Nature.com'u ziyaret ettiğiniz için teşekkür ederiz.Kullanmakta olduğunuz tarayıcı sürümü sınırlı CSS desteğine sahiptir.En iyi deneyim için güncellenmiş bir tarayıcı kullanmanızı (veya Internet Explorer'da Uyumluluk Modunu devre dışı bırakmanızı) öneririz.Bu arada, sürekli destek sağlamak için siteyi stiller ve JavaScript olmadan yapacağız.
Kuşların doğurganlığı, sperm depolama kanallarında (SST) uzun bir süre boyunca yeterince canlı spermi depolama yeteneklerine bağlıdır.Spermatozoanın SST'ye girdiği, burada kaldığı ve SST'den ayrıldığı tam mekanizma tartışmalıdır.Sharkasi tavuklarının spermi, birçok hücre içeren hareketli lifli demetler oluşturarak aglütinasyona yüksek bir eğilim gösterdi.Opak bir fallop tüpünde spermatozoanın hareketliliğini ve davranışını gözlemlemenin zorluğu nedeniyle, spermatozoa aglütinasyonunu ve hareketliliğini incelemek için spermatozoanınkine benzer bir mikrokanal enine kesitine sahip bir mikroakışkan cihaz kullandık.Bu çalışma, sperm demetlerinin nasıl oluştuğunu, nasıl hareket ettiğini ve SST'de sperm yerleşimini uzatmadaki olası rollerini tartışmaktadır.Hidrostatik basınçla (akış hızı = 33 µm/s) mikroakışkan bir kanal içinde sıvı akışı oluşturulduğunda sperm hızını ve reolojik davranışı araştırdık.Spermatozoa akıntıya karşı yüzme eğilimindedir (pozitif reoloji) ve sperm demetinin hızı, tek spermatozoaya kıyasla önemli ölçüde azalır.Sperm demetlerinin bir spiral şeklinde hareket ettiği ve daha fazla tek sperm toplandıkça uzunluk ve kalınlıklarının arttığı gözlemlenmiştir. > 33 µm/s sıvı akış hızı ile süpürülmekten kaçınmak için mikroakışkan kanalların yan duvarlarına yaklaşan ve yapışan sperm demetleri gözlendi. > 33 µm/s sıvı akış hızı ile süpürülmekten kaçınmak için mikroakışkan kanalların yan duvarlarına yaklaşan ve yapışan sperm demetleri gözlendi. Было замечено, что пучки сперматозоидов приближаются ve прилипают к боковым стенкам микрофлюдных каналов, 33 mkm / с. Sperm demetlerinin > 33 µm/s sıvı akış hızlarında süpürülmekten kaçınmak için mikroakışkan kanalların yan duvarlarına yaklaştığı ve bunlara yapıştığı gözlemlenmiştir.33 µm/s 扫过。33 µm/sn. Было замечено, что пучки сперматозоидов приближаются ve прилипают к боковым стенкам микрожидкостного канала, 33 mkm/sn. Sperm demetlerinin, >33 µm/s'lik sıvı akışı tarafından süpürülmekten kaçınmak için mikroakışkan kanalın yan duvarlarına yaklaştığı ve bunlara yapıştığı gözlemlenmiştir.Tarama ve transmisyon elektron mikroskobu, sperm demetlerinin bol miktarda yoğun malzeme ile desteklendiğini ortaya çıkardı.Elde edilen veriler, Sharkazi tavuk spermatozoasının benzersiz hareketliliğinin yanı sıra spermatozoanın aglütine olma ve mobil demetler oluşturma yeteneğini göstermektedir; bu da spermatozoanın SMT'de uzun süreli depolanmasının daha iyi anlaşılmasına katkıda bulunur.
İnsanlarda ve çoğu hayvanda döllenmeyi başarmak için, sperm ve yumurtaların döllenme yerine doğru zamanda ulaşması gerekir.Bu nedenle, çiftleşme yumurtlamadan önce veya sırasında gerçekleşmelidir.Öte yandan, köpekler gibi bazı memeliler ve böcekler, balıklar, sürüngenler ve kuşlar gibi memeli olmayan türler, yumurtaları döllenmeye hazır olana kadar (asenkron döllenme 1) üreme organlarında uzun bir süre sperm depolarlar.Kuşlar, yumurtaları dölleyebilen spermatozoanın canlılığını 2-10 hafta boyunca koruyabilirler2.
Bu, eş zamanlı çiftleşme ve yumurtlama olmadan birkaç hafta boyunca tek bir tohumlamadan sonra yüksek bir döllenme olasılığı sağladığı için kuşları diğer hayvanlardan ayıran benzersiz bir özelliktir.Sperm depolama tübülü (SST) olarak adlandırılan ana sperm depolama organı, uterovajinal bileşkedeki iç mukozal kıvrımlarda bulunur.Bugüne kadar, spermin sperm bankasına girdiği, kaldığı ve çıktığı mekanizmalar tam olarak anlaşılamamıştır.Daha önceki çalışmalara dayanarak, birçok hipotez öne sürüldü, ancak hiçbiri doğrulanmadı.
Forman4, spermatozoanın, SST epitel hücreleri (reoloji) üzerinde bulunan protein kanalları yoluyla sıvı akış yönüne karşı sürekli salınım hareketi yoluyla SST boşluğunda ikametini koruduğunu varsaymıştır.ATP, spermi SST lümeninde tutmak için gereken sürekli flagellar aktivite nedeniyle tükenir ve hareketlilik, sperm bankasından sıvı akışıyla taşınana ve spermi döllemek için yükselen fallop tüpünden aşağı yeni bir yolculuğa başlayana kadar sonunda azalır.Yumurta (Forman4).Bu sperm depolama modeli, SST epitel hücrelerinde bulunan akuaporinler 2, 3 ve 9'un immünositokimyası ile tespiti ile desteklenir.Bugüne kadar, tavuk sperması reolojisi ve bunun SST saklama, vajinal sperm seçimi ve sperm rekabetindeki rolü üzerine çalışmalar eksiktir.Tavuklarda sperm, doğal çiftleşmeden sonra vajinaya girer, ancak spermatozoanın %80'den fazlası çiftleşmeden kısa bir süre sonra vajinadan dışarı atılır.Bu, vajinanın kuşlarda sperm seçimi için birincil bölge olduğunu düşündürür.Ayrıca vajinada döllenen spermlerin %1'inden daha azının SST'lerde son bulduğu bildirilmiştir2.Vajinada civcivlerin suni tohumlanmasında, tohumlamadan 24 saat sonra SST'ye ulaşan spermatozoa sayısı artma eğilimindedir.Şimdiye kadar, bu süreçte sperm seçim mekanizması belirsizdir ve sperm hareketliliği, SST sperm alımında önemli bir rol oynayabilir.Fallop tüplerinin kalın ve opak duvarları nedeniyle, kuşların fallop tüplerindeki sperm hareketliliğini doğrudan izlemek zordur.Bu nedenle, spermatozoanın fertilizasyondan sonra SST'ye nasıl geçtiğine dair temel bilgimiz yok.
