Nature.com'u ziyaret ettiğiniz için teşekkür ederiz. Kullandığınız tarayıcı sürümü sınırlı CSS desteğine sahiptir. En iyi deneyim için, güncellenmiş bir tarayıcı kullanmanızı (veya Internet Explorer'da uyumluluk modunu kapatmanızı) öneririz. Bu arada, sürekli desteği sağlamak için siteyi stiller ve JavaScript olmadan göstereceğiz.
İnsan bağırsağı morfogenezi, 3D epitel mikromimarisinin ve uzamsal organizasyonun kript villus özelliklerini oluşturur. Bu benzersiz yapı, bazal kriptteki kök hücre nişini eksojen mikrobiyal antijenlerden ve bunların metabolitlerinden koruyarak bağırsak homeostazını korumak için gereklidir. vitro bağırsak modelleri.Çip üzerinde organik mimetik gut, gelişmiş fizyolojik fonksiyonlar ve biyomekanik ile bağırsak epitelinin spontan 3D morfogenezini indükleyebilir. Burada, bağırsakta bağırsak morfogenezini mikroakışkan bir çipte ve ayrıca bir Transwell gömülü hibrit çipte sağlam bir şekilde indüklemek için tekrarlanabilir bir protokol sağlıyoruz. Cihaz üretimi, Caco-2 veya bağırsak organoid epitel hücrelerinin geleneksel ayarlarda ve ayrıca bir mikroflu üzerinde kültürlenmesi için ayrıntılı yöntemler açıklıyoruz idic platformu, 3D morfogenez indüksiyonu ve çoklu görüntüleme yöntemleri kullanılarak kurulan 3D epitel karakterizasyonu. Bu protokol, bazolateral sıvı akışını 5 gün boyunca kontrol ederek fonksiyonel bağırsak mikro mimarisinin yenilenmesini sağlar. İn vitro morfogenez yöntemimiz fizyolojik olarak ilgili kayma stresi ve mekanik hareket kullanır ve mevcut diğer tekniklerden daha iyi performans gösterebilecek karmaşık hücre mühendisliği veya manipülasyon gerektirmez. Önerilen protokolümüzün biyomedikal araştırma topluluğu için geniş etkileri olabileceğini ve rejenerasyon için bir yöntem sunabileceğini öngörüyoruz Biyomedikal, klinik ve farmasötik uygulamalar için in vitro 3D bağırsak epitelyal katmanları.
Deneyler, gut-on-a-chip1,2,3,4,5 veya iki katmanlı mikroakışkan cihazlarda6,7 kültürlenen bağırsak epitelyal Caco-2 hücrelerinin, altta yatan mekanizma net bir şekilde anlaşılmadan in vitro spontan 3D morfogenez geçirebileceğini göstermektedir. türetilmiş bağırsak organoidleri.Epitel hücreleri doğrulandı. Bu çalışmada, güçlü bir Wnt antagonisti olan Dickkopf-1'in (DKK-1) hücre üretimi ve konsantrasyon dağılımına özellikle odaklandık. bağırsak, morfogenezi inhibe eder veya önceden yapılandırılmış 3D epitel tabakasını bozar, bu da kültür sırasındaki antagonistik stresin in vitro bağırsak morfogenezinden sorumlu olduğunu düşündürür. Bu nedenle, epitelyal arayüzde sağlam morfogenez elde etmek için pratik bir yaklaşım, aktif yıkama (örn., gut-on-a-chip veya hybrid-on-a-chip platformlarında) veya difüzyon yoluyla bazolateral bölmedeki Wnt antagonistlerinin seviyelerini kaldırmak veya minimum seviyede tutmaktır. Bazolateral ortam (örn. Transwell'den kuyulardaki büyük bazolateral rezervuarlara ekler).
Bu protokolde, polidimetilsiloksan (PDMS) bazlı gözenekli zarlarda (adım 6A, 7A, 8, 9) veya Transwell eklerinin polyester zarlarında (adım 6B, 7B, 8, 9) ve indüklenmiş 3D morfogenez in vitro ( adım 10).Ayrıca çoklu görüntüleme yöntemleri uygulayarak dokuya özgü histogenezin ve soy bağımlı hücresel farklılaşmanın göstergesi olan hücresel ve moleküler özellikleri belirledik (adım 11-24). Caco-2 veya bağırsak organoidleri gibi insan bağırsak epitel hücrelerini kullanarak morfojenezi indükledik. vitro.2D epitelyal tek tabakalardan 3D morfogenezi indüklemek için, ortamı kültürün bazolateral bölmesine akıtarak her iki kültürlü formdaki morfojen antagonistlerini çıkardık. Son olarak, morfojene bağlı epitel büyümesini, uzunlamasına konakçı-mikrobiyom ortak kültürlerini, patojen enfeksiyonu, enflamatuar yaralanmayı, epitel bariyeri işlev bozukluğunu ve pro biyotik tabanlı tedaviler Örnek.etkiler.
