Nature.com'u ziyaret ettiğiniz için teşekkür ederiz.Kullanmakta olduğunuz tarayıcı sürümü sınırlı CSS desteğine sahiptir.En iyi deneyim için güncellenmiş bir tarayıcı kullanmanızı (veya Internet Explorer'da Uyumluluk Modunu devre dışı bırakmanızı) öneririz.Bu arada, sürekli destek sağlamak için siteyi stiller ve JavaScript olmadan yapacağız.
Angustifolius lupin (NLL, Lupinus angustifolius L.), gıda üretimi ve toprak ıslahı için kullanılan bir baklagil bitkisidir.NLL'nin bir ürün olarak küresel genişlemesi, yıkıcı antraknoz hastalığına neden olan acı bakla antraknozu da dahil olmak üzere birçok patojenik mantarı kendine çekmiştir.NLL ıslahında artan direnç sağlayan Lanr1 ve AnMan adlı iki alel kullanılmıştır, ancak altta yatan moleküler mekanizmalar bilinmemektedir.Bu çalışmada Avrupa NLL örneklerini taramak için Lanr1 ve AnMan belirteçleri kullanıldı.Aşının kontrollü bir ortamda test edilmesi, her iki dirençli donörün etkinliğini doğruladı.Diferansiyel gen ekspresyon profili, temsili dirençli ve hassas hatlar üzerinde gerçekleştirildi.Antraknoz direnci, "GO:0006952 Savunma Tepkisi", "GO:0055114 Redoks Süreci" ve "GO:0015979 Fotosentez" gen ontolojisi terimlerinin aşırı ekspresyonu ile ilişkilendirildi.Ek olarak, Lanr1(83A:476) çizgisi, aşılamadan sonra hızla yeniden programlanan önemli bir transkriptom gösterirken, diğer çizgiler bu tepkide yaklaşık 42 saat gecikme gösterdi.Savunma yanıtları, TIR-NBS, CC-NBS-LRR ve NBS-LRR genleri, patogenezde yer alan 10 protein, lipid transfer proteinleri, endoglukan-1,3-β-glukosidaz, glisinden zengin hücre duvarı proteinleri ve reaktif oksijen yolundan gelen genler ile ilişkilidir.83A:476'ya verilen erken yanıtlar, fotosentezle ilişkili genlerin dikkatli bir şekilde bastırılması dahil, mantar biyolojisinin vejetatif büyüme fazı sırasındaki başarılı koruma ile aynı zamana denk geldi, bu da bir efektörün bağışıklığı tetiklediğini düşündürür.Mandeloop reaksiyonu, genel yatay sürükleme gibi yavaşlar.
Dar yapraklı acı bakla (NLL, Lupinus angustifolius L.), Batı Akdeniz bölgesi menşeli yüksek proteinli bir tahıldır1,2.Şu anda hayvanlar ve insanlar için bir gıda ürünü olarak yetiştirilmektedir.Aynı zamanda, simbiyotik nitrojen sabitleyici bakteriler tarafından nitrojen tespiti ve toprak yapısının genel olarak iyileştirilmesi nedeniyle ürün rotasyonu sistemlerinde yeşil gübre olarak kabul edilir.NLL, geçen yüzyılda hızlı bir evcilleştirme sürecinden geçmiştir ve halen yüksek üreme baskısı altındadır3,4,5,6,7,8,9,10,11,12.NLL'nin yaygın olarak yetiştirilmesiyle, patojenik mantarların art arda gelmesi, yeni tarımsal nişler geliştirdi ve yeni mahsulü yok eden hastalıklara neden oldu. Acı bakla çiftçileri ve yetiştiricileri için en dikkat çekici olanı, patojenik mantar olan Colletotrichum lupini (Bondar) Nirenberg, Feiler & Hagedorn13'ün neden olduğu antraknoz görünümüydü. Acı bakla çiftçileri ve yetiştiricileri için en dikkat çekici olanı, patojenik mantar olan Colletotrichum lupini (Bondar) Nirenberg, Feiler & Hagedorn13'ün neden olduğu antraknoz görünümüydü. Наиболее примечательным для фермеров и селекционеров люпина было появление антракноза, вызванного патогенным гр ибком Colletotrichum lupini (Bondar) Nirenberg, Feiler & Hagedorn13. Acı bakla çiftçileri ve yetiştiricileri için en dikkate değer olanı, patojenik mantar Colletotrichum lupini (Bondar) Nirenberg, Feiler & Hagedorn13'ün neden olduğu antraknozun ortaya çıkışıydı.Nir enberg, Feiler & Hagedorn13 引起的.Colletotrichum lupini (Bondar)嵵Saçlı。1 Наиболее поразительным для фермеров и селекционеров люпина является появление антракноза, вызываемого патогенным грибком Colletotrichum lupini (Bondar) Nirenberg, Feiler & Hagedorn13. Acı bakla çiftçileri ve yetiştiricileri için en çarpıcı olanı, patojenik mantar Colletotrichum lupini (Bondar) Nirenberg, Feiler & Hagedorn13'ün neden olduğu antraknozun ortaya çıkışıdır.Hastalığın ilk raporları Brezilya ve Amerika Birleşik Devletleri'nden geldi ve tipik semptomlar sırasıyla 1912 ve 1929'da ortaya çıktı.Bununla birlikte, yaklaşık 30 yıl sonra, patojen Colletotrichum gloeosporioides (Penz.) Penz olarak belirlendi. & Sacc., teleomorf Glomerella cingulata (Taş Adam) Spauld. & Sacc., teleomorf Glomerella cingulata (Taş Adam) Spauld. & Sacc., телеоморф Glomerella cingulata (Taş Adam) Spauld. & Sacc., Glomerella cingulata (Taş Adam) Spauld'un teleomorfu. & Sacc., Glomerella cingulata (Taş Adam) Spauld. & Sacc., Glomerella cingulata (Taş Adam) Spauld. & Sacc., Glomerella cingulata (Stoneman) Spauld в Целенаправленной морфологии. & Sacc., Hedeflenen Morfolojide Glomerella cingulata (Taş Adam) Spauld. & H. Schrenk,. & H. Schrenk, .ve H. Schrenk. & H.施伦克. & H.施伦克.ve H. Schlenk, .20. yüzyılın ortalarında yapılan ön hastalık fenotiplemesi, NLL ve sarı acı bakla (L. luteus L.) çeşitlerinde bir miktar direnç gösterdi, ancak test edilen tüm beyaz acı bakla (L. albus L.) çeşitleri oldukça duyarlıydı15,16.Çalışmalar, antraknoz gelişiminin artan yağış (hava nemi) ve sıcaklık (12-28°C aralığında) ile ilişkili olduğunu ve bunun daha yüksek sıcaklıklarda direncin ihlaline yol açtığını göstermiştir17, 18. Aslında, konidianın çimlenmesi ve hastalığın başlaması için gereken süre, 24°C'de (4 saat), yüksek nemli koşullarda 12°C'ye (16 saat) göre dört kat daha kısaydı19.Böylece devam eden küresel ısınma antraknozun yayılmasına neden olmuştur.Bununla birlikte, hastalık Fransa'da (1982) ve Ukrayna'da (1983) yaklaşmakta olan bir tehdidin habercisi olarak görüldü, ancak görünüşe göre o sırada acı bakla endüstrisi tarafından görmezden gelindi20,21.Birkaç yıl sonra, bu yıkıcı hastalık tüm dünyaya yayıldı ve aynı zamanda Avustralya, Polonya ve Almanya22,23,24 gibi acı bakla üreten başlıca ülkeleri de etkiledi.1990'ların ortasındaki bir antraknoz salgınının ardından, kapsamlı tarama, NLL19 numunelerinde birkaç dirençli donörün tanımlanmasıyla sonuçlandı.Antraknoza karşı NLL direnci, farklı germplazm kaynaklarında bulunan iki ayrı baskın alel tarafından kontrol edilir: Tanjil çeşidinde Lanr1 ve kültivarında Wonga ve AnMan.Mandalay 25, 26. Bu aleller, üreme programlarında dirençli germplazma seçimini destekleyen moleküler belirteçleri tamamlar25,26,27,28,29,30.Lanr1 aleli taşıyan dirençli üreme hattı 83A:476, duyarlı vahşi hat P27255 ile çaprazlanarak antraknoz direnci için ayrılan bir RIL popülasyonu elde edildi; (NLL-11), ancak farklı pozisyonlarda29,34,35.Bununla birlikte, az sayıda RIL ve belirteçler ile karşılık gelen aleller arasındaki büyük genetik mesafe nedeniyle, bunların altında yatan genler hakkında güvenilir sonuçlar çıkarılamaz.Öte yandan, acı baklalarda ters genetiğin kullanılması, çok düşük rejenerasyon potansiyelleri nedeniyle zordur, bu da genetik manipülasyonu külfetli hale getirir37.
83A:476 (Lanr1) ve Mandelup (AnMan) gibi istenen aleli homozigot durumda taşıyan evcilleştirilmiş germplazmanın gelişimi, vahşi popülasyonlarda alellerin karşıt kombinasyonlarının varlığı karşısında antraknoz direncini incelemeye kapı açmıştır.Moleküler mekanizmaların olasılıkları.Belirli genotipler tarafından üretilen savunma yanıtlarını karşılaştırın.Bu çalışma, NLL'nin C. lupini aşılamasına erken transkriptom yanıtını değerlendirdi.İlk olarak, 215 çizgi içeren bir Avrupa NLL germplazm paneli, Lanr1 ve AnMan alellerini işaretleyen moleküler işaretleyiciler kullanılarak tarandı.Antraknoz fenotiplemesi daha sonra önceden moleküler işaretçiler için seçilen 50 NLL hattı üzerinde kontrollü koşullar altında gerçekleştirildi.Bu deneylere dayanarak, antraknoz direncinde ve Lanr1/AnMan alelik bileşiminde farklılık gösteren dört hat, iki tamamlayıcı yaklaşım kullanılarak diferansiyel savunma gen ekspresyonu profili için seçildi: yüksek verimli RNA dizileme ve gerçek zamanlı PCR ölçümü.