Reoloji son zamanlarda memeli üreme organlarında sperm taşınmasını kontrol eden önemli bir faktör olarak kabul edilmiştir.Hareketli spermlerin ters yönde hareket etme kabiliyetine dayanarak, Zaferani ve ark.8 hareketli spermleri kafeslenmiş semen numunelerinden pasif olarak izole etmek için bir korra mikroakışkan sistemi kullanmışlardır.Bu tip semen ayıklama, tıbbi kısırlık tedavisi ve klinik araştırmalar için gereklidir ve zaman ve emek yoğun olan ve sperm morfolojisi ile yapısal bütünlüğünü tehlikeye atabilen geleneksel yöntemlere göre tercih edilir.Ancak bugüne kadar tavukların genital organlarından salgılanan salgıların sperm motilitesine etkisi ile ilgili herhangi bir çalışma yapılmamıştır.
SST'de depolanan spermi koruyan mekanizmadan bağımsız olarak, pek çok araştırmacı yerleşik spermatozoaların tavuk 9, 10, bıldırcın 2 ve hindilerin 11 SST'sinde aglütine olmuş sperm demetleri oluşturmak üzere kafa kafaya aglütine olduğunu gözlemlemiştir.Yazarlar, bu aglütinasyon ile spermatozoanın SST'de uzun süreli depolanması arasında bir bağlantı olduğunu öne sürüyorlar.
Tingari ve Lake12, tavuğun sperm alan bezindeki spermatozoa arasında güçlü bir ilişki olduğunu bildirmişler ve kuş spermatozoasının memeli spermatozoasıyla aynı şekilde aglütine olup olmadığını sorgulamışlardır.Vas deferens'teki spermler arasındaki derin bağlantıların, küçük bir alanda çok sayıda spermin varlığından kaynaklanan stresten kaynaklanabileceğine inanıyorlar.
Taze asılı cam lamlar üzerinde spermatozoanın davranışı değerlendirilirken, özellikle semen damlacıklarının kenarlarında geçici aglütinasyon belirtileri görülebilir.Bununla birlikte, aglütinasyon, bu fenomenin geçici doğasını açıklayan sürekli hareketle ilişkili dönme hareketi tarafından sıklıkla rahatsız edildi.Araştırmacılar ayrıca semene seyreltici eklendiğinde uzun "iplik benzeri" hücre kümelerinin ortaya çıktığını da fark ettiler.
Bir spermi taklit etmeye yönelik erken girişimler, asılı bir damladan ince bir telin çıkarılmasıyla yapıldı, bu da semen damlasından çıkıntı yapan uzun sperm benzeri bir vezikülle sonuçlandı.Spermatozoa hemen vezikül içinde paralel bir şekilde dizildi, ancak 3D sınırlaması nedeniyle tüm birim hızla kayboldu.Bu nedenle, spermatozoa aglütinasyonunu incelemek için, spermatozoanın doğrudan izole edilmiş sperm depolama tübüllerindeki motilitesini ve davranışını gözlemlemek gerekir ki bu elde edilmesi zordur.Bu nedenle, sperm hareketliliği ve aglütinasyon davranışı çalışmalarını desteklemek için spermatozoayı taklit eden bir alet geliştirmek gereklidir.Brillard ve arkadaşları13 yetişkin civcivlerde sperm depolama tübüllerinin ortalama uzunluğunun 400-600 µm olduğunu ancak bazı SST'lerin 2000 µm kadar uzun olabileceğini bildirmiştir.Mero ve Ogasawara14 seminifer bezleri, her ikisi de aynı uzunlukta (~500 µm) ve boyun genişliği (~38 µm) olan, ancak tübüllerin ortalama lümen çapı 56.6 ve 56.6 µm olan büyümüş ve genişlememiş sperm depolama tübüllerine ayırdı.., sırasıyla 11,2 μm.Mevcut çalışmada, kesiti güçlendirilmiş SST'ninkine biraz yakın olan, 200 µm × 20 µm (G × Y) kanal boyutuna sahip bir mikroakışkan cihaz kullandık.Ek olarak, Foreman'ın SST epitel hücreleri tarafından üretilen sıvının spermi ters akım (reolojik) yönde lümende tuttuğu hipoteziyle uyumlu olarak akan sıvıdaki sperm hareketliliğini ve aglütinasyon davranışını inceledik.
Bu çalışmanın amacı, fallop tüpünde spermatozoa motilitesini gözlemleme problemlerinin üstesinden gelmek ve dinamik bir ortamda spermatozoanın reolojisini ve davranışını incelemenin zorluklarından kaçınmaktı.Bir tavuğun cinsel organlarında sperm hareketliliğini simüle etmek için hidrostatik basınç oluşturan bir mikroakışkan cihaz kullanıldı.
Mikrokanal cihazına bir damla seyreltilmiş sperm numunesi (1:40) yüklendiğinde, iki tür sperm hareketliliği tanımlanabilir (izole sperm ve bağlı sperm).Ek olarak, spermatozoa akıntıya karşı yüzme eğilimindeydi (pozitif reoloji; video 1, 2). Sperm demetlerinin tek başına spermden daha düşük hıza sahip olmasına rağmen (p < 0.001), pozitif reotaksis gösteren sperm yüzdesini artırdılar (p < 0.001; Tablo 2). Sperm demetlerinin tek başına spermden daha düşük hıza sahip olmasına rağmen (p < 0.001), pozitif reotaksis gösteren sperm yüzdesini artırdılar (p < 0.001; Tablo 2). Хотя пучки сперматозоидов имели более низкую скорость, чем у одиночных сперматозоидов (p < 0,001), они увеличивали процент сперматозоидов, демонстрирующих положительный реотаксис (p < 0,001; таблица 2). Spermatozoa demetleri, tek spermatozoanınkinden daha düşük bir hıza sahip olmasına rağmen (p < 0.001), pozitif reotaksis gösteren sperm yüzdesini artırdılar (p < 0.001; Tablo 2).Daha Fazla Bilgi （p < 0.001; 2）.尽管 精子束 的 速度 低于 孤独 的 速度 (p <0,001) ， 但 增加 了 显示 阳性 流变性 精子 百分比 （p <0.001 ； 2。。。。。。）））））） Хотя скорость пучков сперматозоидов была ниже, чем у одиночных сперматозоидов (p < 0,001), они увеличивали процентов сперматозоидов с положительной реологией (p < 0,001; таблица 2). Sperm demetlerinin hızı, tek spermatozoadan daha düşük olmasına rağmen (p < 0.001), pozitif reolojiye sahip spermatozoa yüzdesini artırdılar (p < 0.001; Tablo 2).Tek spermatozoa ve kümeler için pozitif reolojinin sırasıyla yaklaşık %53 ve %85 olduğu tahmin edilmektedir.
