Nature.com'u ziyaret ettiğiniz için teşekkür ederiz. Kullandığınız tarayıcı sürümünde CSS desteği sınırlıdır. En iyi deneyim için güncel bir tarayıcı kullanmanızı (veya Internet Explorer'da uyumluluk modunu kapatmanızı) öneririz. Bu arada, sürekli desteğin sağlanması için siteyi stiller ve JavaScript olmadan görüntüleyeceğiz.
İnsan bağırsağı morfogenezi, 3 boyutlu epitel mikro mimarisinin ve mekansal organizasyonunun kript-villus özelliklerini oluşturur. Bu benzersiz yapı, bazal kriptteki kök hücre nişini ekzojen mikrobiyal antijenlerden ve bunların metabolitlerinden koruyarak bağırsak homeostazını korumak için gereklidir. Ek olarak, bağırsak villusları ve salgılayan mukus, bağırsak mukozal yüzeyinde koruyucu bir bariyere sahip işlevsel olarak farklılaşmış epitel hücreleri sunar. Bu nedenle, 3 boyutlu epitel yapıların yeniden oluşturulması, in vitro bağırsak modellerinin oluşturulması için çok önemlidir. Özellikle, organik taklitçi bağırsak-çip, gelişmiş fizyolojik işlevler ve biyomekanik ile bağırsak epitelinin kendiliğinden 3 boyutlu morfogenezini indükleyebilir. Burada, bir mikroakışkan çipte ve bir Transwell gömülü hibrit çipte bağırsakta bağırsak morfogenezini sağlam bir şekilde indüklemek için tekrarlanabilir bir protokol sağlıyoruz. Geleneksel ortamlarda ve ayrıca bir mikroakışkan platform, 3B morfogenezin indüksiyonu ve çoklu görüntüleme yöntemleri kullanılarak oluşturulmuş 3B epitelinin karakterizasyonu. Bu protokol, bazolateral sıvı akışını 5 gün boyunca kontrol ederek işlevsel bağırsak mikro mimarisinin yenilenmesini sağlar. İn vitro morfogenez yöntemimiz fizyolojik olarak ilgili kayma gerilimi ve mekanik hareket kullanır ve karmaşık hücre mühendisliği veya manipülasyonu gerektirmez; bu da diğer mevcut tekniklerden daha iyi performans gösterebilir. Önerdiğimiz protokolümüzün biyomedikal araştırma topluluğu için geniş kapsamlı etkileri olabileceğini ve biyomedikal, klinik ve farmasötik uygulamalar için in vitro 3B bağırsak epitel katmanlarını yenilemek için bir yöntem sağlayabileceğini öngörüyoruz.
Deneyler, bağırsakta çip1,2,3,4,5 veya çift katmanlı mikroakışkan aygıtlarda6,7 kültüre edilen bağırsak epitel Caco-2 hücrelerinin, altta yatan mekanizmanın net bir şekilde anlaşılması olmaksızın in vitro kendiliğinden 3B morfogeneze uğrayabileceğini göstermektedir. Son çalışmamızda, kültür aygıtlarından bazolateral olarak salgılanan morfogen antagonistlerinin uzaklaştırılmasının, in vitro 3B epitel morfogenezi başlatmak için gerekli ve yeterli olduğunu bulduk; bu, Caco-2 ve hasta kaynaklı bağırsak organoidleri ile gösterilmiştir. Epitel hücreleri doğrulandı. Bu çalışmada, özellikle bağırsakta çip üzerinde ve "Hibrit Çip" olarak adlandırılan Transwell ekleri içeren modifiye edilmiş mikroakışkan cihazlarda güçlü bir Wnt antagonisti olan Dickkopf-1'in (DKK-1) hücre üretimi ve konsantrasyon dağılımına odaklandık. Çip üzerindeki bağırsağa ekzojen Wnt antagonistlerinin (DKK-1, Wnt baskılayıcı 1, salgılanan kıvırcık ilişkili protein 1 veya Soggy-1 gibi) eklenmesinin morfogenezi engellediğini veya önceden yapılandırılmış 3B epitel tabakasını bozduğunu gösterdik; bu da kültür sırasında antagonistik stresin in vitro bağırsak morfogenezinden sorumlu olduğunu düşündürmektedir. Bu nedenle, epitel arayüzünde sağlam bir morfogeneze ulaşmak için pratik bir yaklaşım, bazolateral bölmedeki Wnt antagonistlerinin seviyelerini aktif yıkama (örneğin, bağırsakta çip üzerinde veya hibrit çip platformlarında) veya difüzyonla ortadan kaldırmak veya asgari düzeyde tutmaktır. Bazolateral ortam (örneğin, kuyulardaki büyük bazolateral rezervuarlara Transwell ek parçalarından).
Bu protokolde, bağırsak epitel hücrelerini polidimetilsiloksan (PDMS) bazlı gözenekli membranlar (adımlar 6A, 7A, 8, 9) veya Transwell eklerinin polyester membranları (adımlar 6B, 7B, 8, 9) üzerinde kültürlemek ve in vitro 3B morfogenezi indüklemek için bağırsak-çip mikrocihazları ve Transwell-yerleştirilebilir hibrit çipler (adımlar 1-5) üretmek için ayrıntılı bir yöntem sunuyoruz (adım 10). Ayrıca, birden fazla görüntüleme modalitesi uygulayarak (adımlar 11-24) dokuya özgü histogenezi ve soy-bağımlı hücresel farklılaşmayı gösteren hücresel ve moleküler özellikleri belirledik. Gözenekli membranların yüzey modifikasyonu, 2B monokatmanların oluşturulması ve bağırsak biyokimyasal ve biyomekanik mikroçevrenin yeniden üretilmesi gibi teknik ayrıntılarla Caco-2 veya bağırsak organoidleri gibi insan bağırsak epitel hücrelerini kullanarak morfogenezi indüklüyoruz. vitro. 2D epitel monokatmanlarından 3D morfogenezi başlatmak için, ortamı kültürün bazolateral bölmesine akıtarak her iki kültür formundaki morfogen antagonistlerini uzaklaştırdık. Son olarak, morfogen bağımlı epitel büyümesini, uzunlamasına konak-mikrobiyom ortak kültürlerini, patojen enfeksiyonunu, inflamatuar hasarı, epitel bariyer disfonksiyonunu ve probiyotik bazlı terapileri modellemek için kullanılabilen yenilenebilir bir 3D epitel tabakasının faydasına dair bir sunum sağlıyoruz. Örnek.etkiler.
