Salamat sa pagbisita sa Nature.com.Ang bersyon ng browser na iyong ginagamit ay may limitadong suporta sa CSS.Para sa pinakamagandang karanasan, inirerekomenda namin na gumamit ka ng na-update na browser (o huwag paganahin ang Compatibility Mode sa Internet Explorer).Pansamantala, upang matiyak ang patuloy na suporta, ire-render namin ang site nang walang mga istilo at JavaScript.
Ang Angustifolius lupine (NLL, Lupinus angustifolius L.) ay isang halamang leguminous na ginagamit para sa produksyon ng pagkain at pagpapabuti ng lupa.Ang pandaigdigang pagpapalawak ng NLL bilang isang pananim ay umakit ng maraming pathogenic fungi, kabilang ang lupine anthracnose, na nagiging sanhi ng mapangwasak na sakit na anthracnose.Dalawang alleles, Lanr1 at AnMan, na nagbibigay ng mas mataas na pagtutol, ay ginamit sa pag-aanak ng NLL, ngunit ang pinagbabatayan na mga mekanismo ng molekular ay nananatiling hindi kilala.Sa pag-aaral na ito, ginamit ang mga marker ng Lanr1 at AnMan upang i-screen ang mga sample ng European NLL.Ang pagsubok sa bakuna sa isang kontroladong kapaligiran ay nagpatunay sa bisa ng parehong lumalaban na mga donor.Ang differential gene expression profiling ay isinagawa sa kinatawan na lumalaban at madaling kapitan ng mga linya.Ang paglaban sa anthracnose ay nauugnay sa sobrang pagpapahayag ng mga termino ng gene ontology na "GO:0006952 Defense Response", "GO:0055114 Redox Process", at "GO:0015979 Photosynthesis".Bilang karagdagan, ang linya ng Lanr1(83A:476) ay nagpakita ng makabuluhang transcriptome reprogramming nang mabilis pagkatapos ng inoculation, habang ang iba pang mga linya ay nagpakita ng pagkaantala sa tugon na ito nang humigit-kumulang 42 oras.Ang mga tugon sa pagtatanggol ay nauugnay sa TIR-NBS, CC-NBS-LRR at NBS-LRR na mga gene, 10 protina na kasangkot sa pathogenesis, lipid transfer protein, endoglucan-1,3-β-glucosidase, glycine-rich cell wall protein, at mga gene mula sa reaktibong landas ng oxygen.Ang mga maagang tugon sa 83A:476, kabilang ang maingat na pagsugpo sa mga gene na nauugnay sa photosynthesis, ay kasabay ng matagumpay na proteksyon sa panahon ng vegetative growth phase ng fungal biology, na nagmumungkahi na ang isang effector ay nagpapalitaw ng kaligtasan sa sakit.Ang reaksyon ng Mandeloop ay pinabagal, tulad ng pangkalahatang pahalang na pag-drag.
Ang makitid na dahon na lupine (NLL, Lupinus angustifolius L.) ay isang mataas na protina na cereal na nagmula sa kanlurang rehiyon ng Mediterranean1,2.Ito ay kasalukuyang pinatubo bilang isang pananim na pagkain para sa mga hayop at tao.Itinuturing din itong green manure sa mga crop rotation system dahil sa nitrogen fixation sa pamamagitan ng symbiotic nitrogen fixing bacteria at pangkalahatang pagpapabuti ng istraktura ng lupa.Ang NLL ay sumailalim sa isang mabilis na proseso ng domestication noong nakaraang siglo at nasa ilalim pa rin ng mataas na presyon ng pag-aanak3,4,5,6,7,8,9,10,11,12.Sa malawakang paglilinang ng NLL, ang sunud-sunod na mga pathogenic fungi ay nakabuo ng mga bagong niches sa agrikultura at nagdulot ng mga bagong sakit na sumisira sa pananim. Ang pinaka-kapansin-pansin para sa mga magsasaka at breeder ng lupine ay ang hitsura ng anthracnose, sanhi ng pathogenic fungus, Colletotrichum lupini (Bondar) Nirenberg, Feiler & Hagedorn13. Ang pinaka-kapansin-pansin para sa mga magsasaka at breeder ng lupine ay ang hitsura ng anthracnose, sanhi ng pathogenic fungus, Colletotrichum lupini (Bondar) Nirenberg, Feiler & Hagedorn13. Наиболее примечательным для фермеров и селекционеров люпина было появление антракноза, вызванного памогеннеров люпина было появление антракноза, вызванного памогенринкборски , Feiler at Hagedorn13. Ang pinaka-kapansin-pansin sa mga magsasaka at breeder ng lupine ay ang paglitaw ng anthracnose na dulot ng pathogenic fungus na Colletotrichum lupini (Bondar) Nirenberg, Feiler & Hagedorn13.对于羽扇豆农民和饲养者来说，最引人注目的是炭疽病的出现，它是由病原真由病原真tric菌病原真tric炭疽病的出现，它是由病原真tric菌 & Fenenbergi Lunenberg引起的。对于羽扇豆农民和饲养者来说，最引人注目的是炭疽病的出现，它是由病原眀由病原真菌菌真菌原真菌 Наиболее поразительным для фермеров и селекционеров люпина является появление антракноза, вызываемогебрикомтор Nirenberg, Feiler at Hagedorn13. Ang pinaka-kapansin-pansin sa mga magsasaka at breeder ng lupine ay ang paglitaw ng anthracnose na dulot ng pathogenic fungus na Colletotrichum lupini (Bondar) Nirenberg, Feiler & Hagedorn13.Ang mga pinakaunang ulat ng sakit ay nagmula sa Brazil at Estados Unidos, na may mga tipikal na sintomas na lumilitaw noong 1912 at 1929 ayon sa pagkakabanggit.Gayunpaman, pagkatapos ng humigit-kumulang 30 taon, ang pathogen ay itinalaga bilang Colletotrichum gloeosporioides (Penz.) Penz. & Sacc., teleomorph Glomerella cingulata (Stoneman) Spauld. & Sacc., teleomorph Glomerella cingulata (Stoneman) Spauld. & Sacc., телеоморф Glomerella cingulata (Stoneman) Spauld. & Sacc., teleomorph ng Glomerella cingulata (Stoneman) Spauld. & Sacc.，有目的形态的Glomerella cingulata (Stoneman) Spauld。 & Sacc.，有目的形态的Glomerella cingulata (Stoneman) Spauld。 & Sacc., Glomerella cingulata (Stoneman) Spauld в Целенаправленной морфологии. & Sacc., Glomerella cingulata (Stoneman) Spauld sa Targeted Morphology. & H. Schrenk,. & H. Schrenk, .at H. Schrenk. & H.施伦克，。 & H.施伦克，。at H. Schlenk, .Ang paunang phenotyping ng sakit na ginawa noong kalagitnaan ng ika-20 siglo ay nagpakita ng ilang pagtutol sa NLL at yellow lupine (L. luteus L.) accessions, ngunit lahat ng white lupine (L. albus L.) accessions na nasubok ay lubhang madaling kapitan15,16.Ipinakita ng mga pag-aaral na ang pag-unlad ng anthracnose ay nauugnay sa tumaas na pag-ulan (kahalumigmigan ng hangin) at temperatura (sa hanay na 12-28°C), na humahantong sa isang paglabag sa paglaban sa mas mataas na temperatura17, 18. Sa katunayan, ang oras na kinakailangan para tumubo ang conidia at magsimula ang sakit , ay apat na beses na mas maikli sa 24°C sa ilalim ng 12 oras na mataas na temperatura (4 na oras) C.Kaya, ang patuloy na pag-init ng mundo ay humantong sa pagkalat ng anthracnose.Gayunpaman, ang sakit ay naobserbahan sa France (1982) at Ukraine (1983) bilang isang harbinger ng isang nalalapit na banta, ngunit tila hindi pinansin ng industriya ng lupine noong panahong iyon20,21.Pagkalipas ng ilang taon, kumalat ang nakapipinsalang sakit na ito sa buong mundo at naapektuhan din ang mga pangunahing bansang gumagawa ng lupine tulad ng Australia, Poland at Germany22,23,24.Kasunod ng anthracnose outbreak noong kalagitnaan ng 1990s, nagresulta ang malawak na screening sa pagkakakilanlan ng ilang lumalaban na donor sa mga sample ng NLL19.Ang paglaban ng NLL sa anthracnose ay kinokontrol ng dalawang magkahiwalay na nangingibabaw na alleles na matatagpuan sa iba't ibang pinagmumulan ng germplasm: Lanr1 sa cultivar Tanjil at Wonga at AnMan sa cultivar.Mandalay 25, 26. Ang mga alleles na ito ay umaakma sa mga molecular marker na sumusuporta sa pagpili ng lumalaban na germplasm sa mga programa sa pag-aanak25,26,27,28,29,30.Ang lumalaban na linya ng pag-aanak 83A:476 na nagdadala ng Lanr1 allele ay na-crossed sa madaling kapitan ng ligaw na linya na P27255 upang makakuha ng populasyon ng RIL na naghihiwalay para sa anthracnose resistance, na naging posible upang italaga ang Lanr1 locus sa chromosome NLL-1131, 32, 33. Aligners mula sa isang balangkas ng pag-uugnay sa NLL-1, 32, 33. inihayag ang lokasyon ng lahat ng tatlong alleles sa parehong chromosome (NLL-11), ngunit sa iba't ibang mga posisyon29,34,35.Gayunpaman, dahil sa maliit na bilang ng mga RIL at ang malaking genetic na distansya sa pagitan ng mga marker at kaukulang mga alleles, walang maaasahang konklusyon ang maaaring makuha tungkol sa kanilang pinagbabatayan na mga gene.Sa kabilang banda, mahirap ang paggamit ng reverse genetics sa mga lupin dahil sa napakababang potensyal ng pagbabagong-buhay nito, na nagpapahirap sa genetic manipulation37.
