Salamat sa pagbisita sa Nature.com. Gumagamit ka ng bersyon ng browser na may limitadong suporta sa CSS. Para sa pinakamagandang karanasan, inirerekomenda namin na gumamit ka ng na-update na browser (o huwag paganahin ang Compatibility Mode sa Internet Explorer). Bilang karagdagan, upang matiyak ang patuloy na suporta, ipinapakita namin ang site na walang mga istilo at JavaScript.
Nagpapakita ng carousel ng tatlong slide nang sabay-sabay. Gamitin ang Nakaraang at Susunod na mga pindutan upang lumipat sa tatlong mga slide sa isang pagkakataon, o gamitin ang mga pindutan ng slider sa dulo upang lumipat sa tatlong mga slide sa isang pagkakataon.
Ang mga porous na particle ng silica ay inihanda ng paraan ng sol-gel na may ilang mga pagbabago upang makakuha ng mga particle ng malawak na butas. Ang mga particle na ito ay hinango sa N-phenylmaleimide-methylvinyl isocyanate (PMI) at styrene sa pamamagitan ng reverse chain transfer-fragmentation (RAFT) polymerization upang makabuo ng N-phenylmaleimide intercalated polyamides. Styrene (PMP) nakatigil na yugto. Ang makitid na mga haligi na hindi kinakalawang na asero (100 × 1.8 mm na panloob na lapad) ay nilagyan ng slurry packing. Ang chromatographic performance ng PMP column ay nasuri upang paghiwalayin ang isang halo ng synthetic peptides na binubuo ng limang peptides (Gly-Tyr, Gly-Leu-Tyr, Gly-Gly-Tyr-Arg, Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg, Leu amino acid enkephalin) at tryptic hydrolyzate ng human serum (HASrum albumin). Sa ilalim ng pinakamainam na kondisyon ng elution, ang teoretikal na bilang ng mga plate na may pinaghalong peptides ay umabot sa 280,000 plates/sq.m. Kung ikukumpara ang pagganap ng paghihiwalay ng nabuong column sa commercial na column na Ascentis Express RP-Amide, napagmasdan na ang kahusayan sa paghihiwalay ng column ng PMP ay mas mataas kaysa sa commercial column sa mga tuntunin ng kahusayan at resolusyon ng paghihiwalay.
Ang industriya ng biopharmaceutical ay naging isang lumalawak na pandaigdigang merkado na may makabuluhang pagtaas sa bahagi ng merkado sa mga nakaraang taon. Sa pagsabog ng industriya ng biopharmaceutical1,2,3 mayroong malaking pangangailangan para sa pagsusuri ng peptide at protina. Bilang karagdagan sa target na peptide, ang iba't ibang mga impurities ay nabuo sa panahon ng peptide synthesis, kaya ang chromatographic purification ay kinakailangan upang makuha ang ninanais na kadalisayan ng peptide. Ang pagsusuri at paglalarawan ng mga protina sa mga likido ng katawan, mga tisyu, at mga selula ay isang napakahirap na gawain dahil sa malaking bilang ng mga potensyal na natutukoy na mga species na nasa isang sample. Bagama't ang mass spectrometry ay isang epektibong tool para sa pagkakasunud-sunod ng mga peptide at protina, kung ang mga naturang sample ay direktang ipinapasok sa mass spectrometer, ang paghihiwalay ay magiging hindi kasiya-siya. Ang problemang ito ay maaaring malutas sa pamamagitan ng pagsasagawa ng liquid chromatography (LC) bago ang pagsusuri ng MS, na magbabawas sa dami ng mga analyte na pumapasok sa mass spectrometer sa isang naibigay na oras4,5,6. Bilang karagdagan, ang mga analyte ay maaaring tumutok sa isang makitid na rehiyon sa panahon ng paghihiwalay ng bahagi ng likido, sa gayon ay tinutuon ang mga analyte na ito at pinatataas ang sensitivity ng MS detection. Ang liquid chromatography (LC) ay makabuluhang umunlad sa nakalipas na dekada at naging malawakang ginagamit na paraan para sa proteomic analysis7,8,9,10.
Ang reverse-phase liquid chromatography (RP-LC) ay malawakang ginagamit upang linisin at paghiwalayin ang mga mixture ng peptides gamit ang octadecyl-modified silica (ODS) bilang nakatigil na yugto11,12,13. Gayunpaman, dahil sa kanilang kumplikadong istraktura at amphoteric na kalikasan, ang 14,15 RP stationary phase ay hindi maaaring magbigay ng isang kasiya-siyang paghihiwalay ng mga peptides at protina. Samakatuwid, ang pagsusuri ng mga peptides at protina na may mga polar at non-polar na mga fragment ay nangangailangan ng espesyal na idinisenyong nakatigil na mga yugto upang makipag-ugnay at mapanatili ang mga analyte na ito. Ang pinaghalong chromatography, na nag-aalok ng mga multimodal na pakikipag-ugnayan, ay maaaring maging alternatibo sa RP-LC para sa paghihiwalay ng mga peptide, protina, at iba pang kumplikadong mixture. Maraming mga mixed-type na nakatigil na phase ang inihanda at ang mga haligi na puno ng mga nakatigil na phase na ito ay ginamit upang paghiwalayin ang mga peptide at protina17,18,19,20,21. Dahil sa pagkakaroon ng mga polar at non-polar group, ang mixed mode stationary phases (WAX/RPLC, HILIC/RPLC, polar intercalation/RPLC) ay angkop para sa paghihiwalay ng peptides at proteins22,23,24,25,26,27,28. , ang mga polar intercalated stationary phase na may covalently bonded polar groups ay nagpapakita ng mahusay na separation capabilities at unique selectivity para sa polar at non-polar analytes dahil ang separation ay nakasalalay sa interaksyon sa pagitan ng analyte at ng stationary phase Multimodal interactions 29,30,31,32. Kamakailan, si Zhang et al. 30 ay nakakuha ng behenyl-terminated stationary phases ng polyamines at matagumpay na pinaghiwalay ang mga hydrocarbon, antidepressants, flavonoids, nucleosides, estrogens, at ilang iba pang analytes. Ang polar na naka-embed na nakatigil na materyal ay may parehong polar at non-polar na mga grupo, kaya maaari itong magamit upang paghiwalayin ang mga peptide at protina sa hydrophobic at hydrophilic na mga bahagi. Ang mga polar inline na column (hal., C18 na mga column na may amide inline) ay available sa ilalim ng trade name na Ascentis Express RP-Amide column, ngunit ang mga column na ito ay ginamit lamang para sa pagsusuri ng amine 33.
