng mahalagang impormasyon tungkol sa kalusugan ng mga marine habitat bilang tugon sa stress sa kapaligiran.
Ang data ng genome sequencing ay idineposito sa NCBI Sequence Read Archive https://www.ncbi.nlm.nih.gov/sra/SRR8924808 sa ilalim ng Bioprojects SRR8924808.
Brierley AS, Kingsford MJ Epekto ng pagbabago ng klima sa marine life at ecosystem.Cole Biology.2009;19: P602–P614.
Gissi E, Manea E, Mazaris AD, Fraschetti S, Almpanidou V, Bevilacqua S, et al.Isaalang-alang ang pinagsamang epekto ng pagbabago ng klima at iba pang mga lokal na stressor sa kapaligiran ng dagat.pangkalahatang pang-agham na kapaligiran.2021;755:142564.
Carella F, Antuofermo E, Farina S, Salati F, Mandas D, Prado P, et al.).Agham ng una ng Marso.2020;7:48.
Seront L, Nicastro CR, Zardi GI, Goberville E. Ang pinababang pagtitiis sa init sa ilalim ng paulit-ulit na mga kondisyon ng stress sa init ay nagpapaliwanag ng mataas na namamatay sa tag-init ng mga asul na tahong.Ulat sa agham 2019;9:17498.
Fey SB, Siepielski AM, Nussle S, Cervantes-Yoshida K, Hwan JL, Huber ER, et al.Mga kamakailang pagbabago sa dalas, sanhi at lawak ng pagkamatay ng mga hayop.Proc Natl Acad Sci USA.2015;112:1083-8.
Scarpa F, Sanna D, Azzena I, Mugheti D, Cerruti F, Hosseini S, et al.Maaaring nagdulot ng mass mortality ng Pinna nobilis ang maramihang mga pathogen na hindi partikular sa mga species.Buhay.2020;10:238.
Bradley M, Coutts SJ, Jenkins E, O'Hara TM.Potensyal na epekto ng pagbabago ng klima sa Arctic zoonotic disease.Int J Circumpolar kalusugan.2005;64:468–77.
Beyer J., Greene NW, Brooks S., Allan IJ, Ruus A., Gomez T. et al.Mga asul na tahong (Mytilus edulis spp.) bilang mga senyales na organismo sa pagsubaybay sa polusyon sa baybayin: isang pagsusuri.Mar Environ Res 2017;130:338-65.
Siravegna G, Marsoni S, Siena S, Bardelli A. Pagsasama ng likidong biopsy sa paggamot sa kanser.Nat Rev Clean Oncol.2017;14:531–48.
Wan JCM, Massie C, Garcia-Corbacho J, Mouliere F, Brenton JD, Caldas C, et al.Liquid biopsy maturation: Nagbibigay-daan sa tumor DNA na umikot.Nat Rev Cancer.2017;17:223–38.
Mandel P., Metais P. Mga nucleic acid sa plasma ng tao.Mga minuto ng pagpupulong ng mga subsidiary ng Soc Biol.1948;142:241-3.
Bronkhorst AJ, Ungerer W, Holdenrieder S. Isang bagong tungkulin para sa cell-free na DNA bilang isang molecular marker para sa paggamot sa kanser.Pagsusuri ng biomolar.2019;17:100087.
Ignatiadis M., Sledge GW, Jeffrey SS Liquid biopsy ay pumapasok sa klinika - mga isyu sa pagpapatupad at mga hamon sa hinaharap.Nat Rev Clin Oncol.2021;18:297–312.
Lo YM, Corbetta N., Chamberlain PF, Rai W., Sargent IL, Redman CW at iba pa.Ang fetal DNA ay naroroon sa maternal plasma at serum.Lancet.1997;350:485-7.
Mufarray MN, Wong RJ, Shaw GM, Stevenson DK, Quake SR Pag-aaral ng kurso ng pagbubuntis at mga komplikasyon nito gamit ang circulating extracellular RNA sa dugo ng mga kababaihan sa panahon ng pagbubuntis.Dopediatrics.2020;8:605219.
Ollerich M, Sherwood K, Keown P, Schütz E, Beck J, Stegbauer J, et al.Liquid biopsy: Ang donor cell-free DNA ay ginagamit upang makita ang mga allogeneic lesion sa isang kidney graft.Nat Rev Nephrol.2021;17:591–603.
Juan FC, Lo YM Innovations sa prenatal diagnostics: maternal plasma genome sequencing.Anna MD.2016;67:419-32.
Gu W, Deng X, Lee M, Sucu YD, Arevalo S, Stryke D, et al.Mabilis na pagtuklas ng pathogen na may susunod na henerasyong metagenomic na pagkakasunud-sunod ng mga nahawaang likido sa katawan.Nat Medicine.2021;27:115-24.