Protokolümüz, temel (ör. bağırsak mukozal biyolojisi, kök hücre biyolojisi ve gelişim biyolojisi) ve uygulamalı araştırma (ör. klinik öncesi ilaç testi, hastalık modellemesi, doku mühendisliği ve gastroenteroloji) geniş etki alanındaki çok çeşitli bilim adamları için yararlı olabilir. Protokolümüzün in vitro bağırsak epitelinin 3D morfogenezini indükleme konusundaki tekrarlanabilirliği ve sağlamlığı nedeniyle, teknik stratejimizin bağırsak gelişimi, rejenerasyon sırasında hücre sinyalleme dinamiklerini inceleyen izleyicilere yayılabileceğini öngörüyoruz. veya homeostaz .Ayrıca protokolümüz, Norovirüs 8, Şiddetli Akut Solunum Sendromu Coronavirüs 2 (SARS-CoV-2), Clostridium difficile, Salmonella Typhimurium 9 veya Vibrio cholerae gibi çeşitli enfeksiyöz ajanlar altındaki enfeksiyonu sorgulamak için kullanışlıdır.Hastalık patolojisi ve patogenezinin hedef kitleleri de yararlıdır. Çip üzerinde bir bağırsak mikrofizyoloji sisteminin kullanılması, uzunlamasına ortak kültürün 10 ve ardından gastrointestinal (GI) kanalda konak savunmasının, bağışıklık tepkilerinin ve patojenle ilişkili yaralanma onarımının değerlendirilmesine izin verebilir 11. Sızdıran bağırsak sendromu, çölyak hastalığı, Crohn hastalığı, ülseratif kolit, poşit veya hassas bağırsak sendromu ile ilişkili diğer GI bozuklukları, 3D bağırsak epitel katmanları hazırlandığında simüle edilebilir hastanın 3B bağırsak epitel katmanlarını kullanan bu hastalıklar arasında villöz atrofi, kript kısalması, mukozal hasar veya bozulmuş epitel bariyeri bulunur. Biyopsi veya kök hücre kaynaklı bağırsak organoidleri12,13. Hastalık ortamının daha yüksek karmaşıklığını daha iyi modellemek için okuyucular, 3B bağırsak villus-kript mikro mimarilerini içeren modellere hasta periferik kan mononükleer hücreleri (PBMC'ler) gibi hastalıkla ilgili hücre türlerini eklemeyi düşünebilir.dokuya özgü bağışıklık hücreleri, 5.
3B epitelyal mikro yapı, kesit alma işlemi olmadan sabitlenebildiği ve görselleştirilebildiği için, uzamsal transkriptomikler ve yüksek çözünürlüklü veya süper çözünürlüklü görüntüleme üzerinde çalışan izleyiciler, epitelyal nişler üzerindeki genlerin ve proteinlerin uzamsal-zamansal dinamiklerini haritalandırmamızla ilgilenebilirler.Teknolojiye ilgi. Mikrobiyal veya immün uyaranlara yanıt. Ayrıca, bağırsak homeostazını koordine eden uzunlamasına konakçı-mikrobiyom karışması 10, 14, çeşitli mikrobiyal türlerin, mikrobiyal toplulukların veya dışkı mikrobiyotasının, özellikle de çip üzerinde bağırsakta birlikte kültürlenmesiyle 3 boyutlu bağırsak mukozal tabakasında kurulabilir.platformda.Bu yaklaşım, laboratuvarda daha önce kültürlenmemiş bağırsak mikrobiyotasını yetiştirmek isteyen mukozal immünoloji, gastroenteroloji, insan mikrobiyomu, kültür bilimi ve klinik mikrobiyoloji okuyan izleyiciler için özellikle caziptir. İn vitro morfogenez protokolümüz, bazolateral bölmeleri sürekli olarak yenileyen 24, 96 veya 384 kuyulu plakalardaki çok oyuklu ekler gibi ölçeklenebilir kültür formatlarına uyarlanabilirse, protokol farmasötik, biyomedikal veya gıda endüstrisi için yüksek verimli tarama veya doğrulama platformları.Bir ilke kanıtı olarak, yakın zamanda 24 kuyulu bir plaka formatına ölçeklenebilen çok katlı yüksek verimli bir morfojenez sisteminin fizibilitesini gösterdik.Ayrıca, çoklu organ-on-a-chip ürünleri ticarileştirildi16,17,18.Bu nedenle, in vitro morfogenez yöntemimizin doğrulaması hızlandırılabilir ve hücresel yeniden programlamayı anlamak için birçok araştırma laboratuvarı, endüstri veya hükümet ve düzenleyici kurum tarafından potansiyel olarak benimsenebilir ilaçları veya biyoterapötikleri test etmek için transkriptomik seviyede in vitro bağırsak morfogenezinin birleştirilmesi İlaç adaylarının emilimi ve taşınması, bağırsak morfojenez sürecinin tekrar üretilebilirliğini değerlendirmek için 3B bağırsak suretleri veya özel veya ticari çip üzerinde organ modelleri kullanılarak değerlendirildi.
Temel olarak in vitro 3D morfogenezi indüklemek için uygulanabilir protokollerin olmaması nedeniyle, sınırlı sayıda insanla ilgili deneysel model bağırsak epitel morfogenezini incelemek için kullanılmıştır. Aslında, bağırsak morfogenezi hakkındaki mevcut bilgilerin çoğu hayvan çalışmalarına dayanmaktadır (örn. zebra balığı20, fareler21 veya tavuklar22). ayrıca çok yönlü ölçeklenebilir bir şekilde test edilme yetenekleri de çok sınırlıdır. Bu nedenle, in vitro 3D doku yapılarını yeniden oluşturma protokolümüz, in vivo hayvan modellerinin yanı sıra diğer geleneksel statik 2D hücre kültürü modellerinden daha iyi performans gösterir. hücreler, konakçı faktörlere (örneğin, iç ve dış mukus katmanları, IgA ve antimikrobiyal peptitlerin salgılanması) yanıt olarak mekansal nişler ve ekolojik evrim oluşturmak için rekabet eder. Ayrıca, 3B epitel morfolojisi, bağırsak mikrobiyotasının kendi topluluklarını nasıl yapılandırdığını ve bazal kriptlerde hücresel organizasyonu ve kök hücre nişlerini şekillendiren mikrobiyal metabolitleri (örneğin kısa zincirli yağ asitleri) sinerjik olarak nasıl ürettiğini anlamamıza olanak tanır. Bu özellikler yalnızca 3B epitel katmanları in vitro olarak kurulmuştur.