Sa kasalukuyang pag-aaral, ang isang polar embedding stationary phase (N-phenylmaleimide, embedding polystyrene) ay inihanda at nasuri para sa peptide separation at tryptic HSA cleavage. Ang sumusunod na diskarte ay ginamit upang ihanda ang nakatigil na yugto. Ang mga porous na particle ng silica ay inihanda ayon sa mga pamamaraan na inilarawan sa aming mga nakaraang publikasyon, na may ilang mga pagbabago sa mga scheme ng paghahanda 31, 34, 35, 36, 37, 38, 39. Ang mga ratios ng urea, polyethylene glycol (PEG), TMOS at aqueous-acetic acid ay nababagay upang makakuha ng mga particle ng silica na may malalaking pore. Pangalawa, ang isang bagong phenylmaleimide-methylvinyl isocyanate ligand ay na-synthesize at ang mga derivatized na mga particle ng silica ay ginamit upang maghanda ng mga polar na naka-embed na nakatigil na mga phase. Ang nakuha na nakatigil na yugto ay naka-pack sa isang hindi kinakalawang na haligi na asero (inner diameter 100 × 1.8 mm) ayon sa isang optimized packing scheme. Ang pag-iimpake ng haligi ay tinutulungan ng mekanikal na panginginig ng boses upang matiyak ang isang pare-parehong layer sa loob ng haligi. Ang naka-pack na haligi ay nasuri para sa paghihiwalay ng isang halo ng mga peptide na binubuo ng limang peptides (Gly-Tyr, Gly-Leu-Tyr, Gly-Gly-Tyr-Arg, Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg, leucine-enkephalin peptide). at tryptic hydrolysates ng human serum albumin (HSA). Napagmasdan na ang pinaghalong peptide at ang HSA tryptic digest ay naghiwalay na may mahusay na resolusyon at kahusayan. Ang kahusayan sa paghihiwalay ng column ng PMP ay inihambing sa column ng Ascentis Express RP-Amide. Napansin na ang mga peptide at protina ay may mahusay na resolusyon at mataas na kahusayan sa paghihiwalay sa haligi ng PMP, at ang kahusayan ng paghihiwalay ng haligi ng PMP ay mas mataas kaysa sa haligi ng Ascentis Express RP-Amide.
PEG (polyethylene glycol), urea, acetic acid, trimethoxyorthosilicate (TMOS), trimethylchlorosilane (TMCS), trypsin, human serum albumin (HSA), ammonium chloride, urea, hexamethylmethacryloyldisilazane (HMDS), methacryloyl chloride (MC4, BP, BP), styrene, acetonitrile (ACN) para sa HPLC, methanol, 2-propanol at acetone. Sigma-Aldrich Company (St. Louis, Missouri, USA).
Ang pinaghalong urea (8 g), polyethylene glycol (8 g) at 8 ml ng 0.01 N. acetic acid ay hinalo sa loob ng 10 minuto, at 24 ml ng TMOS ang idinagdag dito sa ilalim ng paglamig ng yelo. Ang pinaghalong reaksyon ay pinainit sa 40°C sa loob ng 6 na oras at pagkatapos ay sa 120°C sa loob ng 8 oras sa isang hindi kinakalawang na asero na autoclave. Ang tubig ay decanted at ang nalalabi ay natuyo sa 70 ° C sa loob ng 12 oras. Ang pinatuyong malambot na mga bloke ay dinudurog nang maayos at na-calcine sa isang hurno sa 550°C sa loob ng 12 oras. Tatlong batch ang inihanda at nailalarawan upang subukan ang muling paggawa ng mga laki ng butil, laki ng butas at lugar sa ibabaw.
Polar group at stationary phase para sa polystyrene chain. Ang pamamaraan ng paghahanda ay inilarawan sa ibaba.
Ang N-phenylmaleimide (200 mg) at methyl vinyl isocyanate (100 mg) ay natunaw sa anhydrous toluene, at pagkatapos ay 0.1 ml ng 2,2′-azoisobutyronitrile (AIBN) ay idinagdag sa reaction flask upang makakuha ng copolymer ng phenylmaleimide at methylPMCP isocyanate (methylPMCP isocyanate). ) Ang timpla ay pinainit sa 60°C sa loob ng 3 oras, sinala at pinatuyo sa oven sa 40°C sa loob ng 3 oras.