Sharkasi tavuklarının spermatozoalarının boşalmadan hemen sonra düzinelerce bireyden oluşan doğrusal demetler oluşturduğu gözlemlenmiştir.Bu tutamların uzunluğu ve kalınlığı zamanla artar ve dağılmadan önce in vitro olarak birkaç saat kalabilir (video 3).Bu ipliksi demetler, epididimin sonunda oluşan echidna spermatozoa şeklindedir.Sharkashi tavuğu semeninin, toplandıktan sonra bir dakikadan kısa bir süre içinde aglütine olma ve ağsı bir demet oluşturma eğiliminin yüksek olduğu bulunmuştur.Bu kirişler dinamiktir ve yakındaki duvarlara veya statik nesnelere yapışabilir.Sperm demetleri, sperm hücrelerinin hızını azaltsa da, makroskopik olarak doğrusallıklarını artırdıkları açıktır.Demetlerin uzunluğu, demetlerde toplanan sperm sayısına bağlı olarak değişir.Demetin iki kısmı izole edildi: aglütine spermin serbest başını içeren ilk kısım ve spermin kuyruğu ve distal ucunun tamamını içeren uç kısım.Yüksek hızlı kamera (950 fps) kullanılarak, demetin ilk kısmında salınan hareketlerinden dolayı demetin hareketinden sorumlu olan serbest aglütine spermatozoa başları gözlendi, geri kalanları sarmal bir hareketle demetin içine sürükledi (Video 4).Bununla birlikte, uzun kümelerde, bazı serbest sperm başlarının vücuda yapışık olduğu ve kümenin uç kısmının, kümeyi itmeye yardımcı olmak için kanat görevi gördüğü gözlemlenmiştir.
Yavaş bir sıvı akışı içindeyken, sperm demetleri birbirine paralel hareket eder, ancak akış hızı arttıkça akım tarafından yıkanıp gitmemek için, sperm demetleri üst üste binmeye ve hareketsiz olan her şeye yapışmaya başlarlar.Demetler, bir avuç sperm hücresinin birbirine yaklaşmasıyla oluşur, senkronize hareket etmeye başlar ve birbirlerinin etrafına sarılır ve ardından yapışkan bir maddeye yapışır.Şekil 1 ve 2, spermlerin birbirine nasıl yaklaştığını ve kuyruklar birbirinin etrafına dolanırken bir bağlantı noktası oluşturduğunu göstermektedir.
Araştırmacılar, sperm reolojisini incelemek için bir mikro kanalda sıvı akışı oluşturmak için hidrostatik basınç uyguladılar.200 µm × 20 µm (G × Y) boyutunda ve 3,6 µm uzunluğunda bir mikrokanal kullanıldı.Uçlarında şırınga bulunan kaplar arasında mikrokanallar kullanın.Kanalların daha görünür olması için gıda boyası kullanıldı.
Ara bağlantı kablolarını ve aksesuarları duvara bağlayın.Video faz kontrast mikroskobu ile çekilmiştir.Her görüntü ile faz kontrast mikroskobu ve haritalama görüntüleri sunulur.(A) İki akış arasındaki bağlantı, sarmal hareket nedeniyle akışa direnir (kırmızı ok).(B) Tüp demeti ile kanal duvarı (kırmızı oklar) arasındaki bağlantı, aynı zamanda diğer iki demete (sarı oklar) bağlanır.(C) Mikroakışkan kanaldaki sperm demetleri, sperm demetlerinden oluşan bir ağ oluşturarak birbirleriyle bağlantı kurmaya başlar (kırmızı oklar).(D) Sperm demetlerinden oluşan bir ağ oluşumu.
Mikroakışkan cihaza bir damla seyreltilmiş sperm yüklendiğinde ve bir akış oluşturulduğunda, sperm demetinin akış yönünün tersine hareket ettiği gözlendi.Demetler, mikro kanalların duvarlarına sıkıca oturur ve demetlerin ilk kısmındaki serbest kafalar, onlara sıkıca oturur (video 5).Ayrıca, akıntı tarafından süpürülmeye direnmek için yollarındaki moloz gibi sabit parçacıklara da yapışırlar.Zamanla bu tutamlar, diğer tek spermleri tutan uzun iplikçikler ve daha kısa tutamlar haline gelir (Video 6).Akış yavaşlamaya başladığında, uzun sperm sıraları bir sperm çizgileri ağı oluşturmaya başlar (Video 7; Şekil 2).
Yüksek akış hızında (V > 33 µm/s), akışın sürüklenen kuvvetine daha iyi direnen demet oluşturan birçok bireysel spermi yakalama girişimi olarak ipliklerin spiral hareketleri artar. Yüksek akış hızında (V > 33 µm/s), akışın sürüklenen kuvvetine daha iyi direnen demet oluşturan birçok bireysel spermi yakalama girişimi olarak ipliklerin spiral hareketleri artar. При высокой скорости потока (V > 33 мкм/с) спиралевидные движения нитей усиливаются, поскольку они пытаются поймать м ножество отдельных сперматозоидов, образующих пучки, которые лучше противостоят дрейфующей силе потока. Yüksek akış hızlarında (V > 33 µm/s), akışın sürüklenen kuvvetine daha iyi direnebilen demetler oluşturan birçok bireysel spermi yakalamaya çalıştıkça iplikçiklerin sarmal hareketleri artar.Ölçümler (V > 33 µm/s)地抵抗流动的漂移力.在 高 流速 (v> 33 µm/s) 时 ， 的 螺旋 运动 增加 ， 以 试图 许多 形成 束 单 个 精子 ， 从而 更地 抵抗 的 漂移力。。。。。。。。。。 При высоких скоростях потока (V > 33 мкм/с) спиральное движение нитей увеличивается в попытке захватить множество отдельных сперматозоидов, образующих пучки, чтобы лучше сопротивляться силам дрейфа потока. Yüksek akış hızlarında (V > 33 µm/s), akışın sürüklenme kuvvetlerine daha iyi direnmek için birçok bireysel spermatozoayı oluşturan demetleri yakalama çabasıyla filamentlerin sarmal hareketi artar.Ayrıca yan duvarlara mikro kanallar eklemeye çalıştılar.
