Nature.com'u ziyaret ettiğiniz için teşekkür ederiz. Kullandığınız tarayıcı sürümü sınırlı CSS desteğine sahiptir. En iyi deneyim için, güncellenmiş bir tarayıcı kullanmanızı (veya Internet Explorer'da uyumluluk modunu kapatmanızı) öneririz. Bu arada, sürekli desteği sağlamak için siteyi stiller ve JavaScript olmadan göstereceğiz.
Gözenekli silika parçacıkları, makro gözenekli parçacıklar elde etmek için bazı modifikasyonlarla bir sol-jel yöntemiyle hazırlandı. Bu parçacıklar, polistirenin (PMP) durağan fazının N-fenilmaleimid interkalasyonunu hazırlamak için N-fenilmaleimid-metilvinilizosiyanat (PMI) ve stiren ile tersinir eklemeli parçalanma zincirli transfer (RAFT) polimerizasyonuyla türevlendirildi. Dar delikli paslanmaz çelik kolonlar (100 x 1.8 mm iç çap) s sulu ambalaj. Beş peptitten (Gly-Tyr, Gly-Leu-Tyr, Gly-Gly-Tyr-Arg, Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg, lösin enkefalin) kromatografik performanstan oluşan bir peptit karışımının değerlendirilmiş PMP kolon ayrımı ve insan serum albümininin (HAS) tripsin sindirimi. Optimum elüsyon koşulları altında, peptit karışımının teorik plaka sayısı 280.000 plaka/m² kadar yüksektir. Geliştirilen kolonun ayırma performansı, ticari Ascentis Express RP-Amide kolonu ile kıyaslandığında, PMP kolonunun ayırma performansının, ayırma etkinliği ve rezolüsyon açısından ticari kolona göre daha üstün olduğu görülmüştür.
Son yıllarda, biyofarmasötik endüstrisi, pazar payında önemli bir artışla genişleyen bir küresel pazar haline geldi. Biyofarmasötik endüstrisinin1,2,3 patlayıcı büyümesiyle, peptitlerin ve proteinlerin analizi oldukça arzu edilir. Hedef peptite ek olarak, peptit sentezi sırasında çeşitli safsızlıklar üretilir ve bu nedenle, istenen saflıkta peptitleri elde etmek için kromatografik saflaştırma gerekir. Vücut sıvılarında, dokularda ve hücrelerde proteinlerin analizi ve karakterizasyonu, tek bir numunede çok sayıda potansiyel olarak saptanabilir tür nedeniyle son derece zorlu bir görevdir. .Kütle spektrometresi, peptit ve protein dizilimi için etkili bir araç olsa da, bu tür numuneler kütle spektrometresine tek geçişte enjekte edilirse, ayırma ideal olmayacaktır. Bu sorun, MS analizinden önce sıvı kromatografi (LC) ayırmaları uygulanarak hafifletilebilir; bu, belirli bir zamanda kütle spektrometresine giren analitlerin sayısını azaltacaktır4,5,6. Ek olarak, sıvı faz ayrımı sırasında, analitler dar bölgelerde odaklanabilir, böylece bu analitleri konsantre edebilir ve MS saptama hassasiyetini geliştirebilir. d kromatografisi (LC) son on yılda önemli ölçüde gelişmiştir ve proteomik analiz7,8,9,10'da popüler bir teknik haline gelmiştir.