Ang pinatuyong mga particle ng silica (2 g) ay dispersed sa dry toluene (100 ml), hinalo at sonicated para sa 10 min sa isang 500 ml round bottom flask. Ang PMCP (10 mg) ay natunaw sa toluene at idinagdag ang dropwise sa reaction flask sa pamamagitan ng isang karagdagan na funnel. Ang timpla ay refluxed sa 100 ° C sa loob ng 8 oras, sinala, hugasan ng acetone at tuyo sa 60 ° C sa loob ng 3 oras. Pagkatapos, ang mga silica particle na nauugnay sa PMCP (100 g) ay natunaw sa toluene (200 ml), at ang 4-hydroxy-TEMPO (2 ml) ay idinagdag dito sa pagkakaroon ng 100 μl ng dibutyltin dilaurate bilang isang katalista. Ang halo ay hinalo sa 50 ° C sa loob ng 8 oras, sinala at tuyo sa 50 ° C sa loob ng 3 oras.
Ang styrene (1 ml), benzoyl peroxide BPO (0.5 ml) at mga particle ng silica na nakakabit sa TEMPO-PMCP (1.5 g) ay dispersed sa toluene at nilinis ng nitrogen. Ang polymerization ng styrene ay isinasagawa sa 100 ° C sa loob ng 12 oras. Ang resultang produkto ay hinugasan ng methanol at pinatuyo magdamag sa 60°C. Ang pangkalahatang pamamaraan ng reaksyon ay ipinapakita sa fig. isa.
Ang mga sample ay na-degassed sa 393 K para sa 1 h hanggang sa isang natitirang presyon na mas mababa sa 10-3 Torr ay nakuha. Ang halaga ng N2 adsorbed sa relatibong presyon P/P0 = 0.99 ay ginamit upang matukoy ang kabuuang dami ng butas. Ang morpolohiya ng dalisay at ligand-bound na mga particle ng silica ay napagmasdan gamit ang isang scanning electron microscope (Hitachi High Technologies, Tokyo, Japan). Ang mga dry sample (pure silica at ligand bound silica particle) ay inilagay sa aluminum rods gamit ang carbon tape. Ang ginto ay idineposito sa sample gamit ang isang Q150T sputtering device, at isang 5 nm makapal na Au layer ang idineposito sa sample. Pinapabuti nito ang kahusayan ng proseso ng mababang boltahe at nagbibigay ng pinong malamig na pag-spray. Ang pagtatasa ng elemento ay isinagawa gamit ang isang Thermo Electron (Waltham, MA, USA) Flash EA1112 elemental composition analyzer. Ang isang Malvern particle size analyzer (Worcestershire, UK) Mastersizer 2000 ay ginamit upang makuha ang pamamahagi ng laki ng butil. Ang mga uncoated silica particle at ligand-bound silica particle (5 mg bawat isa) ay dispersed sa 5 ml ng isopropanol, sonicated para sa 10 minuto, nabalisa para sa 5 minuto, at inilagay sa isang Mastersizer optical bench. Ang Thermogravimetric analysis ay isinasagawa sa bilis na 5 °C bawat minuto sa hanay ng temperatura mula 30 hanggang 800 °C.
Ang glass fiber lined narrow bore stainless steel columns na may mga sukat (ID 100 × 1.8 mm) ay naka-pack sa pamamagitan ng slurry filling method na sumusunod sa parehong pamamaraan tulad ng sa reference 31. Stainless steel column (glass lined, ID 100 × 1 .8 mm) at isang outlet na naglalaman ng 1 µm frit ay konektado sa isang slurry packaging machine, De USA. Maghanda ng suspension ng stationary phase sa pamamagitan ng pagsususpinde ng 150 mg ng stationary phase sa 1.2 ml ng methanol at pagpapakain nito sa isang reservoir column. Ang methanol ay ginamit bilang slurry solvent at control solvent. I-pack ang column sa pamamagitan ng paglalapat ng pressure sequence na 100 MP para sa 10 min, 80 MP para sa 15 min, at 60 MP para sa 30 min. Ang proseso ng pag-iimpake ay gumamit ng dalawang gas chromatography column vibrator (Alltech, Deerfield, IL, USA) para sa mekanikal na vibration upang matiyak ang pare-parehong column packing. Isara ang slurry packer at dahan-dahang bitawan ang pressure para maiwasan ang pagkasira ng string. Ang haligi ay nadiskonekta mula sa slurry nozzle at isa pang kabit ay nakakabit sa pumapasok at nakakonekta sa LC system upang subukan ang operasyon nito.
Ang isang custom na MLC ay ginawa gamit ang isang LC pump (10AD Shimadzu, Japan), isang sampler na may 50 nL injection loop (Valco (USA) C14 W.05), isang membrane degasser (Shimadzu DGU-14A), at isang UV-VIS capillary window. Detector device (UV-2075) at enamelled microcolumn. Gumamit ng napakakitid at maiikling connecting tubes para mabawasan ang epekto ng karagdagang pagpapalawak ng column. Pagkatapos punan ang column, mag-install ng capillary (50 µm id 365) sa labasan ng 1/16″ reducing junction at mag-install ng capillary (50 µm) ng reducing junction. Ang pangongolekta ng data at pagpoproseso ng chromatogram ay isinasagawa gamit ang Multichro 2000 software. Sa 254 nm, ang UV absorbance ng mga subject analytes ay sinusubaybayan sa 0. Ang Chromatographic data ay nasuri gamit ang OriginPro8 (Northampton, MA).