Protokolümüz temel (örneğin bağırsak mukozal biyolojisi, kök hücre biyolojisi ve gelişim biyolojisi) ve uygulamalı araştırma (örneğin klinik öncesi ilaç testi, hastalık modelleme, doku mühendisliği ve gastroenteroloji) alanlarında geniş bir yelpazedeki bilim insanları için yararlı olabilir. Protokolümüzün bağırsak epitelinin in vitro 3B morfogenezini indüklemedeki tekrarlanabilirliği ve sağlamlığı nedeniyle, teknik stratejimizin bağırsak gelişimi, rejenerasyonu veya homeostaz sırasında hücre sinyallemesinin dinamiklerini inceleyen kitlelere yayılabileceğini öngörüyoruz. Ek olarak, protokolümüz Norovirüs 8, Şiddetli Akut Solunum Yolu Sendromu Koronavirüs 2 (SARS-CoV-2), Clostridium difficile, Salmonella Typhimurium 9 veya Vibrio cholerae gibi çeşitli enfeksiyöz ajanlar altında enfeksiyonu sorgulamak için yararlıdır. Hastalık patolojisi ve patogenezine yönelik izleyiciler de faydalıdır. Çip üstü bağırsak mikrofizyoloji sisteminin kullanımı, uzunlamasına eş kültür 10 ve ardından gastrointestinal (GI) sistemde konak savunması, bağışıklık tepkileri ve patojenle ilişkili yaralanma onarımının değerlendirilmesine olanak tanıyabilir 11. Sızdıran bağırsak sendromu, çölyak hastalığı, Crohn hastalığı, ülseratif kolit, kesecik iltihabı veya irritabl bağırsak sendromu ile ilişkili diğer GI bozuklukları, hastanın 3B bağırsak epitel katmanları kullanılarak 3B bağırsak epitel katmanları hazırlandığında simüle edilebilir; bu hastalıklar arasında villöz atrofi, kript kısalması, mukozal hasar veya bozulmuş epitel bariyeri bulunur. Biyopsi veya kök hücreden türetilen bağırsak organoidleri 12,13. Hastalık ortamının daha yüksek karmaşıklığını daha iyi modellemek için okuyucular, 3B bağırsak villus-kript mikromimarilerini içeren modellere hasta periferik kan mononükleer hücreleri (PBMC'ler) gibi hastalıkla ilgili hücre tiplerini eklemeyi düşünebilirler. dokuya özgü bağışıklık hücreleri, 5.
3D epitel mikro yapısı kesit alma işlemi olmadan sabitlenebildiği ve görselleştirilebildiği için, uzaysal transkriptomik ve yüksek çözünürlüklü veya süper çözünürlüklü görüntüleme üzerinde çalışan izleyiciler, epitel nişlerindeki genlerin ve proteinlerin uzaysal ve zamansal dinamiklerinin haritalanmasıyla ilgilenebilir. Teknolojiyle ilgileniyor. Mikrobiyal veya bağışıklık uyaranlarına yanıt. Dahası, bağırsak homeostazını koordine eden uzunlamasına konak-mikrobiyom çapraz konuşması 10, 14, özellikle çip üzerindeki bağırsakta çeşitli mikrobiyal türlerin, mikrobiyal toplulukların veya fekal mikrobiyotanın birlikte kültürlenmesiyle 3D bağırsak mukozal tabakasında oluşturulabilir. platformda. Bu yaklaşım, daha önce kültürlenmemiş bağırsak mikrobiyotasını laboratuvarda yetiştirmeyi amaçlayan mukozal immünoloji, gastroenteroloji, insan mikrobiyomu, kültüromik ve klinik mikrobiyoloji okuyan kitleler için özellikle çekicidir. İn vitro morfogenez protokolümüz, bazolateral bölmeleri sürekli olarak yenileyen 24, 96 veya 384 kuyulu plakalardaki çok kuyulu ekler gibi ölçeklenebilir kültür formatlarına uyarlanabilirse, protokol ayrıca gıda endüstrisi için farmasötik, biyomedikal veya yüksek verimli tarama veya doğrulama platformları geliştirenlere de yayılabilir. Bir ilke kanıtı olarak, yakın zamanda 24 kuyulu bir plaka formatına ölçeklenebilir çoklu yüksek verimli bir morfogenez sisteminin uygulanabilirliğini gösterdik. Ek olarak, birden fazla organ-on-a-chip ürünü ticarileştirildi16,17,18. Bu nedenle, in vitro morfogenez yöntemimizin doğrulaması hızlandırılabilir ve hücresel İlaç veya biyoterapötikleri test etmek için transkriptomik düzeyde in vitro bağırsak morfogenezinin yeniden programlanması İlaç adaylarının emilimi ve taşınması, bağırsak morfogenezi sürecinin tekrarlanabilirliğini değerlendirmek için 3 boyutlu bağırsak taşıyıcıları veya özel veya ticari organ-çip modelleri kullanılarak değerlendirildi.
İnsanla ilgili sınırlı sayıda deneysel model, esas olarak in vitro 3B morfogenezi indüklemek için uygulanabilir protokollerin eksikliğinden dolayı, intestinal epitel morfogenezi incelemek için kullanılmıştır. Aslında, bağırsak morfogenezi hakkındaki mevcut bilginin çoğu hayvan çalışmalarına dayanmaktadır (örneğin, zebra balığı20, fareler21 veya tavuklar22). Ancak, emek ve maliyet açısından yoğun, etik açıdan sorgulanabilir ve en önemlisi, insan gelişim süreçlerini kesin olarak belirlemezler. Bu modeller ayrıca çok yönlü ölçeklenebilir bir şekilde test edilme yetenekleri açısından da oldukça sınırlıdır. Bu nedenle, in vitro 3B doku yapılarını yenilemek için kullandığımız protokol, in vivo hayvan modellerinin yanı sıra diğer geleneksel statik 2B hücre kültürü modellerinden de daha iyi performans göstermektedir. Daha önce açıklandığı gibi, 3B epitel yapıların kullanılması, çeşitli mukozal veya bağışıklık uyaranlarına yanıt olarak kript-villus eksenindeki farklılaşmış hücrelerin mekansal lokalizasyonunu incelememize olanak tanıdı. 3B epitel katmanları, mikrobiyal hücrelerin konak faktörlerine (örneğin, iç ve dış mukus katmanları, IgA ve antimikrobiyal peptitlerin salgılanması) yanıt olarak mekansal nişler ve ekolojik evrim oluşturmak için rekabet ederler. Dahası, 3B epitel morfolojisi, bağırsak mikrobiyotasının topluluklarını nasıl yapılandırdığını ve bazal kriptlerde hücresel organizasyonu ve kök hücre nişlerini şekillendiren mikrobiyal metabolitleri (örneğin, kısa zincirli yağ asitleri) nasıl sinerjik olarak ürettiğini anlamamızı sağlayabilir. Bu özellikler yalnızca 3B epitel katmanları in vitro oluşturulduğunda gösterilebilir.
3B bağırsak epitel yapıları oluşturma yöntemimize ek olarak, birkaç in vitro yöntem daha vardır. Bağırsak organoid kültürü, belirli morfogen koşulları altında bağırsak kök hücrelerinin yetiştirilmesine dayanan son teknoloji bir doku mühendisliği tekniğidir23,24,25. Ancak, 3B organoid modellerinin taşıma analizi veya konak-mikrobiyom ortak kültürleri için kullanımı genellikle zordur, çünkü bağırsak lümeni organoidin içinde kapalıdır ve bu nedenle mikrobiyal hücreler veya ekzojen antijenler gibi lüminal bileşenlerin tanıtımı sınırlıdır. Organoid lümenlerine erişim, bir mikroenjektör kullanılarak iyileştirilebilir26,27 ancak bu yöntem invaziv ve emek yoğun olup, gerçekleştirmek için özel bilgi gerektirir. Dahası, statik koşullar altında hidrojel iskelelerinde tutulan geleneksel organoid kültürleri, aktif in vivo biyomekaniği doğru bir şekilde yansıtmaz.