Sperm demetleri, ışık mikroskobu (LM) kullanılarak sperm başları ve kıvrık kuyruk kümeleri olarak tanımlandı.Çeşitli agregalara sahip sperm demetleri ayrıca bükülmüş kafalar ve flagellar agregatlar, çoklu kaynaşmış sperm kuyrukları, bir kuyruğa bağlı sperm başları ve çoklu kaynaşmış çekirdekler olarak bükülmüş çekirdekli sperm başları olarak tanımlanmıştır.transmisyon elektron mikroskobu (TEM).Taramalı elektron mikroskobu (SEM), sperm demetlerinin, sperm başlarının kılıflı agregatları olduğunu ve sperm agregatlarının, bağlı bir sarılı kuyruk ağı gösterdiğini gösterdi.
Spermatozoanın morfolojisi ve ince yapısı, spermatozoa demetlerinin oluşumu ışık mikroskobu (yarım kesit), taramalı elektron mikroskobu (SEM) ve transmisyon elektron mikroskobu (TEM) kullanılarak incelendi, sperm yaymaları akridin oranjı ile boyandı ve epifloresan mikroskopi kullanılarak incelendi.
Akridin oranjı ile sperm smear boyaması (Şekil 3B), sperm başlarının birbirine yapışık olduğunu ve büyük kümelerin oluşumuna yol açan salgı maddesiyle kaplandığını gösterdi (Şekil 3D).Sperm demetleri, bağlı kuyruklardan oluşan bir ağ ile sperm kümelerinden oluşuyordu (Şekil 4A-C).Sperm demetleri, birbirine yapışmış birçok spermatozoanın kuyruklarından oluşur (Şekil 4D).Sırlar (Şekil 4E,F) spermatozoa demetlerinin başlarını kaplamıştır.
Spermatozoa demetinin oluşumu Faz kontrast mikroskobu ve akridin oranjı ile boyanmış sperm yaymaları kullanılarak, spermatozoa başlarının birbirine yapıştığı görüldü.(A) Erken sperm kümesi oluşumu, bir sperm (beyaz daire) ve üç sperm (sarı daire) ile başlar ve spiral kuyruktan başlar ve kafada biter.(B) Yapışık sperm başlarını (oklar) gösteren, akridin turuncusu ile boyanmış bir sperm yaymasının fotomikrografisi.Deşarj kafa(lar)ı kaplar.Büyütme × 1000. (C) Mikroakışkan bir kanalda akışla taşınan büyük bir ışının geliştirilmesi (950 fps'de yüksek hızlı bir kamera kullanılarak).(D) Büyük tutamları (oklar) gösteren, akridin turuncusu ile boyanmış bir sperm yaymasının mikrografı.Büyütme: ×200.
Bir sperm demetinin taramalı elektron mikrografı ve akridin turuncusu ile boyanmış bir sperm yayması.(A, B, D, E), spermatozoanın dijital renkli taramalı elektron mikrograflarıdır ve C ve F, kaudal ağı saran çoklu spermatozoa ekini gösteren akridin turuncusu lekeli sperm yaymalarının mikrograflarıdır.(AC) Sperm kümeleri, bağlı kuyruklardan (oklar) oluşan bir ağ olarak gösterilir.(D) Birkaç spermatozoanın (yapışkan maddeli, pembe çerçeveli, oklu) kuyruğun etrafına sarılması.(E ve F) Yapışkan malzeme (işaretçiler) ile kaplı sperm başı kümeleri (işaretçiler).Spermatozoa, birkaç girdap benzeri yapı (F) ile demetler oluşturdu.(C) ×400 ve (F) ×200 büyütme.
Transmisyon elektron mikroskobu kullanarak, sperm demetlerinin kuyruklara (Şekil 6A, C), başların kuyruklara (Şekil 6B) veya başların kuyruklara (Şekil 6D) bağlı olduğunu bulduk.Demetteki spermatozoanın başları kavislidir ve ikinci bölümde nükleer bölgeleri gösterir (Şekil 6D).İnsizyon demetinde spermatozoa, iki nükleer bölge ve çok sayıda flagellar bölge ile bükülmüş bir kafaya sahipti (Şekil 5A).
Sperm demetindeki bağlantı kuyruklarını ve sperm başlarını birleştiren aglütinasyon maddesini gösteren dijital renkli elektron mikrografı.(A) Çok sayıda spermatozoanın ekli kuyruğu.Kuyruğun hem dikey (ok) hem de yatay (ok) projeksiyonlarda nasıl göründüğüne dikkat edin.(B) Spermin başı (ok) kuyruğuna (ok) bağlıdır.(C) Birkaç sperm kuyruğu (oklar) eklenmiştir.(D) Aglütinasyon materyali (AS, mavi) dört sperm başını (mor) birbirine bağlar.
Taramalı elektron mikroskobu, salgılar veya zarlarla kaplı sperm demetlerindeki sperm başlarını saptamak için kullanıldı (Şekil 6B), bu da sperm demetlerinin hücre dışı malzeme tarafından sabitlendiğini gösteriyor.Aglütine olmuş materyal, sperm kafasında konsantre edildi (denizanası kafası benzeri düzenek; Şekil 5B) ve distale doğru genişleyerek, akridin turuncusu ile boyandığında floresan mikroskobu altında parlak sarı bir görünüm verdi (Şekil 6C).Bu madde, bir tarama mikroskobu altında açıkça görülebilir ve bir bağlayıcı olarak kabul edilir.Yarı ince kesitler (Şekil 5C) ve akridin oranjı ile boyanmış sperm yaymaları, yoğun bir şekilde paketlenmiş başları ve kıvrık kuyrukları içeren sperm demetlerini gösterdi (Şekil 5D).
Çeşitli yöntemler kullanılarak sperm başlarının ve katlanmış kuyrukların kümelenmesini gösteren çeşitli fotomikrograflar.(A) İki parçalı bir çekirdeğe (mavi) ve birkaç flagellar parçaya (yeşil) sahip sarmal bir sperm kafasını gösteren bir sperm demetinin enine kesitsel dijital renkli transmisyon elektron mikrografı.(B) Kaplanmış gibi görünen bir denizanası benzeri sperm başları (oklar) kümesini gösteren dijital renkli taramalı elektron mikrografı.(C) Toplanmış sperm başlarını (oklar) ve kıvrık kuyrukları (oklar) gösteren yarı ince kesit.(D) Sperm başlarının (oklar) ve kıvrık yapışık kuyrukların (oklar) kümelerini gösteren, akridin turuncusu ile boyanmış bir sperm yaymasının mikrografı.Yapışkan bir maddenin (S) spermatozoanın başını kapladığını unutmayın.(D) × 1000 büyütme.
Transmisyon elektron mikroskobu kullanılarak (Şekil 7A), ayrıca, akridin turuncusu ile boyanmış ve floresan mikroskobu kullanılarak incelenen sperm yaymalarıyla doğrulandığı gibi, sperm başlarının büküldüğü ve çekirdeklerin spiral bir şekle sahip olduğu da kaydedildi (Şekil 7B).