Ters faz sıvı kromatografisi (RP-LC), durağan faz olarak oktadesil modifiye silika (ODS) kullanılarak peptit karışımlarının saflaştırılması ve ayrılması için yaygın olarak kullanılır11,12,13. Bununla birlikte, RP durağan fazlar, karmaşık yapıları ve amfifilik doğaları nedeniyle peptitlerin ve proteinlerin tatmin edici bir şekilde ayrılmasını sağlamaz14,15. Bu nedenle, etkileşim için polar ve polar olmayan kısımlara sahip peptitleri ve proteinleri analiz etmek için özel olarak tasarlanmış durağan fazlar gerekir 16.Multimodal etkileşimler sağlayan Mixed-mode kromatografi, peptitlerin, proteinlerin ve diğer kompleks karışımların ayrılması için RP-LC'ye bir alternatif olabilir.Peptit ve protein ayrımları için birkaç karışık modlu durağan fazlar hazırlanmıştır ve bu fazlarla dolu kolonlar kullanılmıştır17,18,19,20,21.Karışık modlu durağan fazlar (WAX/RPLC, HILIC/RPLC, polar interkal) ation/RPLC), hem polar hem de polar olmayan grupların varlığından dolayı peptit ve protein ayrımları için uygundur22,23,24,25,26,27,28.Benzer şekilde, kovalent olarak bağlı polar gruplara sahip polar araya giren durağan fazlar, ayırma analit ve durağan faz arasındaki etkileşime bağlı olduğundan, polar ve polar olmayan analitler için iyi ayırma gücü ve benzersiz seçicilik gösterir.Çok modlu etkileşimler 29, 30, 31, 32. Son zamanlarda, Zhang ve ark.30, dodesil sonlu bir poliamin durağan faz hazırladı ve hidrokarbonları, antidepresanlar, flavonoidler, nükleositler, östrojenler ve diğer bazı analitleri başarıyla ayırdı.Polar interkalatör hem polar hem de polar olmayan gruplara sahiptir, bu nedenle hem hidrofobik hem de hidrofilik parçalara sahip peptitleri ve proteinleri ayırmak için kullanılabilir.Polar gömülü kolonlar (örn. amid gömülü C18 kolonları), Ascentis Express markası altında ticari olarak temin edilebilir RP-Amit kolonları, ancak bu kolonlar sadece amin 33'ün analizi için kullanılır.
Mevcut çalışmada, bir polar-gömülü sabit faz (N-fenilmaleimid-gömülü polistiren) hazırlandı ve HSA'nın peptitlerinin ve tripsin sindirimlerinin ayrılması için değerlendirildi. Sabit faz, aşağıdaki strateji kullanılarak hazırlandı. Gözenekli silika parçacıkları, hazırlama protokolünde bazı modifikasyonlar ile önceki yayınımızda verilen prosedüre göre hazırlandı. Büyük gözenek boyutuna sahip silika parçacıkları hazırlamak için üre, polietilen glikol (PEG), TMOS, su asetik asit oranı ayarlandı. İkincisi, yeni bir ligand, fenilmaleimid-metil vinil izosiyanat sentezlendi ve polar gömülü bir durağan faz hazırlamak için silis partiküllerini türevlendirmek için kullanıldı. Ortaya çıkan sabit faz, optimize edilmiş paketleme şeması kullanılarak paslanmaz çelik bir kolona (100 x 1,8 mm iç çap) paketlendi. Kolon paketleme, kolon içinde homojen bir yatak oluşmasını sağlamak için mekanik titreşimle desteklenir. Beş peptitten oluşan peptit karışımlarının paketlenmiş kolon ayrımını değerlendirin;(Gly-Tyr, Gly-Leu-Tyr, Gly-Gly-Tyr-Arg, Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg, Leucine Enkephalin) ve insan serum albümininin (HAS) Tripsin sindirimi. HSA'nın peptit karışımı ve tripsin sindiriminin iyi çözünürlük ve verimlilikle ayrıldığı gözlemlendi. PMP kolonunun ayırma performansı Ascentis Express RP-Amide kolonununkiyle karşılaştırıldı. Hem peptitlerin hem de proteinlerin iyi olduğu gözlendi Ascentis Express RP-Amide kolonundan daha verimli olan PMP kolonunda çözülmüş ve verimli.
PEG (Polietilen Glikol), Üre, Asetik Asit, Trimetoksi Ortosilikat (TMOS), Trimetil Klorosilan (TMCS), Tripsin, İnsan Serum Albümini (HSA), Amonyum Klorür, Üre, Heksan Metildisilazan (HMDS), Metakriloil Klorür (MC), Stiren, 4-Hidroksi-TEMPO, Benzoil Peroksit (BPO), HPLC Derece Ası tonitril (ACN), Metanol, 2-Propanol ve Sigma-Aldrich'ten (St. Louis, MO, ABD) Satın Alınan Aseton.