Birkaç araştırma grubu tarafından kullanılan diğer yaklaşımlar, izole edilmiş insan bağırsak hücrelerini jel yüzeyinde kültüre ederek bağırsak epitel yapısını taklit etmek için önceden yapılandırılmış 3B hidrojel iskeleleri kullanır. 3B yazdırılmış, mikro frezelenmiş veya litografik olarak üretilmiş kalıplar kullanarak hidrojel iskeleleri oluşturun. Bu yöntem, fizyolojik olarak ilgili morfogen gradyanları ile izole edilmiş epitel hücrelerinin in vitro kendi kendini organize eden düzenlemesini gösterir, iskeleye stromal hücreleri dahil ederek yüksek en boy oranlı bir epitel yapısı ve stroma-epitelyal çapraz konuşması oluşturur. Bununla birlikte, önceden yapılandırılmış iskelelerin doğası, kendiliğinden oluşan morfogenetik sürecin kendisinin görüntülenmesini engelleyebilir. Bu modeller ayrıca, bağırsak hücrelerinin morfogeneze girmesi ve fizyolojik işlev kazanması için ihtiyaç duyduğu sıvı kayma geriliminden yoksun olduğundan dinamik lüminal veya interstisyel akış sağlamaz. Yakın zamanda yapılan başka bir çalışmada, mikroakışkan bir platformda hidrojel iskeleleri kullanılmış ve lazerle aşındırma teknikleri kullanılarak bağırsak epitel yapıları desenlenmiştir. Fare bağırsak organoidleri Kazınmış desenler bağırsak tübüler yapıları oluşturur ve lümen içi sıvı akışı bir mikroakışkan modülü kullanılarak tekrarlanabilir. Ancak, bu model ne kendiliğinden oluşan morfogenetik süreçleri sergiler ne de bağırsak mekanobiyolojik hareketlerini içerir. Aynı gruptan gelen 3B baskı teknikleri kendiliğinden oluşan morfogenetik süreçlere sahip minyatür bağırsak tüpleri oluşturabilmiştir. Tüp içindeki farklı bağırsak segmentlerinin karmaşık üretimine rağmen, bu modelde lümen sıvı akışı ve mekanik deformasyon da yoktur. Ek olarak, modelin işlerliği, özellikle biyobaskı süreci tamamlandıktan sonra sınırlı olabilir ve bu da deneysel koşulları veya hücre-hücre etkileşimlerini bozabilir. Bunun yerine, önerdiğimiz protokol kendiliğinden oluşan bağırsak morfogenezi, fizyolojik olarak ilgili kayma gerilimi, bağırsak hareketliliğini taklit eden biyomekanik, bağımsız apikal ve bazolateral bölmelere erişilebilirlik ve modülerliğin karmaşık biyolojik mikro ortamlarının yeniden yaratılmasını sağlar. Bu nedenle, in vitro 3B morfogenez protokolümüz mevcut yöntemlerin zorluklarının üstesinden gelmek için tamamlayıcı bir yaklaşım sağlayabilir.
Protokolümüz tamamen 3B epitel morfogenezine odaklanmıştır ve kültürde sadece epitel hücreleri vardır ve mezenkimal hücreler, endotel hücreleri ve bağışıklık hücreleri gibi çevreleyen diğer hücre tipleri yoktur. Daha önce açıklandığı gibi, protokolümüzün özü, tanıtılan ortamın bazolateral tarafında salgılanan morfogen inhibitörlerini çıkararak epitel morfogenezinin başlatılmasıdır. Çip üzerindeki bağırsağımızın ve çip üzerindeki hibritimizin sağlam modülerliği, dalgalı 3B epitel tabakasını yeniden oluşturmamıza izin verirken, epitel-mezenkimal etkileşimler33,34, hücre dışı Matriks (ECM) birikimi35 ve modelimizde bazal kriptlerde kök hücre nişlerini ileten kript-villus özellikleri gibi ek biyolojik karmaşıklıklar daha fazla dikkate alınmayı beklemektedir. Mezenşimdeki stromal hücreler (örneğin fibroblastlar), ECM proteinlerinin üretiminde ve bağırsak morfogenezinin düzenlenmesinde önemli bir rol oynar vivo35,37,38.Modelimize mezenkimal hücrelerin eklenmesi morfogenetik süreci ve hücre bağlanma verimliliğini artırdı. Endotel tabakası (yani kılcal damarlar veya lenfatikler) bağırsak mikroçevresinde moleküler taşımayı39 ve bağışıklık hücresi alımını40 düzenlemede önemli bir rol oynar. Dahası, doku modelleri arasında bağlanabilen damar bileşenleri, doku modelleri çoklu organ etkileşimlerini göstermek üzere tasarlandığında ön koşuldur. Bu nedenle, organ düzeyinde çözünürlükle daha doğru fizyolojik özellikleri modellemek için endotel hücrelerinin dahil edilmesi gerekebilir. Hastadan türetilen bağışıklık hücreleri ayrıca bağırsak hastalığını taklit etme bağlamında doğuştan gelen bağışıklık tepkilerini, antijen sunumunu, doğuştan gelen adaptif bağışıklık çapraz konuşmasını ve dokuya özgü bağışıklığı göstermek için de önemlidir.
Hibrit çiplerin kullanımı, bağırsak üstü çipten daha basittir çünkü cihaz kurulumu daha basittir ve Transwell eklerinin kullanımı bağırsak epitelinin ölçeklenebilir kültürüne izin verir. Bununla birlikte, polyester membranlı ticari olarak temin edilebilen Transwell ekleri elastik değildir ve peristaltik benzeri hareketleri simüle edemez. Dahası, hibrit çipe yerleştirilen Transwell ekinin apikal bölmesi, apikal tarafta kayma gerilimi olmadan sabit kalmıştır. Açıkça, apikal bölmedeki statik özellikler, hibrit çiplerde uzun vadeli bakteriyel ortak kültüre nadiren olanak tanır. Hibrit çipler kullanıldığında Transwell eklerinde 3B morfogenezi sağlam bir şekilde indükleyebilmemize rağmen, fizyolojik olarak ilgili biyomekanik ve apikal sıvı akışının eksikliği, hibrit çip platformlarının potansiyel uygulamalar için uygulanabilirliğini sınırlayabilir.
Bağırsakta çip ve hibrit çip kültürlerinde insan kript-villus ekseninin tam ölçekli yeniden yapılandırmaları henüz tam olarak oluşturulmamıştır. Morfogenez epitel tek tabakadan başladığından, 3B mikro mimariler in vivo kriptlere morfolojik benzerlik sağlamayabilir. Mikromühendislikli 3B epitelde bazal kript alanına yakın çoğalan hücre popülasyonunu karakterize etmemize rağmen, kript ve villöz bölgeler açıkça sınırlandırılmamıştır. Çip üzerindeki daha yüksek üst kanallar mikromühendislikli epitelin yüksekliğinin artmasına neden olsa da, maksimum yükseklik hala ~300-400 µm ile sınırlıdır. İnsan bağırsak kriptlerinin küçük ve büyük bağırsaklardaki gerçek derinliği sırasıyla ~135 µm ve ~400 µm'dir ve ince bağırsak villuslarının yüksekliği ~600 µm'dir41.