Ang pagbuo ng domesticated germplasm na nagdadala ng ninanais na allele sa homozygous na estado, tulad ng 83A: 476 (Lanr1) at Mandelup (AnMan), ay nagbukas ng pinto sa pag-aaral ng anthracnose resistance sa harap ng pagkakaroon ng magkasalungat na kumbinasyon ng mga alleles sa mga ligaw na populasyon.Mga posibilidad ng mga mekanismo ng molekular.Ihambing ang mga tugon sa pagtatanggol na nabuo ng mga partikular na genotype.Sinuri ng pag-aaral na ito ang maagang transcriptome na tugon ng NLL sa pagbabakuna ng C. lupini.Una, ang isang European NLL germplasm panel na naglalaman ng 215 na linya ay na-screen gamit ang mga molecular marker na nagmamarka ng Lanr1 at AnMan alleles.Pagkatapos ay isinagawa ang anthracnose phenotyping sa 50 linya ng NLL, na dati nang napili para sa mga molekular na marker, sa ilalim ng kinokontrol na mga kondisyon.Batay sa mga eksperimentong ito, apat na linya na naiiba sa anthracnose resistance at Lanr1/AnMan allelic composition ang napili para sa differential defense gene expression profiling gamit ang dalawang pantulong na diskarte: high-throughput RNA sequencing at real-time PCR quantification.
Ang pag-screen ng isang set ng NLL germplasm (N = 215) na may mga marker na Lanr1 (Anseq3 at Anseq4) at AnMan (Anseq4) at AnMan (AnManM1) ay nagpakita na isang linya lamang (95726, malapit sa Salamanca-b) ang nagpapalaki ng "resistance" allele para sa lahat ng marker , habang ang "nakikita'8 ang lahat ng mga marker ng 5 marker" .5%) linya.Labintatlong linya ay gumawa ng dalawang "lumalaban" na mga allele ng Lanr1 marker, at 8 linya ay gumawa ng "lumalaban" na mga allele ng Lanr1.pananda.Ang "paglaban" allele ng AnMan marker (Karagdagang Talaan S1).Dalawang linya ay heterozygous para sa Anseq3 marker at isang heterozygous para sa AnManM1 marker.42 na linya (19.5%) ang nagdala ng magkasalungat na yugto ng Anseq3 at Anseq4 alleles, na nagpapahiwatig ng mataas na dalas ng recombination sa pagitan ng dalawang loci na ito.Ang mga anthracnose phenotypes sa ilalim ng kinokontrol na mga kondisyon (Karagdagang Talaan S2) ay nagsiwalat ng pagkakaiba-iba sa paglaban ng mga nasubok na genotypes, na makikita sa kalubhaan ng anthracnose.Ang mga pagkakaiba sa mga average na marka ay mula 1.8 (katamtamang lumalaban) hanggang 6.9 (madaling kapitan) at ang mga pagkakaiba sa timbang ng halaman ay mula 0.62 (madaling kapitan) hanggang 4.45 g (lumalaban). Nagkaroon ng makabuluhang ugnayan sa pagitan ng mga halagang naobserbahan sa dalawang replikasyon ng eksperimento (0.51 para sa mga marka ng kalubhaan ng sakit, P = 0.00017 at 0.61 para sa timbang ng halaman, P <0.0001) pati na rin sa pagitan ng dalawang parameter na ito (− 0.59 at − 0.77, P <0.000). Nagkaroon ng makabuluhang ugnayan sa pagitan ng mga halagang naobserbahan sa dalawang replikasyon ng eksperimento (0.51 para sa mga marka ng kalubhaan ng sakit, P = 0.00017 at 0.61 para sa timbang ng halaman, P <0.0001) pati na rin sa pagitan ng dalawang parameter na ito (− 0.59 at − 0.77, P <0.77, P <0.77). Выявлена ​​достоверная корреляция между значениями, наблюдаемыми в двух повторностях эксперимента (0,51 для тля бля, 0,51 для тя 0017 at 0,61 для массы растения, P < 0,0001), а также между этими двумя параметрами (-0,59 и -0,77, Р < 0,0001) Ang isang makabuluhang ugnayan ay natagpuan sa pagitan ng mga halaga na naobserbahan sa dalawang pag-uulit ng eksperimento (0.51 para sa mga marka ng kalubhaan ng sakit, P = 0.00017 at 0.61 para sa timbang ng halaman, P <0.0001), pati na rin sa pagitan ng dalawang parameter na ito (- 0.59 at -0.77, P < 0.0001)).在两次重复实验中观察到的值之间存在显着相关性（疾病严重程度评分中，00.000，P0.00，0.量为0.61，P < 0.0001）以及这两个参数之间（- 0.59 和- 0.77，P <0.0001).在 两 次 重复 实验 中 观察 的 值 之间 存在 相关性 （疾病 严重 程度 了 1 了 了 1 ， p = 0.00017 ， 植物 为 为 0.61 ， p <0.0001） 以及 两 个 参数 之间 （（（（- 0.0001） 以及 两 个 参数 之间 （（（（- 0.59 . 9 和- 0.77，P < 0.0001). Наблюдалась значительная корреляция между значениями, наблюдаемыми в двух повторностях (оценка тяжести видео, и0 за 0л, за 1 сса растения 0,61, P <0,0001), и между этими двумя параметрами (-0,59 и -0,0001) 0,77, P <0,0001. Nagkaroon ng makabuluhang ugnayan sa pagitan ng mga halagang naobserbahan sa dobleng (iskor ng kalubhaan ng sakit 0.51, P = 0.00017 at timbang ng halaman 0.61, P <0.0001) at sa pagitan ng dalawang parameter na ito (-0.59 at -0.0001) 0.77, P<0.0001 ).Ang mga tipikal na sintomas na makikita sa madaling kapitan ng mga halaman ay kinabibilangan ng kinking at twisting ng stem na kahawig ng istraktura ng "shepherd's bow", na sinusundan ng mga oval na lesyon na may orange/pink sporozoites (Karagdagang Fig. 1).Ang mga pag-access sa Australia na nagdadala ng Lanr1 (83A:476 at Tanjil) at AnMan (Mandelup) na mga gene ay katamtamang lumalaban, 0.0331 at 0.0036).Ang ilang mga linya na nagdadala din ng "lumalaban" na Lanr1 at/o AnMan alleles ay nagpapakita ng mga sintomas ng sakit.
Kapansin-pansin, ang ilang linya ng NLL na kulang sa anumang "lumalaban" na marker allele ay nagsiwalat ng mataas na antas ng anthracnose resistance (maihahambing o mas mataas kaysa sa Lanr1 o AnMan genotypes), tulad ng Boregine (P value <0.0001 para sa parehong mga parameter), Bojar (P value <0.0001 para sa marka at 0.001 para sa B9-5). puntos at hindi mahalaga para sa timbang). Kapansin-pansin, ang ilang linya ng NLL na kulang sa anumang "lumalaban" na marker allele ay nagsiwalat ng mataas na antas ng anthracnose resistance (maihahambing o mas mataas kaysa sa Lanr1 o AnMan genotypes), tulad ng Boregine (P value <0.0001 para sa parehong mga parameter), Bojar (P value <0.0001 para sa marka at 0.001 para sa B9-5). puntos at hindi mahalaga para sa timbang). Интересно, что несколько линий NLL, лишенных какого-либо «резистентного» маркерного аллеля, показали высокний коснокич урость у (сопоставимый или более высокий, чем для генотипов Lanr1 или AnMan), таких как Boregine (значение P <0,0001 для обои (х парада), Boregine (х парам) оценки и 0,001 для массы растения) at популяции B-549/79b (значение P <0,0001 для оценки и незначимо для массы). Kapansin-pansin, maraming linya ng NLL na walang anumang 'lumalaban' na marker allele ay nagpakita ng mataas na antas ng paglaban sa anthracnose (maihahambing sa o mas mataas kaysa sa Lanr1 o AnMan genotypes), tulad ng Boregine (P value <0.0001 para sa parehong mga parameter ), Bojar (P value < 0.0001 para sa pagsusuri at 0.0001 para sa timbang ng halaman at 0.0001 para sa bigat ng halaman at 0.0001 b. para sa pagsusuri at hindi makabuluhan para sa timbang).有趣的是，一些缺乏任何“抗性”标记等位基因的NLL 系显示出高水平的炭疽病抗中疽病抗怎型相当或更高），例如Boregine（两个参数的P 值< 0.0001）、Bojar（P 值<得分为0.0001，里礍片B-549/79b（得分P 值< 0.0001，重量不显着）。 Kapansin-pansin na ang ilang mga NLL system na walang anumang "antigenic" na mga marker ay nagpapakita ng mataas na pahalang na pagtutol (katumbas ng Lanr1 o AnMan na mga gene o mas mataas), tulad ng Boregine (parehong mga parameter P <0.0001), Bojar (P value <0.0001, plant weight 0.001) at strain B-549/79b (P) value <1.000. Интересно, что некоторые линии NLL, лишенные каких-либо маркерных аллелей «резистентности», показали высокиостозраки уротник внимые или выше, чем у генотипов Lanr1 o AnMan), такие как Boregine (значение P для обоих параметров <0,0001), Bojar (значение P <0,м01, рам) популяция B-549/79b (оценка P-значение <0,0001, масса незначительна). Kapansin-pansin, ang ilang mga linya ng NLL na walang anumang 'resistance' marker alleles ay nagpakita ng mataas na antas ng anthracnose resistance (maihahambing sa o mas mataas kaysa sa Lanr1 o AnMan genotypes), tulad ng Boregine (P value para sa parehong mga parameter <0.0001), Bojar (P-value <0.0001, bigat ng halaman 0.0001) at 0.001 na populasyon hindi makabuluhan ang timbang).Ang hindi pangkaraniwang bagay na ito ay nagmumungkahi ng posibilidad ng isang nobelang genetic na pinagmumulan ng paglaban, na nagpapaliwanag sa naobserbahang kakulangan ng ugnayan sa pagitan ng mga marker genotypes at mga sakit na phenotypes (mga halaga ng P mula ~0.42 hanggang ~0.98).Kaya, ang Kolmogorov-Smirnov test ay nagpakita na ang data sa anthracnose resistance ay humigit-kumulang na karaniwang ipinamamahagi para sa mga marka (P-values ​​​​0.25 at 0.11) at masa ng halaman (P-values ​​​​0.47 at 0.55), na nagmumungkahi na ako ay nag-hypothesize na mas maraming alleles kaysa Lanr1 at AnMan ang kasangkot.
Batay sa mga resulta ng screening ng anthracnose resistance, 4 na linya ang napili para sa transcriptome analysis: 83A:476, Boregine, Mandelup, at Population 22660. Ang mga linyang ito ay muling sinuri para sa anthrax resistance sa mga eksperimento sa inoculation sa pamamagitan ng RNA sequencing, sa kondisyon na pareho ang mga ito sa nakaraang pagsubok.Ang mga halaga ng marka ay ang mga sumusunod: Boregin (1.71 ± 1.39), 83A: 476 (2.09 ± 1.38), Mandelup (3.82 ± 1.42) at populasyon 22660 (6.11 ± 1.29 ).
