Nature.com'u ziyaret ettiğiniz için teşekkür ederiz. Kullandığınız tarayıcı sürümü sınırlı CSS desteğine sahiptir. En iyi deneyim için güncellenmiş bir tarayıcı kullanmanızı (veya Internet Explorer'da Uyumluluk Modunu devre dışı bırakmanızı) öneririz. Bu arada, sürekli desteği sağlamak için siteyi stiller ve JavaScript olmadan sunacağız.
Son zamanlarda, yapay su nanoyapıları (EWNS) kullanan nanoteknolojiye dayalı kimyasal içermeyen bir antimikrobiyal platform geliştirildi. EWNS'ler yüksek bir yüzey yüküne sahiptir ve gıda kaynaklı patojenler de dahil olmak üzere bir dizi mikroorganizma ile etkileşime girebilen ve onları etkisiz hale getirebilen reaktif oksijen türleri (ROS) ile doyurulur. Burada, sentez sırasında özelliklerinin antibakteriyel potansiyellerini daha da artırmak için ince ayarlanabileceği ve optimize edilebileceği gösterilmiştir. EWNS laboratuvar platformu, sentez parametrelerini değiştirerek EWNS'nin özelliklerini ince ayarlamak üzere tasarlanmıştır. Modern analitik yöntemler kullanılarak EWNS özelliklerinin (yük, boyut ve ROS içeriği) karakterizasyonu. Ayrıca, Escherichia coli, Salmonella enterica, Listeria innocuous, Mycobacterium paraaccidentum ve Saccharomyces cerevisiae gibi gıda kaynaklı mikroorganizmalara karşı mikrobiyal inaktivasyon potansiyelleri açısından değerlendirildiler. Burada sunulan sonuçlar, EWNS'nin özelliklerinin sentez sırasında ince ayarlanabileceğini ve bunun da inaktivasyon verimliliğinde üssel bir artışla sonuçlanabileceğini göstermektedir. Özellikle, yüzey yükü dört kat arttı ve reaktif oksijen türleri arttı. Mikrobiyal giderim oranı mikrobiyal olarak bağımlıydı ve 40.000 #/cc EWNS'lik bir aerosol dozuna 45 dakikalık maruziyetten sonra 1,0 ila 3,8 log arasında değişiyordu.
Mikrobiyal kontaminasyon, patojenlerin veya toksinlerinin yutulması sonucu oluşan gıda kaynaklı hastalıkların başlıca nedenidir. Sadece Amerika Birleşik Devletleri'nde gıda kaynaklı hastalıklar her yıl yaklaşık 76 milyon hastalığa, 325.000 hastaneye yatışa ve 5.000 ölüme neden olmaktadır1. Ayrıca, Amerika Birleşik Devletleri Tarım Bakanlığı (USDA), taze ürün tüketiminin artmasının Amerika Birleşik Devletleri'nde bildirilen tüm gıda kaynaklı hastalıkların %48'inden sorumlu olduğunu tahmin etmektedir2. Amerika Birleşik Devletleri'nde gıda kaynaklı patojenlerin neden olduğu hastalık ve ölüm maliyeti çok yüksektir ve Hastalık Kontrol ve Önleme Merkezleri (CDC) tarafından yılda 15,6 milyar ABD dolarından fazla olarak tahmin edilmektedir3.
Günümüzde gıda güvenliğini sağlamak için kimyasal4, radyasyon5 ve termal6 antimikrobiyal müdahaleler, sürekli olarak değil, çoğunlukla üretim zinciri boyunca sınırlı kritik kontrol noktalarında (CCP'ler) gerçekleştirilmektedir (genellikle hasattan sonra ve/veya paketleme sırasında). Bu nedenle çapraz bulaşmaya eğilimlidirler. 7. Gıda kaynaklı hastalıkların ve gıda bozulmalarının daha iyi kontrolü, çevresel etkiyi ve maliyetleri azaltırken çiftlikten sofraya sürekliliğine potansiyel olarak uygulanabilen antimikrobiyal müdahaleler gerektirir.