3D bağırsak epitel yapıları oluşturma yöntemimize ek olarak, birkaç in vitro yöntem vardır. Bağırsak organoid kültürü, belirli morfojen koşullar altında bağırsak kök hücrelerinin yetiştirilmesine dayanan son teknoloji bir doku mühendisliği tekniğidir23,24,25. Bununla birlikte, taşıma analizi veya konakçı-mikrobiyom ortak kültürleri için 3B organoid modellerin kullanımı, bağırsak lümeni organoid içinde kapalı olduğundan ve bu nedenle mikrobiyal hücreler gibi lümen bileşenlerinin tanıtılmasından dolayı genellikle zordur. veya ekzojen antijenler sınırlıdır.Organoid lümenlere erişim, bir mikroenjektör kullanılarak iyileştirilebilir,26,27 ancak bu yöntem invaziv ve emek yoğundur ve gerçekleştirmek için özel bilgi gerektirir. Ayrıca, statik koşullar altında hidrojel yapı iskelelerinde tutulan geleneksel organoid kültürler, aktif in vivo biyomekaniği doğru şekilde yansıtmaz.
Birkaç araştırma grubu tarafından kullanılan diğer yaklaşımlar, jel yüzeyinde izole edilmiş insan bağırsak hücrelerini kültürleyerek bağırsak epitel yapısını taklit etmek için önceden yapılandırılmış 3D hidrojel yapı iskelelerini kullanır. 3D baskılı, mikro öğütülmüş veya litografik olarak üretilmiş kalıplar kullanarak hidrojel yapı iskeleleri oluşturun. stromal hücreleri iskeleye dahil ederek karışma. Bununla birlikte, önceden yapılandırılmış yapı iskelelerinin doğası, spontan morfogenetik sürecin kendisinin görüntülenmesini engelleyebilir. Bu modeller ayrıca dinamik lüminal veya interstisyel akış sağlamaz, bağırsak hücrelerinin morfogenezden geçmesi ve fizyolojik fonksiyon kazanması için ihtiyaç duyduğu sıvı kayma stresinden yoksundur. Yakın zamanda yapılan başka bir çalışmada, mikroakışkan bir platformda hidrojel iskeleler ve lazerle dağlama teknikleri kullanılarak desenli bağırsak epitel yapıları kullanılmıştır. Fare bağırsak organoidleri kazınmış takip eder Bağırsak tübüler yapıları oluşturmak için desenler ve intraluminal sıvı akışı, bir mikroakışkan modülü kullanılarak özetlenebilir. Bununla birlikte, bu model, spontan morfogenetik süreçleri sergilemez ve bağırsak mekanobiyolojik hareketlerini içermez. Aynı gruptan alınan 3D baskı teknikleri, spontan morfogenetik süreçlere sahip minyatür bağırsak tüpleri oluşturmayı başardı. Tüp içindeki farklı bağırsak segmentlerinin karmaşık üretimine rağmen, bu modelde ayrıca lümen sıvı akışı ve mekanik deformasyon yoktur. Ek olarak, modelin çalışabilirliği, özellikle biyobaskıdan sonra sınırlı olabilir süreç tamamlandı, rahatsız edici deneysel koşullar veya hücreden hücreye etkileşimler. Bunun yerine, önerdiğimiz protokol spontan bağırsak morfogenezi, fizyolojik olarak ilgili kayma gerilimi, bağırsak hareketliliğini taklit eden biyomekanik, bağımsız apikal ve bazolateral bölmelere erişilebilirlik ve modülerliğin karmaşık biyolojik mikro ortamlarının yeniden oluşturulmasını sağlar. Bu nedenle, in vitro 3D morfogenez protokolümüz, mevcut yöntemlerin zorluklarının üstesinden gelmek için tamamlayıcı bir yaklaşım sağlayabilir.
Protokolümüz tamamen 3D epitelyal morfogenez üzerine odaklanmıştır, kültürde yalnızca epitel hücreleri vardır ve mezenkimal hücreler, endotelyal hücreler ve bağışıklık hücreleri gibi başka çevre hücre türleri yoktur. dalgalı 3D epitel tabakasını yeniden oluşturmak için bize, epitelyal-mezenkimal etkileşimler33,34, hücre dışı Matriks (ECM) biriktirme 35 ve modelimizde, bazal kriptlerde kök hücre nişlerini ileten kript-villus özellikleri gibi ek biyolojik karmaşıklıklar daha fazla dikkate alınmaya devam etmektedir. Mezenşimdeki stromal hücreler (örn. 37,38.Modelimize mezenkimal hücrelerin eklenmesi, morfogenetik süreci ve hücre bağlanma etkinliğini artırdı. Endotel tabakası (yani, kılcal damarlar veya lenfatikler), bağırsak mikroçevresinde moleküler taşınımı39 ve immün hücre alımını40 düzenlemede önemli bir rol oynar. Ayrıca, doku modelleri arasında bağlanabilen vaskülatür bileşenleri, doku modelleri çoklu organ etkileşimlerini göstermek üzere tasarlanırken bir ön koşuldur. Bu nedenle, daha doğru fizyolojik modellemek için endotel hücrelerinin dahil edilmesi gerekebilir organ düzeyinde çözünürlüğe sahip özellikler. Hastadan türetilen bağışıklık hücreleri ayrıca bağırsak hastalığını taklit etme bağlamında doğuştan gelen bağışıklık tepkilerini, antijen sunumunu, doğuştan gelen adaptif bağışıklık karışmasını ve dokuya özgü bağışıklığı göstermek için gereklidir.
Hibrit çiplerin kullanımı chip-on-a-chip'ten daha basittir çünkü cihaz kurulumu daha basittir ve Transwell insertlerinin kullanımı bağırsak epitelyumunun ölçeklenebilir kültürüne izin verir. Ancak, ticari olarak temin edilebilen polyester membranlı Transwell insertleri elastik değildir ve peristaltik benzeri hareketleri simüle edemez. Ayrıca, hibrit çipe yerleştirilen Transwell insertinin apikal bölmesi, apikal tarafta herhangi bir kayma gerilimi olmaksızın sabit kalmıştır. Açıkça, apikal bölmedeki statik özellikler nadiren hibrit çiplerde uzun vadeli bakteri ortak kültürünü mümkün kılar. Hibrit çipler kullanırken Transwell eklerinde 3D morfogenezi sağlam bir şekilde indükleyebilirken, fizyolojik olarak ilgili biyomekaniğin ve apikal sıvı akışının eksikliği, potansiyel uygulamalar için hibrit çip platformlarının fizibilitesini sınırlayabilir.
