Nature.com'u ziyaret ettiğiniz için teşekkür ederiz. Kullandığınız tarayıcı sürümü sınırlı CSS desteğine sahiptir. En iyi deneyim için güncellenmiş bir tarayıcı kullanmanızı (veya Internet Explorer'da Uyumluluk Modunu devre dışı bırakmanızı) öneririz. Bu arada, sürekli desteği sağlamak için siteyi stiller ve JavaScript olmadan sunacağız.
Sıvı biyopsi (LB), biyomedikal alanda hızla popülerlik kazanan bir kavramdır. Kavram esas olarak, çeşitli dokularda hücre ölümünden sonra çoğunlukla küçük parçalar halinde salınan dolaşımdaki hücre dışı DNA'nın (ccfDNA) parçalarının tespitine dayanmaktadır. Bu parçaların küçük bir kısmı yabancı (yabancı) dokulardan veya organizmalardan kaynaklanmaktadır. Mevcut çalışmada, bu kavramı yüksek deniz suyu filtrasyon kapasiteleriyle bilinen bir bekçi türü olan midyelere uyguladık. Midyelerin doğal filtreler gibi davranma yeteneğini kullanarak çeşitli kaynaklardan çevresel DNA parçalarını yakalayarak deniz kıyı ekosistemlerinin biyoçeşitliliği hakkında bilgi sağlıyoruz. Sonuçlarımız midye hemolimfinin 1 ila 5 kb arasında büyüklükleri büyük ölçüde değişen DNA parçaları içerdiğini göstermektedir. Shotgun dizilemesi, çok sayıda DNA parçasının yabancı mikrobiyal kökenli olduğunu göstermiştir. Bunlar arasında, kıyı deniz ekosistemlerinde yaygın olarak bulunan çeşitli konakçıları enfekte ettiği bilinen virüsler de dahil olmak üzere bakteri, arke ve virüslerden DNA parçaları bulduk. Sonuç olarak çalışmamız, midyelere uygulanan LB kavramının deniz kıyı ekosistemlerindeki mikrobiyal çeşitlilik hakkında zengin ancak henüz keşfedilmemiş bir bilgi kaynağı olduğunu göstermektedir.
İklim değişikliğinin (İK) deniz ekosistemlerinin biyolojik çeşitliliği üzerindeki etkisi hızla büyüyen bir araştırma alanıdır. Küresel ısınma yalnızca önemli fizyolojik streslere neden olmakla kalmaz, aynı zamanda deniz organizmalarının termal kararlılığının evrimsel sınırlarını zorlayarak bir dizi türün yaşam alanını etkiler ve onları daha uygun koşullar aramaya sevk eder [1, 2]. İK, metazoanların biyolojik çeşitliliğini etkilemenin yanı sıra, konak-mikrobiyal etkileşimlerin hassas dengesini de bozar. Bu mikrobiyal disbakteriyoz, deniz organizmalarını enfeksiyöz patojenlere karşı daha duyarlı hale getirdiği için deniz ekosistemleri için ciddi bir tehdit oluşturur [3, 4]. SS'nin küresel deniz ekosistemlerinin yönetimi için ciddi bir sorun olan kitlesel ölümlerde önemli bir rol oynadığına inanılmaktadır [5, 6]. Bu, birçok deniz türünün ekonomik, ekolojik ve besinsel etkileri göz önüne alındığında önemli bir konudur. Bu, özellikle CK'nin etkilerinin daha ani ve şiddetli olduğu kutup bölgelerinde yaşayan çift kabuklular için geçerlidir [6, 7]. Aslında, Mytilus spp. gibi çift kabuklular. CC'nin deniz ekosistemleri üzerindeki etkilerini izlemek için yaygın olarak kullanılır. Şaşırtıcı olmayan bir şekilde, sağlıklarını izlemek için nispeten çok sayıda biyobelirteç geliştirilmiştir ve bu biyobelirteçler genellikle enzimatik aktiviteye veya hücre canlılığı ve fagositik aktivite gibi hücresel işlevlere dayanan işlevsel biyobelirteçleri içeren iki kademeli bir yaklaşım kullanır [8]. Bu yöntemler ayrıca, büyük miktarda deniz suyunun emiliminden sonra yumuşak dokularda biriken belirli basınç göstergelerinin konsantrasyonunun ölçülmesini de içerir. Bununla birlikte, çift kabuklu yumuşakçaların yüksek filtrasyon kapasitesi ve yarı açık dolaşım sistemi, hasta yönetimine yönelik basit ve minimal invaziv bir yaklaşım olan sıvı biyopsi (LB) kavramını kullanarak yeni hemolimf biyobelirteçleri geliştirme fırsatı sunar. kan örnekleri [9, 10]. İnsan LB'sinde çeşitli tipte dolaşımdaki moleküller bulunabilmesine rağmen, bu kavram öncelikle plazmadaki dolaşımdaki hücre dışı DNA (ccfDNA) parçalarının DNA dizileme analizine dayanmaktadır. Aslında, insan plazmasında dolaşan DNA'nın varlığı 20. yüzyılın ortalarından beri bilinmektedir [11], ancak yüksek verimli dizileme yöntemlerinin ortaya çıkması ancak son yıllarda ccfDNA'ya dayalı klinik tanıya yol açmıştır. Bu dolaşan DNA parçalarının varlığı kısmen hücre ölümünden sonra genomik DNA'nın (nükleer ve mitokondriyal) pasif olarak salınmasından kaynaklanmaktadır. Sağlıklı bireylerde ccfDNA konsantrasyonu normalde düşüktür (<10 ng/mL) ancak çeşitli patolojileri olan veya strese maruz kalan hastalarda 5-10 kat artarak doku hasarına neden olabilir. Sağlıklı bireylerde ccfDNA konsantrasyonu normalde düşüktür (<10 ng/mL) ancak çeşitli patolojileri olan veya strese maruz kalan hastalarda 5-10 kat artarak doku hasarına neden olabilir. У здоровых людей концентрация вккДНК в норме низкая (<10 нг/мл), но может повышаться в 5–10 раз у больных с различной патологией veya подвергающихся стрессу, приводящему к повреждению тканей. Sağlıklı kişilerde cccDNA konsantrasyonu normalde düşüktür (<10 ng/mL), ancak çeşitli patolojileri olan hastalarda veya doku hasarına yol açan stres altındaki hastalarda 5-10 kat artabilir.在健康个体中，ccfDNA 的浓度通常较低（<10 ng/mL)在 健康 个体 中 ， ccfdna 的 浓度 较 低 （（<10 ng/ml） 但 在 各 种 病理 或 承受 压力 患者5-10 gün önce , 从而 组织。。。 损伤 损伤 损伤 损伤 损伤 损伤 损伤 损伤 损伤损伤Концентрации ccfDNA обычно низкие (<10 нг/мл) у здоровых людей, но могут быть увеличены в 5-10 раз у пациентов с различными патологиями veya стрессом, что приводит к повреждению тканей. Sağlıklı bireylerde ccfDNA konsantrasyonları genellikle düşüktür (<10 ng/ml), ancak çeşitli patolojileri olan veya strese maruz kalan hastalarda 5-10 kat artarak doku hasarına neden olabilir.ccfDNA parçalarının boyutu büyük ölçüde değişir, ancak genellikle 150 ila 200 bp arasındadır. [12]. Kendiliğinden türetilen ccfDNA'nın, yani normal veya dönüştürülmüş konak hücrelerinden elde edilen ccfDNA'nın analizi, nükleer ve/veya mitokondriyal genomda bulunan genetik ve epigenetik değişiklikleri tespit etmek için kullanılabilir ve böylece klinisyenlerin spesifik moleküler hedefli tedavileri seçmelerine yardımcı olur [13]. Ancak ccfDNA, hamilelik sırasında fetal hücrelerden veya nakledilen organlardan elde edilen ccfDNA gibi yabancı kaynaklardan da elde edilebilir [14,15,16,17]. ccfDNA ayrıca, kan kültürleriyle tanımlanamayan yaygın enfeksiyonların invaziv olmayan bir şekilde tespit edilmesini sağlayan ve enfekte dokudan invaziv biyopsi yapılmasını önleyen, bulaşıcı bir etkenin (yabancı) nükleik asitlerinin varlığını tespit etmek için önemli bir bilgi kaynağıdır [18]. Son çalışmalar, insan kanının viral ve bakteriyel patojenleri tanımlamak için kullanılabilecek zengin bir bilgi kaynağı içerdiğini ve insan plazmasında bulunan ccfDNA'nın yaklaşık %1'inin yabancı kökenli olduğunu göstermiştir [19]. Bu çalışmalar, bir organizmanın dolaşan mikrobiyomunun biyolojik çeşitliliğinin ccfDNA analizi kullanılarak değerlendirilebileceğini göstermektedir. Ancak, yakın zamana kadar bu kavram yalnızca insanlarda ve daha az ölçüde diğer omurgalılarda kullanılmıştır [20, 21].
