Enstrüman teknolojisi zaman içinde gelişse bile LC uygulamasında sorunlar olduğu için bazı LC sorun giderme konuları hiçbir zaman güncelliğini yitirmez. Bir LC sisteminde sorunların ortaya çıkabileceği ve zayıf pik şekliyle sonuçlanabileceği birçok yol vardır. Pik şekliyle ilgili sorunlar ortaya çıktığında, bu sonuçların olası nedenlerinin kısa bir listesi sorun giderme deneyimimizi basitleştirmemize yardımcı olur.
Bu "LC Sorun Giderme" sütununu yazmak ve her ay konuları düşünmek eğlenceliydi, çünkü bazı konuların modası asla geçmiyor. Kromatografi araştırmaları alanında belirli konular veya fikirler, 1983'te bu dergide (o sırada LC Dergisi) yayınlanan ilk sorun giderme makalesinden bu yana, sorun giderme alanında daha yeni ve daha iyi fikirlerin yerini alarak geçersiz hale geliyor. sıvı kromatografisini (LC) etkileyen çağdaş trendlere ilişkin bölümler (örneğin, basıncın retansiyon üzerindeki etkisine ilişkin anlayışımızın göreceli karşılaştırması [2] Yeni Gelişmeler) LC sonuçlarını yorumlamamız ve modern LC cihazlarıyla nasıl sorun giderileceği. Bu serinin konusu, LCGC'nin birçok laboratuvarda asılı olan ünlü “LC Sorun Giderme Kılavuzu” duvar şemasıyla (4) oldukça alakalı. Bu serinin üçüncü bölümünde, tepe şekli veya tepe özellikleriyle ilgili konulara odaklanmayı seçtim. İnanılmaz bir şekilde, duvar şeması zayıf tepe şeklinin 44 farklı potansiyel nedenini listeliyor! Bu sorunların hepsini tek bir makalede ayrıntılı olarak ele alamayız, bu nedenle konuyla ilgili bu ilk bölümde en sık gördüğüm bazılarına odaklanacağım.Umarım genç ve yaşlı LC kullanıcıları bu önemli konuyla ilgili bazı yararlı ipuçları ve hatırlatmalar bulacaksınız.
Kendimi giderek artan bir şekilde "her şey mümkün" şeklinde sorun giderme sorularına yanıt verirken buluyorum. Yorumlanması zor gözlemler göz önüne alındığında bu yanıt kolay görünebilir, ancak genellikle uygun buluyorum. Kötü tepe şeklinin birçok olası nedeni söz konusu olduğunda, sorunun ne olabileceğini düşünürken açık fikirli olmak ve sorun giderme çabalarımıza başlamak için olası nedenleri öncelik sırasına koyabilmek, bu en yaygın olasılıklara odaklanarak bu nokta çok önemlidir.mümkün.
Herhangi bir sorun giderme alıştırmasında önemli bir adım - ancak bunun hafife alındığını düşünüyorum - çözülmesi gereken bir sorun olduğunu kabul etmektir. Bir sorun olduğunu kabul etmek genellikle araca olan şeyin teori, ampirik bilgi ve deneyimle şekillenen beklentilerimizden farklı olduğunu kabul etmek anlamına gelir (5). Burada bahsedilen "zirve şekli" aslında yalnızca zirvenin şeklini (simetrik, asimetrik, pürüzsüz, kabarık, ön kenar, kuyruk vb.) ayrıca genişliğe ilişkin beklentilerimiz basittir. Teori (6), çoğu durumda kromatografik tepe noktalarının simetrik olması ve Şekil 1a'da gösterildiği gibi bir Gauss dağılımının şekline uyması gerektiği şeklindeki ders kitabı beklentisini destekler. Pik genişliklerinden ne beklediğimiz daha karmaşık bir konudur ve bu konuyu gelecekteki bir makalede tartışacağız. Bu bölümde, bu şekil tiplerine yol açabilecek bazı özel durum örneklerini tartışarak zaman harcayacağız.
