Nature.com'u ziyaret ettiğiniz için teşekkür ederiz. Sınırlı CSS desteği olan bir tarayıcı sürümü kullanıyorsunuz. En iyi deneyim için güncellenmiş bir tarayıcı kullanmanızı (veya Internet Explorer'da Uyumluluk Modunu devre dışı bırakmanızı) öneririz. Ayrıca, sürekli desteği sağlamak için siteyi stiller ve JavaScript olmadan gösteriyoruz.
Aynı anda üç slayttan oluşan bir dönen görüntü görüntüler. Üç slaytta birer birer ilerlemek için Önceki ve Sonraki düğmelerini kullanın veya üç slaytta birer birer ilerlemek için sondaki kaydırıcı düğmelerini kullanın.
Gözenekli silika parçacıkları, geniş gözenekli parçacıklar elde etmek için bazı değişikliklerle sol-jel yöntemi ile hazırlandı. Bu parçacıklar, N-fenilmaleimid arakatkılı poliamitler üretmek için ters zincir transfer-parçalanma (RAFT) polimerizasyonu yoluyla N-fenilmaleimid-metilvinil izosiyanat (PMI) ve stiren ile türevlendirildi. Stiren (PMP) sabit fazı. Dar delikli paslanmaz çelik kolonlar (100 × 1,8 mm iç çap) bir bulamaç dolgusu ile dolduruldu. PMP kolonunun kromatografik performansı, beş peptitten (Gly-Tyr, Gly-Leu-Tyr, Gly-Gly-Tyr-Arg, Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg, Leu amino asit enkefalin) ve insan serum albümininin (HAS) triptik hidrolizatından oluşan sentetik peptit karışımını ayırmak için değerlendirildi. Optimum elüsyon koşulları altında, peptit karışımı içeren plakaların teorik sayısı 280.000 plaka/m2'ye ulaştı. Geliştirilen kolonun ayırma performansı ticari Ascentis Express RP-Amide kolonu ile karşılaştırıldığında, PMP kolonunun ayırma verimliliğinin ayırma verimliliği ve çözünürlük açısından ticari kolondan üstün olduğu gözlendi.
Biyofarmasötik endüstrisi son yıllarda pazar payında önemli bir artışla genişleyen küresel bir pazar haline geldi. Biyofarmasötik endüstrisinin patlayıcı büyümesiyle1,2,3 peptit ve protein analizine büyük ihtiyaç duyulmaktadır. Hedef peptidin yanı sıra, peptit sentezi sırasında çeşitli safsızlıklar oluşur, bu nedenle peptidin istenen saflığını elde etmek için kromatografik saflaştırma gerekir. Vücut sıvıları, dokular ve hücrelerdeki proteinlerin analizi ve karakterizasyonu, tek bir numunede bulunan çok sayıda potansiyel olarak tespit edilebilir tür nedeniyle son derece zorlu bir görevdir. Kütle spektrometrisi peptitleri ve proteinleri dizilemek için etkili bir araç olmasına rağmen, bu tür numuneler doğrudan kütle spektrometresine sokulursa, ayırma tatmin edici olmayacaktır. Bu sorun, MS analizinden önce sıvı kromatografisi (LC) yapılarak çözülebilir, bu da belirli bir zamanda kütle spektrometresine giren analit miktarını azaltacaktır4,5,6. Ek olarak, analitler sıvı faz ayrımı sırasında dar bir bölgede yoğunlaşabilir, böylece bu analitleri yoğunlaştırabilir ve MS tespitinin hassasiyetini artırabilir. Sıvı kromatografisi (LC) son on yılda önemli ölçüde ilerlemiş ve proteomik analiz için yaygın olarak kullanılan bir yöntem haline gelmiştir7,8,9,10.
Ters faz sıvı kromatografisi (RP-LC), sabit faz olarak oktadeasil modifiye silika (ODS) kullanarak peptit karışımlarını saflaştırmak ve ayırmak için yaygın olarak kullanılır11,12,13. Ancak, karmaşık yapıları ve amfoterik yapıları nedeniyle,14,15 RP sabit fazları peptit ve proteinlerin tatmin edici bir şekilde ayrılmasını sağlayamaz. Bu nedenle, polar ve polar olmayan parçalara sahip peptit ve proteinlerin analizi, bu analitlerle etkileşime girmek ve onları tutmak için özel olarak tasarlanmış sabit fazlar gerektirir16. Çok modlu etkileşimler sunan karışık kromatografi, peptitleri, proteinleri ve diğer karmaşık karışımları ayırmak için RP-LC'ye bir alternatif olabilir. Birkaç karışık tip sabit faz hazırlandı ve bu sabit fazlarla doldurulmuş kolonlar peptitleri ve proteinleri ayırmak için kullanıldı17,18,19,20,21. Polar ve polar olmayan grupların varlığı nedeniyle, karışık modlu sabit fazlar (WAX/RPLC, HILIC/RPLC, polar interkalasyon/RPLC) peptit ve proteinlerin ayrılması için uygundur22,23,24,25,26,27,28. Kovalent olarak bağlı polar gruplara sahip polar interkalasyonlu sabit fazlar, ayırma analit ile sabit faz arasındaki etkileşime bağlı olduğundan iyi ayırma yetenekleri ve polar ve polar olmayan analitler için benzersiz seçicilik gösterir Çok modlu etkileşimler 29,30,31,32. Son zamanlarda, Zhang ve arkadaşları 30 poliaminlerin behenil sonlandırılmış sabit fazlarını elde ettiler ve hidrokarbonları, antidepresanları, flavonoidleri, nükleozitleri, östrojenleri ve diğer bazı analitleri başarıyla ayırdılar. Polar gömülü sabit malzeme hem polar hem de polar olmayan gruplara sahiptir, bu nedenle peptitleri ve proteinleri hidrofobik ve hidrofilik parçalara ayırmak için kullanılabilir. Polar inline kolonlar (örneğin, amid inline içeren C18 kolonlar) Ascentis Express RP-Amide kolonları ticari adı altında mevcuttur, ancak bu kolonlar yalnızca amin 33'ün analizi için kullanılmıştır.
