Nature.com'u ziyaret ettiğiniz için teşekkür ederiz. Sınırlı CSS desteği olan bir tarayıcı sürümü kullanıyorsunuz. En iyi deneyim için güncellenmiş bir tarayıcı kullanmanızı (veya Internet Explorer'da Uyumluluk Modunu devre dışı bırakmanızı) öneririz. Ayrıca, sürekli desteği sağlamak için siteyi stiller ve JavaScript olmadan gösteriyoruz.
Aynı anda üç slayttan oluşan bir dönen görüntü görüntüler. Üç slaytta birer birer ilerlemek için Önceki ve Sonraki düğmelerini kullanın veya üç slaytta birer birer ilerlemek için sondaki kaydırıcı düğmelerini kullanın.
Kendiliğinden bir araya gelen sinir organelleri, insan gelişimi ve hastalıklarını modellemek için umut verici bir in vitro platformu temsil eder. Ancak organoidler, olgunlaşmayı sınırlayan ve davranışı kontrol eden diğer devrelerle entegrasyonu engelleyen in vivo'da bulunan bağlantıdan yoksundur. Burada, yeni doğmuş çıplak sıçanların somatosensoriyel korteksine nakledilen insan kök hücresinden türetilen kortikal organoidlerin, duyusal ve motivasyonla ilgili devrelere entegre olan olgun hücre tipleri geliştirdiğini gösteriyoruz. MRI, birkaç kök hücre hattında ve hayvanda nakil sonrası organoid büyümesini ortaya koyarken, tek çekirdekli analiz, kortikogenezin ilerlemesini ve aktiviteye bağlı bir transkripsiyon programının ortaya çıkışını ortaya koydu. Gerçekten de, nakledilen kortikal nöronlar, in vitro benzerlerinden daha karmaşık morfolojik, sinaptik ve iç zar özellikleri sergileyerek Timothy sendromlu hastalarda nöronal defektlerin tespit edilmesini sağlar. Anatomik ve işlevsel izleme, nakledilen organellerin talamokortikal ve kortikokortikal girdiler aldığını göstermiştir ve nöral aktivitenin in vivo kayıtları, bu girdilerin insan hücrelerinde duyusal tepkiler üretebileceğini düşündürmektedir. Son olarak, kortikal organoidler sıçan beyni boyunca aksonları uzatır ve optogenetik aktivasyonları ödül arayan davranışa yol açar. Böylece, nakledilen insan korteks nöronları olgunlaşır ve davranışı kontrol eden konak devrelerine katılır. Bu yaklaşımın, diğer yollarla tespit edilemeyen hasta kaynaklı hücrelerde iplik düzeyindeki fenotiplerin tespitini kolaylaştırmasını bekliyoruz.
Gelişen insan beyni, hücrelerin çoğaldığı, farklılaştığı, göç ettiği ve duyusal deneyim yoluyla daha da rafine edilen işlevsel nöronal devreler oluşturmak için bağlandığı dikkate değer bir kendi kendini organize eden süreçtir. İnsan beyni gelişimini, özellikle hastalık bağlamında anlamadaki temel sorunlardan biri, beyin dokusuna erişim eksikliğidir. İnsan korteks organoidleri (hCO; insan korteks küresi olarak da bilinir) dahil olmak üzere kendi kendini organize eden organeller 2,3,4,5,6 üretebilir. Ancak, birkaç sınırlama, bunların sinir devrelerinin gelişimi ve işleyişini anlamak için daha geniş uygulamasını sınırlar. Özellikle, hCO olgunlaşmasının in vivo mevcut belirli mikroçevresel ve duyusal girdilerin yokluğuyla sınırlı olup olmadığı belirsizdir. Ek olarak, hCO'lar davranışsal sonuçlar üretebilen devrelere entegre olmadığından, genetik olarak karmaşık ve davranışsal nöropsikiyatrik bozuklukları modellemedeki faydaları şu anda sınırlıdır.
hCO'nun sağlam canlı bir beyne nakli bu sınırlamaların üstesinden gelebilir. Önceki çalışmalar, kemirgen korteksine nakledilen insan nöronlarının hayatta kalabildiğini, projeksiyon yapabildiğini ve kemirgen hücreleriyle iletişim kurabildiğini göstermiştir7,8,9,10,11,12. Ancak, bu deneyler genellikle yetişkin hayvanlar üzerinde yapılır ve bu da sinaptik ve aksonel entegrasyonu sınırlayabilir. Burada, hiPS hücrelerinden türetilen 3B hCO'yu, plastik gelişimin erken bir aşamasında immün yetmezliği olan sıçanların birincil somatosensoriyel korteksine (S1) naklettiğimiz bir nakil paradigmasını açıklıyoruz. Nakledilen hCO (t-hCO) nöronları önemli ölçüde olgunlaşır, duyusal tepkileri ortaya çıkaran talamokortikal ve kortikal-kortikal girdiler alır ve ödül arayan davranışı yönlendirmek için aksonel projeksiyonları sıçan beynine doğru uzatır. t-hCO'nun uzun süreli olgunlaşması, Timothy sendromu (TS) olan hastalarda nöronal defektleri ortaya çıkardı. Timothy sendromu, voltaj duyarlı L tipi CaV1.2 kalsiyum kanalındaki (CACNA1C tarafından kodlanır) mutasyonların neden olduğu ciddi bir genetik bozukluktur.
İnsan kortikal nöronlarını in vivo devrelerde incelemek için, stereotaktik olarak sağlam 3D hCO'yu erken postnatal atimik sıçanların (doğum sonrası 3-7. günler) S1'ine naklettiler (Şekil 1a ve Şekil 1a-c'nin genişletilmiş verileri). Bu noktada, talamokortikal ve kortikokortikal aksonal projeksiyonlar henüz S1 innervasyonunu tamamlamamıştır (ref. 13). Bu nedenle, bu yaklaşım t-hCO entegrasyonunu en üst düzeye çıkarırken endojen devreler üzerindeki etkiyi en aza indirmek için tasarlanmıştır. Canlı hayvanlarda t-hCO'nun yerini görselleştirmek için, nakilden 2-3 ay sonra sıçanların T2 ağırlıklı MRI beyin rekonstrüksiyonlarını gerçekleştirdik (Şekil 1b ve genişletilmiş veriler, Şekil 1d). t-hCO kolayca gözlemlendi ve t-hCO'nun hacim ölçümleri sabit dilimlerden hesaplananlara benzerdi (Genişletilmiş Veri Şekil 1d,e; P > 0,05). t-hCO kolayca gözlemlendi ve t-hCO'nun hacim ölçümleri sabit dilimlerden hesaplananlara benzerdi (Genişletilmiş Veri Şekil 1d,e; P > 0,05). t-hCO, фиксированных срезов için analog analoglar ile uyumludur (расширенные данные, рис. 1d, e; P> 0,05). t-hCO kolaylıkla gözlemlendi ve hacimsel t-hCO ölçümleri sabit kesitler için hesaplananlara benzerdi (genişletilmiş veriler, Şekil 1d, e; P > 0,05).t-hCO'nun tanımı t-hCO的体积测量值与从固定切片计算的测量值相似（扩展数据图1d、e；P > 0.05）。t-hCO'nun tanımı t-hCO t-hCO çok iyi bir analog, объемные измерения t-hCO фиксированных срезов için analog analoglar (расширенные данные, рис. 1d, e; P> 0,05). t-hCO kolaylıkla gözlemlendi ve hacimsel t-hCO ölçümleri sabit kesitler için hesaplananlara benzerdi (genişletilmiş veriler, Şekil 1d, e; P > 0,05).Nakil yapılan hayvanların %81'inde nakilden yaklaşık 2 ay sonra t-hCO'yu belirledik (n = 72 hayvan; 10 hiPS hücre hattından hCO; Ek Tablo 1'deki hiPS hücre hatları). Bunların %87'si serebral kortekste yer alıyordu (Şekil 1c). Aynı nakledilen sıçanda birden fazla zaman noktasında seri MRI taramaları yaparak, 3 ay içinde t-hCO hacminde dokuz kat artış bulduk (Şekil 1d ve genişletilmiş veriler, Şekil 1f). Nakil yapılan hayvanların nakilden 12 ay sonra yüksek bir sağkalım oranı vardı (%74) (genişletilmiş veriler, Şekil 1g ve Ek Tablo 2) ve belirgin motor veya bellek bozuklukları, gliyozis veya elektroensefalogram (EEG) bulunamadı. Veriler Şekil 1g ve ek tablo 2). 1s–d ve 3e).
a, Deneysel tasarımın şeması. hiPS hücrelerinden türetilen hCO, farklılaşmanın 30-60. günlerinde yenidoğan çıplak sıçanların S1'ine nakledildi. b, Nakilden 2 ay sonra S1'de t-hCO'yu gösteren T2 ağırlıklı koronal ve yatay MRI görüntüleri. Ölçek çubuğu, 2 mm. c, Her hiPS hücre hattı için gösterilen tutunma başarı oranlarının kantifikasyonu (n = 108, çubuklar içindeki sayılar hIPS hücre hattı başına t-hCO miktarını gösterir) ve kortikal veya subkortikal konum (n = 88). d, Bir koroner arterin MRI görüntüsü (sol; ölçek çubuğu, 3 mm) ve buna karşılık gelen 3B hacimsel rekonstrüksiyon (ölçek çubuğu, 3 mm), 3 ay boyunca t-hCO'da bir artışı gösteriyor. e, Sıçan serebral korteksindeki t-hCO modellerinin incelenmesi. Ölçek çubuğu, 1 mm. f, t-hCO'nun temsili immünositokimyasal görüntüleri soldan sağa doğru gösterilmiştir (farklılaşma sırasında): PPP1R17 (4 aylık), NeuN (8 aylık), SOX9 ve GFAP (8 aylık), PDGFRα; (8 aylık), MAP2 (8 aylık) ve IBA1 (8 aylık). Ölçek çubuğu, 20 µm. HNA'nın eş ekspresyonu insan kökenli hücreleri gösterir. g, snRNA-seq: Seurat entegrasyonundan sonra tüm yüksek kaliteli t-hCO çekirdeklerinin birleşik manifold ve projeksiyon (UMAP) boyut indirgeme görüntülemesi (n=3 t-hCO örneği, n=2 hiPS hücre hattı). Astrositler, astrosit hattının hücreleri; cyc prog, dolaşan progenitörler; GluN DL, derin glutamaterjik nöronlar; GluN DL/SP, derin ve sublamellar glutamaterjik nöronlar; GluN UL, üst katman glutamaterjik nöronlar; oligodendrositler, oligodendrositler; OPC, oligodendrosit progenitör hücreleri; RELN, reelin nöronları. h, t-hCO glutamaterjik nöronlarda hCO glutamaterjik nöronlara kıyasla önemli ölçüde yukarı düzenlenen (ayarlanmış P < 0,05, kat değişimi > 2, çekirdeklerin en az %10'unda ifade edilir) genlerin Gen Ontolojisi (GO) terim zenginleştirme analizi. h, t-hCO glutamaterjik nöronlarda hCO glutamaterjik nöronlara kıyasla önemli ölçüde yukarı düzenlenen (ayarlanmış P < 0,05, kat değişimi > 2, çekirdeklerin en az %10'unda ifade edilir) genlerin Gen Ontolojisi (GO) terim zenginleştirme analizi. h, Анализ обогащения терминов Gen Ontolojisi (GO) для генов со значительной активацией (скорректированный P <0,05, кратность) изменения > 2, экспрессия по крайней мере в 10% ядер) в глутаматергических нейронах t-hCO по сравнению с глутаматергическими нейронами hCO. h, t-hCO glutamaterjik nöronlarla hCO glutamaterjik nöronlarda anlamlı aktivasyona sahip genler için Gen Ontolojisi (GO) terim zenginleştirme analizi (ayarlanmış P<0,05, kat değişimi >2, en az %10 çekirdekte ifade). h，与hCO 谷氨酸能神经元相比，t-hCO 谷氨酸能神经元中基因显着上调（调整后P < 0,05, daha fazla bilgi> 2, daha fazla bilgi %10 daha fazla bilgi (GO) 术语富集分析。 h ， 与 hco 谷氨酸 能 元 相比 ， t-hco 谷氨酸 能 神经 元 基因 显着 上调 （后 后 p <0,05 ，变化 变化> 2 ， 至少 10% 的 核中 表达） 基因 基因 基因 的 的 的 的 的 的 的 的 的 的ne oldu 的本体论(GO) 术语富集分析。 h, гены значительно активизировались (скорректированный P <0,05, кратность изменения> 2, экспрессируется по крайней daha fazla 10% ядер) в глутаматергических нейронах t-hCO по сравнению с глутаматергическими нейронами hCO Онтологический (GO) анализ terminali ozgurluk. h, genler t-hCO glutamaterjik nöronlarda hCO glutamaterjik nöronlara kıyasla önemli ölçüde yukarı düzenlenmiştir (ayarlanmış P < 0,05, kat değişimi > 2, çekirdeklerin en az %10'unda ifade edilmiştir) Zenginleştirme teriminin ontolojik (GO) analizi.Noktalı çizgi 0,05'lik aq değerini gösterir. i, t-hCO'daki GluN hücre tiplerinin referans 22 snRNA-seq yetişkin motor korteks veri setinden etiket transferi kullanılarak UMAP görüntülenmesi. CT — kortikotalamik hücreler, ET — ekstraserebral hücreler, IT — internal telensefalik hücreler, NP — yakın projeksiyon.
