Nature.com'u ziyaret ettiğiniz için teşekkür ederiz.Sınırlı CSS desteğine sahip bir tarayıcı sürümü kullanıyorsunuz.En iyi deneyim için güncellenmiş bir tarayıcı kullanmanızı (veya Internet Explorer'da Uyumluluk Modunu devre dışı bırakmanızı) öneririz.Ayrıca, sürekli destek sağlamak için siteyi stiller ve JavaScript olmadan gösteriyoruz.
Aynı anda üç slayttan oluşan bir döngü görüntüler.Üç slaytta aynı anda ilerlemek için Önceki ve Sonraki düğmelerini kullanın veya aynı anda üç slaytta ilerlemek için sondaki kaydırma düğmelerini kullanın.
Kan-beyin bariyeri ve kan-beyin bariyeri, biyoterapötik ajanların merkezi sinir sistemindeki hedeflerine ulaşmasını engellemekte ve böylece nörolojik hastalıkların etkin tedavisini engellemektedir.Yeni beyin taşıyıcılarını in vivo olarak keşfetmek için, bir T7 faj peptit kütüphanesini tanıttık ve kanüle edilmiş bilinçli büyük bir sıçan havuzu modeli kullanarak seri olarak kan ve beyin omurilik sıvısı (BOS) topladık.Spesifik faj klonları, dört seçim turundan sonra CSF'de oldukça zenginleştirildi.Bireysel aday peptitlerin test edilmesi, CSF'de 1000 kattan fazla zenginleşme ortaya çıkardı.Peptit aracılı beyne verilişin biyoaktivitesi, tanımlanan yeni transit peptidine bağlı bir BACE1 peptid inhibitörü kullanılarak beyin omurilik sıvısındaki amiloid-P seviyesinde %40'lık bir azalma ile doğrulandı.Bu sonuçlar, in vivo faj seçim yöntemleriyle tanımlanan peptitlerin, makromoleküllerin terapötik bir etki ile beyne sistemik olarak verilmesi için faydalı araçlar olabileceğini düşündürmektedir.
Merkezi sinir sistemi (CNS) hedefli terapi araştırmaları, büyük ölçüde, beyne aktif ilaç dağıtımını sağlayan mekanizmaları keşfetmeye daha az çaba sarf ederek, CNS hedefleme özellikleri sergileyen optimize edilmiş ilaçları ve ajanları belirlemeye odaklanmıştır.İlaç dağıtımı, özellikle büyük moleküller, modern nörobilim ilaç gelişiminin ayrılmaz bir parçası olduğu için bu durum artık değişmeye başlıyor.Merkezi sinir sisteminin ortamı, kan-beyin bariyeri (BBB) ​​​​ve kan-beyin bariyerinden (BCBB)1 oluşan serebrovasküler bariyer sistemi tarafından iyi korunmaktadır, bu da beyne ilaç verilmesini zorlaştırmaktadır1,2.Büyük moleküllü ilaçların neredeyse tamamı ve küçük moleküllü ilaçların %98'inden fazlasının beyinden atıldığı tahmin edilmektedir3.Bu nedenle, terapötik ilaçların CNS'ye etkili ve spesifik bir şekilde iletilmesini sağlayan yeni beyin taşıma sistemlerini belirlemek çok önemlidir 4,5.Bununla birlikte, BBB ve BCSFB, kapsamlı vaskülatürü yoluyla beynin tüm yapılarına nüfuz ettikleri ve girdikleri için ilaç dağıtımı için mükemmel bir fırsat sunar.Bu nedenle, beyne invazif olmayan uygulama yöntemlerinin kullanılmasına yönelik mevcut çabalar, büyük ölçüde endojen BBB6 reseptörü kullanan reseptör aracılı taşıma (PMT) mekanizmasına dayanmaktadır.Transferrin reseptör yolunu7,8 kullanan son önemli gelişmelere rağmen, iyileştirilmiş özelliklere sahip yeni dağıtım sistemlerinin daha da geliştirilmesi gerekmektedir.Bu amaçla amacımız, prensipte makromolekülleri CNS'ye iletmek veya yeni reseptör yolları açmak için kullanılabileceklerinden, CSF taşınmasına aracılık edebilen peptitleri belirlemekti.Özellikle serebrovasküler sistemin spesifik reseptörleri ve taşıyıcıları (BBB ve BSCFB), biyoterapötik ilaçların aktif ve spesifik iletimi için potansiyel hedefler olarak hizmet edebilir.Beyin omurilik sıvısı (BOS), koroid pleksusun (CS) salgı ürünüdür ve subaraknoid boşluk ve ventriküler boşluk yoluyla beynin interstisyel sıvısı ile doğrudan temas halindedir4.Son zamanlarda, subaraknoid beyin omurilik sıvısının beynin interstisyumuna aşırı derecede yayıldığı gösterilmiştir9.Bu subaraknoid giriş yolunu kullanarak veya doğrudan BBB yoluyla parankimal boşluğa erişmeyi umuyoruz.Bunu başarmak için, bu iki farklı yoldan biri tarafından taşınan peptitleri ideal olarak tanımlayan sağlam bir in vivo faj seçim stratejisi uyguladık.
Şimdi, en yüksek kitaplık çeşitliliğine sahip ilk seçim turlarını izlemek için yüksek verimli sıralama (HTS) ile birleştirilmiş CSF örneklemesi ile sıralı bir in vivo faj görüntüleme tarama yöntemini açıklıyoruz.Kan kontaminasyonunu önlemek için kalıcı olarak implante edilmiş büyük sisterna (CM) kanül ile bilinçli fareler üzerinde tarama yapıldı.Daha da önemlisi, bu yaklaşım hem beyin hedeflemeyi hem de serebrovasküler bariyer boyunca taşıma aktivitesi olan peptitleri seçer.Küçük boyutları (~60 nm)10 nedeniyle T7 fajlarını kullandık ve bunların endotelyal ve/veya epitelyal-medulla bariyerinin transselüler geçişine izin veren veziküllerin taşınması için uygun olduklarını öne sürdük.Dört tur kaydırmadan sonra, güçlü in vivo CSF ​​zenginleştirmesi ve serebral mikrodamar ilişkisi gösteren faj popülasyonları izole edildi.Daha da önemlisi, tercih edilen ve kimyasal olarak sentezlenen en iyi aday peptitlerin protein yükünü beyin omurilik sıvısına taşıyabildiğini göstererek bulgularımızı doğrulayabildik.İlk olarak, CNS'nin farmakodinamik etkileri, önde gelen bir geçiş peptidi ile bir BACE1 peptidi inhibitörü birleştirilerek oluşturulmuştur.İn vivo işlevsel tarama stratejilerinin yeni beyin taşıma peptitlerini etkili protein kargo taşıyıcıları olarak tanımlayabildiğini göstermenin yanı sıra, benzer işlevsel seçim yaklaşımlarının yeni beyin taşıma yollarının belirlenmesinde de önemli hale gelmesini bekliyoruz.