Mevcut çalışmada, polar gömülü sabit faz (N-fenilmaleimid, gömülü polistiren) hazırlandı ve peptit ayırma ve triptik HSA bağının kopması için değerlendirildi. Sabit fazı hazırlamak için aşağıdaki strateji kullanıldı. Gözenekli silika parçacıkları, önceki yayınlarımızda açıklanan prosedürlere göre, 31, 34, 35, 36, 37, 38, 39 numaralı hazırlama şemalarında bazı değişiklikler yapılarak hazırlandı. Üre, polietilen glikol (PEG), TMOS ve sulu-asetik asit oranları, büyük gözenek boyutlarına sahip silika parçacıkları elde etmek için ayarlandı. İkinci olarak, yeni bir fenilmaleimid-metilvinil izosiyanat ligandı sentezlendi ve türevlendirilmiş silika parçacıkları, polar gömülü sabit fazlar hazırlamak için kullanıldı. Elde edilen sabit faz, optimize edilmiş bir paketleme şemasına göre paslanmaz çelik bir kolona (iç çapı 100 × 1,8 mm) dolduruldu. Kolonun doldurulması, kolon içinde düzgün bir tabaka sağlamak için mekanik titreşimle desteklenir. Paketlenmiş kolon, beş peptitten (Gly-Tyr, Gly-Leu-Tyr, Gly-Gly-Tyr-Arg, Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg, lösin-enkefalin peptidi) ve insan serum albümininin (HSA) triptik hidrolizatlarından oluşan bir peptit karışımının ayrılması için değerlendirildi. Peptit karışımının ve HSA triptik sindiriminin iyi çözünürlük ve verimlilikle ayrıldığı gözlemlendi. PMP kolonunun ayırma verimliliği, Ascentis Express RP-Amide kolonununkiyle karşılaştırıldı. Peptitlerin ve proteinlerin PMP kolonunda iyi çözünürlüğe ve yüksek ayırma verimliliğine sahip olduğu ve PMP kolonunun ayırma verimliliğinin Ascentis Express RP-Amide kolonununkinden daha yüksek olduğu gözlemlendi.
PEG (polietilen glikol), üre, asetik asit, trimetoksiortosilikat (TMOS), trimetilklorosilan (TMCS), tripsin, insan serum albümini (HSA), amonyum klorür, üre, hekzametilmetakriloldisilazan (HMDS), metakriloil klorür (MC), stiren, 4-hidroksi-TEMPO, benzoil peroksit (BPO), HPLC için asetonitril (ACN), metanol, 2-propanol ve aseton. Sigma-Aldrich Şirketi (St. Louis, Missouri, ABD).
Üre (8 g), polietilen glikol (8 g) ve 8 ml 0,01 N asetik asit karışımı 10 dakika karıştırıldı ve buna buz soğutması altında 24 ml TMOS eklendi. Reaksiyon karışımı 40 °C'de 6 saat ve ardından paslanmaz çelik bir otoklavda 120 °C'de 8 saat ısıtıldı. Su boşaltıldı ve kalıntı 70 °C'de 12 saat kurutuldu. Kurutulmuş yumuşak bloklar pürüzsüz bir şekilde öğütüldü ve 550 °C'de bir fırında 12 saat kalsine edildi. Parçacık boyutlarının, gözenek boyutunun ve yüzey alanının tekrarlanabilirliğini test etmek için üç parti hazırlandı ve karakterize edildi.
Polistiren zincirleri için polar grup ve sabit faz. Hazırlama prosedürü aşağıda açıklanmıştır.
N-fenilmaleimid (200 mg) ve metil vinil izosiyanat (100 mg) susuz toluende çözüldü ve daha sonra reaksiyon kabına 0,1 ml 2,2'-azoizobutironitril (AIBN) eklenerek fenilmaleimid ve metil vinil izosiyanat kopolimeri (PMCP) elde edildi. ) Karışım 60°C'de 3 saat ısıtıldı, süzüldü ve 40°C'de bir fırında 3 saat kurutuldu.