Görüntüleme açısından, 3 boyutlu mikro mimarilerin yerinde süper çözünürlüklü görüntülenmesi, çip üzerindeki bağırsakla sınırlı olabilir, çünkü objektif lensinden epitel tabakasına kadar gereken çalışma mesafesi birkaç milimetre mertebesindedir. Bu sorunu aşmak için uzak bir objektif gerekebilir. Ayrıca, PDMS'nin yüksek elastikiyeti nedeniyle görüntüleme örneği hazırlamak için ince kesitler yapmak zordur. Ayrıca, bir çip üzerinde bağırsağın katman katman mikrofabrikasyonu, her katman arasında kalıcı yapışma içerdiğinden, epitel tabakasının yüzey yapısını incelemek için üst katmanı açmak veya çıkarmak son derece zordur. Örneğin, taramalı elektron mikroskobu (SEM) kullanarak.
PDMS'nin hidrofobisitesi, hidrofobik küçük moleküllerle ilgilenen mikroakışkan temelli çalışmalarda sınırlayıcı bir faktör olmuştur, çünkü PDMS bu tür hidrofobik molekülleri nonspesifik olarak adsorbe edebilir. PDMS'ye alternatifler diğer polimerik malzemelerle düşünülebilir. Alternatif olarak, hidrofobik moleküllerin adsorpsiyonunu en aza indirmek için PDMS'nin yüzey modifikasyonu (örneğin lipofilik malzemelerle kaplama 42 veya poli(etilen glikol) 43 ) düşünülebilir.
Son olarak, yöntemimiz yüksek verimli tarama veya "tek beden herkese uyan" kullanıcı dostu deneysel bir platform sağlama açısından iyi karakterize edilmemiştir. Mevcut protokol, mikro cihaz başına bir şırınga pompası gerektirir; bu da bir CO2 inkübatöründe yer kaplar ve büyük ölçekli deneyleri engeller. Bu sınırlama, yenilikçi kültür formatlarının ölçeklenebilirliği ile önemli ölçüde iyileştirilebilir (örneğin, bazolateral ortamın sürekli olarak yenilenmesine ve çıkarılmasına izin veren 24 kuyulu, 96 kuyulu veya 384 kuyulu gözenekli ekler).
İnsan bağırsak epitelinin 3 boyutlu morfogenezini in vitro olarak başlatmak için, lümen-kılcal arayüz oluşturmak üzere iki paralel mikrokanal ve aralarında elastik gözenekli bir membran içeren bir mikroakışkan çip bağırsak cihazı kullandık. Ayrıca, Transwell ek parçaları üzerinde büyütülen polarize epitel tabakalarının altında sürekli bazolateral akış sağlayan tek kanallı bir mikroakışkan cihazın (bir hibrit çip) kullanımını da gösterdik. Her iki platformda da, çeşitli insan bağırsak epitel hücrelerinin morfogenezi, bazolateral bölmeden morfogen antagonistlerini uzaklaştırmak için akışın yönlü manipülasyonu uygulanarak gösterilebilir. Tüm deneysel prosedür (Şekil 1) beş bölümden oluşur: (i) bağırsak çipinin veya Transwell yerleştirilebilir hibrit çipin mikrofabrikasyonu (adımlar 1-5; Kutu 1), (ii) bağırsak epitel hücrelerinin (Caco-2 hücreleri) veya insan bağırsak organoidlerinin hazırlanması; kutular 2-5), (iii) bağırsak çipleri veya hibrit çipler üzerinde bağırsak epitel hücrelerinin kültürü (adımlar 6-9), (iv) in vitro 3B morfogenezisin indüklenmesi (adım 10) ve (v) ) 3B epitel mikro yapısını karakterize etmek (adımlar 11-24). Son olarak, epitel morfogenezi mekansal, zamansal, koşullu veya prosedürel kontrollerle karşılaştırarak in vitro morfogenezisin etkinliğini doğrulamak için uygun bir kontrol grubu (aşağıda daha ayrıntılı olarak ele alınacaktır) tasarlandı.
İki farklı kültür platformu kullandık: düz kanallı veya doğrusal olmayan kıvrımlı kanallı bağırsak-çip veya mikroakışkan bir cihazda Transwell (TW) ekleri içeren hibrit çipler, Kutu 1'de açıklandığı gibi üretildi ve adım 1-5. "Cihaz Üretimi", tek bir çip veya hibrit çip üretmenin ana adımlarını göstermektedir. "İnsan Bağırsak Epitel Hücrelerinin Kültürü", bu protokolde kullanılan hücre kaynağını (Caco-2 veya insan bağırsak organoidleri) ve kültür prosedürünü açıklamaktadır. "In vitro morfogenez", Caco-2 veya organoid türevi epitel hücrelerinin bir bağırsak çipi veya bir hibrit çipin Transwell ekleri üzerinde kültürlendiği, ardından 3B morfogenezin indüklendiği ve karakterize edilmiş bir epitel yapının oluşturulduğu genel adımları göstermektedir. Program adım numarası veya kutu numarası her okun altında gösterilir. Uygulama, oluşturulmuş bağırsak epitel katmanlarının nasıl kullanılabileceğine dair örnekler sağlar, örneğin hücre farklılaşma karakterizasyonunda, bağırsak fizyolojisi çalışmalarında, konak-mikrobiyom ekosistemleri ve hastalık modellemesi. “Hücre Farklılaşması”ndaki immünofloresan görüntüleri, bağırsak çipinde üretilen 3D Caco-2 epitel tabakasında ifade edilen çekirdekleri, F-aktini ve MUC2'yi göstermektedir. MUC2 sinyali, goblet hücrelerinde ve mukozal yüzeylerden salgılanan mukus içinde mevcuttur. Bağırsak Fizyolojisi'ndeki floresan görüntüler, floresan buğday tohumu aglutinini kullanılarak siyalik asit ve N-asetilglukozamin kalıntıları için boyama ile üretilen mukusu göstermektedir. “Konuk-Mikrop Eş-Kültürleri”ndeki iki örtüşen görüntü, bir çip üzerinde bağırsaktaki temsili konak-mikrobiyom eş-kültürlerini göstermektedir. Sol panel, mikromühendislikli 3D Caco-2 epitel hücreleri ile yeşil floresan proteini (GFP) ifade eden E. coli'nin eş-kültürünü göstermektedir. Sağ panel, 3D Caco-2 epitel hücreleri ile birlikte kültürlenen GFP E. coli'nin lokalizasyonunu ve ardından F-aktin (kırmızı) ve çekirdekler (mavi) ile immünofloresan boyama ile.Hastalık modellemesi, bakteriyel antijenler (örn. lipopolisakkarit, LPS) ve bağışıklık hücreleri (örn. PBMC; yeşil) ile fizyolojik mücadele altında bağırsak iltihabı çiplerinde sağlıklı ve sızdıran bağırsağı göstermektedir.Caco-2 hücreleri, 3 boyutlu bir epitel tabakası oluşturmak için kültürlendi.Ölçek çubuğu, 50 µm.Alt sıradaki resimler: “Hücrelerin farklılaşması” referans 2'den izin alınarak uyarlanmıştır. Oxford University Press; Ref.5'ten izin alınarak yeniden üretilmiştir. NAS; “Host-Mikrop Ortak Kültürü” referans 3'ten izin alınarak uyarlanmıştır. NAS; “Hastalık Modellemesi” referans 5'ten izin alınarak uyarlanmıştır. NAS.