Üre (8 g), polietilen glikol (8 g) ve 8 mL 0,01 N asetik asit karışımı 10 dakika karıştırıldıktan sonra buz gibi koşullarda 24 mL TMOS ilave edildi. Reaksiyon karışımı 40°C'de 6 saat ve ardından 120°C'de 8 saat paslanmaz çelik otoklavda ısıtıldı. Su döküldü ve kalan malzeme 70°C'de 12 saat kurutuldu. kurutulmuş yumuşak kütle, bir fırında pürüzsüz bir şekilde öğütüldü ve 550°C'de 12 saat kalsine edildi. Partikül boyutu, gözenek boyutu ve yüzey alanı açısından tekrar üretilebilirliği incelemek üzere üç parti hazırlandı ve karakterize edildi.
Silika parçacıklarının önceden sentezlenmiş ligand fenilmaleimid-metilvinilizosiyanat (PCMP) ile yüzey modifikasyonu ve ardından stiren ile radyal polimerizasyon yoluyla polar grup içeren bir bileşik hazırlandı.Agregalar ve polistiren zincirleri için sabit faz. Hazırlama işlemi aşağıda açıklanmıştır.
N-fenilmaleimid (200 mg) ve metil vinil izosiyanat (100 mg) kuru toluen içinde çözüldü ve fenilmaleimid-metil vinil izosiyanat kopolimeri (PMCP) hazırlamak için reaksiyon şişesine 0,1 mL 2,2'-azoizobutironitril (AIBN) ilave edildi. Karışım 60°C'de 3 saat ısıtıldı, süzüldü ve 40°C'de bir fırında kurutuldu 3 saat boyunca.
Kurutulmuş silis parçacıkları (2 g), kuru toluen (100 mL) içinde dağıtıldı, karıştırıldı ve 500 mL'lik yuvarlak dipli bir şişede 10 dakika sonike edildi. PMCP (10 mg), tolüen içinde çözüldü ve bir damlatma hunisi aracılığıyla damla damla reaksiyon şişesine ilave edildi. Karışım, 100°C'de 8 saat geri akıtıldı, süzüldü ve asetonla yıkandı ve 60°C'de 3 saat kurutuldu. Ardından, PMCP-bağ ed silika partikülleri (100 g) toluen (200 mi) içinde eritildi ve katalizör olarak 100 uL dibütil kalay dilaurat varlığında 4-hidroksi-TEMPO (2 mL) ilave edildi. Karışım 50°C'de 8 saat karıştırıldı, süzüldü ve 50°C'de 3 saat kurutuldu.
Stiren (1 mL), benzoil peroksit BPO (0,5 mL) ve TEMPO-PMCP ekli silika partikülleri (1,5 g) toluen içinde dağıtıldı ve nitrojenle temizlendi. Stirenin polimerizasyonu 100°C'de 12 saat gerçekleştirildi. Nihai ürün, metanol ile yıkandı ve gece boyunca 60°C'de kurutuldu. Genel reaksiyon şeması Şekil 1'de gösterilmektedir.
10-3 Torr'dan daha düşük bir artık basınç elde etmek için numunelerin gazı 1 saat boyunca 393 K'de giderildi. Toplam gözenek hacmini belirlemek için P/P0 = 0.99'luk bir nispi basınçta adsorbe edilen N2 miktarı kullanıldı. Çıplak ve ligand bağlı silika partiküllerinin morfolojisi, taramalı elektron mikroskobu (Hitachi High Technologies, Tokyo, Japonya) ile incelendi. Kurutulmuş numuneler (çıplak silika ve ligand bağlı silika partikülleri) bir alüminyum üzerine yerleştirildi. yapışkan karbon bant kullanılarak kolon. Altın, bir Q150T püskürtmeli kaplayıcı kullanılarak numunelerin üzerine kaplandı ve numunelerin üzerinde 5 nm'lik bir Au tabakası biriktirildi. Bu, düşük voltajlar kullanarak proses verimliliğini artırır ve ince taneli, soğuk püskürtme sağlar. Çıplak silika partikülleri ve ligand bağlı silika partikülleri (her biri 5 mg), 5 mL izopropanol içinde dağıtıldı, 10 dakika sonike edildi, 5 dakika vortekslendi ve Mastersizer'ın optik tezgahına yerleştirildi. Termogravimetrik analiz, 30 ila 800 °C sıcaklık aralığında dakikada 5 °C hızında gerçekleştirildi.