Bazen kromatogramda ayrıştırılmalarının beklendiği pikler hiç gözlenmez. Yukarıdaki duvar tablosu, bir pik olmamasının (örneğin, hedef analiti, dedektör tepkisini gürültünün üzerinde görmek için yeterli kılacak bir konsantrasyonda gerçekten içerdiğini varsayarsak) genellikle bazı cihaz sorunlarıyla veya yanlış mobil faz koşullarıyla (eğer gözlemlenirse) ilişkilidir.zirveler, genellikle çok "zayıf"). Bu kategorideki potansiyel sorunların ve çözümlerin kısa bir listesi Tablo I'de bulunabilir.
Yukarıda bahsedildiği gibi, dikkat edilmeden ve düzeltmeye çalışılmadan önce pik genişlemesinin ne kadar tolere edilmesi gerektiği sorusu, gelecekteki bir makalede tartışacağım karmaşık bir konudur. Deneyimlerime göre, önemli pik genişlemesine genellikle pik şeklinde önemli bir değişiklik eşlik eder ve pik kuyruğu, pik öncesi veya bölünmeden daha yaygındır. Ancak, nominal olarak simetrik pikler de genişler ve bunun birkaç farklı nedeni olabilir:
Bu sorunların her biri, Troubleshooting LC'nin önceki sayılarında ayrıntılı olarak ele alınmıştır ve bu konularla ilgilenen okuyucular, bu sorunların temel nedenleri ve olası çözümleri hakkında bilgi için bu önceki makalelere başvurabilir.Daha fazla detay.
Peak tailing, pik fronting ve splitting'in tümü kimyasal veya fiziksel olaylardan kaynaklanabilir ve bu sorunlara olası çözümlerin listesi, kimyasal mı yoksa fiziksel bir sorunla mı uğraştığımıza bağlı olarak büyük ölçüde değişir. Genellikle, bir kromatogramdaki farklı pikleri karşılaştırarak, suçlunun hangisi olduğuna dair önemli ipuçları bulabilirsiniz. Bir kromatogramdaki tüm pikler benzer şekiller sergiliyorsa, neden büyük ihtimalle fiziksel değildir.
Pik kuyruğunun kimyasal nedenleri burada kısaca tartışılamayacak kadar karmaşıktır. İlgili okuyucu, daha derinlemesine bir tartışma için "LC Troubleshooting"in son sayısına bakabilir (10). Bununla birlikte, denenmesi kolay bir şey, enjekte edilen analitin kütlesini azaltmak ve pik şeklinin iyileşip iyileşmediğine bakmaktır. Eğer öyleyse, bu, sorunun "kütlesel aşırı yüklenme" olduğuna dair iyi bir ipucudur. Bu durumda, yöntem, küçük analit kütleleri enjekte etmekle sınırlandırılmalı veya iyi pik şekillerinin elde edilmesi için kromatografik koşullar değiştirilmelidir enjekte edilen daha büyük kütlelerle bile elde edilebilir.
Pik kuyruk oluşumunun birçok potansiyel fiziksel nedeni de vardır. Olasılıkların ayrıntılı bir tartışmasıyla ilgilenen okuyucular, "LC Sorun Giderme"nin (11) yakın tarihli başka bir sayısına yönlendirilirler. Pik kuyruğunun en yaygın fiziksel nedenlerinden biri, enjektör ile dedektör arasındaki bir noktada zayıf bağlantıdır (12). Uç bir örnek, birkaç hafta önce laboratuvarımda elde edilen Şekil 1d'de gösterilmektedir. Bu durumda, daha önce kullanmadığımız yeni bir enjeksiyon valfi ile bir sistem kurduk ve yüksüklü küçük hacimli bir enjeksiyon döngüsü kurduk paslanmaz çelik bir kapiler üzerine kalıplanmıştı. İlk sorun giderme deneylerinden sonra, enjeksiyon valfi statorundaki bağlantı noktası derinliğinin alıştığımızdan çok daha derin olduğunu fark ettik ve bu da bağlantı noktasının altında büyük bir ölü hacme neden oldu. Bu sorun, enjeksiyon halkasını başka bir tüple değiştirerek kolayca çözülebilir, bağlantı noktasının altındaki ölü hacmi ortadan kaldırmak için halkayı uygun konuma ayarlayabiliriz.
