Bazı LC sorun giderme konuları asla güncelliğini yitirmez, çünkü cihaz teknolojisi zamanla gelişse bile LC uygulamasında sorunlar vardır. Bir LC sisteminde sorunların ortaya çıkmasının ve kötü tepe şekliyle sonuçlanmasının birçok yolu vardır. Tepe şekliyle ilgili sorunlar ortaya çıktığında, bu sonuçlara ilişkin olası nedenlerin kısa bir listesi sorun giderme deneyimimizi basitleştirmeye yardımcı olur.
Bu "LC Sorun Giderme" sütununu yazmak ve her ay konular hakkında düşünmek eğlenceliydi, çünkü bazı konular asla modası geçmez. Kromatografi araştırma alanında belirli konular veya fikirler, daha yeni ve daha iyi fikirler tarafından yer değiştirildiği için modası geçmiş hale gelirken, sorun giderme alanında, bu dergide (o zamanlar LC Dergisi) ilk sorun giderme makalesi yayınlandığından beri (bazı konular hala geçerli olduğundan) 1983'te(1). Geçtiğimiz birkaç yıl içinde, birkaç LC Sorun Giderme bölümünü sıvı kromatografisini (LC) etkileyen çağdaş eğilimlere odakladım (örneğin, basıncın tutma üzerindeki etkisine dair anlayışımızın göreceli karşılaştırması [2] Yeni Gelişmeler) LC sonuçlarının yorumlanması ve modern LC cihazlarıyla sorun giderme. Bu ayki bölümde, Aralık 2021'de başlayan ve LC sorun gidermenin "yaşam ve ölüm" konularından bazılarını ele alan (3) serime devam ediyorum; kullandığımız sistemin yaşı ne olursa olsun, herhangi bir sorun giderici için harika olan unsurlar esastır. Temel Bu serinin konusu, birçok laboratuvarda asılı duran LCGC'nin ünlü "LC Sorun Giderme Kılavuzu" duvar çizelgesi (4) ile oldukça alakalıdır. Bu serinin üçüncü bölümünde, tepe şekli veya tepe özellikleriyle ilgili sorunlara odaklanmayı seçtim. İnanılmaz bir şekilde, duvar çizelgesi zayıf tepe şeklinin 44 farklı olası nedenini listeliyor! Bu sorunların hepsini tek bir makalede ayrıntılı olarak ele alamayız, bu nedenle konuyla ilgili bu ilk bölümde en sık gördüğüm bazı sorunlara odaklanacağım. Genç ve yaşlı LC kullanıcılarının bu önemli konu hakkında bazı yararlı ipuçları ve hatırlatıcılar bulacağını umuyorum.
Kendimi sorun giderme sorularını giderek daha fazla "her şey mümkün" şeklinde yanıtlarken buluyorum. Yorumlanması zor gözlemler göz önünde bulundurulduğunda bu yanıt kolay görünebilir, ancak bunu genellikle uygun buluyorum. Zayıf tepe şeklinin birçok olası nedeni olduğundan, sorunun ne olabileceğini düşünürken açık fikirli olmak ve sorun giderme çabalarımıza başlamak için olası nedenleri öncelik sırasına koyabilmek, en yaygın olasılıklara odaklanmak önemlidir, bu nokta çok önemlidir.
Herhangi bir sorun giderme egzersizindeki önemli bir adım — ancak bence hafife alınan bir adım — çözülmesi gereken bir sorun olduğunu kabul etmektir. Bir sorun olduğunu kabul etmek, genellikle araca olanların teori, ampirik bilgi ve deneyim tarafından şekillendirilen beklentilerimizden farklı olduğunu kabul etmek anlamına gelir (5). Burada bahsedilen "zirve şekli" aslında yalnızca zirvenin şekline (simetrik, asimetrik, pürüzsüz, kabarık, ön kenar, kuyruk vb.) değil, aynı zamanda genişliğe de atıfta bulunur. Gerçek zirve şekline ilişkin beklentilerimiz basittir. Teori (6), çoğu durumda kromatografik zirvelerin simetrik olması ve Şekil 1a'da gösterildiği gibi bir Gauss dağılımının şekline uyması gerektiği yönündeki ders kitabı beklentisini iyi destekler. Zirve genişliklerinden beklediğimiz şey daha karmaşık bir konudur ve bu konuyu gelecekteki bir makalede tartışacağız. Şekil 1'deki diğer zirve şekilleri, gözlemlenebilecek diğer olasılıklardan bazılarını gösterir; başka bir deyişle, işlerin ters gidebileceği bazı yollar. Bu bölümün geri kalanında, Bu şekil tiplerine yol açabilecek bazı özel durum örneklerini tartışmaya zaman ayıracağız.