Son zamanlarda, yapay su nanoyapıları (EWNS) kullanarak yüzey ve havadaki bakterileri inaktive edebilen kimyasal içermeyen, nanoteknoloji tabanlı bir antimikrobiyal platform geliştirildi. EWNS, elektrosprey ve su iyonizasyonu olmak üzere iki paralel işlem kullanılarak sentezlendi (Şekil 1a). Önceki çalışmalar, EWNS'nin benzersiz bir fiziksel ve biyolojik özellik kümesine sahip olduğunu göstermiştir8,9,10. EWNS, yapı başına ortalama 10 elektrona ve 25 nm'lik ortalama bir nanoölçek boyutuna sahiptir (Şekil 1b,c)8,9,10. Ek olarak, elektron spin rezonansı (ESR), EWNS'nin büyük miktarda reaktif oksijen türü (ROS), esas olarak hidroksil (OH•) ve süperoksit (O2-) radikalleri içerdiğini göstermiştir (Şekil 1c)8. EVNS havada uzun süre kalır ve havada asılı kalan ve yüzeyde bulunan mikroorganizmalarla çarpışarak ROS yüklerini iletebilir ve mikroorganizmaların inaktivasyonuna neden olabilir (Şekil 1d). Bu erken çalışmalar ayrıca EWNS'nin yüzeylerde ve havada mikobakteriler de dahil olmak üzere çeşitli gram-negatif ve gram-pozitif bakterilerle etkileşime girebileceğini ve onları etkisiz hale getirebileceğini gösterdi. Transmisyon elektron mikroskobu, inaktivasyonun hücre zarının bozulmasından kaynaklandığını gösterdi. Ek olarak, akut inhalasyon çalışmaları, yüksek dozda EWNS'nin akciğer hasarına veya inflamasyona neden olmadığını gösterdi 8 .
(a) Elektrosprey, sıvı içeren bir kılcal tüp ile bir karşı elektrot arasında yüksek voltaj uygulandığında meydana gelir. (b) Yüksek basınç uygulaması iki farklı olguyla sonuçlanır: (i) suyun elektrospreylenmesi ve (ii) EWNS'de tutulan reaktif oksijen türlerinin (iyonlarının) oluşumu. (c) EWNS'nin benzersiz yapısı. (d) Nanometre ölçeğindeki yapıları nedeniyle EWNS'ler oldukça hareketlidir ve havadaki patojenlerle etkileşime girebilir.
EWNS antimikrobiyal platformunun taze gıdanın yüzeyindeki gıda kaynaklı mikroorganizmaları etkisiz hale getirme yeteneği de yakın zamanda gösterilmiştir. Ayrıca, EWNS'nin yüzey yükünün bir elektrik alanıyla birlikte hedeflenen iletimi elde etmek için kullanılabileceği gösterilmiştir. Dahası, yaklaşık 50.000 #/cm3'lük bir EWNS'de 90 dakikalık bir maruziyetten sonra organik domatesler için elde edilen ön sonuçlar, E. coli ve Listeria 11 gibi çeşitli gıda kaynaklı mikroorganizmaların gözlemlenmesiyle cesaret vericiydi. Ek olarak, ön organoleptik testler, kontrol domateslerine kıyasla hiçbir duyusal etki göstermedi. Bu ilk inaktivasyon sonuçları, 50.000 #/cc'lik çok düşük EWNS dozlarında bile gıda güvenliği uygulamaları için cesaret verici olsa da, daha yüksek bir inaktivasyon potansiyelinin enfeksiyon ve bozulma riskini daha da azaltmak için daha faydalı olacağı açıktır.
Burada, EWNS'nin sentez parametrelerinin ince ayarını ve antibakteriyel potansiyellerini artırmak için EWNS'nin fizikokimyasal özelliklerinin optimizasyonunu sağlamak üzere bir EWNS üretim platformunun geliştirilmesine odaklanacağız. Özellikle, optimizasyon yüzey yüklerini (hedeflenen iletimi iyileştirmek için) ve ROS içeriğini (inaktivasyon verimliliğini iyileştirmek için) artırmaya odaklanmıştır. Modern analitik yöntemleri kullanarak optimize edilmiş fizikokimyasal özellikleri (boyut, yük ve ROS içeriği) karakterize edin ve E. gibi yaygın gıda mikroorganizmalarını kullanın.
EVNS, yüksek saflıktaki suyun (18 MΩ cm–1) eş zamanlı elektrospreylenmesi ve iyonizasyonu ile sentezlendi. Elektrikli nebülizatör 12, tipik olarak sıvıların atomizasyonu ve polimer ve seramik parçacıklarının 13 ve kontrollü boyuttaki liflerin 14 sentezi için kullanılır.