Mevcut makalede, 35 milyon yıl önce oluşmuş büyük bir platonun tepesindeki bir ada grubu olan subantarktik Kerguelen Adaları'nda yaygın olarak bulunan güneyli bir tür olan Aulacomya atra'nın ccfDNA'sını analiz etmek için LB potansiyelini kullanıyoruz. volkanik patlama. Bir in vitro deneysel sistem kullanarak, deniz suyundaki DNA parçalarının midyeler tarafından hızla alındığını ve hemolenf bölmesine girdiğini bulduk. Shotgun dizilemesi, midye hemolenf ccfDNA'sının, simbiyotik bakteriler ve soğuk volkanik deniz kıyı ekosistemlerine özgü biyomlardan gelen DNA parçaları da dahil olmak üzere kendi ve kendi olmayan kökenli DNA parçaları içerdiğini göstermiştir. Hemolenf ccfDNA ayrıca farklı konak aralıklarına sahip virüslerden türetilen viral diziler içerir. Ayrıca kemikli balıklar, deniz anemonları, algler ve böcekler gibi çok hücreli hayvanlardan DNA parçaları bulduk. Sonuç olarak çalışmamız, LB konseptinin deniz ekosistemlerinde zengin bir genomik repertuar oluşturmak amacıyla deniz omurgasızlarına başarıyla uygulanabileceğini göstermektedir.
Yetişkinler (55-70 mm uzunluğunda) Mytilus platensis (M. platensis) ve Aulacomya atra (A. atra), Aralık 2018'de Kerguelen Adaları'ndaki Port-au-France'ın (049°21.235 G, 070°13.490 D) gelgit kayalık kıyılarından toplandı. Diğer yetişkin mavi midyeler (Mytilus spp.) ticari bir tedarikçiden (PEI Mussel King Inc., Prince Edward Adası, Kanada) temin edildi ve 10–20 L 32‰ yapay tuzlu su içeren sıcaklık kontrollü (4°C) havalandırmalı bir tanka yerleştirildi. (yapay deniz tuzu Reef Crystal, Instant Ocean, Virginia, ABD). Her deney için, ayrı ayrı kabukların uzunluğu ve ağırlığı ölçüldü.
Bu program için ücretsiz bir açık erişim protokolü çevrimiçi olarak mevcuttur (https://doi.org/10.17504/protocols.io.81wgb6z9olpk/v1). Kısaca, LB hemolenfi abdüktör kaslarından açıklandığı gibi toplandı [22]. Hemolenf, 1200 × g'de 3 dakika santrifüj edilerek berraklaştırıldı, üstteki sıvı kullanılana kadar donduruldu (-20 °C). cfDNA'nın izolasyonu ve saflaştırılması için, örnekler (1,5-2,0 ml) çözüldü ve üreticinin talimatlarına göre NucleoSnap cfDNA kiti (Macherey-Nagel, Bethlehen, PA) kullanılarak işlendi. ccfDNA, daha fazla analiz yapılana kadar -80 °C'de saklandı. Bazı deneylerde, ccfDNA, QIAamp DNA Araştırma Kiti (QIAGEN, Toronto, Ontario, Kanada) kullanılarak izole edildi ve saflaştırıldı. Saflaştırılmış DNA, standart bir PicoGreen testi kullanılarak kantifize edildi. İzole edilen ccfDNA'nın parça dağılımı, Yüksek Hassasiyetli DNA Kiti kullanılarak Agilent 2100 biyoanalizörü (Agilent Technologies Inc., Santa Clara, CA) kullanılarak kapiler elektroforezle analiz edildi. Test, üreticinin talimatlarına göre 1 µl ccfDNA örneği kullanılarak gerçekleştirildi.
Hemolenf ccfDNA parçalarının dizilenmesi için, Génome Québec (Montreal, Quebec, Kanada) Illumina MiSeq PE75 kitinin Illumina DNA Mix kitini kullanarak shotgun kütüphaneleri hazırladı. Standart bir adaptör (BioO) kullanıldı. Ham veri dosyaları NCBI Sequence Read Archive'den (SRR8924808 ve SRR8924809) edinilebilir. Temel okuma kalitesi FastQC [23] kullanılarak değerlendirildi. Trimmomatic [24], adaptörleri ve düşük kaliteli okumaları kesmek için kullanıldı. Eşleştirilmiş uçlara sahip shotgun okumaları, uyumsuzlukları önlemek için en az 20 bp örtüşme ile daha uzun tekli okumalara FLASH ile birleştirildi [25]. Birleştirilmiş okumalar, çift kabuklu NCBI Taksonomi veritabanı (e değeri < 1e−3 ve %90 homoloji) kullanılarak BLASTN ile açıklandı ve düşük karmaşıklıktaki dizilerin maskelenmesi DUST [26] kullanılarak gerçekleştirildi. Birleştirilmiş okumalar, çift kabuklu NCBI Taksonomi veritabanı (e değeri < 1e−3 ve %90 homoloji) kullanılarak BLASTN ile açıklandı ve düşük karmaşıklıktaki dizilerin maskelenmesi DUST [26] kullanılarak gerçekleştirildi. Объединенные чтения были аннотированы с помощью BLASTN с использованием базы данных таксономии двустворчатых моллюсков NCBI (значение e < 1e-3 ve 90% гомологии), а маскирование последовательностей низкой сложности Bu, DUST'ın bir parçasıydı [26]. Birleştirilmiş okumalar, NCBI çift kabuklu taksonomi veritabanı (e değeri < 1e-3 ve %90 homoloji) kullanılarak BLASTN ile açıklandı ve düşük karmaşıklıkta dizi maskelemesi DUST [26] kullanılarak gerçekleştirildi.使用双壳类NCBI 分类数据库（e 值< 1e-3 和90% 同源性）用BLASTN 注释合并的读数，并使用DUST [26] Bir başka deyişle, iyi bir şey değil.使用 双 壳类 ncbi 分类 （（（<1e-3 和 90% 同源） 用 用 用 注释 合并 读数 ， 并 使用 toz [26]进行 复杂度 序列 的。。。。 掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽Объединенные чтения были аннотированы с помощью BLASTN с использованием таксономической базы данных двустворчатых моллюсков NCBI (значение e <1e-3 ve 90% гомологии), а маскирование последовательностей низкой сложности DUST'ın tozlu olması [26]. Birleştirilmiş okumalar, NCBI çift kabuklu taksonomik veritabanı (e değeri <1e-3 ve %90 homoloji) kullanılarak BLASTN ile açıklandı ve düşük karmaşıklıkta dizi maskelemesi DUST [26] kullanılarak gerçekleştirildi.Okumalar iki gruba ayrıldı: çift kabuklu dizilerle ilgili (burada kendi kendine okumalar olarak adlandırılır) ve ilgisiz (kendi kendine okumayanlar). İki grup, bitişikler oluşturmak için MEGAHIT kullanılarak ayrı ayrı bir araya getirildi [27]. Bu arada, yabancı mikrobiyom okumalarının taksonomik dağılımı Kraken2 [28] kullanılarak sınıflandırıldı ve Galaxy'de bir Krona pasta grafiği ile grafiksel olarak gösterildi [29, 30]. Ön deneylerimizden optimum kmerlerin kmer-59 olduğu belirlendi. Daha sonra kendi bitişikleri, son açıklama için BLASTN (bivalve NCBI veri tabanı, e değeri < 1e−10 ve %60 homoloji) ile hizalanarak tanımlandı. Daha sonra kendi bitişikleri, son açıklama için BLASTN (bivalve NCBI veri tabanı, e değeri < 1e−10 ve %60 homoloji) ile hizalanarak tanımlandı. Затем собственные контиги были идентифицированы путем сопоставления с BLASTN (база данных двустворчатых) NCBI'nin моллюсков, значение e <1e-10 ve гомология 60%) окончательной аннотации. Daha sonra kendi kendine bitişik olanlar, son açıklama için BLASTN'ye (NCBI çift kabuklular veri tabanı, e değeri <1e-10 ve %60 homoloji) göre eşleştirilerek tanımlandı.