Plak oluşturucu birimlere (PFU) dayalı olarak, faj paketleme aşamasından sonra, yaklaşık 109 çeşitliliğe sahip rastgele 12-mer lineer T7 faj peptitlerinden oluşan bir kitaplık tasarlandı ve oluşturuldu (bkz. Malzemeler ve Yöntemler).Bu kitaplığı in vivo kaydırmadan önce dikkatlice analiz ettiğimize dikkat etmek önemlidir.Faj kitaplığı örneklerinin değiştirilmiş primerler kullanılarak PCR amplifikasyonu, HTS'ye doğrudan uygulanabilir amplikonlar üretti (Ek Şekil 1a).A) HTS11 sıralama hataları, b) primerlerin kalitesi üzerindeki etki (NNK) 1-12 ve c) bekleme kitaplığında vahşi tip (wt) fajın (iskelet ekleri) varlığı nedeniyle, yalnızca doğrulanmış dizi bilgilerini çıkarmak için bir dizi filtreleme prosedürü uygulandı (Ek Şekil 1b).Bu filtre adımları, tüm HTS sıralama kitaplıkları için geçerlidir.Standart kitaplık için, %39'u filtre kriterlerini geçen ve kitaplık analizi ve sonraki turlar için seçim için kullanılan toplam 233.868 okuma elde edildi (Ek Şekil 1c-e).Okumalar, ağırlıklı olarak, 36 nükleotitte bir tepe noktası olan 3 baz çiftinin katlarıydı (Ek Şekil 1c), kütüphane tasarımını (NNK) 1-12 doğruladı.Özellikle, kütüphane üyelerinin yaklaşık %11'i 12 boyutlu bir vahşi tip (ağırlık) omurga PAGISRELVDKL eki içeriyordu ve dizilerin neredeyse yarısı (%49) eklemeler veya silmeler içeriyordu.Kütüphane kitaplığının HTS'si, kitaplıktaki yüksek peptit çeşitliliğini doğruladı: peptit dizilerinin %81'inden fazlası yalnızca bir kez bulundu ve yalnızca %1,5'i ≥4 kopyada meydana geldi (Ek Şekil 2a).Repertuardaki 12 pozisyonun hepsindeki amino asitlerin (aa) frekansları, dejenere NKK repertuvarı tarafından üretilen kodon sayısı için beklenen frekanslarla iyi bir korelasyon gösterdi (Ek Şekil 2b).Bu ekler tarafından kodlanan aa kalıntılarının gözlemlenen frekansı, hesaplanan frekansla (r = 0.893) iyi bir korelasyon gösterdi (Ek Şekil 2c).Faj kitaplıklarının enjeksiyon için hazırlanması, amplifikasyon ve endotoksinin çıkarılması adımlarını içerir.Bunun daha önce faj kitaplıklarının çeşitliliğini potansiyel olarak azalttığı gösterilmiştir12,13.Bu nedenle, endotoksin giderme işlemine tabi tutulmuş plaka ile büyütülmüş bir faj kitaplığını sıraladık ve AA sıklığını tahmin etmek için orijinal kitaplık ile karşılaştırdık.Orijinal havuz ile büyütülmüş ve saflaştırılmış havuz arasında güçlü bir korelasyon (r = 0.995) gözlendi (Ek Şekil 2d), bu, T7 faj kullanılarak plakalar üzerinde büyütülen klonlar arasındaki rekabetin büyük yanlılığa neden olmadığını gösterir.Bu karşılaştırma, her kitaplıktaki tripeptit motiflerinin sıklığına dayanmaktadır, çünkü kitaplıkların çeşitliliği (~109) HTS ile bile tam olarak yakalanamaz.Her pozisyondaki aa'nın frekans analizi, girilen repertuarın son üç pozisyonunda küçük bir pozisyona bağlı önyargı ortaya çıkardı (Ek Şekil 2e).Sonuç olarak, kitaplığın kalitesinin ve çeşitliliğinin kabul edilebilir olduğu ve çeşitli seçim turları arasında faj kitaplıklarının amplifikasyonu ve hazırlanması nedeniyle çeşitlilikte yalnızca küçük değişikliklerin gözlemlendiği sonucuna vardık.
Seri beyin omurilik sıvısı örneklemesi, BBB ve/veya BCSFB yoluyla intravenöz (iv) enjekte edilen T7 fajının tanımlanmasını kolaylaştırmak için bilinçli farelerin CM'sine cerrahi olarak bir kanül implante edilerek gerçekleştirilebilir (Şekil 1a-b).İn vivo seçimin ilk üç turunda iki bağımsız seçim kolu (A ve B kolları) kullandık (Şekil 1c).Seçimin ilk üç turunda eklenen toplam faj miktarını azaltarak seçimin katılığını kademeli olarak artırdık.Dördüncü kaydırma turu için, A ve B dallarından örnekleri birleştirdik ve üç ek bağımsız seçim gerçekleştirdik.Bu modelde T7 faj partiküllerinin in vivo özelliklerini incelemek için, kuyruk damarından sıçanlara vahşi tip faj (PAGISRELVDKL master insert) enjekte edildi.Farklı zaman noktalarında beyin omurilik sıvısı ve kandan fajların geri kazanılması, nispeten küçük T7 ikosahedral fajların kan bölmesinden hızlı bir başlangıç ​​temizleme aşamasına sahip olduğunu gösterdi (Ek Şekil 3).Uygulanan titrelere ve sıçanların kan hacmine dayanarak, ağırlıkça sadece yaklaşık %1 olduğunu hesapladık.intravenöz enjeksiyondan 10 dakika sonra kanda uygulanan dozdan faj saptanmıştır.Bu ilk hızlı düşüşün ardından, 27.7 dakikalık yarı ömür ile daha yavaş bir birincil klerens ölçüldü.Önemli olarak, CSF bölmesinden yalnızca çok az faj alındı, bu da BOS bölmesine vahşi tip faj göçü için düşük bir arka plana işaret ediyor (Ek Şekil 3).Ortalama olarak, tüm numune alma periyodu boyunca (0-250 dakika) beyin omurilik sıvısında kanda sadece yaklaşık %1 x %10-3 T7 faj titresi ve başlangıçta infüze edilen fajların %4 x %10-8'i tespit edildi.Özellikle, vahşi tip fajın beyin omurilik sıvısındaki yarı ömrü (25.7 dakika) kanda gözlenene benzerdi.Bu veriler, CSF bölmesini kandan ayıran bariyerin, CM-kanüle edilmiş sıçanlarda bozulmamış olduğunu ve kandan CSF bölmesine kolayca taşınan klonları tanımlamak için faj kitaplıklarının in vivo seçimine izin verdiğini göstermektedir.
(a) Büyük bir havuzdan beyin omurilik sıvısını (BOS) yeniden örneklemek için bir yöntem kurmak.(b) Merkezi sinir sistemi (CNS) bariyerinin hücresel konumunu ve kan-beyin bariyerini (BBB) ​​ve kan-beyin bariyerini geçen peptitleri tanımlamak için kullanılan seçim stratejisini gösteren diyagram.(c) In vivo faj görüntüleme tarama akış şeması.Her seçim turunda, damardan fajlar (okların içindeki hayvan tanımlayıcıları) enjekte edildi.İki bağımsız alternatif dal (A, B) 4. tur elemeye kadar ayrı tutulur.3. ve 4. seçim turları için, CSF'den ekstrakte edilen her bir faj klonu manuel olarak sekanslandı.(d) T7 peptit kitaplığının (2 x 1012 faj/hayvan) intravenöz enjeksiyonundan sonra kanüle edilmiş iki farede ilk seçim turu sırasında kandan (kırmızı daireler) ve beyin omurilik sıvısından (yeşil üçgenler) izole edilen fajın kinetiği.Mavi kareler, toplam kan hacmi dikkate alınarak enjekte edilen faj miktarından hesaplanan kandaki ortalama ilk faj konsantrasyonunu gösterir.Siyah kareler, kan faj konsantrasyonlarından tahmin edilen y çizgisinin kesişme noktasını gösterir.(e,f) Peptitte bulunan tüm olası örtüşen tripeptit motiflerinin göreli frekansını ve dağılımını gösterin.1000 okumada bulunan motif sayısı gösterilmektedir.Önemli ölçüde (p < 0.001) zenginleştirilmiş motifler kırmızı noktalarla işaretlenmiştir.(e) Enjekte edilen kitaplığın tripeptit motifinin nispi frekansını #1.1 ve #1.2 numaralı hayvanlardan alınan kandan türetilmiş faj ile karşılaştıran korelasyon dağılım grafiği.(f) Kan ve beyin omurilik sıvısında izole edilen #1.1 ve #1.2 hayvan faj tripeptid motiflerinin nispi frekanslarını karşılaştıran korelasyon dağılım grafiği.( g, h ) Her iki hayvanda bir tur in vivo seçimden sonra kanla zenginleştirilmiş fajın (g) enjekte edilen kitaplıklara ve BOS'ta zenginleştirilmiş fajın (h) kana karşı dizi kimliği gösterimi.Tek harfli kodun boyutu, o amino asidin o pozisyonda ne sıklıkta oluştuğunu gösterir.Yeşil = polar, mor = nötr, mavi = bazik, kırmızı = asidik ve siyah = hidrofobik amino asitler.Şekil 1a, b, Eduard Urich tarafından tasarlanmış ve üretilmiştir.