Çip üzerinde bağırsak ve çip üzerinde hibrit kültürlerde insan kript villus ekseninin tam ölçekli rekonstrüksiyonları tam olarak oluşturulmamıştır. Morfogenez bir epitelyal tek tabakadan başladığından, 3D mikro mimariler in vivo kriptlere morfolojik benzerlik sağlamayabilir. işaretli.Çip üzerindeki daha yüksek üst kanallar, mikromühendislik epitelinin yüksekliğinin artmasına neden olsa da, maksimum yükseklik hala ~300–400 µm ile sınırlıdır. İnce ve kalın bağırsaklardaki insan bağırsak kriptlerinin gerçek derinliği sırasıyla ~135 µm ve ~400 µm'dir ve ince bağırsak villusunun yüksekliği ~600 µm41'dir.
Görüntüleme açısından bakıldığında, 3D mikro mimarilerin yerinde süper çözünürlüklü görüntülemesi, bir çip üzerindeki bağırsakla sınırlı olabilir, çünkü objektif lensten epitel tabakasına gereken çalışma mesafesi birkaç milimetre mertebesindedir. Bu sorunun üstesinden gelmek için uzak bir hedef gerekebilir. epitel tabakasının yüzey yapısını incelemek için üst tabakayı açmak veya çıkarmak son derece zordur. Örneğin, bir taramalı elektron mikroskobu (SEM) kullanarak.
PDMS'nin hidrofobikliği, hidrofobik küçük moleküllerle ilgili mikroakışkan tabanlı çalışmalarda sınırlayıcı bir faktör olmuştur, çünkü PDMS bu tür hidrofobik molekülleri spesifik olmayan bir şekilde adsorbe edebilir. PDMS'ye alternatifler, diğer polimerik malzemelerle birlikte düşünülebilir. Alternatif olarak, PDMS'nin yüzey modifikasyonu (örn.
Son olarak, yöntemimiz, yüksek verimli bir tarama veya "herkese uyan tek beden" kullanıcı dostu deney platformu sağlama açısından iyi bir şekilde karakterize edilmemiştir. Mevcut protokol, bir CO2 inkübatöründe yer kaplayan ve büyük ölçekli deneyleri önleyen mikro cihaz başına bir şırınga pompası gerektirir. Bu sınırlama, yenilikçi kültür formatlarının ölçeklenebilirliği ile önemli ölçüde iyileştirilebilir (örn. medya).
İnsan bağırsak epitelinin in vitro 3D morfogenezini indüklemek için, bir lümen-kılcal arayüz oluşturmak için aralarında iki paralel mikro kanal ve elastik gözenekli bir zar içeren bir mikroakışkan çip bağırsak cihazı kullandık. morfojen antagonistlerini bazolateral bölmeden çıkarmak için akış. Deneysel prosedürün tamamı (Şekil 1) beş bölümden oluşur: (i) bağırsak çipinin veya Transwell takılabilir hibrit çipin mikrofabrikasyonu (adım 1-5; Kutu 1), (ii) bağırsak epitel hücrelerinin (Caco-2 hücreleri) veya insan bağırsak organoidlerinin hazırlanması;kutular 2-5), (iii) bağırsak çipleri veya hibrit çipler üzerinde bağırsak epitel hücrelerinin kültürü (adım 6-9), (iv) 3D epitelyal mikroyapıyı karakterize etmek için in vitro 3D morfojenez indüksiyonu (adım 10) ve (v) ) (adım 11-24). Son olarak, epitelyal morfogenezi uzamsal ile karşılaştırarak in vitro morfojenezin etkinliğini doğrulamak için uygun bir kontrol grubu (aşağıda daha ayrıntılı tartışılmıştır) tasarlanmıştır. , zamansal, koşullu veya prosedürel kontroller.
İki farklı kültür platformu kullandık: düz kanallı veya doğrusal olmayan kıvrımlı kanallara sahip çip üzerinde bağırsak veya Kutu 1 ve adım 1-5'te açıklandığı gibi üretilmiş bir mikroakışkan cihazda Transwell (TW) ekleri içeren hibrit çipler. In vitro morfojenez", Caco-2 veya organoid türevli epitel hücrelerinin bir bağırsak çipinde veya bir hibrit çipin Transwell eklerinde kültürlendiği genel adımları ve ardından 3D morfojenezin indüksiyonunu ve karakterize edilmiş bir epitel yapısının oluşumunu gösterir. Program adım numarası veya kutu numarası her okun altında görüntülenir. me ekosistemleri ve hastalık modelleme. Bağırsak çipinde oluşturulan 3D Caco-2 epitel tabakasında ifade edilen çekirdekleri, F-aktini ve MUC2'yi gösteren "Hücre Farklılaşması"ndaki immünofloresan görüntüler. MUC2 sinyali, goblet hücrelerinde ve mukozal yüzeylerden salgılanan mukusta mevcuttur. Bağırsak Fizyolojisindeki floresan görüntüler, floresan buğday tohumu agg kullanılarak sialik asit ve N-asetilglukosamin kalıntıları için boyama ile üretilen mukusu gösterir. lutinin. "Konak Mikrop Ortak Kültürleri"ndeki üst üste binen iki görüntü, bir çip üzerinde bağırsaktaki temsili konak mikrobiyom ortak kültürlerini gösterir. Sol panel, mikro mühendislik ürünü 3D Caco-2 epitel hücreleri ile yeşil flüoresan protein (GFP) ifade eden E. coli'nin ortak kültürünü gösterir. Sağ panel, 3D Caco-2 epitel hücreleri ile birlikte kültürlenmiş GFP E. coli'nin lokalizasyonunu ve ardından F ile immünofloresan boyamayı gösterir. -aktin (kırmızı) ve çekirdekler (mavi). Hastalık modellemesi, bakteriyel antijenler (örn. lipopolisakarit, LPS) ve bağışıklık hücreleri (örn. PBMC;yeşil).Caco-2 hücreleri, bir 3D epitel tabakası oluşturmak için kültürlendi. Ölçek çubuğu, 50 µm. Alt sıradaki resimler: "Hücrelerin farklılaşması", referansın izniyle uyarlanmıştır.2.Oxford Üniversite Yayınları;Ref.5'in izniyle çoğaltılmıştır.NAS;“Konak Mikrop Ortak Kültürü” ref.3'ten izin alınarak uyarlanmıştır.NAS;“Hastalık Modellemesi” referanstan izin alınarak uyarlanmıştır.5.NAS.