然后通过与BLASTN（双壳贝类NCBI 数据库，e 值< 1e-10 和60%同源性）对齐来识别自身重叠群以进行最终注释。然后通过与BLASTN（双壳贝类NCBI 数据库，e 值< 1e-10 和60% Затем были идентифицированы собственные контиги для окончательной аннотации путем сопоставления с BLASTN (NCBI'nin для двустворчатых моллюсков, значение e <1e-10 ve гомология 60%'e kadar). Daha sonra kendi kendine bitişik olanlar, BLASTN (NCBI çift kabuklular veri tabanı, e değeri <1e-10 ve %60 homoloji) ile eşleştirilerek son açıklama için tanımlandı. Paralel olarak, kendi olmayan grup kontigleri BLASTN ile açıklandı (nt NCBI veri tabanı, e değeri < 1e−10 ve %60 homoloji). Paralel olarak, kendi olmayan grup kontigleri BLASTN ile açıklandı (nt NCBI veri tabanı, e değeri < 1e−10 ve %60 homoloji). Параллельно чужеродные групповые контиги были аннотированы с помощью BLASTN (база данных nt NCBI, значение e) <1e-10 ve гомология 60%). Paralel olarak, yabancı grup bitişikleri BLASTN (NT NCBI veri tabanı, e değeri <1e-10 ve %60 homoloji) ile açıklandı.平行地，用BLASTN（nt NCBI 数据库，e 值< 1e-10 和60% 同源性）注释非自身组重叠群。平行地，用BLASTN（nt NCBI 数据库，e 值< 1e-10 和60% 同源性）注释非自身组重叠群。 Параллельно контиги, не относящиеся к собственной группе, были аннотированы с помощью BLASTN (база данных nt) NCBI, значение e <1e-10 ve гомология 60%). Paralel olarak, kendi grubu olmayan bitişikler BLASTN (nt NCBI veri tabanı, e değeri <1e-10 ve %60 homoloji) ile açıklandı. BLASTX ayrıca nr ve RefSeq protein NCBI veri tabanları (e değeri < 1e−10 ve %60 homoloji) kullanılarak kendi olmayan bitişikler üzerinde de yürütüldü. BLASTX ayrıca nr ve RefSeq protein NCBI veri tabanları (e değeri < 1e−10 ve %60 homoloji) kullanılarak kendi olmayan bitişikler üzerinde de yürütüldü. BLASTX, nr ve RefSeq NCBI'de yeni bir bağlantı kurarak en iyi şekilde çalışır. (значение e <1e-10 ve гомология 60%). BLASTX ayrıca nr ve RefSeq NCBI protein veri tabanları (e değeri < 1e-10 ve %60 homoloji) kullanılarak kendi kendine olmayan bitişikler üzerinde de gerçekleştirildi.还使用nr ve RefSeq 蛋白NCBI 数据库对非自身重叠群进行了BLASTX（e 值< 1e-10 和60% 同源性）。还使用nr ve RefSeq 蛋白NCBI 数据库对非自身重叠群进行了BLASTX（e 值< 1e-10 和60% 同源性）。 BLASTX, nr ve RefSeq NCBI'de (e-posta yoluyla) yeni bir müşteri bağlantısına sahiptir. <1e-10 ve гомология 60%). BLASTX, nr ve RefSeq NCBI protein veri tabanları (e değeri <1e-10 ve %60 homoloji) kullanılarak kendi kendine olmayan bitişikler üzerinde de gerçekleştirildi.Kendine ait olmayan bitişiklerin BLASTN ve BLASTX havuzları son bitişikleri temsil eder (Ek dosyaya bakın).
PCR için kullanılan primerler Tablo S1'de listelenmiştir. Taq DNA polimerazı (Bio Basic Canada, Markham, ON) ccfDNA hedef genlerini çoğaltmak için kullanılmıştır. Aşağıdaki reaksiyon koşulları kullanılmıştır: 95°C'de 3 dakika denatürasyon, 95°C'de 1 dakika, 1 dakika sabit tavlama sıcaklığı, 72°C'de 1 dakika uzama, 35 döngü ve son olarak 10 dakika içinde 72°C. PCR ürünleri SYBRTM Safe DNA Jel Boyası (Invitrogen, Burlington, ON, Kanada) içeren agar jellerde (%1,5) 95 V'da elektroforezle ayrılmıştır.
Midyeler (Mytilus spp.) 4°C'de 24 saat boyunca 500 ml oksijenli deniz suyunda (32 PSU) aklimatize edildi. İnsan galectin-7 cDNA dizisini kodlayan bir ek içeren plazmit DNA'sı (NCBI erişim numarası L07769) 190 μg/μl'lik son konsantrasyonda şişeye eklendi. DNA eklenmeden aynı koşullar altında inkübe edilen midyeler kontroldü. Üçüncü kontrol tankı midye içermeyen DNA içeriyordu. Deniz suyundaki DNA kalitesini izlemek için belirtilen zamanda her tanktan deniz suyu örnekleri (20 μl; üç tekrar) alındı. Plazmit DNA izlenebilirliği için LB midyeleri belirtilen zamanlarda hasat edildi ve qPCR ve ddPCR ile analiz edildi. Deniz suyunun yüksek tuz içeriği nedeniyle, tüm PCR analizlerinden önce alikotlar PCR kalitesindeki suda (1:10) seyreltildi.
Dijital damlacık PCR (ddPCR), BioRad QX200 protokolü (Mississauga, Ontario, Kanada) kullanılarak gerçekleştirildi. Optimum sıcaklığı belirlemek için sıcaklık profilini kullanın (Tablo S1). Damlalar bir QX200 damla jeneratörü (BioRad) kullanılarak oluşturuldu. ddPCR şu şekilde gerçekleştirildi: 5 dakika boyunca 95°C, 30 saniye boyunca 95°C'lik 50 döngü ve 1 dakika boyunca belirli bir tavlama sıcaklığı ve 30 saniye boyunca 72°C, 5 dakika boyunca 4°C ve 5 dakika içinde 90°C. Damla sayısı ve pozitif reaksiyonlar (kopya sayısı/µl) bir QX200 damla okuyucusu (BioRad) kullanılarak ölçüldü. 10.000'den az damlacık içeren örnekler reddedildi. Her ddPCR çalıştırıldığında desen kontrolü yapılmadı.
qPCR, Rotor-Gene® 3000 (Corbett Research, Sidney, Avustralya) ve LGALS7 spesifik primerleri kullanılarak gerçekleştirildi. Tüm kantitatif PCR'ler, QuantiFast SYBR Green PCR Kiti (QIAGEN) kullanılarak 20 µl'de gerçekleştirildi. qPCR, 95°C'de 15 dakikalık bir inkübasyonla başlatıldı, ardından 95°C'de 10 saniye ve 60°C'de 60 saniye olmak üzere bir veri toplama ile 40 döngü gerçekleştirildi. Erime eğrileri, 95°C'de 5 saniye, 65°C'de 60 saniye ve qPCR'nin sonunda 97°C'de ardışık ölçümler kullanılarak oluşturuldu. Kontrol örnekleri hariç her qPCR üçlü olarak gerçekleştirildi.