Lanr1 (Anseq3 ve Anseq4) ve AnMan (Anseq4) ve AnMan (AnManM1) belirteçleri ile bir dizi NLL germplazmının (N = 215) taranması, yalnızca bir satırın (95726, Salamanca-b yakınında) tüm belirteçler için "direnç" alelini yükselttiğini gösterirken, "'duyarlı' alellerin varlığı" 158'de (~73) tüm belirteçlerin oranını buldu .5% satırları.On üç sıra, Lanr1 markörünün iki "dirençli" aleli üretti ve 8 sıra, Lanr1'in "dirençli" aleli üretti.işaretleyici.AnMan işaretleyicisinin "direnç" aleli (Ek Tablo S1).Anseq3 markörü için iki hat heterozigot ve AnManM1 markörü için bir heterozigottu.42 sıra (%19,5) Anseq3 ve Anseq4 alellerinin zıt fazlarını taşıdı ve bu iki lokus arasında yüksek bir rekombinasyon sıklığına işaret ediyor.Kontrollü koşullar altındaki antraknoz fenotipleri (Ek Tablo S2), antraknozun şiddetine yansıyan, test edilen genotiplerin direncinde değişkenlik gösterdi.Ortalama puanlardaki farklılıklar 1.8 (orta derecede dirençli) ila 6.9 (hassas) arasında ve bitki ağırlığı farklılıkları 0.62 (hassas) ila 4.45 g (dirençli) arasında değişmiştir. Deneyin iki tekrarında gözlemlenen değerler arasında (hastalık şiddet skorları için 0.51, bitki ağırlığı için P = 0.00017 ve 0.61, P < 0.0001) ve bu iki parametre arasında (- 0.59 ve - 0.77, P < 0.0001) anlamlı bir korelasyon vardı. Deneyin iki tekrarında gözlemlenen değerler arasında (hastalık şiddet skorları için 0.51, bitki ağırlığı için P = 0.00017 ve 0.61, P < 0.0001) ve bu iki parametre arasında (- 0.59 ve - 0.77, P < 0.0001) anlamlı bir korelasyon vardı. Выявлена ​​​​достоверная корреляция между значениями, наблюдаемыми в двух повторностях эксперимента (0,51 для баллов) тяжести болезни, P = 0,00017 и 0,61 для массы растения, P < 0,0001), ve также между этими двумя параметрами (-0,59 и -0,77, Р < 0,0001) 0,0001). Deneyin iki tekrarında gözlemlenen değerler arasında (hastalık şiddet skorları için 0.51, bitki ağırlığı için P = 0.00017 ve 0.61, P < 0.0001) ve ayrıca bu iki parametre arasında (- 0.59 ve -0.77, P < 0.0001) 0.0001) anlamlı bir korelasyon bulundu.0.51, P = 0.00017, 植0.61，P < 0.0001）以及这两个参数之间（- 0.59 和- 0.77，P < 0.0001)。0.5 1 ， p = 0.00017 ， 植物 为 为 0.61 ， p <0.0001） 以及 两 个 参数 之间 （（（（- 0.59 和– 0.59 和– 0.59 0.59 和- 0.77，P < 0.0001)。 Наблюдалась значительная корреляция между значениями, наблюдаемыми в двух повторностях (оценка тяжести за) Değerler 0,51, P = 0,00017 ve büyük oranlar 0,61, P <0,0001), ve ayar parametreleri (-0,59 ve -0,0001) 0,77, P <0,0001. Çift olarak gözlemlenen değerler arasında (hastalık şiddet skoru 0.51, P = 0.00017 ve bitki ağırlığı 0.61, P < 0.0001) ve bu iki parametre arasında (-0.59 ve -0 .0001) 0.77, P<0.0001 arasında anlamlı bir korelasyon vardı. ).Duyarlı bitkilerde görülen tipik semptomlar, sapın bir “çoban yayı” yapısına benzeyen bükülmesini ve bükülmesini, ardından turuncu/pembe sporozoitlerle oval lezyonları içerir (Ek Şekil 1).Lanr1 (83A:476 ve Tanjil) ve AnMan (Mandelup) genlerini taşıyan Avustralya türleri orta derecede dirençlidir, 0,0331 ve 0,0036)."Dirençli" Lanr1 ve/veya AnMan alellerini de taşıyan bazı soylar, hastalığın belirtilerini gösterir.
İlginç bir şekilde, herhangi bir "dirençli" işaret aleli içermeyen birkaç NLL hattı, yüksek seviyede antraknoz direnci (Lanr1 veya AnMan genotipleriyle karşılaştırılabilir veya daha yüksek) ortaya çıkardı; örneğin, Boregine (her iki parametre için P değeri < 0.0001), Bojar (puan için P değeri < 0.0001 ve bitki ağırlığı için 0.001) ve Popülasyon B-549/79b (skor ve işaretsizlik için P değeri < 0.0001) ağırlık için önemli). İlginç bir şekilde, herhangi bir "dirençli" işaret aleli içermeyen birkaç NLL hattı, yüksek seviyede antraknoz direnci (Lanr1 veya AnMan genotipleriyle karşılaştırılabilir veya daha yüksek) ortaya çıkardı; örneğin, Boregine (her iki parametre için P değeri < 0.0001), Bojar (puan için P değeri < 0.0001 ve bitki ağırlığı için 0.001) ve Popülasyon B-549/79b (skor ve işaretsizlik için P değeri < 0.0001) ağırlık için önemli). Интересно, что несколько линий NLL, лишенных какого-либо «резистентного» маркерного аллеля, показали высокий уровень устойчивости к антракнозу (сопоставимый или более высокий, чем для генотипов Lanr1 veya AnMan), таких как Boregine (значение P <0,0001) значение значение для оценки и 0,001 для массы растения) ve популяции B-549/79b (значение P <0,00) 01 Ocak'ta ve En Büyük Haftada). İlginç bir şekilde, herhangi bir "dirençli" işaret aleli içermeyen birkaç NLL çizgisi, Boregine (her iki parametre için P değeri < 0.0001), Bojar (değerlendirme için P değeri < 0.0001 ve bitki ağırlığı için 0.001) ve popülasyon B-549/79b (değerlendirme için P değeri < 0.0001 ve anlamlı değil) gibi antraknoza karşı yüksek düzeyde direnç gösterdi (Lanr1 veya AnMan genotipleriyle karşılaştırılabilir veya daha yüksek) ağırlık için).Lanr1 或AnMan基因型相当或更高）,例如Boregine（两个参数的P 值< 0,0001）,Bojar（P 值<得分为0,0001,植物重量为0,001 ）B-549/79b（得分P 值< 0.0001，重量不显着）Önemli. Boregine (her iki parametre de P < 0.0001), Bojar (P değeri < 0.0001, bitki ağırlığı 0.001) ve B-549/79b suşu (P değeri < 0.0001, ağırlık anlamlı değil) gibi "antijenik" belirteçleri olmayan bazı NLL sistemlerinin yüksek yatay direnç (Lanr1 veya AnMan genlerine eşdeğer veya daha yüksek) göstermesi ilginçtir. Интересно, что некоторые линии NLL, лишенные каких-либо маркерных аллелей «резистентности», показали высокие уров ни устойчивости к антракнозу (сравнимые или выше, чем у генотипов Lanr1 veya AnMan), такие как Boregine (значение P для обоих параметров) <0,0001), Bojar (значение P <0,0001, масса растения 0,001) ve популяция B-549/79b (оценка P-значение <0,0001, масса незначительна ). İlginç bir şekilde, herhangi bir 'direnç' işaretleyici aleli olmayan bazı NLL hatları, Boregine (her iki parametre için P değeri <0.0001), Bojar (P değeri < 0.0001, bitki ağırlığı 0.001) ve popülasyon B-549/79b (P değeri < 0.0001, ağırlık önemli değil) gibi yüksek düzeyde antraknoz direnci (Lanr1 veya AnMan genotipleriyle karşılaştırılabilir veya daha yüksek) gösterdi.Bu fenomen, yeni bir genetik direnç kaynağı olasılığını düşündürerek, belirteç genotipleri ile hastalık fenotipleri arasında gözlemlenen korelasyon eksikliğini açıklar (P değerleri ~0.42 ila ~0.98).Bu nedenle, Kolmogorov-Smirnov testi, antraknoz direncine ilişkin verilerin, puanlar (P değerleri 0.25 ve 0.11) ve bitki kütlesi (P değerleri 0.47 ve 0.55) için yaklaşık olarak normal bir şekilde dağıldığını gösterdi;
Antraknoz direnç taramasının sonuçlarına göre, transkriptom analizi için 4 hat seçildi: 83A:476, Boregine, Mandelup ve Population 22660. Bu hatlar, önceki testtekiyle aynı olmaları koşuluyla, RNA dizilimi ile aşılama deneylerinde şarbon direnci açısından yeniden test edildi.Puan değerleri ise şöyle oldu: Boregin (1,71±1,39), 83A: 476 (2,09±1,38), Mandelup (3,82±1,42) ve nüfus 22660 (6,11±1,29).