Kurutulmuş silika parçacıkları (2 g) kuru toluende (100 ml) dağıtıldı, karıştırıldı ve 500 ml'lik yuvarlak tabanlı bir şişede 10 dakika boyunca sonikasyona tabi tutuldu. PMCP (10 mg) toluende çözüldü ve bir ekleme hunisi aracılığıyla reaksiyon şişesine damla damla eklendi. Karışım 100 °C'de 8 saat boyunca geri akıtıldı, süzüldü, asetonla yıkandı ve 60 °C'de 3 saat boyunca kurutuldu. Daha sonra, PMCP (100 g) ile ilişkili silika parçacıkları toluende (200 ml) çözüldü ve katalizör olarak 100 μl dibutiltin dilaurat varlığında buna 4-hidroksi-TEMPO (2 ml) eklendi. Karışım 50 °C'de 8 saat boyunca karıştırıldı, süzüldü ve 50 °C'de 3 saat boyunca kurutuldu.
Stiren (1 ml), benzoil peroksit BPO (0,5 ml) ve TEMPO-PMCP'ye (1,5 g) bağlı silika parçacıkları toluende dağıtıldı ve nitrojenle temizlendi. Stirenin polimerizasyonu 100°C'de 12 saat boyunca gerçekleştirildi. Elde edilen ürün metanolle yıkandı ve 60°C'de bir gece boyunca kurutuldu. Reaksiyonun genel şeması şekil 1'de gösterilmiştir.
Örnekler, 10-3 Torr'dan daha düşük bir artık basınç elde edilene kadar 1 saat boyunca 393 K'de gazı alındı. Toplam gözenek hacmini belirlemek için bağıl basınçta (P/P0 = 0,99) adsorbe edilen N2 miktarı kullanıldı. Saf ve ligand bağlı silika parçacıklarının morfolojisi bir taramalı elektron mikroskobu (Hitachi High Technologies, Tokyo, Japonya) kullanılarak incelendi. Kuru örnekler (saf silika ve ligand bağlı silika parçacıkları) karbon bant kullanılarak alüminyum çubuklar üzerine yerleştirildi. Altın, bir Q150T püskürtme cihazı kullanılarak örnek üzerine biriktirildi ve 5 nm kalınlığında bir Au tabakası örnek üzerine biriktirildi. Bu, düşük voltajlı işlemin verimliliğini artırır ve ince soğuk püskürtme sağlar. Element analizi, bir Thermo Electron (Waltham, MA, ABD) Flash EA1112 element kompozisyon analizörü kullanılarak gerçekleştirildi. Parçacık boyut dağılımını elde etmek için bir Malvern parçacık boyut analizörü (Worcestershire, İngiltere) Mastersizer 2000 kullanıldı. Kaplanmamış silika parçacıkları ve ligand bağlı silika parçacıkları (her biri 5 mg) 5 ml izopropanolde dağıtıldı, 10 dakika boyunca sonikasyona tabi tutuldu, 5 dakika boyunca çalkalandı ve bir Mastersizer optik tezgahına yerleştirildi. Termogravimetrik analiz, 30 ila 800 °C arasındaki sıcaklık aralığında dakikada 5 °C hızında gerçekleştirilir.
Cam elyaf astarlı dar delikli paslanmaz çelik kolonlar (ID 100 × 1,8 mm) referans 31'dekiyle aynı prosedür izlenerek bulamaç doldurma yöntemi ile dolduruldu. Paslanmaz çelik kolon (cam astarlı, ID 100 × 1,8 mm) ve 1 µm frit içeren bir çıkış bir bulamaç paketleme makinesine (Alltech Deerfield, IL, ABD) bağlandı. 1,2 ml metanolde 150 mg sabit faz süspanse ederek ve bunu bir rezervuar kolonuna besleyerek sabit fazın bir süspansiyonunu hazırlayın. Metanol, bulamaç çözücü ve kontrol çözücüsü olarak kullanıldı. Kolonu 10 dakika boyunca 100 MP, 15 dakika boyunca 80 MP ve 30 dakika boyunca 60 MP basınç dizisi uygulayarak doldurun. Paketleme işleminde, düzgün kolon paketlemesini sağlamak için mekanik titreşim için iki gaz kromatografisi kolon vibratörü (Alltech, Deerfield, IL, ABD) kullanıldı. Bulamaç paketleyiciyi kapatın ve ipin hasar görmesini önlemek için basıncı yavaşça boşaltın. Kolon bulamaç nozulundan ayrıldı ve girişe başka bir bağlantı parçası takılarak LC sistemine bağlandı ve çalışması test edildi.
Özel bir MLC, bir LC pompası (10AD Shimadzu, Japonya), 50 nL enjeksiyon halkalı bir örnekleyici (Valco (ABD) C14 W.05), bir membran gaz giderici (Shimadzu DGU-14A) ve bir UV-VIS kılcal pencere kullanılarak oluşturuldu. Dedektör cihazı (UV-2075) ve emaye mikrokolon. Ek kolon genişlemesinin etkisini en aza indirmek için çok dar ve kısa bağlantı tüpleri kullanın. Kolonu doldurduktan sonra, 1/16″ indirgeyici bağlantının çıkışına bir kılcal (50 µm id 365) takın ve indirgeyici bağlantının bir kılcalını (50 µm) takın. Veri toplama ve kromatogram işleme, Multichro 2000 yazılımı kullanılarak gerçekleştirilir. 254 nm'de, deneklerin UV absorbansı 0 olarak izlendi. Kromatografik veriler OriginPro8 (Northampton, MA) kullanılarak analiz edildi.