Nakamit ng Illumina NovaSeq 6000 protocol ang isang average ng 40.5 Mread pares bawat sample (29.7 hanggang 54.4 Mreads) (Pandagdag na Talaan S3).Ang mga marka ng pagkakahanay sa reference sequence ay mula 75.5% hanggang 88.6%.Ang average na ugnayan ng data ng read count sa pagitan ng mga eksperimentong variant sa pagitan ng mga biological replicates ay mula 0.812 hanggang 0.997 (mean 0.959). Sa 35,170 na mga gene na nasuri, 2917 ay nagsiwalat ng walang pagpapahayag, at ang iba pang 4785 na mga gene ay ipinahayag sa hindi gaanong antas (base mean <5). Sa 35,170 na mga gene na nasuri, 2917 ay nagsiwalat ng walang pagpapahayag, at ang iba pang 4785 na mga gene ay ipinahayag sa hindi gaanong antas (base mean <5). Из 35 170 проанализированных генов 2917 не проявляли экспрессии, а остальные 4785 генов экспрессировались на музировались е среднее <5). Sa 35,170 na mga gene na nasuri, 2917 ay hindi nagpakita ng pagpapahayag, at ang natitirang 4785 na mga gene ay ipinahayag sa isang hindi gaanong antas (base mean <5).在分析的35,170 个基因中，2917 个没有表达，其他4785 个基因的表达可以忽略可以忽略不埡。35,170 Из 35 170 проанализированных генов 2917 не экспрессировались, а остальные 4785 генов имели незначительнсудюба значение <5). Sa 35,170 na mga gene na nasuri, 2917 ay hindi ipinahayag at ang natitirang 4785 na mga gene ay may hindi gaanong pagpapahayag (base mean <5).Kaya, ang bilang ng mga gene na itinuturing na ipinahayag (base mean ≥ 5) sa panahon ng eksperimento ay 27,468 (78.1%) (Karagdagang Talaan S4).
Mula sa unang pagkakataon, ang lahat ng mga linya ng NLL ay tumugon sa inoculation ng C. lupini (strain Col-08) sa pamamagitan ng reprogramming ng transcriptome (Talahanayan 1), gayunpaman, ang mga makabuluhang pagkakaiba ay naobserbahan sa pagitan ng mga linya.Kaya, ang linya ng paglaban 83A: 476 (na nagdadala ng Lanr1 gene) ay nagpakita ng makabuluhang transcriptome reprogramming sa unang punto ng oras (6 hpi) na may 31-69-tiklop na pagtaas sa bilang ng mga nakahiwalay na up- at down-genes kumpara sa iba pang mga time point sa oras na ito.Bilang karagdagan, ang rurok na ito ay maikli ang buhay, dahil ang pagpapahayag ng ilang mga gene lamang ay nanatiling makabuluhang binago sa pangalawang punto ng oras (12 hpi).Kapansin-pansin, ang Boregine, na nagpakita rin ng mataas na antas ng paglaban sa graft test, ay hindi sumailalim sa napakalaking transcriptional reprogramming sa panahon ng eksperimento.Gayunpaman, ang bilang ng mga differentially expressed genes (DEG) ay pareho para sa Boregine at 83A: 476 sa 12 HPI.Parehong ang Mandelup at populasyon na 22660 ay nagpakita ng mga taluktok ng DEG sa huling punto ng oras (48 l/s), na nagpapahiwatig ng kamag-anak na pagkaantala sa mga tugon sa pagtatanggol.
Dahil ang 83A:476 ay sumailalim sa napakalaking transcriptome reprogramming bilang tugon sa C. lupini sa 6 HPI kumpara sa lahat ng iba pang linya, ~ 91% ng mga DEG na naobserbahan sa puntong ito ay partikular sa lahi (Fig. 1).Gayunpaman, mayroong ilang overlap sa mga maagang tugon sa pagitan ng mga linya ng pag-aaral, dahil ang 68.5%, 50.9%, at 52.6% DEG sa Boregine, Mandelup, at populasyon 22660, ayon sa pagkakabanggit, ay nag-overlap sa mga matatagpuan sa 83A:476 sa ilang partikular na punto sa oras.Gayunpaman, ang mga DEG na ito ay nagkakahalaga lamang ng isang maliit na bahagi (0.97–1.70%) ng lahat ng mga DEG na kasalukuyang nakita gamit ang 83A:476.Bilang karagdagan, ang 11 DEG mula sa lahat ng mga linya ay magkakaugnay sa oras na ito (Mga Pandagdag na Talahanayan S4-S6), kabilang ang mga karaniwang bahagi ng mga tugon sa pagtatanggol ng halaman: lipid transfer protein (TanjilG_32225), endoglucan-1,3-β-glucoside enzyme (TanjilG_23384), dalawang stress-inducible na protina tulad ng SAM22 (TanjilG_322 (TanjilG_3225) at protina ng stress-inducible tulad ng SAM22 (TanjilG_38_1) 32352), at dalawang glycine-rich structural cell wall proteins (TanjilG_19701 at TanjilG_19702).Nagkaroon din ng medyo mataas na overlap sa mga transcriptome na tugon sa pagitan ng 83A:476 at Boregine sa 24 HPI (kabuuang 16-38% DEG) at sa pagitan ng Mandelup at Populasyon 22660 sa 48 HPI (kabuuang 14-20% DEG).
Venn diagram na nagpapakita ng bilang ng mga differentially expressed genes (DEG) sa mga linyang narrow-leaved lupine (NLL) na inoculated sa Colletotrichum lupini (strain Col-08 na nakuha mula sa lupine fields sa Wierzhenice, Poland, 1999).Ang mga linya ng NLL na nasuri ay: 83A:476 (lumalaban, dala ang Lanr1 allele), Boregine (lumalaban, hindi alam ang genetic na background), Mandelup (katamtamang lumalaban, dala ang AnMan allele) at populasyon 22660 (napakadaling madaling kapitan).Ang abbreviation na hpi ay nangangahulugang ilang oras pagkatapos ng pagbabakuna.Ang mga zero na halaga ay inalis upang gawing simple ang graph.
Ang hanay ng mga overexpressed gen sa 6 hpi ay nasuri para sa pagkakaroon ng mga canonical R gene domain (Karagdagang Talaan S7).Ang pag-aaral na ito ay nagsiwalat ng transcriptome induction ng mga klasikong gene na paglaban sa sakit na may mga domain ng NBS-LRR lamang sa 83A: 476.Ang set na ito ay binubuo ng isang TIR-NBS-LRR gene (tanjilg_05042), limang CC-NBS-LRR genes (tanjilg_06165, tanjilg_06162, tanjilg_22773, tanjilg_22640, at tanjilg_16162), at Four NBS-LR16jilg2 (Tanjilg_16162) at Four NBS-LR16jilg2 ) pati na rin ang Apat na NBS-Lrr (tanjilg_16162) at Apat na NBS-LRR (TANJILG_16162).Ang lahat ng mga gene na ito ay may mga canonical domain na nakaayos sa mga conserved sequence.Bilang karagdagan sa mga gene ng domain ng NBS-LRR, maraming mga RLL kinases ang na-activate sa 6 hpi, lalo na ang isa sa Boregine (TanjilG_19877), dalawa sa Mandelup (TanjilG_07141 at TanjilG_19877) at sa populasyon na 22660 (TanjilG_09014 at TanjilG_19877) at dalawa.
Ang mga gene na may makabuluhang binagong expression bilang tugon sa inoculation na may C. lupini (strain Col-08) ay sumailalim sa Gene Ontology (GO) enrichment analysis (Supplement Table S8). Ang pinakamadalas na overrepresented na biological process term ay "GO:0006952 defense response" na lumitaw sa 6 sa 16 (time × line) na kumbinasyon na may mataas na kabuluhan (P value <0.001) (Fig. 2). Ang pinakamadalas na overrepresented na biological process term ay "GO:0006952 defense response" na lumitaw sa 6 sa 16 (time × line) na kumbinasyon na may mataas na kabuluhan (P value <0.001) (Fig. 2). Наиболее часто чрезмерно представленным термином биологического процесса был «GO: 0006952 защитный отверт» 16 (время × линия) комбинаций с высокой значимостью (значение P <0,001) (рис. 2). Ang pinakamadalas na overrepresented na biological process term ay 'GO:0006952 defense response', na lumitaw sa 6 sa 16 (time × lineage) na kumbinasyon na may mataas na kabuluhan (P value <0.001) (Fig. 2).最常被过度代表的生物过程术语是“GO:0006952 防御反应”，它出现在16 个（时闐（时闐（时间×中一一一一一一一一一一一一一一一一为具有高显着性（P 值< 0.001）（图2）。 Ang pinakakinakatawan na termino sa prosesong biyolohikal ay "GO:0006952 defense response", na lumilitaw sa 6 sa 16 (时间×线) na kumbinasyon, na may mataas na kahalagahan (P value <0.001) (图2) . Наиболее часто чрезмерно представленным термином биологического процесса был «GO: 0006952 Defense Response», котовлыв 6 полого ий (время × линия) с высокой значимостью (значение P <0,001) (рис. 2). Ang pinakamadalas na overrepresented na biological process term ay 'GO:0006952 Defense Response', na lumabas sa 6 sa 16 na kumbinasyon (time × line) na may mataas na kahalagahan (P value <0.001) (Fig. 2).Ang terminong ito ay overrepresented sa dalawang time point sa 83A: 476 at Boregine (6 at 24 hpi) at sa isang time point sa Mandelup at Population 22660 (12 at 6 hpi, ayon sa pagkakabanggit).Ito ay isang inaasahang resulta, na nagha-highlight sa antifungal na tugon ng mga lumalaban na linya.Bilang karagdagan, ang 83A:476 ay tumugon sa C. lupini sa pamamagitan ng mabilis na pag-uudyok ng mga gene na nauugnay sa oxidative burst na kinakatawan ng terminong "GO:0055114 redox process", na nagpapahiwatig ng isang partikular na tugon sa pagtatanggol, habang ang Boregine ay nagpahayag ng mga partikular na tugon sa pagtatanggol, na nauugnay sa terminong 'GO'.:0006950 Tugon sa stress”.Ang Populasyon 22660 ay nag-activate ng pahalang na tugon ng pagtutol na kinasasangkutan ng mga pangalawang metabolite, na binibigyang-diin ang labis na bilang ng mga terminong "GO:0016104 Proseso ng triterpene biosynthesis" at "GO:0006722 Proseso ng triterpene metabolism" (ang parehong mga termino ay nabibilang sa parehong hanay ng mga gene ), na isinasaalang-alang ang mga resulta ng GO: term na Bondelup2 na pagsusuri sa pagpapayaman sa pagitan ng Ma00regulation2 na reaksyon. karagdagan, ang maagang reaksyon na 83A:476 (6 hpi) at naantalang reaksyon na Mandelup at Population 22660 ay kinabibilangan ng terminong GO:0015979 'photosynthesis' at iba pang nauugnay na biological na proseso.