Önceki yayınlarda 8, 9, 10, 11 ayrıntılı olarak açıklandığı gibi, tipik bir deneyde, bir metal kılcal ve topraklanmış bir karşı elektrot arasına yüksek voltaj uygulandı. Bu işlem sırasında iki farklı olgu meydana gelir: i) elektrosprey ve ii) su iyonizasyonu. İki elektrot arasındaki güçlü bir elektrik alanı, yoğunlaşmış suyun yüzeyinde negatif yüklerin birikmesine neden olur ve bu da Taylor konilerinin oluşumuyla sonuçlanır. Sonuç olarak, Rayleigh teorisinde16 olduğu gibi daha küçük parçacıklara ayrılmaya devam eden yüksek yüklü su damlacıkları oluşur. Aynı zamanda, güçlü elektrik alanları bazı su moleküllerinin bölünmesine ve elektronları soymasına (iyonlaşmasına) neden olur ve bu da büyük miktarda reaktif oksijen türü (ROS)17 oluşumuna yol açar. Eş zamanlı olarak üretilen ROS18, EWNS'de kapsüllendi (Şekil 1c).
Şekil 2a'da bu çalışmada EWNS sentezinde geliştirilen ve kullanılan EWNS üretim sistemi gösterilmektedir. Kapalı bir şişede saklanan saflaştırılmış su, bir Teflon tüp (2 mm iç çap) aracılığıyla 30G paslanmaz çelik iğneye (metal kılcal) beslendi. Su akışı, Şekil 2b'de gösterildiği gibi şişenin içindeki hava basıncıyla kontrol edilir. İğne bir Teflon konsola monte edilmiştir ve karşı elektrottan belirli bir mesafeye manuel olarak ayarlanabilir. Karşı elektrot, örnekleme için ortasında bir delik bulunan cilalı bir alüminyum disktir. Karşı elektrotun altında, bir örnekleme portu aracılığıyla deney düzeneğinin geri kalanına bağlanan bir alüminyum örnekleme hunisi bulunur (Şekil 2b). Örnekleyicinin çalışmasını bozabilecek yük birikmesini önlemek için tüm örnekleyici bileşenleri elektriksel olarak topraklanmıştır.
(a) Mühendislik Su Nanoyapı Üretim Sistemi (EWNS). (b) En önemli parametreleri gösteren, örnekleyici ve elektrospreyin kesiti. (c) Bakteri inaktivasyonu için deneysel kurulum.
Yukarıda açıklanan EWNS üretim sistemi, EWNS özelliklerinin ince ayarını kolaylaştırmak için temel çalışma parametrelerini değiştirme yeteneğine sahiptir. EWNS özelliklerini ince ayarlamak için uygulanan voltajı (V), iğne ile karşı elektrot arasındaki mesafeyi (L) ve kılcal damardan geçen su akışını (φ) ayarlayın. Farklı kombinasyonları temsil etmek için kullanılan sembol: [V (kV), L (cm)]. Belirli bir sette [V, L] kararlı bir Taylor konisi elde etmek için su akışını ayarlayın. Bu çalışmanın amaçları doğrultusunda, karşı elektrotun (D) açıklık çapı 0,5 inç (1,29 cm) olarak tutuldu.
Sınırlı geometri ve asimetri nedeniyle, elektrik alan şiddeti ilk prensiplerden hesaplanamaz. Bunun yerine, elektrik alanını hesaplamak için QuickField™ yazılımı (Svendborg, Danimarka)19 kullanıldı. Elektrik alanı tekdüze değildir, bu nedenle kılcal damarın ucundaki elektrik alanının değeri çeşitli yapılandırmalar için referans değeri olarak kullanıldı.
Çalışma sırasında iğne ile karşı elektrot arasındaki voltaj ve mesafenin çeşitli kombinasyonları Taylor koni oluşumu, Taylor koni kararlılığı, EWNS üretim kararlılığı ve tekrarlanabilirlik açısından değerlendirildi. Çeşitli kombinasyonlar Ek Tablo S1'de gösterilmiştir.