Midyeler yüksek filtrasyon hızlarıyla bilindiklerinden, öncelikle deniz suyunda bulunan DNA parçalarını filtreleyip tutup tutamayacaklarını araştırdık. Ayrıca bu parçaların yarı açık lenfatik sistemlerinde birikip birikmediğiyle de ilgileniyorduk. Bu sorunu, mavi midye tanklarına eklenen çözünebilir DNA parçalarının kaderini izleyerek deneysel olarak çözdük. DNA parçalarının izlenmesini kolaylaştırmak için insan galectin-7 genini içeren yabancı (kendi değil) plazmit DNA'sı kullandık. ddPCR, deniz suyundaki ve midyelerdeki plazmit DNA parçalarını izler. Sonuçlarımız, midyelerin yokluğunda deniz suyundaki DNA parçalarının miktarı zamanla (7 güne kadar) nispeten sabit kalırsa, midyelerin varlığında bu seviyenin 8 saat içinde neredeyse tamamen ortadan kalktığını göstermektedir (Şekil 1a,b). Ekzojen DNA parçaları, intravalvüler sıvıda ve hemolenfte 15 dakika içinde kolayca tespit edildi (Şekil 1c). Bu parçalar maruziyetten 4 saat sonra bile hala tespit edilebiliyordu. DNA parçaları açısından bu filtreleme aktivitesi, bakteri ve alglerin filtreleme aktivitesine benzemektedir [31]. Bu sonuçlar, midyelerin sıvı bölmelerinde yabancı DNA'yı filtreleyebildiğini ve biriktirebildiğini göstermektedir.
Midyelerin varlığında (A) veya yokluğunda (B) deniz suyundaki plazmid DNA'sının bağıl konsantrasyonları, ddPCR ile ölçülmüştür. A'da, sonuçlar yüzde olarak ifade edilmiştir ve kutuların sınırları 75. ve 25. persentilleri temsil etmektedir. Uydurulmuş logaritmik eğri kırmızıyla gösterilmiştir ve griyle gölgelenen alan %95 güven aralığını temsil etmektedir. B'de, kırmızı çizgi ortalamayı ve mavi çizgi konsantrasyon için %95 güven aralığını temsil etmektedir. C Plazmid DNA'sının eklenmesinden sonra farklı zamanlarda midyelerin hemolenf ve kapak sıvısında plazmid DNA'sının birikmesi. Sonuçlar tespit edilen mutlak kopya/mL (±SE) olarak sunulmuştur.
Daha sonra, sınırlı antropojenik etkiye sahip uzak bir ada grubu olan Kerguelen Adaları'ndaki midye yataklarından toplanan midyelerdeki ccfDNA'nın kökenini araştırdık. Bu amaçla, midye hemolenflerinden cccDNA izole edildi ve insan cccDNA'sını saflaştırmak için yaygın olarak kullanılan yöntemlerle saflaştırıldı [32, 33]. Midyelerdeki ortalama hemolenf ccfDNA konsantrasyonlarının ml hemolenf başına düşük mikrogram aralığında olduğunu bulduk (bkz. Tablo S2, Ek Bilgiler). Bu konsantrasyon aralığı sağlıklı insanlara göre çok daha büyüktür (mililitre başına düşük nanogram), ancak nadir durumlarda, kanser hastalarında ccfDNA seviyesi mililitre başına birkaç mikrograma ulaşabilir [34, 35]. Heolenf ccfDNA'nın boyut dağılımının analizi, bu parçaların 1000 bp ile 1000 bp arasında değişen büyüklüklerde olduğunu gösterdi. 5000 bp'ye kadar (Şekil 2). Benzer sonuçlar, ccfDNA [36] dahil olmak üzere düşük konsantrasyonlu DNA örneklerinden genomik DNA'yı hızla izole etmek ve saflaştırmak için adli bilimlerde yaygın olarak kullanılan bir yöntem olan silika bazlı QIAamp Araştırma Kiti kullanılarak elde edildi.
Midye hemolimfinin temsili ccfDNA elektroforegramı. NucleoSnap Plasma Kit (üstte) ve QIAamp DNA Araştırma Kiti ile ekstrakte edilmiştir. B Midyelerde hemolimf ccfDNA konsantrasyonlarının (±SE) dağılımını gösteren keman çizimi. Siyah ve kırmızı çizgiler medyanı ve sırasıyla birinci ve üçüncü çeyrekleri temsil eder.
İnsanlarda ve primatlarda ccfDNA'nın yaklaşık %1'i yabancı bir kaynağa sahiptir [21, 37]. Çift kabukluların yarı açık dolaşım sistemi, mikrobiyal açıdan zengin deniz suyu ve midye ccfDNA'sının boyut dağılımı göz önüne alındığında, midye hemolimf ccfDNA'sının zengin ve çeşitli bir mikrobiyal DNA havuzu içerebileceği hipotezini öne sürdük. Bu hipotezi test etmek için Kerguelen Adaları'ndan toplanan Aulacomya atra örneklerinden hemolimf ccfDNA'sını diziledik ve 10 milyondan fazla okuma elde ettik; bunların %97,6'sı kalite kontrolünden geçti. Daha sonra okumalar BLASTN ve NCBI çift kabuklu veri tabanları kullanılarak kendi kaynaklarına ve kendi kaynaklarına göre sınıflandırıldı (Şekil S1, Ek Bilgiler).
İnsanlarda hem nükleer hem de mitokondriyal DNA kan dolaşımına salınabilir [38]. Ancak, mevcut çalışmada, A. atra genomunun dizilenmemesi veya tanımlanmaması nedeniyle midyelerin nükleer genomik DNA'sını ayrıntılı olarak tanımlamak mümkün olmamıştır. Ancak, çift kabuklular kütüphanesini kullanarak kendi kökenimize ait bir dizi ccfDNA parçasını tanımlayabildik (Şekil S2, Ek Bilgiler). Ayrıca, dizilenen A. atra genlerinin yönlendirilmiş PCR amplifikasyonu ile kendi kökenimize ait DNA parçalarının varlığını doğruladık (Şekil 3). Benzer şekilde, A. atra'nın mitokondriyal genomunun kamuya açık veritabanlarında mevcut olduğu göz önüne alındığında, A. atra'nın hemolimfinde mitokondriyal ccfDNA parçalarının varlığına dair kanıt bulunabilir. Mitokondriyal DNA parçalarının varlığı PCR amplifikasyonu ile doğrulandı (Şekil 3).
A. atra'nın (kırmızı noktalar - stok numarası: SRX5705969) ve M. platensis'in (mavi noktalar - stok numarası: SRX5705968) hemolimfinde PCR ile çoğaltılan çeşitli mitokondriyal genler mevcuttu. Şekil Breton ve ark.'dan uyarlanmıştır, 2011 B A. atra'dan hemolimf üst sıvısının çoğaltılması FTA kağıdına depolanmıştır. PCR karışımını içeren PCR tüpüne doğrudan eklemek için 3 mm'lik bir delgeç kullanın.