Boyutları (100 x 1.8 mm iç çap) olan cam astarlı paslanmaz çelik dar delikli kolonlar, Ref.31.1 µm frit içeren bir çıkış bağlantısına sahip bir paslanmaz çelik kolon (cam astarlı, 100 × 1,8 mm iç çap) bir bulamaç paketleyiciye (Alltech Deerfield, IL, ABD) bağlandı. 150 mg sabit fazı 1,2 mL metanol içinde süspanse ederek sabit faz bulamacı hazırlayın ve bunu depolama kolonuna gönderin. Bulamaç çözücünün yanı sıra itici çözücü olarak metanol kullanıldı.Fi 100 MP 10 dakika, 80 MP 15 dakika ve 60 MP basınçları 30 dakika uygulayarak kolonu sırayla doldurun. Paketleme sırasında, kolonun muntazam bir şekilde paketlenmesini sağlamak için iki GC kolon çalkalayıcı (Alltech, Deerfield, IL, ABD) ile mekanik vibrasyon uygulandı. Kolon içinde herhangi bir hasarı önlemek için bulamaç paketleyiciyi kapatın ve basıncı yavaşça boşaltın. Kolonu bulamaç paketleme ünitesinden ayırın ve girişe başka bir fiting takın ve performansını kontrol etmek için LC sistemine.
Bir LC pompası (10AD Shimadzu, Japonya), 50nL enjeksiyon döngüsüne sahip enjektör (Valco (ABD) C14 W.05), membran gaz giderici (Shimadzu DGU-14A), UV-VIS kapiler penceresi, Özel µLC cihaz detektörü (UV-2075) ve cam kaplı mikro sütunlar yapılmıştır. Ekstra kolon bandı genişlemesinin etkisini en aza indirmek için çok dar ve kısa bağlantı boruları kullanın. 50 μm id 365 ve indirgeyici birleşim kılcal damarları (50 μm), indirgeyici birliğin 1/16" çıkışına yerleştirildi. Veri toplama ve kromatografik işleme, Multichro 2000 yazılımı kullanılarak yapıldı. 254 nm'de izleme Analitler, UV emilimi için test edildi. Kromatografik veriler, OriginPro8 (Northampton, MA) tarafından analiz edildi.
İnsan serumundan albümin, liyofilize toz, ≥ %96 (agaroz jel elektroforezi) 3 mg, tripsin (1,5 mg), 4,0 M üre (1 mL) ve 0,2 M amonyum bikarbonatla (1 mL) karıştırıldı. Çözelti 10 dakika karıştırıldı ve 37°C'de 6 saat su banyosunda tutuldu, ardından 1 mL %0,1 TFA ile söndürüldü. Çözeltiyi süzün ve saklayın 4 °C'nin altında.
Peptid karışımlarının ve HSA tripsin sindirimlerinin ayrılması, PMP kolonlarında ayrı ayrı değerlendirildi. Peptit karışımının ve HSA'nın tripsin sindiriminin ayrılmasını PMP kolonu ile kontrol edin ve sonuçları Ascentis Express RP-Amide kolonuyla karşılaştırın. Teorik plaka sayısı şu şekilde hesaplanır:
Çıplak silis parçacıklarının ve liganda bağlı silis parçacıklarının SEM görüntüleri, Şekil 2'de gösterilmektedir.2. Çıplak silika partiküllerinin (A, B) SEM görüntüleri, önceki çalışmalarımızın aksine, bu partiküllerin, partiküllerin uzamış veya düzensiz simetriye sahip olduğu küresel olduğunu göstermektedir. Ligand bağlı silika partiküllerinin (C, D) yüzeyi, silis partiküllerinin yüzeyi üzerindeki polistiren zincirlerinin kaplanmasından kaynaklanabilecek çıplak silika partiküllerininkinden daha pürüzsüzdür.
Çıplak silika parçacıklarının (A, B) ve ligand bağlı silika parçacıklarının (C, D) taramalı elektron mikroskobu görüntüleri.