EWNS üretim sisteminin çıktısı, parçacık sayısı konsantrasyonu ölçümü için doğrudan bir Tarama Hareketliliği Parçacık Boyutu Analizörüne (SMPS, Model 3936, TSI, Shoreview, MN) ve bir Aerosol Faraday Elektrometresine (TSI, Model 3068B, Shoreview, MN) bağlandı. ) aerosol akımları için önceki yayınımızda açıklandığı gibi ölçüldü. Hem SMPS hem de aerosol elektrometresi 0,5 L/dk akış hızında (toplam örnek akışı 1 L/dk) örneklendi. Parçacıkların sayı konsantrasyonu ve aerosol akışı 120 saniye boyunca ölçüldü. Ölçüm 30 kez tekrarlandı. Mevcut ölçümlere dayanarak, toplam aerosol yükü hesaplanır ve belirli sayıda seçili EWNS parçacığı için ortalama EWNS yükü tahmin edilir. EWNS'nin ortalama maliyeti Denklem (1) kullanılarak hesaplanabilir:
Burada IEl ölçülen akım, NSMPS SMPS ile ölçülen dijital konsantrasyon ve φEl elektrometre başına akış hızıdır.
Bağıl nem (RH) yüzey yükünü etkilediğinden deney boyunca sıcaklık ve bağıl nem (RH) sırasıyla 21°C ve %45'te sabit tutuldu.
Atomik kuvvet mikroskobu (AFM), Asylum MFP-3D (Asylum Research, Santa Barbara, CA) ve AC260T probu (Olympus, Tokyo, Japonya) EWNS'nin boyutunu ve ömrünü ölçmek için kullanıldı. AFM tarama frekansı 1 Hz, tarama alanı 5 μm × 5 μm ve 256 tarama çizgisiydi. Tüm görüntüler Asylum yazılımı kullanılarak 1. derece görüntü hizalamasına tabi tutuldu (maske aralığı 100 nm, eşik 100 pm).
Test hunisi çıkarıldı ve mika yüzeyi, parçacık kümelenmesini ve mika yüzeyinde düzensiz damlacıklar oluşmasını önlemek için ortalama 120 saniye boyunca karşı elektrottan 2,0 cm uzaklığa yerleştirildi. EWNS, doğrudan taze kesilmiş mika yüzeyine püskürtüldü (Ted Pella, Redding, CA). AFM püskürtme işleminden hemen sonra mika yüzeyinin görüntüsü. Taze kesilmiş, değiştirilmemiş mika yüzeyinin temas açısı 0°'ye yakındır, bu nedenle EVNS, mika yüzeyinde bir kubbe şeklinde dağılmıştır. Dağılan damlacıkların çapı (a) ve yüksekliği (h) doğrudan AFM topografisinden ölçüldü ve daha önce doğrulanmış yöntemimizi kullanarak EWNS kubbeli difüzyon hacmini hesaplamak için kullanıldı. Yerleşik EWNS'nin aynı hacme sahip olduğu varsayılarak, eşdeğer çap Denklem (2) kullanılarak hesaplanabilir:
Daha önce geliştirdiğimiz yönteme dayanarak, EWNS'de kısa ömürlü radikal ara maddelerin varlığını tespit etmek için bir elektron spin rezonansı (ESR) spin tuzağı kullanıldı. Aerosoller, 235 mM DEPMPO(5-(dietoksifosforil)-5-metil-1-pirolin-N-oksit) (Oxis International Inc.) çözeltisi içeren 650 μm'lik bir Midget sparger'dan (Ace Glass, Vineland, NJ) kabarcıklar halinde geçirildi. Portland, Oregon). Tüm ESR ölçümleri bir Bruker EMX spektrometresi (Bruker Instruments Inc. Billerica, MA, ABD) ve bir düz panel hücresi kullanılarak gerçekleştirildi. Verileri toplamak ve analiz etmek için Acquisit yazılımı (Bruker Instruments Inc. Billerica, MA, ABD) kullanıldı. ROS'un özelliklerinin belirlenmesi yalnızca bir dizi çalışma koşulu için gerçekleştirildi [-6,5 kV, 4,0 cm]. Çarpma cihazındaki EWNS kayıpları hesaba katıldıktan sonra SMPS kullanılarak EWNS konsantrasyonları ölçüldü.
Ozon seviyeleri 205 Dual Beam Ozone Monitor™ (2B Technologies, Boulder, Co) kullanılarak izlendi8,9,10.
Tüm EWNS özellikleri için, ortalama değer ölçüm değeri olarak, standart sapma ise ölçüm hatası olarak kullanılmıştır. Optimize edilmiş EWNS niteliklerinin değerlerini, baz EWNS'nin karşılık gelen değerleriyle karşılaştırmak için T-testleri yapılmıştır.
Şekil 2c, yüzeyde EWNS'nin hedefli iletimi için kullanılabilen, daha önce geliştirilmiş ve karakterize edilmiş bir elektrostatik çökeltme (EPES) "çekme" sistemini göstermektedir. EPES, güçlü bir elektrik alanının etkisi altında doğrudan hedefin yüzeyine "yönlendirilebilen" EVNS yükleri kullanır. EPES sisteminin ayrıntıları Pyrgiotakis ve ark. tarafından yakın zamanda yayınlanan bir yayında sunulmuştur. 11 . Bu nedenle, EPES, konik uçlu 3 boyutlu yazdırılmış bir PVC haznesinden oluşur ve merkezde 15,24 cm aralıklı iki paralel paslanmaz çelik (304 paslanmaz çelik, ayna kaplamalı) metal plaka içerir. Levhalar harici bir yüksek voltaj kaynağına (Bertran 205B-10R, Spellman, Hauppauge, NY) bağlandı, alt plaka her zaman pozitif voltaja bağlandı ve üst plaka her zaman toprağa (yüzen toprak) bağlandı. Hazne duvarları, parçacık kaybını önlemek için elektriksel olarak topraklanmış alüminyum folyo ile kaplıdır. Odanın, test yüzeylerinin yüksek voltaj girişimini önlemek için alt metal plakanın üzerine yükseltilen plastik standlara yerleştirilmesine olanak tanıyan kapalı bir ön yükleme kapısı vardır.
EWNS'nin EPES'teki biriktirme verimliliği, Ek Şekil S111'de ayrıntılı olarak açıklanan daha önce geliştirilmiş bir protokole göre hesaplandı.
Kontrol odası olarak, EPES sistemine seri olarak ikinci bir silindirik akış odası bağlandı ve burada EWNS'yi gidermek için bir ara HEPA filtresi kullanıldı. Şekil 2c'de gösterildiği gibi, EWNS aerosolü iki yerleşik odadan pompalandı. Kontrol odası ile EPES arasındaki filtre, kalan EWNS'yi gidererek aynı sıcaklık (T), bağıl nem (RH) ve ozon seviyelerine neden olur.
Taze gıdaları kirleten önemli gıda kaynaklı mikroorganizmalar bulunmuştur; bunlar arasında E. coli (ATCC #27325), dışkı göstergesi Salmonella enterica (ATCC #53647), gıda kaynaklı patojen Listeria harmless (ATCC #33090), ATCC'den (Manassas, VA) türetilen patojenik Listeria monocytogenes'in vekili, Saccharomyces cerevisiae (ATCC #4098), bozulma mayasının yerine geçen bir bakteri ve daha dirençli inaktif bir bakteri olan Mycobacterium paralucky (ATCC #19686) bulunur.
Yerel pazarınızdan rastgele kutularca organik üzüm domatesi satın alın ve kullanana kadar (en fazla 3 gün) 4°C'de buzdolabında saklayın. Deneysel domateslerin hepsi aynı boyuttaydı, çapları yaklaşık 1/2 inçti.
Kültür, aşılama, maruz bırakma ve koloni sayımı protokolleri önceki yayınımızda ayrıntılı olarak açıklanmış ve Ek Veriler'de ayrıntılı olarak verilmiştir. EWNS'nin etkinliği, aşılanmış domateslerin 45 dakika boyunca 40.000 #/cm3'e maruz bırakılmasıyla değerlendirildi. Kısaca, üç domates t = 0 dakika zamanında hayatta kalan mikroorganizmaları değerlendirmek için kullanıldı. Üç domates EPES'e yerleştirildi ve 40.000 #/cc'de EWNS'ye maruz bırakıldı (EWNS'ye maruz bırakılan domatesler) ve kalan üçü kontrol odasına yerleştirildi (kontrol domatesleri). Her iki gruptaki domateslere ek işlem yapılmadı. EWNS'ye maruz bırakılan domatesler ve kontrol domatesleri, EWNS'nin etkisini değerlendirmek için 45 dakika sonra çıkarıldı.
Her deney üç kez gerçekleştirildi. Veri analizi Ek Verilerde açıklanan protokole göre gerçekleştirildi.
İnaktivasyon mekanizmaları, maruz kalan EWNS örneklerinin (40.000 #/cm3 EWNS aerosol konsantrasyonunda 45 dakika) ve zararsız bakteriler E. coli, Salmonella enterica ve Lactobacillus'un ışınlanmamış örneklerinin sedimantasyonuyla değerlendirildi. Parçacıklar, oda sıcaklığında 2 saat boyunca 0,1 M sodyum kakodilat tamponunda (pH 7,4) %2,5 glutaraldehit, %1,25 paraformaldehit ve %0,03 pikrik asitte fiksasyona uğradı. Yıkamadan sonra, %1 osmiyum tetroksit (OsO4)/%1,5 potasyum ferrosiyanür (KFeCN6) ile 2 saat post-fiksasyona tabi tutun, 3 kez suda yıkayın ve %1 uranil asetatta 1 saat inkübe edin, ardından iki kez suda yıkayın, ardından %50, %70, %90, %100 alkolde 10 dakika dehidrate edin. Örnekler daha sonra 1 saat boyunca propilen oksit içine yerleştirildi ve 1:1 propilen oksit ve TAAP Epon karışımıyla emprenye edildi (Marivac Canada Inc. St. Laurent, CA). Örnekler TAAB Epon içine gömüldü ve 60°C'de 48 saat boyunca polimerize edildi. Sertleştirilmiş granüler reçine kesildi ve AMT 2k CCD kamera (Advanced Microscopy Techniques, Corp., Woburn, Massachusetts, ABD) ile donatılmış geleneksel bir transmisyon elektron mikroskobu JEOL 1200EX (JEOL, Tokyo, Japonya) kullanılarak TEM ile görüntülendi.
Tüm deneyler üçer kez gerçekleştirildi. Her zaman noktası için, bakteri yıkamaları üçer kez ekildi ve bu da nokta başına toplam dokuz veri noktasıyla sonuçlandı, bunların ortalaması o belirli mikroorganizma için bakteri konsantrasyonu olarak kullanıldı. Standart sapma ölçüm hatası olarak kullanıldı. Tüm noktalar sayılır.
Bakteri konsantrasyonundaki azalmanın t=0 dk'ya göre logaritması aşağıdaki formül kullanılarak hesaplandı:
Burada C0, kontrol numunesindeki bakteri konsantrasyonunun 0 anındaki (yani yüzey kuruduktan sonra ancak hazneye yerleştirilmeden önceki) değeri ve Cn, n dakikalık maruziyetten sonra yüzeydeki bakteri konsantrasyonudur.
45 dakikalık maruziyet sırasında bakterilerin doğal bozunmasını hesaba katmak için, 45 dakikadan sonra kontrole kıyasla logaritmik azalma da aşağıdaki şekilde hesaplandı:
Burada Cn, n zamanında kontrol örneğindeki bakteri konsantrasyonudur ve Cn-Kontrol, n zamanında kontrol bakteri konsantrasyonudur. Veriler, kontrole kıyasla logaritmik azalma olarak sunulur (EWNS maruziyeti yok).
Çalışma sırasında, iğne ile karşı elektrot arasındaki voltaj ve mesafenin çeşitli kombinasyonları Taylor koni oluşumu, Taylor koni kararlılığı, EWNS üretim kararlılığı ve tekrarlanabilirlik açısından değerlendirildi. Çeşitli kombinasyonlar Ek Tablo S1'de gösterilmiştir. Kapsamlı çalışma için kararlı ve tekrarlanabilir özellikler gösteren iki vaka (Taylor koni, EWNS üretimi ve zaman içinde kararlılık) seçildi. Şekil 3'te her iki vakada da ROS'un yükü, boyutu ve içeriği için sonuçlar gösterilmektedir. Sonuçlar ayrıca Tablo 1'de özetlenmiştir. Referans olması açısından, hem Şekil 3 hem de Tablo 1 daha önce sentezlenen optimize edilmemiş EWNS8, 9, 10, 11'in (başlangıç-EWNS) özelliklerini içermektedir. İki kuyruklu t-testi kullanılarak yapılan istatistiksel anlamlılık hesaplamaları Ek Tablo S2'de yeniden yayınlanmıştır. Ek olarak, ek veriler karşı elektrot örnekleme deliği çapının (D) ve toprak elektrot ile uç arasındaki mesafenin (L) etkisine ilişkin çalışmaları içerir (Ek Şekiller S2 ve S3).
(ac) AFM ile ölçülen boyut dağılımı. (df) Yüzey yük karakteristiği. (g) EPR'nin ROS karakterizasyonu.
Yukarıdaki tüm koşullar için ölçülen iyonizasyon akımının 2 ila 6 μA arasında ve voltajın -3,8 ila -6,5 kV arasında olduğunu ve bunun da bu tek EWNS üretim temas modülü için 50 mW'tan daha az bir güç tüketimiyle sonuçlandığını belirtmek de önemlidir. EWNS yüksek basınç altında sentezlenmiş olmasına rağmen, ozon seviyeleri çok düşüktü ve hiçbir zaman 60 ppb'yi geçmedi.
Ek Şekil S4, sırasıyla [-6,5 kV, 4,0 cm] ve [-3,8 kV, 0,5 cm] senaryoları için simüle edilmiş elektrik alanlarını göstermektedir. [-6,5 kV, 4,0 cm] ve [-3,8 kV, 0,5 cm] senaryoları için alan hesaplamaları sırasıyla 2 × 105 V/m ve 4,7 × 105 V/m'dir. Bu beklenen bir durumdur çünkü ikinci durumda voltaj-mesafe oranı çok daha yüksektir.
Şekil 3a,b'de AFM8 ile ölçülen EWNS çapı gösterilmektedir. Hesaplanan ortalama EWNS çapları sırasıyla [-6,5 kV, 4,0 cm] ve [-3,8 kV, 0,5 cm] şemaları için 27 nm ve 19 nm'dir. [-6,5 kV, 4,0 cm] ve [-3,8 kV, 0,5 cm] senaryoları için dağılımların geometrik standart sapmaları sırasıyla 1,41 ve 1,45'tir ve dar bir boyut dağılımını gösterir. Hem ortalama boyut hem de geometrik standart sapma, sırasıyla 25 nm ve 1,41'de temel EWNS'ye çok yakındır. Şekil 3c'de aynı koşullar altında aynı yöntem kullanılarak ölçülen temel EWNS'nin boyut dağılımı gösterilmektedir.
Şekil 3d,e'de yük karakterizasyonunun sonuçları gösterilmektedir. Veriler, konsantrasyon (#/cm3) ve akımın (I) 30 eş zamanlı ölçümünün ortalama ölçümleridir. Analiz, EWNS'deki ortalama yükün sırasıyla [-6,5 kV, 4,0 cm] ve [-3,8 kV, 0,5 cm] için 22 ± 6 e- ve 44 ± 6 e- olduğunu göstermektedir. Bunlar, temel EWNS'ye (10 ± 2 e-) kıyasla önemli ölçüde daha yüksek yüzey yüklerine sahiptir, [-6,5 kV, 4,0 cm] senaryosundan iki kat ve [-3,8 kV, 0,5 cm] senaryosundan dört kat daha büyüktür. Şekil 3f, Temel-EWNS için yük verilerini göstermektedir.
EWNS sayısının konsantrasyon haritalarından (Ek Şekiller S5 ve S6), [-6,5 kV, 4,0 cm] senaryosunun [-3,8 kV, 0,5 cm] senaryosundan önemli ölçüde daha fazla parçacığa sahip olduğu görülebilir. Ayrıca, EWNS sayısı konsantrasyonunun 4 saate kadar izlendiğine (Ek Şekiller S5 ve S6) dikkat çekmek gerekir; burada EWNS üretim kararlılığı her iki durumda da aynı parçacık sayısı konsantrasyon seviyelerini göstermiştir.
Şekil 3g'de, [-6,5 kV, 4,0 cm]'de optimize edilmiş EWNS kontrolünün (arka plan) çıkarılmasından sonraki EPR spektrumu gösterilmektedir. ROS spektrumları ayrıca daha önce yayınlanmış bir çalışmada Baseline-EWNS senaryosuyla karşılaştırılmıştır. Spin tuzaklarıyla reaksiyona giren EWNS sayısının 7,5 × 104 EWNS/s olduğu hesaplanmıştır; bu, daha önce yayınlanmış Baseline-EWNS8'e benzerdir. EPR spektrumları, baskın tür olan O2- ve daha az bol bulunan OH• olmak üzere iki tür ROS'un varlığını açıkça göstermiştir. Ek olarak, tepe yoğunluklarının doğrudan karşılaştırılması, optimize edilmiş EWNS'nin, baz EWNS'ye kıyasla önemli ölçüde daha yüksek bir ROS içeriğine sahip olduğunu göstermiştir.
Şekil 4'te EPES'te EWNS'nin biriktirme verimliliği gösterilmektedir. Veriler ayrıca Tablo I'de özetlenmiş ve orijinal EWNS verileriyle karşılaştırılmıştır. EUNS'nin her iki durumu için de biriktirme, 3,0 kV'luk düşük bir voltajda bile %100'e yakındır. Tipik olarak, 3,0 kV, yüzey yükü değişiminden bağımsız olarak %100 biriktirme için yeterlidir. Aynı koşullar altında, Baseline-EWNS'nin biriktirme verimliliği, daha düşük yükleri (EWNS başına ortalama 10 elektron) nedeniyle yalnızca %56 idi.
Şekil 5'te ve tablo 2'de, optimum modda [-6,5 kV, 4,0 cm] 45 dakika boyunca yaklaşık 40.000 #/cm3 EWNS'ye maruz bırakıldıktan sonra domateslerin yüzeyine aşılanan mikroorganizmaların inaktivasyon değeri özetlenmiştir. Aşılanan E. coli ve Lactobacillus innocuous, 45 dakikalık maruziyet sırasında 3,8 log'luk önemli bir azalma gösterdi. Aynı koşullar altında, S. enterica'da 2,2 log'luk bir azalma olurken, S. cerevisiae ve M. parafortutum'da 1,0 log'luk bir azalma oldu.
Elektron mikrografileri (Şekil 6), zararsız Escherichia coli, Streptococcus ve Lactobacillus hücrelerinde EWNS tarafından indüklenen ve bunların inaktivasyonuna yol açan fiziksel değişiklikleri göstermektedir. Kontrol bakterilerinin sağlam hücre zarları vardı, maruz kalan bakterilerin ise hasarlı dış zarları vardı.
Kontrol ve maruz kalan bakterilerin elektron mikroskobik görüntülemesinde membran hasarı ortaya çıktı.
Optimize edilmiş EWNS'nin fizikokimyasal özelliklerine ilişkin veriler, EWNS'nin özelliklerinin (yüzey yükü ve ROS içeriği) daha önce yayınlanan EWNS temel verilerine8,9,10,11 kıyasla önemli ölçüde iyileştirildiğini topluca göstermektedir. Öte yandan, boyutları daha önce bildirilen sonuçlara çok benzer şekilde nanometre aralığında kalmış ve bu da havada uzun süreler kalabilmelerini sağlamıştır. Gözlemlenen polidispersite, EWNS'nin boyutunu belirleyen yüzey yükü değişimleri, Rayleigh etkisinin rastgeleliği ve potansiyel birleşme ile açıklanabilir. Ancak, Nielsen ve ark. tarafından22 ayrıntılı olarak açıklandığı gibi, yüksek yüzey yükü, su damlasının yüzey enerjisini/gerilimini etkili bir şekilde artırarak buharlaşmayı azaltır. Önceki yayınımızda8 bu teori mikro damlacıklar 22 ve EWNS için deneysel olarak doğrulanmıştır. Fazla mesai sırasında yük kaybı da boyutu etkileyebilir ve gözlemlenen boyut dağılımına katkıda bulunabilir.
Ek olarak, yapı başına yük, duruma bağlı olarak yaklaşık 22-44 e-'dir ve bu, yapı başına ortalama 10 ± 2 elektron yüküne sahip temel EWNS'ye kıyasla önemli ölçüde daha yüksektir. Ancak, bunun EWNS'nin ortalama yükü olduğu unutulmamalıdır. Seto ve ark. Yükün homojen olmadığı ve log-normal bir dağılım izlediği gösterilmiştir21. Önceki çalışmalarımızla karşılaştırıldığında, yüzey yükünün iki katına çıkarılması EPES sistemindeki biriktirme verimliliğini neredeyse %100'e çıkarır11.