Deniz suyundaki bol miktarda mikrobiyal içerik göz önüne alındığında, başlangıçta hemolenf içindeki mikrobiyal DNA dizilerinin karakterizasyonuna odaklandık. Bunu yapmak için iki farklı strateji kullandık. İlk strateji, BLAST ve diğer araçlarla karşılaştırılabilir bir doğrulukla mikrobiyal dizileri tanımlayabilen algoritma tabanlı bir dizi sınıflandırma programı olan Kraken2'yi kullandı [28]. 6719'dan fazla okumanın bakteri kökenli olduğu belirlenirken, 124 ve 64'ü sırasıyla arkelerden ve virüslerdendi (Şekil 4). En bol bakteriyel DNA parçaları Firmicutes (%46), Proteobacteria (%27) ve Bacteroidetes (%17) idi (Şekil 4a). Bu dağılım, deniz mavi midye mikrobiyomunun önceki çalışmalarıyla tutarlıdır [39, 40]. Gammaproteobacteria, birçok Vibrionales dahil olmak üzere Proteobacteria'nın ana sınıfıydı (%44) (Şekil 4b). ddPCR yöntemi, A. atra hemolimf'in ccfDNA'sında Vibrio DNA parçalarının varlığını doğruladı (Şekil 4c) [41]. ccfDNA'nın bakteriyel kökeni hakkında daha fazla bilgi edinmek için ek bir yaklaşım benimsendi (Şekil S2, Ek Bilgiler). Bu durumda, örtüşen okumalar eşleştirilmiş uçlu okumalar olarak bir araya getirildi ve BLASTN ve 1e−3 e değeri ve >%90 homolojiye sahip bir kesme noktası kullanılarak kendi (bivalvler) veya kendi olmayan kökenli olarak sınıflandırıldı. Bu durumda, örtüşen okumalar eşleştirilmiş uçlu okumalar olarak bir araya getirildi ve BLASTN ve 1e−3 e değeri ve >%90 homolojiye sahip bir kesme noktası kullanılarak kendi (bivalvler) veya kendi olmayan kökenli olarak sınıflandırıldı. В этом случае перекрывающиеся чтения были собраны как чтения с концами ve были классифицированы как собственные (двустворчатые молюски) veya чужие по происхождению с использованием BLASTN ve значения e 1e-3 ve отсечения с гомологией> 90%. Bu durumda, örtüşen okumalar eşleştirilmiş uçlu okumalar olarak toplandı ve BLASTN ve 1e-3 e değeri ve >%90 homolojiye sahip kesme kullanılarak doğal (bivalv) veya orijinal olmayan olarak sınıflandırıldı.在这种情况下,重叠的读数组装为配对末端读数,并使用BLASTN ve 1e-3 的e 值和>90%同源性的截止值分类为自身（双壳类）或非自身来源。在 这 种 情况 下 ， 重叠 读数 组装 为 配 末端 读数 ， 使用 使用 使用 blastn 和 1e-3 的 的值 和> 90% 同源性 的 分类 自身 （双 壳类） 非 自身。。。。。。。。. В этом случае перекрывающиеся чтения были собраны как чтения с парными концами ve классифицированы как собственные (двустворчатые моллюски) veya несобственные по происхождению с использованием значений e BLASTN ve 1e-3 ve sonraki oyunlar>% 90. Bu durumda, örtüşen okumalar eşleştirilmiş uçlu okumalar olarak toplandı ve e BLASTN ve 1e-3 değerleri ve %90'dan fazla bir homoloji eşiği kullanılarak kendi (bivalvler) veya orijinal olmayan olarak sınıflandırıldı.A. atra genomu henüz dizilenmediğinden, MEGAHIT Yeni Nesil Dizileme (NGS) birleştiricisinin de novo birleştirme stratejisini kullandık. Toplam 147.188 bitişik parça kökene bağlı (bivalv) olarak tanımlandı. Bu bitişik parçalar daha sonra BLASTN ve BLASTX kullanılarak 1e-10 e-değerleriyle patlatıldı. Bu strateji, A. atra ccfDNA'da bulunan 482 bivalv olmayan parçayı tanımlamamızı sağladı. Bu DNA parçalarının yarısından fazlası (%57), esas olarak sülfotrofik simbiyontlar da dahil olmak üzere solungaç simbiyontlarından ve solungaç simbiyontları Solemya velum'dan (Şekil 5) bakterilerden elde edildi.
Tip düzeyindeki göreli bolluk. B İki ana filumun (Firmicutes ve Proteobacteria) mikrobiyal çeşitliliği. ddPCR'nin temsili amplifikasyonu C Vibrio spp. A. Üç atra hemolimfindeki 16S rRNA geninin (mavi) parçaları.
Toplam 482 toplanan kontig analiz edildi. Metagenomik kontig açıklamalarının (prokaryotlar ve ökaryotlar) taksonomik dağılımının genel profili. B BLASTN ve BLASTX tarafından tanımlanan bakteriyel DNA parçalarının ayrıntılı dağılımı.
Kraken2 analizi ayrıca midye ccfDNA'sının Euryarchaeota (%65), Crenarchaeota (%24) ve Thaurmarcheota (%11) DNA parçaları da dahil olmak üzere arkeal DNA parçaları içerdiğini gösterdi (Şekil 6a). Daha önce Kaliforniya midyelerinin mikrobiyal topluluğunda bulunan Euryarchaeota ve Crenarchaeota'dan türetilen DNA parçalarının varlığı sürpriz olmamalıdır [42]. Euryarchaeota genellikle aşırı koşullarla ilişkilendirilmesine rağmen, artık hem Euryarchaeota hem de Crenarcheota'nın deniz kriyojenik ortamındaki en yaygın prokaryotlar arasında olduğu kabul edilmektedir [43, 44]. Kerguelen Platosu'ndaki dip sızıntılarından kaynaklanan yoğun metan sızıntılarına ilişkin son raporlar [45] ve Kerguelen Adaları kıyılarında gözlemlenen olası mikrobiyal metan üretimi [46] göz önüne alındığında, midyelerde metanojenik mikroorganizmaların varlığı şaşırtıcı değildir.
Dikkatimiz daha sonra DNA virüslerinden gelen okumalara kaydı. Bildiğimiz kadarıyla, bu midyelerin virüs içeriğine dair ilk hedef dışı çalışmadır. Beklendiği gibi, bakteriyofajların (Caudovirales) DNA parçalarını bulduk (Şekil 6b). Ancak, en yaygın viral DNA, nükleer sitoplazmik büyük DNA virüsü (NCLDV) olarak da bilinen ve herhangi bir virüsün en büyük genomuna sahip olan bir nükleositovirüs şubesinden gelir. Bu şubede, DNA dizilerinin çoğu, doğal konakçıları omurgalılar ve eklembacaklılar olan Mimimidoviridae (%58) ve Poxviridae (%21) ailelerine aittir, bu DNA dizilerinin küçük bir kısmı ise bilinen virolojik alglere aittir. Deniz ökaryotik alglerini enfekte eder. Diziler ayrıca, bilinen herhangi bir viral cinsin en büyük genom boyutuna sahip dev virüs olan Pandora virüsünden de elde edildi. İlginçtir ki, hemolimf ccfDNA dizilimi ile belirlendiği üzere, virüsle enfekte olduğu bilinen konakçıların aralığı nispeten genişti (Şekil S3, Ek Bilgi). Baculoviridae ve Iridoviridae gibi böcekleri enfekte eden virüslerin yanı sıra amip, alg ve omurgalıları enfekte eden virüsleri de içerir. Ayrıca Pithovirus sibericum genomuyla eşleşen diziler de bulduk. Pitovirüsler (aynı zamanda "zombi virüsleri" olarak da bilinir) ilk olarak Sibirya'daki 30.000 yıllık permafrosttan izole edildi [47]. Dolayısıyla, sonuçlarımız bu virüslerin tüm modern türlerinin neslinin tükenmediğini [48] ve bu virüslerin uzak subarktik deniz ekosistemlerinde mevcut olabileceğini gösteren önceki raporlarla tutarlıdır.