Çıplak silika parçacıklarının ve ligand bağlı silika parçacıklarının parçacık boyutu dağılımları Şekil 3(A)'da gösterilmiştir. Hacim tabanlı parçacık boyutu dağılım eğrileri, kimyasal modifikasyondan sonra silika parçacıklarının boyutunun arttığını göstermiştir (Şekil 3A). Mevcut çalışma ve önceki çalışmadan elde edilen silika parçacıklarının parçacık boyutu dağılım verileri, Tablo 1(A)'da karşılaştırılmıştır. 3,05 μm (polistirene bağlı silika partikülleri)34.Bu parti, reaksiyon karışımındaki değişen PEG, üre, TMOS ve asetik asit oranları nedeniyle önceki çalışmamıza kıyasla daha dar bir partikül boyutu dağılımına sahipti. PMP fazının partikül boyutu, daha önce incelediğimiz polistirene bağlı silika partikül fazınınkinden biraz daha büyüktür. Bu, silika partiküllerinin stiren ile yüzey işlevselleştirilmesinin, silika üzerinde yalnızca bir polistiren tabakası (0,97 µm) biriktirdiği anlamına gelir. yüzey, oysa PMP fazında katman kalınlığı 1.38 um idi.
Çıplak silika parçacıklarının ve liganda bağlı silika parçacıklarının parçacık boyutu dağılımı (A) ve gözenek boyutu dağılımı (B).
Mevcut çalışmanın silika parçacıklarının gözenek boyutu, gözenek hacmi ve yüzey alanı Tablo 1(B)'de verilmiştir. Çıplak silika parçacıklarının ve ligand bağlı silika parçacıklarının PSD profilleri Şekil 3(B)'de gösterilmiştir. Sonuçlar önceki çalışmamızla karşılaştırılabilir. Çıplak ve liganda bağlı silika parçacıklarının gözenek boyutları sırasıyla 310 ve 241'dir, bu da Tablo 1(B)'de gösterildiği gibi kimyasal modifikasyondan sonra gözenek boyutunun 69 oranında azaldığını ve eğrinin değiştiğini gösterir. Şekil 3(B)'de gösterilmektedir. Benzer şekilde, kimyasal modifikasyondan sonra silika partiküllerinin gözenek hacmi 0,67'den 0,58 cm3/g'ye düşmüştür. Halihazırda incelenen silika partiküllerinin spesifik yüzey alanı 116 m2/g'dir ve bu önceki çalışmamızla (124 m2/g) karşılaştırılabilir. Tablo 1(B)'de gösterildiği gibi, silika partiküllerinin yüzey alanı (m2/g) da 116 m2/g'den 105 m2'ye düşmüştür. /g kimyasal modifikasyondan sonra.
Durağan fazın elemental analizinin sonuçları Tablo 2'de gösterilmektedir. Mevcut durağan fazın karbon yükü %6,35'tir, bu da önceki çalışmamızın karbon yükünden daha düşüktür (polistiren bağlı silis partikülleri, sırasıyla %7,9335 ve %10,21) -metilvinilizosiyanat (PCMP) ve 4-hidroksi-TEMPO kullanılmıştır. Mevcut durağan fazın nitrojen ağırlık yüzdesi, önceki çalışmalarda sırasıyla %0,1735 ve %0,85 olan nitrojene kıyasla %2,21'dir. Bu, nitrojenin ağırlıkça %'sinin fenilmaleimide bağlı olarak mevcut durağan fazda daha yüksek olduğu anlamına gelir. Benzer şekilde, (4) ve (5) ürünlerinin karbon yüklemeleri %2,7 ve 2,9 idi. Nihai ürünün (6) karbon yükü Tablo 2'de gösterildiği gibi sırasıyla %6,35 iken, ağırlık kaybı PMP durağan fazı ile kontrol edildi ve TGA eğrisi Şekil 4'te gösterildi. TGA eğrisi, karbon yükü (%6,35) ile iyi bir uyum içinde olan %8,6'lık bir ağırlık kaybı gösteriyor çünkü ligandlar sadece C'yi değil, aynı zamanda N, O ve H'yi de içeriyor.
Fenilmaleimid-metilvinilizosiyanat ligandı, polar fenilmaleimid gruplarına ve vinilizosiyanat gruplarına sahip olduğu için silis parçacıklarının yüzey modifikasyonu için seçildi. Vinil izosiyanat grupları canlı radikal polimerizasyon yoluyla ayrıca stirenle reaksiyona girebilir. durağan fazın yoğunluğu optimum miktarda stiren ve serbest radikal polimerizasyonun reaksiyon süresi ile kontrol edilebilir. Reaksiyonun son adımı (serbest radikal polimerizasyon) kritiktir ve durağan fazın polaritesini değiştirebilir. Bu durağan fazların karbon yükünü kontrol etmek için elementel analiz yapılmıştır. Stiren miktarının ve reaksiyon süresinin artmasının durağan fazın karbon yükünü arttırdığı ve bunun tersinin de arttığı gözlemlenmiştir. Farklı stiren konsantrasyonları ile hazırlanan SP'lerin farklı karbon yükleri vardır.A kazanın, bu sabit fazları paslanmaz çelik kolonlara yükleyin ve kromatografik performanslarını (seçicilik, çözünürlük, N değeri, vb.) kontrol edin. Bu deneylere dayanarak, kontrollü polarite ve iyi analit tutma sağlamak için PMP sabit fazını hazırlamak üzere optimize edilmiş bir formülasyon seçildi.