Hem bağırsak-çip hem de hibrit çipler, yumuşak litografi1,44 ile silikon kalıplardan kalıptan çıkarılan ve SU-8 ile desenlendirilen PDMS replikaları kullanılarak üretildi. Her çipteki mikrokanalların tasarımı, kayma gerilimi ve hidrodinamik basınç1,4,12 gibi hidrodinamikler dikkate alınarak belirlenir. İki yan yana paralel düz mikrokanaldan oluşan orijinal bağırsak-çip tasarımı (Genişletilmiş Veri Şekil 1a), kültürlenmiş hücrelerin artan sıvı kalma süresi, doğrusal olmayan akış desenleri ve çok eksenli deformasyonunu indüklemek için bir çift eğimli mikrokanal içeren karmaşık bir bağırsak-çip'e (Genişletilmiş Veri Şekil 1b) dönüştü (Şekil 2a–f) 12. Daha karmaşık bağırsak biyomekaniğinin yeniden yaratılması gerektiğinde, karmaşık bağırsak-çipler seçilebilir. Kıvrımlı Bağırsak-Çip'in benzer bir zaman diliminde benzer bir derecede 3B morfogenezi de güçlü bir şekilde indüklediğini gösterdik Orijinal Gut-Chip ile karşılaştırıldığında epitelyal büyüme, kültürlenmiş hücre tipinden bağımsızdır. Bu nedenle, 3 boyutlu morfogenezi başlatmak için, doğrusal ve karmaşık çip üstü bağırsak tasarımları birbirinin yerine kullanılabilir. SU-8 desenlerine sahip silikon kalıplar üzerinde kürlenen PDMS replikaları, kalıptan çıkarıldıktan sonra negatif özellikler sağladı (Şekil 2a). Çip üzerinde bağırsak üretmek için, hazırlanan üst PDMS tabakası gözenekli bir PDMS filmine sırayla bağlandı ve daha sonra bir korona işlemcisi kullanılarak geri döndürülemez bağlama yoluyla alt PDMS tabakasıyla hizalandı (Şekil 2b–f). Hibrit çipler üretmek için, kürlenen PDMS replikaları, Transwell eklerini barındırabilen tek kanallı mikroakışkan cihazlar oluşturmak için cam slaytlara bağlandı (Şekil 2h ve Genişletilmiş Veri Şekil 2). Bağlama işlemi, PDMS replikasının ve camın yüzeylerinin oksijen plazması veya korona işlemi ile işlenmesiyle gerçekleştirilir. Silikon tüpe bağlanan mikrofabrike cihazın sterilizasyonundan sonra, cihaz kurulumu çalışmaya hazırdı Bağırsak epitelinin 3 boyutlu morfogenezi (Şekil 2g).
a, SU-8 desenli silikon kalıplardan PDMS parçalarının hazırlanmasının şematik gösterimi. Sertleştirilmemiş PDMS çözeltisi bir silikon kalıba döküldü (sol), 60 °C'de sertleştirildi (orta) ve kalıptan çıkarıldı (sağ). Kalıptan çıkarılan PDMS parçalara kesildi ve daha sonraki kullanım için temizlendi. b, PDMS üst katmanını hazırlamak için kullanılan silikon kalıbın fotoğrafı. c, PDMS gözenekli membranı üretmek için kullanılan silikon kalıbın fotoğrafı. d, Üst ve alt PDMS bileşenlerinin ve birleştirilmiş çip üstü bağırsak cihazının bir dizi fotoğrafı. e, Üst, membran ve alt PDMS bileşenlerinin hizalanmasının şeması. Her katman plazma veya korona işlemiyle geri döndürülemez şekilde bağlanmıştır. f, Üst üste bindirilmiş kıvrımlı mikrokanallar ve vakum odalarına sahip üretilmiş bağırsak-çip cihazının şeması. g, Mikroakışkan hücre kültürü için bağırsak-çip kurulumu. Silikon tüp ve şırınga ile birleştirilmiş üretilmiş bağırsak, bir çip üzerine yerleştirildi bir lamel. Çip cihazı, işleme tabi tutulmak üzere 150 mm'lik bir Petri kabının kapağına yerleştirildi. Bağlayıcı, silikon tüpü kapatmak için kullanılır. h, Hibrit çip üretiminin ve hibrit çipler kullanılarak 3B morfogenezin görsel anlık görüntüleri. Bağırsak epitel hücrelerinin 2B monokatmanlarını kültürlemek için bağımsız olarak hazırlanan Transwell ekleri, bağırsak 3B morfogenezisini indüklemek için hibrit çipe yerleştirildi. Ortam, Transwell ek parçası üzerinde oluşturulan hücre tabakasının altındaki mikrokanallar aracılığıyla perfüze edilir. Ölçek çubuğu, 1 cm. h Referanstan izin alınarak yeniden basılmıştır. 4. Elsevier.
Bu protokolde, Caco-2 hücre hattı ve bağırsak organoidleri epitel kaynakları olarak kullanıldı (Şekil 3a). Her iki hücre tipi de bağımsız olarak kültürlendi (Kutu 2 ve Kutu 5) ve çip üstü bağırsak veya Transwell eklerinin ECM kaplı mikrokanallarına tohum ekmede kullanıldı. Hücreler birleşik olduğunda (şişelerde >%95 kapsama), rutin olarak T şişelerinde kültürlenen Caco-2 hücreleri (10 ve 50 arasındaki pasajlar) tripsinizasyon sıvısıyla ayrıştırılmış hücre süspansiyonları hazırlamak için hasat edildi (kutu 2). Bağırsak biyopsilerinden veya cerrahi rezeksiyonlardan elde edilen insan bağırsak organoidleri, yapısal mikroçevreyi desteklemek için 24 kuyulu plakalarda Matrigel iskele kubbelerinde kültürlendi. Kutu 3'te açıklandığı gibi hazırlanan temel morfogenleri (Wnt, R-spondin ve Noggin gibi) ve büyüme faktörlerini içeren ortam, organoidler ~500'e büyüyene kadar her iki günde bir takviye edildi Çapı µm'dir. Tamamen büyümüş organoidler hasat edilir ve bağırsaklara veya çip üzerindeki Transwell eklerine ekilmek üzere tek hücrelere ayrıştırılır (Kutu 5). Daha önce bildirdiğimiz gibi, hastalık tipine12,13 (örn. ülseratif kolit, Crohn hastalığı, kolorektal kanser veya normal donör), lezyon bölgesine (örn. lezyonlu veya lezyonsuz alan) ve sistemdeki gastrointestinal konuma (örn. duodenum, jejunum, ileum, çekum, kolon veya rektum) göre farklılaştırılabilir. Kutu 5'te, genellikle ince bağırsak organoidlerinden daha yüksek konsantrasyonlarda morfogen gerektiren kolon organoidlerinin (koloidler) kültürü için optimize edilmiş bir protokol sunuyoruz.
a, Bağırsak çipinde bağırsak morfogenezi indüksiyonu için iş akışı. Bu protokolde 3B morfogenezi göstermek için Caco-2 insan bağırsak epiteli ve bağırsak organoidleri kullanılır. İzole edilmiş epitel hücreleri hazırlanmış bağırsak-çip cihazına ekildi (çip hazırlama). Hücreler ekildikten (ekildikten) ve PDMS gözenekli membrana bağlandıktan (tutturulduktan) sonra 0. günde (D0), apikal (AP) akış başlatılır ve ilk 2 gün boyunca sürdürülür (akış, AP, D0-D2). Tam bir 2B monokatman oluştuğunda bazolateral (BL) akış da döngüsel germe hareketleriyle (germe, akış, AP ve BL) birlikte başlatılır. Bağırsak 3B morfogenezi, mikroakışkan kültüründen 5 gün sonra kendiliğinden meydana geldi (morfogenez, D5). Faz kontrast görüntüleri, her deneysel adımda veya zaman noktasında Caco-2 hücrelerinin temsili morfolojisini gösterir (çubuk grafik, 100 µm). Bağırsak morfogenezinin karşılık gelen basamaklarını gösteren dört şematik diyagram (sağ üst). Şemada kesikli oklar sıvı akışının yönünü temsil eder.b, Yerleşik 3B Caco-2 epitelinin yüzey topolojisini gösteren SEM görüntüsü (sol). Büyütülmüş alanı vurgulayan ek parça (beyaz kesikli kutu), 3B Caco-2 tabakasındaki (sağ) yenilenen mikrovillusları gösterir.c, Yerleşik Caco-2 3B, klaudin (ZO-1, kırmızı) ve F-aktin (yeşil) ve çekirdekler (mavi) olarak etiketlenen sürekli fırça kenarlı zarların yatay önden görünümü. Bağırsak çipleri üzerindeki epitel hücrelerinin immünofloresan konfokal görselleştirilmesi. Ortadaki şemayı işaret eden oklar, her bir konfokal görünüm için odak düzleminin yerini gösterir.d, Faz kontrast mikroskobu ile elde edilen bir çip üzerinde kültüre edilen organoidlerdeki morfolojik değişikliklerin zaman seyri, 3., 7., 9., 11. ve 13.Ekteki resim (sağ üstte) verilen görüntünün yüksek büyütmesini göstermektedir.e, 7. günde alınan dilimde bağırsakta oluşturulan organoid 3B epitelinin DIC fotomikrografisi.f, sırasıyla 3 gün boyunca bağırsak çipleri üzerinde büyütülen kök hücreler (LGR5; macenta), goblet hücreleri (MUC2; yeşil), F-aktin (gri) ve çekirdekler (camgöbeği) için belirteçleri gösteren üst üste bindirilmiş immünofloresan görüntüleri (Sol) ve epitel tabakasındaki 13 günlük (orta) organoidler.Ayrıca, MUC2 sinyali olmadan LGR5 sinyalini vurgulayan Genişletilmiş Veri Şekil 3'e bakın.Kültürün 13. gününde plazma membranının CellMask boyası ile boyanmasıyla bir çip üzerinde bağırsakta oluşturulan 3B organoid epitelinin epitel mikro yapısını (sağ) gösteren floresan görüntüleri (sağ).Aksi belirtilmediği takdirde ölçek çubuğu 50 μm'dir.b Referanstan izin alınarak yeniden basılmıştır.2. Oxford University Press; c Reference.2'den izin alınarak uyarlanmıştır. Oxford University Press; e ve f referans alınarak izin alınarak uyarlanmıştır.12 Creative Commons Lisansı CC BY 4.0 kapsamındadır.
Çip üzerindeki bağırsakta, başarılı ECM kaplaması için PDMS gözenekli membranın hidrofobik yüzeyini değiştirmek gerekir. Bu protokolde, PDMS membranlarının hidrofobisitesini değiştirmek için iki farklı yöntem uyguluyoruz. Caco-2 hücrelerinin kültürü için, yalnızca UV/ozon işlemiyle yüzey aktivasyonu, PDMS yüzeyinin hidrofobisitesini azaltmak, ECM'yi kaplamak ve Caco-2 hücrelerini PDMS membranına bağlamak için yeterliydi. Bununla birlikte, organoid epitelinin mikroakışkan kültürü, polietilenimin (PEI) ve glutaraldehitin PDMS mikrokanallarına sırayla uygulanmasıyla ECM proteinlerinin verimli bir şekilde biriktirilmesini sağlamak için kimyasal bazlı yüzey fonksiyonelleştirmesi gerektirir. Yüzey modifikasyonundan sonra, ECM proteinleri fonksiyonelleştirilmiş PDMS yüzeyini kaplamak için biriktirildi ve ardından izole edilmiş organoid epitele sokuldu. Hücreler bağlandıktan sonra, mikroakışkan hücre kültürü, hücreler tam bir tek tabaka oluşturana kadar yalnızca ortamı üst mikrokanala geçirerek başlar, alt mikrokanal ise Statik koşulları korur. Yüzey aktivasyonu ve ECM kaplaması için optimize edilmiş bu yöntem, organoid epitelinin bağlanarak PDMS yüzeyinde 3 boyutlu morfogenezi indüklemesini sağlar.
Transwell kültürleri hücre ekiminden önce ECM kaplaması da gerektirir; ancak, Transwell kültürleri gözenekli eklerin yüzeyini aktive etmek için karmaşık ön işlem adımları gerektirmez. Caco-2 hücrelerinin Transwell ekleri üzerinde yetiştirilmesi için, gözenekli eklere ECM kaplaması ayrışmış Caco-2 hücrelerinin bağlanmasını (<1 saat) ve sıkı bağlantı bariyeri oluşumunu (<1-2 gün) hızlandırır. Organoidleri Transwell ekleri üzerinde kültürlemek için, izole edilmiş organoidler ECM kaplı eklere ekilir, membran yüzeyine bağlanır (<3 saat) ve organoidler bariyer bütünlüğüne sahip tam bir monokatman oluşturana kadar tutulur. Transwell kültürleri hibrit çipler kullanılmadan 24 kuyulu plakalarda gerçekleştirilir.
In vitro 3D morfogenezis, yerleşik bir epitel tabakasının bazolateral yönüne sıvı akışı uygulanarak başlatılabilir. Çip üzerindeki bağırsakta, epitel morfogenezis, ortam üst ve alt mikrokanallara perfüze edildiğinde başladı (Şekil 3a). Daha önce açıklandığı gibi, yönlendirilmiş salgılanan morfojen inhibitörlerinin sürekli olarak uzaklaştırılması için inferior (bazolateral) bölmeye sıvı akışı getirilmesi kritik öneme sahiptir. Gözenekli zarlara bağlı hücrelere yeterli besin ve serum sağlamak ve lüminal kayma gerilimi oluşturmak için, genellikle çip üzerindeki bağırsakta çift akış uygularız. Hibrit çiplerde, epitel monokatmanları içeren Transwell ekleri hibrit çiplere yerleştirildi. Ardından, ortam mikrokanal aracılığıyla gözenekli Transwell ekinin bazolateral tarafının altına uygulandı. Bağırsak morfogenezi, her iki kültür platformunda da bazolateral akışın başlatılmasından 3-5 gün sonra meydana geldi.
Mikromühendislikli 3B epitel katmanlarının morfolojik özellikleri, faz kontrast mikroskopisi, diferansiyel interferans kontrast (DIC) mikroskopisi, SEM veya immünofloresan konfokal mikroskopisi dahil olmak üzere çeşitli görüntüleme yöntemleri uygulanarak analiz edilebilir (Şekil 3 ve 4).Faz kontrastı veya DIC görüntüleme, 3B epitel katmanlarının şeklini ve çıkıntısını izlemek için kültür sırasında herhangi bir zamanda kolayca gerçekleştirilebilir. PDMS ve polyester filmlerin optik şeffaflığı nedeniyle, hem bağırsak-çip hem de hibrit çip platformları, cihazın kesilmesine veya sökülmesine gerek kalmadan gerçek zamanlı yerinde görüntüleme sağlayabilir. İmmünofloresan görüntüleme gerçekleştirirken (Şekil 1, 3c, f ve 4b, c), hücreler genellikle %4 (ağırlık/hacim) paraformaldehit (PFA) ile sabitlenir, ardından sırasıyla Triton X-100 ve %2 (ağırlık/hacim) sığır serum albümini (BSA) gelir.Hücreye bağlı olarak tip, farklı fiksatifler, geçirgenleştiriciler ve bloke edici ajanlar kullanılabilir. Soy-bağımlı hücre veya bölge belirteçlerini hedefleyen birincil antikorlar, çip üzerinde yerinde immobilize edilmiş hücreleri vurgulamak için kullanılır, ardından çekirdeği (örneğin, 4',6-diamidino-2-fenilen) indol, DAPI) veya F-aktini (örneğin, floresanla işaretlenmiş faloidin) hedefleyen bir karşıt boya ile birlikte ikincil antikorlar kullanılır. Floresan tabanlı canlı görüntüleme, mukus üretimini (Şekil 1, “Hücre farklılaşması” ve “Bağırsak fizyolojisi”), mikrobiyal hücrelerin rastgele kolonizasyonunu (Şekil 1, “Konak-mikrop ortak kültürü”), bağışıklık hücrelerinin toplanmasını (Şekil 1, 'Hastalık Modelleme') veya 3B epitel morfolojisinin konturlarını (Şekil 3c,f ve 4b,c) tespit etmek için yerinde de gerçekleştirilebilir. Üst tabakayı ref'de açıklandığı gibi alt mikrokanal tabakası. Şekil 2'de gösterildiği gibi, apikal fırça sınırındaki 3B epitel morfolojisi ve mikrovilluslar SEM ile görselleştirilebilir (Şekil 3b). Farklılaşma belirteçlerinin ifadesi, kantitatif PCR5 veya tek hücreli RNA dizilemesi yapılarak değerlendirilebilir. Bu durumda, bağırsak çiplerinde veya hibrit çiplerde yetiştirilen epitel hücrelerinin 3B katmanları tripsinizasyonla hasat edilir ve daha sonra moleküler veya genetik analiz için kullanılır.
a, Hibrit bir çipte intestinal morfogenezisin indüklenmesi için iş akışı. Caco-2 ve intestinal organoidler, bu protokolde hibrit çip platformunda 3B morfogenezi göstermek için kullanılır. Ayrışmış epitel hücreleri hazırlanmış Transwell eklerine ekildi (TW hazırlığı; aşağıdaki şekle bakın). Hücreler ekildikten (ekildikten) ve Transwell eklerindeki polyester membranlara bağlandıktan sonra, tüm hücreler statik koşullar altında kültürlendi (TW kültürü). 7 gün sonra, epitel hücrelerinin 2B tek katmanını içeren tek bir Transwell eki, bir bazolateral akış (Flow, BL) oluşturmak için bir hibrit çipe entegre edildi ve bu da nihayetinde bir 3B epitel katmanının (morfogenez) oluşumuna yol açtı. Faz kontrast mikrografları, her deneysel adımda veya zaman noktasında normal donörden (C103 hattı) türetilen insan organ epitel hücrelerinin morfolojik özelliklerini gösteriyor. Üst katmanlardaki şemalar, her adım için deneysel yapılandırmayı göstermektedir. b, Hibrit çipler (sol Şematik) farklı Z pozisyonlarında (üst, orta ve alt; sağdaki şematik ve karşılık gelen noktalı çizgilere bakınız) alınan yukarıdan aşağıya konfokal mikroskopi görünümleriyle organoid epitel hücrelerinin 3B morfogenezine yol açabilir. belirgin morfolojik özellikler göstermiştir. F-aktin (camgöbeği), çekirdek (gri).c, Statik Transwell'de (TW; beyaz kesikli kutu içine eklenmiş) kültüre alınan organoid türevi epitel hücrelerinin floresan konfokal mikrografları (3B açılı görünüm) ve hibrit çip (en büyük tam çekim) sırasıyla 2B ile 3B morfolojiyi karşılaştırmaktadır. Bir çift 2B dikey çapraz kesim görünümü (sağ üst köşeye eklenmiş; “XZ”) de 2B ve 3B özelliklerini göstermektedir. Ölçek çubuğu, 100 µm.c Referanstan izin alınarak yeniden basılmıştır.4. Elsevier.
Kontroller, aynı hücrelerin (Caco-2 veya bağırsak organoid epitel hücreleri) geleneksel statik kültür koşulları altında iki boyutlu monokatmanlara kültürlenmesiyle hazırlanabilir. Özellikle, mikrokanalların sınırlı hacim kapasitesi nedeniyle (yani orijinal bağırsak çipi tasarımında üst kanalda ~4 µL) besin tükenmesi meydana gelebilir. Bu nedenle, bazolateral akım uygulanmadan önce ve sonra epitel morfolojisi de karşılaştırılabilir.
Yumuşak litografi işlemi temiz odada gerçekleştirilmelidir. Çip üzerindeki her katman (üst ve alt katmanlar ve membranlar) ve hibrit çipler için, mikrokanalların yükseklikleri farklı olduğu için farklı fotomaskeler kullanılmış ve ayrı silikon wafer'lar üzerinde üretilmiştir. Çip üzerindeki bağırsağın üst ve alt mikrokanallarının hedef yükseklikleri sırasıyla 500 µm ve 200 µm'dir. Hibrit çipin kanal hedef yüksekliği 200 µm'dir.