İki CM enstrüman faresine (A ve B sınıfı) bir faj peptid kütüphanesi enjekte ettik ve beyin omurilik sıvısı ve kandan izole edilmiş faj (Şekil 1d).Kütüphanenin başlangıçtaki hızlı temizliği, vahşi tip faja kıyasla daha az belirgindi.Her iki hayvanda da enjekte edilen kitaplığın ortalama yarı ömrü, vahşi tip faja benzer şekilde kanda 24.8 dakika ve BOS'ta 38.5 dakikaydı.Her hayvandan alınan kan ve beyin omurilik sıvısı faj numuneleri HTS'ye tabi tutuldu ve tanımlanan tüm peptitler, kısa bir tripeptit motifinin varlığı açısından analiz edildi.Tripeptit motifleri, yapı oluşumu ve peptit-protein etkileşimleri14,15 için minimum bir temel sağladıkları için seçildi.Enjekte edilen faj kitaplığı ile her iki hayvanın kanından çıkarılan klonlar arasındaki motif dağılımında iyi bir korelasyon bulduk (Şekil 1e).Veriler, kitaplığın bileşiminin kan bölmesinde yalnızca marjinal olarak zenginleştiğini göstermektedir.Amino asit frekansları ve konsensüs dizileri, Weblogo16 yazılımının bir uyarlaması kullanılarak her pozisyonda ayrıca analiz edildi.İlginç bir şekilde, kan glisin kalıntılarında güçlü bir zenginleşme bulduk (Şekil 1g).Kan, CSF'den seçilen klonlarla karşılaştırıldığında, motiflerde güçlü seçim ve bazı seçimlerin kaldırılması gözlemlendi (Şekil 1f) ve belirli amino asitler, 12-üyede önceden belirlenmiş konumlarda tercihen mevcuttu (Şekil 1h).Özellikle, bireysel hayvanlar beyin omurilik sıvısında önemli ölçüde farklılık gösterirken, her iki hayvanda da kan glisin zenginleşmesi gözlendi (Ek Şekil 4a-j).# 1.1 ve # 1.2 hayvanlarının beyin omurilik sıvısındaki sekans verilerinin sıkı bir şekilde filtrelenmesinden sonra, toplam 964 ve 420 benzersiz 12-mer peptit elde edildi (Ek Şekil 1d-e).İzole edilen faj klonları büyütüldü ve ikinci bir in vivo seçim turuna tabi tutuldu.İkinci seçim turundan çıkarılan faj, her hayvanda HTS'ye tabi tutuldu ve tanımlanan tüm peptidler, tripeptit motiflerinin oluşumunu analiz etmek için bir motif tanıma programına girdi olarak kullanıldı (Şekil 2a, b, ef).CSF'den geri kazanılan fajın ilk döngüsüyle karşılaştırıldığında, A ve B dallarında CSF'deki birçok motifin daha fazla seçilip seçimlerinin kaldırıldığını gözlemledik (Şekil 2).Tutarlı dizinin farklı modellerini temsil edip etmediklerini belirlemek için bir ağ tanımlama algoritması uygulandı.CSF tarafından alternatif A sınıfında (Şekil 2c, d) ve B sınıfında (Şekil 2g, h) geri kazanılan 12 boyutlu diziler arasında açık bir benzerlik gözlendi.Her daldaki birleştirilmiş analiz, 12-mer peptidler için farklı seçim profilleri (Ek Şekil 5c, d) ve birinci tur seçime kıyasla ikinci seçim turundan sonra havuzlanmış klonlar için zaman içinde CSF/kan titresi oranında bir artış ortaya çıkardı (Ek Şekil 5e).).
Motiflerin ve peptitlerin beyin omurilik sıvısındaki iki ardışık in vivo fonksiyonel faj görüntüleme seçimi turuyla zenginleştirilmesi.
Her bir hayvanın (hayvanlar #1.1 ve #1.2) ilk turundan geri kazanılan tüm beyin omurilik sıvısı fajları bir araya toplandı, büyütüldü, HT sekanslandı ve birlikte yeniden enjekte edildi (2 x 1010 faj/hayvan) 2 SM kanüle edilmiş sıçan (#1.1 → #).2.1 ve 2.2, 1.2 → 2.3 ve 2.4).(a,b,e,f) Birinci ve ikinci seçim turlarında tüm CSF'den türetilmiş fajların tripeptit motiflerinin nispi frekansını karşılaştıran korelasyon dağılım grafikleri.Her iki yönde peptitlerde bulunan tüm olası örtüşen tripeptitleri temsil eden motiflerin göreli sıklığı ve dağılımı.1000 okumada bulunan motif sayısı gösterilmektedir.Karşılaştırılan kitaplıklardan birinde önemli ölçüde (p < 0.001) seçilen veya hariç tutulan motifler kırmızı noktalarla vurgulanır.(c, d, g, h) İn vivo seçimin 2. ve 1. turlarına dayanan tüm CSF açısından zengin 12 amino asit uzun dizilerinin dizi logosu gösterimi.Tek harfli kodun boyutu, o amino asidin o pozisyonda ne sıklıkta oluştuğunu gösterir.Logoyu temsil etmek için, iki seçim turu arasında tek tek hayvanlardan çıkarılan BOS dizilerinin sıklığı karşılaştırılır ve ikinci turdaki zenginleştirilmiş diziler gösterilir: (c) #1.1–#2.1 (d) #1.1–#2.2 (g) #1.2–#2.3 ve (h) #1.2–#2.4.Belirli bir pozisyonda en zengin amino asitler (c,d) hayvanlarında no.2.1 ve hayır.2.2 veya (g, h) hayvanlarda no.2.3 ve hayır.2.4 renkli olarak gösterilmiştir.Yeşil = polar, mor = nötr, mavi = bazik, kırmızı = asidik ve siyah = hidrofobik amino asitler.
Üçüncü seçim turundan sonra, iki hayvandan izole edilen 332 CSF ile yeniden oluşturulmuş faj klonundan 124 benzersiz peptit dizisi (#3.1 ve #3.2) belirledik (Ek Şekil 6a).LGSVS dizisi (%18,7) en yüksek nispi orana sahipti, bunu PAGISRELVDKL (%8,2), MRWFFSHASQGR (%3), DVAKVS (%3), TWLFSLG (%2,2) ve SARGSWREIVSLS (%2,2) izledi.Son dördüncü turda, üç ayrı hayvandan bağımsız olarak seçilen iki dalı havuzladık (Şekil 1c).CSF'den geri kazanılan 925 sekanslı faj klonundan dördüncü turda, aralarında vahşi tip fajın nispi oranının %0.8'e düştüğü 64 benzersiz peptit sekansı (Ek Şekil 6b) bulduk.Dördüncü turdaki en yaygın CSF klonları LYVLHSRGLWGFKLAAALE (%18), LGSVS (%17), GFVRFRLSNTR (%14), KVAWRVFSLFWK (%7), SVHGV (%5), GRPQKINGARVC (%3,6) ve RLSSVDSDLSGC (%3,2) idi.%)).Seçilen peptitlerin uzunluk aralığı, NNK kitaplığı tasarımı için dejenere kodonlar kullanılırken kitaplık primerlerindeki nükleotit eklemeleri/silmelerinden veya erken durdurma kodonlarından kaynaklanmaktadır.Erken durdurma kodonları daha kısa peptitler üretir ve uygun aa motifini içerdikleri için seçilirler.Daha uzun peptitler, sentetik kitaplıkların primerlerindeki eklemelerden/silmelerden kaynaklanabilir.Bu, tasarlanan durdurma kodonunu çerçevenin dışına konumlandırır ve aşağı akışta yeni bir durdurma kodonu görünene kadar onu okur.Genel olarak, girdi verilerini örnek çıktı verileriyle karşılaştırarak dört seçim turunun tümü için zenginleştirme faktörlerini hesapladık.İlk tarama turu için, spesifik olmayan bir arka plan referansı olarak vahşi tip faj titreleri kullandık.İlginç bir şekilde, negatif faj seçimi ilk BOS döngüsünde çok güçlüydü, ancak kanda değil (Şekil 3a); bu, peptit kitaplığının çoğu üyesinin CSF bölmesine pasif difüzyon olasılığının düşük olması veya ilgili fajların bakteriyofajlara göre kan dolaşımından daha verimli bir şekilde tutulma veya uzaklaştırılma eğiliminden kaynaklanabilir.Bununla birlikte, ikinci kaydırma turunda, her iki kuşakta da CSF'de güçlü faj seçimi gözlendi, bu, önceki turun, CSF alımını destekleyen peptitler sergileyen fajlarda zenginleştirildiğini öne sürdü (Şekil 3a).Yine, önemli bir kan zenginleştirmesi olmadan.Ayrıca üçüncü ve dördüncü turlarda, faj klonları CSF'de önemli ölçüde zenginleştirildi.Son iki seçim turu arasındaki her benzersiz peptit sekansının nispi frekansını karşılaştırarak, sekansların dördüncü seçim turunda daha da zenginleştiğini bulduk (Şekil 3b).Her iki peptit oryantasyonu kullanılarak 64 eşsiz peptit dizisinin hepsinden toplam 931 tripeptit motifi ekstre edildi.Dördüncü turdaki en zenginleştirilmiş motifler, enjekte edilen kitaplığa kıyasla tüm turlardaki zenginleştirme profilleri açısından daha yakından incelendi (kesim: %10 zenginleştirme) (Ek Şekil 6c).Genel seçim kalıpları, incelenen motiflerin çoğunun her iki seçim dalının önceki tüm turlarında zenginleştirildiğini gösterdi.Bununla birlikte, bazı motifler (örn. SGL, VSG, LGS GSV) ağırlıklı olarak alternatif sınıf A'dandı, diğerleri (örn. FGW, RTN, WGF, NTR) alternatif grup B'de zenginleştirildi.
Streptavidin yüklerine konjüge edilmiş BOS ile zenginleştirilmiş fajla görüntülenen peptitlerin ve biyotinlenmiş lider peptitlerin CSF naklinin doğrulanması.
(a) Enjekte edilen (giriş = I) faj (PFU) titrelerine ve belirlenmiş CSF faj titrelerine (çıkış = O) dayalı olarak dört turun tamamında (R1-R4) hesaplanan zenginleştirme oranları.Son üç tur (R2-R4) için zenginleştirme faktörleri, ağırlık verileri ile bir önceki tur ve ilk tur (R1) ile karşılaştırılarak hesaplandı.Açık çubuklar beyin omurilik sıvısıdır, gölgeli çubuklar plazmadır.(***p<0.001, Student t-testine göre).(b) Seçimin 4. turundan sonra CSF'de toplanan tüm fajlara nispi oranlarına göre sıralanan en bol faj peptitlerinin listesi.En yaygın altı faj klonu, renkle vurgulanır, numaralandırılır ve seçimin 3. ve 4. turları (ekler) arasında zenginleştirme faktörleri.(c,d) 4. turdaki en zenginleştirilmiş altı faj klonu, boş faj ve ebeveyn faj peptid kitaplığı, bir CSF örnekleme modelinde ayrı ayrı analiz edildi.BOS ve kan örnekleri belirtilen zaman noktalarında toplandı.(c) Eşit miktarlarda 6 aday faj klonu (2 x 1010 faj/hayvan), boş faj (#1779) (2 x 1010 faj/hayvan) ve stok faj peptit kitaplıkları (2 x 1012 faj/hayvan) Kanüle edilmiş hayvana kuyruk damarından ayrı olarak en az 3 CM enjekte edilir.Enjekte edilen her bir faj klonunun ve faj peptit kitaplığının zaman içindeki CSF farmakokinetiği gösterilmiştir.(d), örnekleme süresi boyunca geri kazanılan tüm fajlar/mL için ortalama BOS/kan oranını gösterir.(e) Dört sentetik lider peptit ve bir karıştırılmış kontrol, N-terminalleri (tetramer gösterimi) ve ardından enjeksiyon (kuyruk damarı iv, 10 mg streptavidin/kg) yoluyla biotin ile streptavidine bağlandı.En az üç entübe sıçan (N = 3).).CSF numuneleri, belirtilen zaman noktalarında toplandı ve streptavidin konsantrasyonları, CSF anti-streptavidin ELISA (nd = saptanmadı) ile ölçüldü.(*p<0,05, **p<0,01, ***p<0,001, ANOVA testine göre).(f) En zenginleştirilmiş faj peptit klonu #2002'nin (mor) amino asit sekansının, 4. seçim turundan seçilen diğer faj peptit klonlarıyla karşılaştırılması.Aynı ve benzer amino asit fragmanları renk kodludur.
Dördüncü turdaki tüm zenginleştirilmiş fajlardan (Şekil 3b), CSF örnekleme modelinde daha fazla bireysel analiz için altı aday klon seçildi.Üç kanüle edilmiş CM hayvanına eşit miktarlarda altı aday faj, boş faj (ek yok) ve profaj peptid kitaplığı enjekte edildi ve CSF (Şekil 3c) ve kan (Ek Şekil 7) tahlillerinde farmakokinetik belirlendi.Test edilen tüm faj klonları, boş kontrol fajından (#1779) 10-1000 kat daha yüksek bir seviyede CSF bölmesini hedefledi.Örneğin #2020 ve #2077 klonları, kontrol fajından yaklaşık 1000 kat daha yüksek CSF titrelerine sahipti.Seçilen her peptitin farmakokinetik profili farklıdır, ancak hepsinin yüksek bir CSF homing yeteneği vardır.#1903 ve #2011 klonları için zaman içinde sabit bir düşüş gözlemledik, #2077, #2002 ve #2009 klonları için ilk 10 dakikadaki artış aktif taşımayı gösterebilir ancak doğrulanması gerekiyor.#2020, #2002 ve #2077 klonları yüksek seviyelerde stabilize olurken #2009 klonunun CSF konsantrasyonu ilk artışın ardından yavaş yavaş düştü.Daha sonra her BOS adayının nispi sıklığını kan konsantrasyonuyla karşılaştırdık (Şekil 3d).Her bir BOS adayının ortalama titresinin tüm numune alma zamanlarındaki kan titresi ile korelasyonu, altı adaydan üçünün kan BOS'unda önemli ölçüde zenginleştiğini gösterdi.İlginç bir şekilde, klon #2077 daha yüksek kan stabilitesi gösterdi (Ek Şekil 7).Peptidlerin kendilerinin faj partikülleri dışındaki kargoları aktif olarak CSF bölmesine taşıyabildiklerini doğrulamak için, peptitlerin faj partikülüne bağlandığı N-terminalinde biotin ile türetilmiş dört lider peptidi sentezledik.Biyotinlenmiş peptitler (no. 2002, 2009, 2020 ve 2077), faj geometrisini bir şekilde taklit eden multimerik formlar elde etmek için streptavidin (SA) ile konjuge edildi.Bu format aynı zamanda kargo taşıyan protein peptitleri olarak kanda ve beyin omurilik sıvısında SA maruziyetini ölçmemizi sağladı.Daha da önemlisi, faj verileri, bu SA-konjuge formatta sentetik peptitler uygulandığında sıklıkla yeniden üretilebilir (Şekil 3e).Karıştırılmış peptitler, 48 saat içinde tespit edilemeyen seviyelerle daha az ilk maruziyete ve daha hızlı CSF klirensine sahipti.Bu peptit faj klonlarının CSF boşluğuna teslim yollarına dair fikir edinmek için, in vivo intravenöz enjeksiyondan 1 saat sonra faj partiküllerini doğrudan saptamak için immünohistokimya (IHC) kullanarak bireysel faj peptit isabetlerinin lokalizasyonunu analiz ettik.Özellikle #2002, #2077 ve #2009 klonları beyin kılcal damarlarında güçlü boyama ile tespit edilebilirken kontrol faj (#1779) ve klon #2020 tespit edilmedi (Ek Şekil 8).Bu, bu peptidlerin tam olarak BBB'yi geçerek beyin üzerindeki etkiye katkıda bulunduğunu düşündürür.BSCFB rotası da dahil olabileceğinden, bu hipotezi test etmek için daha ayrıntılı analiz gereklidir.En zenginleştirilmiş klonun (#2002) amino asit dizisini diğer seçilmiş peptidlerle karşılaştırırken, bazılarının benzer bir taşıma mekanizmasına işaret edebilecek benzer amino asit uzantılarına sahip olduğu kaydedildi (Şekil 3f).
Eşsiz plazma profili ve zaman içinde CSF'deki önemli artış nedeniyle, faj görüntüleme klonu #2077, 48 saatlik daha uzun bir süre boyunca daha fazla araştırıldı ve sürekli SA seviyeleri ile bağlantılı olarak gözlenen BOS'taki hızlı artışı yeniden oluşturabildi (Şekil 4a).Tanımlanan diğer faj klonları ile ilgili olarak, #2077 beyin kılcal damarları için güçlü bir şekilde boyandı ve daha yüksek çözünürlükte görüntülendiğinde kapiler işaretleyici lektin ile önemli kollokalizasyon ve muhtemelen parankimal boşlukta bir miktar lekelenme gösterdi (Şekil 4b).CNS'de peptit aracılı farmakolojik etkilerin elde edilip edilemeyeceğini araştırmak için, i) #2077 transit peptidinin ve ii) BACE1 inhibitör peptidinin biyotinlenmiş versiyonlarının SA ile iki farklı oranda karıştırıldığı bir deney gerçekleştirdik.Bir kombinasyon için sadece BACE1 peptit inhibitörünü kullandık ve diğeri için 1:3 oranında BACE1 peptit inhibitörü ile #2077 peptit kullandık.Her iki örnek de intravenöz olarak uygulandı ve zaman içinde beta-amiloid peptit 40'ın (Abeta40) kan ve beyin omurilik sıvısı seviyeleri ölçüldü.Abeta40, beyin parankimindeki BACE1 inhibisyonunu yansıttığı için CSF'de ölçüldü.Beklendiği gibi, her iki kompleks de Abeta40'ın kan seviyelerini önemli ölçüde azalttı (Şekil 4c, d).Ancak sadece peptit karışımı içeren numuneler no.2077 ve SA'ya konjuge BACE1 peptidinin bir inhibitörü, beyin omurilik sıvısında Abeta40'ta önemli bir azalmaya neden oldu (Şekil 4c).Veriler, peptit no.2077, 60 kDa SA proteinini CNS'ye taşıyabilir ve ayrıca BACE1 peptidinin SA-konjuge inhibitörleri ile farmakolojik etkilere neden olur.