Beş peptit karışımı (Gly-Tyr, Gly-Leu-Tyr, Gly-Gly-Tyr-Arg, Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg, lösin enkefalin) ayrıca bir mobil faz kullanılarak bir PMP kolonu kullanılarak değerlendirildi;80 μL/dak akış hızında 60/40 (v/v) asetonitril/su (%0,1 TFA).Optimal elüsyon koşulları altında, kolon başına teorik plaka sayısı (N) (100 × 1,8 mm id) 20.000 ± 100'dür (200.000 plaka/m²). Tablo 3, üç PMP kolonu için N değerlerini verir ve kromatogramlar Şekil 5A'da gösterilir .Yüksek akış hızında (700 μL/dak) bir PMP kolonunda hızlı analiz, bir dakika içinde beş peptit elüe edildi, N değerleri çok iyiydi, kolon başına 13.500 ± 330 (100 × 1.8 mm id), 135.000 plaka/m'ye karşılık gelir (Şekil 5B).Üç özdeş boyutlu kolon (100 × 1.8 mm id), üç farklı PMP durağan faz partisi ile paketlendi tekrar üretilebilirliği kontrol edin. Her kolon için analit konsantrasyonu, optimum elüsyon koşulları ve teorik plaka sayısı N ve her kolonda aynı test karışımını ayırmak için alıkonma süresi kullanılarak kaydedildi. PMP kolonları için tekrar üretilebilirlik verileri Tablo 4'te gösterilmektedir. PMP kolonunun tekrar üretilebilirliği, Tablo 3'te gösterildiği gibi çok düşük %RSD değerleri ile iyi bir korelasyona sahiptir.
Peptid karışımının PMP kolonu (B) ve Ascentis Express RP-Amide kolonu (A) üzerinde ayrılması;mobil faz 60/40 ACN/H2O (TFA %0,1), PMP sütun boyutları (100 × 1,8 mm iç çap);analitik Bileşiklerin elüsyon sırası: 1 (Gly-Tyr), 2 (Gly-Leu-Tyr), 3 (Gly-Gly-Tyr-Arg), 4 (Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg) ve 5 (lösin) asit enkefalin)).
Bir PMP kolonu (100 x 1,8 mm iç çap), yüksek performanslı sıvı kromatografide insan serum albümininin triptik sindirimlerinin ayrılması için değerlendirildi. Şekil 6'daki kromatogram, numunenin iyi ayrıldığını ve çözünürlüğün çok iyi olduğunu göstermektedir. 17 peptite karşılık gelen 17 tepe noktasına bölünmüştür. HSA sindirimindeki her bir tepe noktasının ayırma etkinliği hesaplanmış ve değerler Tablo 5'te verilmiştir.
HSA'nın (100 x 1.8 mm id) triptik bir özeti, bir PMP kolonunda ayrıldı;akış hızı (100 µL/dk), mobil faz 60/40 asetonitril/su, %0,1 TFA ile.
L kolon uzunluğu, η mobil fazın viskozitesi, ΔP kolon geri basıncı ve u mobil fazın lineer hızıdır. PMP kolonunun geçirgenliği 2,5 × 10-14 m2, akış hızı 25 μL/dak ve 60/40 v/v ACN/su kullanılmıştır. PMP kolonunun geçirgenliği (100 × 1,8 mm id) önceki çalışmamızınkine benzerdi Ref.34.Yüzeysel gözenekli partiküllerle doldurulmuş kolonun geçirgenliği: 1,3 μm partiküller için 1,7 × 10-15, 1,7 µm partiküller için 3,1 × 10-15, 2,6 µm partiküller için 5,2 × 10-15 ve 2,5 × 10-14 m2 5 µm partiküller için 43. Bu nedenle, PMP fazının geçirgenliği şuna benzer: 5 μm çekirdek-kabuk parçacıkları.