Illumina NovaSeq 6000 protokolü, numune başına ortalama 40,5 Mread çifti elde etti (29,7 ila 54,4 Mreads) (Ek Tablo S3).Referans dizideki hizalama puanları %75,5 ile %88,6 arasında değişmektedir.Biyolojik kopyalar arasındaki deneysel varyantlar arasındaki okuma sayısı verilerinin ortalama korelasyonu 0,812 ila 0,997 (ortalama 0,959) arasında değişmektedir. Analiz edilen 35.170 genden 2917'si ifade göstermedi ve diğer 4785 gen ihmal edilebilir düzeyde ifade edildi (temel ortalama < 5). Analiz edilen 35.170 genden 2917'si ifade göstermedi ve diğer 4785 gen ihmal edilebilir düzeyde ifade edildi (temel ortalama < 5). 35 170 Ekim'de 2917'de ilk kez, 4785'te ilk kez ительном уровне (базовое среднее <5). Analiz edilen 35.170 genden 2917'si ifade göstermedi ve geri kalan 4785 gen ihmal edilebilir düzeyde ifade edildi (temel ortalama <5).Daha fazla bilgi值< 5)。35.170 35 170 Ekim 2917'de 2917 Ekim'de, 4785'te 4785'te ию (базовое среднее значение <5). Analiz edilen 35.170 genden 2917'si ifade edilmedi ve geri kalan 4785 gen ihmal edilebilir düzeyde ifadeye sahipti (baz ortalama <5).Bu nedenle, deney sırasında ifade edildiği düşünülen genlerin sayısı (temel ortalama ≥ 5) 27.468'dir (%78.1) (Ek Tablo S4).
İlk zaman noktasından itibaren tüm NLL hatları, transkriptomu yeniden programlayarak (Tablo 1) C. lupini'nin (Col-08 suşu) aşılanmasına yanıt verdi, ancak hatlar arasında önemli farklılıklar gözlendi.Böylece, direnç çizgisi 83A:476 (Lanr1 genini taşıyan), bu zaman noktasındaki diğer zaman noktalarına kıyasla izole edilmiş yukarı ve aşağı genlerin sayısında 31-69 kat artışla ilk zaman noktasında (6 hpi) önemli transkriptom yeniden programlaması gösterdi.Ek olarak, ikinci zaman noktasında (12 hpi) yalnızca birkaç genin ifadesi önemli ölçüde değiştirilmiş kaldığından, bu zirve kısa sürdü.İlginç bir şekilde, aşılama testinde de yüksek düzeyde direnç gösteren Boregine, deney sırasında bu kadar büyük transkripsiyonel yeniden programlamaya tabi tutulmadı.Ancak diferansiyel olarak eksprese edilen genlerin (DEG) sayısı, 12 HPI'de Boregine ve 83A:476 için aynıydı.Hem Mandelup hem de 22660 popülasyonu, son zaman noktasında (48 l/s) DEG zirveleri gösterdi ve bu, savunma tepkilerinde göreli bir gecikmeye işaret ediyor.
83A:476, diğer tüm hatlara kıyasla 6 HPI'de C. lupini'ye yanıt olarak yoğun transkriptom yeniden programlamaya tabi tutulduğu için, bu zaman noktasında gözlemlenen DEG'lerin ~%91'i soy-spesifikti (Şekil 1).Bununla birlikte, Boregine, Mandelup ve popülasyon 22660'ta sırasıyla %68.5, %50.9 ve %52.6 DEG olarak, çalışma satırları arasında erken yanıtlarda bir miktar örtüşme vardı ve zamanın belirli noktalarında 83A:476'da bulunanlarla örtüşüyordu.Ancak, bu DEG'ler şu anda 83A:476 kullanılarak tespit edilen tüm DEG'lerin yalnızca küçük bir bölümünü (%0,97-1,70) oluşturuyordu.Ek olarak, bitki savunma tepkilerinin ortak bileşenleri dahil olmak üzere tüm hatlardan 11 DEG şu anda tutarlıydı (Ek Tablolar S4-S6): lipid transfer proteini (TanjilG_32225), endoglukan-1,3-β-glukozit enzimi (TanjilG_23384), SAM22 (TanjilG_31528 ve TanjilG_31531) gibi iki stresle indüklenebilir protein, temel lateks proteini (TanjilG_32352) ve iki glisin açısından zengin yapısal hücre duvarı proteini (TanjilG_19701 ve TanjilG_19702).Ayrıca, 24 HPI'de (toplam %16-38 DEG) 83A:476 ve Boregine arasında ve 48 HPI'de (toplam %14-20 DEG) Mandelup ve Nüfus 22660 arasında transkriptom yanıtlarında nispeten yüksek bir örtüşme vardı.
Colletotrichum lupini (Wierzhenice, Polonya, 1999'daki acı bakla tarlalarından elde edilen Col-08 suşu) ile aşılanmış dar yapraklı acı bakla (NLL) hatlarında diferansiyel olarak ifade edilen genlerin (DEG) sayısını gösteren Venn diyagramı.Analiz edilen NLL hatları şunlardı: 83A:476 (dirençli, Lanr1 aleli taşıyan), Boregine (dirençli, genetik arka plan bilinmiyor), Mandelup (orta derecede dirençli, AnMan aleli taşıyan) ve popülasyon 22660 (çok duyarlı).Hpi kısaltması aşılamadan sonraki saatleri ifade eder.Grafiği basitleştirmek için sıfır değerleri kaldırıldı.
6 hpi'de aşırı eksprese edilmiş gen seti, kanonik R gen alanlarının varlığı açısından analiz edildi (Ek Tablo S7).Bu çalışma, yalnızca 83A:476'da NBS-LRR alanlarıyla klasik hastalık direnci genlerinin transkriptom indüksiyonunu ortaya çıkardı.Bu set bir TIR-NBS-LRR geni (tanjilg_05042), beş CC-NBS-LRR geni (tanjilg_06165, tanjilg_06162, tanjilg_22773, tanjilg_22640 ve tanjilg_16162) ve Dört NBS-LR, Tanjilg_16162) ve Dört NBS-LRRE'den (tanjilg) oluşuyordu _16162) ve ayrıca Dört NBS-Lrr (tanjilg_16162) ve Dört NBS-LRR (TANJILG_16162).Bu genlerin tümü, korunmuş dizilerde düzenlenmiş kanonik alanlara sahiptir.NBS-LRR alan genlerine ek olarak, 6 hpi'de, yani iki hpi'de (tanjilg_19877), tanjilg_07141 ve tanjilg_19877) ve 22660'da (tanjilg_09014 ve tanjilg_11360) (tanjilg_014 ve tanjilg_11) aktive edildi.
C. lupini (Col-08 suşu) ile aşılamaya yanıt olarak ekspresyonu önemli ölçüde değiştirilmiş genler, Gen Ontolojisi (GO) zenginleştirme analizine (Ek Tablo S8) tabi tutuldu. En sık aşırı temsil edilen biyolojik süreç terimi, yüksek öneme sahip (P değeri < 0.001) 16 kombinasyondan 6'sında (zaman × çizgi) ortaya çıkan “GO:0006952 savunma yanıtı” idi (Şekil 2). En sık aşırı temsil edilen biyolojik süreç terimi, yüksek öneme sahip (P değeri < 0.001) 16 kombinasyondan 6'sında (zaman × çizgi) ortaya çıkan “GO:0006952 savunma yanıtı” idi (Şekil 2). «GO: 0006952 защитный ответ», ко торый появлялся в 6 из 16 (время × линия) комбинаций с высокой значимостью (значение P <0,001) (рис. 2). En sık aşırı temsil edilen biyolojik süreç terimi, yüksek öneme sahip (P değeri < 0.001) 16 kombinasyonun 6'sında (zaman × soy) ortaya çıkan 'GO:0006952 savunma yanıtı' idi (Şekil 2).最常被过度代表的生物过程术语是“GO:0006952 防御反应”，它出现在16 个（时间×线）组合中的6个中，具有高显着性（P 值< 0.001）（图2）。 En temsili biyolojik süreç terimi, 16 kombinasyonun 6'sında (时间×线) görülen ve yüksek öneme sahip (P değeri < 0,001) (图2) olan "GO:0006952 savunma yanıtı"dır. «GO: 0006952 Defence Response», который появлял ся в 6 из 16 комбинаций (время × line) с высокой значимостью (значение P <0,001) (рис. 2). En sık aşırı temsil edilen biyolojik süreç terimi, 16 kombinasyondan 6'sında (zaman × çizgi) ortaya çıkan ve yüksek öneme sahip (P değeri < 0.001) olan 'GO:0006952 Savunma Tepkisi' idi (Şekil 2).Bu terim, 83A'da iki zaman noktasında aşırı temsil edildi: 476 ve Boregine (6 ve 24 hpi) ve bir zaman noktasında Mandelup ve Population 22660'ta (sırasıyla 12 ve 6 hpi).Bu, dirençli hatların antifungal tepkisini vurgulayan, beklenen bir sonuçtur.Ek olarak, 83A:476, C. lupini'ye, "GO:0055114 redoks işlemi" terimi ile temsil edilen oksidatif patlamayla ilgili genleri hızla indükleyerek yanıt verdi ve bu, belirli bir savunma tepkisini gösterirken, Boregine, "GO" terimiyle ilgili belirli savunma tepkilerini ortaya çıkardı.:0006950 Stres tepkisi”.Popülasyon 22660, ikincil metabolitleri içeren yatay direnç tepkisini etkinleştirdi ve GO terimi zenginleştirme analizinin sonuçlarını dikkate alarak "GO:0016104 Triterpen biyosentezi süreci" ve "GO:0006722 Triterpen metabolizması süreci" (her iki terim de aynı gen grubuna aittir) terimlerinin aşırı sayısını vurgulayarak, Mandelup reaksiyonu stabilitesi Boregine ve Popülasyon 22660 arasındaydı. Ek olarak, erken reaksiyon 83A: 476 (6 hpi) ve gecikmeli reaksiyon Mandelup ve Population 22660, GO:0015979 "fotosentez" terimini ve diğer ilgili biyolojik süreçleri içerir.