İnsan serum albümini, liyofilize toz, ≥ %96 (agaros jel elektroforezi) 3 mg, tripsin (1,5 mg), 4,0 M üre (1 ml) ve 0,2 M amonyum bikarbonat (1 ml) ile karıştırıldı. Çözelti 10 dakika karıştırıldı ve 6 saat boyunca 37°C'de bir su banyosunda tutuldu, ardından 1 ml %0,1 TFA ile söndürüldü. Çözeltiyi süzün ve 4°C'nin altında saklayın.
Peptit ve triptik sindirim HSA karışımının bir PMP kolonu üzerinde ayrılması ayrı olarak değerlendirildi. Bir PMP kolonu ile ayrılmış bir peptit ve HSA karışımının triptik hidrolizini kontrol edin ve sonuçları bir Ascentis Express RP-Amide kolonu ile karşılaştırın. Teorik plaka sayısı aşağıdaki denklem kullanılarak hesaplanır:
Saf silika parçacıklarının ve ligand bağlı silika parçacıklarının SEM görüntüleri Şekil 2'de gösterilmiştir. Saf silika parçacıklarının (A, B) SEM görüntüleri, parçacıkların daha önceki çalışmalarımıza kıyasla uzamış veya düzensiz simetriye sahip olduğu küresel bir şekil göstermektedir. Ligand (C, D) tarafından bağlanan silika parçacıklarının yüzeyi, saf silika parçacıklarının yüzeyinden daha pürüzsüzdür; bu, silika parçacıklarının yüzeyini kaplayan polistiren zincirlerinden kaynaklanıyor olabilir.
Saf silika parçacıklarının (A, B) ve ligand bağlı silika parçacıklarının (C, D) taramalı elektron mikroskobu görüntüleri.
Saf silika parçacıklarının ve ligand bağlı silika parçacıklarının parçacık boyut dağılımı Şekil 2'de gösterilmiştir. 3(A). Hacimsel parçacık boyut dağılım eğrileri, silika parçacık boyutunun kimyasal modifikasyondan sonra arttığını göstermiştir (Şekil 3A). Mevcut çalışmadan ve önceki çalışmadan elde edilen silika parçacık boyut dağılımı verileri Tablo 1(A)'da karşılaştırılmıştır. PMP'nin hacimsel parçacık boyutu d(0,5) değeri 3,36 µm iken, önceki çalışmamızdaki (polistiren bağlı silika parçacıkları) ad(0,5) değeri 3,05 µm idi34. Reaksiyon karışımındaki PEG, üre, TMOS ve asetik asit oranındaki değişiklik nedeniyle, bu partinin parçacık boyut dağılımı önceki çalışmamıza kıyasla daha dardı. PMP fazının parçacık boyutu, daha önce incelediğimiz polistiren bağlı silika parçacık fazınınkinden biraz daha büyüktür. Bu, silika parçacıklarının stirenle yüzey fonksiyonelleştirilmesinin silika yüzeyinde sadece bir polistiren tabakası (0,97 µm) biriktirdiği, PMP fazında ise tabaka kalınlığının 1,38 µm olduğu anlamına gelmektedir.
Saf silika parçacıklarının ve ligand bağlı silika parçacıklarının parçacık boyut dağılımı (A) ve gözenek boyut dağılımı (B).
Bu çalışmada kullanılan silika parçacıklarının gözenek boyutu, gözenek hacmi ve yüzey alanı Tablo 1 (B)'de gösterilmiştir. Saf silika parçacıklarının ve ligand bağlı silika parçacıklarının PSD profilleri Şekil 3 (B)'de gösterilmiştir. Sonuçlar önceki çalışmamızla karşılaştırılabilirdi34. Saf ve ligand bağlı silika parçacıklarının gözenek boyutları sırasıyla 310 Å ve 241 Å olup, kimyasal modifikasyondan sonra gözenek boyutunun Tablo 1 (B)'de gösterildiği gibi 69 Å azaldığını ve kayma eğrisinin Şekil 1'de gösterildiğini göstermektedir. Mevcut çalışmadaki silika parçacıklarının özgül yüzey alanı 116 m2/g olup, önceki çalışmamızla (124 m2/g) karşılaştırılabilirdir. Tablo 1 (B)'de gösterildiği gibi, kimyasal modifikasyondan sonra silika parçacıklarının yüzey alanı (m2/g) da 116 m2/g'dan 105 m2/g'a düşmüştür.
Sabit fazın elementel analiz sonuçları Tablo 2'de sunulmuştur. Mevcut sabit fazın karbon içeriği %6,35'tir ve bu önceki çalışmamızdakinden (polistirenle ilişkili silika parçacıkları, sırasıyla %7,9335 ve %10,21) daha düşüktür 42. Mevcut sabit fazın karbon içeriği aşağıdadır, çünkü SP hazırlanmasında stirene ek olarak fenilmaleimid metil vinil izosiyanat (PCMP) ve 4-hidroksi-TEMPO gibi bazı polar ligandlar kullanılmıştır. Mevcut sabit fazdaki azotun ağırlık yüzdesi, önceki çalışmalardaki %0,1735 ve %0,85'e kıyasla %2,21'dir42. Bu, mevcut sabit fazın fenilmaleimid nedeniyle yüksek bir azot ağırlık yüzdesine sahip olduğu anlamına gelir. Benzer şekilde, ürünler (4) ve (5) sırasıyla %2,7 ve %2,9 karbon içeriğine sahipken, son ürün (6) Tablo 2'de gösterildiği gibi %6,35 karbon içeriğine sahiptir. Ağırlık kaybını test etmek için PMP'nin sabit fazında termogravimetrik analiz (TGA) kullanıldı ve TGA eğrisi Şekil 4'te gösterilmiştir. TGA eğrisi, ligandların yalnızca C değil, aynı zamanda N, O ve H de içermesi nedeniyle karbon içeriğiyle (%6,35) oldukça uyumlu olan %8,6'lık bir ağırlık kaybı göstermektedir.