Human serum albumin, lyophilized powder, ≥ 96% (agarose gel electrophoresis) 3 mg na may halong trypsin (1.5 mg), 4.0 M urea (1 ml) at 0.2 M ammonium bicarbonate (1 ml). Ang solusyon ay hinalo para sa 10 min at itago sa isang paliguan ng tubig sa 37 ° C sa loob ng 6 na oras, pagkatapos ay pinatay ng 1 ml ng 0.1% TFA. Salain ang solusyon at mag-imbak sa ibaba 4°C.
Ang paghihiwalay ng isang pinaghalong peptides at tryptic digest HSA sa isang haligi ng PMP ay nasuri nang hiwalay. Suriin ang tryptic hydrolysis ng pinaghalong peptides at HSA na pinaghihiwalay ng isang PMP column at ihambing ang mga resulta sa isang Ascentis Express RP-Amide column. Ang bilang ng mga teoretikal na plato ay kinakalkula gamit ang sumusunod na equation:
Ang mga imahe ng SEM ng purong silica particle at ligand bound silica particle ay ipinapakita sa Figure 2. Ang SEM imahe ng purong silica particle (A, B) ay nagpapakita ng spherical na hugis kung saan ang mga particle ay pinahaba o may hindi regular na simetrya kumpara sa aming mga nakaraang pag-aaral. Ang ibabaw ng mga particle ng silica na nakatali ng ligand (C, D) ay mas makinis kaysa sa purong mga particle ng silica, na maaaring dahil sa mga polystyrene chain na sumasaklaw sa ibabaw ng mga particle ng silica.
Pag-scan ng mga electron micrograph ng purong silica particle (A, B) at ligand bound silica particle (C, D).
Ang distribusyon ng laki ng butil ng mga purong silica particle at ligand-bound na silica particle ay ipinapakita sa Fig. 2. 3(A). Ang volumetric na particle size distribution curves ay nagpakita na ang silica particle size ay tumaas pagkatapos ng kemikal na pagbabago (Fig. 3A). Ang data ng pamamahagi ng laki ng silica particle mula sa kasalukuyang pag-aaral at sa nakaraang pag-aaral ay inihambing sa Talahanayan 1(A). Ang volumetric particle size d(0.5) ng PMP ay 3.36 µm, kumpara sa ad(0.5) value na 3.05 µm sa aming nakaraang pag-aaral (polystyrene bonded silica particles)34. Dahil sa pagbabago sa ratio ng PEG, urea, TMOS at acetic acid sa pinaghalong reaksyon, ang pamamahagi ng laki ng butil ng batch na ito ay mas makitid kumpara sa aming nakaraang pag-aaral. Ang laki ng particle ng PMP phase ay bahagyang mas malaki kaysa sa polystyrene bound silica particle phase na pinag-aralan natin kanina. Nangangahulugan ito na ang paggana sa ibabaw ng mga particle ng silica na may styrene ay nagdeposito lamang ng isang polystyrene layer (0.97 µm) sa ibabaw ng silica, habang sa PMP phase ang kapal ng layer ay 1.38 µm.
Pamamahagi ng laki ng butil (A) at pamamahagi ng laki ng butas (B) ng purong mga particle ng silica at mga particle ng silica na nakagapos ng ligand.
Ang laki ng butas, dami ng butas, at lugar ng ibabaw ng mga particle ng silica na ginamit sa pag-aaral na ito ay ipinapakita sa Talahanayan 1 (B). Ang mga profile ng PSD ng purong mga particle ng silica at mga particle ng silica na nakagapos ng ligand ay ipinapakita sa Fig. 3(B). Ang mga resulta ay maihahambing sa aming nakaraang pag-aaral34. Ang laki ng pore ng purong at ligand-bound na silica particle ay 310 Å at 241 Å, ayon sa pagkakabanggit, na nagpapahiwatig na pagkatapos ng pagbabago ng kemikal, ang laki ng pore ay bumaba ng 69 Å, tulad ng ipinapakita sa Talahanayan 1 (B), at ang shift curve ay ipinapakita sa Fig. m2/g). Tulad ng ipinapakita sa Talahanayan 1(B), ang surface area (m2/g) ng mga particle ng silica pagkatapos ng pagbabago ng kemikal ay bumaba rin mula 116 m2/g hanggang 105 m2/g.
Ang mga resulta ng elemental na pagsusuri ng nakatigil na yugto ay ipinakita sa Talahanayan. 2. Ang carbon content ng kasalukuyang stationary phase ay 6.35%, na mas mababa kaysa sa aming nakaraang pag-aaral (silica particles na nauugnay sa polystyrene, 7.93%35 at 10.21%, ayon sa pagkakabanggit) 42. Ang carbon content ng kasalukuyang stationary phase sa ibaba, dahil ang ilang mga polar ligand tulad ng phenylmaleimide to methylMP isocyanate ay ginamit (mayroong methylMP isocyanate) at O4PC. styrene sa paghahanda ng SP. Ang porsyento ng timbang ng nitrogen sa kasalukuyang nakatigil na yugto ay 2.21% kumpara sa 0.1735 at 0.85% sa mga nakaraang pag-aaral42. Nangangahulugan ito na ang kasalukuyang nakatigil na yugto ay may mataas na porsyento ng timbang ng nitrogen dahil sa phenylmaleimide. Katulad nito, ang mga produkto (4) at (5) ay may nilalamang carbon na 2.7% at 2.9%, ayon sa pagkakabanggit, habang ang panghuling produkto (6) ay may nilalamang carbon na 6.35%, tulad ng ipinapakita sa Talahanayan 2. Ginamit ang Thermogravimetric analysis (TGA) sa nakatigil na yugto ng PMP upang subukan ang pagbaba ng timbang, at ang kurba ng TGA ay ipinapakita sa Figure 6 ng pagbaba ng timbang. na sumasang-ayon sa nilalaman ng carbon (6.35%), dahil ang mga ligand ay naglalaman ng hindi lamang C , kundi pati na rin ang N, O at H.