Ang mga termino ng bioprocess gene ontology na napili sa annotation ng differentially expressed genes sa panahon ng transcriptome responses ng narrow-leaved lupine (NLL) inoculated with anthrax lupine (Col-08 strain na nakuha mula sa lupine fields sa Wierzhenice, Poland, noong 1999) ay labis na pinalaki.Ang mga linya ng NLL na nasuri ay: 83A: 476 (lumalaban, nagdadala ng homozygous Lanr1 allele), Boregine (lumalaban, hindi kilalang genetic na background), Mandelup (katamtamang lumalaban, nagdadala ng homozygous AnMan allele) at populasyon 22660 (madaling kapitan).
Dahil ang pag-aaral na ito ay naglalayong tukuyin ang mga gene na nag-aambag sa anthracnose resistance, ang mga gene na itinalaga sa mga terminong GO "GO: 0006952 Defensive responses" at "GO: 0055114 Redox na mga proseso" ay nasuri nang may mga cut-off dahil ang baseline ay nangangahulugang ≥ 30 na may hindi bababa sa isang linya.× point in time na pinagsasama-sama ang mga istatistikal na makabuluhang halaga ng log2 (fold change).Ang bilang ng mga gene na nakakatugon sa mga pamantayang ito ay 65 para sa GO:0006952 at 524 para sa GO:0055114.
Ang 83A:476 ay nagsiwalat ng dalawang DEG peak na may annotation ng terminong GO:0006952, ang una sa 6 na genes bawat pulgada (64 genes, pataas at pababang regulasyon) at ang pangalawa sa 24 na genes bawat pulgada (15 genes, up regulation lang).Ipinakita rin ng Boregine na ang GO:0006952 ay tumaas sa parehong punto ng oras, ngunit may mas kaunting DEG (11 at 8) at preferential activation.Nagpakita ang Mandeloop ng dalawang peak ng GO: 0006952 sa 12 at 48 HPI, na parehong nagdadala ng 12 genes (ang una ay may mga activating genes, at ang pangalawa ay may mga suppressive genes lamang), habang ang 22660 na populasyon sa 6 HPI (13 genes) ay may higit na namamayani sa pagtaas ng peak.regulasyon.Dapat pansinin na ang 96.4% ng GO: 0006952 DEG sa mga taluktok na ito ay may parehong uri ng tugon (pataas o pababa), na nagpapahiwatig ng isang makabuluhang overlap sa mga tugon sa pagtatanggol sa kabila ng mga pagkakaiba sa bilang ng mga gene na kasangkot.Ang pinakamalaking pangkat ng mga sequence na nauugnay sa terminong GO:0006952 ay nag-encode ng Starvation Stress-Associated Message Protein 22 (tulad ng SAM22), na kabilang sa class 10 pathogenesis-associated protein (PR-10) na clade na protina at ang core protein latex.katulad (MLP-like) protein) protina (Larawan 3).Ang dalawang grupo ay magkaiba sa likas na katangian ng pagpapahayag at direksyon ng tugon.Ang mga gene na nag-encode ng mga protina na tulad ng SAM22 ay nagpakita ng pare-pareho at makabuluhang induction sa mga maagang punto ng oras (6 o 12 hpi) at sa pangkalahatan ay hindi tumutugon sa pagtatapos ng eksperimento (48 hpi), habang ang mga protina na tulad ng MLP ay nagpakita ng koordinasyon sa 6 hpi.hpi.83A:476 at Mandelup sa 48 hp/in, halos lahat ng iba pang data point ay hindi tumutugon.Bilang karagdagan, ang mga pagkakaiba sa mga profile ng expression ng SAM22 na tulad ng mga protina na gen ay sumunod sa naobserbahang pagkakaiba-iba sa anthracnose resistance, dahil ang mas maraming lumalaban na linya ay may mas maraming time point na makabuluhang nag-uudyok sa mga gen na ito kaysa sa mas madaling kapitan ng mga gene.Ang isa pang LlR18A/B-like PR-10 gene ay nagpakita ng isang katulad na pattern ng expression sa SAM22-like protein gene.
Natukoy ang mga pangunahing bahagi ng terminong biological process na "GO:0006952 Defense Response" at ang mga pattern ng pagpapahayag ng mga gene ng kandidato ng Lanr1 at AnMan alleles.Ang Log2 scale ay kumakatawan sa log2 values ​​​​(fold change) sa pagitan ng inoculated (Colletotrichum lupini, strain Col-08, nakuha mula sa lupine fields, Wizhenica, Poland, 1999) at kontrol (sham-inoculated) na mga halaman sa parehong oras.Ang mga sumusunod na linya ng narrowleaf lupine ay nasuri: 83A: 476 (lumalaban, nagdadala ng homozygous Lanr1 allele), Boregine (lumalaban, hindi alam ang genetic na background), Mandelup (katamtamang lumalaban, nagdadala ng homozygous na AnMan allele), at Population 22660 (madaling kapitan).
Bilang karagdagan, ang mga profile ng expression ng RNA-seq candidate genes na Lanr1 (TanjilG_05042) at AnMan (TanjilG_12861) ay nasuri (Fig. 3).Ang TanjilG_05042 gene ay nagpakita ng isang makabuluhang tugon (pag-activate) sa 83A: 476 lamang sa unang pagkakataon na punto (6 hpi), habang ang TanjilG_12861 ay makabuluhan sa Mandeloop sa dalawang oras lamang: 6 hpi (pababang regulasyon) at 24 hpi (6 hpi).Kasama.).adjustable)).
Ang pinaka-overexpressed na mga gene sa terminong GO:0055114 na "redox process" ay mga gene na nag-encode ng cytochrome P450 na protina at peroxidase (Larawan 4).Para sa mga sample na nakahiwalay mula sa 83A:476 sa 6 HPI, ang maximum o minimum na log2 (fold change) na mga halaga (para sa 86.6% ng mga gene) ay karaniwang sinusunod sa pagitan ng inoculated at control na mga halaman, na nagpapakita ng mataas na tugon ng genotype na ito sa inoculating sex.Ang 83A:476 ay nagpakita ng pinakamahalagang GO: 0055114 DEG sa 6 hpi (503 genes), habang ang natitirang mga linya sa 48 hpi (Boregine, 31 genes; Mandelup, 85 genes; at Population 22660, 78 genes)).Sa karamihan ng mga gene ng pamilyang GO:0055114, dalawang uri ng mga tugon sa pagbabakuna (pag-activate at pagsugpo) ay naobserbahan.Kapansin-pansin, hanggang sa 97.6% ng mga DEG na natukoy para sa terminong GO: 0055114 sa Mandelupe sa 48 hp Ang mga obserbasyong ito ay nagmumungkahi na, sa kabila ng makabuluhang mas maliit na sukat (ibig sabihin, ang bilang ng mga mutated redox genes, 85 kumpara sa 503), ang pattern ng naantalang transcriptome na mga tugon ng maagang mandeloup 4 ay katulad ng 8 na maagang pagtugon ng 6:6.Sa Boregine at Population 22660, ang convergence na ito ay mas mababa sa 51.6% at 75.6%, ayon sa pagkakabanggit.
Ang mga pattern ng pagpapahayag ng mga pangunahing bahagi ng termino ng biological na proseso na "GO:0055114 Redox process" ay ipinahayag.Ang Log2 scale ay kumakatawan sa log2 values ​​​​(fold change) sa pagitan ng inoculated (Colletotrichum lupini, strain Col-08, nakuha mula sa lupine fields, Wizhenica, Poland, 1999) at kontrol (sham-inoculated) na mga halaman sa parehong oras.Ang mga sumusunod na linya ng narrowleaf lupine ay nasuri: 83A: 476 (lumalaban, nagdadala ng homozygous Lanr1 allele), Boregine (lumalaban, hindi alam ang genetic na background), Mandelup (katamtamang lumalaban, nagdadala ng homozygous na AnMan allele), at Population 22660 (madaling kapitan).
83A:476 Ang mga transcriptomic na tugon sa inoculation na may C. lupini (strain Col-08) ay kasama rin ang coordinated silencing ng mga gene na nauugnay sa terminong GO:0015979 "photosynthesis" at iba pang nauugnay na biological na proseso (FIG. 5).Ang GO:0015979 DEG set na ito ay naglalaman ng 105 gene na makabuluhang napigilan sa 6 hpi sa 83A:476.Sa subset na ito, 37 genes ang na-downregulated din sa Mandelup sa 48 HPI at 35 sa parehong oras na punto sa 22660 na populasyon, kabilang ang 19 DEG na karaniwan sa parehong genotypes.Walang mga DEG na nauugnay sa terminong GO: 0015979 ang makabuluhang na-activate sa anumang kumbinasyon (linya x oras).
Ang mga pattern ng pagpapahayag ng mga pangunahing bahagi ng termino ng biological na proseso na "GO:0015979 Photosynthesis" ay ipinahayag.Ang Log2 scale ay kumakatawan sa log2 values ​​​​(fold change) sa pagitan ng inoculated (Colletotrichum lupini, strain Col-08, nakuha mula sa lupine fields, Wizhenica, Poland, 1999) at kontrol (sham-inoculated) na mga halaman sa parehong oras.Ang mga sumusunod na linya ng narrowleaf lupine ay nasuri: 83A: 476 (lumalaban, nagdadala ng homozygous Lanr1 allele), Boregine (lumalaban, hindi alam ang genetic na background), Mandelup (katamtamang lumalaban, nagdadala ng homozygous na AnMan allele), at Population 22660 (madaling kapitan).
Batay sa mga resulta ng pagsusuri sa pagkakaiba-iba ng expression at maaaring kasangkot sa mga tugon sa pagtatanggol laban sa mga pathogenic fungi, ang set na ito ng pitong gen ay napili para sa dami ng mga profile ng expression sa pamamagitan ng real-time na PCR (Karagdagang Talaan S9).
Ang putative protein gene TanjilG_10657 ay makabuluhang naimpluwensyahan sa lahat ng pinag-aralan na mga linya at mga punto ng oras kumpara sa control (mimic) na mga halaman (Mga Pandagdag na Talaan S10, S11).Bilang karagdagan, ang expression na profile ng TanjilG_10657 ay nagpakita ng pagtaas ng trend sa kurso ng eksperimento para sa lahat ng mga linya.Ang populasyon 22660 ay nagpakita ng pinakamataas na sensitivity ng TanjilG_10657 sa inoculation na may 114-tiklop na pag-activate at ang pinakamataas na antas ng kamag-anak na expression (4.4 ± 0.4) sa 24 HPI (Fig. 6a).Ang PR10 LlR18A protein gene TanjilG_27015 ay nagpakita rin ng activation sa lahat ng linya at time point, na may statistical significance sa karamihan ng data point (Fig. 6b).Katulad sa TanjilG_10657, ang pinakamataas na kamag-anak na antas ng pagpapahayag ng TanjilG_27015 ay na-obserbahan sa 22660 inoculated na populasyon sa 24 HPI (19.5 ± 2.4).Ang acid endochitinase gene TanjilG_04706 ay makabuluhang na-upregulated sa lahat ng mga linya at sa lahat ng mga punto ng oras maliban sa Boregine 6 hpi (Larawan 6c).Malakas itong na-induce sa unang punto ng oras (6 HPI) sa 83A:476 (sa pamamagitan ng 10.5 beses) at katamtamang nadagdagan sa iba pang mga linya (sa pamamagitan ng 6.6-7.5 beses).Sa panahon ng eksperimento, ang pagpapahayag ng TanjilG_04706 ay nanatili sa magkatulad na antas sa 83A:476 at Boregine, habang sa Mandelup at Populasyon 22660 ito ay tumaas nang malaki, na umaabot sa medyo mataas na mga halaga (5.9 ± 1.5 at 6.2 ± 1.5, ayon sa pagkakabanggit).Ang endoglucan-1,3-β-glucosidase-like gene TanjilG_23384 ay nagpakita ng mataas na activation sa unang dalawang time point (6 at 12 hpi) sa lahat ng linya maliban sa populasyon 22660 (Fig. 6d).Ang pinakamataas na antas ng kamag-anak na expression ng TanjilG_23384 ay na-obserbahan sa pangalawang oras na punto (12 hpi) sa Mandelup (2.7 ± 0.3) at 83A: 476 (1.5 ± 0.1).Sa 24 HPI, ang expression ng TanjilG_23384 ay medyo mababa sa lahat ng pinag-aralan na linya (mula 0.04 ± 0.009 hanggang 0.44 ± 0.12).
Ang mga profile ng expression ng mga napiling genes (ag) na ipinahayag ng dami ng PCR.Ang mga numero 6, 12 at 24 ay kumakatawan sa mga oras pagkatapos ng pagbabakuna.Ang mga gen ng LanDExH7 at LanTUB6 ay ginamit para sa normalisasyon at ang LanTUB6 ay ginamit para sa inter-series na pagkakalibrate.Ang mga error bar ay kumakatawan sa standard deviation batay sa tatlong biological replicates, bawat isa ay ang average ng tatlong teknikal na replicates. Ang istatistikal na kahalagahan ng mga pagkakaiba sa mga antas ng expression sa pagitan ng inoculated (Colletotrichum lupini, strain Col-08, nakuha noong 1999 mula sa lupine field sa Wierzenica, Poland) at control (mock-inoculated) na mga halaman ay minarkahan sa itaas ng mga data point (*P value < 0.05, **P value ≤ 0.01, *** P value ≤ 0.01, *** P 0.01, *** P 0.01. Ang istatistikal na kahalagahan ng mga pagkakaiba sa mga antas ng expression sa pagitan ng inoculated (Colletotrichum lupini, strain Col-08, nakuha noong 1999 mula sa lupine field sa Wierzenica, Poland) at control (mock-inoculated) na mga halaman ay minarkahan sa itaas ng mga data point (*P value < 0.05, **P value ≤ 0.01, *** P value ≤ 0.01, *** P 0.01, *** P 0.01. Статистическая значимость различий в уровнях экспрессии между инокулированными (Colletotrichum lupini, штамм Col-08, получен гля в 1 99н г. женице, Польша) и контрольными (ложно инокулированными) растениями отмечена над точками данных (*значение P, **, ничение P < 0,05 P ≤ 0,001). Ang mga istatistikal na makabuluhang pagkakaiba sa mga antas ng expression sa pagitan ng inoculated (Colletotrichum lupini, strain Col-08, nakuha noong 1999 mula sa isang lupine field sa Wierzhenice, Poland) at control (sham-inoculated) na mga halaman ay nabanggit sa itaas ng mga punto ng data (*P value <0.05, **P-value ≤ 0.01 , ***P-0).接种（Colletotrichum lupini，Col-08株，1999年从波兰Wierzenica的羽扇豆田获得）和对照（模拟接种義耶和华差异的统计学显着性标记在数据点上方（*P值< 0.05, **P ≤ 0.01, ***P ≤ 0.001).接种 （colletotrichum lupini ， color-08 株 ， 1999 年 波兰 波兰 wierzenica 的 羽扇 获得） 和 对照 （ 接秉 （接秉差异 的 统计学 显着性 标记 数据点 上方*p 值 <0.05, **P ≤ 0.01, ***P ≤ 0.001). Статистически значимые различия в уровнях экспрессии между инокулированными (Colletotrichum lupini, штамм Col-08, полученный спо, полученный спол. Польша, в 1999 г.) и контрольными (ложно инокулированными) растениями отмечены над точками данных (* P, ** ч0,ние х 5 ***P-значение ≤ 0,001). Ang mga istatistikal na makabuluhang pagkakaiba sa mga antas ng expression sa pagitan ng inoculated (Colletotrichum lupini, strain Col-08, nakuha mula sa mga lupine field sa Verzhenice, Poland, noong 1999) at control (sham-inoculated) na mga halaman ay nabanggit sa itaas ng mga punto ng data (*P value < 0.05 , **P-value ≤ 0.01 , ≤ 0-P-1).Ang mga linya ng NLL na nasuri ay: 83A: 476 (lumalaban, nagdadala ng homozygous Lanr1 allele), Mandelup (katamtamang lumalaban, nagdadala ng homozygous AnMan allele), Boregine (lumalaban, hindi kilalang genetic na background) at populasyon 22660 (madaling kapitan).
Ang kandidatong gene na TanjilG_05042 sa Lanr1 locus ay nagpakita ng isang kapansin-pansing naiibang pattern ng pagpapahayag mula sa mga profile na nakuha mula sa RNA-seq na pag-aaral (Larawan 6e).Ang makabuluhang pag-activate ng gene na ito ay naobserbahan sa Mandelup at ang 22660 populasyon (hanggang sa 39.7 at 11.7 beses, ayon sa pagkakabanggit), na nagreresulta sa medyo mataas na antas ng pagpapahayag (hanggang sa 1.4 ± 0.14 at 7.2 ± 1.3, ayon sa pagkakabanggit).83A:476 ay nagsiwalat din ng ilang upregulation ng TanjilG_05042 gene (hanggang sa 3.8-tiklop), gayunpaman, ang mga kamag-anak na antas ng expression na nakamit (0.044 ± 0.002) ay higit sa 30-tiklop na mas mababa kaysa sa mga naobserbahan sa Mandelup at sa 22660 populasyon.nasuri ng qPCR ay nagpakita ng makabuluhang pagkakaiba sa mga antas ng pagpapahayag sa pagitan ng mga genotype sa mock-vaccinated (control) na mga variant, na umaabot sa 58-tiklop na pagkakaiba sa pagitan ng mga populasyon na 22660 at 83A:476, pati na rin sa pagitan ng mga populasyon na 22660 at 22660. Isang dalawang beses na pagkakaiba ang nakamit sa pagitan ng Boregine at Mandalup.
Ang gene ng kandidato sa locus ng AnMan, TanjilG_12861, ay isinaaktibo bilang tugon sa pagbabakuna sa 83A: 476 at Mandelup, ay neutral sa 22660 na populasyon, at na-downregulated sa Boregine (Fig. 6f).Ang kamag-anak na pagpapahayag ng TanjilG_12861 gene ay ang pinakamataas sa inoculated 83A: 476 (0.14±0.01).Ang 17.4 kDa class I heat shock protein gene TanjilG_05080 HSP17.4 ay nagpakita ng mas mababang antas ng kamag-anak na expression sa lahat ng pinag-aralan na mga strain at time point (Fig. 6g).Ang pinakamataas na halaga ay naobserbahan sa 24 HPI sa 22660 populasyon (0.14 ± 0.02, isang walong beses na pagtaas bilang tugon sa pagbabakuna).
Ang paghahambing ng mga profile ng expression ng gene (Larawan 7) ay nagsiwalat ng mataas na ugnayan sa pagitan ng TanjilG_10657 at apat na iba pang mga gene: TanjilG_27015 (r = 0.89), TanjilG_05080 (r = 0.85), TanjilG_05042 (r = 0.804), at TanjilG6_9.Ang ganitong mga resulta ay maaaring magpahiwatig ng co-regulasyon ng mga gene na ito sa panahon ng mga tugon sa pagtatanggol.Ang TanjilG_12861 at TanjilG_23384 gen ay nagpakita ng iba't ibang mga profile ng expression na may mas mababang mga halaga ng coefficient ng Pearson correlation (mula 0.08 hanggang 0.43 at -0.19 hanggang 0.28, ayon sa pagkakabanggit) kumpara sa iba pang mga gene.
Ang mga ugnayan sa pagitan ng mga profile ng expression ng gene ay nakita gamit ang quantitative PCR.Ang mga sumusunod na linya ng makitid na lupine ay nasuri: 83A: 476 (lumalaban, nagdadala ng homozygous Lanr1 allele), Mandelup (katamtamang lumalaban, nagdadala ng homozygous AnMan allele), Boregine (lumalaban, hindi alam ang genetic na background), at Population 22660 (madaling kapitan).Tatlong time point ang kinakalkula (6, 12 at 24 na oras pagkatapos ng inoculation), kasama ang inoculated (Colletotrichum lupini, strain Col-08, na nakuha mula sa mga lupine field sa Wierzhenice, Poland, noong 1999) at kontrol (sham-inoculated) na mga halaman.Ipinapakita ng iskala ang halaga ng koepisyent ng ugnayan ng Pearson.