Ligand fenilmaleimid-metilvinil izosiyanat, polar fenilmaleimid ve vinilizosiyanat grupları nedeniyle silika parçacıklarının yüzeyini değiştirmek için seçildi. Vinil izosiyanat grupları, yaşayan radikal polimerizasyonu yoluyla stirenle daha fazla reaksiyona girebilir. İkinci neden, analit ile orta düzeyde etkileşimleri olan ve analit ile durağan faz arasında güçlü elektrostatik etkileşimleri olmayan bir grup eklemektir, çünkü fenilmaleimid kısmının normal pH'ta sanal yükü yoktur. Durağan fazın polaritesi, optimum stiren miktarı ve serbest radikal polimerizasyonunun reaksiyon süresi ile kontrol edilebilir. Reaksiyonun son adımı (serbest radikal polimerizasyonu), durağan fazın polaritesini değiştirdiği için kritiktir. Bu durağan fazlardaki karbon içeriğini kontrol etmek için element analizi gerçekleştirildi. Stiren miktarının ve reaksiyon süresinin artırılmasının durağan fazın karbon içeriğini artırdığı ve bunun tersinin de geçerli olduğu gözlemlenmiştir. Farklı stiren konsantrasyonlarıyla hazırlanan SP'ler farklı karbon yüklerine sahiptir. Benzer şekilde, bu sabit fazlar paslanmaz çelik kolonlara yerleştirildi ve kromatografik özellikleri (seçicilik, çözünürlük, N değeri, vb.) kontrol edildi. Bu deneylere dayanarak, kontrollü polarite ve analitin iyi tutulmasını sağlamak için PMP sabit fazının hazırlanması için optimize edilmiş bir kompozisyon seçildi.
PMP kolonu ayrıca mobil fazın kapasitesi kullanılarak beş peptit karışımının (Gly-Tyr, Gly-Leu-Tyr, Gly-Gly-Tyr-Arg, Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg, lösin-enkefalin) analizi için değerlendirildi. 80 µl/dk akış hızında 60/40 (v/v) ACN/su (%0,1 TFA). Optimum elüsyon koşulları altında (200.000 plaka/m), kolon başına (100 × 1,8 mm) teorik plaka sayısı (N) 20.000 ± 100'dür. Üç PMP kolonu için N değerleri Tablo 3'te ve kromatogramlar Şekil 5A'da gösterilmektedir. Yüksek akış hızında (700 µl/dk) bir PMP kolonunda hızlı analiz, bir dakika içinde elüe edilen beş peptit, kolon başına 13.500 ± 330'luk mükemmel N değeri (100 x 1,8 mm çap), 135.000 plaka/m3'e eşdeğerdir (Şekil 5B). Aynı boyuttaki üç kolon (iç çapı 100 x 1,8 mm), tekrarlanabilirliği test etmek için üç farklı PMP sabit faz partisi ile dolduruldu. Her kolon için analitler, optimum elüsyon koşulları, teorik plaka sayısı N ve tutulma süresi kullanılarak her kolonda aynı test karışımını ayırarak kaydedildi. PMP kolonları için tekrarlanabilirlik verileri Tablo 4'te gösterilmiştir. PMP kolonunun tekrarlanabilirliği, Tablo 3'te gösterildiği gibi çok düşük %RSD değerleriyle iyi bir korelasyon gösterdi.
Peptit karışımlarının bir PMP kolonu (B) ve bir Ascentis Express RP-Amide kolonu (A) üzerinde ayrılması, hareketli faz 60/40 ACN/H2O (TFA %0,1), PMP kolon boyutları (100 x 1,8 mm iç çap), analiz Bileşiklerin elüsyon sırası: 1 (Gly-Tyr), 2 (Gly-Leu-Tyr), 3 (Gly-Gly-Tyr-Arg), 4 (Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg) ve 5 (lösik asit enkefalin).
İnsan serum albümininin triptik hidrolizatının HPLC ile ayrılması için bir PMP kolonu (iç çapı 100 x 1,8 mm) değerlendirildi. Şekil 6'daki kromatogram, numunelerin çok iyi çözünürlükle iyi bir şekilde ayrıldığını göstermektedir. HSA çözeltileri, 100 μl/dakika akış hızı, 70/30 asetonitril/su ve %0,1 TFA'dan oluşan bir mobil faz kullanılarak analiz edildi. HSA'nın ayrılması, kromatogramda (Şekil 6) gösterildiği gibi 17 peptite karşılık gelen 17 tepeye bölündü. HSA hidrolizatından ayrı tepelerin ayırma verimlilikleri hesaplandı ve değerler Tablo 5'te gösterilmiştir.
HSA tripsin hidrolizatları bir PMP kolonunda (iç çapı 100 x 1,8 mm), akış hızında (100 μl/dak), hareketli faz 60/40 asetonitril/su ve %0,1 TFA'da ayrıldı.