Şarbonlu acı bakla (1999'da Polonya, Wierzhenice'deki acı bakla tarlalarından elde edilen Col-08 suşu) ile aşılanmış dar yapraklı acı baklanın (NLL) transkriptom tepkileri sırasında diferansiyel olarak ifade edilen genlerin notunda seçilen biyoproses gen ontolojisi terimleri büyük ölçüde abartılmıştır.Analiz edilen NLL hatları şunlardı: 83A:476 (dirençli, homozigot Lanr1 aleli taşıyan), Boregine (dirençli, bilinmeyen genetik arka plan), Mandelup (orta derecede dirençli, homozigot AnMan aleli taşıyan) ve popülasyon 22660 (hassas).
Bu çalışma, antraknoz direncine katkıda bulunan genleri belirlemeyi amaçladığından, GO “GO: 0006952 Defensive responses” ve “GO: 0055114 Redox processs” terimlerine atanan genler, en az bir satırla temel ortalama ≥ 30 olduğundan, kesme değerleri ile analiz edildi.× log2'nin istatistiksel olarak anlamlı değerlerini birleştiren zaman noktası (kat değişimi).Bu kriterleri karşılayan gen sayısı GO:0006952 için 65 ve GO:0055114 için 524 idi.
83A:476, GO:0006952 terimi ile açıklamalı iki DEG tepesi ortaya çıkardı, ilki inç başına 6 gen (64 gen, yukarı ve aşağı düzenleme) ve ikincisi inç başına 24 gen (yalnızca 15 gen, yukarı düzenleme).Boregine ayrıca GO:0006952'nin aynı zaman noktasında zirveye ulaştığını, ancak daha az DEG (11 ve 8) ve tercihli aktivasyon ile gösterdi.Mandeloop, 12 ve 48 HPI'de iki GO:0006952 zirvesi gösterdi, her ikisi de 12 gen taşıyor (birincisi aktive edici genlere sahip ve ikincisi sadece baskılayıcı genlere sahip), 6 HPI'deki (13 gen) 22660 popülasyonu ise artış zirvesinde daha büyük bir baskınlığa sahipti.düzenleme.Bu tepe noktalarında GO:0006952 DEG'nin %96,4'ünün aynı tipte yanıta (yukarı veya aşağı) sahip olduğu ve ilgili genlerin sayısındaki farklılıklara rağmen savunma yanıtlarında önemli bir örtüşmeye işaret ettiği belirtilmelidir.GO:0006952 terimiyle ilgili en büyük dizi grubu, sınıf 10 patogenezle ilişkili protein (PR-10) protein sınıfına ve çekirdek protein lateksine ait olan Açlık Stresiyle İlişkili Mesaj Proteini 22'yi (SAM22 benzeri) kodlar.benzer (MLP benzeri) protein) protein (Şekil 3).İki grup, ifadenin doğası ve tepkinin yönü bakımından farklılık gösteriyordu.SAM22 benzeri proteinleri kodlayan genler, erken zaman noktalarında (6 veya 12 hpi) tutarlı ve önemli indüksiyon gösterdi ve genellikle deneyin sonunda (48 hpi) tepkisiz kaldı, MLP benzeri proteinler ise 6 hpi'de koordinasyon gösterdi.hpi.83A:476 ve Mandelup 48 hp/in'de, neredeyse tüm diğer veri noktaları yanıt vermiyordu.Ek olarak, SAM22 benzeri protein genlerinin ekspresyon profillerindeki farklılıklar, antraknoz direncinde gözlemlenen değişkenliği takip etti, çünkü daha dirençli hatlar, daha duyarlı genlere göre bu genleri önemli ölçüde indükleyen daha fazla zaman noktasına sahipti.Başka bir LlR18A/B benzeri PR-10 geni, SAM22 benzeri protein genine çok benzer bir ifade modeli gösterdi.
Biyolojik süreç terimi "GO:0006952 Savunma Tepkisi"nin ana bileşenleri ve Lanr1 ve AnMan alellerinin aday genlerinin ifade kalıpları belirlendi.Log2 ölçeği, aynı zaman noktasında aşılanmış (Colletotrichum lupini, acı bakla tarlalarından elde edilen Colletotrichum lupini, Col-08 suşu, Wizhenica, Polonya, 1999) ve kontrol (sahte aşılanmış) bitkiler arasındaki log2 değerlerini (kat değişimi) temsil eder.Aşağıdaki dar yapraklı acı bakla hatları analiz edildi: 83A:476 (dirençli, homozigot Lanr1 aleli taşıyan), Boregine (dirençli, genetik arka plan bilinmiyor), Mandelup (orta derecede dirençli, homozigot AnMan aleli taşıyan) ve Popülasyon 22660 (hassas).
Ek olarak, RNA-seq aday genleri Lanr1 (TanjilG_05042) ve AnMan'in (TanjilG_12861) ekspresyon profilleri değerlendirildi (Şekil 3).TanjilG_05042 geni, yalnızca ilk zaman noktasında (6 hpi) 83A:476'da önemli bir yanıt (aktivasyon) gösterirken, TanjilG_12861 Mandeloop'ta yalnızca iki zaman noktasında önemliydi: 6 hpi (aşağı düzenleme) ve 24 hpi (6 hpi).İle.).ayarlanabilir) ).
GO:0055114 "redoks işlemi" teriminde en fazla eksprese edilen genler, sitokrom P450 proteinlerini ve peroksidazı kodlayan genlerdi (Şekil 4).83A:476'dan 6 HPI'de izole edilen numuneler için, maksimum veya minimum log2 (kat değişimi) değerleri (genlerin %86,6'sı için) genel olarak aşılanan ve kontrol bitkileri arasında gözlendi ve bu genotipin aşılama cinsiyetine yüksek tepkisini vurguladı.83A:476, 6 hpi'de (503 gen) en anlamlı GO: 0055114 DEG'i gösterirken, hatların geri kalanı 48 hpi'de (Boregine, 31 gen; Mandelup, 85 gen; ve Popülasyon 22660, 78 gen)).GO:0055114 ailesinin çoğu geninde aşılamaya karşı iki tür yanıt (aktivasyon ve inhibisyon) gözlendi.İlginç bir şekilde, 48 hp'de Mandelupe'de GO: 0055114 terimi için tanımlanan DEG'lerin %97,6'sına kadar.Boregine ve Population 22660'ta bu yakınsama sırasıyla %51,6 ve %75,6 ile daha düşüktür.
Biyolojik süreç “GO:0055114 Redoks süreci” teriminin ana bileşenlerinin ifade kalıpları ortaya çıkarıldı.Log2 ölçeği, aynı zaman noktasında aşılanmış (Colletotrichum lupini, acı bakla tarlalarından elde edilen Colletotrichum lupini, Col-08 suşu, Wizhenica, Polonya, 1999) ve kontrol (sahte aşılanmış) bitkiler arasındaki log2 değerlerini (kat değişimi) temsil eder.Aşağıdaki dar yapraklı acı bakla hatları analiz edildi: 83A:476 (dirençli, homozigot Lanr1 aleli taşıyan), Boregine (dirençli, genetik arka plan bilinmiyor), Mandelup (orta derecede dirençli, homozigot AnMan aleli taşıyan) ve Popülasyon 22660 (hassas).
83A:476 C. lupini (Col-08 suşu) ile aşılamaya yönelik transkriptomik tepkiler ayrıca GO:0015979 "fotosentez" terimine ve diğer ilgili biyolojik süreçlere atfedilen genlerin koordineli susturulmasını da içerir (ŞEK. 5).Bu GO:0015979 DEG seti, 83A:476'da 6 hpi'de önemli ölçüde baskılanmış 105 gen içeriyordu.Bu alt kümede, her iki genotip için ortak olan 19 DEG dahil olmak üzere, 22660 popülasyonunda aynı zaman noktasında 35 ve 48 HPI'de Mandelup'ta 37 gen de aşağı regüle edildi.GO terimiyle ilgili hiçbir DEG: 0015979, herhangi bir kombinasyonda (satır x zaman) önemli ölçüde etkinleştirilmedi.
Biyolojik süreç “GO:0015979 Fotosentez” teriminin ana bileşenlerinin ifade kalıpları ortaya çıkarıldı.Log2 ölçeği, aynı zaman noktasında aşılanmış (Colletotrichum lupini, acı bakla tarlalarından elde edilen Colletotrichum lupini, Col-08 suşu, Wizhenica, Polonya, 1999) ve kontrol (sahte aşılanmış) bitkiler arasındaki log2 değerlerini (kat değişimi) temsil eder.Aşağıdaki dar yapraklı acı bakla hatları analiz edildi: 83A:476 (dirençli, homozigot Lanr1 aleli taşıyan), Boregine (dirençli, genetik arka plan bilinmiyor), Mandelup (orta derecede dirençli, homozigot AnMan aleli taşıyan) ve Popülasyon 22660 (hassas).
Diferansiyel ekspresyon analizinin sonuçlarına dayanarak ve muhtemelen patojenik mantarlara karşı savunma tepkilerinde yer alan bu yedi gen seti, gerçek zamanlı PCR ile ekspresyon profillerinin miktarının belirlenmesi için seçildi (Ek Tablo S9).