Batay sa data na nakuha sa 6 lakas-kabayo bawat pulgada, ang WGCNA ay isinagawa sa 9981 DEG na kinilala sa pamamagitan ng paghahambing ng inoculated at control na mga halaman upang tumuon sa mga maagang tugon sa pagtatanggol (Karagdagang Talaan S12).Dalawampu't dalawang gene module (mga kumpol) ang natagpuang may kaugnayan (positibo o negatibo) na mga profile ng expression sa pagitan ng mga genotype at mga eksperimentong variant. Sa karaniwan, ang mga antas ng expression ng gene ay bumababa sa pagkakasunud-sunod na 83A:476 > Mandelup > Boregine > Populasyon 22660 (sa parehong mga variant, gayunpaman, ang trend na ito ay mas malakas sa mga control plant). Sa karaniwan, ang mga antas ng expression ng gene ay bumababa sa pagkakasunud-sunod na 83A:476 > Mandelup > Boregine > Populasyon 22660 (sa parehong mga variant, gayunpaman, ang trend na ito ay mas malakas sa mga control plant). В среднем уровни экспрессии генов снижались в порядке 83A:476 > Mandelup > Boregine > Populasyon 22660 (в обоих вариантах, обнтако, бальный контрольных растений). Sa karaniwan, bumaba ang mga antas ng expression ng gene sa pagkakasunud-sunod na 83A:476 > Mandelup > Boregine > Population 22660 (sa parehong mga variant, gayunpaman, ang trend na ito ay mas malakas sa mga control plant).平均而言，基因表达水平按83A:476 > Mandelup > Boregine > Populasyon 22660 的顺序下降（然而，在两种变作耶和华照植物中更强）。平均 而 言 ， 基因 水平 按 按 83a: 476> mandelup> boregine> populasyon 22660 的 顺序 下降 （， 在 种 中 在 种 中中 更） . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . В среднем уровни экспрессии генов снижались в ряду 83A:476 > Mandelup > Boregine > Populasyon 22660 рольных растений). Sa karaniwan, bumaba ang mga antas ng expression ng gene sa seryeng 83A:476 > Mandelup > Boregine > Population 22660 (gayunpaman, sa parehong variant, mas malakas ang trend na ito sa mga control plant).Ang pagbabakuna ay nagresulta sa upregulation ng gene expression, lalo na sa mga module 18, 19, 14, 6 at 1 (sa pababang pagkakasunud-sunod ng epekto), negatibong regulasyon (eg modules 9 at 20) o may mga neutral na epekto (eg modules 11, 22, 8 at 13).Ang pagtatasa ng pagpayaman ng termino (Karagdagang Talahanayan S13) ay nagsiwalat ng "GO: 0006952 Mga Tugon sa Proteksyon" para sa inoculated module (18) na may maximum na pag -activate, kabilang ang mga genes na nasuri ng qPCR (Tanjilg_04706, Tanjilg_23384, Tanjilg_10657 at Tanjilg_27015), pati na rin ang labis na pagsugpo sa mga photosynthesy modules (9).Ang module 18 concentrator (Larawan 8) ay kinilala bilang ang TanjilG_26536 gene na naka-encode ng PR-10-like LlR18B na protina, at ang module 9 concentrator ay nakilala bilang ang TanjilG_28955 gene na naka-encode ng photosystem II PsbQ na protina.Ang isang kandidatong anthracnose resistance gene na Lanr1, TanjilG_05042, ay natagpuan sa module 22 (Fig. 9) at nauugnay sa mga terminong "GO:0044260 Cellular macromolecular metabolic process" at "GO:0006355 Transcriptional regulation, DNA templating" na nagdadala ng TanjilG_01212 hub.ang gene ay nag-encode ng heat stress transcription factor A-4a (HSFA4a).
Weighted network analysis ng gene co-expression ng mga module na may overrepresented biological process terms "GO: 0006952 Defense responses".Ang Ligation ay pinasimple upang i-highlight ang apat na gen na nasuri ng qPCR (TanjilG_04706, TanjilG_23384, TanjilG_10657 at TanjilG_27015).
Weighted network analysis ng gene co-expression ng isang module na may overrepresented biological process term "GO: 0006355: Transcriptional regulation, DNA templating" at nagdadala ng kandidatong anthracnose resistance gene Lanr1 TanjilG_05042.Ang ligation ay pinasimple upang ihiwalay ang TanjilG_05042 gene at ang gitnang TanjilG_01212 gene.
Anthracnose resistance screening na nakolekta sa Australia ay nagpakita na ang karamihan sa mga maagang inilabas cultivars ay madaling kapitan;Ang Kalya, Coromup at Mandelup ay inilarawan bilang katamtamang lumalaban, habang ang Wonga, Tanjil at 83A:476 ay inilarawan bilang lubos na lumalaban26,27,31.ay may parehong allele ng resistensya, itinalagang Lanr1, at ang Coromup at Mandelup ay may magkaibang allele, na itinalagang AnMan10, 26, 39, habang si Kalya ay nagpasa sa ibang allele., Lanr2.Ang pag-screen para sa anthracnose resistance sa Germany ay nagresulta sa pagkakakilanlan ng isang lumalaban na linyang Bo7212 na may kandidatong allele maliban sa Lanr1, na itinalagang LanrBo36.
Ang aming pag-aaral ay nagsiwalat ng napakababang dalas (mga 6%) ng Lanr1 allele sa nasubok na germplasm.Ang pagmamasid na ito ay naaayon sa mga resulta ng screening ng East European germplasm gamit ang Anseq3 at Anseq4 marker, na nagpakita na ang Lanr1 allele ay naroroon lamang sa dalawang linya ng Belarusian.Ito ay nagmumungkahi na ang Lanr1 allele ay hindi pa malawakang ginagamit ng mga lokal na programa sa pag-aanak, hindi katulad sa Australia, kung saan ito ay isa sa mga pangunahing alleles para sa marker-assisted breeding.Ito ay maaaring dahil sa mas mababang antas ng paglaban na ibinigay ng Lanr1 allele sa mga kondisyon sa larangan ng Europa kumpara sa ulat ng Australia.Bilang karagdagan, ang mga pag-aaral ng anthracnose sa mga lugar na may mataas na pag-ulan sa Australia ay nagpakita na ang mga tugon sa paglaban na pinagsama ng Lanr1 allele ay maaaring hindi epektibo sa mga kondisyon ng panahon na pinapaboran ang paglaki at mabilis na pag-unlad ng pathogen19,42.Sa katunayan, sa kasalukuyang pag-aaral, ang ilang mga sintomas ng anthracnose ay naobserbahan din sa mga genotype na nagdadala ng Lanr1 allele, na nagmumungkahi na ang paglaban ay maaaring mawala sa ilalim ng pinakamainam na mga kondisyon para sa pagbuo ng C. lupini.Bilang karagdagan, ang mga maling positibong interpretasyon ng pagkakaroon ng Anseq3 at Anseq4 marker, na humigit-kumulang 1 cM mula sa Lanr1 locus, ay posible 28,30,43 .
Ang aming pag-aaral ay nagpakita na ang 83A: 476, na nagdadala ng Lanr1 allele, ay tumugon sa C. lupini inoculation na may malakihang transcriptome reprogramming sa unang nasuri na time point (6 hpi), habang sa Mandelup, na nagdadala ng AnMan allele, ang mga transcriptomic na tugon ay naobserbahan sa ibang pagkakataon.(mula 24 hanggang 48 hp).Ang mga temporal na pagkakaiba-iba sa mga tugon sa pagtatanggol ay nauugnay sa mga pagkakaiba sa mga sintomas ng sakit, na nagbibigay-diin sa kahalagahan ng maagang pagkilala sa pathogen para sa isang matagumpay na pagtugon sa paglaban.Upang makahawa sa tissue ng halaman, ang mga spore ng anthrax ay dapat dumaan sa ilang mga yugto ng pag-unlad sa ibabaw ng host, kabilang ang pagtubo, paghahati ng cell, at pagbuo ng isang appressorium.Ang appendage ay isang infective na istraktura na nakakabit sa ibabaw ng host at pinapadali ang pagtagos sa mga tissue ng host.Kaya, ang mga spores ng C. gloeosporioides sa pea extract ay nagpakita ng unang dibisyon ng nucleus pagkatapos ng 75-90 minuto ng pagpapapisa ng itlog, ang pagbuo ng germ tube pagkatapos ng 90-120 minuto, at pagsugpo pagkatapos ng 4 na oras 45 .Ang Mango C. gloeosporioides ay nagpakita ng higit sa 40% conidial germination pagkatapos ng 3 oras ng pagpapapisa ng itlog at humigit-kumulang 20% ​​ng pagbuo ng mga apppressor pagkatapos ng 4 na oras.Ang virulence-associated CAP20 gene ng C. gloeosporioides ay nagpakita ng transcriptional na aktibidad sa epiphyte-forming conidia pagkatapos ng 3.5 h incubation sa avocado surface wax na may mataas na konsentrasyon ng CAP20 protein pagkatapos ng 4 h 46 min.Katulad nito, ang aktibidad ng melanin biosynthesis genes sa C. trifolii ay naudyok sa loob ng 2-oras na incubation na sinundan ng pagbuo ng isang appressorium pagkatapos ng 1 oras.Ang mga pag-aaral ng mga tisyu ng dahon ay nagpakita na ang mga strawberry na inoculate ng C. acutatum ay may unang pagsugpo sa 8 hpi, habang ang mga kamatis na inoculate ng C. coccodes ay may unang pagsugpo sa 4 hpi48,49.higit sa lahat ay naaayon sa sukat ng oras ng Colletotrichum spp.nakakahawang proseso.Ang mga mabilis na tugon sa pagtatanggol sa 83A:476 ay nagmumungkahi ng pagkakasangkot ng resistensya ng halaman at effector-triggered immunity (ETI) na mga gene sa linyang ito, habang ang mga naantalang tugon ni Mandelup ay sumusuporta sa micro-associated molecular pattern-triggered immunity (MTI) hypothesis 50. Mga maagang tugon sa 83A: 476.Ang bahagyang overlap sa pagitan ng up-o down-regulated na mga gene sa naantalang tugon ay sumusuporta din sa konseptong ito, dahil ang ETI ay madalas na itinuturing na isang pinabilis at pinahusay na tugon ng MTI na nagtatapos sa naka-program na cell death sa lugar ng impeksyon, na kilala bilang anaphylactic shock 51,52 .