(A) Dijital renkli transmisyon elektron mikrografı ve (B) Sarmal başları ve sperm başları ve kuyruklarının ekini (oklar) gösteren akridin turuncusu lekeli sperm yayması.(B) × 1000 büyütme.
İlginç bir bulgu, Sharkazi'nin sperminin mobil lifli demetler oluşturmak üzere bir araya gelmesidir.Bu demetlerin özellikleri, SST'de spermatozoanın emilmesi ve depolanmasındaki olası rollerini anlamamıza izin verir.
Çiftleşmeden sonra sperm vajinaya girer ve yoğun bir seçim sürecinden geçer, bu da SST'ye yalnızca sınırlı sayıda spermin girmesiyle sonuçlanır15,16.Bugüne kadar, spermin SST'ye girip çıktığı mekanizmalar belirsizdir.Kümes hayvanlarında spermatozoa, türe bağlı olarak 2 ila 10 haftalık uzun bir süre boyunca SST'de saklanır6.Semenin SST'de saklanması sırasındaki durumu hakkında tartışmalar devam etmektedir.Hareket halindeler mi yoksa duruyorlar mı?Yani sperm hücreleri SST'deki konumlarını bu kadar uzun süre nasıl koruyor?
Forman4, SST'de kalış ve ejeksiyonun sperm motilitesiyle açıklanabileceğini ileri sürmüştür.Yazarlar, spermin SST epiteli tarafından oluşturulan sıvı akışına karşı yüzerek pozisyonunu koruduğunu ve spermin hızı, enerji eksikliği nedeniyle geriye doğru hareket etmeye başladığı noktanın altına düştüğünde SST'den atıldığını varsayıyorlar.Zaniboni5, Foreman'ın sperm depolama modelini dolaylı olarak destekleyebilecek SST epitel hücrelerinin apikal kısmında aquaporin 2, 3 ve 9'un varlığını doğruladı.Mevcut çalışmada, Sharkashi'nin spermatozoalarının neredeyse yarısının akan sıvıda pozitif reoloji gösterdiğini ve aglütine olmuş sperm demetlerinin pozitif reoloji gösteren spermatozoa sayısını arttırdığını, ancak aglütinasyonun onları yavaşlattığını bulduk.Sperm hücrelerinin kuşun fallop tüpünden döllenme bölgesine nasıl ulaştığı tam olarak anlaşılamamıştır.Memelilerde, foliküler sıvı kemoçeker spermatozoa.Bununla birlikte, kemoatraktanların spermatozoayı uzun mesafelere yaklaşmaya yönlendirdiğine inanılmaktadır7.Bu nedenle, sperm taşınmasından başka mekanizmalar sorumludur.Spermin çiftleşmeden sonra salınan fallop tüpü sıvısına doğru yönelme ve akma yeteneğinin, farelerde spermi hedeflemede önemli bir faktör olduğu bildirilmiştir.Parker 17, spermatozoanın kuşlarda ve sürüngenlerde siliyer akıntıya karşı yüzerek yumurta kanallarını geçtiğini öne sürdü.Kuşlarda deneysel olarak kanıtlanmamış olmasına rağmen, Adolphi18, bir filtre kağıdı şeridi ile lamel ve slayt arasında ince bir sıvı tabakası oluşturulduğunda kuş sperminin olumlu sonuçlar verdiğini ilk bulan kişi olmuştur.reoloji.Hino ve Yanagimachi [19], bir perfüzyon halkasına bir fare yumurtalık-tubal-uterin kompleksi yerleştirdiler ve fallop tüplerindeki sıvı akışını görselleştirmek için kıstağa 1 µl mürekkep enjekte ettiler.Tüm mürekkep toplarının düzenli bir şekilde fallop tüpünün ampullasına doğru hareket ettiği fallop tüpünde çok aktif bir kasılma ve gevşeme hareketi fark ettiler.Yazarlar, spermin yükselmesi ve döllenmesi için alttan üst fallop tüplerine tüp sıvı akışının önemini vurgulamaktadır.Brillard20 tavuklarda ve hindilerde spermatozoaların depolandıkları vajinal girişten depolandıkları utero-vajinal bileşkeye aktif hareketle göç ettiklerini bildirmiştir.Ancak uterovajinal bileşke ile infundibulum arasında bu hareket gerekli değildir çünkü spermatozoa pasif yer değiştirme ile taşınır.Bu önceki öneriler ve mevcut çalışmada elde edilen sonuçlar bilindiğinde, spermatozoanın yukarı doğru hareket etme yeteneğinin (reoloji) seçim sürecinin dayandığı özelliklerden biri olduğu varsayılabilir.Bu, spermatozoanın vajinadan geçişini ve saklanmak üzere SKK'ya girişini belirler.Forman4'ün öne sürdüğü gibi, bu aynı zamanda spermin SST'ye ve yaşam alanına bir süre girip, hızı yavaşlamaya başladığında dışarı çıkmasını da kolaylaştırabilir.
Öte yandan, Matsuzaki ve Sasanami 21, kuş spermatozoasının, erkek ve dişi üreme yollarında uyku durumundan hareketliliğe hareket değişimlerine uğradığını öne sürmüştür.SST'de yerleşik sperm hareketliliğinin inhibisyonu, spermin uzun süre saklanmasını ve ardından SST'den ayrıldıktan sonra gençleşmesini açıklamak için önerilmiştir.Hipoksik koşullar altında, Matsuzaki ve ark.1, SST'de yerleşik sperm hareketliliğinin inhibisyonuna yol açabilecek yüksek laktat üretimi ve salınımı bildirdi.Bu durumda, sperm reolojisinin önemi, spermatozoanın saklanmasında değil, seçilmesinde ve emilmesinde yansıtılır.
Sperm aglütinasyon paterni, SST'de spermin uzun süre saklanması için makul bir açıklama olarak kabul edilir, çünkü bu, kümes hayvanlarında sperm tutmanın yaygın bir paternidir2,22,23.Bakst ve ark.2, çoğu spermatozoanın birbirine yapışarak fasiküler agregatlar oluşturduğunu ve tek spermatozoanın bıldırcın CCM'sinde nadiren bulunduğunu gözlemledi.Öte yandan, Wen ve ark.24 tavuklarda SST lümeninde daha fazla dağınık spermatozoa ve daha az spermatozoa kümesi gözlemlemiştir.Bu gözlemlere dayanarak, sperm aglütinasyon eğiliminin kuşlar arasında ve aynı ejakülattaki spermler arasında farklılık gösterdiği varsayılabilir.Ayrıca Van Krey ve ark.9, aglütine spermatozoanın rastgele ayrışmasının, spermatozoanın fallop tüpünün lümenine kademeli olarak nüfuz etmesinden sorumlu olduğunu ileri sürmüştür.Bu hipoteze göre, önce aglütinasyon kapasitesi düşük spermatozoa SST'den atılmalıdır.Bu bağlamda, spermatozoanın aglütine olma yeteneği, kirli kanatlılarda sperm rekabetinin sonucunu etkileyen bir faktör olabilir.Ek olarak, aglütine sperm ne kadar uzun süre ayrışırsa, doğurganlık o kadar uzun süre korunur.