Hem çip üzerinde bağırsak hem de hibrit çipler, silikon kalıplardan yumuşak litografi1,44 ile kalıptan çıkarılan ve SU-8 ile modellenen PDMS kopyaları kullanılarak üretildi. Her çipteki mikro kanalların tasarımı, kayma gerilimi ve hidrodinamik basınç gibi hidrodinamikler dikkate alınarak belirlenir. Artan sıvı kalma süresini, doğrusal olmayan akış modellerini ve kültürlenmiş hücrelerin çok eksenli deformasyonunu indüklemek için bir çift kavisli mikrokanal içeren bir çip üzerinde (Genişletilmiş Veri Şekil 1b) (Şekil 2a-f) kültürlenmiş hücre tipinden bağımsız olarak orijinal Gut-Chip ile karşılaştırıldığında epitelyal büyüme.2a). Bağırsağı bir çip üzerinde imal etmek için, hazırlanan üst PDMS katmanı sırayla gözenekli bir PDMS filmine bağlandı ve ardından bir korona işleyici kullanılarak geri döndürülemez bir şekilde bağlanarak alt PDMS katmanıyla hizalandı (Şekil 2b-f). Hibrit çipler üretmek için, iyileştirilmiş PDMS kopyaları, Transwell eklerini barındırabilecek tek kanallı mikroakışkan cihazlar oluşturmak için cam slaytlara bağlandı (Şekil 2h ve Genişletilmiş Veri Şekil 2). Bağlama işlemi PDMS replikasının ve camın yüzeylerinin oksijen plazma veya korona tedavisi ile işlenmesiyle gerçekleştirilir. Silikon tüpe bağlı mikrofabrike cihazın sterilizasyonundan sonra, cihaz kurulumu bağırsak epitelinin 3D morfogenezini gerçekleştirmeye hazırdı (Şekil 2g).
a, SU-8 desenli silikon kalıplardan PDMS parçalarının hazırlanmasının şematik gösterimi. Sertleşmemiş PDMS çözeltisi bir silikon kalıba döküldü (solda), 60 °C'de sertleştirildi (ortada) ve kalıptan çıkarıldı (sağda). ve alt PDMS bileşenleri ve birleştirilmiş çip üzerinde bağırsak cihazı.e, Üst, zar ve alt PDMS bileşenlerinin hizalanmasının şeması. dudak.Çip cihazı, işlenmek üzere 150 mm'lik bir Petri kabının kapağına yerleştirildi. Bağlayıcı, silikon tüpü kapatmak için kullanılır.h, Hibrit çip üretiminin görsel anlık görüntüleri ve hibrit çipler kullanılarak 3D morfojenez. Bağırsak epitel hücrelerinin 2D tek tabakalarını kültürlemek için bağımsız olarak hazırlanan Transwell ekleri, bağırsak 3B morfojenezini indüklemek için hibrit çipe yerleştirildi. Ortam, Transwell eki üzerinde oluşturulan hücre katmanının altındaki mikro kanallar aracılığıyla perfüze edilir. Ölçek çubuğu, 1 cm .h Reference.4'ün izniyle yeniden basılmıştır.Elsevier.
Bu protokolde, epitel kaynakları olarak Caco-2 hücre çizgisi ve bağırsak organoidleri kullanıldı (Şekil 3a). Her iki hücre türü de bağımsız olarak kültürlendi (Kutu 2 ve Kutu 5) ve çip üstü bağırsağın veya Transwell eklerinin ECM kaplı mikro kanallarını tohumlamak için kullanıldı. Hücreler birleştiğinde (şişelerde >%95 kapsama), T-şişelerde rutin olarak kültürlenen Caco-2 hücreleri (10 ve 50 pasajları arasında) hasat edilir Tripsinizasyon sıvısı ile ayrışmış hücre süspansiyonları hazırlamak için ed (kutu 2). Bağırsak biyopsilerinden veya cerrahi rezeksiyonlardan elde edilen insan bağırsak organoidleri, yapısal mikro ortamı desteklemek için 24 oyuklu plakalarda Matrigel iskele kubbelerinde kültürlendi. Temel morfojenler (Wnt, R-spondin ve Noggin gibi) ve Kutu 3'te açıklandığı gibi hazırlanan büyüme faktörlerini içeren ortam, organoidler ~500 um çapa ulaşana kadar her gün desteklendi. Tamamen büyümüş organoidler hasat edilir ve bağırsak üzerine tohumlama veya bir çip üzerindeki Transwell ekleri için tek hücreler halinde ayrıştırılır (Kutu 5). Daha önce bildirdiğimiz gibi, hastalık tipine12,13 (örn. ülseratif kolit, Crohn hastalığı, kolorektal kanser veya normal donör), lezyon bölgesine (örn. ).Kutu 5'te, tipik olarak ince bağırsak organoidlerinden daha yüksek morfojen konsantrasyonları gerektiren kolonik organoidlerin (koloidler) kültürlenmesi için optimize edilmiş bir protokol sağlıyoruz.
a, Bağırsak çipinde bağırsak morfogenezinin uyarılması için iş akışı. Caco-2 insan bağırsak epiteli ve bağırsak organoidleri, 3D morfogenezi göstermek için bu protokolde kullanılır. İzole edilmiş epitel hücreleri, hazırlanan çip üzerinde bağırsak cihazına (çip hazırlığı) ekilmiştir. ilk 2 gün (akış, AP, D0-D2). Bazolateral (BL) akış, tam bir 2B tek tabaka oluşturulduğunda döngüsel germe hareketleriyle (germe, akış, AP ve BL) birlikte başlatılır. Bağırsak 3B morfogenezi, 5 günlük mikroakışkan kültürden (morfogenez, D5) sonra kendiliğinden meydana gelir. Faz kontrast görüntüleri, her deneysel adımda veya zaman noktasında (çubuk grafik, 100 µm) Caco-2 hücrelerinin temsili morfolojisini gösterir. karşılık gelen bağırsak morfogenezi basamaklarını gösteren şematik diyagramlar (sağ üst). Şematikteki kesikli oklar, sıvı akışının yönünü temsil eder.b, yerleşik 3D Caco-2 epitelinin (solda) yüzey topolojisini gösteren SEM görüntüsü. Büyütülmüş alanı vurgulayan iç kısım (beyaz kesikli kutu), 3D Caco-2 katmanında (sağda) yenilenmiş mikrovillusları gösterir (sağda).c, Yerleşik Caco-2 3'ün yatay önden görünümü D, claudin (ZO-1, kırmızı) ve F-aktin (yeşil) ve çekirdekler (mavi) etiketli sürekli fırça sınır zarları Bağırsak çiplerinde epitel hücrelerinin immünofloresan konfokal görselleştirmesi. Orta şemayı gösteren oklar, her bir konfokal görünüm için odak düzleminin konumunu gösterir.d, 3, 7, 9, 11 ve 1. 3.Ek parça (sağ üst), sağlanan görüntünün yüksek büyütme oranını gösterir. e, 7.f gününde alınan dilimde bağırsakta oluşturulan organoid 3D epitelyumun DIC fotomikrografı, kök hücreler için belirteçleri gösteren üst üste bindirilmiş immünofloresan görüntüleri (LGR5;macenta), goblet hücreleri (MUC2; yeşil), F-aktin (gri) ve çekirdekler (cam göbeği), epitel tabakasında sırasıyla 3 gün boyunca (Solda) ve 13 günlük (ortada) organoidlerde büyütüldü. MUC2 sinyali olmadan LGR5 sinyalini vurgulayan Genişletilmiş Veri Şekil 3'e bakın. kültürün 13. gününde plazma zarını CellMask boyası (sağda) ile boyayarak çip. Aksi belirtilmedikçe ölçek çubuğu 50 μm'dir.b Reference.2'nin izniyle yeniden basılmıştır.Oxford Üniversite Yayınları;c Reference.2'nin izniyle uyarlanmıştır.Oxford Üniversite Yayınları;e ve f, referans alınarak izin alınarak uyarlanmıştır.12 Creative Commons Lisansı Altında CC BY 4.0.
Bir çip üzerindeki bağırsakta, başarılı ECM kaplaması için PDMS gözenekli zarının hidrofobik yüzeyini değiştirmek gerekir. Bu protokolde, PDMS zarlarının hidrofobikliğini değiştirmek için iki farklı yöntem uyguluyoruz. PDMS mikrokanallarına sırayla polietilenimin (PEI) ve glutaraldehit uygulayarak ECM proteinlerinin verimli bir şekilde biriktirilmesini sağlamak için kimyasal bazlı yüzey işlevselleştirme. Yüzey modifikasyonundan sonra, ECM proteinleri işlevselleştirilmiş PDMS yüzeyini kaplamak için biriktirildi ve daha sonra izole organoid epitelyuma yerleştirildi. statik koşullar. Yüzey aktivasyonu ve ECM kaplaması için optimize edilmiş bu yöntem, PDMS yüzeyinde 3D morfogenezi indüklemek için organoid epitelyumun eklenmesini sağlar.
Transwell kültürleri ayrıca hücre tohumlamadan önce ECM kaplaması gerektirir;bununla birlikte, Transwell kültürleri, gözenekli eklerin yüzeyini aktive etmek için karmaşık ön işlem adımları gerektirmez. Transwell eklerinde büyüyen Caco-2 hücreleri için, gözenekli eklerde ECM kaplaması, ayrışmış Caco-2 hücrelerinin bağlanmasını (<1 saat) ve sıkı bağlantı bariyeri oluşumunu (<1-2 gün) hızlandırır. bariyer bütünlüğüne sahip katman. Transwell kültürleri, hibrit çipler kullanılmadan 24 oyuklu plakalarda gerçekleştirilir.
İn vitro 3D morfogenez, yerleşik bir epitel tabakasının bazolateral yönüne sıvı akışı uygulanarak başlatılabilir. Bir çip üzerindeki bağırsakta, epitelyal morfogenez, ortam üst ve alt mikro kanallara perfüze edildiğinde başladı (Şekil 3a). stres, tipik olarak bir çip üzerinde bağırsakta ikili akış uyguluyoruz. Hibrit çiplerde, epitel tek tabakalarını içeren Transwell ekleri hibrit çiplere yerleştirildi. Daha sonra ortam, gözenekli Transwell ek parçasının bazolateral tarafının altına mikro kanal aracılığıyla uygulandı. Bağırsak morfogenezi, her iki kültür platformunda da bazolateral akışın başlamasından 3-5 gün sonra meydana geldi.
Mikromühendislik ürünü 3B epitel katmanlarının morfolojik özellikleri, faz kontrast mikroskobu, diferansiyel girişim kontrast (DIC) mikroskobu, SEM veya immünofloresan konfokal mikroskopi (Şekil 3 ve 4) dahil olmak üzere çeşitli görüntüleme yöntemleri uygulanarak analiz edilebilir. Faz kontrastı veya DIC görüntüleme, 3B epitel katmanlarının şeklini ve çıkıntısını izlemek için kültür sırasında herhangi bir zamanda kolayca gerçekleştirilebilir. çip üzerinde ve hibrit çip platformları, cihazın bölümlere ayrılmasına veya sökülmesine ihtiyaç duymadan gerçek zamanlı yerinde görüntüleme sağlayabilir. İmmünofloresan görüntüleme yapılırken (Şekil 1, 3c, f ve 4b, c), hücreler tipik olarak %4 (ağırlık/hacim) paraformaldehit (PFA), ardından Triton X-100 ve %2 (ağırlık/hacim) ) sığır serum albümini (BSA) ile sırayla sabitlenir. Hücre tipine bağlı olarak , farklı fiksatifler, geçirgenleştiriciler ve bloke edici maddeler kullanılabilir. Soy bağımlı hücre veya bölge işaretleyicilerini hedefleyen birincil antikorlar, çip üzerinde yerinde immobilize edilmiş hücreleri vurgulamak için kullanılır, ardından sekonder antikorlar ve çekirdeği (örn. 4',6-diamidino-2-fenilen) indol, DAPI) veya F-aktin'i (örn. floresan etiketli phalloidin) hedefleyen bir karşı boyama ile birlikte kullanılır. Floresan bazlı canlı görüntüleme, mukus üretimini saptamak için yerinde de gerçekleştirilebilir (Şek.1, "Hücre farklılaşması" ve "Bağırsak fizyolojisi"), mikrobiyal hücrelerin rastgele kolonizasyonu (Şekil 1, "Konakçı-mikrop ortak kültürü"), bağışıklık hücrelerinin toplanması (Şekil 1, 'Hastalık Modelleme') veya 3D epitelyal morfolojinin konturları (Şekil 3c,f ve 4b,c). ref.'de açıklandığı gibi üst katmanı alt mikrokanal katmanından ayırmak için çip üzerindeki bağırsakları değiştirirken Şekil 2, 3 boyutlu epitel morfolojisi ve ayrıca apikal fırça sınırındaki mikrovillus SEM ile görselleştirilebilir (Şekil 3b). Farklılaşma belirteçlerinin ifadesi, kantitatif PCR5 veya tek hücreli RNA dizilimi gerçekleştirilerek değerlendirilebilir. Bu durumda, bağırsak çiplerinde veya hibrit çiplerde yetiştirilen epitel hücrelerinin 3 boyutlu katmanları, trypsinization ile hasat edilir ve daha sonra moleküler veya genetik analiz için kullanılır.
a, Hibrit bir çipte bağırsak morfogenezinin uyarılması için iş akışı. Caco-2 ve bağırsak organoidleri, bu protokolde bir hibrit çip platformunda 3D morfogenezi göstermek için kullanılır. Ayrışmış epitel hücreleri, hazırlanmış Transwell eklerine (TW hazırlığı; aşağıdaki şekle bakın) ekildi. Hücreler ekildikten (tohumlandıktan) ve Transwell eklerinde polyester zarlara bağlandıktan sonra, tüm hücreler statik koşullar altında kültürlendi (TW kültürü). 7 gün sonra, tek bir Transwell eki 2D tek tabakalı epitel hücreleri içeren bir hibrit çipe entegre edilerek bir bazolateral akış (Flow, BL) tanıtıldı ve bu da sonuçta bir 3D epitel tabakasının oluşturulmasına (morfogenez) yol açtı. Normal donörden (C103 çizgisi) yükselen kolondan türetilen insan organı epitel hücrelerinin morfolojik özelliklerini gösteren faz kontrast mikrografları her deneysel adımda veya zaman noktasında. Üst katmanlardaki şemalar her adım için deneysel konfigürasyonu gösterir.b, Hibrit çipler (sol şematik) ) farklı Z konumlarında (üst, orta ve alt;sağ şemaya ve karşılık gelen noktalı çizgilere bakın).bariz morfolojik özellikler gösterdi.c, sırasıyla 2B ile 3B morfolojiyi karşılaştıran statik Transwell'de (TW; beyaz kesikli kutu içinde iç metin) kültürlenmiş organoid türevli epitel hücrelerinin Floresan konfokal mikrografları (3B açılı görünüm). D özellikleri.Ölçek çubuğu, 100 µm.c Reference.4'ün izniyle yeniden basılmıştır.Elsevier.
Kontroller, aynı hücrelerin (Caco-2 veya bağırsak organoid epitel hücreleri) geleneksel statik kültür koşulları altında iki boyutlu tek tabakalara kültürlenmesiyle hazırlanabilir. Özellikle, mikro kanalların sınırlı hacim kapasitesi nedeniyle besin maddesinin tükenmesi meydana gelebilir (yani, orijinal bağırsak çipi tasarımında üst kanalda ~4 µL). Bu nedenle, bazolateral akışın uygulanmasından önceki ve sonraki epitel morfolojisi de karşılaştırılabilir.
Yumuşak litografi işlemi temiz bir odada yapılmalıdır. Çip (üst ve alt katmanlar ve zarlar) ve hibrit çipler üzerindeki her katman için, mikrokanalların yükseklikleri farklı olduğu için farklı fotomaskeler kullanıldı ve ayrı silikon gofretler üzerinde üretildi. Çip üzerindeki bağırsağın üst ve alt mikrokanallarının hedef yükseklikleri sırasıyla 500 µm ve 200 µm'dir. Hibrit çipin kanal hedef yüksekliği 200 µm'dir.
Asetonlu bir tabağa 3 inçlik bir silikon gofret yerleştirin. Plakayı 30 saniye hafifçe döndürün, ardından gofreti havayla kurutun. Gofreti IPA içeren bir plakaya aktarın, ardından temizlemek için plakayı 30 saniye döndürün.
Bir piranha solüsyonu (hidrojen peroksit ve konsantre sülfürik asit karışımı, 1:3 (hacim/hacim)) isteğe bağlı olarak silikon gofret yüzeyinden organik kalıntıların çıkarılmasını maksimize etmek için kullanılabilir.
Piranha solüsyonu son derece aşındırıcıdır ve ısı üretir. Ek güvenlik önlemleri gereklidir. Atık bertarafı için solüsyonun soğumasını bekleyin ve temiz, kuru bir atık kabına aktarın. İkincil kaplar kullanın ve atık kaplarını uygun şekilde etiketleyin. Daha ayrıntılı prosedürler için lütfen tesisin güvenlik yönergelerini izleyin.
Gofretleri 200 °C'lik bir sıcak plaka üzerine 10 dakika koyarak kurutun. Dehidrasyondan sonra, gofret soğuması için havada beş kez çalkalandı.
Temizlenmiş silikon levhanın ortasına ~10 g fotodirençli SU-8 2100 dökün. Fotodirenci gofretin üzerine eşit şekilde yaymak için cımbız kullanın. Fotorezistin daha az yapışkan olması ve yayılmasını kolaylaştırmak için gofreti ara sıra 65°C'lik bir sıcak plaka üzerine yerleştirin. Gofreti doğrudan sıcak plaka üzerine koymayın.
SU-8, spin kaplama çalıştırılarak gofretin üzerine eşit şekilde dağıtıldı. SU-8'in gelen dönüşünü 5–10 s için 500 rpm'de 100 rpm/s'lik bir ivmeyle yayılacak şekilde programlayın. 300 rpm/s hızlanma 1.200 rpm'de 30 saniye.
Ana sıkma hızı, silikon gofret üzerindeki SU-8 deseninin hedeflenen kalınlığına göre ayarlanabilir.
Çip üzerindeki bağırsağın üst tabakası için 500 µm yüksekliğinde SU-8 modellerini imal etmek amacıyla, bu Kutunun döndürerek kaplama ve yumuşak pişirme adımları (adım 7 ve 8), 250 µm'lik iki tabaka üretmek üzere sırayla tekrarlandı (bkz. adım 9).
SU-8 kaplı gofretleri, gofretleri 65 °C'de 5 dakika boyunca sıcak bir plaka üzerine dikkatlice yerleştirerek yumuşak pişirin, ardından ayarı 95 °C'ye değiştirin ve 40 dakika daha inkübe edin.
Üst mikro kanalda SU-8 modelinin 500 μm yüksekliğini elde etmek için, 250 μm kalınlığında iki SU-8 katmanı oluşturmak için 7. ve 8. adımları tekrarlayın.
UV Maske Hizalayıcıyı kullanarak, levhanın maruz kalma süresini hesaplamak için üreticinin talimatlarına göre bir lamba testi yapın.(maruz kalma süresi, ms) = (maruz kalma dozu, mJ/cm2)/(lamba gücü, mW/cm2).
Pozlama süresini belirledikten sonra, fotomaskeyi UV maskesi hizalayıcının maske tutucusuna yerleştirin ve fotomaskeyi SU-8 kaplı gofret üzerine yerleştirin.
UV dağılımını en aza indirmek için foto maskenin baskılı yüzeyini doğrudan silikon levhanın SU-8 kaplı tarafına yerleştirin.
SU-8 kaplı gofreti ve foto maskeyi önceden belirlenmiş maruz kalma süresi için dikey olarak 260 mJ/cm2 UV ışığına maruz bırakın (bu kutunun 10. adımına bakın).
UV'ye maruz kaldıktan sonra SU-8 kaplı silikon gofretler, 200 μm yüksekliğe sahip desenler üretmek için her bir sıcak plaka üzerinde 65°C'de 5 dakika ve 95°C'de 15 dakika pişirildi.
Developer bir cam tabağa dökülür ve pişmiş gofret tabağa yerleştirilir. SU-8 Developer'ın hacmi cam plakanın boyutuna göre değişebilir. Pozlanmamış SU-8'i tamamen çıkarmak için yeterli SU-8 Developer kullandığınızdan emin olun. Örneğin, 1 L kapasiteli 150 mm çapında bir cam tabak kullanırken ~300 mL SU-8 Developer kullanın. Kalıbı ara sıra hafifçe döndürerek 25 dakika boyunca geliştirin.
Geliştirilen kalıbı ~10 mL taze geliştirici ve ardından bir pipet kullanarak çözeltiyi püskürterek IPA ile durulayın.
Gofreti bir plazma temizleyiciye yerleştirin ve 1,5 dakika boyunca oksijen plazmasına (atmosferik gaz, hedef basınç 1 × 10−5 Torr, güç 125 W) maruz bırakın.
Gofreti, içinde cam slayt bulunan bir vakum kurutucuya yerleştirin. Gofretler ve slaytlar yan yana yerleştirilebilir. Vakum kurutucu bir plaka ile birkaç katmana bölünmüşse, slaytları alt bölmeye ve gofretleri üst bölmeye yerleştirin.
Bir şişe donmuş Caco-2 hücresini 37°C'lik bir su banyosunda eritin, ardından çözülmüş hücreleri 15 mL 37°C'de önceden ısıtılmış Caco-2 ortamı içeren bir T75 şişesine aktarın.
Caco-2 hücrelerini ~%90 konfluansta geçirmek için, önce ılık Caco-2 ortamı, PBS ve %0,25 tripsin/1 mM EDTA, 37°C'lik bir su banyosunda.
Vakum aspirasyonu ile ortamı aspire edin. Vakum aspirasyonunu tekrarlayarak ve taze PBS ekleyerek hücreleri 5 mL ılık PBS ile iki kez yıkayın.