Şekil 1e'de gösterilenler gibi pik cephelerine fiziksel veya kimyasal problemler de neden olabilir. Ön kenarın yaygın bir fiziksel nedeni, kolonun parçacık yatağının iyi paketlenmemiş olması veya parçacıkların zaman içinde yeniden organize edilmiş olmasıdır. Bu fiziksel fenomenin neden olduğu pik kuyruğunda olduğu gibi, bunu düzeltmenin en iyi yolu kolonu değiştirmek ve devam etmektir. durağan faz tarafından tutulan (dolayısıyla alıkonma faktörü), kolondaki analitin konsantrasyonu ile doğrusal olarak ilişkilidir. Kromatografik olarak bu, kolona enjekte edilen analitin kütlesi arttıkça tepe noktasının daha uzun olduğu ancak daha geniş olmadığı anlamına gelir. Bu ilişki, tutma davranışı doğrusal olmadığında bozulur ve daha fazla kütle enjekte edildikçe tepe noktaları sadece daha uzun değil aynı zamanda daha geniş hale gelir. Ek olarak, doğrusal olmayan şekiller, ön veya arka kenarlarla sonuçlanan kromatografik tepe noktalarının şeklini belirler. Kütle yüklenmesinde olduğu gibi Pik kuyruğuna neden olan (10), doğrusal olmayan alıkonmanın neden olduğu pik öndeliği, enjekte edilen analit kütlesinin azaltılmasıyla da teşhis edilebilir. Pik şekli iyileşirse, yöntem, ön kenara neden olan enjeksiyon kalitesini aşmayacak şekilde değiştirilmeli veya bu davranışı en aza indirmek için kromatografik koşullar değiştirilmelidir.
Bazen, Şekil 1f'de gösterildiği gibi, "bölünmüş" bir pik gibi görünen bir şey gözlemleriz. Bu sorunu çözmenin ilk adımı, pik şeklinin kısmi birlikte elüsyondan (yani, iki farklı fakat yakından yıkanan bileşiğin varlığından) kaynaklanıp kaynaklanmadığını belirlemektir. Aslında birbirine yakın elüsyon yapan iki farklı analit varsa, o zaman bu onların çözünürlüğünü artırma meselesidir (örneğin, seçiciliği, tutmayı veya plaka sayısını artırarak) ve görünen "bölünmüş" pikler fizikselle ilgilidir Performansın kolonun kendisiyle hiçbir ilgisi yoktur. Çoğu zaman, bu kararın en önemli ipucu, kromatogramdaki tüm piklerin bölünmüş şekiller mi yoksa yalnızca bir mi yoksa iki mi gösterdiğidir. Yalnızca bir veya iki ise, muhtemelen bir ortak elüsyon sorunudur;tüm zirveler bölünmüşse, bu büyük olasılıkla sütunun kendisiyle ilgili olan fiziksel bir sorundur.
Kolonun kendisinin fiziksel özellikleriyle ilgili bölünmüş pikler genellikle kısmen bloke edilmiş giriş veya çıkış fritlerinden veya kolondaki parçacıkların yeniden düzenlenmesinden kaynaklanır, bu da diğer bölgelerde (11) kolon kanalı oluşumunun belirli alanlarında mobil fazın mobil fazdan daha hızlı akmasına izin verir. Kısmen tıkanmış frit bazen kolondaki akışı tersine çevirerek temizlenebilir;ancak, deneyimlerime göre, bu genellikle uzun vadeli olmaktan çok kısa vadeli bir çözümdür. Parçacıklar kolon içinde yeniden birleşirse, modern kolonlarda bu genellikle ölümcüldür. Bu noktada, kolonu değiştirip devam etmek en iyisidir.
Yine kendi laboratuvarımdaki yakın tarihli bir örnekten alınan Şekil 1g'deki zirve, genellikle sinyalin o kadar yüksek olduğunu ve yanıt aralığının üst sınırına ulaştığını gösterir. Optik absorbans dedektörleri için (bu durumda UV-vis), analit konsantrasyonu çok yüksek olduğunda, analit dedektör akış hücresinden geçen ışığın çoğunu emerek algılanacak çok az ışık bırakır. Bu koşullar altında, fotodetektörden gelen elektrik sinyali kaçak ışık ve "karanlık akım" gibi çeşitli gürültü kaynaklarından büyük ölçüde etkilenir. sinyali görünüşte çok "bulanık" hale getirir ve analit konsantrasyonundan bağımsızdır.Bu olduğunda, sorun analitin enjeksiyon hacmini azaltarak - enjeksiyon hacmini azaltarak, numuneyi seyrelterek veya her ikisini birden yaparak - kolayca çözülebilir.