Burada L kolon uzunluğu, η mobil fazın viskozitesi, ΔP kolonun geri basıncı ve u mobil fazın doğrusal hızıdır. PMP kolonunun geçirgenliği 2,5 × 10-14 m2, akış hızı 25 µl/dak, 60/40 v/v kullanılmıştır. ACN/su. PMP kolonunun (ID 100 × 1,8 mm) geçirgenliği önceki Ref.34 çalışmamıza benzerdi. Yüzeysel gözenekli parçacıklarla doldurulmuş bir kolonun geçirgenliği 1,7 × 10 .6 µm, 5 µm parçacıklar için 2,5 × 10-14 m2'dir43. Bu nedenle, PMP fazının geçirgenliği 5 μm boyutundaki çekirdek-kabuk parçacıklarının geçirgenliğine benzerdir.
Burada Wx kloroformla doldurulmuş kolonun kütlesi, Wy metanolle doldurulmuş kolonun kütlesi ve ρ çözücünün yoğunluğudur. Metanolün (ρ = 0,7866) ve kloroformun (ρ = 1,484) yoğunluğu. Silika-C18 partikül kolonunun (100 × 1,8 mm ID)34 ve daha önce incelediğimiz C18-üre31 kolonunun toplam gözenekliliği sırasıyla 0,63 ve 0,55'ti. Bu, üre ligandlarının varlığının sabit fazın geçirgenliğini azalttığı anlamına gelir. Öte yandan, PMP kolonunun (iç çapı 100 × 1,8 mm) toplam gözenekliliği 0,60'tır. PMP kolonları, C18 bağlı silika parçacıklarıyla dolu kolonlardan daha az geçirgendir çünkü C18 tipi sabit fazlarda C18 ligandları silika parçacıklarına doğrusal zincirler halinde bağlanırken, polistiren tipi sabit fazlarda parçacıkların etrafında nispeten kalın bir polimer oluşur. A katmanı. Tipik bir deneyde, kolon gözenekliliği aşağıdaki gibi hesaplanır:
Şekil 7A, B'de aynı elüsyon koşulları altında bir PMP kolonu (id 100 x 1,8 mm) ve bir Ascentis Express RP-Amide kolonu (id 100 x 1,8 mm) için Van Deemter grafikleri gösterilmektedir, her iki kolonda da 60/40 ACN/H2O ve 0,1% TFA 20 µl/dak ila 800 µl/dak. Optimum akış hızında (80 µl/dak) minimum HETP değerleri PMP kolonu ve Ascentis Express RP-Amide kolonu için sırasıyla 2,6 µm ve 3,9 µm idi. HETP değerleri, PMP kolonunun (100 x 1,8 mm id) ayırma verimliliğinin ticari olarak satılan Ascentis Express RP-Amide kolonundan (100 x 1,8 mm id) çok daha yüksek olduğunu göstermektedir. Şekil 7(A)'daki van Deemter grafiği, N değerindeki azalmanın önceki çalışmamıza kıyasla artan akışla önemli ölçüde daha yüksek olmadığını göstermektedir. PMP kolonunun (id 100 × 1,8 mm) Ascentis Express RP-Amide kolonuna kıyasla daha yüksek ayırma verimliliği, iyileştirilmiş parçacık şekli ve boyutuna ve mevcut çalışmada kullanılan sofistike kolon paketleme prosedürüne dayanmaktadır34.
(A) 0,1% TFA içeren 60/40 ACN/H2O'da bir PMP kolonu (id 100 x 1,8 mm) üzerinde elde edilen Van Deemter grafiği (HETP'ye karşı mobil faz doğrusal hızı). (B) 0,1% TFA içeren 60/40 ACN/H2O'da bir Ascentis Express RP-Amide kolonu (id 100 x 1,8 mm) üzerinde elde edilen Van Deemter grafiği (HETP'ye karşı mobil faz doğrusal hızı).
Araya yerleştirilmiş polistirenin polar durağan fazı, sentetik peptitler ve insan serum albümininin (HSA) triptik hidrolizatının bir karışımının yüksek performanslı sıvı kromatografisinde ayrılması için hazırlandı ve değerlendirildi. Peptit karışımları için PMP kolonlarının kromatografik performansı, ayırma verimliliği ve çözünürlük açısından mükemmeldir. PMP kolonlarının gelişmiş ayırma verimliliği, silika parçacık boyutu ve gözenek boyutu, durağan fazların kontrollü sentezi ve karmaşık kolon paketleme malzemeleri gibi çeşitli nedenlerden kaynaklanmaktadır. Yüksek ayırma verimliliğine ek olarak, bu durağan fazın bir diğer avantajı da yüksek akış hızlarında düşük kolon geri basıncıdır. PMP kolonları son derece tekrarlanabilirdir ve peptit karışımlarını ve çeşitli proteinlerin triptik sindirimini analiz etmek için kullanılabilir. Bu kolonu, sıvı kromatografisinde doğal ürünlerden, tıbbi bitki özlerinden ve mantarlardan biyoaktif bileşiklerin ayrılması için kullanmayı amaçlıyoruz. Gelecekte, PMP kolonları proteinlerin ve monoklonal antikorların ayrılması için de değerlendirilecektir.