Bazen kromatogramda, elüsyona uğramaları beklenirken, tepe noktaları hiç gözlemlenmez. Yukarıdaki duvar çizelgesi, bir tepe noktasının yokluğunun (numunenin aslında hedef analiti, dedektör tepkisinin onu gürültünün üzerinde görebilmesi için yeterli olması gereken bir konsantrasyonda içerdiğini varsayarak) genellikle bazı cihaz sorunlarıyla veya yanlış mobil faz koşullarıyla (eğer gözlemlenirse) ilişkili olduğunu gösterir. Tepe noktaları, genellikle çok "zayıf"). Bu kategorideki olası sorunların ve çözümlerin kısa bir listesi Tablo I'de bulunabilir.
Yukarıda belirtildiği gibi, dikkat edip düzeltmeye çalışmadan önce ne kadar tepe genişlemesine tahammül edilmesi gerektiği sorusu, gelecekteki bir makalede tartışacağım karmaşık bir konudur. Deneyimime göre, önemli tepe genişlemesine genellikle tepe biçiminde önemli bir değişiklik eşlik eder ve tepe kuyruğu, tepe öncesi veya bölünmeden daha yaygındır. Ancak, nominal olarak simetrik tepeler de genişler ve bu birkaç farklı nedenden kaynaklanabilir:
Bu sorunların her biri Troubleshooting LC'nin önceki sayılarında ayrıntılı olarak ele alınmıştır ve bu konularla ilgilenen okuyucular bu sorunların temel nedenleri ve olası çözümleri hakkında bilgi edinmek için bu önceki makalelere başvurabilirler. Daha fazla ayrıntı.
Tepe kuyruklanması, tepe öne çıkması ve bölünmenin hepsi kimyasal veya fiziksel olaylardan kaynaklanabilir ve bu sorunlara yönelik olası çözümlerin listesi, kimyasal veya fiziksel bir sorunla karşı karşıya olmamıza bağlı olarak büyük ölçüde değişir. Genellikle, bir kromatogramdaki farklı tepeleri karşılaştırarak, suçlunun hangisi olduğuna dair önemli ipuçları bulabilirsiniz. Bir kromatogramdaki tüm tepeler benzer şekiller sergiliyorsa, neden büyük olasılıkla fiziksel değildir. Yalnızca bir veya birkaç tepe etkilenmişse, ancak geri kalanı iyi görünüyorsa, neden büyük olasılıkla kimyasaldır.
Pik kuyruğunun kimyasal nedenleri burada kısaca tartışmak için çok karmaşıktır. İlgilenen okuyucu daha derinlemesine bir tartışma için yakın zamanda yayınlanan “LC Sorun Giderme” sayısına yönlendirilebilir (10). Ancak, denenmesi kolay bir şey, enjekte edilen analitin kütlesini azaltmak ve pik şeklinin iyileşip iyileşmediğine bakmaktır. Eğer öyleyse, bu sorunun “kütle aşırı yüklenmesi” olduğuna dair iyi bir ipucudur. Bu durumda, yöntem küçük analit kütlelerinin enjekte edilmesiyle sınırlı olmalı veya kromatografik koşullar değiştirilmeli, böylece daha büyük kütleler enjekte edildiğinde bile iyi pik şekilleri elde edilebilir.
Tepe kuyruğu için birçok potansiyel fiziksel neden de vardır. Olasılıkların ayrıntılı bir tartışmasıyla ilgilenen okuyucular, "LC Troubleshooting"in (11) başka bir yakın tarihli sayısına yönlendirilebilir. Tepe kuyruğunun daha yaygın fiziksel nedenlerinden biri, enjektör ve dedektör arasındaki bir noktadaki zayıf bağlantıdır (12). Birkaç hafta önce laboratuvarımda elde ettiğim aşırı bir örnek, Şekil 1d'de gösterilmektedir. Bu durumda, daha önce kullanmadığımız yeni bir enjeksiyon valfi ile bir sistem oluşturduk ve paslanmaz çelik bir kılcal boruya kalıplanmış bir ferül ile küçük hacimli bir enjeksiyon halkası yerleştirdik. Bazı ilk sorun giderme deneylerinden sonra, enjeksiyon valfi statorundaki port derinliğinin alıştığımızdan çok daha derin olduğunu ve bunun da portun alt kısmında büyük bir ölü hacimle sonuçlandığını fark ettik. Bu sorun, enjeksiyon halkasını başka bir tüple değiştirerek kolayca çözülebilir, ferülü, portun alt kısmındaki ölü hacmi ortadan kaldırmak için uygun konuma ayarlayabiliriz.