Kromatografi okulunda, numunedeki analit konsantrasyonunun bir göstergesi olarak detektör sinyalini (yani, kromatogramdaki y ekseni) kullanırız. Bu nedenle, sıfırın altında bir sinyale sahip bir kromatogram görmek tuhaf görünüyor, çünkü basit yorum bunun negatif bir analit konsantrasyonunu gösterdiğidir - ki bu elbette fiziksel olarak mümkün değildir. Tecrübelerime göre, negatif tepe noktaları en çok optik absorbans dedektörleri (örn. UV-vis) kullanılırken gözlemlenir.
Bu durumda, negatif bir pik basitçe, kolondan çıkan moleküllerin pikten hemen önce ve sonra mobil fazın kendisinden daha az ışık absorbe ettiği anlamına gelir. Bu, örneğin nispeten düşük algılama dalga boyları (<230 nm) ve bu dalga boylarındaki ışığın çoğunu emen mobil faz katkı maddeleri kullanıldığında meydana gelebilir. Bu tür katkı maddeleri, metanol gibi mobil faz solvent bileşenleri veya asetat veya format gibi tampon bileşenleri olabilir. Bir kalibrasyon eğrisi hazırlamak ve doğru nicel bilgi elde etmek için aslında negatif pikler kullanılabilir, dolayısıyla bunlardan kaçınmak için temel bir neden yoktur. per se (bu yönteme bazen "dolaylı UV tespiti" denir) (13). Bununla birlikte, absorbans tespiti durumunda negatif tepe noktalarından tamamen kaçınmak istiyorsak, en iyi çözüm farklı bir tespit dalga boyu kullanmaktır, böylece analit mobil fazdan daha fazlasını emer veya mobil fazın bileşimini değiştirerek analitlerden daha az ışık emer.
Negatif pikler ayrıca, çözücü matrisi gibi numunedeki analit dışındaki bileşenlerin kırılma indisi mobil fazın kırılma indisinden farklı olduğunda kırılma indeksi (RI) tespiti kullanılırken de görünebilir. Bu aynı zamanda UV-vis tespiti ile olur, ancak bu etki RI tespitine göre zayıflama eğilimindedir. Her iki durumda da, numune matrisinin bileşiminin mobil fazınkiyle daha yakından eşleştirilmesiyle negatif tepe noktaları en aza indirilebilir.
LC sorun gidermenin temel konusuyla ilgili üçüncü bölümde, gözlemlenen tepe şeklinin beklenen veya normal tepe şeklinden farklı olduğu durumları tartıştım. Bu tür sorunların etkili şekilde giderilmesi, beklenen tepe şekillerinin bilinmesiyle başlar (teoriye veya mevcut yöntemlerle önceki deneyimlere dayalıdır), bu nedenle bu beklentilerden sapmalar açıktır. Tepe şekli problemlerinin birçok farklı potansiyel nedeni vardır (çok geniş, kuyruk, ön kenar vb.). Bu bölümde, en sık karşılaştığım nedenlerden bazılarını ayrıntılı olarak ele alıyorum. Tüm olasılıkları yakalayamazsınız. Nedenlerin ve çözümlerin daha ayrıntılı bir listesiyle ilgilenen okuyucular, LCGC “LC Sorun Giderme Kılavuzu” duvar tablosuna başvurabilir.
(4) LCGC "LC Sorun Giderme Kılavuzu" duvar tablosu.https://www.chromatographyonline.com/view/troubleshooting-wallchart (2021).
(6) A. Felinger, Kromatografide Veri Analizi ve Sinyal İşleme (Elsevier, New York, NY, 1998), s. 43-96.
(8) Wahab MF, Dasgupta PK, Kadjo AF ve Armstrong DW, Anal.Chim.Journal.Rev.907, 31–44 (2016).https://doi.org/10.1016/j.aca.2015.11.043.