Field, JK, Euerby, MR, Lau, J., Thøgersen, H. & Petersson, P. Ters faz kromatografisi peptit ayırma sistemlerinin araştırılması, bölüm I: Kolon karakterizasyonu için bir protokolün geliştirilmesi. Field, JK, Euerby, MR, Lau, J., Thøgersen, H. & Petersson, P. Ters faz kromatografisi peptit ayırma sistemlerinin araştırılması, bölüm I: Kolon karakterizasyonu için bir protokolün geliştirilmesi.Field, JK, Owerby, MR, Lau, J., Togersen, H. ve Petersson, P. Ters Faz Kromatografisi ile Peptit Ayırma Sistemlerinin Araştırılması, Bölüm I: Kolon Karakterizasyonu için Bir Protokol Geliştirme. Field, JK, Euerby, MR, Lau, J., Thøgersen, H. & Petersson, P. Ters faz kromatografisi peptit ayırma sistemlerinin araştırılması, bölüm I: Kolon özellikleri için bir protokolün geliştirilmesi. Field, JK, Euerby, MR, Lau, J., Thøgersen, H. & Petersson, P. Ters faz kromatografisi peptit ayırma sistemlerinin araştırılması, bölüm I: Kolon özellikleri için bir protokolün geliştirilmesi.Field, JK, Owerby, MR, Lau, J., Togersen, H. ve Petersson, P. Ters Faz Kromatografisi ile Peptit Ayırma Sistemlerinin Araştırılması, Bölüm I: Kolon Karakterizasyonu için Bir Protokol Geliştirme.J.色谱法。 1603，113-129。 https://doi.org/10.1016/j.chroma.2019.05.038(2019)。
Gomez, B. ve diğerleri. Bulaşıcı hastalıkların tedavisi için geliştirilmiş aktif peptitler oluşturma yöntemleri. Biyoteknoloji. Başarılar 36(2), 415–429. https://doi.org/10.1016/j.biotechadv.2018.01.004 (2018).
Vlieghe, P., Lisowski, V., Martinez, J. ve Khrestchatisky, M. Sentetik terapötik peptitler: Bilim ve pazar. Vlieghe, P., Lisowski, V., Martinez, J. ve Khrestchatisky, M. Sentetik terapötik peptitler: Bilim ve pazar.Vliege P, Lisowski V, Martinez J ve Chreschatyski M. Sentetik terapötik peptitler: bilim ve pazar.Vliege P, Lisowski V, Martinez J ve Khreschatsky M. Sentetik terapötik peptitler: bilim ve pazar. İlaç keşfi. Bugün 15 (1–2), 40–56. https://doi.org/10.1016/j.drudis.2009.10.009 (2010).
Xie, F., Smith, RD ve Shen, Y. Gelişmiş proteomik sıvı kromatografisi. Xie, F., Smith, RD ve Shen, Y. Gelişmiş proteomik sıvı kromatografisi.Bkz. F., Smith RD ve Shen Yu. İleri proteomik sıvı kromatografisi. Xie, F., Smith, RD & Shen, Y. Xie, F., Smith, RD & Shen, Y. Gelişmiş protein bileşimi.Bkz. F., Smith RD ve Shen Yu. İleri proteomik sıvı kromatografisi.J. Kromatografi. A 1261, 78–90 (2012).
Liu, W. ve diğerleri. Gelişmiş sıvı kromatografisi-kütle spektrometrisi, geniş tabanlı metabolomik ve proteomikleri birleştirebilir. anüs. Chim. Acta 1069, 89–97 (2019).
Chesnut, SM ve Salisbury, JJ Farmasötik geliştirmede UHPLC'nin rolü. Chesnut, SM ve Salisbury, JJ Farmasötik geliştirmede UHPLC'nin rolü.Chesnut, SM ve Salisbury, JJ Farmasötik geliştirmede UHPLC'nin rolü.Chesnut, SM ve Salisbury, JJ İlaç geliştirmede UHPLC'nin rolü. J. Sept Science. 30(8), 1183–1190 (2007).
Wu, N. & Clausen, AM Hızlı ayırmalar için ultra yüksek basınçlı sıvı kromatografisinin temel ve pratik yönleri. Wu, N. & Clausen, AM Hızlı ayırmalar için ultra yüksek basınçlı sıvı kromatografisinin temel ve pratik yönleri.Wu, N. ve Clausen, AM Hızlı ayırma için yüksek basınçlı sıvı kromatografisinin temel ve pratik yönleri. Wu, N. & Clausen, AM Wu, N. & Clausen, AM Hızlı ayırma için ultra yüksek basınçlı sıvı kromatografisinin temel ve pratik yönleri.Wu, N. ve Clausen, AM Hızlı ayırma için yüksek basınçlı sıvı kromatografisinin temel ve pratik yönleri.J. Eylül Bilimi. 30(8), 1167–1182. https://doi.org/10.1002/jssc.200700026 (2007).