Son olarak, diğer çok hücreli hayvanlardan DNA parçaları bulup bulamayacağımızı görmek için test yaptık. BLASTN ve BLASTX tarafından nt, nr ve RefSeq kütüphaneleri (genomik ve protein) ile toplam 482 yabancı bitişik tanımlandı. Sonuçlarımız, çok hücreli hayvanların ccfDNA'sının yabancı parçaları arasında kemiksi kemiklerin DNA'sının baskın olduğunu göstermektedir (Şekil 5). Böceklerden ve diğer türlerden DNA parçaları da bulundu. DNA parçalarının nispeten büyük bir kısmı, muhtemelen çok sayıda deniz türünün karasal türlere kıyasla genomik veritabanlarında yetersiz temsil edilmesi nedeniyle tanımlanamamıştır [49].
Mevcut makalede, hemolimf ccfDNA atış dizilemesinin deniz kıyı ekosistemlerinin bileşimine ilişkin içgörü sağlayabileceğini savunarak LB konseptini midyelere uyguluyoruz. Özellikle, 1) midye hemolimfinin nispeten yüksek konsantrasyonlarda (mikrogram seviyelerinde) nispeten büyük (~1-5 kb) dolaşan DNA parçaları içerdiğini; 2) bu DNA parçalarının hem bağımsız hem de bağımsız olmadığını; 3) Bu DNA parçalarının yabancı kaynakları arasında bakteri, arke ve viral DNA'nın yanı sıra diğer çok hücreli hayvanların DNA'sını bulduk; 4) Bu yabancı ccfDNA parçalarının hemolimfte birikmesi hızla gerçekleşir ve midyelerin iç filtreleme aktivitesine katkıda bulunur. Sonuç olarak, çalışmamız, şimdiye kadar esas olarak biyotıp alanında uygulanan LB konseptinin, bekçi türler ile çevreleri arasındaki etkileşimi daha iyi anlamak için kullanılabilecek zengin ancak keşfedilmemiş bir bilgi kaynağını kodladığını göstermektedir.
Primatlara ek olarak, fareler, köpekler, kediler ve atlar dahil olmak üzere memelilerde ccfDNA izolasyonu bildirilmiştir [50, 51, 52]. Ancak, bildiğimiz kadarıyla, çalışmamız açık dolaşım sistemiyle deniz türlerinde ccfDNA'nın tespitini ve dizilimini bildiren ilk çalışmadır. Midyelerin bu anatomik özelliği ve filtreleme yeteneği, en azından kısmen, dolaşımdaki DNA parçalarının diğer türlere kıyasla farklı boyut özelliklerini açıklayabilir. İnsanlarda, kanda dolaşan DNA parçalarının çoğu, 150 ila 200 bp arasında değişen boyutlarda küçük parçalardır ve maksimum 167 bp'lik bir tepe noktasına sahiptir [34, 53]. DNA parçalarının küçük ancak önemli bir kısmı 300 ila 500 bp arasındadır ve yaklaşık %5'i 900 bp'den daha uzundur. [54]. Bu boyut dağılımının nedeni, plazmadaki ccfDNA'nın ana kaynağının, sağlıklı bireylerde dolaşan hematopoietik hücrelerin nekrozu veya kanser hastalarında tümör hücrelerinin apoptozu nedeniyle hücre ölümü sonucu ortaya çıkmasıdır (dolaşımdaki tümör DNA'sı olarak bilinir). , ctDNA). Midyelerde bulduğumuz hemolenf ccfDNA'nın boyut dağılımı 1000 ila 5000 bp arasında değişiyordu ve bu da midye ccfDNA'sının farklı bir kökene sahip olduğunu gösteriyordu. Bu mantıklı bir hipotezdir, çünkü midyeler yarı açık bir damar sistemine sahiptir ve yüksek konsantrasyonlarda mikrobiyal genomik DNA içeren deniz su ortamlarında yaşarlar. Aslında, ekzojen DNA kullanarak yaptığımız laboratuvar deneyleri, midyelerin deniz suyunda DNA parçaları biriktirdiğini, en azından birkaç saat sonra hücresel alımdan sonra parçalandığını ve/veya çeşitli organizasyonlarda serbest bırakıldığını ve/veya depolandığını göstermiştir. Hücrelerin (hem prokaryotik hem de ökaryotik) nadirliği göz önüne alındığında, intravalvular bölmelerin kullanımı, hem kendi kaynaklarından hem de yabancı kaynaklardan gelen ccfDNA miktarını azaltacaktır. Çift kabukluların doğuştan gelen bağışıklığının önemini ve dolaşımdaki çok sayıda fagositi göz önünde bulundurarak, yabancı ccfDNA'nın bile mikroorganizmaların ve/veya hücresel kalıntıların yutulması üzerine yabancı DNA biriktiren dolaşımdaki fagositik hücrelerde zenginleştiği hipotezini ileri sürdük. Sonuçlarımız bir araya getirildiğinde, çift kabuklu hemolimf ccfDNA'sının benzersiz bir moleküler bilgi deposu olduğunu ve bir bekçi türü olarak statülerini güçlendirdiğini göstermektedir.
Verilerimiz, bakteri kaynaklı hemolenf ccfDNA parçalarının dizilenmesi ve analizinin, konak bakteri florası ve çevredeki deniz ekosisteminde bulunan bakteriler hakkında önemli bilgiler sağlayabileceğini göstermektedir. Atış dizileme teknikleri, kısmen bir referans kütüphanesi önyargısı nedeniyle, geleneksel 16S rRNA tanımlama yöntemleri kullanılmış olsaydı gözden kaçacak olan komensal bakteri A. atra solungaç dizilerini ortaya çıkarmıştır. Aslında, Kerguelen'deki aynı midye katmanında M. platensis'ten toplanan LB verilerini kullanmamız, solungaçla ilişkili bakteriyel simbiyontların bileşiminin her iki midye türü için de aynı olduğunu göstermiştir (Şekil S4, Ek Bilgiler). Genetik olarak farklı iki midyenin bu benzerliği, Kerguelen'in soğuk, kükürtlü ve volkanik yataklarındaki bakteri topluluklarının bileşimini yansıtabilir [55, 56, 57, 58]. Port-au-France kıyısı gibi biyotürbasyonlu kıyı bölgelerinden midye hasadı yapıldığında daha yüksek seviyelerde kükürt azaltıcı mikroorganizmalar iyi tanımlanmıştır [59]. Başka bir olasılık da komensal midye florasının yatay iletimden etkilenebilmesidir [60, 61]. Deniz ortamı, deniz tabanı yüzeyi ve midyelerdeki simbiyotik bakteri bileşimi arasındaki ilişkiyi belirlemek için daha fazla araştırmaya ihtiyaç vardır. Bu çalışmalar şu anda devam etmektedir.