Varsayılan protein geni TanjilG_10657, kontrol (taklit) bitkileriyle karşılaştırıldığında incelenen tüm hatlarda ve zaman noktalarında önemli ölçüde indüklendi (Ek Tablolar S10, S11).Ayrıca, TanjilG_10657'nin ifade profili, tüm hatlar için deney boyunca artan bir eğilim gösterdi.Popülasyon 22660, TanjilG_10657'nin 114 kat aktivasyonla aşılamaya karşı en yüksek hassasiyetini ve 24 HPI'de en yüksek bağıl ifade seviyesini (4.4 ± 0.4) gösterdi (Şekil 6a).PR10 LlR18A protein geni TanjilG_27015 ayrıca tüm hatlar ve zaman noktalarında aktivasyon gösterdi ve çoğu veri noktasında istatistiksel anlamlılık gösterdi (Şekil 6b).TanjilG_10657'ye benzer şekilde, TanjilG_27015'in en yüksek bağıl ekspresyon seviyesi, 24 HPI'de (19,5 ± 2,4) 22660 aşılanmış popülasyonda gözlendi.Asit endokitinaz geni TanjilG_04706, Boregine 6 hpi hariç tüm hatlarda ve tüm zaman noktalarında önemli ölçüde yukarı regüle edildi (Şekil 6c).İlk zaman noktasında (6 HPI) 83A:476'da (10.5 kat) güçlü bir şekilde indüklendi ve diğer hatlarda orta derecede arttı (6.6-7.5 kat).Deney sırasında, TanjilG_04706'nın ifadesi 83A:476 ve Boregine'de benzer seviyelerde kalırken, Mandelup ve Popülasyon 22660'ta önemli ölçüde artarak nispeten yüksek değerlere ulaştı (sırasıyla 5.9 ± 1.5 ve 6.2 ± 1.5).Endoglukan-1,3-β-glukosidaz benzeri gen TanjilG_23384, popülasyon 22660 (Şekil 6d) hariç tüm hatlarda ilk iki zaman noktasında (6 ve 12 hpi) yüksek aktivasyon gösterdi.TanjilG_23384'ün en yüksek göreli ifade seviyeleri, Mandelup'ta (2,7 ± 0,3) ve 83A:476'da (1,5 ± 0,1) ikinci zaman noktasında (12 hpi) gözlendi.24 HPI'de TanjilG_23384 ifadesi, incelenen tüm hatlarda nispeten düşüktü (0,04 ± 0,009'dan 0,44 ± 0,12'ye).
Seçilen genlerin (ag) ifade profilleri kantitatif PCR ile ortaya çıkarılmıştır.6, 12 ve 24 sayıları aşılamadan sonraki saatleri temsil eder.Normalizasyon için LanDExH7 ve LanTUB6 genleri, seriler arası kalibrasyon için LanTUB6 kullanıldı.Hata çubukları, her biri üç teknik kopyanın ortalaması olan üç biyolojik kopyaya dayanan standart sapmayı temsil eder. Aşılanmış (Colletotrichum lupini, 1999'da Wierzenica, Polonya'daki acı bakla tarlasından elde edilen Colletotrichum lupini, Col-08 türü) ve kontrol (sahte aşılanmış) bitkileri arasındaki ifade seviyelerindeki farklılıkların istatistiksel önemi, veri noktalarının üzerinde işaretlenmiştir (*P değeri < 0,05, **P değeri ≤ 0,01, ***P değeri ≤ 0,001). Aşılanmış (Colletotrichum lupini, 1999'da Wierzenica, Polonya'daki acı bakla tarlasından elde edilen Colletotrichum lupini, Col-08 türü) ve kontrol (sahte aşılanmış) bitkileri arasındaki ifade seviyelerindeki farklılıkların istatistiksel önemi, veri noktalarının üzerinde işaretlenmiştir (*P değeri < 0,05, **P değeri ≤ 0,01, ***P değeri ≤ 0,001). Статистическая значимость различий уровнях экспрессии между инокулированными (Colletotrichum lupini, штамм Col-08, получен в 1) 999 г. анных (*значение P < 0,05, **значение P ≤ 0,01, ***значение P ≤ 0,001). Aşılanmış (Colletotrichum lupini, 1999'da Wierzhenice, Polonya'daki bir acı bakla tarlasından elde edilen Colletotrichum lupini, Col-08 türü) ve kontrol (sahte aşılanmış) bitkileri arasındaki ifade düzeylerinde istatistiksel olarak anlamlı farklılıklar, veri noktalarının üzerinde belirtilmiştir (*P değeri < 0,05, **P değeri ≤ 0,01, ***P değeri ≤ 0,001).接种（Colletotrichum lupini，Col-08株，1999年从波兰Wierzenica的羽扇豆田获得）和对照（模拟接种）植物之间表达水平差异的统计学显着性标记在数据点上方（*P值< 0.05, **P 值≤ 0.01, ***P 值≤ 0.001)。接种 （colletotrichum lupini ， color-08 株 ， 1999 年 波兰 波兰 wierzenica 的 羽扇 获得） 和 对照 （接种 植物 之间 水平 差异 的 统计学 显着性 标记 数据点 上方*p 值 <0,05, **P ≤ 0,01, ***P ≤ 0,001)。 Статистически значимые различия уровнях экспрессии между инокулированными (Colletotrichum lupini, штамм Col-08, полученный с) полей люпина в Верженице, Польша, 1999 г.) ve контрольными (ложно инокулированными) растениями отмечены над точк ами данных (* значение P < 0,05, ** P-значение ≤ 0,01, ***P-значение ≤ 0,001). Aşılanmış (Colletotrichum lupini, 1999'da Polonya, Verzhenice'deki acı bakla tarlalarından elde edilen Colletotrichum lupini, soy Col-08) ve kontrol (sahte aşılanmış) bitkiler arasındaki ifade düzeylerinde istatistiksel olarak anlamlı farklılıklar, veri noktalarının üzerinde belirtilmiştir (*P değeri < 0,05 , **P değeri ≤ 0,01, ***P değeri ≤ 0,001).Analiz edilen NLL hatları şunlardı: 83A:476 (dirençli, homozigot Lanr1 aleli taşıyan), Mandelup (orta derecede dirençli, homozigot AnMan aleli taşıyan), Boregine (dirençli, bilinmeyen genetik arka plan) ve popülasyon 22660 (hassas).
Lanr1 lokusundaki aday gen TanjilG_05042, RNA-seq çalışmalarından elde edilen profillerden belirgin şekilde farklı bir ifade modeli gösterdi (Şekil 6e).Mandelup ve 22660 popülasyonunda (sırasıyla 39,7 ve 11,7 kata kadar) bu genin önemli aktivasyonu gözlendi ve bu da nispeten yüksek ifade seviyeleriyle sonuçlandı (sırasıyla 1,4 ± 0,14 ve 7,2 ± 1,3'e kadar).83A:476 ayrıca TanjilG_05042 geninin bir miktar yukarı regülasyonunu (3,8 kata kadar) ortaya çıkardı, ancak elde edilen göreli ifade seviyeleri (0,044 ± 0,002), Mandelup ve 22660 popülasyonunda gözlemlenenlerden 30 kattan fazla daha düşüktü.qPCR ile analiz edildiğinde, sahte aşılanmış (kontrol) varyantlardaki genotipler arasındaki ekspresyon düzeylerinde önemli farklılıklar gösterildi; bu, 22660 ve 83A:476 popülasyonları ile 22660 ve 22660 popülasyonları arasında 58 kat farka ulaştı. Boregine ve Mandalup arasında iki kat fark elde edildi.
AnMan lokusundaki aday gen, TanjilG_12861, 83A:476 ve Mandelup'ta aşılamaya yanıt olarak aktive edildi, 22660 popülasyonunda nötrdü ve Boregine'de aşağı regüle edildi (Şekil 6f).TanjilG_12861 geninin bağıl ifadesi aşılanmış 83A'da en yüksekti: 476 (0.14±0.01).17.4 kDa sınıf I ısı şoku protein geni TanjilG_05080 HSP17.4, çalışılan tüm suşlarda ve zaman noktalarında daha düşük nispi ifade seviyeleri gösterdi (Şekil 6g).En yüksek değer 22660 popülasyonda 24 HPI'de gözlendi (0,14 ± 0,02, aşılamaya yanıtta sekiz kat artış).
Gen ekspresyon profillerinin karşılaştırılması (Şekil 7), TanjilG_10657 ve diğer dört gen arasında yüksek bir korelasyon ortaya çıkardı: TanjilG_27015 (r = 0.89), TanjilG_05080 (r = 0.85), TanjilG_05042 (r = 0.80) ve TanjilG_04706 (r = 0.79).Bu tür sonuçlar, savunma tepkileri sırasında bu genlerin birlikte düzenlenmesini gösterebilir.TanjilG_12861 ve TanjilG_23384 genleri, diğer genlere kıyasla daha düşük Pearson korelasyon katsayısı değerleri (sırasıyla 0,08'den 0,43'e ve -0,19'dan 0,28'e) ile farklı ifade profilleri gösterdi.
Gen ekspresyon profilleri arasındaki korelasyonlar kantitatif PCR kullanılarak tespit edildi.Aşağıdaki dar yapraklı acı bakla hatları analiz edildi: 83A:476 (dirençli, homozigot Lanr1 aleli taşıyan), Mandelup (orta derecede dirençli, homozigot AnMan aleli taşıyan), Boregine (dirençli, genetik arka plan bilinmiyor) ve Popülasyon 22660 (hassas).Aşılanmış (Colletotrichum lupini, 1999'da Polonya, Wierzhenice'deki acı bakla tarlalarından elde edilen Colletotrichum lupini, soy Col-08) ve kontrol (sahte aşılanmış) bitkiler dahil olmak üzere üç zaman noktası hesaplandı (aşılamadan 6, 12 ve 24 saat).Ölçek, Pearson korelasyon katsayısının değerini gösterir.