Karamihan sa mga gene na nauugnay sa overrepresented na terminong Gene Ontology GO:0006952 "Defense Response" ay ang 11 homologues ng stress-induced fasting message 22 protein (katulad ng SAM22) at ang pitong pangunahing latex protein-likes (MLPs).-tulad ng mga protina 31, 34, 43 at 423 ay nagpakita ng pagkakapareho ng pagkakasunud-sunod.Ang mga gen na tulad ng SAM22 ay nagpakita ng makabuluhang pag-activate na tumagal nang mas matagal, na nagpapakita ng mas mataas na antas ng anthracnose resistance (83A:476 at Boregine).Gayunpaman, ang mga gen na tulad ng MLP ay na-downregulated lamang sa mga linya na nagdadala ng allele ng paglaban ng kandidato (83A: 476 / Lanr1 sa 6 hpi at Mandelup / AnMan sa 24 hpi).Dapat pansinin na ang lahat ng natukoy na mga homologue na tulad ng SAM22 ay nagmula sa isang kumpol ng gene na sumasaklaw ng humigit-kumulang 105 kb, habang ang mga gen na tulad ng MLP ay nagmula sa magkahiwalay na mga rehiyon ng genome.Ang coordinated activation ng naturang SAM22-like genes ay natagpuan din sa aming nakaraang pag-aaral ng NLL resistance sa Diaporthetoxica inoculation, na nagmumungkahi na sila ay kasangkot sa mga pahalang na bahagi ng tugon ng depensa.Ang konklusyong ito ay sinusuportahan din ng mga ulat ng positibong tugon ng mga gene na tulad ng SAM22 sa pinsala o paggamot na may salicylic acid, fungal inducers, o hydrogen peroxide.
Ang mga gene na tulad ng MLP ay ipinakitang tumutugon sa iba't ibang abiotic at biotic na stress, kabilang ang bacterial, viral at pathogenic fungal infection sa maraming species ng halaman55.Ang mga direksyon ng pagtugon sa ilang partikular na interaksyon sa pagitan ng mga halaman at pathogens ay mula sa malakas na pagtaas (ibig sabihin, sa panahon ng infestation ng cotton na may Verticillium dahliae) hanggang sa makabuluhang bumababa (ibig sabihin, pagkatapos ng impeksyon ng puno ng mansanas na may Alternaria spp.)56,57.Ang makabuluhang pagbaba ng regulasyon ng MLP-like 423 gene ay naobserbahan sa panahon ng pagtatanggol ng avocado sa F. niger infection at sa panahon ng impeksyon ng puno ng mansanas na Botryosphaeria berengeriana f.cn.Ang piricola at Alternaria alternata ay mga pathotype ng mansanas58,59.Bilang karagdagan, ang apple calli na nag-overexpress sa MLP-like 423 gene ay may mas mababang pagpapahayag ng mga gene na nauugnay sa paglaban at mas madaling kapitan sa impeksyon sa fungal59.Kasunod ng Fusarium oxysporum f, ang MLP-like 423 gene ay pinigilan din sa lumalaban na karaniwang bean germplasm.cn.Impeksyon sa bean 60.
Ang iba pang mga miyembro ng pamilyang PR-10 na nakilala sa aming pag-aaral sa RNA-seq ay ang LlR18A at LlR18B na mga gene bilang tugon sa upregulation, pati na rin ang upregulated (1 gene) o downregulated (3 genes) na gene para sa lipid transfer protein DIR1..Bilang karagdagan, itinatampok ng WGCNA ang LlR18B gene bilang isang hub sa modyul na ito, na lubhang madaling kapitan sa pagbabakuna at nagdadala ng ilang mga gene na tumutugon sa proteksyon.Ang LlR18A at LlR18B genes ay na-induce sa dilaw na dahon ng lupine bilang tugon sa pathogenic bacteria, gayundin sa NLL stems pagkatapos ng D. toxica inoculation, habang ang rice homologue ng mga genes na ito, RSOsPR10, ay mabilis na na-induce ng fungal infection na malamang na kasangkot sa jasmonic acid na non-transportation na pathway53, lipids na non-protein genes. na kinakailangan para sa simula ng systemic acquired resistance (SAR).Sa pagbuo ng mga proteksiyon na reaksyon, ang DIR1 na protina ay dinadala mula sa pokus ng impeksyon sa pamamagitan ng phloem upang mahikayat ang SAR sa malalayong organo.Kapansin-pansin, ang TanjilG_02313 DIR1 gene ay makabuluhang na-induce sa unang punto ng pagkakataon sa mga linya 84A:476 at Populasyon 22660, ngunit matagumpay na nabuo ang anthracnose resistance sa linya 84A:476 lamang.Ito ay maaaring magpahiwatig ng ilang subfunctionalization ng DIR1 gene sa NLL, dahil ang natitirang tatlong homologue ay tumugon sa inoculation lamang sa 83A:476 na linya sa 6 hpi, at ang tugon na ito ay nakadirekta pababa.
Sa aming pag-aaral, ang pinakakaraniwang bahagi na nauugnay sa biological na proseso na tinatawag na "GO:0055114 Redox process" ay cytochrome P450 protein, peroxidase, linoleic acid 9S-/13S-lipoxygenase, at 1-aminocyclopropane-1-carboxylic acid oxidase.Bilang karagdagan, tinukoy ng aming WGCNA ang HSFA4a homologue bilang isang hub na nagdadala ng mga module tulad ng Lanr1 resistance gene candidate na TanjilG_05042.Ang HSFA4a ay isang bahagi ng redox-dependent na regulasyon ng nuclear transcription sa mga halaman.
Ang mga cytochrome P450 na protina ay mga oxidoreductases na nagpapagana ng NADPH at/o O2-dependent na mga reaksyon ng hydroxylation sa pangunahin at pangalawang metabolismo, kabilang ang metabolismo ng xenobiotics, pati na rin ang mga hormone, fatty acid, sterol, mga bahagi ng cell wall, biopolymer, at ang biosynthesis ng mga protective compound 69. fold change) sa 5.7 dahil sa isang malaking bilang ng mga binagong homologue (37) at mga pagkakaiba sa mga pattern ng pagtugon sa pagitan ng mga partikular na gene, na sumasalamin sa isang pataas na rebisyon..Ang paggamit lamang ng data ng RNA-seq upang maipaliwanag ang putative biological function ng NLL genes sa tulad ng isang malaking superfamily ng protina ay magiging lubos na haka-haka.Gayunpaman, nararapat na tandaan na ang ilang mga cytochrome P450 genes ay nauugnay sa pagtaas ng paglaban sa mga pathogenic fungi o bakterya, kabilang ang isang kontribusyon sa mga reaksiyong alerdyi69,70,71.
Ang Class III peroxidases ay mga multifunctional na enzyme ng halaman na kasangkot sa isang malawak na hanay ng mga metabolic na proseso sa panahon ng paglago at pag-unlad ng halaman, gayundin bilang tugon sa mga stress sa kapaligiran tulad ng kaasinan, tagtuyot, mataas na intensity ng liwanag, at pag-atake ng pathogen72.Ang mga peroxidases ay kasangkot sa interaksyon ng ilang species ng halaman sa Anthracis, kabilang ang Stylosanthes humilis at C. gloeosporioides, Lens culinaris at C. truncatum, Phaseolus vulgaris at C. lindemuthianum, Cucumis sativus at C. lagenarium73,74,75,76.Ang tugon ay napakabilis, minsan kahit na sa 4 HPI, bago tumagos ang fungus sa tissue ng halaman73.Ang peroxidase gene ay tumugon din sa D. toxica NLL inoculation.Bilang karagdagan sa kanilang mga tipikal na function upang i-regulate ang oxidative burst o alisin ang oxidative stress, ang mga peroxidases ay maaaring makagambala sa paglago ng pathogen sa pamamagitan ng paglikha ng mga pisikal na hadlang batay sa cell wall reinforcement sa panahon ng lignification, subunit o cross-linking ng mga partikular na compound.Ang function na ito ay maaaring maiugnay sa silico sa TanjilG_03329 gene na naka-encode ng isang putative lignin-forming anion peroxidase na makabuluhang na-upregulated sa aming pag-aaral sa 83A: 476 na lumalaban na linya sa 6 HPI, ngunit hindi sa iba pang mga strain at time point na hindi tumugon.
Ang 9S-/13S-lipoxygenase ng linoleic acid ay ang unang hakbang sa oxidative pathway ng lipid biosynthesis78.Ang mga produkto ng pathway na ito ay may maraming mga function sa pagtatanggol ng halaman, kabilang ang pagpapalakas ng cell wall sa pamamagitan ng pagbuo ng mga deposito ng callose at pectin, at regulasyon ng oxidative stress sa pamamagitan ng paggawa ng reactive oxygen species79,80,81,82,83.Sa kasalukuyang pag-aaral, ang pagpapahayag ng linoleic acid 9S-/13S-lipoxygenase ay binago sa lahat ng mga strain, ngunit sa madaling kapitan na populasyon 22660, ang upregulation ay nanaig sa iba't ibang mga punto ng oras, habang sa mga strain na nagdadala ng lumalaban na Lanr1 at ang AnMan allele, binibigyang-diin nito ang pagkakaiba-iba ng mga reaksyong proteksiyon ng oxylipinx na ito.
Ang 1-aminocyclopropane-1-carboxylate oxidase (ACO) homologue ay makabuluhang na-upregulated (9 genes) o downregulated (2 genes) kapag inoculated na may lupine.Sa dalawang pagbubukod, ang lahat ng mga tugon na ito ay naganap sa 6 hp.sa 83A:476.Ang reaksyon ng enzymatic na pinagsama ng mga protina ng ACO ay ang hakbang na naglilimita sa rate sa paggawa ng ethylene at samakatuwid ay lubos na kinokontrol84.Ang Ethylene ay isang hormone ng halaman na gumaganap ng iba't ibang mga tungkulin sa pag-regulate ng pag-unlad ng halaman at pagtugon sa mga kondisyon ng abiotic at biotic na stress.Ang induction ng ACO transcription at activation ng ethylene signaling pathway ay kasangkot sa pagtaas ng resistensya ng bigas sa hemibiotrophic fungus oryzae oryzae sa pamamagitan ng pag-regulate ng produksyon ng reactive oxygen species at phytoalexins.Ang isang halos kaparehong proseso ng impeksyon sa dahon na natagpuan sa pagitan ng M. oryzae at C. lupini88,89, laban sa backdrop ng isang makabuluhang upregulation ng ACO homologues sa linyang 83A:476 na iniulat sa pag-aaral na ito, ay nagbabago sa posibilidad na magbigay ng paglaban sa NLL anthracnose Ethylene na isang senyas na sentral na hakbang sa mga molecular pathway .