Çeşitli çalışmalarda2,22,24 spermatozoa agregasyonu ve demetler halinde agregasyonu gözlemlenmiş olsa da, SST içindeki kinematik gözlemlerinin karmaşıklığı nedeniyle bunlar ayrıntılı olarak açıklanmamıştır.İn vitro sperm aglütinasyonunu incelemek için birkaç girişimde bulunulmuştur.İnce tel sarkan tohum damlasından çıkarıldığında kapsamlı ancak geçici topaklanma gözlendi.Bu, seminal bezi taklit eden uzun bir balonun damladan dışarı çıkmasına neden olur.3D sınırlamaları ve kısa damla kuruma süreleri nedeniyle tüm blok hızla bakıma muhtaç hale geldi9.Mevcut çalışmada, Sharkashi tavukları ve mikroakışkan çipler kullanarak bu tutamların nasıl oluştuğunu ve nasıl hareket ettiğini açıklayabildik.Sperm demetleri, semen toplanmasından hemen sonra oluştu ve akışta mevcut olduklarında pozitif reoloji göstererek bir spiral içinde hareket ettikleri bulundu.Ayrıca, makroskopik olarak bakıldığında, sperm demetlerinin izole spermatozoaya kıyasla motilite doğrusallığını arttırdığı gözlemlenmiştir.Bu, SST penetrasyonundan önce sperm aglütinasyonunun meydana gelebileceğini ve daha önce önerildiği gibi sperm üretiminin stres nedeniyle küçük bir alanla sınırlı olmadığını düşündürmektedir (Tingari ve Lake12).Püskül oluşumu sırasında spermatozoa bir bağlantı oluşturana kadar senkronize yüzer, ardından kuyrukları birbirine dolanır ve spermin başı serbest kalır, ancak spermatozoanın kuyruğu ve distal kısmı yapışkan bir madde ile birbirine yapışır.Bu nedenle, bağın serbest başı, bağın geri kalanını sürükleyerek hareketten sorumludur.Sperm demetlerinin taramalı elektron mikroskobu, çok sayıda yapışkan malzeme ile kaplı yapışık sperm başlarını gösterdi; bu da, sperm başlarının, depolama alanına (SST) ulaştıktan sonra meydana gelmiş olabilecek dinlenme demetleri halinde yapışık olduğunu düşündürdü.
Sperm yayması akridin oranjı ile boyandığında, floresan mikroskop altında sperm hücrelerinin etrafındaki hücre dışı yapışkan madde görülebilir.Bu madde, sperm demetlerinin çevreleyen akışla birlikte sürüklenmemesi için çevredeki herhangi bir yüzeye veya partiküle yapışmasını ve tutunmasını sağlar.Bu nedenle, gözlemlerimiz spermatozoa yapışmasının hareketli demetler biçimindeki rolünü göstermektedir.Akıntıya karşı yüzebilme ve yakındaki yüzeylere yapışabilme yetenekleri, spermin SST'de daha uzun süre kalmasını sağlar.
Rothschild25, mikroskobun hem dikey hem de yatay optik ekseni olan bir kamera aracılığıyla fotomikrograflar çekerek, bir damla süspansiyonda sığır semeninin yüzen dağılımını incelemek için bir hemasitometri kamerası kullandı.Sonuçlar, spermatozoanın odanın yüzeyine çekildiğini gösterdi.Yazarlar, sperm ve yüzey arasında hidrodinamik etkileşimler olabileceğini öne sürüyorlar.Bunu hesaba katarsak, Sharkashi civcivi spermasının yapışkan tutamlar oluşturma yeteneği ile birlikte, semenin SST duvarına yapışması ve uzun süre saklanması olasılığını artırabilir.
Bccetti ve Afzeliu26, sperm glikokaliksinin gamet tanıma ve aglütinasyon için gerekli olduğunu bildirmiştir.Forman10, kuş semeninin nöraminidaz ile muamele edilmesiyle glikoprotein-glikolipid kaplamalardaki a-glikosidik bağların hidrolizinin, sperm motilitesini etkilemeden doğurganlığın azalmasına yol açtığını gözlemledi.Yazarlar, nöraminidazın glikokaliks üzerindeki etkisinin, utero-vajinal bileşkede sperm sekestrasyonunu bozarak doğurganlığı azalttığını öne sürüyorlar.Gözlemleri, nöraminidaz tedavisinin sperm ve oosit tanınmasını azaltabileceği olasılığını göz ardı edemez.Forman ve Engel10, tavukların nöraminidaz ile işlenmiş semen ile intravajinal olarak tohumlanmasının doğurganlığın azaldığını bulmuşlardır.Bununla birlikte, nöraminidazla tedavi edilen spermlerle yapılan IVF, kontrol tavuklarına kıyasla fertiliteyi etkilemedi.Yazarlar, sperm zarı etrafındaki glikoprotein-glikolipid kaplamasındaki değişikliklerin, spermin utero-vajinal bağlantıda sekestrasyonunu bozarak spermin dölleme yeteneğini azalttığı ve bunun da utero-vajinal bağlantının hızı nedeniyle sperm kaybını artırdığı, ancak sperm ve yumurta tanımayı etkilemediği sonucuna varmışlardır.
Bakst ve Bauchan 11 hindilerde SST lümeninde küçük kesecikler ve zar parçaları bulmuşlar ve bu granüllerin bir kısmının sperm zarı ile kaynaştığını gözlemlemişlerdir.Yazarlar, bu ilişkilerin SST'de spermatozoanın uzun süreli depolanmasına katkıda bulunabileceğini öne sürüyorlar.Ancak araştırmacılar, bu parçacıkların kaynağını, CCT epitel hücreleri tarafından salgılanıp salgılanmadıklarını, erkek üreme sistemi tarafından üretilip salgılanmadıklarını veya spermin kendisi tarafından üretilip üretilmediklerini belirtmediler.Ayrıca, bu parçacıklar aglütinasyondan sorumludur.Grützner ve arkadaşları27, epididimal epitel hücrelerinin, tek gözenekli seminal yolların oluşumu için gerekli olan spesifik bir proteini ürettiğini ve salgıladığını bildirmiştir.Yazarlar ayrıca bu demetlerin dağılımının epididimal proteinlerin etkileşimine bağlı olduğunu da bildirmektedir.Nixon ve arkadaşları28 adneksin bir protein, asidik sistein açısından zengin osteonektin salgıladığını bulmuşlardır;SPARC, kısa gagalı echidnas ve ornitorenklerde sperm kümelerinin oluşumunda yer alır.Bu ışınların saçılması, bu proteinin kaybı ile ilişkilidir.