İnç başına 6 beygir gücünde elde edilen verilere dayanarak, WGCNA, erken savunma tepkilerine odaklanmak için aşılanmış ve kontrol bitkilerini karşılaştırarak tanımlanan 9981°'de gerçekleştirildi (Ek Tablo S12).Genotipler ve deneysel varyantlar arasında ilişkili (pozitif veya negatif) ekspresyon profilleri ile yirmi iki gen modülü (küme) bulundu. Ortalama olarak, gen ekspresyon seviyeleri 83A:476 > Mandelup > Boregine > Popülasyon 22660 sırasıyla azalıyordu (ancak her iki varyantta da, bu eğilim kontrol bitkilerinde daha güçlüydü). Ortalama olarak, gen ekspresyon seviyeleri 83A:476 > Mandelup > Boregine > Popülasyon 22660 sırasıyla azalıyordu (ancak her iki varyantta da, bu eğilim kontrol bitkilerinde daha güçlüydü). 83A:476 > Mandelup > Boregine > Nüfus 22660 (в обоих вариантах, однако, эта тенден) ция была сильнее у контрольных растений). Ortalama olarak, gen ekspresyon seviyeleri 83A:476 > Mandelup > Boregine > Popülasyon 22660 sırasıyla azaldı (ancak her iki varyantta da bu eğilim kontrol bitkilerinde daha güçlüydü).平均而言，基因表达水平按83A:476 > Mandelup > Boregine > Nüfus 22660在对照植物中更强）。平均 而 言 ， 基因 水平 按 按 83a: 476> mandelup> boregine> nüfus 22660 的 顺序 下降 （， 在 种 中 ， 这 种 在在 植物 中 更） В среднем уровни экспрессии генов снижались в ряду 83A:476 > Mandelup > Boregine > Population 22660 (однако в обоих вариантах эта тенденция) была сильнее у контрольных растений). Ortalama olarak, gen ekspresyon seviyeleri 83A:476 > Mandelup > Boregine > Population 22660 serisinde azaldı (ancak her iki varyantta da bu eğilim kontrol bitkilerinde daha güçlüydü).Aşılama, özellikle modül 18, 19, 14, 6 ve 1'de (azalan etki sırasına göre) gen ekspresyonunun yukarı regülasyonu, negatif düzenleme (örn. modül 9 ve 20) veya nötr etkilerle (örn. modül 11, 22, 8 ve 13) sonuçlandı.GO terimi zenginleştirme analizi (Ek Tablo S13), qPCR (TanjilG_04706, TanjilG_23384, TanjilG_10657 ve TanjilG_27015) tarafından analiz edilen genler ve birçok Aşılama en çok bastırılmış fotosentez modülü (9) tarafından analiz edilen genler dahil olmak üzere maksimum aktivasyona sahip aşılanmış modül (18) için "GO: 0006952 Koruyucu yanıtlar" ortaya çıkardı (9).Modül 18 yoğunlaştırıcı (Şekil 8), PR-10 benzeri LlR18B proteinini kodlayan TanjilG_26536 geni olarak tanımlandı ve modül 9 yoğunlaştırıcı, fotosistem II PsbQ proteinini kodlayan TanjilG_28955 geni olarak tanımlandı.Bir aday antraknoz direnç geni Lanr1, TanjilG_05042, modül 22'de bulundu (Şekil 9) ve TanjilG_01212 merkezini taşıyan "GO:0044260 Hücresel makromoleküler metabolik süreçler" ve "GO:0006355 Transkripsiyonel düzenleme, DNA şablonu oluşturma" terimleriyle ilişkilidir.gen, ısı stresi transkripsiyon faktörü A-4a'yı (HSFA4a) kodlar.
Aşırı temsil edilen biyolojik süreç terimleri "GO: 0006952 Savunma yanıtları" ile modüllerin gen ortak ifadesinin ağırlıklı ağ analizi.Ligasyon, qPCR (TanjilG_04706, TanjilG_23384, TanjilG_10657 ve TanjilG_27015) tarafından analiz edilen dört geni vurgulamak için basitleştirildi.
"GO: 0006355: Transkripsiyonel düzenleme, DNA şablonu oluşturma" ve aşırı temsil edilen bir biyolojik işlem terimi olan ve bir aday antraknoz direnç geni Lanr1 TanjilG_05042 taşıyan bir modülün gen ortak ifadesinin ağırlıklı ağ analizi.TanjilG_05042 genini ve merkezi TanjilG_01212 genini izole etmek için ligasyon basitleştirildi.
Avustralya'da toplanan antraknoz direnç taraması, erken salınan çeşitlerin çoğunun duyarlı olduğunu gösterdi;Kalya, Coromup ve Mandelup orta derecede dirençli olarak tanımlanırken, Wonga, Tanjil ve 83A:476 oldukça dirençli olarak tanımlanmıştır26,27,31.Lanr1 olarak adlandırılan aynı direnç aleline sahipti ve Coromup ve Mandelup, AnMan10, 26, 39 olarak adlandırılan farklı bir alele sahipken, Kalya farklı bir aleli aktardı., Lanr2.Almanya'da antraknoz direnci için tarama, Lanr1 dışında LanrBo36 olarak adlandırılan bir aday alel ile dirençli bir hat Bo7212'nin tanımlanmasıyla sonuçlandı.
Çalışmamız, test edilen germplazmda Lanr1 alelinin çok düşük bir frekansını (yaklaşık %6) ortaya çıkardı.Bu gözlem, Lanr1 alelinin yalnızca iki Beyaz Rusya soyunda bulunduğunu gösteren Anseq3 ve Anseq4 belirteçleri kullanılarak Doğu Avrupa germplazmasının taranmasının sonuçlarıyla tutarlıdır.Bu, Lanr1 alelinin, marker destekli üreme için anahtar alellerden biri olduğu Avustralya'nın aksine, yerel yetiştirme programları tarafından henüz yaygın olarak kullanılmadığını göstermektedir.Bunun nedeni, Avustralya raporuna kıyasla Avrupa saha koşullarında Lanr1 aleli tarafından sağlanan daha düşük direnç seviyesi olabilir.Ek olarak, Avustralya'daki yüksek yağış alan bölgelerdeki antraknoz çalışmaları, Lanr1 alelinin aracılık ettiği direnç tepkilerinin, patojenin büyümesini ve hızlı gelişimini destekleyen hava koşullarında etkili olmayabileceğini göstermiştir19,42.Aslında, bu çalışmada, Lanr1 aleli taşıyan genotiplerde antraknozun bazı semptomlarının da gözlenmesi, C. lupini'nin gelişimi için en uygun koşullar altında direncin ortadan kalkabileceğini düşündürmektedir.Ek olarak, Lanr1 lokusundan yaklaşık 1 cM uzaklıktaki Anseq3 ve Anseq4 belirteçlerinin varlığına ilişkin yanlış pozitif yorumlar mümkündür28,30,43 .
Çalışmamız, Lanr1 aleli taşıyan 83A:476'nın, analiz edilen ilk zaman noktasında (6 hpi) büyük ölçekli transkriptom yeniden programlaması ile C. lupini aşılamasına yanıt verdiğini, AnMan aleli taşıyan Mandelup'ta ise transkriptomik tepkilerin çok daha sonra gözlemlendiğini gösterdi.(24 ila 48 hp arası).Savunma yanıtlarındaki bu geçici varyasyonlar, hastalık semptomlarındaki farklılıklarla ilişkilidir ve bu da, dirence başarılı bir yanıt için erken patojen tanımanın önemini vurgulamaktadır.Bitki dokusunu enfekte etmek için, şarbon sporlarının konak yüzeyinde çimlenme, hücre bölünmesi ve bir apresoryum oluşumu dahil olmak üzere çeşitli gelişim aşamalarından geçmesi gerekir.Ek, konağın yüzeyine yapışan ve konakçı dokulara penetrasyonu kolaylaştıran enfektif bir yapıdır.Böylece, bezelye ekstraktındaki C. gloeosporioides sporları, 75-90 dakikalık inkübasyondan sonra çekirdeğin ilk bölünmesini, 90-120 dakikalık inkübasyondan sonra germ tüpünün oluşumunu ve 4 saatin ardından baskılanmayı gösterdi45.Mango C. gloeosporioides, 3 saatlik inkübasyondan sonra %40'tan fazla konidial çimlenme ve 4 saat sonra yaklaşık %20 oranında apresör oluşumu gösterdi.C. gloeosporioides'in virülansla ilişkili CAP20 geni, 4 saat 46 dakika sonra yüksek konsantrasyonlarda CAP20 proteini içeren avokado yüzey mumunda 3.5 saat inkübasyondan sonra epifit oluşturan konidide transkripsiyonel aktivite gösterdi.Benzer şekilde, C. trifolii'deki melanin biyosentez genlerinin aktivitesi, 2 saatlik bir inkübasyon sırasında indüklendi ve ardından 1 saat sonra bir apresoryum oluştu.Yaprak dokuları üzerinde yapılan araştırmalar, C. acutatum ile aşılanmış çileklerin 8 hpi'de ilk bastırmaya sahip olduğunu, C. kokodları ile aşılanmış domateslerin ise 4 hpi'de ilk bastırmaya sahip olduğunu göstermiştir48,49.Colletotrichum spp.'nin zaman ölçeği ile büyük ölçüde tutarlıdır.bulaşıcı süreç83A:476'ya verilen hızlı savunma yanıtları, bu çizgide bitki direnci ve efektörle tetiklenen bağışıklık (ETI) genlerinin yer aldığını gösterirken, Mandelup'un gecikmiş yanıtları, mikro ilişkili moleküler modelle tetiklenen bağışıklık (MTI) hipotezi 50'yi destekler. 83A: 476 ve Mandelup'a erken yanıtlar.Gecikmiş yanıtta yukarı veya aşağı regüle edilmiş genler arasındaki kısmi örtüşme de bu kavramı desteklemektedir, çünkü ETI genellikle anafilaktik şok olarak bilinen enfeksiyon bölgesinde programlanmış hücre ölümüyle sonuçlanan hızlandırılmış ve gelişmiş bir MTI yanıtı olarak kabul edilir 51,52 .