Asetonlu bir tabağa 3 inçlik bir silikon plaka yerleştirin. Plakayı 30 saniye boyunca yavaşça döndürün, ardından plakayı hava ile kurutun. Plakayı IPA içeren bir tabağa aktarın, ardından temizlemek için plakayı 30 saniye döndürün.
İsteğe bağlı olarak, silikon gofret yüzeyinden organik kalıntıların maksimum düzeyde uzaklaştırılması için bir piranha çözeltisi (hidrojen peroksit ve konsantre sülfürik asit karışımı, 1:3 (hacim/hacim)) kullanılabilir.
Piranha çözeltisi son derece aşındırıcıdır ve ısı üretir. Ek güvenlik önlemleri gereklidir. Atık bertarafı için çözeltinin soğumasını bekleyin ve temiz, kuru bir atık konteynerine aktarın. İkincil konteynerler kullanın ve atık konteynerlerini uygun şekilde etiketleyin. Daha ayrıntılı prosedürler için lütfen tesisin güvenlik yönergelerini izleyin.
Gofretleri 200 °C'lik sıcak bir plaka üzerinde 10 dakika tutarak kurutun. Kurutulduktan sonra, gofret soğuması için beş kez havada çalkalandı.
Temizlenmiş silikon plakanın ortasına ~10 gr fotorezist SU-8 2100 dökün. Fotorezisti plaka üzerinde eşit şekilde yaymak için cımbız kullanın. Fotorezistin daha az yapışkan olması ve yayılmasının kolay olması için plakayı ara sıra 65°C'lik sıcak bir plakaya yerleştirin. Plakayı doğrudan sıcak plakanın üzerine koymayın.
SU-8, spin kaplama çalıştırılarak gofret üzerine eşit şekilde dağıtıldı. SU-8'in gelen dönüşünü 5-10 saniye boyunca 100 rpm/sn'lik bir ivmeyle 500 rpm'de yayılacak şekilde programlayın. Ana dönüşü 1.500 rpm'de 200 µm kalınlık desenine ayarlayın veya 300 rpm/sn'lik bir ivmeyle 1.200 rpm'de 30 saniye boyunca 250 µm kalınlığa ulaşın (çip üzerindeki bağırsağın üst tabakası için 500 µm yükseklik yapın; aşağıdaki "Kritik adımlar" bölümüne bakın).
Ana sıkma hızı, silikon wafer üzerindeki SU-8 deseninin hedef kalınlığına göre ayarlanabilmektedir.
Çip üzerindeki bağırsağın üst tabakası için 500 µm yüksekliğinde SU-8 desenleri üretmek için, bu Kutunun döndürme kaplama ve yumuşak pişirme adımları (adım 7 ve 8) sırayla tekrarlanarak (adım 9'a bakın) 250 µm kalınlığında iki SU-8 tabakası üretildi. Bu kutunun 12. adımında UV ışığına maruz bırakılarak katmanlaştırılıp birleştirilebilen bu katman, 500 µm yüksekliğinde bir katman oluşturuyor.
SU-8 kaplı gofretleri dikkatlice 65 °C'de sıcak bir plaka üzerine yerleştirerek 5 dakika yumuşak bir şekilde pişirin, ardından ayarı 95 °C'ye getirin ve 40 dakika daha inkübe edin.
Üst mikrokanalda SU-8 deseninin 500 μm yüksekliğe ulaşması için, 250 μm kalınlığında iki SU-8 katmanı oluşturmak üzere 7. ve 8. adımları tekrarlayın.
UV Maskesi Hizalayıcıyı kullanarak, plakanın maruz kalma süresini hesaplamak için üreticinin talimatlarına göre bir lamba testi gerçekleştirin. (maruz kalma süresi, ms) = (maruz kalma dozu, mJ/cm2)/(lamba gücü, mW/cm2).
Pozlama süresini belirledikten sonra fotomaskeyi UV maske hizalayıcının maske tutucusuna yerleştirin ve fotomaskeyi SU-8 kaplı gofretin üzerine yerleştirin.
UV dağılımını en aza indirmek için fotomask'ın basılı yüzeyini doğrudan silikon gofretin SU-8 kaplı tarafına yerleştirin.
SU-8 kaplı gofreti ve fotomaskeyi önceden belirlenmiş maruz kalma süresi boyunca dikey olarak 260 mJ/cm2 UV ışığına maruz bırakın (bu kutunun 10. adımına bakın).
UV ışınlarına maruz bırakıldıktan sonra, SU-8 kaplı silikon plakalar her bir sıcak plaka üzerinde 65 °C'de 5 dakika ve 95 °C'de 15 dakika pişirilerek 200 µm yüksekliğinde desenler oluşturuldu. 500 µm yüksekliğinde desenler oluşturmak için 95 °C'de pişirme sonrası süre 30 dakikaya çıkarıldı.
Geliştirici bir cam tabağa dökülür ve pişmiş gofret tabağa yerleştirilir. SU-8 geliştiricisinin hacmi, cam plakanın boyutuna bağlı olarak değişebilir. Açığa çıkmamış SU-8'i tamamen çıkarmak için yeterli miktarda SU-8 geliştiricisi kullandığınızdan emin olun. Örneğin, 1 L kapasiteli 150 mm çapında bir cam tabak kullanırken ~300 mL SU-8 geliştiricisi kullanın. Kalıbı ara sıra hafifçe döndürerek 25 dakika boyunca geliştirin.
Geliştirilen kalıbı ~10 mL taze geliştirici ile durulayın ve ardından bir pipet kullanarak çözeltiyi püskürterek IPA ekleyin.
Plakayı bir plazma temizleyicisine yerleştirin ve 1,5 dakika boyunca oksijen plazmasına (atmosferik gaz, hedef basınç 1 × 10−5 Torr, güç 125 W) maruz bırakın.
Plakanın içine cam bir slayt yerleştirilmiş bir vakumlu desikatöre plakayı yerleştirin. Plakalar ve slaytlar yan yana yerleştirilebilir. Vakumlu desikatör bir plaka ile birkaç katmana bölünmüşse, slaytları alt hazneye ve plakaları üst hazneye yerleştirin. Bir cam slayt üzerine 100 μL trikloro(1H, 1H, 2H, 2H-perflorooktil)silan çözeltisi damlatın ve silanizasyon için vakum uygulayın.
Dondurulmuş Caco-2 hücrelerinin bulunduğu bir şişeyi 37°C su banyosunda çözdürün, ardından çözülen hücreleri 15 mL 37°C önceden ısıtılmış Caco-2 ortamı içeren bir T75 şişesine aktarın.
Caco-2 hücrelerini yaklaşık %90 birleşme oranında geçirmek için, öncelikle Caco-2 ortamını, PBS'yi ve %0,25 tripsin/1 mM EDTA'yı 37°C'lik su banyosunda ısıtın.
Ortamı vakum aspirasyonu ile aspire edin. Hücreleri vakum aspirasyonunu tekrarlayarak ve taze PBS ekleyerek 5 mL ılık PBS ile iki kez yıkayın.