burada Wx, kloroform ile doldurulmuş kolonun ağırlığı, Wy, metanol ile doldurulmuş kolonun ağırlığı ve ρ, çözücünün yoğunluğudur. Metanol (ρ = 0,7866) ve kloroformun (ρ = 1,484) yoğunlukları. sırasıyla 0.63 ve 0.55 idi. Bu, üre ligandlarının varlığının sabit fazın geçirgenliğini azalttığı anlamına gelir. Öte yandan, PMP kolonunun toplam gözenekliliği (100 x 1.8 mm id) 0.60'tır. doğrusal zincirler, polistiren tipi sabit fazlarda ise, çevresinde nispeten kalın bir polimer tabakası oluşur. Tipik bir deneyde, kolon gözenekliliği şu şekilde hesaplanır:
Şekil 7A,B, aynı elüsyon koşullarını (yani, 60/40 ACN/H2O ve %0,1 TFA) kullanan PMP kolonunu (100 × 1,8 mm id) ve Ascentis Express RP-Amide kolonunu (100 × 1,8 mm id) göstermektedir.) van Deemter planının.Seçilen peptit karışımları (Gly-Tyr, Gly-Leu-Tyr, Gly-Gly-Tyr-Arg, Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg, Leucine Enkephalin) 20 µL/ Her iki kolon için minimum akış hızı 800 µL/dk olarak hazırlandı. PMP kolonu ve Ascentis Express RP-Amide kolonu için optimum akış hızında (80 µL/dk) minimum HETP değerleri 2 idi. Sırasıyla 6 µm ve 3,9 µm. HETP değerleri, PMP kolonunun (100 × 1,8 mm id) ayırma verimliliğinin, piyasada bulunan Ascentis Express RP-Amide kolonundan (100 × 1,8 mm id) çok daha iyi olduğunu gösterir. Şekil 7(A)'daki van Deemter grafiği, artan akışla N değerindeki düşüşün önceki çalışmamıza kıyasla önemli olmadığını göstermektedir. PMP kolonunun (100 × 1) daha yüksek ayırma verimliliği .8 mm id) Ascentis Express RP-Amide kolonuyla karşılaştırıldığında, partikül şekli, boyutu ve mevcut çalışmada kullanılan karmaşık kolon paketleme prosedürlerindeki iyileştirmelere dayanmaktadır34.
(A) %0,1 TFA ile 60/40 ACN/H2O'da bir PMP kolonu (100 × 1,8 mm id) kullanılarak elde edilen van Deemter grafiği (HETP'ye karşı mobil faz doğrusal hızı). FA.
Bir polar gömülü polistiren sabit faz hazırlandı ve yüksek performanslı sıvı kromatografide insan serum albümininin (HAS) sentetik peptit karışımlarının ve tripsin sindirimlerinin ayrılması için değerlendirildi. Peptid karışımları için PMP kolonlarının kromatografik performansı, ayırma etkinliği ve çözünürlüğü açısından mükemmeldir. PMP kolonlarının iyileştirilmiş ayırma performansı, silika parçacıklarının parçacık boyutu ve gözenek boyutu, durağan fazın kontrollü sentezi ve karmaşık kolon paketlemesi gibi çeşitli nedenlerden kaynaklanır. Yüksek ayırma etkinliğine ek olarak, yüksek akışta düşük sütun geri basıncı oranları bu durağan fazın bir diğer avantajıdır. PMP kolonları iyi tekrar üretilebilirlik sergiler ve peptit karışımlarının analizi ve çeşitli proteinlerin tripsin sindirimi için kullanılabilir. Bu kolonu sıvı kromatografide doğal ürünlerin, tıbbi bitkilerden biyoaktif bileşiklerin ve mantar özlerinin ayrılması için kullanmayı amaçlıyoruz. Gelecekte, PMP kolonları proteinlerin ve monoklonal antikorların ayrılması için de değerlendirilecektir.
Field, JK, Euerby, MR, Lau, J., Thøgersen, H. & Petersson, P. Ters Faz Kromatografisi ile Peptit Ayırma Sistemleri Üzerine Araştırma Bölüm I: Bir Sütun Karakterizasyon Protokolünün Geliştirilmesi.J.Chromatography.1603, 113–129.https://doi.org/10.1016/j.chroma.2019.05.038 (2019).