Daha sonra t-hCO'nun sito mimarisini ve genel hücresel kompozisyonunu değerlendirdik. Sıçan endotel hücrelerinin antikor boyaması t-hCO ile vaskülarizasyonu ortaya koyarken, IBA1 boyaması greft boyunca sıçan mikrogliasının varlığını ortaya koydu (Şekil 1f ve genişletilmiş veriler, Şekil 3c,d). İmmün boyama, PPP1R17 (kortikal progenitörler), NeuN (nöronlar), SOX9 ve GFAP (glial kaynaklı hücreler) veya PDGFRα'yı (oligodendrosit progenitörleri) birlikte ifade eden insan nükleer antijeni (HNA) pozitif hücreleri ortaya koydu (Şekil 1f). t-hCO'nun hücresel kompozisyonunu tek hücre çözünürlüğünde incelemek için, yaklaşık 8 aylık farklılaşmadan sonra tek çekirdekli RNA dizilemesi (snRNA-seq) gerçekleştirdik. Toplu filtrasyon ve sıçan çekirdeklerinin çıkarılması 21.500 yüksek kaliteli insan mononükleer haritası üretti (Şekil 1g ve genişletilmiş veriler, Şekil 4a,b). Tipik hücre tipi belirteçlerinin ifade kalıpları, derin ve yüzeysel glutamatergik nöronlar, dolaşan progenitörler, oligodendrositler ve astrosit soyu dahil olmak üzere majör kortikal hücre sınıflarının kümelerini tanımladı (Şekil 1g, genişletilmiş veriler, Şekil 4c ve Ek Tablo 3). SATB2 ve CTIP2 için immün boyama, kortikal alt tiplerin varlığına rağmen t-hCO'nun net anatomik tabakalaşma göstermediğini gösterdi (genişletilmiş veriler, Şekil 3a). Aşama eşleştirilmiş snRNA-seq hCO, oligodendrositlerin yokluğu ve GABAerjik nöronların varlığı gibi birkaç istisna dışında, genel olarak benzer hücre sınıfları üretti; bu, daha önce bildirilen lateral progenitör hücreler için uygun in vitro koşulları yansıtabilir15 (genişletilmiş veriler, Şekil 4f – i ve Ek Tablo 4). Farklı gen ekspresyon analizi, t-hCO ve hCO arasındaki glutamaterjik nöronlarda önemli farklılıklar ortaya koydu (Ek Tablo 5), sinaptik sinyalleme, dendritik lokalizasyon ve voltaj kapılı kanal aktivitesi gibi nöronal olgunlaşma ile ilişkili gen kümelerinin aktivasyonu dahil (Şekil 1h ve Ek Tablo 5). Tablo 6). Buna göre, kortikal glutamaterjik t-hCO nöronları hızlandırılmış transkripsiyonel olgunlaşma sergiledi.
t-hCO'daki bu transkripsiyonel değişikliklerin in vitro hCO ve in vivo t-hCO arasındaki morfolojik farklılıklarla ilişkili olup olmadığını açıklamak için, 7-8 aylık farklılaşmadan sonra akut kesitlerde aşama eşleştirilmiş biyositin dolu hCO ve hCO'yu yeniden yapılandırdık. hCO nöronları (Şekil 2a). t-hCO nöronları önemli ölçüde daha büyüktü, soma çapının 1,5 katı, iki kat daha fazla dendriti vardı ve in vitro hCO ile karşılaştırıldığında toplam dendritik uzunlukta genel olarak altı kat artış vardı (Şekil 2b). Ek olarak, t-hCO nöronlarında hCO nöronlarına kıyasla önemli ölçüde daha yüksek yoğunlukta dendritik dikenler gözlemledik (Şekil 2c). Bu, t-hCO nöronlarının kapsamlı dendritik uzama ve dallanma geçirdiğini ve bunun devam eden hücre çoğalmasıyla birlikte nakilden sonra t-hCO'nun yoğun büyümesine katkıda bulunabileceğini göstermektedir (Şekil 1d ve Genişletilmiş Veriler Şekil 1f). Bu bizi elektrofizyolojik özellikleri araştırmaya yöneltti. Membran kapasitansı sekiz kat daha yüksekti (genişletilmiş veriler, Şekil 8d), dinlenme durumu membran potansiyeli daha hiperpolarizeydi (yaklaşık 20 mV) ve akım enjeksiyonu t-hCO nöronlarında hCO nöronlarına göre daha yüksek bir maksimum uyarılma oranı oluşturdu. in vitro (Şekil 2d), e), bu da t-hCO'nun daha büyük ve daha karmaşık morfolojik özellikleriyle tutarlıdır. Ek olarak, kendiliğinden uyarıcı postsinaptik akım olaylarının (EPSC) sıklığı t-hCO nöronlarında önemli ölçüde daha yüksekti (Şekil 2f), bu da t-hCO nöronlarında gözlenen dendritik dikenlerin artan yoğunluğunun işlevsel uyarılabilirlikle ilişkili olduğunu düşündürmektedir. cinsel sinaps. Etiketli glutamaterjik nöronları kaydederek hCO nöronlarının olgunlaşmamış karakterini in vitro doğruladık (genişletilmiş veriler, Şekil 6a-c).
a, 8 aylık farklılaşmadan sonra biyositin dolu hCO ve t-hCO nöronlarının 3 boyutlu rekonstrüksiyonu. b, Morfolojik özelliklerin kantifikasyonu (n = 8 hCO nöronu, n = 6 t-hCO nöronu; **P = 0,0084, *P = 0,0179 ve ***P < 0,0001). b, Morfolojik özelliklerin kantifikasyonu (n = 8 hCO nöronu, n = 6 t-hCO nöronu; **P = 0,0084, *P = 0,0179 ve ***P < 0,0001). б, количественная оценка морфологических признаков (n = 8 нейронов hCO, n = 6 нейронов t-hCO; ** P = 0,0084, * P = 0,0179 и *** P <0,0001). b, morfolojik özelliklerin kantifikasyonu (n=8 hCO nöronu, n=6 t-hCO nöronu; **P=0,0084, *P=0,0179 ve ***P<0,0001). b，形态学特征的量化（n = 8 个hCO 神经元，n = 6 个t-hCO 神经元；**P = 0,0084，*P = 0,0179 和***P < 0.0001）。 b，形态学特征的量化（n = 8 个hCO 神经元，n = 6 个t-hCO 神经元；**P = 0,0084，*P = 0,0179 和***P < 0.0001）。 б, количественная оценка морфологических признаков (n = 8 нейронов hCO, n = 6 нейронов t-hCO; ** P = 0,0084, * P = 0,0179 и *** P <0,0001). b, morfolojik özelliklerin kantifikasyonu (n=8 hCO nöronu, n=6 t-hCO nöronu; **P=0,0084, *P=0,0179 ve ***P<0,0001).c, 8 aylık farklılaşmadan sonra hCO ve t-hCO dendritik dallarının 3B yeniden yapılandırılması. Kırmızı yıldızlar varsayımsal dendritik dikenleri göstermektedir. Dendritik diken yoğunluğu kantifikasyonu (n = 8 hCO nöronu, n = 6 t-hCO nöronu; **P = 0,0092). d, Dinlenme zar potansiyelinin kantifikasyonu (n = 25 hCO nöronu, n = 16 t-hCO nöronu; ***P < 0,0001). d, Dinlenme zar potansiyelinin kantifikasyonu (n = 25 hCO nöronu, n = 16 t-hCO nöronu; ***P < 0,0001). d, количественная оценка мембранного потенциала покоя (n = 25 нейронов hCO, n = 16 нейронов t-hCO; *** P <0,0001). d, dinlenme zar potansiyeli kantifikasyonu (n = 25 hCO nöronu, n = 16 t-hCO nöronu; ***P < 0,0001). d，静息膜电位的量化（n = 25 hCO 神经元，n = 16 t-hCO 神经元；***P < 0,0001）。 d，静息膜电位的量化（n = 25 hCO 神经元，n = 16 t-hCO 神经元；***P < 0,0001）。 d, количественная оценка мембранного потенциала покоя (n = 25 нейронов hCO, n = 16 нейронов t-hCO; *** P <0,0001). d, dinlenme zar potansiyeli kantifikasyonu (n = 25 hCO nöronu, n = 16 t-hCO nöronu; ***P < 0,0001). e, Artan akım enjeksiyonları ile hCO ve t-hCO'da tekrarlayan aksiyon potansiyeli ateşlemesi ve maksimum ateşleme hızının kantifikasyonu (n = 25 hCO nöronu, n = 16 t-hCO nöronu; ***P < 0,0001). e, Artan akım enjeksiyonları ile hCO ve t-hCO'da tekrarlayan aksiyon potansiyeli ateşlemesi ve maksimum ateşleme hızının kantifikasyonu (n = 25 hCO nöronu, n = 16 t-hCO nöronu; ***P < 0,0001). e, hCO ve t-hCO'da potansiyel teslimatı gerçekleştirerek, size en uygun olanı ve diğerlerini sunuyoruz. максимальной скорости возбуждения (n = 25 нейронов hCO, n = 16 нейронов t-hCO; *** P <0,0001). e, hCO ve t-hCO'da akım artışı ve maksimum ateşleme oranının kantifikasyonu ile indüklenen aksiyon potansiyeli yeniden ateşlemesi (n = 25 hCO nöronu, n = 16 t-hCO nöronu; *** P < 0,0001). e，通过增加电流注入诱导的hCO 和t-hCO 重复动作电位放电，以及最大放电率的量化（n = 25个hCO 神经元，n = 16 个t-hCO 神经元；***P < 0.0001）。 E ， 通过 增加 电流 注入 的 的 hco 和 t-hco 重复 电位 放电 ， 以及 最 大 的 量化 （（n = 25个 hco 神经 , n = 16 个 t-hco 神经 ； *** p <0,0001） 。 e, повторяющееся возбуждение потенциала действия hCO ve t-hCO, вызванное увеличением подачи тока, ve количественная оценка максимальной скорости возбуждения (n = 25 нейронов hCO, n = 16 нейронов t-hCO; *** P <0,0001). e, artan akım temini ve maksimum ateşleme oranının kantifikasyonu ile indüklenen hCO ve t-hCO aksiyon potansiyellerinin tekrarlayan ateşlenmesi (n = 25 hCO nöronu, n = 16 t-hCO nöronu; *** P < 0,0001). f, 8 aylık farklılaşmada hCO ve t-hCO nöronlarındaki kendiliğinden oluşan EPSC'ler (sEPSC'ler) ve sinaptik olayların sıklığının kantifikasyonu (n = 25 hCO nöronu, n = 17 t-hCO nöronu; ***P < 0,0001). f, 8 aylık farklılaşmada hCO ve t-hCO nöronlarındaki kendiliğinden oluşan EPSC'ler (sEPSC'ler) ve sinaptik olayların sıklığının kantifikasyonu (n = 25 hCO nöronu, n = 17 t-hCO nöronu; ***P < 0,0001). f, hCO ve t-hCO'da EPSC'yi (sEPSC) 8 ay boyunca hCO ve t-hCO'da destekliyoruz. синаптических событий (n = 25 нейронов hCO, n = 17 нейронов t-hCO; *** P <0,0001) . f, hCO ve t-hCO nöronlarındaki 8 aylık farklılaşmada kendiliğinden oluşan EPSC'ler (sEPSC'ler) ve sinaptik olay oranlarının kantifikasyonu (n=25 hCO nöronu, n=17 t-hCO nöronu; ***P<0,0001). f，分化8 个月时hCO vet-hCO 神经元中的自发性EPSCs (sEPSCs)，以及突触事件频率的量化（n = 25 hCO神经元，n = 17 t-hCO 神经元；***P < 0,0001） . f，分化8 个月时hCO vet-hCO 神经元中的自发性EPSCs (sEPSCs)，以及突触事件频率的量匼（n = 25 hCO神率的量匼（n = 25 hCO 神率的量匼（n = 25hCO P < 0,0001） . f, hCO ve t-hCO'da EPSC'yi (sEPSC) 8 ay boyunca hCO ve t-hCO'da destekliyoruz. синаптических событий (n = 25 нейронов hCO, n = 17 нейронов t-hCO; *** P <0,0001). f, hCO ve t-hCO nöronlarındaki spontan EPSC'ler (sEPSC'ler) farklılaşmanın 8. ayında ve sinaptik olay oranlarının kantifikasyonunda (n = 25 hCO nöronu, n = 17 t-hCO nöronu; *** P<0,0001).1208-2 satırındaki bf, hCO ve t-hCO için paralel olarak tutulan aynı farklılaşma partisinden alınmıştır. g, t-hCO glutamaterjik nöronlarda hCO glutamaterjik nöronlara kıyasla önemli ölçüde yukarı düzenlenen (ayarlanmış P < 0,05, kat değişimi > 2, çekirdeklerin en az %10'unda ifade edilir) genlerin gen seti zenginleştirme analizi (tek taraflı Fisher kesin testi), hem erken yanıt (ERG) hem de geç yanıt (LRG) aktivitesine bağlı genlerin gen setleri, in vivo fare çalışmasından16 ve in vitro nöronlardan elde edilen insan spesifik LRG'leri17 ile karşılaştırılmıştır. g, t-hCO glutamaterjik nöronlarda hCO glutamaterjik nöronlara kıyasla önemli ölçüde yukarı düzenlenen (ayarlanmış P < 0,05, kat değişimi > 2, çekirdeklerin en az %10'unda ifade edilir) genlerin gen seti zenginleştirme analizi (tek taraflı Fisher kesin testi), hem erken yanıt (ERG) hem de geç yanıt (LRG) aktivitesine bağlı genlerin gen setleri, in vivo fare çalışmasından16 ve in vitro nöronlardan elde edilen insan spesifik LRG'leri17 ile karşılaştırılmıştır. g, анализ обогащения набора генов (односторонний точный критерий Фишера) генов со значительной активацией (скорректированный P <0,05, кратность изменения > 2, экспрессия по меньшей мере в 10% ядер) в глутаматергических нейронах t-hCO по сравнению с глутаматергическими нейронами hCO наборы генов как раннего (ERG), так и позднего (LRG) генов, зависящих от активности, идентифицированных в исследовании на мышах на in vivo16 ve специфических человека LRG ve з нейронов in vitro17. g, t-hCO glutamaterjik nöronlarda hCO glutamaterjik nöron kümeleriyle karşılaştırıldığında anlamlı aktivasyona sahip genlerin (ayarlanmış P<0,05, kat değişimi >2, çekirdeklerin en az %10'unda ifade) gen kümesi zenginleştirmesinin (tek kuyruklu Fisher kesin testi) analizi, hem erken (ERG) hem de geç (LRG) aktiviteye bağlı genlerin in vivo farelerde16 ve nöronlardan in vitro insan spesifik LRG'lerinde17 belirlenmesi. g，t-hCO谷氨酸能神经元与hCO谷氨酸能神经元相比，t -hCO谷氨酸能神经元显着上调（调整后P<0.05，倍数变化>2,%10细胞核中表达）的基因集富集分析（单侧F isher精确检验）从体内小鼠研究中鉴定的早期反应(ERG)和晚期反应(LRG) 活性依赖性基因的基因组16 和体外神经元17 中的人类特异性LRG。 g ， t-hco 谷氨酸 神经 元 与 hco 谷氨酸 神经 元 相比 ， t-hco 谷氨酸 神经 元 上调 （调整 后 p <0,05 ， 倍数> 2 ， 至少 至少 10%的 细胞 核中 表达） 的 集富集 分析 （单侧 balıkçı 精确））体内 小鼠 研究 中 的 早期 反应 反应 反应 和 晚期 反应 反应 (lrg) 活性 基因 的 基因组 16 和17., 17., 17., 17. tarihler LRG'de. g, глутаматергические нейроны t-hCO были значительно активизированы по сравнению сравнению с глутаматергическими нейронами hCO (скорректированный P<0,05, кратность изменения> 2, не менее 10% Анализ обогащения набора генов (односторонний точный тест Фишера) раннего ответа (ERG) ve daha iyi bir performans sergiliyor, (LRG) etkin bir şekilde çalışıyor ve in vivo ortamda gerçekleştirilen yayınları tanımlıyor16 ve нейронах in vitro17. LRG, bunun için özel olarak tasarlandı. g, t-hCO glutamaterjik nöronlar, hCO glutamaterjik nöronlara kıyasla önemli ölçüde yukarı düzenlenmiştir (ayarlanmış P<0,05, katlama değişimi >2, en az %10 Erken yanıt (ERG) ve geç yanıt gen zenginleştirme analizi (tek kuyruklu Fisher'ın kesin testi) yanıt aktivitesine bağlı genler (LRG'ler), in vivo farelerde16 ve in vitro nöronlarda17 tanımlanmıştır. İnsana özgü LRG'ler.Noktalı çizgi 0,05'lik Bonferroni düzeltilmiş P değerini gösterir. h, GluN gen ifadesi (her genin psödo paketi ve ölçeklenmesi) t-hCO glutamaterjik nöronlardaki LRG genlerinin snRNA-seq replikalarında önemli ölçüde yukarı düzenlenmiştir. i, t-hCO (üst) ve hCO (alt) nöronlarında SCG2 ifadesini gösteren immünoboyama. Beyaz oklar SCG2+ hücrelerini gösterir. Ölçek çubuğu, 25 µm. Veriler ortalama ± standart sapma olarak ifade edilir.