(a) CSF peptit #2077'nin (RLSSVDSDLSGC) ve enjekte edilmemiş kontrol fajının (#1779) CM ile entübe edilmiş en az üç sıçanda uzun vadeli farmakokinetik profillerini gösteren T7 fajının klonal enjeksiyonu (2 x 106 faj/hayvan).(b) Faj enjekte edilmiş sıçanlarda (2 x 10 10 faj/hayvan) temsili kortikal mikrodamarların konfokal mikroskobik görüntüsü, peptid #2077 ve damarların (lektin) karşı boyamasını gösteriyor.Bu faj klonları, 3 sıçana uygulandı ve perfüzyondan önce 1 saat süreyle dolaşıma bırakıldı.Beyinler kesildi ve T7 faj kapsidine karşı poliklonal FITC etiketli antikorlarla boyandı.Perfüzyondan ve müteakip fiksasyondan on dakika önce, DyLight594 etiketli lektin intravenöz olarak uygulandı.Kılcal damarların ve perivasküler beyin dokusunun lümeninde mikrodamarların ve fajların (yeşil) lümen tarafının lektin lekelenmesini (kırmızı) gösteren floresan görüntüler.Ölçek çubuğu 10 µm'ye karşılık gelir.(c, d) Tek başına veya biyotinlenmiş transit peptit #2077 ile kombinasyon halinde biyotinlenmiş BACE1 inhibe edici peptit, streptavidine birleştirildi, ardından kanüle edilmiş en az üç CM sıçana (10 mg streptavidin/kg) intravenöz enjeksiyon yapıldı.Ap40'ta BACE1 peptit inhibitörü aracılı azalma, belirtilen zaman noktalarında kanda (kırmızı) ve beyin omurilik sıvısında (turuncu) Ap1-40 ELISA ile ölçülmüştür.Daha iyi netlik için grafik üzerinde %100 ölçeğinde noktalı bir çizgi çizilir.(c) 3:1 oranında transit peptit #2077 ve BACE1 inhibe edici peptit ile konjuge streptavidin ile tedavi edilen sıçanlarda kanda (kırmızı üçgenler) ve beyin omurilik sıvısında (turuncu üçgenler) Aβ40'ta yüzde azalma.(d) Yalnızca bir BACE1 inhibe edici peptit ile birleştirilmiş streptavidin ile tedavi edilen sıçanların kan Aβ40 (kırmızı daireler) ve beyin omurilik sıvısında (turuncu daireler) azalma yüzdesi.Kontroldeki Ap konsantrasyonu 420 pg/ml idi (standart sapma = 101 pg/ml).
Faj gösterimi, biyomedikal araştırma17çeşitli alanlarda başarıyla uygulanmıştır.Bu yöntem, in vivo vasküler çeşitlilik çalışmaları18,19ve ayrıca serebral damarları20,21,22,23,24,25,26 hedef alan çalışmalar için kullanılmıştır.Bu çalışmada, bu seçim yönteminin uygulamasını sadece serebral damarları hedef alan peptitlerin doğrudan tanımlanmasına değil, aynı zamanda kan-beyin bariyerini geçmek için aktif taşıma özelliklerine sahip adayların keşfedilmesine de genişlettik.Şimdi CM entübe edilmiş sıçanlarda bir in vivo seçim prosedürünün gelişimini açıklıyoruz ve bunun CSF homing özelliklerine sahip peptitleri belirleme potansiyelini gösteriyoruz.12-mer rasgele peptidlerden oluşan bir kitaplık sergileyen T7 fajını kullanarak, T7 fajının kan-beyin bariyerine adapte edilebilecek kadar küçük (yaklaşık 60 nm çapında)10 olduğunu ve böylece doğrudan kan-beyin bariyerini veya koroid pleksusu geçtiğini gösterebildik.Kanüle edilmiş CM farelerinden alınan CSF'nin iyi kontrol edilen bir in vivo fonksiyonel tarama yöntemi olduğunu ve çıkarılan fajın sadece vaskülatüre bağlanmakla kalmayıp aynı zamanda kan-beyin bariyeri boyunca bir taşıyıcı olarak işlev gördüğünü gözlemledik.Ayrıca, aynı anda kan toplayarak ve CSF'ye ve kandan türetilen fajlara HTS uygulayarak, CSF seçimimizin kan zenginleştirmesinden veya seçim turları arasında genişlemeye uygunluğundan etkilenmediğini doğruladık.Bununla birlikte, kan bölmesi seçim prosedürünün bir parçasıdır, çünkü BOS bölmesine ulaşabilen fajların beyinde kendilerini zenginleştirecek kadar uzun süre hayatta kalması ve kan dolaşımında dolaşması gerekir.Ham HTS verilerinden güvenilir sıralama bilgisi elde etmek için analiz iş akışında platforma özgü sıralama hatalarına uyarlanmış filtreler uyguladık.Tarama yöntemine kinetik parametreleri dahil ederek, vahşi tip T7 fajlarının kandaki hızlı farmakokinetiğini (t½ ~ 28 dakika) doğruladık24, 27, 28 ve ayrıca beyin omurilik sıvısındaki yarı ömürlerini (t½ ~ 26 dakika)/dakika olarak belirledik.Kan ve CSF'deki benzer farmakokinetik profillere rağmen, kan-beyin bariyeri boyunca vahşi tip T7 fajının düşük arka plan hareketliliğine işaret ederek, BOS'ta kandaki faj konsantrasyonunun yalnızca %0,001'i saptanabildi.Bu çalışma, özellikle birkaç klon CNS bölmesine ulaşabildiğinden, dolaşımdan hızla temizlenen faj sistemleri için in vivo kaydırma stratejileri kullanılırken ilk seçim turunun önemini vurgulamaktadır.Bu nedenle, ilk turda, bu çok katı CSF modelinde sonunda yalnızca sınırlı sayıda klon toplandığından, kitaplık çeşitliliğindeki azalma çok büyüktü.Bu in vivo kaydırma stratejisi, CSF bölmesinde aktif birikim, kan bölmesinde klonun hayatta kalması ve ilk 10 dakika içinde kandan T7 faj klonlarının hızlı bir şekilde çıkarılması gibi çeşitli seçim adımlarını içermiştir (Şekil 1d ve Ek Şekil 4M).).Böylece, ilk turdan sonra, bireysel hayvanlar için aynı başlangıç ​​havuzu kullanılmasına rağmen, CSF'de farklı faj klonları tanımlandı.Bu, çok sayıda kitaplık üyesi olan kaynak kitaplıklar için çok sayıda katı seçim adımının çeşitlilikte önemli bir azalmaya yol açtığını gösterir.Bu nedenle, rastgele olaylar, sonucu büyük ölçüde etkileyen ilk seçim sürecinin ayrılmaz bir parçası haline gelecektir.Orijinal kitaplıktaki klonların çoğunun çok benzer bir BOS zenginleştirme eğilimine sahip olması muhtemeldir.Bununla birlikte, aynı deneysel koşullar altında bile, başlangıç ​​havuzundaki her belirli klonun sayısının az olması nedeniyle seçim sonuçları farklılık gösterebilir.
BOS'ta zenginleştirilmiş motifler kandakilerden farklıdır.İlginç bir şekilde, bireysel hayvanların kanında glisin açısından zengin peptitlere doğru ilk kaymayı not ettik.(Şekil 1g, Ek Şekiller 4e, 4f).Glisin peptidleri içeren faj daha kararlı olabilir ve dolaşımdan alınma olasılığı daha düşük olabilir.Bununla birlikte, bu glisin açısından zengin peptitler, beyin omurilik sıvısı örneklerinde tespit edilmedi, bu da küratörlü kitaplıkların iki farklı seçim aşamasından geçtiğini düşündürüyor: biri kanda ve diğeri beyin omurilik sıvısında birikmesine izin verildi.Dördüncü seçim turundan kaynaklanan CSF ile zenginleştirilmiş klonlar kapsamlı bir şekilde test edilmiştir.Bireysel olarak test edilen klonların neredeyse tamamının, boş kontrol fajına kıyasla CSF açısından zengin olduğu doğrulandı.Bir peptit vuruşu (#2077) daha ayrıntılı olarak incelenmiştir.Diğer isabetlere kıyasla daha uzun bir plazma yarı ömrü gösterdi (Şekil 3d ve Ek Şekil 7) ve ilginç bir şekilde bu peptit, C-terminalinde bir sistein kalıntısı içeriyordu.Son zamanlarda peptitlere sistein eklenmesinin, albümin 29'a bağlanarak farmakokinetik özelliklerini geliştirebileceği gösterilmiştir.Bu, peptit #2077 için şu anda bilinmiyor ve daha fazla çalışma gerektiriyor.Bazı peptidler, T7 kapsidinin görüntülenen yüzey geometrisi ile ilişkili olabilecek BOS zenginleştirmesinde (veriler gösterilmemiştir) bir değer bağımlılığı gösterdi.Kullandığımız T7 sistemi, faj parçacığı başına her peptitten 5-15 kopya gösterdi.IHC, sıçanların serebral korteksine intravenöz olarak enjekte edilen aday kurşun faj klonları üzerinde gerçekleştirildi (Ek Şekil 8).Veriler, en az üç klonun (No. 2002, No. 2009 ve No. 2077) BBB ile etkileşime girdiğini gösterdi.Bu BBB etkileşiminin CSF birikimine mi yoksa bu klonların doğrudan BCSFB'ye hareketine mi yol açtığı henüz belirlenmemiştir.Önemli olarak, seçilen peptitlerin sentezlendiklerinde ve protein yüküne bağlandıklarında BOS taşıma kapasitelerini koruduklarını gösteriyoruz.N-terminal biyotinlenmiş peptitlerin SA'ya bağlanması, kanda ve beyin omurilik sıvısında ilgili faj klonlarıyla elde edilen sonuçları esasen tekrarlar (Şekil 3e).Son olarak, kurşun peptit #2077'nin SA'ya konjüge edilmiş biyotinlenmiş bir BACE1 peptit inhibitörünün beyin hareketini destekleyebildiğini ve BOS'ta Abeta40 seviyelerini önemli ölçüde azaltarak CNS'de belirgin farmakodinamik etkilere neden olduğunu gösterdik (Şekil 4).Tüm isabetler için bir peptit dizisi homoloji araması gerçekleştirerek veri tabanında herhangi bir homolog tanımlayamadık.T7 kitaplığının boyutunun yaklaşık 109, 12-mer için teorik kitaplık boyutunun ise 4 x 1015 olduğunu not etmek önemlidir. Bu nedenle, 12-mer peptit kitaplığının çeşitlilik alanının yalnızca küçük bir kısmını seçtik; bu, tanımlanan bu isabetlerin bitişik dizi alanı değerlendirilerek daha optimize edilmiş peptitlerin tanımlanabileceği anlamına gelebilir.Varsayımsal olarak, bu peptitlerin herhangi bir doğal homologunu bulamamamızın nedenlerinden biri, evrim sırasında belirli peptit motiflerinin beyne kontrolsüz girişini önlemek için seçimin kaldırılması olabilir.