Gomez, B. et al.Bulaşıcı hastalıkların tedavisi için tasarlanmış geliştirilmiş aktif peptidler.Biotechnology.Advanced.36(2), 415-429.https://doi.org/10.1016/j.biotechadv.2018.01.004 (2018).
Vlieghe, P., Lisowski, V., Martinez, J. & Khrestchatisky, M. Sentetik terapötik peptidler: bilim ve pazar. ilaç keşfi.15 (1-2) bugün, 40-56.https://doi.org/10.1016/j.drudis.2009.10.009 (2010).
Xie, F., Smith, RD & Shen, Y. Gelişmiş Proteomik Sıvı Kromatografisi.J.Kromatografi.A 1261, 78–90 (2012).
Liu, W. ve ark.Gelişmiş sıvı kromatografi-kütle spektrometrisi, geniş hedefli metabolomik ve proteomiklerin dahil edilmesini sağlar.anus.Chim.Acta 1069, 89–97 (2019).
Chesnut, SM & Salisbury, JJ İlaç geliştirmede UHPLC'nin rolü.J.Eylül Sci.30(8), 1183-1190 (2007).
Wu, N. & Clausen, AM Hızlı ayırmalar için ultra yüksek basınçlı sıvı kromatografisinin temel ve pratik yönleri.J.Sep. Sci.30(8), 1167-1182.https://doi.org/10.1002/jssc.200700026 (2007).
Wren, SA & Tchelitcheff, P. İlaç geliştirmede ultra yüksek performanslı sıvı kromatografi uygulaması.J.Chromatography.1119(1-2), 140-146.https://doi.org/10.1016/j.chroma.2006.02.052 (2006).
Gu, H. et al. Enterovirüslerin verimli saflaştırılması için su içinde yağ yüksek iç fazlı emülsiyonlardan hazırlanan yekpare makro gözenekli hidrojeller. Chemical.Britain.J.401, 126051 (2020).
Shi, Y., Xiang, R., Horváth, C. & Wilkins, JA Sıvı kromatografinin proteomikteki rolü.J.Kromatografi.A 1053(1-2), 27-36 (2004).
Fekete, S., Veuthey, J.-L.& Guillarme, D. Terapötik peptidlerin ve proteinlerin ters fazlı sıvı kromatografi ayrımlarında ortaya çıkan eğilimler: teori ve uygulamalar.J.Pharmacy.Biomedical Science.anus.69, 9-27 (2012).
Gilar, M., Olivova, P., Daly, AE & Gebler, JC Birinci ve ikinci ayırma boyutlarında farklı pH değerleri kullanılarak bir RP-RP-HPLC sistemi kullanılarak peptitlerin iki boyutlu ayrılması.J.Eylül Sci.28(14), 1694-1703 (2005).
Feletti, S. ve ark.Tam ve yüzeysel olarak gözenekli parçacıklar ile doldurulmuş C18 2 μm altı yüksek verimli kromatografik kolonların kütle aktarım özellikleri ve kinetik performansı araştırıldı.J.Eylül Sci.43 (9-10), 1737-1745 (2020).
Piovesana, S. et al.Bitki biyoaktif peptitlerinin izolasyonu, tanımlanması ve doğrulanmasındaki son trendler ve analitik zorluklar.anus.biological anus.Chemical.410(15), 3425–3444.https://doi.org/10.1007/s00216-018-0852-x (2018).
Mueller, JB ve ark.Yaşam krallığının proteomik manzarası.Nature 582(7813), 592-596.https://doi.org/10.1038/s41586-020-2402-x (2020).
DeLuca, C. ve diğ. Terapötik peptitlerin hazırlayıcı sıvı kromatografisi ile aşağı yönde işlenmesi. Molecule (Basel, Switzerland) 26(15), 4688(2021).
Yang, Y. & Geng, X. Karışık modlu kromatografi ve bunun biyopolimerlere uygulanması.J.Kromatografi.A 1218(49), 8813–8825 (2011).
Zhao, G., Dong, X.-Y.& Sun, Y. Karışık mod protein kromatografisi için ligandlar: ilke, karakterizasyon ve tasarım.J.Biotechnology.144(1), 3-11 (2009).