Ex vivo dilimlerde gözlemlenen t-hCO'nun artan aktivitesine dayanarak, snRNA-seq, t-hCO'da in vitro hCO ile karşılaştırıldığında gen transkriptlerinin aktiviteye bağlı bir yukarı regülasyonunu ortaya koydu. Glutamaterjik t-hCO nöronları, fare ve insan nöronlarında yapılan önceki çalışmalarda bulunan geç yanıt aktivitesini düzenleyen genlerin daha yüksek seviyelerini ifade etti (Şekil 2g,h)16,17. Örneğin, primatlara özgü bir aktivite düzenleyici gen olan BDNF18, SCG2 ve OSTN, hCO nöronlarına kıyasla t-hCO nöronlarında artmış ifade gösterdi (Şekil 2g-i). Bu nedenle, t-hCO nöronları, transkripsiyonel, morfolojik ve fonksiyonel analizlerle hCO nöronlarına kıyasla gelişmiş olgunlaşma özellikleri sergiledi.
t-hCO olgunlaşmasının insan beyni gelişimi ile ilişkisini daha ileri değerlendirmek için fetal ve yetişkin kortikal hücre tiplerinin19,20 ve yetişkinlerin21,22 transkriptomik karşılaştırmalarını ve gelişim sırasında kortikal gen ekspresyonu hakkında kapsamlı verileri23 gerçekleştirdik (genişletilmiş veriler, Şekil 5). ). önceki çalışmalarla24 birlikte, 7-8 aylık farklılaşmadaki genel hCO ve t-hCO transkriptom olgunlaşma durumu, in vivo gelişim süresiyle genel olarak tutarlıdır ve geç fetal yaşamla en çok eşdeğerdir (Genişletilmiş Veriler, Şekil 5a). Özellikle, yaşa eşleştirilmiş hCO ile karşılaştırıldığında t-hCO'da artmış transkriptom olgunluğunun yanı sıra sinaptogenez, astrogenez ve miyelinleşme ile ilişkili transkriptom aktivasyonu gözlemledik (genişletilmiş veriler, Şekil 5b-d). Hücresel düzeyde, t-hCO'da daha ince bir korteks alt tipinin kanıtını bulduk, glutamaterjik nöron kümeleri yetişkin L2/3, L5 ve L6 nöron alt tipleriyle örtüşüyordu (Şekil 1i). Buna karşılık, glutamaterjik t-hCO nöronları ile fetal kortikal nöronlar arasındaki küme örtüşmesi gebeliğin ortasında daha sınırlıydı (genişletilmiş veriler, Şekil 5e-j). t-hCO nöronlarının işlevsel olarak insan doğum sonrası neokortikal nöronlarına benzer olup olmadığını belirlemek için, insan doğum sonrası korteksinin keskin kesitlerinde insan L2/3 piramidal nöronlarının elektrofizyolojik kayıtlarını ve anatomik rekonstrüksiyonlarını gerçekleştirdik (genişletilmiş veriler, Şekil 7a). L2/3 piramidal nöronların elektrofizyolojik özellikleri t-hCO piramidal nöronlarının özelliklerine benziyordu (genişletilmiş veriler, Şekil 7e). Morfolojik olarak, doğum sonrası insan örneklerinden alınan L2/3 nöronları hCO'dan ziyade t-hCO'ya daha çok benziyordu, ancak L2/3 hücreleri daha uzundu, genel olarak daha fazla dal içeriyordu ve daha yüksek diken yoğunluğuna sahipti (Şekil 3g ve genişletilmiş veriler, Şekil 7b-). G).
a, kontrol ve TS hiPS hücre hatları tarafından üretilen hCO'nun neonatal sıçanlara nakli. b, 8 aylık farklılaşmadan sonra biyositin dolu t-hCO nöronlarının 3B rekonstrüksiyonu. c, ortalama dendritik uzunluğun kantifikasyonu (n = 19 kontrol nöronu, n = 21 TS nöronu; **P = 0,0041). d, kontrol ve TS t-hCO'dan 8 aylık farklılaşmada 3 boyutlu yeniden yapılandırılmış dendritik dallar ve dendritik diken yoğunluğunun kantifikasyonu (n = 16 kontrol nöronu, n = 21 TS nöronu, ***P < 0,0001). d, kontrol ve TS t-hCO'dan 8 aylık farklılaşmada 3 boyutlu yeniden yapılandırılmış dendritik dallar ve dendritik diken yoğunluğunun kantifikasyonu (n = 16 kontrol nöronu, n = 21 TS nöronu, ***P < 0,0001). d, 3D-rekonструкция дендритных ветвей из controля ve TS t-hCO через 8 месяцев дифференцировки ve количественная оценка плотности дендритных шипов (n = 16 контрольных нейронов, n = 21 TS нейронов, *** P <0,0001). d, 8 aylık farklılaşmada kontrol ve t-hCO TS'den dendritik dalların 3B rekonstrüksiyonu ve dendritik diken yoğunluğu kantifikasyonu (n=16 kontrol nöronu, n=21 TS nöronu, ***P<0,0001). d，分化8 个月时对照和TS t-hCO 的3D 重建树突分支，以及树突棘密度的量化（n = 16个对照神经元,n = 21 个TS 神经元，***P < 0,0001）。 d ， 分化 8 个 时 对照 和 ts t-hco 的 3d 重建 分支 分支 以及 树突棘 密度 量化 （n = 16 个神经 元 ， n = 21 个 ts 神经 ， *** p <0,0001 ）。 d, 3D-rekonструкция дендритных ветвей контроля ve TS t-hCO через 8 месяцев дифференцировки ve количественная оценка плотности дендритных шипов (n = 16 контрольных нейронов, n = 21 TS нейронов, *** P <0,0001). d, 8 aylık farklılaşmada kontrol dendritik dallarının ve TS t-hCO'nun 3B rekonstrüksiyonu ve dendritik diken yoğunluğu kantifikasyonu (n=16 kontrol nöronu, n=21 TS nöronu, ***P<0,0001).Kırmızı yıldızlar varsayımsal dendritik dikenleri gösterir. e, 8 aylık farklılaşmadan sonra kontrol ve TS t-hCO nöronlarındaki kendiliğinden oluşan EPSC'ler. f, kümülatif frekans grafiği ve sinaptik olayların frekans ve genliğinin kantifikasyonu (n=32 kontrol nöronu, n=26 TS nöronu; **P=0,0076 ve P=0,8102). g, hCO ve t-hCO'daki TS ve kontrol nöronlarının Scholl analizi. Kesikli çizgiler karşılaştırma için insan L2/3 doğum sonrası piramidal nöronlarını gösterir (n = 24 kontrol t-hCO nöronu, n = 21 TS t-hCO nöronu, n = 8 kontrol hCO nöronu ve n = 7 TS hCO nöronu). Veriler ortalama ± standart sapma olarak ifade edilir
t-hCO'nun insan korteks nöronlarının morfolojik ve işlevsel özelliklerini yüksek düzeyde kopyalama yeteneği, t-hCO'nun hastalık fenotiplerini tespit etmek için kullanılıp kullanılamayacağını araştırmamıza yol açtı. Nöronlarda aktiviteye bağlı gen transkripsiyonunu başlatan CaV1.2 kodlayan gendeki işlev kazanımı mutasyonlarından kaynaklanan ciddi bir nörogelişimsel bozukluk olan TS'ye odaklandık. En yaygın ikameyi (p.G406R) taşıyan üç TS hastasından ve üç kontrolden hCO elde ettik (Şekil 3a). Nakilden sonra, TS nöronlarında dendritik morfolojinin kontrollerle karşılaştırıldığında değiştiğini (Şekil 3b ve genişletilmiş veriler, Şekil 8a,b), birincil dendrit sayısında iki kat artış ve dendritik uzunlukta genel ortalamada artış ve genel azalma olduğunu (Şekil 3c ve genişletilmiş veriler, Şekil 8c) bulduk. Bu, TS'de kontrol nöronlarına kıyasla dikenlerin yoğunluğunun artması ve kendiliğinden EPSC'lerin sıklığının artmasıyla ilişkilendirildi (Şekil 3d–f ve genişletilmiş veriler, Şekil 8g). Daha ileri analizler, t-hCO TS'de kontrollerle karşılaştırıldığında anormal dendritik dallanma desenleri ortaya koydu, ancak benzer bir farklılaşma aşamasında in vitro TS hCO'da ortaya koymadı (Şekil 3g). Bu, TS'de aktiviteye bağlı dendritik büzülmeye ilişkin önceki raporlarımızla tutarlıdır ve bu nakil platformunun hastalık fenotiplerini in vivo tespit etme yeteneğini vurgular.
Daha sonra t-hCO hücrelerinin sıçan S1'e işlevsel olarak ne ölçüde entegre olduğunu sorduk. Kemirgenlerdeki S1, ipsilateral ventral bazal ve posterior talamik çekirdeklerden, ayrıca ipsilateral motor ve sekonder somatosensoriyel kortekslerden ve kontralateral S1'den güçlü sinaptik girdiler alır (Şekil 4a). Sinirlenme düzenini eski haline getirmek için hCO'yu kuduz virüsü-dG-GFP/AAV-G ile enfekte ettik ve hCO'yu 3 gün sonra S1 sıçanına naklettik. Nakilden 7-14 gün sonra ipsilateral S1 ve ventral bazal ganglionların nöronlarında yoğun GFP ekspresyonu gözlemledik (Şekil 4b, c). Ek olarak, talamik belirteç netrin G1'in antikor boyaması, t-hCO'da talamik sonlanmaların varlığını ortaya koydu (Şekil 4d, e). Bu afferent projeksiyonların t-hCO hücrelerinde sinaptik yanıtları ortaya çıkarıp çıkaramayacağını değerlendirmek için, talamokortikal tabakanın keskin kesitlerinde insan hücrelerinden tam hücre kayıtları gerçekleştirdik. Sıçan S1'in, iç kapsülün, beyaz maddenin, t-hCO yakınındaki liflerin elektriksel uyarımı veya t-hCO'daki opsin ifade eden talamik sonlanmaların optogenetik aktivasyonu, AMPA reseptör antagonisti NBQX'e maruz kalan t-hCO nöronlarındaki kısa gecikmeli EPSC'leri indükledi. (Şekil 4f, g ve genişletilmiş veriler, Şekil 9a–g). Bu veriler, t-hCO'nun anatomik olarak sıçan beynine entegre olduğunu ve sıçan konak dokusu tarafından aktive edilebildiğini göstermektedir.
a, Kuduz izleme deneyinin şematik diyagramı. b, t-hCO ve sıçan serebral korteksi arasındaki GFP ve insana özgü STEM121 ekspresyonu (üst panel). Ayrıca sıçan ipsilateral ventral bazal çekirdeğinde (VB) (sol alt) ve ipsilateral S1'de (sağ alt) GFP ekspresyonu gösterilmektedir. Ölçek çubuğu, 50 µm. Kırmızı kareler görüntülerin çekildiği beyin bölgelerini temsil eder. c, GFP ekspresyonu gösteren hücrelerin kantifikasyonu (n = 4 sıçan). d, e — t-hCO'daki Netrin G1+ talamik terminaller. d, t-hCO ve VB çekirdekleri içeren koronal kesiti gösterir. Ölçek çubuğu, 2 mm. e, t-hCO (sol) ve VB (sağ) nöronlarında Netrin G1 ve STEM121 ekspresyonunu gösterir. Ölçek çubuğu, 50 µm. Turuncu noktalı çizgi t-hCO sınırını gösterir. f, g, S1 sıçanında (f) veya iç kapsülde (g) elektriksel stimülasyondan sonra t-hCO nöronlarının mevcut izleri, NBQX ile (mor) veya NBQX olmadan (siyah) (sol). NBQX ile ve NBQX olmadan EPSC genlikleri (n = 6 S1 nöronu, *P = 0,0119; ve n = 6 iç kapsül nöronu, **P = 0,0022) (ortada). Sıçan S1'in (f) veya iç kapsülün (g) elektriksel stimülasyonuna yanıt olarak EPSC gösteren t-hCO nöronlarının yüzdesi (sağ). aCSF, yapay beyin omurilik sıvısı. h, 2P görüntüleme deneyinin şematik diyagramı (sol). t-hCO'da GCaMP6 ekspresyonu (orta). Ölçek çubuğu, 100 µm. GCaMP6'ların floresan zaman aralığı (sağ). i, Spontan aktivite floresansının Z skoru. j, bıyık stimülasyonunun şematik gösterimi. k, bir denemede z-puanlı 2P floresan yörüngeleri, örnek hücrelerde zaman sıfırdaki bıyık sapmasıyla (kesik çizgi) hizalanmıştır. l, zaman sıfırdaki bıyık sapmasıyla (kesik çizgi) (kırmızı) hizalanmış tüm hücrelerin popülasyon ortalamalı z-puanı yanıtları veya rastgele oluşturulmuş zaman damgaları (gri). m. Optik işaretleme deneyinin şematik diyagramı. n, mavi lazer uyarımı veya bıyık sapması sırasında bir örnek t-hCO hücresinden alınan ham voltaj eğrileri. Kırmızı oklar, ışıktan (üst) veya bıyık sapmasından (alt) kaynaklanan ilk sivri uçları göstermektedir. Gri gölgeleme, bıyık sapması dönemlerini göstermektedir. o, Tepe ışık dalga biçimleri ve bıyık sapması yanıtları. p, tek bir denemenin sivri uçları, örnek hücrelerdeki bıyıkların sapmasıyla hizalanmıştır. 0, bıyık sapmasını (kesik çizgi) göstermektedir. q, tüm ışığa duyarlı hücreler için popülasyon ortalamalı z-puanı ateşleme hızı, sıfır zamanında bıyık sapmasıyla (kesikli çizgi) (kırmızı) veya rastgele oluşturulmuş zaman damgalarıyla (gri) hizalanmıştır. r, Bıyık sapmasıyla önemli ölçüde modüle edilen ışığa duyarlı birimlerin oranı (n = 3 sıçan) (sol). Tepe z-puanı gecikmesi (n = 3 sıçan; n = 5 (açık yeşil), n = 4 (koyu yeşil) ve n = 4 (camgöbeği) sıçan başına bıyık sapma modülasyon birimi) (sağ). Veriler ortalama ± standart sapma olarak ifade edilir
Daha sonra t-hCO'nun in vivo duyusal uyaranlarla aktive edilip edilemeyeceğini sorduk. Genetik olarak kodlanmış kalsiyum göstergeleri GCaMP6'yı ifade eden hCO'yu S1 sıçanlarına naklettik. 150 gün sonra, lif fotometrisi veya iki fotonlu kalsiyum görüntülemesi gerçekleştirdik (Şekil 4h ve genişletilmiş veriler, Şekil 10a). t-hCO hücrelerinin senkronize ritmik aktivite sergilediğini bulduk (Şekil 4i, Genişletilmiş Veriler, Şekil 10b ve Ek Video 1). Zirve t-hCO aktivitesini karakterize etmek için, anestezi uygulanmış nakil sıçanlarında ekstraselüler elektrofizyolojik kayıtlar gerçekleştirdik (genişletilmiş veriler, Şekil 10c-f). MRI görüntülerinden stereotaksik koordinatlar ürettik; bu nedenle, bu kaydedilen birimler varsayımsal insan nöronlarını temsil ediyor, ancak elektrofizyoloji tek başına bir köken türünün belirlenmesine izin vermiyor. Senkronize aktivite patlamaları gözlemledik (genişletilmiş veriler, Şekil 10d). Patlamalar yaklaşık 460 ms sürdü ve yaklaşık 2 saniyelik sessizlik periyotlarıyla ayrıldı (genişletilmiş veriler, Şekil 10d, e). Bireysel birimler patlama başına ortalama yaklaşık üç tur ateşledi; bu, patlama başına kayıtlı birimlerin yaklaşık %73'üne denk geliyor. Bireysel birimlerin aktiviteleri oldukça ilişkiliydi ve bu korelasyonlar, aynı koşullar altında kaydedilen aşılanmamış hayvanlarda tanımlanan birimlerin korelasyonlarından daha yüksekti (genişletilmiş veriler, Şekil 10f). Tanımlanan insan kaynaklı nöronların sivri yanıtlarını daha da karakterize etmek için, t-hCO nöronlarının mavi ışık uyaranlarına yanıt olarak kısa gecikmeli tanıma (10 ms'den az) yaptığı ışığa duyarlı katyon kanalı rodopsin 2'yi (hChR2) ifade eden hCO nakledilen anestezi uygulanmış sıçanlar üzerinde ışık etiketleme deneyleri gerçekleştirdik (Şekil 4m–o). t-hCO nöronları, kalsiyum görüntülemede ve ışık işaretlemesinin olmadığı t-hCO'da gerçekleştirilen elektrofizyolojik kayıtlarda gözlenenlere benzer frekanslarda kendiliğinden aktivite patlamaları sergiledi (genişletilmiş veriler, Şekil 10c-g). İn vitro kaydedilen hCO'nun karşılık gelen evrelerinde kendiliğinden aktivite gözlenmedi. t-hCO'nun duyusal uyaranlarla aktive edilip edilemeyeceğini değerlendirmek için, sıçan bıyıklarını t-hCO'dan kısa bir süreliğine uzaklaştırdık (Şekil 4j,m ve genişletilmiş veriler, Şekil 10h,k). Önceki çalışmalara göre8,10, t-hCO hücrelerinin bir alt kümesi, bıyık sapmasına yanıt olarak artmış aktivite gösterdi; bu, veriler rastgele zaman damgalarıyla karşılaştırıldığında gözlemlenmedi (Şekil 4k–q ve genişletilmiş veriler, Şekil 10h–q). Gerçekten de, opto-etiketli tek ünitelerin yaklaşık %54'ü, bıyık uyarımından sonra önemli ölçüde artmış bir uyarılma oranı gösterdi ve yaklaşık 650 ms'de zirveye ulaştı (Şekil 4r). Tüm bu veriler bir arada değerlendirildiğinde, t-hCO'nun uygun fonksiyonel girdileri aldığı ve çevresel uyaranlarla aktive edilebildiği görülmektedir.
Daha sonra t-hCO'nun sıçanlarda davranışı kontrol etmek için devreleri aktive edip edemeyeceğini araştırdık. İlk olarak t-hCO nöronlarının aksonlarının sıçanın çevreleyen dokularına projeksiyon yapıp yapmadığını araştırdık. hCO'yu hChR2'yi EYFP'ye kaynaştırılmış bir lentivirüsle (hChR2-EYFP) enfekte ettik. 110 gün sonra, işitsel, motor ve somatosensoriyel korteksler de dahil olmak üzere ipsilateral kortikal bölgelerde ve striatum, hipokampüs ve talamus da dahil olmak üzere subkortikal bölgelerde EYFP ekspresyonunu gözlemledik (Şekil 5a). Bu eferent projeksiyonların sıçan hücrelerinde sinaptik yanıtlar ortaya çıkarıp çıkaramayacağını değerlendirmek için keskin beyin kesitlerinde sıçan serebral korteks hücrelerini kaydederek hChR2-EYFP ekspresyonu gösteren t-hCO hücrelerini optik olarak aktive ettik. t-hCO aksonlarının mavi ışıkla aktivasyonu, NBQX tarafından bloke edilen sıçan piramidal korteks nöronlarında kısa gecikmeli EPSC'leri indükledi (Şekil 5b–g). Ek olarak, bu yanıtlar tetrodotoksin (TTX) tarafından bloke edilebilir ve 4-aminopiridin (4-AP) tarafından geri yüklenebilir, bu da bunların monosinaptik bağlantılardan kaynaklandığını düşündürmektedir (Şekil 5e).
a, Akson takibinin şematik diyagramı (sol). t-hCO EYFP ekspresyonu (sağ). Ölçek çubuğu, 100 µm. A1, işitsel korteks, ACC, anterior singulat korteks, d. striatum, dorsal striatum, HPC, hipokampus; Diyafram, lateral septum, mPFC, medial prefrontal korteks, piri, piriform korteks, v. striatum, ventral striatum, VPM, talamusun ventropostomedial çekirdeği, VTA, ventral tegmental bölge. Kırmızı kareler, görüntülerin alındığı beyin bölgelerini temsil eder. b, Uyarım deneyinin şematik diyagramı. c, d, İnsan (c) EYFP+ t-hCO veya sıçan (d) EYFP- hücrelerinde mavi ışıkla oluşturulan fotoakım (üst) ve voltaja (alt) verilen yanıtın örnekleri. e, f, TTX ve 4-AR (yeşil), TTX (gri) veya aCSF (siyah) ile t-hCO aksonlarının mavi ışıkla uyarılmasından sonra sıçan nöronlarının mevcut izleri (e), ile (mor) veya olmadan (siyah) ) ) NBQX (e). g, sıçan hücrelerinde mavi ışıkla oluşturulan yanıtların gecikmesi (n = 16 hücre); yatay çubuklar ortalama gecikmeyi (7,13 ms) göstermektedir (sol). NBQX ile veya NBQX olmadan kaydedilen ışıkla uyarılan EPSC'lerin genliği (n = 7 hücre; ***P < 0,0001) (ortada). NBQX ile veya NBQX olmadan kaydedilen ışıkla uyarılan EPSC'lerin genliği (n = 7 hücre; ***P < 0,0001) (ortada). Амплитуда вызванных светом EPSC, зарегистрированных с veya NBQX (n = 7 клеток; ***P <0,0001) (в центре). NBQX ile veya NBQX olmadan kaydedilen ışık kaynaklı EPSC'lerin genliği (n = 7 hücre; ***P < 0,0001) (ortada).NBQX 记录的光诱发EPSC 的振幅（n = 7 个细胞；***P < 0,0001）（中）。NBQX 记录的光诱发EPSC 的振幅（n = 7 个细胞；***P < 0,0001）（中）。 Амплитуда вызванных светом EPSC, зарегистрированных с veya NBQX (n = 7 клеток; ***P <0,0001) (в центре). NBQX ile veya NBQX olmadan kaydedilen ışık kaynaklı EPSC'lerin genliği (n = 7 hücre; ***P < 0,0001) (ortada).Mavi ışığa yanıt veren EPSC'leri gösteren sıçan hücrelerinin yüzdesi (sağ). h, Davranışsal bir görevin şematik diyagramı. d0, gün 0. i. Örnek hayvanların eğitimin 1. gününde (sol) veya 15. gününde (sağ) performansı. 1. günde (sol) veya 15. günde (sağ ortada) gerçekleştirilen yalama sayısının ortalaması (n = 150 mavi ışık denemesi, n = 150 kırmızı ışık denemesi; ***P < 0,0001). 1. günde (sol) veya 15. günde (sağ ortada) gerçekleştirilen yalama sayısının ortalaması (n = 150 mavi ışık denemesi, n = 150 kırmızı ışık denemesi; ***P < 0,0001). Среднее количество облизываний, выполненных в 1. gün (слева) veya день 15 (в центре справа) (n = 150 испытаний с) синим светом, n = 150 испытаний с красным светом; ***P <0,0001). 1. günde (sol) veya 15. günde (orta sağ) gerçekleştirilen yalama sayısının ortalaması (n = 150 mavi ışık denemesi, n = 150 kırmızı ışık denemesi; ***P < 0,0001).第1 天（左）或第15 天（右中）执行的平均舔次数（n = 150 次蓝光试验,n = 150次红光试验；***P < 0,0001）。第1 天（左）或第15 天（右中）执行的平均舔次数（n = 150 次蓝光试验,n = 150次红光试验；***P < 0,001 Среднее количество облизываний, выполненных в 1. gün (слева) veya день 15 (в центре справа) (n = 150 испытаний с) синим светом, n = 150 испытаний с красным светом; ***P <0,0001). 1. günde (sol) veya 15. günde (orta sağ) gerçekleştirilen yalama sayısının ortalaması (n = 150 mavi ışık denemesi, n = 150 kırmızı ışık denemesi; ***P < 0,0001).Kırmızı ve mavi ışık denemeleri için 1. günde (orta sol) veya 15. günde (sağ) kümülatif yalamalar. NS, önemli değil. j,k, hChR2-EYFP (j) veya kontrol floroforu (k) ifade eden t-hCO ile 1. veya 15. günde nakledilen tüm hayvanların davranışsal özellikleri (hChR2-EYFP: n = 9 sıçan, ** P = 0,0049; kontrol: n = 9, P = 0,1497). l, Tercih puanının evrimi (n = 9 hChR2, n = 9 kontrol; **P < 0,001, ***P < 0,0001). l, Tercih puanının evrimi (n = 9 hChR2, n = 9 kontrol; **P < 0,001, ***P < 0,0001). l, Эволюция показателя предпочтения (n = 9 hChR2, n = 9 контрольных; **P <0,001, ***P <0,0001). l, Tercih puanının evrimi (n = 9 hChR2, n = 9 kontrol; **P < 0,001, ***P < 0,0001). l，偏好评分的演变（n = 9 hChR2，n = 9 对照；**P < 0,001，***P < 0,0001）。 l，偏好评分的演变（n = 9 hChR2，n = 9 对照；**P < 0,001，***P < 0,0001）。 l, Эволюция показателей предпочтения (n = 9 hChR2, n = 9 контролей; **P <0,001, ***P <0,0001). l, Tercih puanlarının evrimi (n = 9 hChR2, n = 9 kontrol; **P < 0,001, ***P < 0,0001).m, S1'de t-hCO'nun optogenetik aktivasyonuna yanıt olarak FOS ekspresyonu. FOS ekspresyonunun görüntüleri (sol) ve kantifikasyonu (grup başına n = 3; *P < 0,05, **P < 0,01 ve ***P < 0,001) (sağ) gösterilmektedir. FOS ekspresyonunun görüntüleri (sol) ve kantifikasyonu (grup başına n = 3; *P < 0,05, **P < 0,01 ve ***P < 0,001) (sağ) gösterilmektedir. FOS (слева) ve количественного определения (n = 3 grup; * P <0,05, ** P <0,01 и *** P <0,001) (справа). FOS ekspresyonunun görüntüleri (sol) ve kantifikasyonu (grup başına n = 3; *P<0,05, **P<0,01 ve ***P<0,001) gösterilmektedir (sağ).FOS 表达（左）和量化（每组n = 3；*P < 0,05、**P < 0,01 ve***P < 0,001）（右）的图像。FOS 表达（左）和量化（每组n = 3；*P < 0,05、**P < 0,01 ve***P < 0,001）（右）的图像。 FOS (слева) ve количественного определения (n = 3 grup; * P <0,05, ** P <0,01 и *** P <0,001) (справа). FOS ekspresyonunun görüntüleri (sol) ve kantifikasyonu (grup başına n = 3; *P<0,05, **P<0,01 ve ***P<0,001) gösterilmektedir (sağ).Ölçek çubuğu, 100 µm. Veriler BLA, bazolateral tonsil, MDT, dorsomedial talamik çekirdek, PAG, periakuaduktal grinin ortalama ± standart hatası olarak ifade edilir.
Son olarak, t-hCO'nun sıçan davranışını düzenleyip düzenleyemeyeceğini sorduk. Bunu test etmek için, hChR2-EYFP ifade eden hCO'yu S1'e naklettik ve 90 gün sonra, ışık iletimi için t-hCO'ya optik fiberler naklettik. Daha sonra sıçanları değiştirilmiş bir operant koşullanma paradigmasıyla eğittik (Şekil 5h). Hayvanları bir davranış test odasına yerleştirdik ve rastgele 5 saniyelik mavi (473 nm) ve kırmızı (635 nm) lazer uyaranları uyguladık. Hayvanlar mavi ışık uyarımı sırasında yalarlarsa su ödülü aldılar, ancak kırmızı ışık uyarımı sırasında yalamadılar. Eğitimin ilk gününde, hayvanlar mavi veya kırmızı ışıkla uyarıldığında yalamada hiçbir fark göstermedi. Ancak, 15. günde, hChR2-EYFP ifade eden hCO ile nakledilen hayvanlar, kırmızı ışık uyarımına kıyasla mavi ışıkla uyarıldığında daha aktif yalama gösterdi. Yalama davranışındaki bu değişiklikler, kontrol floroforunu ifade eden hCO ile nakledilen kontrol hayvanlarında gözlenmedi (öğrenme başarı oranı: hChR2 %89, EYFP %0, Şekil 5i-1 ve Ek Video 2). Bu veriler, t-hCO hücrelerinin ödül arama davranışını uyarmak için sıçan nöronlarını aktive edebileceğini göstermektedir. Bu davranışsal değişikliklerde hangi sıçan t-hCO sinir devrelerinin yer alabileceğini bulmak için, eğitilmiş hayvanlarda ve hasat edilen dokularda 90 dakika sonra optogenetik olarak t-hCO'yu aktive ettik. İmmünohistokimya, medial prefrontal korteks, medial talamus ve periaqueductal gri madde dahil olmak üzere motive olmuş davranışta yer alan çeşitli beyin bölgelerinde aktiviteye bağlı FOS proteininin ifadesini ortaya koydu. Bu protein, uyarılmamış kontrol hayvanlarında veya hayvanlarda ifade edildi. pirinç. 5m). Birlikte ele alındığında, bu veriler t-hCO'nun davranışı yönlendirmek için sıçan nöronal aktivitesini modüle edebileceğini göstermektedir.
Sinir organoidleri, insan gelişimini ve hastalıklarını in vitro incelemek için umut vadeden bir sistem sunar, ancak in vivo'da var olan devreler arasındaki bağlantıların eksikliğiyle sınırlıdırlar. İnsan hücre gelişimini ve işlevini in vivo incelemek için hCO'yu bağışıklık sistemi zayıflamış erken doğum sonrası sıçanların S1'ine naklettiğimiz yeni bir platform geliştirdik. t-hCO'nun in vitro'da gözlemlenmeyen olgun hücre tiplerini geliştirdiğini28 ve t-hCO'nun anatomik ve işlevsel olarak kemirgen beynine entegre olduğunu gösterdik. t-hCO'nun kemirgen sinir devrelerine entegrasyonu, insan hücresel aktivitesi ile incelenen hayvan davranışı arasında bir bağlantı kurmamızı sağladı ve t-hCO nöronlarının davranışsal tepkileri yönlendirmek için sıçan nöronal aktivitesini modüle edebileceğini gösterdi.
Açıkladığımız platform, insan hücrelerini kemirgen beyinlerine nakletme konusunda daha önceki araştırmalara kıyasla birçok avantaja sahiptir. İlk olarak, hCO'yu erken doğum sonrası sıçanların gelişmekte olan korteksine naklettik, bu anatomik ve işlevsel entegrasyonu kolaylaştırabilir. İkinci olarak, t-hCO MRI izlemesi, canlı hayvanlarda greft pozisyonunu ve büyümesini incelememize olanak tanıyarak uzun vadeli çok hayvanlı çalışmalar yürütmemize ve çeşitli hiPS hücre hatlarının güvenilirliğini belirlememize olanak sağladı. Son olarak, izole edilmiş tek hücre süspansiyonları yerine, insan hücrelerine daha az zarar veren ve sıçan beyinlerinde insan korteks nöronlarının entegrasyonunu ve üretimini destekleyebilen sağlam organoidler naklettik.
Bu platformdaki gelişmelere rağmen, zamansal, mekansal ve türler arası kısıtlamaların, gelişimin erken bir aşamasında nakilden sonra bile yüksek doğrulukta insan sinir devrelerinin oluşumunu engellediğini kabul ediyoruz. Örneğin, t-hCO'da gözlemlenen kendiliğinden aktivitenin, kortikal gelişim sırasında gözlemlenen ritmik aktiviteye benzer bir gelişimsel fenotipi temsil edip etmediği veya t-hCO'da bulunan baskılayıcı hücre tiplerinin yokluğundan mı kaynaklandığı net değildir. Benzer şekilde, t-hCO'da laminasyonun yokluğunun zincir bağlantısını ne ölçüde etkilediği de net değildir30. Gelecekteki çalışmalar, montaj 6'yı in vitro kullanarak gösterildiği gibi insan mikrogliası, insan endotel hücreleri ve değişen oranlarda GABAerjik internöronlar gibi diğer hücre tiplerini entegre etmeye ve hastalardan elde edilen hücrelerde değiştirilmiş t-hCO'da sinir entegrasyonunun ve işlenmesinin nasıl meydana gelebileceğini anlamaya odaklanacaktır. transkripsiyonel, sinaptik ve davranışsal düzeyler.
Genel olarak, bu in vivo platform, in vitro insan beyin gelişimi ve hastalık araştırmalarını tamamlayabilecek güçlü bir kaynak sunmaktadır. Bu platformun, aksi takdirde yakalanması zor olan hasta kaynaklı hücrelerde yeni iplik düzeyinde fenotipler keşfetmemize ve yeni terapötik stratejileri test etmemize olanak sağlayacağını öngörüyoruz.
Daha önce açıklandığı gibi HiPS hücrelerinden hCO2.5 ürettik. Besleyici katmanlarda kültürlenen hiPS hücrelerinden hCO üretimi başlatmak için, hiPS hücrelerinin sağlam kolonileri dispase (0,35 mg/mL) kullanılarak kültür kaplarından çıkarıldı ve hiPS hücre kültürü ortamı içeren kaplar içeren ultra düşük bağlanma plastik kültürlerine aktarıldı. (Corning) iki SMAD inhibitörü dorsomorfin (5 μM; P5499, Sigma-Aldrich) ve SB-431542 (10 μM; 1614, Tocris) ve ROCK inhibitörü Y-27632 (10 μM; S1049, Selleckchem) ile desteklendi. İlk 5 gün boyunca, hiPS hücre ortamı günlük olarak değiştirildi ve dorsomorfin ve SB-431542 eklendi. Süspansiyonun altıncı gününde, nöral sferoidler nörobazal-A (10888, Life Technologies), A vitamini içermeyen B-27 takviyesi (12587, Life Technologies), GlutaMax (1:100, Life Technologies), penisilin ve streptomisin (1:100, Life Technologies) içeren nöral ortama aktarıldı ve 24. güne kadar epidermal büyüme faktörü (EGF; 20 ng ml-1; R&D Systems) ve fibroblast büyüme faktörü 2 (FGF2; 20 ng ml-1; R&D Systems) ile desteklendi. 25. günden 42. güne kadar ortama beyin kaynaklı nörotrofik faktör (BDNF; 20 ng ml-1, Peprotech) ve nörotrofin 3 (NT3; 20 ng ml-1; Peprotech) eklendi ve ortam her iki günde bir değiştirildi. Süspansiyonun altıncı gününde, nöral sferoidler nörobazal-A (10888, Life Technologies), A vitamini içermeyen B-27 takviyesi (12587, Life Technologies), GlutaMax (1:100, Life Technologies), penisilin ve streptomisin (1:100, Life Technologies) içeren nöral ortama aktarıldı ve 24. güne kadar epidermal büyüme faktörü (EGF; 20 ng ml-1; R&D Systems) ve fibroblast büyüme faktörü 2 (FGF2; 20 ng ml-1; R&D Systems) ile desteklendi. 25. günden 42. güne kadar ortama beyin kaynaklı nörotrofik faktör (BDNF; 20 ng ml-1, Peprotech) ve nörotrofin 3 (NT3; 20 ng ml-1; Peprotech) eklendi ve ortam her iki günde bir değiştirildi.Süspansiyonun altıncı gününde nöral sferoidler, Neurobasal-A (10888, Life Technologies), A vitamini içermeyen B-27 takviyesi (12587, Life Technologies), GlutaMax (1:100, Life Technologies), penisilin içeren nöral ortama transfer edildi.и стрептомицин (1:100, Life Technologies) ve дополнены эпидермальным фактором роста (EGF; 20 нг/мл; R&D Systems) ve фактором роста фибробластов 2 (FGF2; 20 нг/мл; Ar-Ge Sistemleri) 24 gün boyunca. ve streptomisin (1:100, Life Technologies) ile 24. güne kadar epidermal büyüme faktörü (EGF; 20 ng/ml; R&D Systems) ve fibroblast büyüme faktörü 2 (FGF2; 20 ng/ml; R&D Systems) ile desteklendi.25. günden 42. güne kadar besiyerine beyin kaynaklı nörotrofik faktör (BDNF; 20 ng ml-1, Peprotech) ve nörotrofin 3 (NT3; 20 ng ml-1, Peprotech) eklendi ve besiyeri her iki günde bir değiştirildi.在悬浮的第6 天，将神经球体转移到含有nörobasal-A（10888，Life Technologies）、不含维生素A 的B-27补充剂（12587，Life Technologies）、GlutaMax（1:100，Life Technologies）、青霉素的神经培养基中和链霉素（1:100，Life Technologies）并辅以表皮生长因子（EGF；20 ng ml-1；R&D Systems）和成纤维细胞生长因子2（FGF2；20 ng ml-1；R&D Systems (24 Mayıs)在 悬浮 的 第 第 6 天 将 神经 球体 转移 含有 含有 nörobasal-a （10888 ， Life Technologies） 不 含 维生素 a 的b-27 补充剂 （12587 ， Life Technologies） Glutamax （（1: 100 ， Life TechNOGIS青霉素 的 神经 培养 基 中 链霉素 （（1: 100 ， Life Teknolojiler） 生长 因子 （（（20 ng ml-1 ； Ar-Ge Sistemleri） 直至第24天。 На 6-й день суспензии нейросферы были переведены на добавку, содержащую нейробазал-А (10888, Yaşam Teknolojileri), добавку В-27 без витамина А (12587, Yaşam Teknolojileri), GlutaMax (1:100, Yaşam Teknolojileri), пенициллин- нейтрализованный стрептомицин (1:100, Yaşam Teknolojileri) с добавлением эпидермального фактора роста (EGF; 20 нг мл-1; Ar-Ge Sistemleri) ve фактора роста фибробластов 2 (FGF2; 20 нг мл-1) 1; 6. günde, nörosfer süspansiyonları nörobazal-A (10888, Life Technologies), A vitamini içermeyen B-27 takviyesi (12587, Life Technologies), GlutaMax (1:100, Life Technologies), penisilin nötralize streptomisin (1:100, Life Technologies) içeren bir takviyeye, epidermal büyüme faktörü (EGF; 20 ng ml-1; R&D Systems) ve fibroblast büyüme faktörü 2 (FGF2; 20 ng ml-1) 1 ile takviye edilmiş bir takviyeye geçirildi; Ar-Ge Sistemleri) 24 gün önce. Ar-Ge Sistemleri) 24. güne kadar.25. günden 42. güne kadar beyinden türetilen nörotrofik faktör (BDNF; 20 ng ml-1, Peprotech) ve nörotrofik faktör 3 (NT3; 20 ng ml-1, Peprotech) kültür ortamına her iki günde bir eklendi. Ortam bir kez değiştirildi.43. günden itibaren hCO, her 4-6 günde bir ortam değişikliği ile desteklenmemiş nörobazal-A ortamında (NM; 1088022, Thermo Fisher) muhafaza edildi. Besleyicisiz koşullar altında kültürlenen hiPS hücrelerinden hCO elde etmek için hiPS hücreleri Accutase (AT-104, Innovate Cell Technologies) ile 37°C'de 7 dakika inkübe edildi, tek hücrelere ayrıldı ve ROCK inhibitörü Y-27632 (10 μM; S1049, Selleckchem) ile desteklenmiş Essential 8 ortamında kuyu başına 3 × 106 tek hücre yoğunluğunda AggreWell 800 plakalarına (34815, STEMCELL Technologies) eklendi. 24 saat sonra, kuyulardaki medya, dorsomorfin (2,5 μM; P5499, Sigma-Aldrich) ve SB-431542 (10 μM; 1614) ile desteklenmiş Essential 6 medyası (A1516401, Life Technologies) içeren medyaya yukarı ve aşağı pipetlendi. , Tocrida). 2 ila 6. günler arasında, Essential 6 medyası günlük olarak dorsomorfin ve SB-431542 takviyesi ile değiştirildi. Altıncı günden itibaren, nörosfer süspansiyonları nörobazal ortama aktarıldı ve yukarıda açıklandığı gibi muhafaza edildi.
Tüm hayvan prosedürleri Stanford Üniversitesi Laboratuvar Hayvan Bakımı İdari Komitesi (APLAC) tarafından onaylanan hayvan bakımı yönergelerine uygun olarak gerçekleştirildi. Gebe ötimik RNU (rnu/+) sıçanlar satın alındı ​​(Charles River Laboratuvarları) veya barındırıldı. Hayvanlar, ad libitum yiyecek ve su ile 12 saatlik bir ışık-karanlık döngüsünde tutuldu. Üç ila yedi günlük çıplak (FOXN1–/–) sıçan yavruları, ayıklamadan önce olgunlaşmamış bıyıkların büyümesiyle tanımlandı. Yavrular (erkek ve dişi) %2-3 izofluran ile anestezi altına alındı ​​ve stereotaksik bir çerçeveye yerleştirildi. Dura mater bütünlüğü korunarak S1'in yaklaşık 2-3 mm üzerinde bir çapa sahip kafatasının trepanasyonu gerçekleştirildi. Daha sonra durayı delmek için kraniotominin hemen dışından 30-G iğne (yaklaşık 0,3 mm) kullanın. Daha sonra ince bir 3x3 cm parafilme HCO uygulayın ve fazla medyumu temizleyin. 23 G, 45° iğneye takılı bir Hamilton şırıngası kullanarak hCO3'ü iğnenin en distal ucuna nazikçe çekin. Ardından şırıngayı stereotaksik cihaza bağlı şırınga pompasına takın. Ardından iğnenin ucunu dura materde daha önce yapılmış 0,3 mm genişliğindeki bir delme deliğinin üzerine yerleştirin (z = 0 mm) ve iğne dura mater A arasına gelene kadar şırıngayı 1–2 mm (z = yaklaşık –1,5 mm) daraltın. Yoğun bir conta oluşur. Ardından şırıngayı z = -0,5 mm'de kortikal yüzeyin merkezine kaldırın ve dakikada 1-2 µl hızında hCO3 enjekte edin. hCO3 enjeksiyonu tamamlandıktan sonra iğne dakikada 0,2-0,5 mm hızında geri çekilir, deri dikilir ve yavru köpek tamamen iyileşene kadar hemen ılık bir ısıtma yastığına yerleştirilir. Bazı hayvanlar bilateral olarak nakledildi.
Tüm hayvan prosedürleri Stanford Üniversitesi APLAC onaylı hayvan bakımı yönergelerine uygun olarak gerçekleştirildi. Sıçanlar (transplantasyondan 60 günden fazla süre sonra) %5 izofluran anestezisiyle indüklendi ve görüntüleme sırasında %1-3 izofluranla anestezi uygulandı. Görüntüleme için, International Electric Company (IECO) gradyan sürücülü 7 Tesla aktif olarak korunan yatay sondaj tarayıcısı Bruker (Bruker Corp.), 120 mm iç çaplı korumalı gradyan ek parçası (600 mT/m, 1000 T/m/s) AVANCE kullanılarak kullanıldı. III, sekiz kanallı çoklu bobin RF ve çoklu çekirdek yetenekleri ve eşlik eden Paravision 6.0.1 platformu. Kayıt, 86 mm iç çaplı aktif olarak ayrılmış hacimsel RF bobini ve yalnızca alım için dört kanallı kriyo-soğutulmuş RF bobini kullanılarak gerçekleştirildi. 16 kesit yakalamalı, kesit kalınlığı 0,6–0,8 mm olan ve 256 × 256 örnek içeren Aksiyel 2D Turbo-RARE (tekrarlama süresi = 2500 ms, yankı süresi = 33 ms, 2 ortalama). Sinyaller, 2 cm iç çapa sahip bir karesel alıcı-verici hacimsel RF bobini (Rapid MR International, LLC) kullanılarak alındı. Son olarak, 3B oluşturma ve hacim analizi için yerleşik Imaris (BitPlane) yüzey tahmin işlevlerini kullanın. Başarılı bir nakil, nakledilen yarım kürede sürekli T2 ağırlıklı MRI sinyali alanlarının oluştuğu nakil olarak tanımlandı. Greft reddi, nakledilen yarım kürede sürekli T2 ağırlıklı MRI sinyali alanları üretmeyen greft olarak tanımlandı. Subkortikal t-hCO, sonraki analizden hariç tutuldu.
İki foton kalsiyum görüntüleme için hCO'da GCaMP6s'yi stabil bir şekilde ifade etmek için, hiPS hücreleri pLV[Exp]-EF1a::GcaMP6s-WPRE-Puro ile enfekte edildi ve ardından antibiyotik seçimi yapıldı. Kısaca, hücreler EDTA ile ayrıştırıldı ve polibren (5 μg/ml) ve 15 μl virüs varlığında yaklaşık 300.000 hücre yoğunluğunda 1 ml Essential 8 ortamında süspanse edildi. Hücreler daha sonra 60 dakika boyunca süspansiyonda inkübe edildi ve kuyucuk başına 50.000 hücre yoğunluğunda ekildi. Birleşmeden sonra, hücreler 5-10 gün boyunca veya stabil koloniler görünene kadar 5-10 μg ml-1 puromisin ile muamele edildi. Akut hCO enfeksiyonu daha önce açıklandığı gibi5 bazı değişikliklerle gerçekleştirildi. Kısaca, 30-45. gün hCO'yu 100 µl sinir ortamı içeren 1,5 ml Eppendorf mikrosantrifüj tüplerine aktarın. Daha sonra ortamın yaklaşık 90 µl'si çıkarılır, tüpe 3-6 µl yüksek titreli lentivirüs (0,5 x 108'den 1,2 x 109'a) eklenir ve hCO 30 dakika inkübatöre aktarılır. Daha sonra her tüpe 90–100 µl ortam ekleyin ve tüpleri gece boyunca inkübatöre geri koyun. Ertesi gün, hCO'yu düşük bağlanma plakalarındaki taze sinir ortamına aktarın. 7 gün sonra hCO, enfeksiyon kalitesinin görselleştirilmesi ve değerlendirilmesi için 24 kuyulu cam tabanlı plakalara aktarıldı. pLV[Exp]-SYN1::EYFP-WPRE ve pLV[Exp]-SYN1::hChR2-EYFP-WPRE VectorBuilder tarafından üretildi. Lentivirüs çoğu deneyde kullanılır çünkü konak genomuna entegredir ve enfekte hücre hatlarında muhabir gen ekspresyonuna izin verir. Kuduz takibi için, 30-45. gün hCO, kuduz-ΔG-eGFP ve AAV-DJ-EF1a-CVS-G-WPRE-pGHpA (plazmid #67528, Addgene) ile birlikte enfekte edildi, 3 gün boyunca iyice yıkandı ve S1'deki sıçanlara nakledildi ve 7-14 gün boyunca in vivo tutuldu.
İmmünositokimya için, hayvanlar anestezi altına alındı ​​ve PBS ile transkardiyal perfüze edildi, ardından %4 paraformaldehit (PBS içinde PFA; Elektron Mikroskobu Bilimleri) eklendi. Beyinler %4 PFA'da 2 saat veya 4 °C'de bir gece boyunca fiksasyona tabi tutuldu, PBS'de %30 sakarozda 48-72 saat kriyoprezervasyona tabi tutuldu ve 1:1, %30 sakaroz: OCT'ye (Tissue-Tek OCT Bileşik 4583, Sakura Finetek) gömüldü ve koronal kesitler bir kriyostat (Leica) kullanılarak 30 µm'de yapıldı. Kalın kesitlerin immünohistokimyası için, hayvanlar PBS ile perfüze edildi ve beyin diseke edildi ve bir vibratom (Leica) kullanılarak 300-400 µm'de koronal olarak kesildi ve kesitler %4 PFA ile 30 dakika fiksasyona tabi tutuldu. Daha sonra kriyoseksiyonlar veya kalın kesitler PBS ile yıkandı, oda sıcaklığında 1 saat boyunca bloke edildi (%10 normal eşek serumu (NDS) ve PBS'de seyreltilmiş %0,3 Triton X-100) ve 4°C'de bloke etme solüsyonu ile bloke edildi. – İnkübasyon Kriyoseksiyonlar bir gece boyunca inkübe edildi ve kalın kesitler 5 gün boyunca inkübe edildi. Kullanılan birincil antikorlar şunlardı: anti-NeuN (fare, 1:500; ab104224, abcam) anti-CTIP2 (sıçan, 1:300; ab18465, abcam), anti-GFAP (tavşan, 1:1.000; Z0334, Dako), anti-GFP (tavuk, 1:1.000; GTX13970, GeneTex), anti-HNA (fare, 1:200; ab191181, abcam), anti-NeuN (tavşan, 1:500; ABN78, Millipore), anti-PDGFRA (tavşan, 1:200; sc-338, Santa Cruz), anti-PPP1R17 (tavşan, 1:200; HPA047819, Atlas Antikorları), anti-RECA-1 (fare, 1:50; ab9774, abcam), anti-SCG2 (tavşan, 1:100; 20357-1-AP, Proteintech), anti-SOX9 (keçi, 1:500; AF3075, R&D Systems), Netrin G1a (keçi, 1:100; AF1166, R&D Systems), anti-STEM121 (fare, 1:200; Y40410, Takara Bio), anti-SATB2 (fare, 1:50; ab51502, abcam), anti-GAD65/67 (tavşan, 1:400; ABN904, Millipore) ve anti-IBA1 (keçi, 1:100; ab5076, abcam). Kullanılan birincil antikorlar şunlardı: anti-NeuN (fare, 1:500; ab104224, abcam) anti-CTIP2 (sıçan, 1:300; ab18465, abcam), anti-GFAP (tavşan, 1:1.000; Z0334, Dako), anti -GFP (tavuk, 1:1.000; GTX13970, GeneTex), anti-HNA (fare, 1:200; ab191181, abcam), anti-NeuN (tavşan, 1:500; ABN78, Millipore), anti-PDGFRA (tavşan, 1:200; sc-338, Santa Cruz), anti-PPP1R17 (tavşan, 1:200; HPA047819, Atlas Antikorları), anti-RECA-1 (fare, 1:50; ab9774, abcam), anti-SCG2 (tavşan, 1:100; 20357-1-AP, Proteintech), anti-SOX9 (keçi, 1:500; AF3075, R&D Systems), Netrin G1a (keçi, 1:100; AF1166, R&D Systems), anti-STEM121 (fare, 1:200; Y40410, Takara Bio), anti-SATB2 (fare, 1:50; ab51502, abcam), anti-GAD65/67 (tavşan, 1:400; ABN904, Millipore) ve anti-IBA1 (keçi, 1:100; ab5076, abcam). Использовались следующие первичные антитела: анти-NeuN (мышиные, 1:500; ab104224, abcam), анти-CTIP2 (крысиные, 1:300; ab18465, abcam), анти-GFAP (кроличьи, 1:1000; Z0334, Dako), анти- -GFP (курица, 1:1000; GTX13970, GeneTex), анти-HNA (мышь, 1:200; ab191181, abcam), анти-NeuN (кролик, 1:500; ABN78, Millipore), анти-PDGFRA (кролик, 1:200; sc-338, Санта-Круз), анти-PPP1R17 (кролик, 1:200; HPA047819, Atlas Antikorları), анти-RECA-1 (мышь, 1:50; ab9774, abcam), анти-SCG2 (кролик, 1:100; 20357-1-AP, Proteintech), анти-SOX9 (козий, 1:500; AF3075, R&D Systems), нетрин G1a (козий, 1:100; AF1166, Ar-Ge Sistemleri), анти-STEM121 (мышиный, 1:200; Y40410, Takara Bio), анти-SATB2 (мышь, 1:50; ab51502, abcam), анти-GAD65/67 (кролик, 1:400; ABN904, Millipore) ve анти-IBA1 (коза, 1 :100; аб5076, абкам). Kullanılan birincil antikorlar şunlardı: anti-NeuN (fare, 1:500; ab104224, abcam), anti-CTIP2 (sıçan, 1:300; ab18465, abcam), anti-GFAP (tavşan, 1:1000; Z0334, Dako), anti-GFP (tavuk, 1:1000; GTX13970, GeneTex), anti-HNA (fare, 1:200; ab191181, abcam), anti-NeuN (tavşan, 1:500; ABN78, Millipore), anti-PDGFRA (tavşan, 1:200; sc-338, Santa Cruz), anti-PPP1R17 (tavşan, 1:200; HPA047819, Atlas Antikorları), anti-RECA-1 (fare, 1:50; ab9774, abcam), anti- SCG2 (tavşan, 1:100; 20357-1-AP, Proteintech), anti-SOX9 (keçi, 1:500; AF3075, R&D Systems), netrin G1a (keçi, 1:100; AF1166, R&D Systems), anti- STEM121 (fare, 1:200; Y40410, Takara Bio), anti-SATB2 (fare, 1:50; ab51502, abcam), anti-GAD65/67 (tavşan, 1:400; ABN904, Millipore) ve anti-IBA1 (keçi, 1:100; ab5076, abkam).使用的一抗是:抗NeuN（小鼠，1:500；ab104224，abcam）抗CTIP2（大鼠，1:3 00；ab18465，abcam），GFAP（兔，1:1,000；Z0334，Dako），抗-GF P（鸡，1:1,000；GTX13970，GeneTex），抗HNA（小鼠，1:200；ab1911 81，abcam），抗NeuN（兔，1:500；ABN78，Millipore），抗PDGFRA（兔， 1:200；sc-338，Santa Cruz），抗PPP1R17（兔，1:200；HPA047819，Atlas抗体），RECA-1（小鼠，1:50；ab9774，abcam），抗SCG2（兔）, 1:100；20357-1-AP，Proteintech），抗SOX9（山羊，1:500；AF3075，R&D Systems），Netrin G1a（山羊，1:100；AF1166，R&D Systems），抗STEM121（小鼠, 1:200;使用的一抗是:抗NeuN（小鼠，1:500；ab104224，abcam）抗CTIP2（大鼠，1 :300；ab18465，abcam），GFAP（兔，1:1,000；Z0334，Dako），抗-GFP（鸡，1:1,000；GTX13970，GeneTex），抗HNA（小鼠，1:200；ab 191181，abcam），抗NeuN（兔，1:500；ABN78，Millipore％弔，抗1: 200；sc-338，Santa Cruz），抗PPP1R17（兔，1:200；HPA047819，Atlas RECA-1 (小鼠), 1:50, ab9774, abcam), SCG2 100；20357-1-AP，Proteintech），抗SOX9（山羊，1:500；AF3075，R&D Systems）,Netrin G1a（山羊，1:100；AF1166，R&D Sistemler）頏1:20, ;Y40410, Takara Bio), anti-SATB2 (fare, 1:50; ab51502, abcam), anti-GAD65/67 (tavşan, 1:400; ABN904, Millipore) ve anti-IBA1 (keçi, 1:100; ab5076, abcam)。Kullanılan birincil antikorlar şunlardı: anti-NeuN (fare, 1:500; ab104224, abcam), anti-CTIP2 (sıçan, 1:300; ab18465, abcam), anti-GFAP (tavşan, 1:1000; Z0334, Dako). , anti-GFP (tavuk, 1:1000; GTX13970, GeneTex), anti-HNA (fare, 1:200; ab191181, abcam), anti-NeuN (tavşan, 1:500; ABN78, Millipore), anti-PDGFRA (tavşan, 1:200; sc-338, Santa Cruz), anti-PPP1R17 (tavşan, 1:200; HPA047819, Atlas antikoru), anti-RECA-1 (fare, 1:50; ab9774, abcam), anti- SCG2 (tavşan), 1:100;20357-1-AP, Proteintech), анти-SOX9 (коза, 1:500; AF3075, R&D Systems), Нетрин G1a (коза, 1:100; AF1166, R&D Systems), анти -STEM121 (мышь, 1:200; Y40410, Takara Bio), анти-SATB2 (мышь, 1:50; ab51502, abcam), анти-GAD65/67 (кролик, 1:400; ABN904, Millipore) ve анти-IBA1 (коза, 1:100; аб5076, абкам). 20357-1-AP, Proteintech), anti-SOX9 (keçi, 1:500; AF3075, R&D Systems), Netrin G1a (keçi, 1:100; AF1166, R&D Systems), anti-STEM121 (fare, 1:200; Y40410, Takara Bio), anti-SATB2 (fare, 1:50; ab51502, abcam), anti-GAD65/67 (tavşan, 1:400; ABN904, Millipore) ve anti-IBA1 (keçi, 1:100; ab5076, abkam).Kesitler daha sonra PBS ile yıkandı ve sekonder antikorla oda sıcaklığında 1 saat (dondurulmuş kesitler) veya 4°C'de bir gece (kalın kesitler) inkübe edildi. Bloklama solüsyonunda 1:1000 oranında seyreltilmiş Alexa Flor sekonder antikoru (Life Technologies) kullanıldı. PBS ile yıkamadan sonra, çekirdekler bir Hoechst 33258 (Life Technologies) ile görüntülendi. Son olarak, slaytlar bir Aquamount (Polysciences) kullanılarak lamel camlı bir mikroskop (Fisher Scientific) üzerine yerleştirildi ve görüntü üzerinde bir Keyence floresan mikroskobu (BZ-X analizörü) veya bir Leica TCS SP8 konfokal mikroskobu (Las-X) üzerinde analiz edildi. Görüntüler ImageJ programı (Fiji) kullanılarak işlendi. t-hCO ve sıçan korteksindeki insan nöronlarının oranını ölçmek için, t-hCO'nun merkezinde, sıçan korteksinin kenarında veya yakınında 387,5 μm genişliğinde dikdörtgen görüntüler alındı. Greft marjları, doku şeffaflığındaki, HNA+ çekirdeklerindeki ve/veya doku otofloresansındaki değişiklikleri değerlendirerek belirlendi. Her görüntüde, NeuN+ ve HNA+ hücrelerinin toplam sayısı, aynı alandaki NeuN+ hücrelerinin toplam sayısına bölündü. Yalnızca görüntü düzleminde çekirdeği olan hücrelerin sayıldığından emin olmak için, hesaplamaya yalnızca Hoechst+ olan hücreler dahil edildi. İstatistiksel hatayı azaltmak için en az 1 mm arayla ayrılmış iki görüntü ortalaması alındı.
Örnek toplanmasından bir hafta önce, hCO nakil hayvanlarını (yaklaşık 8 aylık farklılaşma) duyusal uyarımı en aza indirmek için bıyıkları kesilmiş karanlık bir odaya koyun. Çekirdeklerin izolasyonu daha önce açıklandığı gibi, bazı değişikliklerle gerçekleştirildi. Kısaca, t-hCO ve hCO deterjan-mekanik hücre lizisi ve 2 ml'lik bir cam doku öğütücü (D8938, Sigma-Aldrich/KIMBLE) kullanılarak yok edildi. Ham çekirdekler daha sonra 40 µm'lik bir filtre kullanılarak filtrelendi ve sakaroz yoğunluk gradyanı gerçekleştirilmeden önce 4 °C'de 10 dakika boyunca 320 g'de santrifüj edildi. Santrifüjleme adımından sonra (4°C'de 20 dakika boyunca 320 g), örnekler 0,2 birim µl-1 RNase inhibitörü (40 u µl-1, AM2682, Ambion) eklenmiş %0,04 BSA/PBS'de yeniden süspanse edildi ve 40 µm akış filtresinden geçirildi. Ayrışmış çekirdekler daha sonra %0,02 BSA içeren PBS'de yeniden süspanse edildi ve bir Chromium Single Cell 3′ çipine yüklendi (şerit başına tahmini 8.000 hücre geri kazanımı). snRNA-seq kütüphaneleri Chromium Single cell 3′ GEM, Library & Gel Bead Kit v3 (10x Genomics) ile hazırlandı. snRNA-seq kütüphaneleri Chromium Single cell 3′ GEM, Library & Gel Bead Kit v3 (10x Genomics) ile hazırlandı. Библиотеки snRNA-seq были приготовлены с помощью Krom Tek hücreli 3′ GEM, Kütüphane ve Jel Boncuk Kiti v3 (10x Genomics). snRNA-seq kütüphaneleri Chromium Single cell 3′ GEM, Library & Gel Bead Kit v3 (10x Genomics) kullanılarak hazırlandı. snRNA-seq 文库是使用Chromium Single Cell 3′ GEM、Library & Gel Bead Kit v3 (10x Genomics) 制备的。 snRNA-seq 文库是使用Chromium Single Cell 3′ GEM、Library & Gel Bead Kit v3 (10x Genomics) 制备的。 Библиотеку snRNA-seq готовили с использованием Krom Tek Hücreli 3′ GEM, Kütüphane ve Jel Boncuk Kiti v3 (10x Genomics). snRNA-seq kütüphanesi Chromium Single Cell 3′ GEM, Library & Gel Bead Kit v3 (10x Genomics) kullanılarak hazırlandı.Farklı örneklerden gelen kütüphaneler bir araya getirildi ve Admera Health tarafından NovaSeq S4 (Illumina) üzerinde dizilendi.
Her varsayımsal nükleer barkod için gen ifadesi düzeyleri 10x Genomics CellRanger analiz yazılım paketi (sürüm 6.1.2) kullanılarak ölçüldü. Özellikle, okumalar mkref komutu ve count ile –include-introns=TRUE komutu kullanılarak oluşturulan insan (GRCh38, Ensemble, sürüm 98) ve sıçan (Rnor_6.0, Ensemble, sürüm 100) referans genomlarının bir kombinasyonuyla eşleştirildi ve intron bölgelerine eşlenen okumaları nicelleştirmek için kullanıldı. t-hCO örnekleri için, insan çekirdekleri, eşlenen tüm okumaların en az %95'inin insan genomuyla eşleşmesi gerektiği şeklindeki muhafazakar gerekliliğe dayanarak tanımlandı. Sonraki tüm analizler, R paketi (sürüm 4.1.2) Seurat (sürüm 4.1.1)32 kullanılarak CellRanger'dan filtrelenmiş bir barkod dizisi çıktısı üzerinde gerçekleştirildi.
Sonraki analize yalnızca yüksek kaliteli çekirdeklerin dahil edilmesini sağlamak için her örnek için yinelemeli bir filtreleme süreci uygulandı. İlk olarak, 1000'den az benzersiz gen bulunan ve toplam mitokondrinin %20'sinden fazlasını barındıran düşük kaliteli çekirdekler tanımlanıp kaldırıldı. Daha sonra, ham gen sayısı matrisi, varsayılan parametreler kullanılarak 3000 en değişken geni de tanımlayan sctransform(vst.flavor=”v2″) fonksiyonu kullanılarak düzenlenmiş negatif binom regresyonu ile normalize edildi. Boyut azaltma, varsayılan parametrelerle 30 veri kümesi boyutu kullanılarak Temel Bileşen Analizi (PCA) kullanılarak üst değişken genler üzerinde gerçekleştirildi (dims = 30, diz bölgelerinin görsel muayenesine göre seçildi ve tüm örnekler ve topluluk analizleri için kullanıldı). Daha sonra, anormal derecede düşük gen sayısına (ortanca 10. persentilin altında), anormal derecede yüksek mitokondriyal gen sayısına (ortanca 95. persentilin üzerinde) göre genleri sınıflandırmak için birkaç tur yinelemeli kümeleme (çözünürlük = 1) gerçekleştirdik ve düşük kaliteli varsayımsal hücreleri tanımlayıp kaldırdık. kümeler ve/veya DoubletFinder33 paketi kullanılarak tanımlanan yüksek oranda şüpheli ikiz (ortanca DoubletFinder puanı 95. persentilin üzerinde). t-hCO örnekleri (n=3) ve hCO örnekleri (n=3) yukarıdaki parametrelerle IntegrateData işlevi kullanılarak ayrı ayrı entegre edildi. Daha sonra, entegre veri setinin nitel filtrelemesinin bir başka turu yukarıda açıklandığı gibi gerçekleştirildi.
Düşük kaliteli çekirdekleri çıkardıktan sonra, entegre veri seti gruplandırıldı (çözünürlük = 0,5) ve UMAP34 görselleştirme amaçları için gömüldü. Her küme için belirteç genler, normalize edilmiş gen ifadesi verilerinden hesaplanan varsayılan parametrelerle FindMarkers işlevi kullanılarak belirlendi. Fetal ve yetişkin kortikal referans veri setlerini belirteç gen ifadesi 19,20,21,35 ve açıklama ile birleştirerek ana hücre sınıflarını tanımladık ve sınıflandırdık. Özellikle, dolaşımdaki öncüller MKI67 ve TOP2A ifadesi ile belirlendi. Progenitör kümeleri, mitotik transkriptlerin yokluğu, geç metafaz fetal korteksinde tanımlanan multipotent glial progenitör kümeleriyle yüksek örtüşme ve EGFR ve OLIG1 ifadesi ile tanımlandı. Astrosit terimini, geç radyal gliadan astrositlerin olgunlaşmasına kadar astrosit farklılaşmasının çeşitli durumlarını kapsayacak şekilde kullanıyoruz. Astrosit kümeleri yüksek seviyelerde SLC1A3 ve AQP4 ifade eder ve fetal radyal glia ve/veya yetişkin astrositlerin alt tipleriyle eşleştiği gösterilmiştir. OPC'ler PDGFRA ve SOX10 ifade ederken oligodendrositler miyelinasyon belirteçlerini (MOG ve MYRF) ifade eder. Glutamaterjik nöronlar nöronal transkriptlerin (SYT1 ve SNAP25) varlığı, GABAerjik belirteçlerin (GAD2) yokluğu ve NEUROD6, SLC17A7, BCL11B veya SATB2 ifadesi ile tanımlanmıştır. GluN nöronları ayrıca üst (SATB2 ifadesi ve BCL11B kaybı) ve derin (BCL11B ifadesi) alt sınıflara ayrılmıştır. Varsayılan alt plak (SP) nöronları derin GluN belirteçlerine ek olarak ST18 ve SORCS1 gibi bilinen SP18 belirteçlerini ifade eder. Koroid pleksus benzeri hücreler TTR ekspresyonuna göre tanımlandı ve meningeal benzeri hücreler fibroblast ilişkili genleri eksprese etti ve referans veri setinin pial/vasküler hücrelerini haritaladı.
t-hCO ve hCO alt sınıfları arasındaki gen ifadesinin diferansiyel analizi, Libra R paketi (sürüm 1.0.0) kullanılarak uygulanan örneklerde yeniden üretilen yeni geliştirilmiş bir psödo-parti yöntemi kullanılarak gerçekleştirildi. Özellikle, edgeR log-olasılık testleri (sürüm 3.36.0, paket R), her örnek replikasyonu için belirli bir hücre sınıfı için hücrelerdeki gen sayısının toplanmasıyla gruplar için gerçekleştirildi. Isı haritası görselleştirmesi için, milyon başına normalize edilmiş (CPM) değerler edgeR (cpm() fonksiyonu) kullanılarak hesaplanır ve ölçeklenir (ortalama = 0, standart sapma = 1 elde etmek için). Önemli ölçüde yukarı düzenlenmiş t-hCO GluN genlerinin Gen Ontolojisi (GO) zenginleştirme analizi yapıldı (t-hCO GluN hücrelerinin en az %10'unda ifade edilen 0,05'ten düşük Benjamin-Hochberg düzeltilmiş P değeri ve en az 2 katlık bir değişim artışı). ToppGene Suite (https://toppgene.cchmc.org/)37 kullanılarak gerçekleştirildi. Varsayılan parametrelerle ToppFun uygulamasını kullanıyoruz ve GO açıklamalı hipergeometrik testlerden hesaplanan Benjamini-Hochberg düzeltmeli P değerlerini bildiriyoruz.
snRNA-seq kümelerimizi birincil tek hücreli RNA-seq veya yetişkin snRNA-seq19,20,21,22 referans çalışmalarından alınan açıklamalı hücre kümeleriyle eşleştirmek için eşleştirilmiş veri kümesi bütünleştirme yaklaşımını uyguladık. Veri kümeleri arasındaki küme örtüşmelerini bütünleştirmek ve karşılaştırmak için Seurat'taki SCTransform (v2) normalizasyon iş akışını kullandık (yukarıdakiyle aynı parametreleri kullanarak). Hesaplama verimliliği için bireysel veri kümeleri orijinal küme başına 500 hücre veya çekirdeğe kadar rastgele alt kümelere ayrıldı. Daha önce açıklanan benzer bir yaklaşım kullanılarak küme örtüşmesi, her bir havuzlanmış kümedeki hücre veya çekirdeklerin referans kümesinin etiketiyle örtüşme oranı olarak tanımlandı. GluN'ları daha fazla sınıflandırmak için GluN hücrelerimize referans veri kümesi etiketleri atamak üzere Seurat'ın GluN alt küme verileri için TransferData iş akışını kullandık.
t-hCO ve hCO örneklerinin global transkriptomunun olgunlaşma durumunu değerlendirmek için, pseudo-bulk örneklerimizi insan beyin gelişimini kapsayan büyük bir RNA dizisinden oluşan BrainSpan/psychENCODE23 ile karşılaştırdık. Döllenmeden 10 hafta sonra ve daha sonra, BrainSpan kortikal örneklerinde daha önce aktif olarak tanımlanmış (kübik bir model kullanılarak yaşla açıklanan gelişimsel varyansta %50'den fazla olarak tanımlanmıştır) 5567 gende (verilerimizle birlikte) birleştirilmiş bir desen normalize edilmiş gen ekspresyon matrisi üzerinde PCA gerçekleştirdik38. Ek olarak, daha önce açıklandığı gibi negatif olmayan matris faktörizasyonu kullanarak nörogelişimin majör transkriptom imzalarıyla ilişkili genleri türettik. Negatif olmayan matris faktörizasyonu prosedürü kullanılarak hesaplanan örnek ağırlıkları, Zhu ve ark. tarafından açıklanan beş imzanın her biri için genişletilmiş verilerle Şekil 5b'de çizilmiştir38. Tekrar, aktiviteye bağlı transkripsiyonel belirteçler daha önce yayınlanmış çalışmalardan türetilmiştir. Özellikle, ERG ve LRG, Ek Tablo 3 Hrvatin ve ark.16'dan görsel uyarıdan sonra fare görsel korteks snRNA-seq koleksiyonu tarafından tanımlanan glutamaterjik nöronlarda önemli ölçüde yukarı düzenlenmiştir. İnsan-zenginleştirilmiş LRG'ler, KCl ile aktive edilmiş insan fetal beyin kültürlerinden elde edilmiş ve uyarıdan 6 saat sonra hasat edilmiştir ve filtrelenmiş genler insanlarda önemli ölçüde yukarı düzenlenmiştir ancak kemirgenlerde değildir (Ek Tablo 4). Bu gen setleri kullanılarak gen seti zenginleştirmesinin analizi, tek yönlü Fisher'ın kesin testi kullanılarak gerçekleştirilmiştir.
Sıçanları izofluranla anestezi edin, beyinleri çıkarın ve 234 mM sakaroz, 11 mM glikoz, 26 mM NaHCO3, 2,5 mM KCl, 1,25 mM. NaH2PO4, 10 mM MgSO4 ve 0,5 mM CaCl2 (yaklaşık 310 mOsm) içeren kesitler için soğuk (yaklaşık 4°C) oksijenli (95% O2 ve 5% CO2) sakaroz solüsyonuna yerleştirin. Daha önce açıklandığı gibi t-hCO içeren sıçan beyin koronal kesitleri (300–400 µm) bir Leica VT1200 vibratom kullanılarak yapıldı39. Kesitler daha sonra 10 mM glikoz, 26 mM NaHCO3, 2,5 mM KCl, 1,25 mM NaHPO4, 1 mM MgSO4, 2 mM CaCl2 ve 126 mM NaCl (298 mOsm)'den hazırlanan aCSF içeren sürekli oda sıcaklığında oksijenasyonlu bir kesit alma odasına aktarıldı. kayıttan en az 45 dakika önce. Kesitler, sürekli olarak aCSF (95% O2 ve 5% CO2 şişesi) ile perfüze edildikleri daldırılmış bir odada kaydedildi. Tüm veriler oda sıcaklığında kaydedildi. t-hCO nöronları, 127 mM potasyum glukonat, 8 mM NaCl, 4 mM magnezyum ATP, 0,3 mM sodyum GTP, 10 mM HEPES ve 0,6 mM EGTA, pH 7,2, dahili çözelti KOH (290 mOsm) ile ayarlanmış bir çözelti ile doldurulmuş bir borosilikat cam pipet ile sonlandırıldı. Kurtarmak için, kayıt çözeltisine biyositin (%0,2) eklendi.
Veriler, 2 kHz'de düşük geçişli filtrelenmiş bir MultiClamp 700B amplifikatör (Molecular Devices) ve bir Digidata 1550B sayısallaştırıcı (Molecular Devices) kullanılarak elde edildi, 20 kHz'de sayısallaştırıldı ve Clampfit (Molecular Devices), Origin (OriginPro) kullanılarak analiz edildi. 2021b, OriginLab). ve özel MATLAB işlevleri (Mathworks). Bağlantı potansiyeli JPCalc kullanılarak hesaplandı ve girişler hesaplanan -14 mV değerine ayarlandı. İşlem IV, -250 ila 750 pA arasında 10-25 pA adımlarla bir dizi akım adımından oluşur.
Daha önce açıklandığı gibi, hCO nöronlarının yama kelepçesi kaydı sırasında talamus, beyaz cevher ve S1 afferentleri talamokortikal dilimlerde elektriksel olarak uyarıldı. Kısaca, beyin 10° açıyla eğimli bir 3B baskı masasına yerleştirildi ve beynin ön tarafı 35° açıyla kesildi. Daha sonra beyin kesilmiş yüzeye yapıştırıldı ve talamokortikal çıkıntılı aksonlar korunarak kesildi. Bipolar tungsten elektrotlar (0,5 MΩ) ikinci bir mikromanipülatöre monte edildi ve hücre başına dört bölgeyi (iç kapsül, beyaz cevher, S1 ve hCO) uyarmak için stratejik olarak konumlandırıldı. 0,03–0,1 Hz'de 300 µA fazik uyarıdan sonra sinaptik yanıtları kaydedin.
hChR2 ifade eden hCO nöronları 480 nm'de aktive edildi ve bir LED (Prizmatix) tarafından üretilen ışık darbeleri, hücrelerin yakınındaki hChR2 ifadesini kaydetmek için bir x40 objektif (0.9 NA; Olympus) aracılığıyla uygulandı. Aydınlatılmış alan çapı yaklaşık 0.5 mm'dir ve toplam güç 10-20 mW'dir. Darbe genişliği, davranışsal öğrenme deneyi sırasında verilen darbeye karşılık gelen 10 ms'ye ayarlandı. 1 ila 20 Hz arasında çeşitli uyarım frekansları kullanıldı, ancak kantifikasyon için yalnızca serinin ilk darbesi kullanıldı. Trenler arasındaki aralıklar, sinaptik inhibe edici veya kolaylaştırıcı yollar üzerindeki etkiyi en aza indirmek için genellikle 30 saniyeden uzundur. hChR2 yanıtının monosinaptik olup olmadığını test etmek için, EPSC reaksiyonu kaybolana kadar banyoya TTX (1 μM) uyguladık ve ardından 4-aminopiridin (4-AP; 100 μM) uyguladık. Tipik olarak, LED ateşlemesi ile EPSC üretimi arasında biraz daha uzun bir gecikmeyle birkaç dakika içinde bir yanıt döndürülür. Yanıtın AMPA reseptörleri tarafından yönlendirilip yönlendirilmediğini test etmek için NBQX (10 μM) kullanıldı.
Keskin hCO kesitleri daha önce açıklandığı gibi oluşturuldu. Kısaca, hCO kesitleri %4 agaroz içine gömüldü ve 126 mM NaCl, 2,5 mM KCl, 1,25 mM NaH2PO4, 1 mM MgSO4, 2 mM CaCl2, 26 mM NaHCO3 ve 10 mM d-(+) -glikoz içeren hücrelere aktarıldı. Kesitler, bir Leica VT1200 vibratörü kullanılarak oda sıcaklığında 200–300 µm'de kesildi ve oda sıcaklığında ASF'de saklandı. Daha sonra, hCO kesitlerinde doğrudan SliceScope mikroskobu (Scientifica) altında tüm hücrelerin patch-camp kaydı gerçekleştirildi. Kesitler aCSF (95% O2 ve 5% CO2) ile perfüze edildi ve hücre sinyalleri oda sıcaklığında kaydedildi. hCO nöronları, 127 mM potasyum glukonat, 8 mM NaCl, 4 mM magnezyum ATP, 0,3 mM sodyum GTP, 10 mM HEPES ve 0,6 mM EGTA içeren bir çözeltiyle doldurulmuş bir borosilikat cam pipet kullanılarak uygulandı, dahili pH 7, 2, KOH ile ayarlandı (ozmolarite 290). Geri kazanım amaçları için dahili çözeltiye %0,2 Biyositin ekleyin.
Veriler, MultiClamp 700B amplifikatör (Molecular Devices) ve Digidata 1550B sayısallaştırıcı (Molecular Devices) kullanılarak Clampex (Clampex 11.1, Molecular Devices) ile elde edildi, 2 kHz'de düşük geçişli filtrelendi, 20 kHz'de sayısallaştırıldı ve analiz için Clampfit (sürüm 10.6) kullanılarak analiz edildi, moleküler cihazlar) ve özel MATLAB işlevleri (MATLAB 2019b, Mathworks). Kavşak potansiyeli JPCalc kullanılarak hesaplandı ve girişler -14 mV'luk hesaplanan kavşak potansiyeline ayarlandı. İşlem IV, -50 ila 250 pA arasında 5-10 pA adımlarla bir dizi akım adımından oluşur.
Sıkışmış nöronların morfolojik rekonstrüksiyonu için, iç solüsyona %0,2 biyositin (Sigma-Aldrich) eklendi. Hücreler, kesme işleminden sonra en az 15 dakika boyunca astarlanır. Daha sonra pipet, kayıtlı membran tamamen kapatılana kadar 1-2 dakika boyunca yavaşça çekilir. Kesit fizyolojisi prosedürünü takiben, kesitler %4 PFA'da 4° C'de bir gece boyunca sabitlendi, PBS X3 ile yıkandı ve streptavidin konjugeli DyLight 549 veya DyLight 405 (Vector Labs) ile 1:1000 oranında seyreltildi. Biyositinle (2%; Sigma-Aldrich) doldurulan hücreler, 2 saat boyunca oda sıcaklığında yama kelepçesi kaydı sırasında etiketlendi. Kesitler daha sonra Aquamount (Thermo Scientific) kullanılarak mikroskopi slaytlarına yerleştirildi ve ertesi gün sayısal açıklık ×40 1.3, büyütme ×0.9–1.0, xy olan bir yağ daldırma objektifi kullanılarak bir Leica TCS SP8 konfokal mikroskobunda görüntülendi. Örnekleme hızı mikron başına yaklaşık 7 pikseldir. 1 µm aralıklarla Z yığınları seri olarak elde edildi ve her nöronun tüm dendritik ağacını kaplamak için z yığını mozaikleri ve Leica tabanlı otomatik dikiş gerçekleştirildi. Daha sonra nöronlar neuTube 40 arayüzü kullanılarak yarı manuel olarak izlendi ve SWC dosyaları oluşturuldu. Dosyalar daha sonra SimpleNeuriteTracer41 Fiji eklentisine (ImageJ, sürüm 2.1.0; NIH) yüklendi.
İnsan korteks dokusu, Stanford Üniversitesi Kurumsal İnceleme Kurulu tarafından onaylanan bir protokole göre bilgilendirilmiş onamla elde edildi. Refrakter epilepsi cerrahisinin bir parçası olarak frontal korteksin (orta frontal girus) rezeksiyonu ile iki adet insan postpartum doku örneği (3 ve 18 yaşında) elde edildi. Rezeksiyondan sonra, dokuyu buz gibi NMDG-aCSF'de hasat edin; bu içerik şunları içerir: 92 mM NMDG, 2,5 mM KCl, 1,25 mM NaH2PO4, 30 mM NaHCO3, 20 mM HEPES, 25 mM glikoz, 2 mM tiyoüre, 5 mM sodyum askorbat, 3 mM sodyum pirüvat, 0,5 mM CaCl2 4H2O ve 10 mM MgSO4 7H2O. Konsantre hidroklorik asit ile pH 7,3-7,4'e titre edin. Dokular 30 dakika içerisinde laboratuvara ulaştırıldı ve yukarıda anlatılan prosedüre göre koronal kesitler alındı.
Tüm hayvan prosedürleri Stanford Üniversitesi APLAC onaylı hayvan bakımı yönergelerine uygun olarak gerçekleştirildi. Sıçanlar (transplantasyondan sonra 140 günden fazla zaman geçmiş) %5 izofluran anestezisiyle indüklendi ve intraoperatif olarak %1-3 izofluranla anestezi altına alındı. Hayvanlar stereotaksik bir çerçeveye (Kopf) yerleştirildi ve sürekli salımlı buprenorfin (SR) deri altına enjekte edildi. Kafatası açığa çıkarıldı, temizlendi ve 3-5 kemik vidası yerleştirildi. t-hCO'yu hedeflemek için MRI görüntülerinden stereotaksik koordinatlar oluşturduk. İlgi duyulan bölgeye bir burr deliği açıldı ve lifler (400 µm çapında, NA 0.48, Dorik) hCO yüzeyinin 100 µm altına indirildi ve UV ile kürlenen diş çimentosu (Relyx) ile kafatasına sabitlendi.
Fiber fotometrik kayıtlar daha önce açıklandığı gibi gerçekleştirildi42. Spontan aktiviteyi kaydetmek için sıçanlar temiz bir kafese yerleştirildi ve fiber optik fotometrik veri toplama sistemine bağlı 400 µm çapında bir fiber optik yama kablosu (Doric) implante edilmiş fiber optik kabloya bağlandı. Motor aktivitenin 10 dakikalık kaydı sırasında hayvanlar kafesi keşfetmekte serbest bırakıldı. Uyarılmış aktiviteyi kaydetmek için sıçanlar (nakilden 140 günden fazla sonra) indüksiyon için %5 izofluran ve bakım için %1-3 izofluran ile anestezi altına alındı. Hayvanı stereotaktik bir çerçeveye (Kopf) yerleştirin ve t-hCO3'ün karşı tarafındaki bıyıklar yaklaşık 2 cm'ye kadar kesilir ve bir piezoelektrik aktüatöre (PI) bağlı bir ağdan geçirilir. 400 µm fiber optik yama kablosu (Doric) implante edilmiş fibere bağlandı ve veri toplama sistemine bağlandı. t-hCO'nun karşı tarafındaki bıyıklar daha sonra 20 dakikalık bir kayıt süresi boyunca piezoelektrik bir sürücü tarafından rastgele zamanlarda 50 kez (20 Hz'de 2 mm, sunum başına 2 saniye) saptırıldı. Sapma süresini özel MATLAB koduyla kontrol etmek için Arduino MATLAB Destek Paketi'ni kullanın. Olaylar, transistör-transistör mantığı (TTL) darbeleri kullanılarak veri toplama yazılımıyla senkronize edilir.
Sıçanlar (transplantasyondan sonra 140 günden fazla) %5 izofluran anestezisiyle indüklendi ve intraoperatif olarak %1-3 izofluranla anestezi altına alındı. Hayvanlar stereotaksik bir çerçeveye (Kopf) yerleştirildi ve buprenorfin SR ve deksametazon deri altına enjekte edildi. Kafatası açığa çıkarıldı, temizlendi ve 3-5 kemik vidası yerleştirildi. t-hCO'yu hedeflemek için, MRI görüntülerinden stereotaksik koordinatlar oluşturduk. Nakledilen hCO'nun doğrudan üzerine yüksek hızlı bir matkapla dairesel bir kraniotomi (yaklaşık 1 cm çapında) gerçekleştirildi. Kemik mümkün olduğunca ince olduğunda, ancak tüm kemiği delmeden önce, alttaki t-hCO'yu ortaya çıkarmak için kalan sağlam pelvik diski çıkarmak için forseps kullanın. Kraniotomi steril tuzlu su ile dolduruldu ve kafatasına UV ile kürlenen diş çimentosu (Relyx) ile bir lamel ve özel bir baş pimi takıldı.
İki fotonlu görüntüleme, Nikon LWD (×16, 0.8 NA) objektifli bir Bruker multifoton mikroskobu kullanılarak gerçekleştirildi. GCaMP6 görüntüleme, 1.4x tek z düzlemi büyütme ve 8x ortalama 7.5 fps ile 920 nm'de gerçekleştirildi. Sıçanlar %5 izofluran anestezisi ile indüklendi ve %1-3 izofluran ile sürdürüldü. Sıçanlar özel yapım bir baş aparatına yerleştirildi ve merceğin altına yerleştirildi. Motor aktivitesinin 3 dakikalık bir arka plan kaydı elde edildi. 20 dakikalık kayıt süresince, 50 nefes (her sunum 100 ms uzunluğunda) bir pikoprimetre kullanılarak t-hCO3'ün karşısındaki bıyık pedine rastgele verildi. Patlama süresini özel MATLAB kodu ile kontrol etmek için Arduino MATLAB Destek Paketi'ni kullanın. Olayları TTL darbeleri kullanarak veri toplama yazılımıyla (PrairieView 5.5) senkronize edin. Analiz için, görüntüler Fiji'de başlatılan MoCo programında afin düzeltme kullanılarak xy hareketi için düzeltildi. CNMF-E43 kullanılarak tek tek hücrelerden floresan izlerinin çıkarılması. Floresan, ilgi duyulan her bölge için çıkarıldı, dF/F eğrilerine dönüştürüldü ve ardından z puanlarına dönüştürüldü.
Sıçanlar (transplantasyondan sonra 140 günden fazla) %5 izofluran anestezisiyle indüklendi ve intraoperatif olarak %1-3 izofluranla anestezi altına alındı. Hayvanlar stereotaksik bir çerçeveye (Kopf) yerleştirildi ve buprenorfin SR ve deksametazon deri altına enjekte edildi. t-hCO'nun karşı tarafındaki bıyıklar yaklaşık 2 cm'ye kesildi ve piezoelektrik aktüatöre bağlı bir ağdan geçirildi. Kafatası açığa çıkarıldı ve temizlendi. Kafatasına paslanmaz çelik bir topraklama vidası takıldı. t-hCO'yu hedeflemek için, MRI görüntülerinden stereotaksik koordinatlar oluşturduk. t-hCO'nun hemen üzerinde yüksek hızlı bir matkapla dairesel bir kraniotomi (yaklaşık 1 cm çapında) gerçekleştirin. Kemik mümkün olduğunca ince olduğunda, ancak tüm kemiği delmeden önce, alttaki t-hCO'yu ortaya çıkarmak için kalan sağlam pelvik diski çıkarmak için forseps kullanın. Bireysel hücreler, toprak vidalarına topraklanmış ve RHD amplifikatörleri (Intan) ile önceden amplifiye edilmiş 32 kanallı veya 64 kanallı yüksek yoğunluklu silikon problar (Cambridge Neurotech) kullanılarak kaydedildi. Manipülatörü kullanarak elektrotları steril tuzlu suyla doldurulmuş kraniotomi yoluyla hedef bölgeye indirin. Veri toplama, Open Ephys veri toplama sistemi kullanılarak 30 kHz frekansında gerçekleştirildi. Kayıt yalnızca 10'dan fazla kanalda yüksek oranda ilişkili ritmik kendiliğinden aktivite tespit ettiğimizde devam etti; bu, elektrotların greftte bulunduğunu gösteriyordu (iki fotonlu kalsiyum görüntüleme verilerine dayanarak). Motor aktivitesinin 10 dakikalık bir arka plan kaydı elde edildi. t-hCO'nun karşı tarafındaki bıyıklar daha sonra 20 dakikalık bir kayıt süresi boyunca piezoelektrik bir tahrikle rastgele zamanlarda 50 kez (20 Hz'de 2 mm, sunum başına 2 saniye) saptırıldı. Arduino için MATLAB Destek Paketini (MATLAB 2019b) kullanarak, özel MATLAB koduyla sapma süresini kontrol edin. Olayları veri toplama yazılımıyla senkronize etmek için TTL darbelerini kullanın.
Optik işaretleme deneyleri için, 473 nm lazere (Omicron) bağlı 200 µm optik yama kablosu (Doric), kraniotomi üzerine yerleştirilen 200 µm optik fibere bağlandı. Bundan hemen önce, jumper gücünü 20 mW'a ayarlayın. Manipülatörü kullanarak elektrotları steril tuzlu suyla doldurulmuş kraniotomi yoluyla hedef bölgeye indirin. Kaydın başlangıcında, 473 nm'lik (frekans 2 Hz, darbe süresi 10 ms) on ışık darbesi yayıldı. Işığa duyarlı hücreler, denemelerin %70'inde veya daha fazlasında 10 ms ışık içinde bir sivri yanıt gösteren hücreler olarak tanımlandı.