Şekil 1e'de gösterilenlere benzer tepe cepheleri fiziksel veya kimyasal problemlerden de kaynaklanabilir. Ön kenarın yaygın bir fiziksel nedeni, kolonun parçacık yatağının iyi paketlenmemiş olması veya parçacıkların zamanla yeniden düzenlenmiş olmasıdır. Bu fiziksel olgunun neden olduğu tepe kuyruğunda olduğu gibi, bunu düzeltmenin en iyi yolu kolonu değiştirmek ve devam etmektir. Temelde, kimyasal kökenli ön kenar tepe şekilleri genellikle "doğrusal olmayan" tutma koşulları dediğimiz şeyden kaynaklanır. İdeal (doğrusal) koşullar altında, sabit faz tarafından tutulan analit miktarı (dolayısıyla tutma faktörü) kolondaki analit konsantrasyonuyla doğrusal olarak ilişkilidir. Kromatografik olarak, bu, kolona enjekte edilen analit kütlesi arttıkça tepenin daha uzun, ancak daha geniş olmadığı anlamına gelir. Tutma davranışı doğrusal olmadığında bu ilişki bozulur ve tepeler yalnızca daha uzun olmakla kalmaz, aynı zamanda daha fazla kütle enjekte edildikçe daha da genişler. Ek olarak, doğrusal olmayan şekiller kromatografik tepelerin şeklini belirler ve bu da ön veya arka kenarlarla sonuçlanır. Tepe kuyruğuna neden olan kütle aşırı yüklenmesi (10), doğrusal olmayan tutulmadan kaynaklanan tepe öncülüğü de enjekte edilen analit kütlesinin azaltılmasıyla teşhis edilebilir. Tepe şekli iyileşirse, yöntem öncü kenara neden olan enjeksiyon kalitesini aşmayacak şekilde değiştirilmeli veya bu davranışı en aza indirmek için kromatografik koşullar değiştirilmelidir.
Bazen, Şekil 1f'de gösterildiği gibi, "bölünmüş" bir tepe gibi görünen bir şey gözlemleriz. Bu problemi çözmedeki ilk adım, tepe şeklinin kısmi eş-elüsyondan (yani, iki ayrı ancak yakından elüsyon yapan bileşiğin varlığından) kaynaklanıp kaynaklanmadığını belirlemektir. Gerçekten birbirine yakın elüsyon yapan iki farklı analit varsa, bu, çözünürlüklerini iyileştirme meselesidir (örneğin, seçiciliği, tutmayı veya plaka sayısını artırarak) ve görünen "bölünmüş" tepeler fiziksel performansla ilgilidir. Performansın kolonun kendisiyle hiçbir ilgisi yoktur. Genellikle, bu karara ilişkin en önemli ipucu, kromatogramdaki tüm tepelerin bölünmüş şekiller mi yoksa sadece bir veya iki tane mi sergilediğidir. Sadece bir veya iki taneyse, muhtemelen bir eş-elüsyon sorunudur; tüm tepeler bölünmüşse, büyük olasılıkla kolonun kendisiyle ilgili fiziksel bir sorundur.
Kolonun fiziksel özellikleriyle ilgili bölünmüş tepeler genellikle kısmen tıkalı giriş veya çıkış fritlerinden veya kolondaki parçacıkların yeniden düzenlenmesinden kaynaklanır ve bu da mobil fazın kolon kanalı oluşumunun belirli alanlarında mobil fazdan daha hızlı akmasına izin verir. Diğer bölgelerde (11). Kısmen tıkalı frit bazen kolondaki akışın tersine çevrilmesiyle temizlenebilir; ancak benim deneyimime göre bu genellikle uzun vadeli bir çözümden ziyade kısa vadeli bir çözümdür. Parçacıklar kolon içinde yeniden birleşirse bu durum modern kolonlarda sıklıkla ölümcüldür. Bu noktada, kolonu değiştirmek ve devam etmek en iyisidir.