Hemolenf ccfDNA'nın uzunluğu ve konsantrasyonu, saflaştırılmasının kolaylığı ve hızlı shotgun dizilemesine izin veren yüksek kalitesi, deniz kıyı ekosistemlerindeki biyoçeşitliliği değerlendirmek için midye ccfDNA'sının kullanılmasının birçok avantajından birkaçıdır. Bu yaklaşım, belirli bir ekosistemdeki viral toplulukları (viromlar) karakterize etmek için özellikle etkilidir [62, 63]. Bakteriler, arkeler ve ökaryotların aksine, viral genomlar 16S dizileri gibi filogenetik olarak korunan genler içermez. Sonuçlarımız, midye gibi gösterge türlerinden alınan sıvı biyopsilerin, tipik olarak kıyı deniz ekosistemlerinde yaşayan konakçıları enfekte ettiği bilinen nispeten büyük sayıda ccfDNA virüs parçasını tanımlamak için kullanılabileceğini göstermektedir. Buna protozoaları, eklembacaklıları, böcekleri, bitkileri ve bakteriyel virüsleri (örneğin, bakteriyofajlar) enfekte ettiği bilinen virüsler dahildir. Kerguelen'deki aynı midye katmanında toplanan mavi midyelerin (M. platensis) hemolimf ccfDNA viromunu incelediğimizde benzer bir dağılım bulduk (Tablo S2, Ek Bilgi). ccfDNA'nın av tüfeği dizilimi, insanların veya diğer türlerin viromunun incelenmesinde ivme kazanan yeni bir yaklaşımdır [21, 37, 64]. Bu yaklaşım, tüm çift sarmallı DNA virüsleri arasında tek bir genin korunmaması ve Baltimore'daki en çeşitli ve geniş virüs sınıfını temsil etmesi nedeniyle çift sarmallı DNA virüslerinin incelenmesinde özellikle yararlıdır [65]. Bu virüslerin çoğu sınıflandırılmamış olsa da ve viral dünyanın tamamen bilinmeyen bir bölümünden virüsler içerebilse de [66], A. atra ve M. platensis midyelerinin viromlarının ve konak aralıklarının iki tür arasında olduğunu bulduk. benzer şekilde (bkz. şekil S3, ek bilgi). Bu benzerlik şaşırtıcı değildir, çünkü ortamda bulunan DNA'nın alımında seçiciliğin eksikliğini yansıtabilir. RNA viromunu karakterize etmek için şu anda saflaştırılmış RNA kullanan gelecekteki çalışmalara ihtiyaç vardır.
Çalışmamızda, yerel ccfDNA'nın birleştirilmesinden önce ve sonra birleştirilmiş okumaların ve bitişiklerin iki aşamalı silinmesini kullanan Kowarski ve meslektaşlarının [37] çalışmasından uyarlanan çok titiz bir boru hattı kullandık ve bunun sonucunda yüksek oranda haritalanmamış okumalar elde ettik. Bu nedenle, bu haritalanmamış okumaların bazılarının hala kendi kökenlerine sahip olma ihtimalini göz ardı edemeyiz, bunun başlıca nedeni bu midye türü için bir referans genomumuz olmamasıdır. Ayrıca, kendi ve kendi olmayan okumalar arasındaki kimeralar ve Illumina MiSeq PE75 tarafından üretilen okuma uzunlukları konusunda endişeli olduğumuz için bu boru hattını kullandık. Haritası çıkarılmamış okumaların çoğunun bir başka nedeni de, özellikle Kerguelen gibi uzak bölgelerdeki deniz mikroplarının çoğunun açıklanmamış olmasıdır. İnsan ccfDNA'sına benzer ccfDNA parça uzunlukları varsayarak Illumina MiSeq PE75'i kullandık. Gelecekteki çalışmalar için, hemolimf ccfDNA'sının insanlardan ve/veya memelilerden daha uzun okumalara sahip olduğunu gösteren sonuçlarımız göz önüne alındığında, daha uzun ccfDNA parçaları için daha uygun bir dizileme platformu kullanmanızı öneririz. Bu uygulama, daha derin analiz için daha fazla endikasyon belirlemeyi çok daha kolay hale getirecektir. Şu anda mevcut olmayan tam A. atra nükleer genom dizisinin elde edilmesi, ccfDNA'nın kendi ve kendi olmayan kaynaklardan ayırt edilmesini de büyük ölçüde kolaylaştıracaktır. Araştırmamızın sıvı biyopsi konseptini midyelere uygulama olasılığına odaklandığı göz önüne alındığında, bu konsept gelecekteki araştırmalarda kullanıldıkça, midyelerin mikrobiyal çeşitliliğini incelemek için bu yöntemin potansiyelini artıracak yeni araçlar ve boru hatları geliştirileceğini umuyoruz. deniz ekosistemi.
İnvaziv olmayan bir klinik biyobelirteç olarak, ccfDNA'nın yüksek insan plazma seviyeleri çeşitli hastalıklar, doku hasarı ve stres koşullarıyla ilişkilidir [67,68,69]. Bu artış, doku hasarından sonra kendi kökenine ait DNA parçalarının salınmasıyla ilişkilidir. Bu sorunu, midyelerin kısa bir süre 30 °C'lik bir sıcaklığa maruz bırakıldığı akut ısı stresi kullanarak ele aldık. Bu analizi, üç bağımsız deneyde üç farklı midye türü üzerinde gerçekleştirdik. Ancak, akut ısı stresinden sonra ccfDNA seviyelerinde herhangi bir değişiklik bulamadık (bkz. Şekil S5, ek bilgi). Bu keşif, midyelerin yarı açık bir dolaşım sistemine sahip olması ve yüksek filtreleme aktiviteleri nedeniyle büyük miktarda yabancı DNA biriktirmesi gerçeğini en azından kısmen açıklayabilir. Öte yandan, birçok omurgasız gibi midyeler de stres kaynaklı doku hasarına karşı daha dirençli olabilir ve bu nedenle hemolenflerinde ccfDNA'nın salınmasını sınırlayabilir [70, 71].
Bugüne kadar, su ekosistemlerindeki biyoçeşitliliğin DNA analizi esas olarak çevresel DNA (eDNA) metabarkodlamasına odaklanmıştır. Ancak, primerler kullanıldığında bu yöntem genellikle biyoçeşitlilik analizinde sınırlıdır. Shotgun dizilemenin kullanımı, PCR'nin sınırlamalarını ve primer setlerinin önyargılı seçimini aşar. Bu nedenle, bir anlamda, yöntemimiz, parçalanmış DNA'yı doğrudan dizileyebilen ve hemen hemen tüm organizmaları analiz edebilen yakın zamanda kullanılan yüksek verimli eDNA Shotgun dizileme yöntemine daha yakındır [72, 73]. Ancak, LB'yi standart eDNA yöntemlerinden ayıran bir dizi temel sorun vardır. Elbette, eDNA ve LB arasındaki temel fark, doğal filtre konaklarının kullanılmasıdır. Süngerler ve çift kabuklular (Dresseina spp.) gibi deniz türlerinin eDNA'yı incelemek için doğal bir filtre olarak kullanıldığı bildirilmiştir [74, 75]. Ancak, Dreissena'nın çalışmasında DNA'nın çıkarıldığı doku biyopsileri kullanılmıştır. LB'den ccfDNA'nın analizi, doku biyopsisi, eDNA veya doku biyopsisiyle ilişkili özel ve bazen pahalı ekipman ve lojistik gerektirmez. Aslında, yakın zamanda LB'den ccfDNA'nın soğuk zincir korunmaksızın FTA desteğiyle saklanabileceğini ve analiz edilebileceğini bildirdik; bu, uzak bölgelerdeki araştırmalar için büyük bir zorluktur [76]. Sıvı biyopsilerden ccfDNA'nın çıkarılması da basittir ve shotgun dizileme ve PCR analizi için yüksek kaliteli DNA sağlar. Bu, eDNA analiziyle ilişkili bazı teknik sınırlamalar göz önüne alındığında büyük bir avantajdır [77]. Örnekleme yönteminin basitliği ve düşük maliyeti de özellikle uzun vadeli izleme programları için uygundur. Yüksek filtreleme yeteneklerine ek olarak, çift kabuklu yumuşakçaların bir diğer iyi bilinen özelliği, virüslerin emilimini destekleyen mukuslarının kimyasal mukopolisakkarit bileşimidir [78, 79]. Bu, çift kabuklu yumuşakçaları belirli bir su ekosistemindeki biyoçeşitliliği ve iklim değişikliğinin etkisini karakterize etmek için ideal bir doğal filtre haline getirir. Konakçıdan türetilen DNA parçalarının varlığı, eDNA ile karşılaştırıldığında yöntemin bir sınırlaması olarak görülebilse de, eDNA ile karşılaştırıldığında böyle doğal bir ccfDNA'ya sahip olmanın maliyeti, sağlık çalışmaları için mevcut olan muazzam miktardaki bilgi nedeniyle aynı zamanda anlaşılabilirdir. ofset konak. Bu, konakçının genomuna entegre edilmiş viral dizilerin varlığını içerir. Bu, çift kabuklularda yatay olarak iletilen lösemik retrovirüslerin varlığı göz önüne alındığında, özellikle midyeler için önemlidir [80, 81]. LB'nin eDNA'ya göre bir diğer avantajı, mikroorganizmaları (ve genomlarını) saran hemolenf içindeki dolaşan kan hücrelerinin fagositik aktivitesini kullanmasıdır. Fagositoz, çift kabuklularda kan hücrelerinin ana işlevidir [82]. Son olarak, yöntem midyelerin yüksek filtreleme kapasitesinden (ortalama 1,5 l/saat deniz suyu) ve iki günlük dolaşımdan yararlanır; bu da farklı deniz suyu katmanlarının karışmasını artırarak heterolog eDNA'nın yakalanmasına olanak tanır. [83, 84]. Bu nedenle, midye ccfDNA analizi, midyelerin besinsel, ekonomik ve çevresel etkileri göz önüne alındığında ilginç bir yoldur. İnsanlardan toplanan LB analizine benzer şekilde, bu yöntem ayrıca dışsal maddelere yanıt olarak konak DNA'sındaki genetik ve epigenetik değişiklikleri ölçme olasılığını da açar. Örneğin, üçüncü nesil dizileme teknolojilerinin nanopore dizilemesi kullanılarak doğal ccfDNA'da genom çapında metilasyon analizi gerçekleştirmesi öngörülebilir. Bu süreç, midye ccfDNA parçalarının uzunluğunun, kimyasal dönüşümlere gerek kalmadan tek bir dizileme çalışmasından genom çapında DNA metilasyon analizine izin veren uzun okuma dizileme platformlarıyla ideal olarak uyumlu olması gerçeğiyle kolaylaştırılmalıdır.85,86] Bu ilginç bir olasılıktır, çünkü DNA metilasyon modellerinin çevresel strese bir yanıtı yansıttığı ve birçok nesil boyunca devam ettiği gösterilmiştir. Bu nedenle, iklim değişikliğine veya kirleticilere maruz kaldıktan sonra tepkiyi yöneten temel mekanizmalara ilişkin değerli içgörüler sağlayabilir [87]. Ancak, LB'nin kullanımı sınırlamasız değildir. Söylemeye gerek yok, bu ekosistemde gösterge türlerinin varlığını gerektirir. Yukarıda belirtildiği gibi, belirli bir ekosistemin biyoçeşitliliğini değerlendirmek için LB'yi kullanmak, kaynaktan gelen DNA parçalarının varlığını hesaba katan titiz bir biyoenformatik boru hattı da gerektirir. Bir diğer büyük sorun, deniz türleri için referans genomlarının mevcudiyetidir. Deniz Memeli Genomları Projesi ve yakın zamanda kurulan Fish10k projesi [88] gibi girişimlerin gelecekte bu tür analizleri kolaylaştıracağı umulmaktadır. LB konseptinin deniz filtre beslemeli organizmalara uygulanması, dizileme teknolojisindeki en son gelişmelerle de uyumludur ve bu da onu çevresel strese yanıt olarak deniz habitatlarının sağlığı hakkında önemli bilgiler sağlamak için çok ohm'luk biyobelirteçlerin geliştirilmesi için çok uygun hale getirir.
Genom dizileme verileri NCBI Dizi Okuma Arşivi'ne https://www.ncbi.nlm.nih.gov/sra/SRR8924808 adresindeki Biyoprojeler SRR8924808 altında depolanmıştır.
Brierley AS, Kingsford MJ İklim değişikliğinin deniz yaşamı ve ekosistemler üzerindeki etkisi. Cole Biyolojisi. 2009; 19: P602–P614.
Gissi E, Manea E, Mazaris AD, Fraschetti S, Almpanidou V, Bevilacqua S, ve diğerleri. İklim değişikliğinin ve diğer yerel stres faktörlerinin deniz ortamı üzerindeki birleşik etkilerini göz önünde bulundurun. genel bilimsel çevre. 2021;755:142564.
Carella F, Antuofermo E, Farina S, Salati F, Mandas D, Prado P, ve diğerleri. ). Mart ayının ilk bilimi. 2020;7:48.
Seront L, Nicastro CR, Zardi GI, Goberville E. Tekrarlayan ısı stresi koşulları altında ısı toleransının azalması, mavi midyelerin yaz aylarındaki yüksek ölüm oranını açıklar. Bilimsel rapor 2019; 9:17498.
Fey SB, Siepielski AM, Nussle S, Cervantes-Yoshida K, Hwan JL, Huber ER, ve diğerleri. Hayvan ölümlerinin sıklığı, nedenleri ve kapsamındaki son değişiklikler. Proc Natl Acad Sci USA. 2015;112:1083-8.
Scarpa F, Sanna D, Azzena I, Mughetti D, Cerruti F, Hosseini S, ve diğerleri. Türe özgü olmayan çok sayıda patojen, Pinna nobilis'in kitlesel ölümüne neden olmuş olabilir. Hayat. 2020;10:238.
Bradley M, Coutts SJ, Jenkins E, O'Hara TM. İklim değişikliğinin Arktik zoonotik hastalıkları üzerindeki potansiyel etkisi. Int J Circumpolar health. 2005; 64:468–77.
Beyer J., Greene NW, Brooks S., Allan IJ, Ruus A., Gomez T. ve diğerleri. Kıyı kirliliğinin izlenmesinde sinyal organizmaları olarak mavi midyeler (Mytilus edulis spp.): bir inceleme. Mar Environ Res 2017; 130:338-65.
Siravegna G, Marsoni S, Siena S, Bardelli A. Kanser tedavisinde sıvı biyopsinin entegrasyonu. Nat Rev Clean Oncol. 2017; 14:531–48.
Wan JCM, Massie C, Garcia-Corbacho J, Mouliere F, Brenton JD, Caldas C, ve diğerleri. Sıvı biyopsi olgunlaşması: Tümör DNA'sının dolaşımına izin verir. Nat Rev Cancer. 2017;17:223–38.
Mandel P., Metais P. İnsan plazmasındaki nükleik asitler. Soc Biol iştiraklerinin toplantı tutanakları. 1948; 142:241-3.
Bronkhorst AJ, Ungerer W, Holdenrieder S. Kanser tedavisi için moleküler belirteç olarak hücresiz DNA'nın yeni bir rolü. Biyomolar analizin kantifikasyonu. 2019;17:100087.
Ignatiadis M., Sledge GW, Jeffrey SS Sıvı biyopsi kliniğe giriyor – uygulama sorunları ve gelecekteki zorluklar. Nat Rev Clin Oncol. 2021; 18:297–312.
Lo YM, Corbetta N., Chamberlain PF, Rai W., Sargent IL, Redman CW ve diğerleri. Fetal DNA, maternal plazma ve serumda mevcuttur. Lancet. 1997; 350:485-7.
Mufarray MN, Wong RJ, Shaw GM, Stevenson DK, Quake SR Gebelik sırasında kadınların kanında dolaşan ekstraselüler RNA kullanılarak gebelik süreci ve komplikasyonlarının incelenmesi. Dopediatrics. 2020;8:605219.
Ollerich M, Sherwood K, Keown P, Schütz E, Beck J, Stegbauer J, ve diğerleri. Sıvı biyopsi: donör hücresiz DNA, böbrek greftindeki allojenik lezyonları tespit etmek için kullanılır. Nat Rev Nephrol. 2021; 17:591–603.
Juan FC, Lo YM Doğum öncesi tanıdaki yenilikler: maternal plazma genom dizilimi. Anna MD. 2016;67:419-32.
Gu W, Deng X, Lee M, Sucu YD, Arevalo S, Stryke D, ve diğerleri. Enfekte vücut sıvılarının yeni nesil metagenomik dizilenmesiyle hızlı patojen tespiti. Nat Medicine. 2021;27:115-24.