Aşırı temsil edilen Gene Ontology GO:0006952 "Savunma Tepkisi" terimine atfedilen genlerin çoğu, stres kaynaklı açlık mesajı 22 proteininin (SAM22'ye benzer) 11 homologu ve yedi ana lateks protein benzeridir (MLP'ler).-benzeri proteinler 31, 34, 43 ve 423 dizi benzerliği gösterdi.SAM22 benzeri genler, daha uzun süren ve antraknoz direncinin (83A:476 ve Boregine) artan seviyelerini gösteren önemli aktivasyon gösterdi.Bununla birlikte, MLP benzeri genler yalnızca aday direnç aleli taşıyan hatlarda aşağı regüle edildi (6 hpi'de 83A:476/Lanr1 ve 24 hpi'de Mandelup/AnMan).Tanımlanan tüm SAM22 benzeri homologların, yaklaşık 105 kb'yi kapsayan bir gen kümesinden kaynaklandığına, MLP benzeri genlerin ise genomun ayrı bölgelerinden kaynaklandığına dikkat edilmelidir.Bu tür SAM22 benzeri genlerin koordineli aktivasyonu, Diaporthetoksik aşılamaya karşı NLL direnci ile ilgili önceki çalışmamızda da bulundu, bu da bunların savunma tepkisinin yatay bileşenlerine dahil olduklarını düşündürüyor.Bu sonuç, SAM22 benzeri genlerin yaralanmaya veya salisilik asit, mantar indükleyiciler veya hidrojen peroksit ile tedaviye pozitif tepki verdiğine dair raporlarla da desteklenir.
MLP benzeri genlerin, birçok bitki türünde bakteriyel, viral ve patojenik mantar enfeksiyonları dahil olmak üzere çeşitli abiyotik ve biyotik streslere yanıt verdiği gösterilmiştir55.Bitkiler ve patojenler arasındaki belirli etkileşimlere verilen yanıt yönleri, güçlü bir artıştan (yani, pamuğun Verticillium dahliae ile istilası sırasında) önemli ölçüde azalmaya (yani, elma ağacının Alternaria spp. ile enfeksiyonundan sonra)56,57 arasında değişmektedir.F. niger enfeksiyonuna karşı avokado savunmaları sırasında ve Botryosphaeria berengeriana f elma ağacının enfeksiyonu sırasında MLP benzeri 423 geninin önemli ölçüde aşağı regülasyonu gözlemlenmiştir.cn.piricola ve Alternaria alternata, elma patotipleridir58,59.Ek olarak, MLP benzeri 423 genini aşırı eksprese eden elma kalisinin dirençle ilişkili genlerin ekspresyonu daha düşüktü ve mantar enfeksiyonuna karşı daha duyarlıydı59.Fusarium oxysporum f'yi takiben, MLP benzeri 423 geni de dirençli ortak fasulye germplazmında baskılanmıştır.cn.Fasulye enfeksiyonu 60.
RNA-seq çalışmamızda tanımlanan PR-10 ailesinin diğer üyeleri, yukarı regülasyona yanıt olarak LlR18A ve LlR18B genlerinin yanı sıra lipit transfer proteini DIR1 için yukarı regüle edilmiş (1 gen) veya aşağı regüle edilmiş (3 gen) gendi..Ek olarak, WGCNA, aşılamaya oldukça duyarlı olan ve birkaç koruyucu yanıt geni taşıyan LlR18B genini bu modülde bir merkez olarak vurgular.LlR18A ve LlR18B genleri, patojenik bakterilere yanıt olarak sarı acı bakla yapraklarında ve ayrıca D.toxica aşılamasından sonra NLL saplarında indüklenirken, bu genlerin pirinç homologu olan RSOsPR10, muhtemelen jasmonik asit sinyal yolunda yer alan bir mantar enfeksiyonu tarafından hızla indüklendi53,61,62. DIR1 geni, sistemik kazanılmış direncin (SAR) başlaması için gerekli olan spesifik olmayan lipid taşıma proteinlerini kodlar ).Koruyucu reaksiyonların gelişmesiyle birlikte DIR1 proteini, uzak organlarda SAR'ı indüklemek için enfeksiyon odağından floem yoluyla taşınır.İlginç bir şekilde, TanjilG_02313 DIR1 geni, 84A:476 ve Popülasyon 22660'ta ilk zaman noktasında önemli ölçüde indüklendi, ancak antraknoz direnci yalnızca 84A:476 hattında başarılı bir şekilde gelişti.Bu, NLL'de DIR1 geninin bir miktar alt-fonksiyonelleşmesine işaret edebilir, çünkü kalan üç homolog aşılamaya sadece 83A:476 hattında 6 hpi'de yanıt verdi ve bu yanıt aşağı doğru yönlendirildi.
Çalışmamızda “GO:0055114 Redox işlemi” olarak adlandırılan biyolojik işleme karşılık gelen en yaygın bileşenler sitokrom P450 proteini, peroksidaz, linoleik asit 9S-/13S-lipoksijenaz ve 1-aminosiklopropan-1-karboksilik asit oksidazdır.Ek olarak, WGCNA'mız HSFA4a homologunu, Lanr1 direnç gen adayı TanjilG_05042 gibi modülleri taşıyan bir merkez olarak tanımlar.HSFA4a, bitkilerde nükleer transkripsiyonun redoks bağımlı düzenlemesinin bir bileşenidir.
Sitokrom P450 proteinleri, ksenobiyotiklerin yanı sıra hormonlar, yağ asitleri, steroller, hücre duvarı bileşenleri, biyopolimerler ve koruyucu bileşiklerin biyosentezi dahil olmak üzere birincil ve ikincil metabolizmada NADPH ve/veya O2'ye bağlı hidroksilasyon reaksiyonlarını katalize eden oksidoredüktazlardır. .7, çok sayıda değiştirilmiş homolog (37) ve belirli genler arasındaki yanıt modellerindeki farklılıklar nedeniyle yukarı doğru bir revizyonu yansıtır..NLL genlerinin böylesine büyük bir protein üst ailesindeki varsayılan biyolojik işlevini aydınlatmak için yalnızca RNA-seq verilerini kullanmak oldukça spekülatif olacaktır.Bununla birlikte, bazı sitokrom P450 genlerinin, alerjik reaksiyonlara katkı da dahil olmak üzere, patojenik mantarlara veya bakterilere karşı artan dirençle ilişkili olduğunu belirtmek gerekir69,70,71.
Sınıf III peroksidazlar, bitki büyümesi ve gelişmesi sırasında ve ayrıca tuzluluk, kuraklık, yüksek ışık yoğunluğu ve patojen saldırısı gibi çevresel streslere yanıt olarak çok çeşitli metabolik süreçlerde yer alan çok işlevli bitki enzimleridir72.Peroksidazlar, Stylosanthes humilis ve C. gloeosporioides, Lens culinaris ve C. truncatum, Phaseolus vulgaris ve C. lindemuthianum, Cucumis sativus ve C. lagenarium73,74,75,76 dahil olmak üzere birçok bitki türünün Anthracis ile etkileşiminde yer alır.Tepki, mantar bitki dokusuna nüfuz etmeden önce, bazen 4 HPI'de bile çok hızlıdır73.Peroksidaz geni ayrıca D.toxica NLL aşılamasına yanıt verdi.Oksidatif patlamayı düzenlemeye veya oksidatif stresi ortadan kaldırmaya yönelik tipik işlevlerine ek olarak peroksidazlar, lignifikasyon, alt birim veya belirli bileşiklerin çapraz bağlanması sırasında hücre duvarı takviyesine dayalı fiziksel bariyerler oluşturarak patojen büyümesine müdahale edebilir.Bu işlev, siliko olarak, çalışmamızda 83A:476 dirençli hatta 6 HPI'de önemli ölçüde yukarı regüle edilen, ancak yanıt vermeyen diğer suşlarda ve zaman noktalarında böyle olmayan, farazi bir lignin oluşturan anyon peroksidazı kodlayan TanjilG_03329 genine atfedilebilir.
Linoleik asidin 9S-/13S-lipoksijenazı, lipit biyosentezinin oksidatif yolundaki ilk adımdır78.Bu yolun ürünleri, bitki savunmasında, kalloz ve pektin birikintilerinin oluşumu yoluyla hücre duvarının güçlendirilmesi ve reaktif oksijen türlerinin üretimi yoluyla oksidatif stresin düzenlenmesi dahil olmak üzere çok sayıda işleve sahiptir79,80,81,82,83.Bu çalışmada, linoleik asit 9S-/13S-lipoksijenaz ekspresyonu tüm suşlarda değişti, ancak duyarlı popülasyon 22660'ta farklı zaman noktalarında yukarı regülasyon hakim olurken, dirençli Lanr1 ve AnMan aleli taşıyan suşlarda bu genotipler arasındaki koruyucu şarbon reaksiyonlarında oksilipin tabakasının çeşitlenmesini vurguluyor.
1-aminosiklopropan-1-karboksilat oksidaz (ACO) homologu, acı bakla ile aşılandığında önemli ölçüde yukarı regüle edilmiş (9 gen) veya aşağı regüle edilmiştir (2 gen).İki istisna dışında, bu yanıtların tümü 6 hp'de gerçekleşti.83A'da:476.ACO proteinlerinin aracılık ettiği enzimatik reaksiyon, etilen üretiminde hız sınırlayıcı adımdır ve bu nedenle yüksek oranda düzenlenir84.Etilen, bitki gelişimini ve abiyotik ve biyotik stres koşullarına tepkiyi düzenlemede çeşitli roller oynayan bir bitki hormonudur.ACO transkripsiyonunun uyarılması ve etilen sinyal yolunun aktivasyonu, reaktif oksijen türlerinin ve fitoaleksinlerin üretimini düzenleyerek pirincin hemibiyotrofik mantar oryzae oryzae'ye karşı direncini arttırmada rol oynar.M. oryzae ve C. lupini88,89 arasında bulunan çok benzer bir yaprak enfeksiyonu süreci, bu çalışmada rapor edilen 83A:476 hattındaki ACO homologlarının önemli ölçüde yukarı regülasyonunun arka planında, NLL antraknoz Etilen'e moleküler yollarda merkezi bir sinyal adımı olan direnç kazandırma olasılığını değiştirir.