Ang ligand na phenylmaleimide-methylvinyl isocyanate ay pinili upang baguhin ang ibabaw ng mga particle ng silica dahil sa mga polar na phenylmaleimide at vinylisocyanate na grupo nito. Ang mga grupo ng vinyl isocyanate ay maaaring higit na tumugon sa styrene sa pamamagitan ng pamumuhay ng radikal na polimerisasyon. Ang pangalawang dahilan ay ang pagpasok ng isang pangkat na may katamtamang pakikipag-ugnayan sa analyte at walang malakas na pakikipag-ugnayan ng electrostatic sa pagitan ng analyte at ng nakatigil na yugto, dahil ang phenylmaleimide moiety ay walang virtual na singil sa normal na pH. Ang polarity ng nakatigil na yugto ay maaaring kontrolin ng pinakamainam na dami ng styrene at ang oras ng reaksyon ng free radical polymerization. Ang huling hakbang ng reaksyon (free radical polymerization) ay kritikal dahil binabago nito ang polarity ng nakatigil na yugto. Ang pagtatasa ng elemento ay isinagawa upang suriin ang nilalaman ng carbon sa mga nakatigil na yugto na ito. Napagmasdan na ang pagtaas ng dami ng styrene at ang oras ng reaksyon ay nagdaragdag sa nilalaman ng carbon ng nakatigil na yugto at kabaliktaran. Ang mga SP na inihanda na may iba't ibang konsentrasyon ng styrene ay may iba't ibang carbon load. Katulad nito, ang mga nakatigil na phase na ito ay inilagay sa mga haligi ng hindi kinakalawang na asero at ang kanilang mga chromatographic na katangian (selectivity, resolution, N value, atbp.) ay nasuri. Batay sa mga eksperimentong ito, napili ang isang na-optimize na komposisyon para sa paghahanda ng nakatigil na yugto ng PMP upang magbigay ng kontroladong polarity at mahusay na pagpapanatili ng analyte.
Sinuri din ang column ng PMP para sa pagsusuri ng limang mixtures ng peptides (Gly-Tyr, Gly-Leu-Tyr, Gly-Gly-Tyr-Arg, Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg, leucine-enkephalin) gamit ang kapasidad ng mobile phase. 60/40 (v/v) ACN/tubig (0.1% TFA) sa bilis ng daloy na 80 µl/min. Sa ilalim ng pinakamainam na kondisyon ng elution (200,000 plates/m), ang bilang ng theoretical plates (N) bawat column (100 × 1.8 mm) ay 20,000 ± 100. Ang mga value ng N para sa tatlong PMP column ay ipinapakita sa Table 3 at ang mga chromatograms ay ipinapakita sa Figure 5A. Mabilis na pagsusuri sa mataas na rate ng daloy (700 µl/min) sa isang column ng PMP, limang peptide ang na-eluted sa loob ng isang minuto, mahusay na N value na 13,500 ± 330 bawat column (100 x 1.8 mm diameter), katumbas ng 135,000 plates/m (Fig. 5B). Tatlong haligi ng parehong laki (inner diameter 100 x 1.8 mm) ay napuno ng tatlong magkakaibang mga batch ng PMP stationary phase upang subukan ang muling paggawa. Ang mga analyte ay naitala para sa bawat column sa pamamagitan ng paghihiwalay ng parehong pinaghalong pagsubok sa bawat column gamit ang pinakamainam na kondisyon ng elution, bilang ng mga theoretical plates N, at oras ng pagpapanatili. Ang data ng reproducibility para sa mga column ng PMP ay ipinapakita sa Talahanayan 4. Ang reproducibility ng column ng PMP ay mahusay na nauugnay sa napakababang mga halaga ng %RSD tulad ng ipinapakita sa Talahanayan 3.
Paghihiwalay ng mga pinaghalong peptide sa isang PMP column (B) at isang Ascentis Express RP-Amide column (A), mobile phase 60/40 ACN/H2O (TFA 0.1%), PMP column dimensions (100 x 1.8 mm id) , pagsusuri Elution order ng mga compound: 1 (Gly-Tyr-Leu), 3-Leu (Leu-Tyr) (Gly-Gly-Tyr-Arg), 4 (Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg) at 5 ( leucic acid enkephalin).
Ang isang haligi ng PMP (inner diameter 100 x 1.8 mm) ay nasuri para sa paghihiwalay ng tryptic hydrolyzate ng human serum albumin ng HPLC. Ang chromatogram sa Figure 6 ay nagpapakita na ang mga sample ay mahusay na pinaghiwalay na may napakahusay na resolution. Ang mga solusyon sa HSA ay nasuri gamit ang isang daloy ng rate ng 100 μl / min, isang mobile phase ng 70/30 acetonitrile / tubig at 0.1% TFA. Ang cleavage ng HSA ay nahahati sa 17 peak, tulad ng ipinapakita sa chromatogram (Fig. 6), na tumutugma sa 17 peptides. Ang mga kahusayan sa paghihiwalay ng mga indibidwal na taluktok mula sa HSA hydrolyzate ay kinakalkula at ang mga halaga ay ipinapakita sa Talahanayan 5.