Mevcut çalışmada, elektron mikroskobu kullanılarak yapılan ultrastrüktürel analiz, spermatozoanın büyük miktarda yoğun malzemeye yapıştığını göstermiştir.Bu maddelerin yapışık kafalar arasında ve çevresinde yoğunlaşan, ancak kuyruk bölgesinde daha düşük konsantrasyonlarda olan aglütinasyondan sorumlu olduğu düşünülmektedir.Boşalma sırasında meninin lenf ve seminal plazmadan ayrıldığını sıklıkla gözlemlediğimiz için, bu aglütinasyon maddesinin erkek üreme sisteminden (epididim veya vas deferens) semenle birlikte atıldığını varsayıyoruz.Kuş spermatozoasının epididim ve vas deferens'ten geçerken, proteinleri bağlama ve plazma lemma ile ilişkili glikoproteinleri alma yeteneklerini destekleyen olgunlaşma ile ilgili değişikliklere uğradığı bildirilmiştir.Bu proteinlerin SST'de yerleşik sperm zarları üzerindeki kalıcılığı, bu proteinlerin sperm zarı stabilitesinin 30 kazanılmasını etkileyebileceğini ve doğurganlıklarını 31 belirleyebileceğini düşündürmektedir.Ahammad ve ark.32, erkek üreme sisteminin çeşitli yerlerinden (testislerden distal vas deferens'e kadar) elde edilen spermatozoanın, depolama sıcaklığından bağımsız olarak sıvı saklama koşullarında canlılıkta ilerleyici bir artış gösterdiğini ve suni tohumlamadan sonra tavuklarda fallop tüplerinde de canlılığın arttığını bildirmiştir.
Sharkashi tavuk sperm kümeleri, echidnas, ornitorenkler, tahta fareleri, geyik fareleri ve kobaylar gibi diğer türlerden farklı özelliklere ve işlevlere sahiptir.Sharkasi tavuklarında, spermatozoa demetlerinin oluşumu, tek spermatozoaya kıyasla yüzme hızlarını azaltmıştır.Bununla birlikte, bu demetler, reolojik olarak pozitif spermatozoa yüzdesini ve spermatozoanın dinamik bir ortamda kendilerini stabilize etme yeteneğini artırdı.Bu nedenle, sonuçlarımız, SST'deki sperm aglütinasyonunun uzun süreli sperm depolaması ile ilişkili olduğu yönündeki önceki öneriyi doğrulamaktadır.Ayrıca, spermin tutam oluşturma eğiliminin SST'deki sperm kayıp oranını kontrol edebileceğini ve bunun da sperm rekabetinin sonucunu değiştirebileceğini varsayıyoruz.Bu varsayıma göre, düşük aglütinasyon kapasiteli spermatozoa önce SST salgılarken, yüksek aglütinasyon kapasiteli spermatozoa yavruların çoğunu üretir.Tek gözenekli sperm demetlerinin oluşumu faydalıdır ve ebeveyn-çocuk oranını etkiler, ancak farklı bir mekanizma kullanır.Echidnas ve ornitorenklerde spermatozoa, ışının ileri hızını artırmak için birbirine paralel olarak düzenlenir.Echidnas demetleri, tek spermatozoadan yaklaşık üç kat daha hızlı hareket eder.Dişiler gelişigüzel olduğundan ve genellikle birkaç erkekle çiftleştiğinden, echidnas'ta bu tür sperm kümelerinin oluşumunun, egemenliği sürdürmek için evrimsel bir adaptasyon olduğuna inanılmaktadır.Bu nedenle, farklı ejakülatlardan gelen spermatozoa, yumurtanın döllenmesi için kıyasıya rekabet eder.
Sharkasi tavuklarının aglütine spermatozoalarının faz kontrast mikroskobu kullanılarak görselleştirilmesi kolaydır; bu, spermatozoanın in vitro davranışının kolayca incelenmesine izin verdiği için avantajlı kabul edilir.Sperm kümesi oluşumunun köpekbalığı tavuklarında üremeyi teşvik ettiği mekanizma, bazı spermatozoaların yumurtalara ulaştığı ve diğer ilgili bireylerin yumurtalarına ulaşıp yumurtalarına zarar vermesine yardımcı olduğu tahta fareleri gibi işbirlikçi sperm davranışını temsil eden bazı plasentalı memelilerde görülenden de farklıdır.kendini kanıtlamak içinözgecil davranış.Kendi kendine dölleme 34. Spermatozoadaki işbirlikçi davranışın bir başka örneği, geyik farelerinde bulundu; burada spermatozoa, genetik olarak en ilişkili spermleri tanımlayıp onlarla birleşebilir ve ilgisiz spermlere kıyasla hızlarını artırmak için işbirlikçi gruplar oluşturabilir35.
Bu çalışmada elde edilen sonuçlar, Foman'ın spermatozoanın SWS'de uzun süreli depolanması teorisiyle çelişmez.Araştırmacılar, sperm hücrelerinin SST'yi kaplayan epitel hücrelerinin akışında uzun bir süre hareket etmeye devam ettiğini ve belirli bir süre sonra sperm hücrelerinin enerji depolarının tükendiğini ve bunun da hızın düşmesine neden olarak küçük moleküler ağırlıklı maddelerin dışarı atılmasını sağladığını bildirmektedir.SST lümeninden sıvı akışı ile spermatozoanın enerjisi Fallop tüpünün boşluğu.Mevcut çalışmada, tekil spermlerin yarısının akan sıvılara karşı yüzebilme yeteneği gösterdiğini ve demet içindeki yapışmalarının pozitif reoloji gösterme yeteneklerini artırdığını gözlemledik.Ayrıca, verilerimiz Matsuzaki ve ark.SST'de artan laktat sekresyonunun yerleşik sperm hareketliliğini engelleyebileceğini bildiren 1 kişi.Bununla birlikte, sonuçlarımız, SST'deki davranışlarını aydınlatmak amacıyla bir mikro kanal içinde dinamik bir ortam varlığında sperm hareketli bağlarının oluşumunu ve reolojik davranışlarını açıklamaktadır.Gelecekteki araştırmalar, araştırmacıların sıvı semeni depolamak ve doğurganlık süresini artırmak için yeni yollar geliştirmelerine şüphesiz yardımcı olacak olan aglütinasyon ajanının kimyasal bileşimini ve kökenini belirlemeye odaklanabilir.