Bu çalışmada, fotosentezle ilişkili birçok genin büyük ölçekli baskılanması 83A:476'da 6 hpi'de ve Mandeloop ve 22660 popülasyonunda 48 hpi'de gözlemlendi.Bu değişikliklerin kapsamı ve ilerlemesi düzeyi ile orantılıdır.Bu deneyde antraknoz direnci gözlemlendi.Son zamanlarda, fotosentezle ilgili transkriptlerin güçlü ve erken baskısı, patojenik bakteri ve mantarlar dahil olmak üzere çeşitli bitki-patojen etkileşim modellerinde rapor edilmiştir.Acele (bazı etkileşimlerde 2 HPI'den) ve enfeksiyona yanıt olarak fotosentezle ilişkili genlerin küresel baskılanması, reaktif oksijen türlerinin konuşlandırılmasına ve alerjik reaksiyonlara aracılık etmek için bunların salisilik asit yolu ile etkileşimine dayalı olarak bitki bağışıklığını tetikleyebilir 90,94.
Sonuç olarak, en dirençli soy için önerilen savunma tepkisi mekanizmaları (83A:476), R geni tarafından hızlı patojen tanımayı (muhtemelen TIR-NBS-LRR TanjilG_05042) ve alerjik tepki aracılı salisilik asit ve etilen sinyalini ve ardından uzun menzilli SAR'ı içerir.etki, DIR-1 proteini tarafından desteklenir.C. lupini enfeksiyonu için biyotrofik dönemin çok kısa (yaklaşık 2 gün) olduğu ve ardından nekrotik büyümenin geldiğine dikkat edilmelidir95.Bu aşamalar arasındaki geçiş, konukçu bitkilerde aşırı duyarlılık reaksiyonları için tetikleyiciler olarak işlev gören etilen ile indüklenebilir proteinlerin nekrozu ve ekspresyonu ile ilişkili olabilir.Bu nedenle, C. lupini'nin biyotrofik aşamada başarılı bir şekilde yakalanması için zaman penceresi çok dardır.83A:476'da 6 hpi'de gözlenen redoks ve fotosentez ile ilişkili genlerin yeniden programlanması, mantar hiflerinin ilerlemesi ile tutarlıdır ve biyotrofik aşamada başarılı bir koruyucu tepkinin gelişiminin habercisidir.Mandelup ve 22660 popülasyonunun transkriptomik tepkileri, nekrotik büyümeye geçmeden önce mantarı yakalamak için çok gecikebilir, ancak PR-10 proteininin nispeten hızlı regülasyonu yatay direnci desteklediği için Mandelup 22660 popülasyonundan daha etkili olabilir.
Kanonik R geni tarafından yönlendirilen ETI, antraknoza karşı fasulye direnci için ortak bir mekanizma gibi görünmektedir.Bu nedenle, baklagil Medicago truncatula modelinde, antraknoza direnç, TIR-NBS-LRR97 bitki R gen sınıfının bir üyesi olan RCT1 geni tarafından sağlanır.Bu gen ayrıca duyarlı bitkilere aktarıldığında yoncada geniş spektrumlu antraknoz direnci sağlar.Fasulyede (P. vulgaris), bugüne kadar iki düzineden fazla antraknoz direnç geni tanımlanmıştır.Bu genlerin bazıları, herhangi bir kanonik R geninin bulunmadığı bölgelerde bulunur, ancak birçoğu, TIR-NBS-LRR'ler99 dahil olmak üzere, NBS-LRR gen kümesini taşıyan kromozomların kenarlarında bulunur.Genom çapında SSR çalışması ayrıca, NBS-LRR geninin ortak fasulyede antraknoz direnci ile ilişkisini de doğruladı.Kanonik R geni, beyaz acı bakla 101'deki ana antraknoz direnç lokusunu taşıyan genomik bölgede de bulundu.
Çalışmamız, bitki enfeksiyonunun erken bir aşamasında (tercihen en geç 12 hpi) etkinleştirilen ani bir direnç reaksiyonunun, dar yapraklı acı baklayı patojenik mantar Collelotrichum lupini'nin neden olduğu antraknozdan etkili bir şekilde koruduğunu göstermektedir.Yüksek verimli dizileme kullanarak, Lanr1 ve AnMan direnç genlerinin aracılık ettiği NLL bitkilerinde antraknoz direnç genlerinin diferansiyel ekspresyon profillerini gösterdik.Başarılı savunma, bitkinin bir patojenle ilk temasından sonraki saatler içinde redoks, fotosentez ve patogenezde yer alan proteinler için genlerin dikkatli bir şekilde tasarlanmasını içerir.Benzer koruyucu reaksiyonlar, ancak zamanla ertelenirse, bitkileri hastalıklardan korumada çok daha az etkilidir.Lanr1 geninin aracılık ettiği şarbon direnci, R geninin tipik hızlı tepkisine (efektörle tetiklenen bağışıklık) benzerken, AnMan geni büyük olasılıkla yatay bir yanıt (mikropla ilişkili bir moleküler model tarafından tetiklenen bağışıklık) sağlayarak orta düzeyde bir sürdürülebilirlik sağlar.
Antraknoz belirteçlerini taramak için kullanılan 215 NLL hattı, 74 kültivar, 60 çaprazlama veya üreme yoluyla elde edilen hat, 5 mutant ve 76 vahşi veya orijinal germplazmdan oluşuyordu.Polonya (58), İspanya (47), Almanya (27), Avustralya (26), Rusya (19), Belarus (7), İtalya (5) başta olmak üzere 17 ülkeden hatlar geldi.10 ülkedenSet ayrıca referans dirençli çizgiler içerir: 83A:476, Tanjil, Lanr1 aleli taşıyan Wonga ve AnMan aleli taşıyan Mandelup.Hatlar, Poznań Plant Breeding Ltd., Wiatrowo, Polonya tarafından sağlanan Avrupa Acı Bakla Genetik Kaynak Veritabanından elde edildi (Ek Tablo S1).
Bitkiler kontrollü koşullar altında (foperiyot 16 saat, sıcaklık gündüz 25°C ve gece 18°C) büyütüldü.İki biyolojik kopya analiz edildi.DNA, protokole göre DNeasy Plant Mini Kit (Qiagen, Hilden, Almanya) kullanılarak üç haftalık yapraklardan izole edildi.İzole edilen DNA'nın kalitesi ve konsantrasyonu spektrofotometrik yöntemlerle değerlendirildi (NanoDrop 2000; Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, ABD).Antraknoz direnç geni AnMan'ı (ev. Mandelup'tan türetilmiştir) işaretleyen AnManM1 işaretçisi ve Lanr1 genini (ev. Tanjil'den türetilmiştir) çevreleyen Anseq3 ve Anseq4 işaretçiler 11,26,28 analiz edilmiştir.Dirençli alel için homozigotlar "1", duyarlı - "0" ve heterozigotlar - 0,5 olarak puanlandı.
AnManM1, AnSeq3 ve AnSeq4 belirteçleri için tarama sonuçlarına ve son takip deneyleri için tohumların mevcudiyetine dayanarak, antraknoz direnci fenotiplemesi için 50 NLL çizgisi seçildi.Analiz, gündüz 22°C ve gece 19°C sıcaklık aralığında 14 saatlik bir fotoperiyod ile bilgisayar kontrollü bir serada iki kez yapıldı.Tohum kabuğunun çok sert olması nedeniyle tohum uyuşukluğunu önlemek ve düzgün çimlenmeyi sağlamak için ekimden önce tohumlar çizilir (embriyonun karşı tarafındaki tohum kabuğu keskin bir bıçakla kesilir).Bitkiler, steril toprak (TS-1 REC 085 Medium Basic, Klasmann-Deilmann Polska, Varşova, Polonya) ile saksılarda (11 x 11 x 21 cm) büyütüldü.Aşılama, 1999 yılında Verzhenitsa, Büyük Polonya'da (52° 27' 42" K 17° 04' 05" Doğu) bir tarlada yetişen dar yapraklı acı bakla bitkilerinin gövdelerinden yetiştirilen Colletotrichum lupini Col-08 suşu ile gerçekleştirildi.Bir alan edinin.İzolatlar, sporlanmayı indüklemek için 21 gün boyunca siyah ışık altında 20°C'de SNA ortamında kültürlendi.Ekimden dört hafta sonra, bitkiler 4-6 yaprak aşamasına ulaştığında, aşılama, ml başına 0.5 x 106 konidyum konsantrasyonunda bir konidyum süspansiyonu püskürtülerek gerçekleştirildi.Aşılamadan sonra bitkiler, konidilerin çimlenmesini ve enfeksiyon sürecini kolaylaştırmak için yaklaşık %98 nem ve 25°C sıcaklıkta 24 saat karanlıkta tutuldu.Bitkiler daha sonra 22°C gündüz/19°C gece ve %70 nemde 14 saatlik bir fotoperiyod altında büyütüldü.Hastalık skoru, aşılamadan 22 gün sonra yapıldı ve gövdelerde ve yapraklarda nekrotik lezyonların varlığına veya yokluğuna bağlı olarak 0 (bağışıklık) ile 9 (çok duyarlı) arasında değişti.Ayrıca puanlama yapıldıktan sonra bitkilerin ağırlıkları ölçülmüştür.Belirteç genotipleri ve hastalık fenotipleri arasındaki ilişkiler, nokta iki dizi korelasyonları olarak hesaplandı (antraknoz direnç fenotipinin analizi için hat setinde heterozigot işaretlerin olmaması).