Ang HSA tryptic hydrolysates ay pinaghiwalay sa isang PMP column (inner diameter 100 x 1.8 mm), flow rate (100 μl/min), mobile phase 60/40 acetonitrile/water, at 0.1% TFA.
kung saan ang L ay ang haba ng column, ang η ay ang lagkit ng mobile phase, ang ΔP ay ang back pressure ng column, at ang u ay ang linear velocity ng mobile phase. Ang pagkamatagusin ng haligi ng PMP ay 2.5 × 10–14 m2, ang rate ng daloy ay 25 µl/min, ginamit ang 60/40 v/v. ACN/tubig. Ang permeability ng column ng PMP (ID 100 × 1.8 mm) ay katulad ng sa aming nakaraang pag-aaral sa Ref.34. Ang permeability ng isang column na puno ng superficially porous na particle ay 1.7×10 .6 µm, 2.5×10-14 m2 para sa 5 µm particle43. Samakatuwid, ang permeability ng PMP phase ay katulad ng permeability ng core-shell particle na may sukat na 5 μm.
kung saan ang Wx ay ang masa ng column na puno ng chloroform, ang Wy ay ang masa ng column na puno ng methanol, at ang ρ ay ang density ng solvent. Densidad ng methanol (ρ = 0.7866) at chloroform (ρ = 1.484). Ang kabuuang porosity ng silica-C18 particle column (100 × 1.8 mm ID)34 at ang dati naming pinag-aralan na C18-urea31 column ay 0.63 at 0.55, ayon sa pagkakabanggit. Nangangahulugan ito na ang pagkakaroon ng mga urea ligand ay binabawasan ang pagkamatagusin ng nakatigil na yugto. Sa kabilang banda, ang kabuuang porosity ng PMP column (inner diameter 100 × 1.8 mm) ay 0.60. Ang mga column ng PMP ay hindi gaanong permeable kaysa sa mga column na naka-pack na may mga C18 bound silica particle dahil sa C18 type stationary phase ang C18 ligands ay nakakabit sa mga silica particle sa linear chain, habang sa polystyrene type stationary phases isang medyo makapal na polimer ang nabuo sa paligid ng mga particle. layer A. Sa isang karaniwang eksperimento, ang porosity ng column ay kinakalkula bilang mga sumusunod:
Sa fig. Ang 7A, B ay nagpapakita ng mga plot ng Van Deemter para sa isang PMP column (id 100 x 1.8 mm) at isang Ascentis Express RP-Amide column (id 100 x 1.8 mm) sa ilalim ng parehong mga kundisyon ng elution, 60/40 ACN/H2O at 0 .1% TFA 20 µl/min sa parehong column hanggang 80µl/min. Ang pinakamababang halaga ng HETP sa pinakamainam na rate ng daloy (80 µl/min) ay 2.6 µm at 3.9 µm para sa column ng PMP at column ng Ascentis Express RP-Amide, ayon sa pagkakabanggit. Ipinapakita ng mga halaga ng HETP na ang kahusayan sa paghihiwalay ng column ng PMP (100 x 1.8 mm id) ay mas mataas kaysa sa column na Ascentis Express RP-Amide na available sa komersyo (100 x 1.8 mm id). Ang van Deemter graph sa Fig. 7(A) ay nagpapakita na ang pagbaba sa halaga ng N ay hindi gaanong mas mataas sa pagtaas ng daloy kumpara sa aming nakaraang pag-aaral. Ang mas mataas na kahusayan sa paghihiwalay ng column ng PMP (id 100 × 1.8 mm) kumpara sa column ng Ascentis Express RP-Amide ay batay sa pinahusay na hugis at laki ng particle at ang sopistikadong pamamaraan ng pag-pack ng column na ginagamit sa kasalukuyang gawain34.
(A) Van Deemter plot (HETP vs. mobile phase linear velocity) nakuha sa isang PMP column (id 100 x 1.8 mm) sa 60/40 ACN/H2O na may 0.1% TFA. (B) Van Deemter plot (HETP versus mobile phase linear velocity) na nakuha sa isang Ascentis Express RP-Amide column (id 100 x 1.8 mm) sa 60/40 ACN/H2O na may 0.1% TFA.
Ang isang polar stationary phase ng intercalated polystyrene ay inihanda at nasuri para sa paghihiwalay ng isang pinaghalong synthetic peptides at tryptic hydrolyzate ng human serum albumin (HSA) sa high performance liquid chromatography. Ang chromatographic performance ng PMP columns para sa peptide mixtures ay mahusay sa mga tuntunin ng separation efficiency at resolution. Ang pinahusay na kahusayan sa paghihiwalay ng mga column ng PMP ay dahil sa ilang kadahilanan tulad ng laki ng silica particle at laki ng butas, kinokontrol na synthesis ng mga nakatigil na phase, at kumplikadong mga materyales sa pag-pack ng column. Bilang karagdagan sa mataas na kahusayan sa paghihiwalay, ang isa pang bentahe ng nakatigil na bahaging ito ay ang mababang presyon ng likod ng haligi sa mataas na mga rate ng daloy. Ang mga column ng PMP ay lubos na nagagawang muli at maaaring magamit upang pag-aralan ang mga pinaghalong peptides at tryptic digestion ng iba't ibang mga protina. Nilalayon naming gamitin ang column na ito para sa paghihiwalay ng mga bioactive compound mula sa mga natural na produkto, mga extract ng mga halamang gamot at mushroom sa liquid chromatography. Sa hinaharap, susuriin din ang mga column ng PMP para sa paghihiwalay ng mga protina at monoclonal antibodies.