Birlikte ele alındığında, sonuçlarımız serebrovasküler bariyerin taşıma sistemlerini in vivo olarak daha ayrıntılı olarak tanımlamak ve karakterize etmek için gelecekteki çalışmalar için bir temel sağlar.Bu yöntemin temel kurulumu, yalnızca serebral vasküler bağlanma özelliklerine sahip klonları tanımlamayan, aynı zamanda başarılı klonların biyolojik engelleri in vivo olarak CNS bölmesine geçmek için içsel aktiviteye sahip olduğu kritik bir adımı da içeren fonksiyonel bir seçim stratejisine dayanmaktadır.bu peptitlerin taşınma mekanizmasını ve bunların beyin bölgesine özgü mikro damar sistemine bağlanma tercihlerini açıklamaktır.Bu, BBB ve reseptörlerin taşınması için yeni yolların keşfedilmesine yol açabilir.Tanımlanan peptitlerin doğrudan serebrovasküler reseptörlere veya BBB veya BCSFB yoluyla taşınan dolaşımdaki ligandlara bağlanabilmesini bekliyoruz.Bu çalışmada keşfedilen CSF taşıma aktivitesine sahip peptit vektörleri daha fazla araştırılacaktır.Şu anda BBB ve/veya BCSFB'yi geçme yetenekleri açısından bu peptitlerin beyin özgüllüğünü araştırıyoruz.Bu yeni peptidler, yeni reseptörlerin veya yolların potansiyel keşfi için ve biyolojikler gibi makromoleküllerin beyne iletilmesi için yüksek verimli yeni platformların geliştirilmesi için son derece değerli araçlar olacaktır.
Daha önce açıklanan yöntemin bir modifikasyonunu kullanarak büyük sarnıcı (CM) kanüle edin.Anestezi uygulanmış Wistar sıçanları (200-350 g) bir stereotaksik aparata monte edildi ve kafatasını ortaya çıkarmak için traş edilmiş ve aseptik olarak hazırlanmış kafa derisi üzerinde ortanca bir kesi yapıldı.Üst kanat alanında iki delik açın ve deliklere sabitleme vidalarını sıkın.Paslanmaz çelik bir kanülün CM'ye stereotaktik kılavuzluğu için lateral oksipital tepede ek bir delik açılmıştır.Kanülün çevresine dental çimento uygulayın ve vidalarla sabitleyin.Foto-sertleştirme ve siman sertleştirme işleminden sonra cilt yarası 4/0 supramid sütür ile kapatıldı.Kanülün doğru yerleştirildiği, beyin omurilik sıvısının (BOS) spontan sızıntısı ile doğrulanır.Fareyi stereotaksik aparattan çıkarın, uygun postoperatif bakım ve ağrı tedavisi alın ve beyin omurilik sıvısında kan belirtileri görülene kadar en az bir hafta iyileşmesine izin verin.Wistar fareleri (Crl:WI/Han) Charles River'dan (Fransa) temin edildi.Tüm sıçanlar spesifik patojen içermeyen koşullar altında tutuldu.Tüm hayvan deneyleri, İsviçre'nin Basel Şehri Veterinerlik Ofisi tarafından onaylandı ve Hayvan Lisansı No. 2474'e (Sıçanın Beyin Omurilik Sıvısı ve Beynindeki Terapötik Adayların Düzeylerinin Ölçülerek Aktif Beyin Aktarımının Değerlendirilmesi) uygun olarak yapıldı.
Yavaşça elinde CM kanül ile bilinçli sıçan tutun.Datura'yı kanülden çıkarın ve 10 µl kendiliğinden akan beyin omurilik sıvısı toplayın.Kanülün açıklığı nihayetinde riske atıldığından, bu çalışmaya yalnızca kan kontaminasyonu veya renk değişikliği kanıtı olmayan berrak beyin omurilik sıvısı örnekleri dahil edildi.Buna paralel olarak kuyruğun ucundaki küçük bir kesiden heparinli (Sigma-Aldrich) tüplere yaklaşık 10–20 µl kan alındı.CSF ve kan, T7 fajının intravenöz enjeksiyonundan sonra çeşitli zaman noktalarında toplandı.Kateterin ölü hacmine karşılık gelen her BOS örneği toplanmadan önce yaklaşık 5-10 µl sıvı atıldı.
Kitaplıklar, T7Select sistem kılavuzunda (Novagen, Rosenberg ve diğ., InNovations 6, 1-6, 1996) açıklandığı gibi T7Select 10-3b vektörü kullanılarak üretildi.Kısaca, rastgele bir 12-mer DNA eki aşağıdaki formatta sentezlendi:
NNK kodonu, ekte çift durdurma kodonlarını ve amino asit aşırı ekspresyonunu önlemek için kullanıldı.N, her bir nükleotidin elle karıştırılmış eşmolar oranıdır ve K, adenin ve sitozin nükleotidlerinin elle karıştırılmış eşmolar oranıdır.Tek sarmallı bölgeler, 37°C'de 3 saat süreyle Klenow tamponunda (New England Biolabs) dNTP (Novagen) ve Klenow enzimi (New England Biolabs) ile daha fazla inkübasyon yoluyla çift sarmallı DNA'ya dönüştürüldü.Reaksiyondan sonra çift sarmallı DNA, EtOH çökeltmesiyle geri kazanıldı.Elde edilen DNA kısıtlama enzimleri EcoRI ve HindIII (her ikisi de Roche'tan) ile sindirildi.Bölünmüş ve saflaştırılmış (QIAquick, Qiagen) eki (T4 ligaz, New England Biolabs) daha sonra 10B kapsid geninin 348. amino asidinden sonra önceden bölünmüş bir T7 vektörüne çerçeve içinde bağlandı.Ligasyon reaksiyonları, in vitro paketlemeden önce 16°C'de 18 saat süreyle inkübe edildi.İn vitro faj paketleme, T7Select 10-3b klonlama kiti (Novagen) ile sağlanan talimatlara göre gerçekleştirildi ve paketleme solüsyonu, Escherichia coli (BLT5615, Novagen) kullanılarak parçalanmak üzere bir kez amplifiye edildi.Lizatlar santrifüjlendi, titre edildi ve -80°C'de bir gliserol stok solüsyonu olarak donduruldu.
Tescilli 454/Roche-amplikon füzyon primerleri kullanılarak et suyu veya plaka içinde çoğaltılan faj değişken bölgelerinin doğrudan PCR amplifikasyonu.İleri füzyon primeri, değişken bölge (NNK) 12'yi (şablona özel), GS FLX Titanyum Adaptör A'yı ve dört tabanlı bir kitaplık anahtar dizisini (TCAG) (Ek Şekil 1a) çevreleyen dizileri içerir:
Ters füzyon primeri ayrıca yakalama boncuklarına eklenmiş biyotin ve emülsiyon PCR sırasında klonal amplifikasyon için gerekli olan GS FLX Titanyum Adaptör B'yi içerir:
Amplikonlar daha sonra 454 GS-FLX Titanium protokolüne göre 454/Roche pyrosequencing'e tabi tutuldu.Manuel Sanger sıralaması için (Applied Biosystems Hitachi 3730 xl DNA Analyzer), T7 faj DNA'sı PCR ile büyütüldü ve aşağıdaki primer çiftleri ile sekanslandı:
Ayrı plaklardan alınan ekler, Roche Fast Start DNA Polimeraz Kiti kullanılarak (üreticinin talimatlarına göre) PCR amplifikasyonuna tabi tutuldu.Sıcak başlatma (95 °C'de 10 dk) ve 35 boost döngüsü (95 °C'de 50 s, 50 °C'de 1 dk ve 72 °C'de 1 dk) gerçekleştirin.