Şekil 1g'deki tepe noktası, yine kendi laboratuvarımda yakın zamanda gerçekleşen bir örnekten, genellikle sinyalin tepki aralığının yüksek ucuna ulaştığı kadar yüksek olduğunu gösterir. Optik absorbans dedektörleri için (bu durumda UV-vis), analit konsantrasyonu çok yüksek olduğunda, analit dedektör akış hücresinden geçen ışığın çoğunu emer ve algılanacak çok az ışık bırakır. Bu koşullar altında, fotodedektörden gelen elektrik sinyali, kaçak ışık ve "karanlık akım" gibi çeşitli gürültü kaynaklarından büyük ölçüde etkilenir ve bu da sinyali görünüşte çok "bulanık" hale getirir ve analit konsantrasyonundan bağımsızdır. Bu olduğunda, sorun genellikle analitin enjeksiyon hacmini azaltarak kolayca çözülebilir - enjeksiyon hacmini azaltarak, numuneyi seyrelterek veya her ikisini birden yaparak.
Kromatografi okulunda, numunedeki analit konsantrasyonunun bir göstergesi olarak dedektör sinyalini (yani, kromatogramdaki y eksenini) kullanırız. Bu nedenle, sıfırın altında bir sinyale sahip bir kromatogram görmek garip görünür, çünkü basit yorumlama, bunun negatif bir analit konsantrasyonunu gösterdiğidir - ki bu elbette fiziksel olarak mümkün değildir. Benim deneyimime göre, negatif tepeler genellikle optik absorbans dedektörleri (örneğin, UV-vis) kullanıldığında gözlemlenir.
Bu durumda, negatif bir tepe basitçe kolondan çıkan moleküllerin tepe noktasından hemen önce ve sonra mobil fazın kendisinden daha az ışık emdiği anlamına gelir. Bu, örneğin, nispeten düşük tespit dalga boyları (<230 nm) ve bu dalga boylarındaki ışığın çoğunu emen mobil faz katkı maddeleri kullanıldığında meydana gelebilir. Bu tür katkı maddeleri, metanol gibi mobil faz çözücü bileşenleri veya asetat veya format gibi tampon bileşenleri olabilir. Aslında, bir kalibrasyon eğrisi hazırlamak ve doğru nicel bilgi elde etmek için negatif tepeler kullanılabilir, bu nedenle bunlardan başlı başına kaçınmak için temel bir neden yoktur (bu yöntem bazen "dolaylı UV tespiti" olarak adlandırılır) (13). Bununla birlikte, absorbans tespiti durumunda negatif tepelerden gerçekten tamamen kaçınmak istiyorsak, en iyi çözüm, analitin mobil fazdan daha fazlasını emmesi için farklı bir tespit dalga boyu kullanmak veya mobil fazın bileşimini, analitlerden daha az ışık emecek şekilde değiştirmektir.
Numunedeki analit dışındaki bileşenlerin kırılma indisi, örneğin çözücü matrisi, hareketli fazın kırılma indisinden farklı olduğunda kırılma indisi (RI) tespiti kullanıldığında da negatif tepeler ortaya çıkabilir. Bu durum UV-vis tespitinde de gerçekleşir, ancak bu etkinin RI tespitine göre zayıflama eğilimi vardır. Her iki durumda da negatif tepeler, numune matrisinin bileşiminin hareketli fazın bileşimine daha yakın eşleştirilmesiyle en aza indirilebilir.
LC arıza gidermenin temel konusu olan üçüncü bölümde, gözlemlenen tepe şeklinin beklenen veya normal tepe şeklinden farklı olduğu durumları ele aldım. Bu tür sorunların etkili bir şekilde giderilmesi, beklenen tepe şekillerinin bilgisiyle başlar (teoriye veya mevcut yöntemlerle ilgili önceki deneyimlere dayanarak), bu nedenle bu beklentilerden sapmalar açıktır. Tepe şekli sorunlarının birçok farklı potansiyel nedeni vardır (çok geniş, kuyruk, ön kenar, vb.). Bu bölümde, en sık gördüğüm nedenlerden bazılarını ayrıntılı olarak tartışıyorum. Bu ayrıntıları bilmek, sorun gidermeye başlamak için iyi bir yer sağlar, ancak tüm olasılıkları kapsamaz. Nedenler ve çözümler hakkında daha derinlemesine bir listeyle ilgilenen okuyucular, LCGC “LC Arıza Giderme Kılavuzu” duvar tablosuna başvurabilirler.
(4) LCGC “LC Sorun Giderme Kılavuzu” duvar şeması. https://www.chromatographyonline.com/view/troubleshooting-wallchart (2021).
(6) A. Felinger, Kromatografide Veri Analizi ve Sinyal İşleme (Elsevier, New York, NY, 1998), s. 43-96.
(8) Wahab MF, Dasgupta PK, Kadjo AF ve Armstrong DW, Anal.Chim.Journal.Rev. 907, 31–44 (2016).https://doi.org/10.1016/j.aca.2015.11.043.