Field, JK, Euerby, MR, Lau, J., Thøgersen, H. & Petersson, P. Pagsisiyasat sa reversed phase chromatography peptide separation systems bahagi I: Pagbuo ng protocol para sa column characterization. Field, JK, Euerby, MR, Lau, J., Thøgersen, H. & Petersson, P. Pagsisiyasat sa reversed phase chromatography peptide separation systems part I: Pagbuo ng isang protocol para sa column characterization.Field, JK, Owerby, MR, Lau, J., Togersen, H., at Petersson, P. Investigation of Peptide Separation Systems by Reverse-Phase Chromatography, Part I: Developing a Protocol for Column Characterization. Field, JK, Euerby, MR, Lau, J., Thøgersen, H. & Petersson, P. Pagsisiyasat sa reversed phase chromatography peptide separation system bahagi I: Pagbuo ng isang protocol para sa mga katangian ng column. Field, JK, Euerby, MR, Lau, J., Thøgersen, H. & Petersson, P. Pagsisiyasat sa reversed phase chromatography peptide separation system bahagi I: Pagbuo ng isang protocol para sa mga katangian ng column.Field, JK, Owerby, MR, Lau, J., Togersen, H., at Petersson, P. Investigation of Peptide Separation Systems by Reverse-Phase Chromatography, Part I: Developing a Protocol for Column Characterization.J.色谱法。 1603，113-129。 https://doi.org/10.1016/j.chroma.2019.05.038(2019).
Gomez, B. et al. Mga pamamaraan para sa paglikha ng pinahusay na aktibong peptides para sa paggamot ng mga nakakahawang sakit. Biotechnology. Mga nakamit 36(2), 415–429. https://doi.org/10.1016/j.biotechadv.2018.01.004 (2018).
Vlieghe, P., Lisowski, V., Martinez, J. & Khrestchatisky, M. Synthetic therapeutic peptides: Science at market. Vlieghe, P., Lisowski, V., Martinez, J. & Khrestchatisky, M. Synthetic therapeutic peptides: Science at market.Vliege P, Lisowski V, Martinez J at Chreschatyski M. Synthetic therapeutic peptides: science at market.Vliege P, Lisowski V, Martinez J at Khreschatsky M. Synthetic therapeutic peptides: science at market. pagtuklas ng droga. Ngayon 15 (1–2), 40–56. https://doi.org/10.1016/j.drudis.2009.10.009 (2010).
Xie, F., Smith, RD & Shen, Y. Advanced na proteomic liquid chromatography. Xie, F., Smith, RD & Shen, Y. Advanced na proteomic liquid chromatography.Tingnan ang F., Smith RD at Shen Yu. Advanced na proteomic liquid chromatography. Xie, F., Smith, RD & Shen, Y. 高级蛋白质组液相色谱。 Xie, F., Smith, RD & Shen, Y. Advanced na komposisyon ng protina 液相色谱。Tingnan ang F., Smith RD at Shen Yu. Advanced na proteomic liquid chromatography.J. Chromatography. A 1261, 78–90 (2012).
Liu, W. et al. Nagagawa ng advanced na liquid chromatography-mass spectrometry na pagsamahin ang malawak na batayan ng metabolomics at proteomics. anus. Chim. Acta 1069, 89–97 (2019).
Chesnut, SM & Salisbury, JJ Ang papel ng UHPLC sa pagpapaunlad ng parmasyutiko. Chesnut, SM & Salisbury, JJ Ang papel ng UHPLC sa pagpapaunlad ng parmasyutiko.Chesnut, SM at Salisbury, JJ Ang papel ng UHPLC sa pagpapaunlad ng parmasyutiko.Chesnut, SM at Salisbury, JJ Ang papel ng UHPLC sa pagpapaunlad ng droga. J. Sept Agham. 30(8), 1183–1190 (2007).
Wu, N. & Clausen, AM Pangunahin at praktikal na aspeto ng ultrahigh pressure liquid chromatography para sa mabilis na paghihiwalay. Wu, N. & Clausen, AM Pangunahin at praktikal na aspeto ng ultrahigh pressure liquid chromatography para sa mabilis na paghihiwalay.Wu, N. at Clausen, AM Pangunahin at praktikal na aspeto ng high pressure liquid chromatography para sa mabilis na paghihiwalay. Wu, N. & Clausen, AM 用于快速分离的超高压液相色谱的基础和实践方面。 Wu, N. & Clausen, AM Basic at praktikal na mga aspeto ng ultra-high pressure liquid chromatography para sa mabilis na paghihiwalay.Wu, N. at Clausen, AM Pangunahin at praktikal na aspeto ng high pressure liquid chromatography para sa mabilis na paghihiwalay.J. Setyembre Agham. 30(8), 1167–1182. https://doi.org/10.1002/jssc.200700026 (2007).