Kütüphanelerden faj, vahşi tip faj, CSF ve kandan kurtarılan faj veya tek tek klonlar, 37°C'de 4 saat süreyle TB suyu (Sigma Aldrich) veya 500 cm2 tabaklarda (Thermo Scientific) Escherichia coli BL5615 içinde çoğaltıldı.Plakalar, Tris-EDTA tamponu (Fluka Analytical) ile durulanarak veya plakalar steril pipet uçlarıyla toplanarak plakalardan faj ekstre edildi.Faj, kültür süpernatanından veya bir tur polietilen glikol (PEG 8000) çökeltmesi (Promega) ile ekstraksiyon tamponundan izole edildi ve Tris-EDTA tamponunda yeniden süspanse edildi.
Büyütülmüş faj, intravenöz (IV) enjeksiyondan (500 ul/hayvan) önce endotoksin giderme boncukları (Miltenyi Biotec) kullanılarak 2-3 tur endotoksin gidermeye tabi tutuldu.İlk turda 2×1012 faj tanıtıldı;ikincisinde 2×1010 faj;üçüncü ve dördüncü seçim turlarında hayvan başına 2×109 faj.Belirtilen zaman noktalarında toplanan CSF ve kan numunelerindeki faj içeriği, üreticinin talimatlarına göre (T7Select sistem kılavuzu) plak sayımı ile belirlendi.Faj seçimi, saflaştırılmış kitaplıkların kuyruk damarına intravenöz enjeksiyonu veya önceki seçim turundan BOS'tan ekstrakte edilen fajın yeniden enjeksiyonu ile gerçekleştirildi ve sonraki hasatlar sırasıyla 10 dakika, 30 dakika, 60 dakika, 90 dakika, 120 dakika, 180 dakika ve 240 dakika BOS ve kan numunelerinde yapıldı.Seçilen iki dalın ayrı ayrı depolandığı ve ilk üç seçim turu sırasında analiz edildiği toplam dört tur in vivo kaydırma gerçekleştirildi.Seçimin ilk iki turundan CSF'den ekstrakte edilen tüm faj ekleri, 454/Roche pyrosequencing'e tabi tutulurken, son iki seçim turundan CSF'den ekstrakte edilen tüm klonlar manuel olarak sekanslandı.İlk seçim turundaki tüm kan fajları da 454/Roche pyrosequencing'e tabi tutuldu.Faj klonlarının enjeksiyonu için seçilen fajlar, 37°C'de 4 saat boyunca 500 cm2'lik plakalar üzerinde E. coli (BL5615) içinde büyütüldü.Bireysel olarak seçilen ve manuel olarak sıralanan klonlar, TB ortamında çoğaltıldı.Faj ekstraksiyonundan, saflaştırılmasından ve endotoksinin uzaklaştırılmasından (yukarıda tarif edildiği gibi), 300 ul içinde 2x1010 faj/hayvan bir kuyruk damarına intravenöz olarak enjekte edildi.
Sekans verilerinin ön işlemesi ve kalitatif filtrelemesi.Ham 454/Roche verileri, satıcı yazılımı kullanılarak bir ikili standart akış haritası formatından (sff) bir Pearson insan tarafından okunabilir formata (fasta) dönüştürüldü.Nükleotit dizisinin daha fazla işlenmesi, aşağıda açıklandığı gibi tescilli C programları ve betikleri (yayınlanmamış yazılım paketi) kullanılarak gerçekleştirildi.Birincil verilerin analizi, katı çok aşamalı filtreleme prosedürlerini içerir.Geçerli bir 12mer ekleme DNA dizisi içermeyen okumaları filtrelemek için okumalar, global Needleman-Wunsch testi kullanılarak başlangıç ​​etiketine (GTGATGTCGGGGATCCGAATTCT), durdurma etiketine (TAAGCTTGCGGCCGCACTCGAGTA) ve arka plan eklemesine (CCCTGCAGGGATATCCCGGGAGTCCGTCGAC) sırayla hizalandı.Hizalama başına 2 adede kadar tutarsızlığa izin veren hizalama31.Bu nedenle, başlatma ve durdurma etiketleri olmayan okumalar ve arka plan ekleri içeren okumalar, yani izin verilen uyumsuzluk sayısını aşan hizalamalar, kitaplıktan kaldırıldı.Kalan okumalara gelince, başlangıç ​​işaretinden uzanan ve durma işaretinden önce biten N-mer DNA dizisi, orijinal okuma dizisinden çıkarıldı ve daha fazla işlendi (bundan böyle "insert" olarak anılacaktır).Ekin çevrilmesinden sonra, primerin 5' ucundaki birinci durdurma kodonundan sonraki kısım, ekten çıkarılır.Ek olarak, primerin 3' ucundaki eksik kodonlara yol açan nükleotidler de çıkarıldı.Yalnızca arka plan dizilerini içeren ekleri hariç tutmak için, amino asit modeli "PAG" ile başlayan çevrilmiş ekler de çıkarıldı.Translasyon sonrası uzunluğu 3 amino asitten az olan peptidler kütüphaneden çıkarıldı.Son olarak, ekleme havuzundaki fazlalığı kaldırın ve her benzersiz eklemenin frekansını belirleyin.Bu analizin sonuçları, nükleotit dizilerinin (ekler) ve bunların (okuma) frekanslarının bir listesini içeriyordu (Ek Şekiller 1c ve 2).
Dizi benzerliğine göre grup N-mer DNA ekleri: 454/Roche'a özgü dizileme hatalarını (homopolimer uzantılarının dizilişindeki problemler gibi) ortadan kaldırmak ve daha az önemli fazlalıkları ortadan kaldırmak için önceden filtrelenmiş N-mer DNA dizisi ekleri (insertler) benzerliğe göre sıralanır.aşağıdaki şekilde tanımlanan yinelemeli bir algoritma kullanılarak eklemeler (2 adede kadar eşleşmeyen tabana izin verilir): eklemeler önce frekanslarına göre (en yüksekten en düşüğe) ve aynılarsa ikincil uzunluklarına göre (en uzundan en kısaya) sıralanır.Böylece en sık ve en uzun eklemeler ilk “grubu” tanımlar.Grup frekansı, anahtar frekansına ayarlanır.Daha sonra sıralanan listede kalan her ekleme, ikili Needleman-Wunsch dizilimi ile gruba eklenmeye çalışılmıştır.Bir hizalamadaki uyumsuzlukların, eklemelerin veya silmelerin sayısı 2 eşiğini geçmiyorsa, gruba bir ekleme eklenir ve eklemenin eklenme sıklığına göre genel grup sıklığı artar.Bir gruba eklenen ekler, kullanılmış olarak işaretlenir ve sonraki işlemlerden çıkarılır.Ekleme dizisi zaten var olan bir gruba eklenemezse, ekleme dizisi uygun ekleme frekansıyla yeni bir grup oluşturmak için kullanılır ve kullanılmış olarak işaretlenir.Yineleme, her ekleme dizisi yeni bir grup oluşturmak için kullanıldığında veya zaten var olan bir gruba dahil edilebildiğinde sona erer.Ne de olsa, nükleotitlerden oluşan gruplandırılmış ekler, sonunda peptit dizilerine (peptit kütüphaneleri) çevrilir.Bu analizin sonucu, ardışık okuma sayısını oluşturan bir dizi ekleme ve bunlara karşılık gelen frekanslardır (Ek Şekil 2).
Motif Oluşturma: Eşsiz peptitlerin bir listesine dayanarak, aşağıda gösterildiği gibi tüm olası amino asit modellerini (aa) içeren bir kitaplık oluşturuldu.3 uzunluğundaki her olası model peptitten çıkarıldı ve bunun ters modeli, tüm modelleri (tripeptitler) içeren ortak bir motif kitaplığı ile birlikte eklendi.Yüksek oranda tekrar eden motiflerden oluşan kitaplıklar sıralandı ve fazlalık kaldırıldı.Ardından, motif kütüphanesindeki her bir tripeptit için, hesaplama araçlarını kullanarak kütüphanedeki varlığını kontrol ettik.Bu durumda, bulunan motif tripeptitini içeren peptidin frekansı eklenir ve motif kütüphanesindeki motife atanır (“motif sayısı”).Motif oluşturmanın sonucu, tripeptitlerin (motiflerin) tüm oluşumlarını ve okumalar filtrelendiğinde, gruplandığında ve çevrildiğinde karşılık gelen motifle sonuçlanan sıralama okumalarının sayısı olan ilgili değerlerini içeren iki boyutlu bir dizidir.Metrikler yukarıda ayrıntılı olarak açıklandığı gibidir.
Motif sayısının normalleştirilmesi ve karşılık gelen dağılım grafikleri: Her numune için motif sayısı, kullanılarak normalleştirildi.
ni, i konusunu içeren okuma sayısıdır.Böylece vi, örnekte i motifi içeren okumaların (veya peptitlerin) yüzde frekansını temsil eder.Normalleştirilmemiş motif sayısı için P değerleri, Fisher'in kesin testi kullanılarak hesaplandı.Motif sayısının korelogramlarına ilişkin olarak, Spearman'ın korelasyonları, R ile normalize edilmiş motif sayısı kullanılarak hesaplanmıştır.