Wren, SA ve Tchelitcheff, P. Farmasötik geliştirmede ultra performanslı sıvı kromatografisinin kullanımı. Wren, SA ve Tchelitcheff, P. Farmasötik geliştirmede ultra performanslı sıvı kromatografisinin kullanımı.Ren, SA ve Chelischeff, P. Farmasötik geliştirmede ultra yüksek performanslı sıvı kromatografisinin kullanımı. Wren, SA & Tchelitcheff, P. 超高效液相色谱在药物开发中的应用。 Wren, SA ve Tchelitcheff, P.Ren, SA ve Chelischeff, P. İlaç geliştirmede ultra performanslı sıvı kromatografisinin uygulanması.J. Kromatografi. 1119(1-2), 140-146. https://doi.org/10.1016/j.chroma.2006.02.052 (2006).
Gu, H. ve diğerleri. Enterovirüs 71'in etkili bir şekilde saflaştırılması için yüksek iç fazlı bir yağ-su emülsiyonundan türetilen monolitik bir makrogözenekli hidrojel. Kimyasal. proje. Dergi 401, 126051 (2020).
Shi, Y., Xiang, R., Horváth, C. ve Wilkins, JA Proteomikte sıvı kromatografisinin rolü. Shi, Y., Xiang, R., Horváth, C. ve Wilkins, JA Proteomikte sıvı kromatografisinin rolü.Shi, Y., Xiang, R., Horvath, C. ve Wilkins, JA Proteomikte sıvı kromatografisinin rolü. Shi, Y., Xiang, R., Horváth, C. & Wilkins, JA 液相色谱在蛋白质组学中的作用。 Shi, Y., Xiang, R., Horváth, C. & Wilkins, JAShi, Y., Xiang, R., Horvath, C. ve Wilkins, JA Proteomikte sıvı kromatografisinin rolü.J. Kromatografi. A 1053 (1-2), 27-36 (2004).
Fekete, S., Vutey, J.-L. & Guillarme, D. Terapötik peptit ve proteinlerin ters fazlı sıvı kromatografik ayrımlarında yeni trendler: Teori ve uygulamalar. & Guillarme, D. Terapötik peptit ve proteinlerin ters fazlı sıvı kromatografik ayrımlarında yeni trendler: Teori ve uygulamalar. & Guillarme, D. Новые тенденции в разделении терапевтических пептидов и белков с помощью жидкостной хроматографии с обращенной фазой: teori ve uygulama. & Guillarme, D. Ters faz sıvı kromatografisi ile terapötik peptit ve proteinlerin ayrılmasında yeni eğilimler: teori ve uygulamalar. & Guillarme, D. & Guillarme, D.ve Guillarmé, D. Ters faz sıvı kromatografisi ile terapötik peptit ve proteinlerin ayrılmasında yeni eğilimler: teori ve uygulamalar.J. Pharm. Biyomedikal Bilim. anüs. 69, 9–27 (2012).
Gilar, M., Olivova, P., Daly, AE ve Gebler, JC Birinci ve ikinci ayırma boyutlarında farklı pH'lı RP-RP-HPLC sistemi kullanılarak peptitlerin iki boyutlu ayrılması. Gilar, M., Olivova, P., Daly, AE ve Gebler, JC Birinci ve ikinci ayırma boyutlarında farklı pH'lı RP-RP-HPLC sistemi kullanılarak peptitlerin iki boyutlu ayrılması.Gilar M., Olivova P., Dali AE ve Gebler JK Birinci ve ikinci ayırma boyutlarında farklı pH'larla RP-RP-HPLC sistemi kullanılarak peptitlerin iki boyutlu ayrılması.Gilar M., Olivova P., Dali AE ve Gebler JK RP-RP-HPLC sistemi kullanılarak birinci ve ikinci ayırma boyutlarında farklı pH değerleri kullanılarak peptitlerin iki boyutlu ayrılması. J. Sept. Science. 28 (14), 1694–1703 (2005).
Fellitti, S. ve diğerleri. 2 µm'den küçük tam gözenekli ve yüzeysel gözenekli C18 parçacıklarıyla doldurulmuş yüksek performanslı kromatografi kolonlarının kütle transferi ve kinetik özelliklerinin araştırılması. J. Sept Science. 43 (9–10), 1737–1745 (2020).
Piovesana, S. ve diğerleri. Bitkisel biyoaktif peptitlerin izolasyonu, tanımlanması ve doğrulanmasında son eğilimler ve analitik zorluklar. anüs. Yaratık anal. Kimyasal. 410(15), 3425-3444. https://doi.org/10.1007/s00216-018-0852-x (2018).
Muller, JB ve diğerleri. Yaşam krallığının proteomik manzarası. Doğa 582 (7813), 592–596. https://doi.org/10.1038/s41586-020-2402-x (2020).
De Luca, K. ve diğerleri. Terapötik peptitlerin preparatif sıvı kromatografisi ile son tedavisi. Moleküller (Basel, İsviçre) 26(15), 4688 (2021).
Yang, Y. ve Geng, X. Karma modlu kromatografi ve biyopolimerlere uygulamaları. Yang, Y. ve Geng, X. Karma modlu kromatografi ve biyopolimerlere uygulamaları.Yang, Yu. ve Geng, X. Karma mod kromatografisi ve biyopolimerlere uygulanması. Yang, Y. & Geng, X. 混合模式色谱及其在生物聚合物中的应用. Yang, Y. & Geng, X. Karma mod kromatografisi ve biyopolimerlerde uygulaması.Yang, Yu. ve Gene, X. Karma mod kromatografisi ve biyopolimerlere uygulanması.J. Kromatografi. A 1218(49), 8813–8825 (2011).