Wren, SA & Tchelitcheff, P. Paggamit ng ultra-performance liquid chromatography sa pharmaceutical development. Wren, SA & Tchelitcheff, P. Paggamit ng ultra-performance liquid chromatography sa pharmaceutical development.Ren, SA at Chelischeff, P. Ang paggamit ng ultra high performance liquid chromatography sa pharmaceutical development. Wren, SA & Tchelitcheff, P. 超高效液相色谱在药物开发中的应用。 Wren, SA at Tchelitcheff, P.Ren, SA at Chelischeff, P. Application ng ultra-performance liquid chromatography sa pagbuo ng gamot.J. Chromatography. 1119(1-2), 140-146. https://doi.org/10.1016/j.chroma.2006.02.052 (2006).
Gu, H. et al. Isang monolithic macroporous hydrogel na nagmula sa isang oil-in-water emulsion na may mataas na internal phase para sa mahusay na paglilinis ng enterovirus 71. Chemical. proyekto. Journal 401, 126051 (2020).
Shi, Y., Xiang, R., Horváth, C. & Wilkins, JA Ang papel ng liquid chromatography sa proteomics. Shi, Y., Xiang, R., Horváth, C. & Wilkins, JA Ang papel ng liquid chromatography sa proteomics.Shi, Y., Xiang, R., Horvath, C. at Wilkins, JA Ang papel ng likidong kromatograpiya sa proteomics. Shi, Y., Xiang, R., Horváth, C. & Wilkins, JA 液相色谱在蛋白质组学中的作用。 Shi, Y., Xiang, R., Horváth, C. & Wilkins, JAShi, Y., Xiang, R., Horvath, C. at Wilkins, JA Ang papel ng likidong kromatograpiya sa proteomics.J. Chromatography. A 1053 (1-2), 27-36 (2004).
Fekete, S., Vutey, J.-L. & Guillarme, D. Mga bagong uso sa reversed-phase liquid chromatographic separations ng mga therapeutic peptides at protina: Teorya at mga aplikasyon. & Guillarme, D. Mga bagong uso sa reversed-phase liquid chromatographic separations ng mga therapeutic peptides at protina: Teorya at mga aplikasyon. & Guillarme, D. Новые тенденции в разделении терапевтических пептидов и белков с помощью жидкостной хроматографира хроматографира хроматографира теория и приложения. & Guillarme, D. Mga bagong uso sa paghihiwalay ng mga therapeutic peptides at protina sa pamamagitan ng reverse phase liquid chromatography: teorya at mga aplikasyon. & Guillarme, D. 治疗性肽和蛋白质的反相液相色谱分离的新趋势：理论和应用。 & Guillarme, D.at Guillarmé, D. Mga bagong uso sa paghihiwalay ng mga therapeutic peptides at protina sa pamamagitan ng reverse phase liquid chromatography: teorya at mga aplikasyon.J. Pharm. Biomedical Science. anus. 69, 9–27 (2012).
Gilar, M., Olivova, P., Daly, AE & Gebler, JC Dalawang-dimensional na paghihiwalay ng mga peptide gamit ang RP-RP-HPLC system na may magkakaibang pH sa una at pangalawang dimensyon ng paghihiwalay. Gilar, M., Olivova, P., Daly, AE & Gebler, JC Dalawang-dimensional na paghihiwalay ng mga peptide gamit ang RP-RP-HPLC system na may magkakaibang pH sa una at pangalawang dimensyon ng paghihiwalay.Gilar M., Olivova P., Dali AE at Gebler JK Dalawang-dimensional na paghihiwalay ng mga peptide gamit ang RP-RP-HPLC system na may iba't ibang pH sa una at pangalawang sukat ng paghihiwalay.Gilar M., Olivova P., Dali AE at Gebler JK Dalawang-dimensional na paghihiwalay ng mga peptide gamit ang iba't ibang mga halaga ng pH sa una at pangalawang dimensyon ng paghihiwalay gamit ang RP-RP-HPLC system. J. Sept Agham. 28 (14), 1694–1703 (2005).
Fellitti, S. et al. Pagsisiyasat ng mass transfer at kinetic na katangian ng mga column ng high-performance na chromatography na puno ng ganap na porous at superficially porous na mga particle ng C18 na mas maliit sa 2 µm. J. Sept Science. 43 (9–10), 1737–1745 (2020).
Piovesana, S. et al. Mga kamakailang uso at analytical na hamon sa paghihiwalay, pagkilala, at pagpapatunay ng mga bioactive peptides ng halaman. anus. Anal ng nilalang. Kemikal. 410(15), 3425-3444. https://doi.org/10.1007/s00216-018-0852-x (2018).
Muller, JB et al. Proteomic na tanawin ng kaharian ng buhay. Kalikasan 582 (7813), 592–596. https://doi.org/10.1038/s41586-020-2402-x (2020).
De Luca, K. et al. Post-treatment ng therapeutic peptides sa pamamagitan ng preparative liquid chromatography. Molecules (Basel, Switzerland) 26(15), 4688 (2021).
Yang, Y. & Geng, X. Mixed-mode chromatography at mga aplikasyon nito sa mga biopolymer. Yang, Y. & Geng, X. Mixed-mode chromatography at mga aplikasyon nito sa mga biopolymer.Yang, Yu. at Geng, X. Mixed mode chromatography at ang aplikasyon nito sa mga biopolymer. Yang, Y. & Geng, X. 混合模式色谱及其在生物聚合物中的应用。 Yang, Y. & Geng, X. Mixed mode chromatography at ang aplikasyon nito sa mga biopolymer.Yang, Yu. at Gene, X. Mixed mode chromatography at ang aplikasyon nito sa mga biopolymer.J. Chromatography. A 1218(49), 8813–8825 (2011).