Peptit kütüphanesindeki her bir pozisyondaki amino asitlerin içeriğini görselleştirmek için web logogramları 32, 33 (http://weblogo.threeplusone.com) yaratıldı.İlk olarak, 12-mer peptidin her pozisyonundaki amino asitlerin içeriği, 20x12'lik bir matriste depolanır.Daha sonra, her pozisyonda aynı nispi amino asit içeriğini içeren 1000 peptitlik bir dizi fasta-dizi formatında üretilir ve her pozisyonda nispi amino asit içeriğinin grafiksel bir temsilini oluşturan web-logo 3'e girdi olarak sağlanır.belirli bir peptit kitaplığı için.Çok boyutlu veri kümelerini görselleştirmek için, R'de dahili olarak geliştirilmiş bir araç (biosHeatmap, henüz piyasaya sürülmemiş bir R paketi) kullanılarak ısı haritaları oluşturuldu.Isı haritalarında sunulan dendrogramlar, Öklid mesafe metriği ile Ward'ın hiyerarşik kümeleme yöntemi kullanılarak hesaplandı.Motif puanlama verilerinin istatistiksel analizi için, normalleştirilmemiş puanlama için P değerleri Fisher'in kesin testi kullanılarak hesaplandı.Diğer veri kümeleri için P değerleri, Student t testi veya ANOVA kullanılarak R'de hesaplandı.
Seçilmiş faj klonları ve eksiz fajlar, kuyruk damarından intravenöz olarak enjekte edildi (300 ul PBS içinde 2 x 1010 faj/hayvan).Perfüzyondan ve müteakip fiksasyondan on dakika önce, aynı hayvanlara intravenöz olarak 100 ul DyLight594 etiketli lektin (Vector Laboratories Inc., DL-1177) enjekte edildi.Faj enjeksiyonundan 60 dakika sonra, sıçanların kalpleri 50 ml PBS ve ardından 50 ml %4 PFA/PBS ile perfüze edildi.Beyin örnekleri ayrıca gece boyunca %4 PFA/PBS içinde sabitlendi ve gece boyunca 4°C'de %30 sükroz içinde ıslatıldı.Numuneler OCT karışımında hızlı dondurulur.Dondurulmuş numunelerin immünohistokimyasal analizi, oda sıcaklığında %1 BSA ile bloke edilen ve 4 °C'de T7 fajına (Novus NB 600-376A) karşı poliklonal FITC etiketli antikorlarla inkübe edilen 30 um kriyoseksiyonlar üzerinde gerçekleştirildi.Bir gecede inkübe edin.Son olarak kesitler 3 kez PBS ile yıkandı ve konfokal lazer mikroskobu (Leica TCS SP5) ile incelendi.
Minimum %98 saflığa sahip tüm peptitler, GenScript USA tarafından sentezlendi, biyotinlendi ve liyofilize edildi.Biyotin, N-terminalinde ek bir üçlü glisin ara parçası aracılığıyla bağlanır.Kütle spektrometresi kullanarak tüm peptitleri kontrol edin.
Streptavidin (Sigma S0677), 5 kat eşmolar fazla biyotinlenmiş peptid, biyotinlenmiş BACE1 inhibe edici peptid veya %5-10 DMSO/PBS içinde inkübe edilmiş biyotinlenmiş BACE1 inhibe edici peptid ve BACE1 inhibe edici peptidin bir kombinasyonu (3:1 oran) ile karıştırılmıştır.Enjeksiyondan önce oda sıcaklığında 1 saat.Streptavidin-konjuge peptidler, beyin boşluğu olan sıçanların kuyruk damarlarından birine 10 mg/kg'lık bir dozda intravenöz olarak enjekte edildi.
Streptavidin-peptit komplekslerinin konsantrasyonu ELISA ile değerlendirildi.Nunc Maxisorp mikrotitre plakaları (Sigma), gece boyunca 4°C'de 1.5 ug/ml fare anti-streptavidin antikoru (Thermo, MA1-20011) ile kaplandı.2 saat oda sıcaklığında bloke ettikten sonra (bloklama tamponu: 140 nM NaCL, 5 mM EDTA, %0,05 NP40, %0,25 jelatin, %1 BSA), plakayı %0,05 Tween-20/PBS (yıkama tamponu) ile 3 saniye yıkayın, CSF ve plazma numuneleri, bloke edici tampon (plazma 1:10,000, CSF 1:11) ile seyreltilmiş kuyucuklara eklendi 5).Plaka daha sonra tespit antikoru (1 ug/ml, anti-streptavidin-HRP, Novus NB120-7239) ile 4°C'de gece boyunca inkübe edildi.Üç yıkama adımından sonra streptavidin, TMB substrat solüsyonunda (Roche) 20 dakikaya kadar inkübasyonla saptandı.1M H2SO4 ile renk gelişimini durdurduktan sonra 450 nm'de absorbansı ölçün.
Streptavidin-peptit-BACE1 inhibitör kompleksinin işlevi, üreticinin protokolüne (Wako, 294-64701) göre Ap(1-40) ELISA ile değerlendirildi.Kısaca, CSF numuneleri standart seyreltici (1:23) içinde seyreltildi ve BNT77 yakalama antikoru ile kaplı 96 oyuklu plakalarda 4°C'de gece boyunca inkübe edildi.Beş yıkama adımından sonra HRP-konjuge BA27 antikoru ilave edildi ve 2 saat 4°C'de inkübe edildi, ardından beş yıkama adımı geldi.Aβ(1-40), oda sıcaklığında 30 dakika boyunca TMB solüsyonunda inkübasyonla saptandı.Durdurma solüsyonu ile renk gelişimi durdurulduktan sonra, 450 nm'de absorbansı ölçün.Plazma numuneleri, Aβ(1–40) ELISA'dan önce katı faz ekstraksiyonuna tabi tutuldu.Plazma, 96 oyuklu plakalarda %0.2 DEA'ya (Sigma) eklendi ve oda sıcaklığında 30 dakika inkübe edildi.SPE plakalarının (Oasis, 186000679) art arda su ve %100 metanol ile yıkanmasından sonra, SPE plakalarına plazma numuneleri eklendi ve tüm sıvı çıkarıldı.Numuneler yıkandı (önce %5 metanol, ardından %30 metanol ile) ve %2 NH4OH/%90 metanol ile yıkandı.Eluatı 55°C'de 99 dakika boyunca sabit N2 akımında kuruttuktan sonra, numuneler standart seyrelticilere indirgendi ve Aβ(1-40) yukarıda açıklandığı gibi ölçüldü.
Bu makaleden nasıl alıntı yapılır: Urich, E. ve ark.İn vivo olarak tanımlanan transit peptitleri kullanarak beyne kargo teslimi.Bilim.5, 14104;doi:10.1038/srep14104 (2015).
Likhota J., Skjorringe T., Thomsen LB ve Moos T. Makromoleküler ilaçların hedefli terapi kullanılarak beyne verilmesi.Journal of Neurochemistry 113, 1–13, 10.1111/j.1471-4159.2009.06544.x (2010).
Brasnjevic, I., Steinbusch, HW, Schmitz, C. ve Martinez-Martinez, P. Kan-beyin bariyerinden peptid ve protein ilaçlarının verilmesi.Prog Neurobiol 87, 212–251, 10.1016/j.pneurobio.2008.12.002 (2009).
Pardridge, WM Kan-beyin bariyeri: beyin ilacı geliştirmede bir darboğaz.NeuroRx 2, 3–14, 10.1602/neurorx.2.1.3 (2005).
Johanson, KE, Duncan, JA, Stopa, EG ve Byrd, A. Geliştirilmiş ilaç dağıtımı ve koroid pleksus-CSF yolu yoluyla beyne hedefleme beklentileri.Farmasötik Araştırma 22, 1011–1037, 10.1007/s11095-005-6039-0 (2005).
Pardridge, WM Beyin teslimi için moleküler Truva atları ile biyofarmasötiklerin modernizasyonu.Bioconjug Chem 19, 1327–1338, 10.1021/bc800148t (2008).
Pardridge, WM reseptör aracılı peptit kan-beyin bariyeri boyunca taşınır.Endocr Rev.7, 314–330 (1986).
Niewoehner, J. ve ark.Tek değerli moleküler mekikleri kullanarak beyin penetrasyonunu ve terapötik antikorların etkinliğini artırın.Neuron 81, 49–60, 10.1016/j.neuron.2013.10.061 (2014).
Bien-Lee, N. ve ark.Transferrin reseptörü (TfR) taşıması, TfR antikorlarının afinite varyantlarının beyin alımını belirler.J Exp Med 211, 233–244, 10.1084/jem.20131660 (2014).