Çalışmada sperm donörü olarak 30 haftalık 15 çıplak boyunlu erkek köpekbalığı (homozigot baskın; Na Na) seçildi.Kuşlar, Mısır Ashit Valiliği, Ashit Üniversitesi Ziraat Fakültesi Araştırma Kümes Hayvanları Çiftliğinde yetiştirildi.Kuşlar, ayrı kafeslerde (30 x 40 x 40 cm) barındırıldı, bir ışık programına (16 saat ışık ve 8 saat karanlık) tabi tutuldu ve 160 g ham protein, 2800 kcal metabolize edilebilir enerji, her biri 35 g kalsiyum içeren bir diyetle beslendi.Diyetin kilogramı başına 5 gram kullanılabilir fosfor.
36, 37 numaralı verilere göre, erkeklerden karın masajıyla sperma alındı.15 erkekten 3 gün boyunca toplam 45 semen örneği alındı.Semen (n = 15/gün), potasyum difosfat (1.27 g), monosodyum glutamat monohidrat (0.867 g), fruktoz (0.5 d) susuz sodyum içeren Belsville Poultry Semen Diluent ile hemen 1:1 (v:v) seyreltildi.asetat (0,43 g), tris(hidroksimetil)aminometan (0,195 g), potasyum sitrat monohidrat (0,064 g), potasyum monofosfat (0,065 g), magnezyum klorür (0,034 g) ve H20 (100 mi), pH = 7, 5, ozmolarite 333 mOsm/kg38.Seyreltilmiş semen numuneleri önce iyi bir semen kalitesinin (nem) sağlanması için ışık mikroskobu altında incelendi ve ardından alındıktan sonra yarım saat içinde kullanılıncaya kadar 37°C'deki su banyosunda saklandı.
Spermatozoanın kinematiği ve reolojisi, bir mikroakışkan cihazlar sistemi kullanılarak açıklanmaktadır.Semen numuneleri, Beltsville Avian Semen Diluent içinde 1:40'a seyreltildi, bir mikroakışkan cihaza yüklendi (aşağıya bakın) ve kinetik parametreler, daha önce mikroakışkan karakterizasyonu için geliştirilmiş bir Bilgisayarlı Semen Analizi (CASA) sistemi kullanılarak belirlendi.sıvı ortamda spermatozoanın hareketliliği üzerine (Makine Mühendisliği Bölümü, Mühendislik Fakültesi, Assiut Üniversitesi, Mısır).Eklenti şu adresten indirilebilir: http://www.assiutmicrofluidics.com/research/casa39.Eğri hızı (VCL, μm/s), lineer hız (VSL, μm/s) ve ortalama yörünge hızı (VAP, μm/s) ölçüldü.Spermatozoa videoları, bir Tucson ISH1000 kameraya bağlı ters Optika XDS-3 faz kontrast mikroskobu (40x objektifli) kullanılarak 30 fps'de 3 sn süreyle alınmıştır.Numune başına en az üç alan ve 500 sperm yörüngesini incelemek için CASA yazılımını kullanın.Kaydedilen video, ev yapımı bir CASA kullanılarak işlendi.CASA eklentisindeki motilite tanımı, akış hızına kıyasla spermin yüzme hızına dayalıdır ve sıvı akışında daha güvenilir olduğu tespit edildiğinden yan yana hareket gibi diğer parametreleri içermez.Reolojik hareket, sperm hücrelerinin sıvı akış yönüne karşı hareketi olarak tanımlanır.Reolojik özelliklere sahip spermatozoa, hareketli spermatozoa sayısına bölündü;hareketsiz spermatozoalar ve konvektif olarak hareket eden spermatozoalar sayıma dahil edilmedi.
Kullanılan tüm kimyasallar, aksi belirtilmedikçe Elgomhoria Pharmaceuticals'dan (Kahire, Mısır) temin edildi.Cihaz, El-sherry ve diğerleri tarafından tarif edildiği gibi üretildi.Bazı değişikliklerle 40.Mikrokanalları imal etmek için kullanılan malzemeler arasında cam plakalar (Howard Glass, Worcester, MA), SU-8-25 negatif direnç (MicroChem, Newton, CA), diaseton alkol (Sigma Aldrich, Steinheim, Almanya) ve poliaseton vardı.-184, Dow Corning, Midland, Michigan).Mikrokanallar, yumuşak litografi kullanılarak üretilir.İlk olarak, yüksek çözünürlüklü bir yazıcıda (Prizmatik, Kahire, Mısır ve Pasifik Sanatları ve Tasarımı, Markham, ON) istenen mikrokanal tasarımına sahip şeffaf bir koruyucu yüz maskesi basılmıştır.Master'lar, substrat olarak cam plakalar kullanılarak yapılmıştır.Plakalar, aseton, izopropanol ve deiyonize su içinde temizlendi ve daha sonra döndürerek kaplama (3000 rpm, 1 dakika) ile 20 um'lik bir SU8-25 tabakası ile kaplandı.SU-8 katmanları daha sonra nazikçe kurutuldu (65°C, 2 dakika ve 95°C, 10 dakika) ve 50 saniye UV radyasyonuna maruz bırakıldı.Maruziyet sonrası SU-8 katmanlarını çapraz bağlamak için 65°C ve 95°C'de 1 dakika ve 4 dakika pişirin, ardından 6.5 dakika diaseton alkol içinde geliştirme.SU-8 katmanını daha da katılaştırmak için gofretleri sert bir şekilde pişirin (200°C'de 15 dakika).
PDMS, monomer ve sertleştiricinin 10:1 ağırlık oranında karıştırılmasıyla hazırlandı, ardından bir vakum desikatöründe gazı alındı ​​ve SU-8 ana çerçevesine döküldü.PDMS bir fırında (120°C, 30 dakika) sertleştirildi, ardından kanallar kesildi, ana kanaldan ayrıldı ve mikro kanalın girişine ve çıkışına tüplerin bağlanmasına izin vermek için delindi.Son olarak, PDMS mikrokanalları, başka bir yerde tarif edildiği gibi taşınabilir bir korona işlemcisi (Electro-Technic Products, Chicago, IL) kullanılarak mikroskop slaytlarına kalıcı olarak bağlandı.Bu çalışmada kullanılan mikrokanal 200 µm × 20 µm (G × Y) ölçülerinde ve 3,6 cm uzunluğundadır.
Mikrokanal içindeki hidrostatik basınç tarafından indüklenen sıvı akışı, giriş haznesindeki sıvı seviyesinin çıkış deposundaki Δh39 yükseklik farkının üzerinde tutulmasıyla sağlanır (Şekil 1).
f sürtünme katsayısıdır, dikdörtgen bir kanalda laminer akış için f = C/Re olarak tanımlanır, burada C kanalın en-boy oranına bağlı bir sabittir, L mikro kanalın uzunluğudur, Vav mikro kanalın içindeki ortalama hızdır, Dh kanalın hidrolik çapıdır, g – yerçekimi ivmesidir.Bu denklem kullanılarak, ortalama kanal hızı aşağıdaki denklem kullanılarak hesaplanabilir: