Nature.com'u ziyaret ettiğiniz için teşekkür ederiz. Kullandığınız tarayıcı sürümü sınırlı CSS desteğine sahiptir. En iyi deneyim için güncellenmiş bir tarayıcı kullanmanızı (veya Internet Explorer'da Uyumluluk Modunu devre dışı bırakmanızı) öneririz. Bu arada, sürekli desteği sağlamak için siteyi stiller ve JavaScript olmadan sunacağız.
AFEX ile ön işlem görmüş mısır sapındaki kalıcı oligosakkaritlerin karmaşık analizi için yeni immünolojik ve kütle spektrometrik yöntemler. Lignoselülozik biyokütle, fosil yakıtlara sürdürülebilir bir alternatiftir ve gıda, yem, yakıt ve kimyasallar gibi ürünlerin üretimi için biyoteknolojiler geliştirmek için yaygın olarak kullanılır. Bu teknolojilerin anahtarı, bitki hücre duvarlarında bulunan karmaşık karbonhidratları glikoz, ksiloz ve arabinoz gibi basit şekerlere dönüştürmek için maliyet açısından rekabetçi süreçlerin geliştirilmesidir. Lignoselülozik biyokütle çok inatçı olduğundan, istenen ürünü elde etmek için termokimyasal işlemlere (örneğin, amonyak lifi soyma (AFEX), seyreltik asitler (DA), iyonik sıvılar (IL)) ve biyolojik işlemlere (örneğin, enzimatik hidroliz ve mikrobiyal fermantasyon) birlikte tabi tutulmalıdır. Ancak, ticari mantar enzimleri hidroliz sürecinde kullanıldığında, oluşan çözünür şekerlerin yalnızca %75-85'i monosakkaritlerdir ve kalan %15-25'i mikroorganizmalar için her zaman erişilebilir olmayan çözünür, inatçı oligosakkaritlerdir. Daha önce, karbon ve diatomlu toprak ayırma ve boyut dışlama kromatografisinin bir kombinasyonunu kullanarak çözünür inatçı oligosakkaritleri başarıyla izole ettik ve saflaştırdık ve ayrıca enzim inhibitör özelliklerini araştırdık. Daha yüksek polimerizasyon derecesi (DP) metillenmiş üronik asit ikameleri içeren oligosakkaritlerin, düşük DP ve nötr oligosakkaritlere göre ticari enzim karışımlarıyla işlenmesinin daha zor olduğunu bulduk. Burada, bitki hücre duvarlarındaki ve enzimatik hidrolizatlardaki glikan bağlarını karakterize etmek için bitki biyokütle glikanlarına özgü monoklonal antikorlar (mAb'ler) kullanan glikan profili, matris destekli lazer desorpsiyon iyonizasyonu, uçuş zamanlı kütle spektrometrisi dahil olmak üzere birkaç ek yöntemin kullanımını bildiriyoruz. . MALDI-TOF-MS) negatif iyonların ikincil bozunmasından sonra spektroskopi, gaz kromatografisi ve kütle spektrometrisi (GC-MS) ile elde edilen yapı bilgilendirici tanısal tepe noktalarını kullanarak oligosakkarit bağlarını türevlendirme ile ve türevlendirme olmadan karakterize eder. Oligosakkaritlerin küçük boyutu (DP 4–20) nedeniyle, bu moleküllerin mAb bağlanması ve karakterizasyonu için kullanılması zordur. Bu sorunun üstesinden gelmek için, mikro plaka yüzeyindeki düşük DP çözünür oligosakkaritlerin çoğunu başarıyla etiketleyen ve daha sonra özgül ligasyon analizi için yüksek verimli bir mAb sisteminde kullanılan yeni bir biyotin konjugasyona dayalı oligosakkarit immobilizasyon yöntemi uyguladık. Bu yeni yöntem, gelecekte tanı amaçlı biyobelirteçlerde bulunan oligosakkaritlerin izole edilmesi ve karakterize edilmesinde kullanılabilecek daha gelişmiş yüksek verimli glikom analizlerinin geliştirilmesini kolaylaştıracaktır.
Tarımsal, ormancılık, çimen ve odunsu malzemelerden oluşan lignoselülozik biyokütle, gıda, yem, yakıt ve daha yüksek değerli ürünler üretmek için kimyasal öncüler de dahil olmak üzere biyobazlı ürünlerin üretimi için potansiyel bir hammaddedir1. Bitki hücre duvarlarında bulunan karbonhidratlar (selüloz ve hemiselüloz gibi) kimyasal işleme ve biyotransformasyon (enzimatik hidroliz ve mikrobiyal fermantasyon gibi) ile monosakkaritlere depolimerize edilir. Yaygın ön işlemler arasında amonyak lif genleşmesi (AFEX), seyreltik asit (DA), iyonik sıvı (IL) ve bitki hücre duvarlarını açarak lignoselüloz üretimini azaltmak için kimyasallar ve ısı kombinasyonunu kullanan buhar patlaması (SE) bulunur3,4. maddenin inatçılığı, 5. Enzimatik hidroliz, ticari aktif karbonhidrat içeren enzimler (CAZymes) ve biyobazlı yakıtlar ve kimyasallar üretmek için transgenik mayalar veya bakteriler kullanılarak mikrobiyal fermantasyon kullanılarak yüksek katı yükünde gerçekleştirilir6.
Ticari enzimlerdeki CAZimler, monosakkaritler oluşturmak için karmaşık karbonhidrat-şeker bağlarını sinerjik olarak kesen enzimlerin karmaşık bir karışımından oluşur2,7. Daha önce bildirdiğimiz gibi, ligninin karbonhidratlarla olan aromatik polimerlerinin karmaşık ağı onları oldukça inatçı hale getirir ve bu da eksik şeker dönüşümüne yol açarak, ön işlem görmüş biyokütlenin enzimatik hidrolizi sırasında üretilmeyen seks oligosakkaritlerinin %15-25'inin birikmesine neden olur. Bu, çeşitli biyokütle ön işlem yöntemlerinde yaygın bir sorundur. Bu darboğazın bazı nedenleri arasında hidroliz sırasında enzim inhibisyonu veya bitki biyokütlesindeki şeker bağlarını kırmak için gereken temel esansiyel enzimlerin yokluğu veya düşük seviyeleri yer alır. Oligosakkaritlerdeki şeker bağları gibi şekerlerin bileşimini ve yapısal özelliklerini anlamak, hidroliz sırasında şeker dönüşümünü iyileştirmemize yardımcı olacak ve biyoteknolojik süreçleri petrol türevi ürünlerle maliyet açısından rekabetçi hale getirecektir.
Karbonhidratların yapısını belirlemek zordur ve sıvı kromatografisi (LC)11,12, nükleer manyetik rezonans spektroskopisi (NMR)13, kapiler elektroforez (CE)14,15,16 ve kütle spektrometrisi (MS)17 gibi yöntemlerin bir kombinasyonunu gerektirir. ,onsekiz. Lazer desorpsiyon ve matris kullanılarak iyonizasyon ile uçuş zamanlı kütle spektrometrisi (MALDI-TOF-MS) gibi MS yöntemleri karbonhidrat yapılarını tanımlamak için çok yönlü bir yöntemdir. Son zamanlarda, sodyum iyon adüktlerinin Çarpışma Tetiklemeli Ayrışma (CID) tandem MS'si, oligosakkarit bağlanma pozisyonlarına, anomerik konfigürasyonlara, dizilere ve dallanma pozisyonlarına karşılık gelen parmak izlerini tanımlamak için en yaygın şekilde kullanılmıştır 20, 21 .
Glikan analizi, karbonhidrat bağlarının derinlemesine tanımlanması için mükemmel bir araçtır22. Bu yöntem, karmaşık karbonhidrat bağlarını anlamak için prob olarak bitki hücre duvarı glikanına yönlendirilmiş monoklonal antikorlar (mAb'ler) kullanır. Çeşitli sakkaritler kullanılarak çeşitli doğrusal ve dallı oligosakkaritlere karşı tasarlanmış, dünya çapında 250'den fazla mAb mevcuttur24. Birkaç mAb, bitki hücre duvarının yapısını, bileşimini ve modifikasyonlarını karakterize etmek için yaygın olarak kullanılmıştır, çünkü bitki hücre tipi, organ, yaş, gelişim aşaması ve büyüme ortamına bağlı olarak önemli farklılıklar vardır25,26. Daha yakın zamanlarda, bu yöntem, bitki ve hayvan sistemlerindeki vezikül popülasyonlarını ve hücre altı belirteçler, gelişim aşamaları veya çevresel uyaranlar tarafından belirlenen glikan taşınmasındaki ilgili rollerini anlamak ve enzimatik aktiviteyi belirlemek için kullanılmıştır. Tanımlanan farklı glikan ve ksilan yapıları arasında pektin (P), ksilan (X), mannan (M), ksiloglukanlar (XylG), karışık bağlı glukanlar (MLG), arabinoksilan (ArbX), galaktomannan (GalG), glukuronik asit-arabinoksilan (GArbX) ve arabino-galaktan (ArbG)29 yer almaktadır.
Ancak, tüm bu araştırma çabalarına rağmen, sadece birkaç çalışma, oligosakkarit salınımı, hidroliz sırasında oligomerik zincir uzunluğu değişiklikleri, çeşitli düşük DP polimerleri ve eğrileri dahil olmak üzere yüksek katı yük (HSL) hidrolizi sırasında oligosakkarit birikiminin doğasına odaklanmıştır. dağılımlar 30,31,32. Bu arada, glikan analizinin glikan yapısının kapsamlı bir analizi için yararlı bir araç olduğu kanıtlanmış olsa da, antikor yöntemleri kullanılarak suda çözünür düşük DP oligosakkaritlerini değerlendirmek zordur. Moleküler ağırlığı 5-10 kDa'dan düşük olan daha küçük DP oligosakkaritleri ELISA plakalarına bağlanmaz 33, 34 ve antikor eklenmeden önce yıkanır.
Burada, ilk kez, çözünebilir refrakter oligosakkaritler için tek adımlı bir biyotinilasyon prosedürünü glikom analiziyle birleştiren monoklonal antikorlar kullanarak avidin kaplı plakalarda bir ELISA analizi gösteriyoruz. Glikom analizine yaklaşımımız, hidrolize şeker bileşimlerinin trimetilsilil (TMS) türevlendirmesi kullanılarak tamamlayıcı oligosakkarit bağlarının MALDI-TOF-MS ve GC-MS tabanlı analiziyle doğrulandı. Bu yenilikçi yaklaşım gelecekte yüksek verimli bir yöntem olarak geliştirilebilir ve biyomedikal araştırmalarda daha geniş uygulama alanı bulabilir35.
Enzimlerin ve antikorların glikozilasyon gibi translasyon sonrası modifikasyonları36 biyolojik aktivitelerini etkiler. Örneğin, serum proteinlerinin glikozilasyonundaki değişiklikler inflamatuar artritte önemli bir rol oynar ve glikozilasyondaki değişiklikler tanı belirteçleri olarak kullanılır37. Literatürde çeşitli glikanların, gastrointestinal sistem ve karaciğerin kronik inflamatuar hastalıkları, viral enfeksiyonlar, yumurtalık, meme ve prostat kanserleri38,39,40 dahil olmak üzere çeşitli hastalıklarda kolayca ortaya çıktığı bildirilmiştir. Antikor bazlı glikan ELISA yöntemleri kullanılarak glikanların yapısının anlaşılması, karmaşık MS yöntemleri kullanılmadan hastalık tanısında ek güven sağlayacaktır.
Önceki çalışmamız, inatçı oligosakkaritlerin ön işlem ve enzimatik hidrolizden sonra hidrolize olmadığını göstermiştir (Şekil 1). Daha önce yayınlanan çalışmamızda, AFEX ile ön işlem görmüş mısır sapı hidrolizatından (ACSH)8 oligosakkaritleri izole etmek için aktif kömür katı faz ekstraksiyon yöntemi geliştirdik. İlk ekstraksiyon ve ayırmadan sonra, oligosakkaritler boyut dışlama kromatografisi (SEC) ile daha fazla fraksiyonlandı ve moleküler ağırlık sırasına göre toplandı. Çeşitli ön işlemlerden salınan şeker monomerleri ve oligomerleri, şeker bileşimi analizi ile analiz edildi. Çeşitli ön işlem yöntemleriyle elde edilen şeker oligomerlerinin içeriğini karşılaştırırken, inatçı oligosakkaritlerin varlığı biyokütlenin monosakkaritlere dönüştürülmesinde yaygın bir sorundur ve şeker veriminde en az %10-15 ve hatta %18'e kadar bir azalmaya yol açabilir. ABD. Bu yöntem, oligosakkarit fraksiyonlarının daha büyük ölçekli üretimi için kullanılır. Elde edilen ACH ve farklı molekül ağırlıklarına sahip sonraki fraksiyonları bu çalışmada oligosakkaritlerin karakterizasyonu için deneysel materyal olarak kullanıldı.
Ön işlem ve enzimatik hidrolizden sonra, kalıcı oligosakkaritler hidrolize olmamış halde kaldı. Burada (A) oligosakkaritlerin, aktif karbon ve diatomlu topraktan oluşan paketlenmiş bir yatak kullanılarak AFEX ile ön işlem görmüş mısır sapı hidrolizatından (ACSH) izole edildiği bir oligosakkarit ayırma yöntemi; (B) Oligosakkaritlerin ayrılması için yöntem. Oligosakkaritler ayrıca boyut dışlama kromatografisi (SEC) ile ayrıldı; (C) Çeşitli ön işlemlerden (seyreltilmiş asit: DA, iyonik sıvı: IL ve AFEX) salınan sakkarit monomerleri ve oligomerleri. Enzimatik hidroliz koşulları: %25 (ağırlık/ağırlık) yüksek katı yüklemesi (yaklaşık %8 glukan yüklemesi), 96 saat hidroliz, 20 mg/g ticari enzim yüklemesi (Ctec2:Htec2:MP-2:1:1 oranı) ve (D) AFEX ile önceden işlenmiş mısır sapından (ACS) salınan glikoz, ksiloz ve arabinozun şeker monomerleri ve oligomerleri.
Glikan analizi, katı biyokütle kalıntılarından izole edilen özütlerdeki glikanların kapsamlı bir yapısal analizi için yararlı bir araç olduğu kanıtlanmıştır. Ancak, suda çözünen sakkaritler bu geleneksel yöntem kullanılarak yeterince temsil edilmez41 çünkü düşük molekül ağırlıklı oligosakkaritlerin ELISA plakalarında immobilize edilmesi zordur ve antikor eklenmeden önce yıkanırlar. Bu nedenle, antikor bağlanması ve karakterizasyonu için, avidin kaplı ELISA plakalarında çözünen, uyumsuz oligosakkaritleri kaplamak için tek adımlı bir biyotinilasyon yöntemi kullanıldı. Bu yöntem, daha önce ürettiğimiz ACSH ve moleküler ağırlığına (veya polimerizasyon derecesine, DP) dayalı bir kesir kullanılarak test edildi. Tek adımlı biyotinilasyon, karbonhidratın indirgeyici ucuna biyotin-LC-hidrazit eklenerek oligosakkarit bağlanma afinitesini artırmak için kullanıldı (Şekil 2). Çözeltide, indirgeyici uçtaki hemiasetal grubu, bir hidrazon bağı oluşturmak için biyotin-LC-hidrazitin hidrazit grubuyla reaksiyona girer. İndirgeyici madde NaCNBH3'ün varlığında, hidrazon bağı kararlı bir biyotinlenmiş son ürüne indirgenir. Şeker indirgeyici ucun modifikasyonuyla, düşük DP oligosakkaritlerinin ELISA plakalarına bağlanması mümkün hale geldi ve çalışmamızda bu, glikan hedefli mAb'ler kullanılarak avidin kaplı plakalarda yapıldı.
Biyotinlenmiş oligosakkaritler için ELISA'ya dayalı monoklonal antikorların taranması. Burada (A) oligosakkaritlerin birleşik biyotinilasyonu ve ardından NeutrAvidin kaplı plakalarda glikan hedefli mAb'lerle ELISA taraması ve (B) reaksiyon ürünlerinin biyotinilasyonu için tek adımlı bir prosedür gösterilmektedir.
Oligosakkarit konjuge antikorlarla Avidin kaplı plakalar daha sonra birincil ve ikincil antikorlara eklendi ve ışık ve zamana duyarlı bir ortamda yıkandı. Antikor bağlanması tamamlandıktan sonra, plakayı inkübe etmek için TMB substratı eklendi. Reaksiyon son olarak sülfürik asitle durduruldu. İnkübe edilen plakalar, antikor-spesifik çapraz bağlanmayı tespit etmek için her bir antikorun bağlanma gücünü belirlemek üzere bir ELISA okuyucusu kullanılarak analiz edildi. Deneyin ayrıntıları ve parametreleri için ilgili “Malzemeler ve Yöntemler” bölümüne bakın.
Bu yeni geliştirilen yöntemin belirli uygulamalar için yararlılığını, ACSH'de bulunan çözünür oligosakkaritlerin yanı sıra lignoselülozik hidrolizatlardan izole edilen ham ve saflaştırılmış oligosakkarit fraksiyonlarını karakterize ederek gösteriyoruz. Şekil 3'te gösterildiği gibi, biyoasile edilmiş glikom analiz yöntemleri kullanılarak ACSH'de tanımlanan en yaygın epitop-ikameli ksilanlar genellikle üronik (U) veya metiluronik (MeU) ve pektik arabinogalaktanlardır. Bunların çoğu, hidrolize olmamış katıların (UHS) glikanlarının analizine ilişkin önceki çalışmamızda da bulunmuştur43.
Hücre duvarı glikanına yönlendirilmiş bir monoklonal antikor kullanılarak dirençli oligosakkarit epitoplarının tespiti. "Nötr" fraksiyon ACN fraksiyonudur ve "asidik" fraksiyon FA fraksiyonudur. Isı haritasındaki daha parlak kırmızılar daha yüksek epitop içeriğini, daha parlak maviler ise boş bir arka planı gösterir. Ölçekteki renk değerleri N=2 formülasyonları için ham OD değerlerine dayanmaktadır. Antikorlar tarafından tanınan ana epitoplar sağda gösterilmiştir.
Bu selüloz olmayan yapılar, en yaygın kullanılan ticari enzimleri içeren test edilen ticari enzim karışımındaki en yaygın selülazlar ve hemiselülazlar tarafından parçalanamadı. Bu nedenle, hidrolizleri için yeni yardımcı enzimlere ihtiyaç duyulmaktadır. Gerekli selüloz olmayan yardımcı enzimler olmadan, bu selüloz olmayan bağlar, ana şeker polimerleri daha kısa parçalara kapsamlı bir şekilde hidrolize edilip ticari enzim karışımları kullanılarak çözülse bile, monosakkaritlere tam dönüşümü engeller.
Sinyal dağılımının ve bağlanma gücünün daha ileri düzeyde incelenmesi, bağlanma epitoplarının yüksek DP şeker fraksiyonlarında (A, B, C, DP 20+'ye kadar) düşük DP fraksiyonlarına (D, E, F, DP) kıyasla dimerlerde daha düşük olduğunu göstermiştir (Şekil 1). Asit parçaları, nötr parçalardan ziyade selüloz dışı epitoplarda daha yaygındır. Bu olgular, yüksek DP ve asit kısımlarının enzimatik hidrolize karşı daha dirençli olduğu önceki çalışmamızda gözlemlenen örüntüyle tutarlıdır. Bu nedenle, selüloz dışı glikan epitoplarının ve U ve MeU ikamelerinin varlığı, oligosakkaritlerin stabilitesine büyük ölçüde katkıda bulunabilir. Bağlanma ve tespit verimliliğinin, özellikle epitop dimerik veya trimerik bir oligosakkaritse, düşük DP oligosakkaritler için sorunlu olabileceği unutulmamalıdır. Bu, her biri belirli bir mAb'ye bağlanan yalnızca bir epitop içeren farklı uzunluklardaki ticari oligosakkaritler kullanılarak test edilebilir.
Böylece, yapıya özgü antikorların kullanımı belirli tipte dirençli bağları ortaya çıkardı. Kullanılan antikor türüne, uygun ligasyon desenine ve ürettiği sinyalin gücüne (en çok ve en az bol) bağlı olarak, yeni enzimler tanımlanabilir ve daha eksiksiz glikokonversiyon için enzim karışımına yarı-kantitatif olarak eklenebilir. Örnek olarak ACSH oligosakkaritlerinin analizini ele alarak, her biyokütle materyali için bir glikan bağları veritabanı oluşturabiliriz. Burada, antikorların farklı afinitesinin hesaba katılması gerektiği ve afiniteleri bilinmiyorsa, bunun farklı antikorların sinyallerini karşılaştırırken belirli zorluklar yaratacağı belirtilmelidir. Ek olarak, glikan bağlarının karşılaştırılması aynı antikor için örnekler arasında en iyi şekilde işe yarayabilir. Bu inatçı bağlar daha sonra CAZyme veritabanına bağlanabilir, buradan enzimleri tanımlayabilir, aday enzimleri seçebilir ve bağ kıran enzimleri test edebilir veya biyorafinerilerde kullanım için bu enzimleri ifade edecek mikrobiyal sistemler geliştirebiliriz44.
İmmünolojik yöntemlerin, lignoselülozik hidrolizatlarda bulunan düşük molekül ağırlıklı oligosakkaritleri karakterize etmek için alternatif yöntemleri nasıl tamamladığını değerlendirmek amacıyla, MALDI (Şekil 4, S1-S8) ve aynı panelde (Şekil 5) oligosakkarit parçası üzerinde GC-MS'ye dayalı TMS türevi sakkaritlerin analizini gerçekleştirdik. MALDI, oligosakkarit moleküllerinin kütle dağılımının amaçlanan yapıyla eşleşip eşleşmediğini karşılaştırmak için kullanılır. Şekil 4'te nötr bileşenler ACN-A ve ACN-B'nin MS'si gösterilmektedir. ACN-A analizi, ağırlıkları MeU-ksilan oligosakkaritlerine karşılık gelen DP 4–8'den (Şekil 4) DP 22'ye (Şekil S1) kadar değişen bir dizi pentoz şekerini doğruladı. ACN-B analizi, DP 8-15'e sahip pentoz ve glukoksilan serilerini doğruladı. Şekil S3 gibi ek materyallerde, FA-C asidik kısım kütle dağılım haritaları, ELISA tabanlı mAb taramasında bulunan ikame edilmiş ksilanlarla tutarlı olan 8-15 DP'li bir dizi (Me)U ikame edilmiş pentoz şekeri göstermektedir. Epitoplar tutarlıdır.
ACS'de bulunan çözünür uyumsuz oligosakkaritlerin MALDI-MS spektrumu. Burada, (A) Metillenmiş üronik asit (DP 4-8) ikameli glukuroksilan oligosakkaritleri içeren ACN-A düşük ağırlık aralığı fraksiyonları ve (B) ACN-B ksilan ve glukuroksilan (DP 8-15) ile ikameli metillenmiş üronik asit oligosakkaritleri.
Refrakter oligosakkaritlerin glikan kalıntısının bileşiminin analizi. Burada (A) GC-MS analizi kullanılarak elde edilen çeşitli oligosakkarit fraksiyonlarının TMS sakkarit bileşimi. (B) Oligosakkaritlerde bulunan çeşitli TMS türevi şekerlerin yapıları. ACN – nötr oligosakkaritler içeren asetonitril fraksiyonu ve FA – asit oligosakkaritler içeren ferulik asit fraksiyonu.
Oligosakkarit fraksiyonunun LC-MS analizinden Şekil S9'da gösterildiği gibi başka bir ilginç sonuç çıkarıldı (yöntemler elektronik ek materyalde görülebilir). Heksoz ve -OAc gruplarının parçaları ACN-B fraksiyonunun ligasyonu sırasında tekrar tekrar gözlemlendi. Bu bulgu sadece glikom ve MALDI-TOF analizinde gözlemlenen parçalanmayı doğrulamakla kalmıyor, aynı zamanda önceden işlenmiş lignoselülozik biyokütledeki potansiyel karbonhidrat türevleri hakkında da yeni bilgiler sağlıyor.
Ayrıca TMS glikan türevlendirmesini kullanarak oligosakkarit fraksiyonlarının glikan kompozisyon analizini gerçekleştirdik. GC-MS kullanarak oligosakkarit fraksiyonundaki nöral (türev olmayan) ve asidik şekerlerin (GluA ve GalA) kompozisyonunu belirledik (Şekil 5). Glukuronik asit asidik bileşenler C ve D'de bulunurken, galakturonik asit asidik bileşenler A ve B'de bulunur ve bunların her ikisi de asidik şekerlerin yüksek DP bileşenleridir. Bu sonuçlar yalnızca ELISA ve MALDI verilerimizi doğrulamakla kalmaz, aynı zamanda oligosakkarit birikimine ilişkin önceki çalışmalarımızla da tutarlıdır. Bu nedenle, oligosakkaritlerin biyotinilasyonunu ve ardından ELISA taramasını kullanan modern immünolojik yöntemlerin çeşitli biyolojik örneklerdeki çözünür dirençli oligosakkaritleri tespit etmek için yeterli olduğuna inanıyoruz.
ELISA tabanlı mAb tarama yöntemleri birkaç farklı yöntemle doğrulandığından, bu yeni kantitatif yöntemin potansiyelini daha fazla keşfetmek istedik. İki ticari oligosakkarit, ksilohekzasakkarit oligosakkarit (XHE) ve 23-α-L-arabinofuranosil-ksilotrioz (A2XX) satın alındı ​​ve hücre duvarı glikanını hedef alan yeni bir mAb yaklaşımı kullanılarak test edildi. Şekil 6, biyotinlenmiş bağlanma sinyali ile oligosakkarit konsantrasyonunun log konsantrasyonu arasında doğrusal bir korelasyon göstermektedir ve bu da olası bir Langmuir adsorpsiyon modelini önermektedir. mAb'ler arasında, CCRC-M137, CCRC-M138, CCRC-M147, CCRC-M148 ve CCRC-M151, XHE ile ve CCRC-M108, CCRC-M109 ve LM11, 1 nm ila 100 nano aralığında A2XX ile korelasyon göstermiştir. Deney sırasında antikorların sınırlı bulunabilirliği nedeniyle, her oligosakkarit konsantrasyonuyla sınırlı deneyler gerçekleştirildi. Burada bazı antikorların bir substrat olarak aynı oligosakkarite çok farklı tepki verdiğine dikkat edilmelidir, muhtemelen biraz farklı epitoplara bağlandıkları ve çok farklı bağlanma afinitelerine sahip olabildikleri için. Yeni mAb yaklaşımı gerçek örneklere uygulandığında doğru epitop tanımlamasının mekanizmaları ve sonuçları çok daha karmaşık olacaktır.
Çeşitli glikan hedefli mAb'lerin tespit aralığını belirlemek için iki ticari oligosakkarit kullanıldı. Burada, oligosakkarit konsantrasyonunun log konsantrasyonuyla doğrusal korelasyonlar (A) mAb ile XHE ve (B) mAb ile A2XX için Langmuir adsorpsiyon desenlerini gösterir. Karşılık gelen epitoplar, deneyde substrat olarak kullanılan ticari oligosakkaritlerin yapılarını gösterir.
Glikan hedefli monoklonal antikorların kullanımı (gliko-kom analizi veya ELISA tabanlı mAb taraması), bitki biyokütlesini oluşturan başlıca hücre duvarı glikanlarının çoğunun derinlemesine karakterizasyonu için güçlü bir araçtır. Ancak klasik glikan analizi yalnızca daha büyük hücre duvarı glikanlarını karakterize eder, çünkü çoğu oligosakkarit ELISA plakalarında etkili bir şekilde immobilize edilmez. Bu çalışmada, AFEX ile önceden işlenmiş mısır sapı yüksek katı içerikte enzimatik olarak hidrolize edildi. Hidrolizattaki dirençli hücre duvarı karbonhidratlarının bileşimini belirlemek için şeker analizi kullanıldı. Ancak, hidrolizatlardaki daha küçük oligosakkaritlerin mAb analizi hafife alınmaktadır ve oligosakkaritleri ELISA plakalarında etkili bir şekilde immobilize etmek için ek araçlara ihtiyaç duyulmaktadır.
Burada, oligosakkarit biyotinilasyonunu NeutrAvidin™ kaplı plakalarda ELISA taramasıyla birleştirerek mAb taraması için yeni ve etkili bir oligosakkarit immobilizasyon yöntemi bildiriyoruz. İmmobilize edilmiş biyotinlenmiş oligosakkaritler, dirençli oligosakkaritlerin hızlı ve etkili bir şekilde tespit edilmesini sağlamak için antikor için yeterli afinite gösterdi. Bu inatçı oligosakkaritlerin kütle spektrometrisine dayalı bileşiminin analizi, immüno-tarama için bu yeni yaklaşımın sonuçlarını doğruladı. Bu nedenle, bu çalışmalar, oligosakkarit biyotinilasyonu ve glikan hedefli monoklonal antikorlarla ELISA taramasının kombinasyonunun oligosakkaritlerdeki çapraz bağları tespit etmek için kullanılabileceğini ve oligosakkaritlerin yapısını karakterize eden diğer biyokimyasal çalışmalarda yaygın olarak uygulanabileceğini göstermektedir.
Bu biyotin bazlı glikan profilleme yöntemi, bitki biyokütlesindeki çözünür oligosakkaritlerin dirençli karbonhidrat bağlarını araştırabilen ilk rapordur. Bu, biyokütlenin bazı kısımlarının biyoyakıt üretimi söz konusu olduğunda neden bu kadar inatçı olduğunu anlamaya yardımcı olur. Bu yöntem, glikom analiz yöntemlerindeki önemli bir boşluğu doldurur ve uygulamasını bitki oligosakkaritlerinin ötesinde daha geniş bir substrat yelpazesine genişletir. Gelecekte, biyotinilasyon için robotik kullanabilir ve ELISA kullanarak numunelerin yüksek verimli analizi için geliştirdiğimiz yöntemi kullanabiliriz.
Pioneer 33A14 hibrit tohumlarından yetiştirilen mısır samanı (CS), 2010 yılında Ray, Colorado'daki Kramer Çiftlikleri'nden hasat edildi. Arazi sahibinin izniyle, bu biyokütle araştırma için kullanılabilir. Numuneler %6'dan az nem içeren fermuarlı torbalarda oda sıcaklığında saklandı. Numuneler %6'dan az nem içeren fermuarlı torbalarda oda sıcaklığında saklandı. Образцы хранились сухими при влажности < 6% в застежкой-молнией при комнатной температуре. Numuneler oda sıcaklığında, fermuarlı torbalarda %6'nın altında nemde kuru olarak saklandı.样品在室温下以干燥< 6% 的水分储存在自封袋中。样品在室温下以干燥< 6% Образцы хранят в пакетах с застежкой-молнией при комнатной sıcaklık с влажностью < 6%. Numuneler %6'dan az nem oranına sahip oda sıcaklığında fermuarlı poşetlerde saklanır.Çalışma yerel ve ulusal yönergelere uygundu. Kompozisyon analizi NREL protokolü kullanılarak gerçekleştirildi. Kompozisyonun %31,4 glukan, %18,7 ksilan, %3,3 arabinan, %1,2 galaktan, %2,2 asetil, %14,3 lignin, %1,7 protein ve %13,4 kül içerdiği bulundu.
