Nature.com'u ziyaret ettiğiniz için teşekkür ederiz.Kullanmakta olduğunuz tarayıcı sürümü sınırlı CSS desteğine sahiptir.En iyi deneyim için güncellenmiş bir tarayıcı kullanmanızı (veya Internet Explorer'da Uyumluluk Modunu devre dışı bırakmanızı) öneririz.Bu arada, sürekli destek sağlamak için siteyi stiller ve JavaScript olmadan yapacağız.
Likit biyopsi (LB), biyomedikal alanda hızla popülerlik kazanan bir kavramdır.Konsept temel olarak, çeşitli dokularda hücre ölümünden sonra küçük parçalar halinde salınan dolaşımdaki hücre dışı DNA (ccfDNA) parçalarının saptanmasına dayanmaktadır.Bu fragmanların küçük bir kısmı yabancı (yabancı) dokulardan veya organizmalardan kaynaklanır.Mevcut çalışmada, bu konsepti, yüksek deniz suyu filtreleme kapasiteleriyle bilinen bir nöbetçi tür olan midyelere uyguladık.Deniz kıyısı ekosistemlerinin biyolojik çeşitliliği hakkında bilgi sağlamak için çeşitli kaynaklardan çevresel DNA parçalarını yakalamak için midyelerin doğal filtreler olarak hareket etme yeteneğini kullanıyoruz.Sonuçlarımız, midye hemolenfinin, 1 ila 5 kb arasında büyük ölçüde değişen DNA parçaları içerdiğini göstermektedir.Av tüfeği dizilimi, çok sayıda DNA fragmanının yabancı mikrobiyal kökenli olduğunu gösterdi.Bunların arasında, kıyı deniz ekosistemlerinde yaygın olarak bulunan çeşitli konakçıları enfekte ettiği bilinen virüsler de dahil olmak üzere bakteri, arkea ve virüslerden DNA parçaları bulduk.Sonuç olarak, çalışmamız midyelere uygulanan LB kavramının, deniz kıyı ekosistemlerindeki mikrobiyal çeşitlilik hakkında zengin ancak henüz keşfedilmemiş bir bilgi kaynağı olduğunu göstermektedir.
İklim değişikliğinin (CC) deniz ekosistemlerinin biyolojik çeşitliliği üzerindeki etkisi hızla büyüyen bir araştırma alanıdır.Küresel ısınma sadece önemli fizyolojik baskılara neden olmakla kalmaz, aynı zamanda deniz organizmalarının termal kararlılığının evrimsel sınırlarını zorlar, bazı türlerin yaşam alanlarını etkiler ve onları daha uygun koşullar aramaya sevk eder [1, 2].Metazoanların biyoçeşitliliğini etkilemenin yanı sıra CC, konakçı-mikrobiyal etkileşimlerin hassas dengesini bozar.Bu mikrobiyal dysbacteriosis, deniz organizmalarını bulaşıcı patojenlere karşı daha duyarlı hale getirdiği için deniz ekosistemleri için ciddi bir tehdit oluşturmaktadır [3, 4].Küresel deniz ekosistemlerinin yönetimi için ciddi bir sorun olan toplu ölümlerde SS'nin önemli bir rol oynadığına inanılmaktadır [5, 6].Birçok deniz türünün ekonomik, ekolojik ve beslenme üzerindeki etkileri göz önüne alındığında bu önemli bir konudur.Bu, özellikle CK'nın etkilerinin daha hızlı ve şiddetli olduğu kutup bölgelerinde yaşayan çift kabuklular için geçerlidir [6, 7].Aslında, Mytilus spp.CC'nin deniz ekosistemleri üzerindeki etkilerini izlemek için yaygın olarak kullanılmaktadır.Şaşırtıcı olmayan bir şekilde, sağlıklarını izlemek için genellikle enzimatik aktiviteye veya hücre canlılığı ve fagositik aktivite gibi hücresel fonksiyonlara dayalı fonksiyonel biyobelirteçleri içeren iki aşamalı bir yaklaşım kullanılarak nispeten çok sayıda biyobelirteç geliştirilmiştir [8].Bu yöntemler ayrıca, büyük miktarlarda deniz suyunun emilmesinden sonra yumuşak dokularda biriken spesifik basınç göstergelerinin konsantrasyonunun ölçülmesini de içerir.Bununla birlikte, çift kabukluların yüksek filtrasyon kapasitesi ve yarı açık dolaşım sistemi, hasta yönetimine yönelik basit ve minimal invaziv bir yaklaşım olan sıvı biyopsi (LB) kavramını kullanarak yeni hemolenf biyobelirteçleri geliştirme fırsatı sağlar.kan örnekleri [9, 10].İnsan LB'sinde çeşitli dolaşımdaki molekül türleri bulunabilmesine rağmen, bu kavram birincil olarak plazmada dolaşımdaki hücre dışı DNA (ccfDNA) fragmanlarının DNA dizileme analizine dayanmaktadır.Aslında, insan plazmasında dolaşan DNA'nın varlığı 20. yüzyılın ortalarından beri bilinmektedir [11], ancak yüksek verimli sıralama yöntemlerinin ortaya çıkışı, ccfDNA'ya dayalı klinik tanıya ancak son yıllarda yol açmıştır.Bu dolaşan DNA fragmanlarının varlığı, kısmen, hücre ölümünden sonra genomik DNA'nın (nükleer ve mitokondriyal) pasif olarak salınmasına bağlıdır. Sağlıklı bireylerde ccfDNA konsantrasyonu normalde düşüktür (<10 ng/mL), ancak çeşitli patolojilerden muzdarip veya strese maruz kalan hastalarda 5-10 kat artarak doku hasarına neden olabilir. Sağlıklı bireylerde ccfDNA konsantrasyonu normalde düşüktür (<10 ng/mL), ancak çeşitli patolojilerden muzdarip veya strese maruz kalan hastalarda 5-10 kat artarak doku hasarına neden olabilir. У здоровых людей концентрация вккДНК в норме низкая (<10 нг/мл), но может повышаться в 5–10 раз у больных с раз у больных с ра. зличной патологией veya подвергающихся стрессу, приводящему к повреждению тканей. Sağlıklı insanlarda cccDNA konsantrasyonu normalde düşüktür (<10 ng/mL), ancak çeşitli patolojileri olan hastalarda veya doku hasarına yol açan stres altında 5-10 kat artabilir.在健康个体中，ccfDNA 的浓度通常较低（<10 ng/mL），但在患有各种病理或承受压力的患者中可增加5-10 倍, 从而导致组织损伤.在 健康 个体 中 ， ccfdna 的 浓度 较 低 （（<10 ng/ml) 但 在 各 种 病理 或 承受 压力 患者 中可 增加 5-10 倍 ， 从而 组织。。。 损伤 损伤 损伤 损伤 损伤 损伤 损伤 损伤 损伤 损伤 损伤ccfDNA'nın Korunması (<10 нг/мл) у здоровых людей, но могут увеличены в 5-10 раз у пациентов различными патологиями veya стрессом, что приводит к повреждению тканей. ccfDNA konsantrasyonları sağlıklı bireylerde genellikle düşüktür (<10 ng/ml), ancak çeşitli patolojiler veya stresli hastalarda 5-10 kat artarak doku hasarına neden olabilir.ccfDNA fragmanlarının boyutu büyük ölçüde değişir, ancak genellikle 150 ila 200 bp arasındadır.[12].Kendinden türetilen ccfDNA'nın, yani normal veya transforme edilmiş konakçı hücrelerden alınan ccfDNA'nın analizi, nükleer ve/veya mitokondriyal genomda mevcut olan genetik ve epigenetik değişiklikleri tespit etmek için kullanılabilir, böylece klinisyenlerin spesifik moleküler hedefli tedavileri seçmesine yardımcı olur [13].Ancak ccfDNA, gebelik sırasında fetal hücrelerden veya nakledilen organlardan ccfDNA gibi yabancı kaynaklardan elde edilebilir [14,15,16,17].ccfDNA aynı zamanda enfeksiyöz bir ajanın (yabancı) nükleik asitlerinin varlığını saptamak için önemli bir bilgi kaynağıdır; bu, kan kültürleri tarafından tanımlanmayan yaygın enfeksiyonların non-invaziv saptanmasına izin vererek enfekte dokunun invaziv biyopsisinden kaçınır [18].Son çalışmalar gerçekten de insan kanının viral ve bakteriyel patojenleri tanımlamada kullanılabilecek zengin bir bilgi kaynağı içerdiğini ve insan plazmasında bulunan ccfDNA'nın yaklaşık %1'inin yabancı kökenli olduğunu göstermiştir [19].Bu çalışmalar, bir organizmanın dolaşımdaki mikrobiyomunun biyolojik çeşitliliğinin ccfDNA analizi kullanılarak değerlendirilebileceğini göstermektedir.Bununla birlikte, yakın zamana kadar, bu kavram yalnızca insanlarda ve daha az ölçüde diğer omurgalılarda kullanılıyordu [20, 21].
Bu yazıda, 35 milyon yıl önce oluşan büyük bir platonun tepesindeki bir grup ada olan subantarktika Kerguelen Adaları'nda yaygın olarak bulunan bir güney türü olan Aulacomya atra'nın ccfDNA'sını analiz etmek için LB potansiyelini kullanıyoruz.Volkanik püskürme.Bir in vitro deney sistemi kullanarak, deniz suyundaki DNA parçalarının midyeler tarafından hızla alındığını ve hemolimf bölmesine girdiğini bulduk.Av tüfeği sıralaması, midye hemolimf ccfDNA'sının, soğuk volkanik deniz kıyısı ekosistemlerine özgü biyomlardan gelen DNA parçaları ve ortakyaşam bakterileri dahil olmak üzere kendi kaynağına ait ve kendinden olmayan DNA parçalarını içerdiğini göstermiştir.Hemolymph ccfDNA ayrıca farklı konak aralıklarına sahip virüslerden türetilen viral dizileri de içerir.Kemikli balıklar, deniz şakayıkları, algler ve böcekler gibi çok hücreli hayvanlardan da DNA parçaları bulduk.Sonuç olarak çalışmamız, LB konseptinin deniz ekosistemlerinde zengin bir genomik repertuar oluşturmak için deniz omurgasızlarına başarıyla uygulanabileceğini göstermektedir.
Yetişkinler (55-70 mm uzunluğunda) Mytilus platensis (M. platensis) ve Aulacomya atra (A. atra), Port-au-France'ın (049°21.235 G, 070°13.490 D) gelgit arası kayalık kıyılarından toplanmıştır.Aralık 2018'de Kerguelen Adaları. Diğer yetişkin mavi midyeler (Mytilus spp.) ticari bir tedarikçiden (PEI Mussel King Inc., Prince Edward Island, Kanada) alındı ​​ve 10–20 L %32 yapay tuzlu su içeren sıcaklık kontrollü (4°C) havalandırmalı bir tanka yerleştirildi.(yapay deniz tuzu Reef Crystal, Instant Ocean, Virginia, ABD).Her deney için, ayrı kabukların uzunluğu ve ağırlığı ölçüldü.
Bu program için ücretsiz bir açık erişim protokolü çevrimiçi olarak mevcuttur (https://doi.org/10.17504/protocols.io.81wgb6z9olpk/v1).Kısaca, LB hemolimfi [22] tarif edildiği gibi abductor kaslardan toplandı.Hemolimf, 1200 x g'de 3 dakika santrifüjleme ile berraklaştırıldı, süpernatan, kullanılana kadar donduruldu (-20°C).cfDNA'nın izolasyonu ve saflaştırılması için numuneler (1.5-2.0 mi) eritildi ve üreticinin talimatlarına göre NucleoSnap cfDNA kiti (Macherey-Nagel, Bethlehen, PA) kullanılarak işlendi.ccfDNA, ileri analize kadar -80°C'de saklandı.Bazı deneylerde ccfDNA izole edilmiş ve QIAamp DNA Araştırmacı Kiti (QIAGEN, Toronto, Ontario, Kanada) kullanılarak saflaştırılmıştır.Saflaştırılmış DNA, standart bir PicoGreen testi kullanılarak ölçüldü.İzole edilmiş ccfDNA'nın fragman dağılımı, bir Yüksek Hassasiyetli DNA Kiti kullanılarak bir Agilent 2100 biyoanalizör (Agilent Technologies Inc., Santa Clara, CA) kullanılarak kapiler elektroforez ile analiz edildi.Test, üreticinin talimatlarına göre 1 ul ccfDNA örneği kullanılarak yapıldı.
Hemolenf ccfDNA fragmanlarının dizilimi için Génome Québec (Montreal, Quebec, Kanada), Illumina MiSeq PE75 kitinin Illumina DNA Mix kitini kullanarak av tüfeği kitaplıkları hazırladı.Standart bir adaptör (BioO) kullanıldı.Ham veri dosyaları, NCBI Dizi Okuma Arşivinden (SRR8924808 ve SRR8924809) edinilebilir.Temel okuma kalitesi, FastQC [23] kullanılarak değerlendirildi.Kırpma adaptörleri ve düşük kaliteli okumalar için Trimmomatic [24] kullanılmıştır.Eşleştirilmiş uçlara sahip av tüfeği okumaları, uyumsuzlukları önlemek için minimum 20 bp örtüşme ile daha uzun tekli okumalarda FLASH birleştirildi [25]. Birleştirilmiş okumalar, çift kabuklu bir NCBI Taksonomi veritabanı (e değeri < 1e−3 ve %90 homoloji) kullanılarak BLASTN ile açıklandı ve düşük karmaşıklıktaki dizilerin maskelenmesi DUST [26] kullanılarak yapıldı. Birleştirilmiş okumalar, çift kabuklu bir NCBI Taksonomi veritabanı (e değeri < 1e−3 ve %90 homoloji) kullanılarak BLASTN ile açıklandı ve düşük karmaşıklıktaki dizilerin maskelenmesi DUST [26] kullanılarak yapıldı. BLASTN'ı kullanarak Объединенные чтения были аннотированы с базы данных таксономии двустворчаты х моллюсков NCBI (значение e < 1e-3 и 90% гомологии), ve маскирование последовательностей низкой сложности было выполнено с и спользованием TOZ [26]. Havuzlanmış okumalar, NCBI çift kabuklu taksonomi veri tabanı (e değeri < 1e-3 ve %90 homoloji) kullanılarak BLASTN ile notlandı ve DUST [26] kullanılarak düşük karmaşıklıktaki dizi maskeleme gerçekleştirildi.使用双壳类NCBI 分类数据库（e 值< 1e-3 和90% 同源性）用BLASTN 注释合并的读数，并使用DUST [26] 进行低复杂度序列的掩蔽.使用 双 壳类 ncbi 分类 （（（<1e-3 和 90% 同源） 用 用 用 注释 合并 读数 ， 并 使用 toz [26] 进行复杂度序列 的。。。。蔽 掩蔽 掩蔽BLASTN'ı kullanarak таксономической базы данных двуствор чатых моллюсков NCBI (значение e <1e-3 и 90% гомологии), а маскирование последовательностей низкой сложности было выполнен ос использованием TOZ [26]. Havuzlanmış okumalar, NCBI çift kabuklu taksonomik veri tabanı (e değeri <1e-3 ve %90 homoloji) kullanılarak BLASTN ile notlandı ve DUST [26] kullanılarak düşük karmaşıklıktaki dizi maskeleme gerçekleştirildi.Okumalar iki gruba ayrıldı: çift kabuklu dizilerle ilgili (burada kendi kendine okumalar olarak adlandırılır) ve ilgisiz (kendi kendine okumalar).Contig'ler [27] oluşturmak için MEGAHIT kullanılarak iki grup ayrı ayrı birleştirildi.Bu arada, yabancı mikrobiyom okumalarının taksonomik dağılımı Kraken2 [28] kullanılarak sınıflandırıldı ve Galaxy [29, 30] üzerindeki bir Krona pasta grafiği ile grafiksel olarak temsil edildi.Ön denemelerimizden optimal kmers-59 olarak belirlendi. Daha sonra, son bir açıklama için BLASTN (çift kabuklu NCBI veritabanı, e değeri <1e−10 ve %60 homoloji) ile hizalanarak kendi kendine bitişikler tanımlandı. Daha sonra, son bir açıklama için BLASTN (çift kabuklu NCBI veritabanı, e değeri <1e−10 ve %60 homoloji) ile hizalanarak kendi kendine bitişikler tanımlandı. BLASTN'ın (BLASTN'de Затем собственные контиги были идентифицированы путем сопоставления с BLASTN (база данных двустворчатых молюс) NCBI, значение e <1e-10 и гомология 60%) аннотации. Daha sonra, son ek açıklama için BLASTN (NCBI çift kabuklu veri tabanı, e değeri <1e-10 ve %60 homoloji) ile eşleştirilerek kendi kendine bitişikler tanımlandı.然后通过与BLASTN（双壳贝类NCBI 数据库，e 值< 1e-10 和60% 同源性）对齐来识别自身重叠群以进行çok güzel.然后通过与BLASTN（双壳贝类NCBI 数据库，e 值< 1e-10 和60% BLASTN (Günümüzden 20 gün) ile ilgili olarak, Затем были идентифицированы собственные контиги для окончательной аннотации путем сопоставления с BLASTN (база дан) NCBI, моллюсков, значение e <1e-10 ve %60'lık bir büyüme oranı ile normaldir. Daha sonra BLASTN (NCBI çift kabuklu veri tabanı, e değeri <1e-10 ve %60 homoloji) ile eşleştirilerek son açıklama için kendi kendine bitişikler tanımlandı. Paralel olarak, kendinden olmayan grup kontigleri BLASTN (nt NCBI veritabanı, e değeri <1e−10 ve %60 homoloji) ile açıklanmıştır. Paralel olarak, kendinden olmayan grup kontigleri BLASTN (nt NCBI veritabanı, e değeri <1e−10 ve %60 homoloji) ile açıklanmıştır. BLASTN (NCBI, значение e <1e-10 и) ile Параллельно чужеродные групповые групповые были аннотированы с помощью BLASTN гомология 60%). Paralel olarak, yabancı grup kontigleri BLASTN (NT NCBI veri tabanı, e değeri <1e-10 ve %60 homoloji) ile açıklanmıştır.平行地，用BLASTN（nt NCBI 数据库，e 值< 1e-10 和60% 同源性）注释非自身组重叠群.平行地，用BLASTN（nt NCBI 数据库，e 值< 1e-10 和60% 同源性）注释非自身组重叠群. Параллельно контиги, не относящиеся к собственной группе, были аннотированы с помощью BLASTN (база данных nt NCBI, зн ачение e <1e-10 и гомология 60%). Paralel olarak, kendinden olmayan grup kontigleri BLASTN (nt NCBI veri tabanı, e değeri <1e-10 ve %60 homoloji) ile açıklanmıştır. BLASTX, nr ve RefSeq protein NCBI veritabanları (e değeri < 1e−10 ve %60 homoloji) kullanılarak kendinden olmayan kontigler üzerinde de gerçekleştirildi. BLASTX, nr ve RefSeq protein NCBI veritabanları (e değeri < 1e−10 ve %60 homoloji) kullanılarak kendinden olmayan kontigler üzerinde de gerçekleştirildi. BLASTX, şu anda mevcut olan en iyi veri kaynağına ve RefSeq NCBI'ye (<1 <1) sahiptir. e-10 и гомология 60%). BLASTX, nr ve RefSeq NCBI protein veritabanları (e değeri < 1e-10 ve %60 homoloji) kullanılarak kendinden olmayan kontiglerde de gerçekleştirildi.nr 和RefSeq 蛋白NCBI 数据库对非自身重叠群进行了BLASTX（e 值< 1e-10 和%60 同源性）。nr 和RefSeq 蛋白NCBI 数据库对非自身重叠群进行了BLASTX（e 值< 1e-10 和%60 同源性）。 BLASTX, veri tabanı kod numarasına ve RefSeq NCBI'ye (<1e-1 koduna göre) sahip olan veri tabanına sahiptir. 0 ve yüzde 60 oranında). BLASTX, nr ve RefSeq NCBI protein veritabanları (e değeri <1e-10 ve %60 homoloji) kullanılarak kendinden olmayan kontiglerde de gerçekleştirildi.Kendi kendine devam etmeyen BLASTN ve BLASTX havuzları, nihai bitişikleri temsil eder (bkz. Ek dosya).
PCR için kullanılan primerler Tablo S1'de listelenmiştir.Taq DNA polimeraz (Bio Basic Canada, Markham, ON), ccfDNA hedef genlerini çoğaltmak için kullanıldı.Aşağıdaki reaksiyon koşulları kullanıldı: 95°C'de 3 dakika denatürasyon, 95°C'de 1 dakika, ayarlanan tavlama sıcaklığı 1 dakika, 72°C'de 1 dakika uzama, 35 döngü ve son olarak 10 dakika içinde 72°C..PCR ürünleri, 95 V'ta SYBRTM Safe DNA Gel Stain (Invitrogen, Burlington, ON, Kanada) içeren agaroz jellerde (%1,5) elektroforez ile ayrıldı.
Midyeler (Mytilus spp.) 500 ml oksijenli deniz suyu (32 PSU) içinde 24 saat 4°C'de ortama alıştırıldı.İnsan galektin-7 cDNA dizisini (NCBI erişim numarası L07769) kodlayan bir ek içeren plazmit DNA, 190 ug/ul nihai konsantrasyonda şişeye ilave edildi.Aynı koşullar altında DNA eklenmeden inkübe edilen midyeler kontrol olarak alındı.Üçüncü kontrol tankı midye içermeyen DNA içeriyordu.Deniz suyundaki DNA kalitesini izlemek için, belirtilen zamanda her tanktan deniz suyu numuneleri (20 µl; üç tekrar) alınmıştır.Plazmid DNA izlenebilirliği için LB midyeleri belirtilen zamanlarda toplandı ve qPCR ve ddPCR ile analiz edildi.Deniz suyunun yüksek tuz içeriği nedeniyle, tüm PCR deneylerinden önce alikotlar PCR kalitesinde suda (1:10) seyreltildi.
Dijital damlacık PCR (ddPCR), BioRad QX200 protokolü (Mississauga, Ontario, Kanada) kullanılarak yapıldı.Optimum sıcaklığı belirlemek için sıcaklık profilini kullanın (Tablo S1).Damlalar, bir QX200 damla üreteci (BioRad) kullanılarak üretildi.ddPCR şu şekilde gerçekleştirildi: 95°C'de 5 dakika, 50 döngü 95°C'de 30 saniye ve belirli bir tavlama sıcaklığında 1 dakika ve 72°C'de 30 saniye, 4°C'de 5 dakika ve 90°C'de 5 dakika.Damla sayısı ve pozitif reaksiyonlar (kopya sayısı/µl) bir QX200 damla okuyucu (BioRad) kullanılarak ölçüldü.10.000'den az damlacık içeren örnekler reddedildi.ddPCR her çalıştırıldığında patern kontrolü gerçekleştirilmedi.
qPCR, Rotor-Gene® 3000 (Corbett Research, Sidney, Avustralya) ve LGALS7'ye özgü primerler kullanılarak yapıldı.Tüm kantitatif PCR'ler, QuantiFast SYBR Green PCR Kiti (QIAGEN) kullanılarak 20 ul'de gerçekleştirildi.qPCR, 95°C'de 15 dakikalık bir inkübasyonla başlatıldı, ardından bir veri toplama ile 95°C'de 10 saniye ve 60°C'de 60 saniye 40 döngü izledi.Erime eğrileri, 95°C'de 5 saniye, 65°C'de 60 saniye ve qPCR'nin sonunda 97°C'de ardışık ölçümler kullanılarak oluşturuldu.Her qPCR, kontrol örnekleri dışında üç kopya halinde gerçekleştirildi.
Midyeler yüksek filtreleme hızlarıyla bilindiğinden, önce deniz suyunda bulunan DNA parçalarını filtreleyip tutamayacaklarını araştırdık.Ayrıca bu fragmanların yarı açık lenfatik sistemlerinde birikip birikip birikmediğiyle de ilgilendik.Mavi midye tanklarına eklenen çözünür DNA parçalarının kaderini takip ederek bu sorunu deneysel olarak çözdük.DNA parçalarının izlenmesini kolaylaştırmak için, insan galektin-7 genini içeren yabancı (kendi değil) plazmit DNA'yı kullandık.ddPCR, deniz suyu ve midyelerdeki plazmit DNA parçalarını izler.Sonuçlarımız, deniz suyundaki DNA fragmanlarının miktarının, midye yokluğunda zaman içinde (7 güne kadar) nispeten sabit kalması durumunda, midye varlığında bu seviyenin 8 saat içinde neredeyse tamamen kaybolduğunu göstermektedir (Şekil 1a,b).Eksojen DNA fragmanları, intravalvüler sıvı ve hemolenfte 15 dakika içinde kolayca tespit edildi (Şekil 1c).Bu parçalar, maruz kaldıktan sonra 4 saate kadar hala tespit edilebilir.DNA fragmanlarına göre bu filtreleme aktivitesi, bakteri ve alglerin filtreleme aktivitesi ile karşılaştırılabilir [31].Bu sonuçlar, midyelerin sıvı bölmelerinde yabancı DNA'yı filtreleyebildiğini ve biriktirebildiğini göstermektedir.
Midye varlığında (A) veya yokluğunda (B) deniz suyunda plazmit DNA'nın bağıl konsantrasyonları, ddPCR ile ölçülür.A'da sonuçlar yüzde olarak ifade edilir ve kutuların sınırları 75. ve 25. yüzdelikleri temsil eder.Uygun logaritmik eğri kırmızı ile gösterilir ve gri ile gölgeli alan %95 güven aralığını temsil eder.B'de kırmızı çizgi ortalamayı temsil eder ve mavi çizgi konsantrasyon için %95 güven aralığını temsil eder.C Plazmid DNA'nın eklenmesinden sonra farklı zamanlarda midyelerin hemolimf ve kapak sıvısında plazmit DNA'nın birikmesi.Sonuçlar, saptanan mutlak kopyalar/mL (±SE) olarak sunulur.
Daha sonra, sınırlı antropojenik etkiye sahip uzak bir ada grubu olan Kerguelen Adaları'ndaki midye yataklarından toplanan midyelerdeki ccfDNA'nın kökenini araştırdık.Bu amaçla, midye hemolimflerinden cccDNA izole edilmiş ve insan cccDNA'sını saflaştırmak için yaygın olarak kullanılan yöntemlerle saflaştırılmıştır [32, 33].Midyelerdeki ortalama hemolimf ccfDNA konsantrasyonlarının ml hemolimf aralığı başına düşük mikrogramlarda olduğunu bulduk (bkz. Tablo S2, Ek Bilgiler).Bu konsantrasyon aralığı, sağlıklı insanlardan çok daha geniştir (mililitrede düşük nanogram), ancak nadir durumlarda, kanser hastalarında, ccfDNA seviyesi mililitrede birkaç mikrograma ulaşabilir [34, 35].Hemolimf ccfDNA'nın boyut dağılımının bir analizi, bu fragmanların boyutlarının 1000 bp ila 1000 bp arasında büyük ölçüde değiştiğini gösterdi.5000 bp'ye kadar (Şek. 2).Benzer sonuçlar, ccfDNA da dahil olmak üzere düşük konsantrasyonlu DNA örneklerinden genomik DNA'yı hızla izole etmek ve saflaştırmak için adli tıpta yaygın olarak kullanılan bir yöntem olan silika bazlı QIAamp Araştırmacı Kiti kullanılarak elde edilmiştir [36].
Midye hemolenfinin temsili ccfDNA elektroforegramı.NucleoSnap Plazma Kiti (üstte) ve QIAamp DNA Araştırmacı Kiti ile özü çıkarıldı.Midyelerde hemolimf ccfDNA konsantrasyonlarının (±SE) dağılımını gösteren B Keman çizimi.Siyah ve kırmızı çizgiler, sırasıyla medyanı ve birinci ve üçüncü çeyrekleri temsil eder.
İnsanlarda ve primatlarda ccfDNA'nın yaklaşık %1'i yabancı bir kaynağa sahiptir [21, 37].Çift kabukluların yarı açık dolaşım sistemi, mikrobiyal açıdan zengin deniz suyu ve midye ccfDNA'nın boyut dağılımı göz önüne alındığında, midye hemolimf ccfDNA'nın zengin ve çeşitli bir mikrobiyal DNA havuzu içerebileceğini varsaydık.Bu hipotezi test etmek için, Kerguelen Adaları'ndan toplanan Aulacomya atra örneklerinden hemolimf ccfDNA'yı sıraladık ve %97,6'sı kalite kontrolünden geçen 10 milyondan fazla okuma sağladık.Okumalar daha sonra BLASTN ve NCBI çift kabuklu veritabanları kullanılarak öz ve öz olmayan kaynaklara göre sınıflandırıldı (Şekil S1, Ek Bilgi).
İnsanlarda hem nükleer hem de mitokondriyal DNA kan dolaşımına salınabilir [38].Bununla birlikte, bu çalışmada, A. atra genomunun dizilimi yapılmadığı veya tanımlanmadığı göz önüne alındığında, midyelerin nükleer genomik DNA'sını ayrıntılı olarak tarif etmek mümkün olmamıştır.Bununla birlikte, çift kabuklu kütüphaneyi kullanarak kendi menşeimize ait birkaç ccfDNA parçasını tanımlayabildik (Şekil S2, Ek Bilgi).Ayrıca dizilenen A. atra genlerinin yönlendirilmiş PCR amplifikasyonu ile kendi kaynağımıza ait DNA fragmanlarının varlığını doğruladık (Şekil 3).Benzer şekilde, A. atra'nın mitokondriyal genomunun halka açık veritabanlarında mevcut olduğu göz önüne alındığında, A. atra'nın hemolenfinde mitokondriyal ccfDNA fragmanlarının varlığına dair kanıtlar bulunabilir.Mitokondriyal DNA fragmanlarının varlığı, PCR amplifikasyonu ile doğrulandı (Şekil 3).
A. atra'nın (kırmızı noktalar – stok numarası: SRX5705969) ve M. platensis'in (mavi noktalar – stok numarası: SRX5705968) hemolimfinde PCR ile güçlendirilmiş çeşitli mitokondriyal genler mevcuttu.Şekil Breton ve ark., 2011'den uyarlanmıştır. B A. atra'dan hemolenf süpernatantının amplifikasyonu FTA kağıdında saklanır.PCR karışımını içeren PCR tüpüne doğrudan eklemek için 3 mm'lik bir zımba kullanın.
Deniz suyundaki bol miktarda mikrobiyal içerik göz önüne alındığında, başlangıçta hemolenfteki mikrobiyal DNA dizilerinin karakterizasyonuna odaklandık.Bunu yapmak için iki farklı strateji kullanıyoruz.İlk strateji, mikrobiyal dizileri BLAST ve diğer araçlarla karşılaştırılabilir bir doğrulukla tanımlayabilen, algoritma tabanlı bir dizi sınıflandırma programı olan Kraken2'yi kullandı [28].6719'dan fazla okumanın bakteri kaynaklı olduğu belirlenirken, sırasıyla 124 ve 64'ün arkea ve virüslerden olduğu belirlendi (Şekil 4).En bol bulunan bakteriyel DNA fragmanları Firmicutes (%46), Proteobacteria (%27) ve Bacteroidetes (%17) idi (Şekil 4a).Bu dağılım, deniz mavisi midye mikrobiyomunun önceki çalışmaları ile tutarlıdır [39, 40].Gammaproteobacteria, birçok Vibrionales dahil olmak üzere Proteobacteria'nın ana sınıfıydı (%44) (Şekil 4b).ddPCR yöntemi, A. atra hemolimfin ccfDNA'sında Vibrio DNA fragmanlarının varlığını doğrulamıştır (Şekil 4c) [41].ccfDNA'nın bakteriyel kökeni hakkında daha fazla bilgi elde etmek için ek bir yaklaşım uygulandı (Şekil S2, Ek Bilgi). Bu durumda, örtüşen okumalar, çift uçlu okumalar olarak birleştirildi ve BLASTN ve 1e−3 e değeri ve >%90 homolojiye sahip bir kesme noktası kullanılarak kendinden (çift kabuklu) veya kendinden olmayan kaynaklı olarak sınıflandırıldı. Bu durumda, örtüşen okumalar, çift uçlu okumalar olarak birleştirildi ve BLASTN ve 1e−3 e değeri ve >%90 homolojiye sahip bir kesme noktası kullanılarak kendinden (çift kabuklu) veya kendinden olmayan kaynaklı olarak sınıflandırıldı. В этом случае перекрывающиеся чтения были собраны как чтения с парными концами ve были классифицированы к ак собственные (двустворчатые моллюски) veya значения e 1e-3 ve отсе чения с гомологией> 90%. Bu durumda, örtüşen okumalar çift uçlu okumalar olarak toplandı ve BLASTN ve 1e-3 e değeri ve >%90 homoloji ile kesme kullanılarak doğal (çift kabuklu) veya orijinal olmayan olarak sınıflandırıldı.BLASTN 和1e-3 的e 值和>90% 同源性的截止值分类为自身（双壳类）或非自身来源。在 这 种 情况 下 ， 重叠 读数 组装 为 配 末端 读数 ， 使用 使用 使用 blastn 和 1e-3 的 的 值 和> 90% В этом случае перекрывающиеся чтения были собраны как чтения с парными концами ve классифицированы как соб ственные (двустворчатые моллюски) veya значений e BLASTN ve 1e-3 ve поро га гомологии> 90%. Bu durumda, örtüşen okumalar, çift uçlu okumalar olarak toplandı ve eBLASTN ve 1e-3 değerleri ve >%90 homoloji eşiği kullanılarak kendi (çift kabuklu) veya orijinal olmayan olarak sınıflandırıldı.A. atra genomu henüz dizilenmediğinden, MEGAHIT Yeni Nesil Dizileme (NGS) derleyicisinin de novo derleme stratejisini kullandık.Toplam 147.188 kontig menşe bağımlı (çift kabuklu) olarak tanımlanmıştır.Bu contig'ler daha sonra BLASTN ve BLASTX kullanılarak 1e-10 e-değerleriyle patlatıldı.Bu strateji, A. atra ccfDNA'da bulunan 482 çift kabuklu olmayan parçayı tanımlamamıza izin verdi.Bu DNA fragmanlarının yarısından fazlası (%57) bakterilerden, özellikle de sülfotrofik ortakyaşarlar da dahil olmak üzere solungaç ortakyaşamlarından ve solungaç ortakyaşamları Solemya velum'dan elde edilmiştir (Şekil 5).
Tip düzeyinde göreli bolluk.B İki ana filumun (Firmicutes ve Proteobacteria) mikrobiyal çeşitliliği.ddPCR C Vibrio spp.'nin temsili amplifikasyonu.A. Üç atra hemolimfte 16S rRNA geninin (mavi) parçaları.
Toplam 482 toplanan kontig analiz edildi.Metagenomik bitiş ek açıklamalarının (prokaryotlar ve ökaryotlar) taksonomik dağılımının genel profili.B BLASTN ve BLASTX tarafından tanımlanan bakteriyel DNA parçalarının ayrıntılı dağılımı.
Kraken2 analizi ayrıca midye ccfDNA'nın Euryarchaeota (%65), Crenarchaeota (%24) ve Thaurmarcheota (%11) DNA fragmanları dahil olmak üzere arkal DNA fragmanları içerdiğini gösterdi (Şekil 6a).Daha önce Kaliforniya midyelerinin mikrobiyal topluluğunda bulunan Euryarchaeota ve Crenarchaeota'dan türetilen DNA fragmanlarının varlığı sürpriz olmamalıdır [42].Euryarchaeota genellikle aşırı koşullarla ilişkilendirilse de, artık hem Euryarchaeota hem de Crenarcheota'nın deniz kriyojenik ortamında en yaygın prokaryotlar arasında olduğu kabul edilmektedir [43, 44].Kerguelen Platosu'ndaki dip sızıntılarından [45] yoğun metan sızıntılarına ve Kerguelen Adaları kıyılarında gözlenen olası mikrobiyal metan üretimine [46] ilişkin son raporlar dikkate alındığında, midyelerde metanojenik mikroorganizmaların varlığı şaşırtıcı değildir.
Daha sonra dikkatimiz DNA virüslerinden alınan okumalara kaydı.Bildiğimiz kadarıyla bu, midyelerin virüs içeriğine ilişkin ilk hedef dışı çalışmadır.Beklendiği gibi, bakteriyofajların (Caudovirales) DNA parçalarını bulduk (Şekil 6b).Bununla birlikte, en yaygın viral DNA, herhangi bir virüsün en büyük genomuna sahip olan nükleer sitoplazmik büyük DNA virüsü (NCLDV) olarak da bilinen bir nükleositovirüs filumundan gelir.Bu filumda, DNA dizilerinin çoğu, doğal konakları omurgalıları ve eklembacaklıları içeren Mimimidoviridae (%58) ve Poxviridae (%21) familyalarına aitken, bu DNA dizilerinin küçük bir kısmı bilinen virolojik alglere aittir.Deniz ökaryotik alglerini enfekte eder.Dizilimler ayrıca, bilinen herhangi bir viral cinsin en büyük genom boyutuna sahip dev virüs olan Pandora virüsünden de elde edildi.İlginç bir şekilde, hemolimf ccfDNA dizilimi ile belirlendiği üzere virüs bulaştığı bilinen konakçıların aralığı nispeten genişti (Şekil S3, Ek Bilgi).Baculoviridae ve Iridoviridae gibi böcekleri enfekte eden virüslerin yanı sıra amip, alg ve omurgalıları enfekte eden virüsleri içerir.Pithovirus sibericum genomuyla eşleşen diziler de bulduk.Pitovirüsler (“zombi virüsleri” olarak da bilinirler) ilk olarak Sibirya'daki 30.000 yıllık permafrosttan izole edildi [47].Bu nedenle, sonuçlarımız, bu virüslerin tüm modern türlerinin neslinin tükenmediğini [48] ve bu virüslerin uzak subarktik deniz ekosistemlerinde bulunabileceğini gösteren önceki raporlarla tutarlıdır.
Son olarak, diğer çok hücreli hayvanlardan DNA parçaları bulup bulamayacağımızı test ettik.BLASTN ve BLASTX tarafından nt, nr ve RefSeq kitaplıklarıyla (genomik ve protein) toplam 482 yabancı kontig tanımlandı.Sonuçlarımız, çok hücreli hayvanların ccfDNA'sının yabancı fragmanları arasında kemikli kemiklerin DNA'sının baskın olduğunu göstermektedir (Şekil 5).Böceklerden ve diğer türlerden DNA parçaları da bulunmuştur.Muhtemelen çok sayıda deniz türünün karasal türlere kıyasla genomik veritabanlarında yetersiz temsil edilmesinden dolayı, DNA fragmanlarının nispeten büyük bir kısmı tanımlanmamıştır [49].
Mevcut yazıda, hemolimf ccfDNA atış dizilemesinin deniz kıyısı ekosistemlerinin bileşimi hakkında bilgi sağlayabileceğini savunarak LB konseptini midyelere uyguluyoruz.Özellikle, 1) midye hemolenfinin nispeten yüksek konsantrasyonlarda (mikrogram seviyeleri) nispeten büyük (~1-5 kb) dolaşımdaki DNA fragmanları içerdiğini bulduk;2) bu DNA fragmanları hem bağımsızdır hem de bağımsız değildir 3) Bu DNA fragmanlarının yabancı kaynakları arasında bakteriyel, arkeal ve viral DNA'nın yanı sıra diğer çok hücreli hayvanların DNA'sını bulduk;4) Bu yabancı ccfDNA fragmanlarının hemolenfte birikmesi hızla gerçekleşir ve midyelerin iç filtreleme aktivitesine katkıda bulunur.Sonuç olarak, çalışmamız, şimdiye kadar ağırlıklı olarak biyotıp alanında uygulanan LB kavramının, nöbetçi türler ve çevreleri arasındaki etkileşimi daha iyi anlamak için kullanılabilecek zengin ancak keşfedilmemiş bir bilgi kaynağını kodladığını göstermektedir.
Primatlara ek olarak, fareler, köpekler, kediler ve atlar dahil olmak üzere memelilerde ccfDNA izolasyonu bildirilmiştir [50, 51, 52].Bununla birlikte, bilgimize göre, çalışmamız açık dolaşım sistemine sahip deniz türlerinde ccfDNA'nın tespitini ve dizilimini bildiren ilk çalışmadır.Midyelerin bu anatomik özelliği ve filtreleme yeteneği, dolaşımdaki DNA parçalarının diğer türlere göre farklı boyut özelliklerini en azından kısmen açıklayabilir.İnsanlarda, kanda dolaşan DNA parçalarının çoğu, boyutları 150 ila 200 bp arasında değişen küçük parçalardır.maksimum tepe değeri 167 bp [34, 53].DNA fragmanlarının küçük ama önemli bir kısmı 300 ila 500 bp boyutundadır ve yaklaşık %5'i 900 bp'den daha uzundur.[54].Bu boyut dağılımının nedeni, plazmadaki ana ccfDNA kaynağının, sağlıklı bireylerde hücre ölümü veya dolaşımdaki hematopoietik hücrelerin nekrozu veya kanser hastalarında tümör hücrelerinin apoptozu (dolaşımdaki tümör DNA'sı olarak bilinir) nedeniyle hücre ölümü sonucu ortaya çıkmasıdır., ctDNA).Midyelerde bulduğumuz hemolimf ccfDNA'nın boyut dağılımı 1000 ila 5000 bp arasında değişiyordu, bu da midye ccfDNA'nın farklı bir kökene sahip olduğunu düşündürüyor.Bu mantıklı bir hipotezdir, çünkü midyeler yarı açık bir damar sistemine sahiptir ve yüksek konsantrasyonlarda mikrobiyal genomik DNA içeren denizel su ortamlarında yaşarlar.Aslında, ekzojen DNA kullanan laboratuvar deneylerimiz, midyelerin DNA parçalarını deniz suyunda biriktirdiğini, en azından birkaç saat sonra hücresel olarak alındıktan ve/veya salındıktan ve/veya çeşitli organizasyonlarda depolandıktan sonra bozulduğunu göstermiştir.Hücrelerin (hem prokaryotik hem de ökaryotik) nadirliği göz önüne alındığında, intravalvüler bölmelerin kullanılması, yabancı kaynakların yanı sıra öz kaynaklardan gelen ccfDNA miktarını azaltacaktır.Çift kabuklu doğuştan gelen bağışıklığın ve çok sayıda dolaşımdaki fagositlerin önemini göz önünde bulundurarak, yabancı ccfDNA'nın bile mikroorganizmaların ve/veya hücresel kalıntıların yutulması üzerine yabancı DNA biriktiren dolaşımdaki fagositlerde zenginleştiğini varsaydık.Birlikte ele alındığında, sonuçlarımız çift kabuklu hemolenf ccfDNA'nın benzersiz bir moleküler bilgi deposu olduğunu ve onların bir nöbetçi tür olarak statülerini güçlendirdiğini gösteriyor.
Verilerimiz, bakteriyel türevli hemolenf ccfDNA fragmanlarının dizilişinin ve analizinin, konak bakteri florası ve çevredeki deniz ekosisteminde bulunan bakteriler hakkında önemli bilgiler sağlayabileceğini göstermektedir.Atış dizileme teknikleri, kısmen bir referans kitaplığı yanlılığı nedeniyle, geleneksel 16S rRNA tanımlama yöntemleri kullanılmış olsaydı gözden kaçabilecek ortak mensal bakteri A. atra gill'in dizilerini ortaya çıkardı.Aslında, Kerguelen'deki aynı midye tabakasındaki M. platensis'ten toplanan LB verilerini kullanmamız, solungaçla ilişkili bakteriyel ortakyaşarların bileşiminin her iki midye türü için de aynı olduğunu gösterdi (Şekil S4, Ek Bilgi).Genetik olarak farklı iki midyenin bu benzerliği, Kerguelen'in soğuk, kükürtlü ve volkanik yataklarındaki bakteri topluluklarının bileşimini yansıtıyor olabilir [55, 56, 57, 58].Port-au-France kıyısı gibi biyotürbasyonlu kıyı bölgelerinden [59] midye hasadı yapılırken daha yüksek seviyelerde kükürt azaltan mikroorganizmalar iyi tanımlanmıştır.Diğer bir olasılık da, kommensal midye florasının yatay bulaşmadan etkilenebileceğidir [60, 61].Midyelerde deniz ortamı, deniz tabanı yüzeyi ve simbiyotik bakteri bileşimi arasındaki ilişkiyi belirlemek için daha fazla araştırmaya ihtiyaç vardır.Bu çalışmalar şu anda devam etmektedir.
Hemolimf ccfDNA'nın uzunluğu ve konsantrasyonu, saflaştırma kolaylığı ve hızlı av tüfeği sıralamasına izin veren yüksek kalitesi, deniz kıyısı ekosistemlerindeki biyolojik çeşitliliği değerlendirmek için midye ccfDNA kullanmanın birçok avantajından bazılarıdır.Bu yaklaşım, belirli bir ekosistemdeki viral toplulukları (viromları) karakterize etmek için özellikle etkilidir [62, 63].Bakteri, arkea ve ökaryotlardan farklı olarak viral genomlar, 16S dizileri gibi filogenetik olarak korunmuş genler içermez.Sonuçlarımız, midye gibi gösterge türlerinden alınan sıvı biyopsilerin, tipik olarak kıyı deniz ekosistemlerinde yaşayan konakçıları enfekte ettiği bilinen nispeten çok sayıda ccfDNA virüs fragmanını tanımlamak için kullanılabileceğini göstermektedir.Bu, protozoa, eklembacaklıları, böcekleri, bitkileri ve bakteriyel virüsleri (örn. bakteriyofajlar) enfekte ettiği bilinen virüsleri içerir.Kerguelen'de aynı midye tabakasında toplanan mavi midyelerin (M. platensis) hemolenf ccfDNA viromunu incelediğimizde de benzer bir dağılım bulundu (Tablo S2, Ek Bilgiler).ccfDNA'nın av tüfeği dizilimi gerçekten de insanların veya diğer türlerin viromunun çalışmasında ivme kazanan yeni bir yaklaşımdır [21, 37, 64].Baltimore'daki en çeşitli ve geniş virüs sınıfını temsil eden tüm çift sarmallı DNA virüsleri arasında tek bir gen korunmadığından, bu yaklaşım özellikle çift sarmallı DNA virüslerini incelemek için yararlıdır [65].Bu virüslerin çoğu sınıflandırılmamış kalsa ve viral dünyanın tamamen bilinmeyen bir kısmından virüsler içerebilse de [66], midye A. atra ve M. platensis'in viromları ve konukçu aralıklarının iki tür arasında yer aldığını bulduk.benzer şekilde (bkz. şekil S3, ek bilgi).Bu benzerlik, çevrede bulunan DNA'nın alımındaki seçicilik eksikliğini yansıtabileceği için şaşırtıcı değildir.RNA viromunu karakterize etmek için şu anda saflaştırılmış RNA kullanan gelecekteki çalışmalara ihtiyaç vardır.
Çalışmamızda, yerel ccfDNA'nın montajından önce ve sonra havuzlanmış okumaların ve devamların iki aşamalı silinmesini kullanan ve yüksek oranda eşlenmemiş okumayla sonuçlanan Kowarski ve meslektaşlarının [37] çalışmasından uyarlanan çok titiz bir ardışık düzen kullandık.Bu nedenle, öncelikle bu midye türü için bir referans genomumuz olmadığı için, bu haritası çıkarılmamış okumalardan bazılarının hala kendi kökenlerine sahip olabileceğini ekarte edemeyiz.Kendi kendine ve kendi kendine olmayan okumalar arasındaki kimeralar ve Illumina MiSeq PE75 tarafından oluşturulan okuma uzunlukları hakkında endişe duyduğumuz için bu boru hattını da kullandık.Haritalanmamış okumaların çoğunun bir başka nedeni de, özellikle Kerguelen gibi uzak bölgelerdeki deniz mikroplarının çoğunun açıklanmamış olmasıdır.İnsan ccfDNA'sına benzer ccfDNA fragman uzunluklarını varsayarak Illumina MiSeq PE75 kullandık.Gelecekteki çalışmalar için, hemolimf ccfDNA'nın insanlardan ve/veya memelilerden daha uzun okumalara sahip olduğunu gösteren sonuçlarımız göz önüne alındığında, daha uzun ccfDNA fragmanları için daha uygun bir sıralama platformu kullanmanızı öneririz.Bu uygulama, daha derin analiz için daha fazla gösterge belirlemeyi çok daha kolaylaştıracaktır.Halihazırda mevcut olmayan eksiksiz A. atra nükleer genom dizisinin elde edilmesi, ccfDNA'nın kendi kendine ve kendi olmayan kaynaklardan ayırt edilmesini de büyük ölçüde kolaylaştıracaktır.Araştırmamızın midyelere likit biyopsi kavramını uygulama olasılığına odaklandığı göz önüne alındığında, bu kavram gelecekteki araştırmalarda kullanıldığından, midyelerin mikrobiyal çeşitliliğini incelemek için bu yöntemin potansiyelini artırmak için yeni araçlar ve boru hatları geliştirileceğini umuyoruz.deniz ekosistemi.
İnvaziv olmayan bir klinik biyobelirteç olarak, yüksek insan plazma ccfDNA seviyeleri çeşitli hastalıklar, doku hasarı ve stres koşulları ile ilişkilidir [67,68,69].Bu artış, doku hasarından sonra kendi orijinli DNA fragmanlarının salınmasıyla ilişkilidir.Midyelerin kısa bir süre 30 °C sıcaklığa maruz bırakıldığı akut ısı stresini kullanarak bu sorunu ele aldık.Bu analizi üç farklı midye türü üzerinde üç bağımsız deneyde gerçekleştirdik.Ancak, akut ısı stresinden sonra ccfDNA seviyelerinde herhangi bir değişiklik bulamadık (bkz. Şekil S5, ek bilgi).Bu keşif, midyelerin yarı açık bir dolaşım sistemine sahip olmalarını ve yüksek filtreleme aktivitelerinden dolayı büyük miktarlarda yabancı DNA biriktirmelerini en azından kısmen açıklayabilir.Öte yandan, birçok omurgasız hayvan gibi midyeler de stresin neden olduğu doku hasarına karşı daha dirençli olabilir ve böylece hemolenflerinde ccfDNA salınımını sınırlayabilir [70, 71].
Bugüne kadar, su ekosistemlerindeki biyoçeşitliliğin DNA analizi, esas olarak çevresel DNA (eDNA) metabarcoding'e odaklanmıştır.Bununla birlikte, bu yöntem genellikle primerler kullanıldığında biyoçeşitlilik analizinde sınırlıdır.Av tüfeği sıralamasının kullanılması, PCR'nin sınırlamalarını ve primer setlerinin önyargılı seçimini ortadan kaldırır.Bu nedenle, yöntemimiz bir anlamda, parçalanmış DNA'yı doğrudan dizileyebilen ve hemen hemen tüm organizmaları analiz edebilen, son zamanlarda kullanılan yüksek verimli eDNA Shotgun dizileme yöntemine daha yakındır [72, 73].Ancak, LB'yi standart eDNA yöntemlerinden ayıran birkaç temel konu vardır.Tabii ki, eDNA ve LB arasındaki temel fark, doğal filtre ana bilgisayarlarının kullanılmasıdır.Süngerler ve çift kabuklular (Dresseina spp.) gibi deniz türlerinin eDNA'yı incelemek için doğal bir filtre olarak kullanıldığı bildirilmiştir [74, 75].Bununla birlikte, Dreissena'nın çalışması, DNA'nın ekstrakte edildiği doku biyopsilerini kullandı.LB'den ccfDNA analizi, doku biyopsisi, özel ve bazen pahalı ekipman ve eDNA veya doku biyopsisi ile bağlantılı lojistik gerektirmez.Aslında, yakın zamanda LB'den gelen ccfDNA'nın, uzak bölgelerdeki araştırmalar için büyük bir zorluk olan bir soğuk zincir sağlamadan FTA desteğiyle depolanabileceğini ve analiz edilebileceğini bildirdik [76].Sıvı biyopsilerden ccfDNA'nın ekstraksiyonu da basittir ve pompalı dizileme ve PCR analizi için yüksek kaliteli DNA sağlar.Bu, eDNA analiziyle ilgili bazı teknik sınırlamalar göz önüne alındığında büyük bir avantajdır [77].Örnekleme yönteminin basitliği ve düşük maliyeti de özellikle uzun vadeli izleme programları için uygundur.Yüksek filtreleme yeteneklerine ek olarak, çift kabukluların iyi bilinen bir başka özelliği de mukuslarının virüslerin emilimini destekleyen kimyasal mukopolisakkarit bileşimidir [78, 79].Bu, çift kabukluları belirli bir su ekosistemindeki biyolojik çeşitliliği ve iklim değişikliğinin etkisini karakterize etmek için ideal bir doğal filtre haline getirir.Konak türevli DNA fragmanlarının varlığı, eDNA'ya kıyasla yöntemin bir sınırlaması olarak görülebilse de, eDNA'ya kıyasla böyle bir doğal ccfDNA'ya sahip olmanın getirdiği maliyet, sağlık araştırmaları için mevcut olan çok miktarda bilgi için aynı anda anlaşılabilir.ofset ana bilgisayar.Bu, konak konağın genomuna entegre edilmiş viral dizilerin varlığını içerir.Çift kabuklularda yatay olarak bulaşan lösemik retrovirüslerin varlığı göz önüne alındığında, bu özellikle midyeler için önemlidir [80, 81].LB'nin eDNA'ya göre bir başka avantajı da, mikroorganizmaları (ve onların genomlarını) yutan hemolenfte dolaşan kan hücrelerinin fagositik aktivitesinden faydalanmasıdır.Çift kabuklularda kan hücrelerinin ana işlevi fagositozdur [82].Son olarak, yöntem, midyelerin yüksek filtreleme kapasitesinden (ortalama 1,5 l/sa deniz suyu) ve iki günlük sirkülasyondan yararlanır ve bu da farklı deniz suyu katmanlarının karışmasını artırarak heterolog eDNA'nın yakalanmasına olanak tanır.[83, 84].Bu nedenle midye ccfDNA analizi, midyelerin beslenme, ekonomik ve çevresel etkileri göz önüne alındığında ilginç bir yoldur.İnsanlardan toplanan LB'nin analizine benzer şekilde, bu yöntem aynı zamanda eksojen maddelere yanıt olarak konak DNA'sındaki genetik ve epigenetik değişiklikleri ölçme olasılığını da açar.Örneğin, üçüncü nesil dizileme teknolojilerinin, nanopore dizileme kullanarak doğal ccfDNA'da genom çapında metilasyon analizi gerçekleştirmesi öngörülebilir.Bu süreç, midye ccfDNA fragmanlarının uzunluğunun, kimyasal dönüşümlere ihtiyaç duymadan tek bir dizileme çalışmasından genom çapında DNA metilasyon analizine izin veren uzun okumalı dizileme platformlarıyla ideal olarak uyumlu olması gerçeğiyle kolaylaştırılmalıdır.85,86] DNA metilasyon modellerinin çevresel strese bir yanıtı yansıttığı ve birçok nesil boyunca devam ettiği gösterildiği için bu ilginç bir olasılıktır.Bu nedenle, iklim değişikliğine veya kirleticilere maruz kaldıktan sonra tepkiyi yöneten altta yatan mekanizmalar hakkında değerli bilgiler sağlayabilir [87].Ancak, LB'nin kullanımı sınırsız değildir.Söylemeye gerek yok, bu ekosistemde gösterge türlerin varlığını gerektirir.Yukarıda bahsedildiği gibi, belirli bir ekosistemin biyolojik çeşitliliğini değerlendirmek için LB kullanmak, kaynaktan DNA parçalarının varlığını hesaba katan titiz bir biyoinformatik boru hattı gerektirir.Diğer bir önemli sorun, deniz türleri için referans genomların mevcudiyetidir.Deniz Memelileri Genomları Projesi ve yakın zamanda kurulan Fish10k projesi [88] gibi girişimlerin gelecekte bu tür analizleri kolaylaştıracağı umulmaktadır.LB konseptinin denizde filtreyle beslenen organizmalara uygulanması, aynı zamanda sıralama teknolojisindeki en son gelişmelerle de uyumludur ve bu da onu, çevresel strese yanıt olarak deniz habitatlarının sağlığı hakkında önemli bilgiler sağlamak için çok ohm'luk biyobelirteçlerin geliştirilmesi için çok uygun hale getirir.
Genom dizileme verileri, Bioprojects SRR8924808 kapsamında NCBI Dizi Okuma Arşivi https://www.ncbi.nlm.nih.gov/sra/SRR8924808'de depolanmıştır.
Brierley AS, Kingsford MJ İklim değişikliğinin deniz yaşamı ve ekosistemler üzerindeki etkisi.Cole Biyoloji.2009;19: P602–P614.
Gissi E, Manea E, Mazaris AD, Fraschetti S, Almpanidou V, Bevilacqua S, et al.İklim değişikliğinin ve diğer yerel stres faktörlerinin deniz ortamı üzerindeki birleşik etkilerini göz önünde bulundurun.genel bilimsel ortam2021;755:142564.
Carella F, Antuofermo E, Farina S, Salati F, Mandas D, Prado P, et al.).Mart ayının ilk bilimi.2020;7:48.
Seront L, Nicastro CR, Zardi GI, Goberville E. Tekrarlayan ısı stresi koşullarında azalan ısı toleransı, mavi midyelerin yazın yüksek ölüm oranını açıklıyor.Bilimsel rapor 2019;9:17498.
Fey SB, Siepielski AM, Nussle S, Cervantes-Yoshida K, Hwan JL, Huber ER, et al.Hayvan ölümlerinin sıklığı, nedenleri ve kapsamındaki son değişiklikler.Proc Natl Acad Sci USA.2015;112:1083-8.
Scarpa F, Sanna D, Azzena I, Mughetti D, Cerruti F, Hosseini S, et al.Türe özgü olmayan çok sayıda patojen, Pinna nobilis'in toplu ölümlerine neden olmuş olabilir.Hayat.2020;10:238.
Bradley M, Coutts SJ, Jenkins E, O'Hara TM.İklim değişikliğinin Arktik zoonotik hastalıklar üzerindeki potansiyel etkisi.Int J Çevresel sağlık.2005;64:468–77.
Beyer J., Greene NW, Brooks S., Allan IJ, Ruus A., Gomez T. ve diğerleri.Kıyı kirliliği izlemede sinyal organizmalar olarak mavi midye (Mytilus edulis spp.): Bir inceleme.Mar Çevre Res 2017;130:338-65.
Siravegna G, Marsoni S, Siena S, Bardelli A. Sıvı biyopsinin kanser tedavisinde entegrasyonu.Nat Rev Clean Oncol.2017;14:531–48.
Wan JCM, Massie C, Garcia-Corbacho J, Mouliere F, Brenton JD, Caldas C ve ark.Sıvı biyopsi olgunlaşması: Tümör DNA'sının dolaşımını sağlar.Nat Rev Kanser.2017;17:223–38.
Mandel P., Metais P. İnsan plazmasındaki nükleik asitler.Soc Biol iştiraklerinin toplantı tutanakları.1948;142:241-3.
Bronkhorst AJ, Ungerer W, Holdenrieder S. Kanser tedavisi için moleküler bir belirteç olarak hücresiz DNA için yeni bir rol.Biyomolar analizin miktarının belirlenmesi.2019;17:100087.
Ignatiadis M., Sledge GW, Jeffrey SS Sıvı biyopsi kliniğe giriyor – uygulama sorunları ve gelecekteki zorluklar.Nat Rev Clin Oncol.2021;18:297–312.
Lo YM, Corbetta N., Chamberlain PF, Rai W., Sargent IL, Redman CW ve diğerleri.Fetal DNA, maternal plazma ve serumda bulunur.Lancet.1997;350:485-7.
Mufarray MN, Wong RJ, Shaw GM, Stevenson DK, Quake SR Hamilelik sırasında kadınların kanında dolaşan hücre dışı RNA kullanılarak hamilelik seyri ve komplikasyonlarının incelenmesi.Dopediatri.2020;8:605219.
Ollerich M, Sherwood K, Keown P, Schütz E, Beck J, Stegbauer J ve diğerleri.Sıvı biyopsi: donör hücre içermeyen DNA, böbrek greftindeki allojenik lezyonları saptamak için kullanılır.Nat Rev Nefrol.2021;17:591–603.
Juan FC, Lo YM Doğum öncesi teşhiste yenilikler: anne plazma genom dizilimi.Ana Doktor2016;67:419-32.
Gu W, Deng X, Lee M, Sucu YD, Arevalo S, Stryke D, et al.Enfekte vücut sıvılarının yeni nesil metagenomik dizilimi ile hızlı patojen tespiti.Nat Tıp.2021;27:115-24.