Sa kasalukuyang pag-aaral, ang malakihang pagsugpo sa maraming mga gene na nauugnay sa photosynthesis ay na-obserbahan sa 6 hpi sa 83A: 476 at sa 48 hpi sa Mandeloop at ang 22660 na populasyon.Ang lawak at pag-unlad ng mga pagbabagong ito ay proporsyonal sa antas.Ang paglaban sa anthracnose ay naobserbahan sa eksperimentong ito.Kamakailan lamang, ang malakas at maagang pagsupil sa mga transcript na nauugnay sa photosynthesis ay naiulat sa ilang mga modelo ng mga pakikipag-ugnayan ng plant-pathogen, kabilang ang pathogenic bacteria at fungi.Ang pagmamadali (mula sa 2 HPI sa ilang mga pakikipag-ugnayan) at pandaigdigang pagsugpo ng mga gene na nauugnay sa photosynthesis bilang tugon sa impeksyon ay maaaring mag-trigger ng kaligtasan sa halaman batay sa pag-deploy ng mga reaktibo na species ng oxygen at ang kanilang pakikipag-ugnayan sa landas ng salicylic acid upang mamagitan ang mga reaksiyong alerdyi 90,94.
Sa konklusyon, ang mga mekanismo ng pagtugon sa pagtatanggol na iminungkahi para sa pinaka-lumalaban na linya (83A: 476) ay kinabibilangan ng mabilis na pagkilala sa pathogen ng R gene (siguro TIR-NBS-LRR TanjilG_05042) at allergic response-mediated salicylic acid at ethylene signaling, na sinusundan ng pagtatatag ng long-range SAR.Ang pagkilos ay sinusuportahan ng DIR-1 na protina.Dapat pansinin na ang biotrophic na panahon para sa impeksyon ng C. lupini ay napakaikli (humigit-kumulang 2 araw), na sinusundan ng necrotic growth95.Ang paglipat sa pagitan ng mga yugtong ito ay maaaring nauugnay sa nekrosis at pagpapahayag ng mga ethylene-inducible na protina na kumikilos bilang mga nag-trigger para sa mga reaksyon ng hypersensitivity sa mga halaman ng host.Samakatuwid, ang window ng oras para sa matagumpay na pagkuha ng C. lupini sa biotrophic stage ay napakakitid.Ang reprogramming ng mga gene na nauugnay sa redox at photosynthesis na naobserbahan sa 83A: 476 sa 6 hpi ay pare-pareho sa pag-unlad ng fungal hyphae at nagbabadya ng pagbuo ng isang matagumpay na proteksiyon na tugon sa biotrophic na yugto.Ang mga transcriptomic na tugon ng Mandelup at ang 22660 na populasyon ay maaaring masyadong naantala upang makuha ang fungus bago lumipat sa necrotic growth, gayunpaman, ang Mandelup ay maaaring mas epektibo kaysa sa 22660 na populasyon dahil ang medyo mabilis na regulasyon ng PR-10 na protina ay nagtataguyod ng pahalang na pagtutol.
Ang ETI, na hinimok ng canonical R gene, ay lumilitaw na isang karaniwang mekanismo para sa paglaban ng bean sa anthracnose.Kaya, sa modelong legume Medicago truncatula, ang paglaban sa anthracnose ay ipinagkaloob ng RCT1 gene, isang miyembro ng TIR-NBS-LRR97 plant R gene class.Ang gene na ito ay nagbibigay din ng malawak na spectrum na anthracnose resistance sa alfalfa kapag inilipat sa madaling kapitan ng mga halaman.Sa karaniwang bean (P. vulgaris), higit sa dalawang dosenang anthracnose resistance genes ang natukoy hanggang sa kasalukuyan.Ang ilan sa mga gene na ito ay matatagpuan sa mga rehiyon na kulang sa anumang canonical R genes, gayunpaman marami pang iba ang matatagpuan sa mga gilid ng chromosome na nagdadala ng NBS-LRR gene cluster, kabilang ang TIR-NBS-LRRs99.Kinumpirma din ng genome-wide SSR na pag-aaral ang kaugnayan ng NBS-LRR gene na may anthracnose resistance sa karaniwang bean.Ang canonical R gene ay natagpuan din sa genomic na rehiyon na nagdadala ng pangunahing anthracnose resistance locus sa white lupine 101.
Ipinapakita ng aming trabaho na ang isang agarang reaksyon ng paglaban, na isinaaktibo sa isang maagang yugto ng impeksyon sa halaman (mas mabuti na hindi lalampas sa 12 hpi), ay epektibong nagpoprotekta sa makitid na dahon na lupine mula sa anthracnose na dulot ng pathogenic fungus na Collelotrichum lupini.Gamit ang mataas na throughput sequencing, ipinakita namin ang mga profile ng pagkakaiba-iba ng expression ng mga anthracnose resistance genes sa mga halaman ng NLL na pinagsama ng Lanr1 at AnMan resistance genes.Ang matagumpay na pagtatanggol ay nagsasangkot ng maingat na pagdidisenyo ng mga gene para sa mga protina na kasangkot sa redox, photosynthesis, at pathogenesis sa loob ng ilang oras ng unang kontak ng halaman sa isang pathogen.Ang mga katulad na proteksiyon na reaksyon, ngunit naantala sa oras, ay hindi gaanong epektibo sa pagprotekta sa mga halaman mula sa mga sakit.Ang paglaban sa anthrax na pinapamagitan ng Lanr1 gene ay kahawig ng tipikal na mabilis na pagtugon ng R gene (effector-triggered immunity), habang ang AnMan gene ay malamang na nagbibigay ng pahalang na tugon (immunity na na-trigger ng isang microbe-associated molecular pattern), na nagbibigay ng katamtamang antas ng sustainability.
Ang 215 na linya ng NLL na ginamit upang i-screen para sa mga anthracnose marker ay binubuo ng 74 na cultivars, 60 linya na nakuha sa pamamagitan ng pagtawid o pag-aanak, 5 mutant, at 76 na ligaw o orihinal na germplasm.Ang mga linya ay nagmula sa 17 bansa, pangunahin mula sa Poland (58), Spain (47), Germany (27), Australia (26), Russia (19), Belarus (7), Italy (5) at iba pang linya.mula sa 10 bansa.Kasama rin sa set ang mga linyang lumalaban sa sanggunian: 83A:476, Tanjil, Wonga na nagdadala ng Lanr1 allele, at Mandelup na nagdadala ng AnMan allele.Ang mga linya ay nakuha mula sa European Lupine Genetic Resource Database na pinananatili ng Poznań Plant Breeding Ltd., Wiatrowo, Poland (Supplementary Table S1).
Ang mga halaman ay lumago sa ilalim ng kontroladong mga kondisyon (photoperiod 16 na oras, temperatura 25°C sa araw at 18°C ​​​​sa gabi).Dalawang biological replicates ang nasuri.Ang DNA ay nahiwalay sa tatlong linggong gulang na dahon gamit ang DNeasy Plant Mini Kit (Qiagen, Hilden, Germany) ayon sa protocol.Ang kalidad at konsentrasyon ng nakahiwalay na DNA ay nasuri ng mga pamamaraan ng spectrophotometric (NanoDrop 2000; Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA).Ang AnManM1 marker na nagmamarka sa anthracnose resistance gene na AnMan (nagmula sa cv. Mandelup) at ang mga marker na Anseq3 at Anseq4 na sumasandal sa gene na Lanr1 (nagmula sa cv. Tanjil) ay nasuri na 11,26,28.Ang mga homozygotes para sa lumalaban na allele ay namarkahan bilang "1", madaling kapitan - bilang "0", at heterozygotes - bilang 0.5.
Batay sa mga resulta ng screening para sa mga marker na AnManM1, AnSeq3 at AnSeq4 at ang pagkakaroon ng mga buto para sa panghuling follow-up na mga eksperimento, 50 linya ng NLL ang napili para sa anthracnose resistance phenotyping.Ang pagsusuri ay isinagawa sa duplicate sa isang computer na kinokontrol na greenhouse na may 14 na oras na photoperiod na may hanay ng temperatura na 22°C sa araw at 19°C sa gabi.Ang mga buto ay kinakamot (pinutol ang seed coat sa tapat ng embryo gamit ang matalim na talim) bago ihasik upang maiwasan ang dormancy ng buto dahil sa sobrang tigas ng seed coat at para matiyak ang pare-parehong pagtubo.Ang mga halaman ay lumaki sa mga kaldero (11 × 11 × 21 cm) na may sterile na lupa (TS-1 REC 085 Medium Basic, Klasmann-Deilmann Polska, Warsaw, Poland).Isinagawa ang inoculation gamit ang Colletotrichum lupini Col-08 strain, na lumago noong 1999 mula sa mga tangkay ng makitid na dahon na lupine na halaman na lumago sa isang bukid sa Verzhenitsa, Greater Poland (52° 27′ 42″ N 17° 04′ 05″ E ).Kumuha ng isang lugar.Ang mga isolates ay nilinang sa SNA medium sa 20° C. sa ilalim ng itim na ilaw sa loob ng 21 araw upang mapukaw ang sporulation.Apat na linggo pagkatapos ng paghahasik, kapag ang mga halaman ay umabot sa 4-6 na yugto ng dahon, ang pagbabakuna ay isinasagawa sa pamamagitan ng pag-spray ng isang suspensyon ng conidia sa isang konsentrasyon ng 0.5 x 106 conidia bawat ml.Pagkatapos ng inoculation, ang mga halaman ay pinananatiling madilim sa loob ng 24 na oras sa humidity na humigit-kumulang 98% at isang temperatura na 25°C upang mapadali ang pagtubo ng conidia at ang proseso ng impeksyon.Ang mga halaman ay lumaki sa ilalim ng 14 na oras na photoperiod sa 22°C araw/19°C gabi at 70% na kahalumigmigan.Ang marka ng sakit ay ginawa 22 araw pagkatapos ng inoculation at mula sa 0 (immune) hanggang 9 (napakadaling madaling kapitan) depende sa pagkakaroon o kawalan ng necrotic lesion sa mga tangkay at dahon.Bilang karagdagan, pagkatapos ng pagmamarka, ang bigat ng mga halaman ay sinusukat.Ang mga ugnayan sa pagitan ng mga marker genotypes at mga sakit na phenotype ay kinakalkula bilang point two-sequence correlations (kawalan ng heterozygous marker sa hanay ng mga linya para sa pagsusuri ng anthracnose resistance phenotype).