Cellic® CTec2 (138 mg protein/ml, lot VCNI 0001), Novozymes'ten (Franklinton, NC, ABD) selülaz, β-glukozidaz ve Cellic® HTec2'nin (157 mg protein/ml, lot VHN00001) karmaşık bir karışımıdır. Pektin parçalayıcı enzimlerin karmaşık bir karışımı olan Multifect Pectinase® (72 mg protein/mL), DuPont Industrial Biosciences (Palo Alto, CA, ABD) tarafından bağışlanmıştır. Enzim protein konsantrasyonları, protein içeriğinin tahmin edilmesiyle (ve protein olmayan azotun katkısının çıkarılmasıyla) Kjeldahl azot analizi (AOAC yöntemi 2001.11, Dairy One Cooperative Inc., Ithaca, NY, ABD) kullanılarak belirlenmiştir. Diyatomlu toprak 545, EMD Millipore'dan (Billerica, MA) satın alınmıştır. Aktif karbon (DARCO, 100 mesh granül), Avicel (PH-101), kayın ksilanı ve diğer tüm kimyasallar Sigma-Aldrich'ten (St. Louis, MO) satın alındı.
AFEX ön işlemi GLBRC'de (Biyokütle Dönüşüm Araştırma Laboratuvarı, MSU, Lansing, MI, ABD) gerçekleştirildi. Ön işlem 140° C'de 15 dakika boyunca gerçekleştirildi. Paslanmaz çelik tezgah üstü parti reaktöründe (Parr Instruments Company) %60 (w/w) yüklemede susuz amonyak/biyokütle oranında 1:1 oranında 46 kalış süresi. 30 dakika sürdü. Reaktör 140° C'ye getirildi ve amonyak hızla salındı, bu da biyokütlenin hızla oda sıcaklığına dönmesini sağladı. AFEX ön işlemli mısır sapının (ACS) bileşimi, işlemsiz mısır sapının (UT-CS) bileşimine benzerdi.
Yüksek katı maddeli ACSH %25 (ağırlık/ağırlık) (yaklaşık %8 dekstran yüklemesi) oligosakkaritlerin büyük ölçekli üretimi için başlangıç ​​materyali olarak hazırlandı. ACS'nin enzimatik hidrolizi, Cellic® Ctec2 10 mg protein/g glukan (önceden işlenmiş biyokütlede), Htec2 (Novozymes, Franklinton, NC), 5 mg protein/g glukan ve Multifect Pektinaz (Genencor Inc, ABD) içeren ticari bir enzim karışımı kullanılarak gerçekleştirildi. ). ), 5 mg protein/g dekstran. Enzimatik hidroliz, 3 litre çalışma hacmine, pH 4,8'e, 50 °C'ye ve 250 rpm'ye sahip 5 litrelik bir biyoreaktörde gerçekleştirildi. 96 saat hidrolizden sonra, hidrolizat 30 dakika boyunca 6000 rpm'de ve daha sonra 30 dakika boyunca 14000 rpm'de santrifüjleme ile toplanarak hidrolize olmamış katılar uzaklaştırıldı. Hidrolizat daha sonra 0,22 mm'lik bir filtre beherinden steril filtrasyona tabi tutuldu. Filtrelenen hidrolizat 4° C'de steril şişelerde saklandı ve daha sonra karbon üzerinde fraksiyonlandı.
NREL laboratuvar analiz prosedürlerine göre ekstrakt bazlı biyokütle örneklerinin bileşiminin analizi: bileşim analizi için örneklerin hazırlanması (NREL/TP-510-42620) ve biyokütledeki yapısal karbonhidratların ve ligninin belirlenmesi (NREL/TP-510 – 42618)47.
Hidrolizat akımının oligosakkarit analizi, otoklav bazlı asit hidroliz yöntemi kullanılarak 2 ml'lik bir ölçekte gerçekleştirildi. Hidrolizat örneğini 10 ml'lik vidalı kapaklı bir kültür tüpünde 69,7 µl %72'lik sülfürik asitle karıştırın ve 121 °C'de bir tezgahta 1 saat inkübe edin, buz üzerinde soğutun ve yüksek performanslı sıvı kromatografisi (HPLC) şişesine süzün. Oligosakkaritlerin konsantrasyonu, asitle hidrolize edilmiş örnekteki toplam şeker konsantrasyonundan hidrolize edilmemiş örnekteki monosakkaritlerin konsantrasyonunun çıkarılmasıyla belirlendi.
Asit hidrolize edilmiş biyokütledeki glikoz, ksiloz ve arabinoz konsantrasyonları, bir Bio-Rad Aminex HPX-87H kolonu üzerinde bir otomatik örnekleyici, kolon ısıtıcısı, izokratik pompa ve kırılma indisi dedektörü ile donatılmış bir Shimadzu HPLC sistemi kullanılarak analiz edildi. Kolon 50°C'de tutuldu ve su akışında 0,6 ml/dak 5 mM H2SO4 ile elüe edildi.
Hidrolizat üst sıvısı seyreltildi ve monomer ve oligosakkarit içeriği açısından analiz edildi. Enzimatik hidrolizden sonra elde edilen monomerik şekerler, Bio-Rad (Hercules, CA) Aminex HPX-87P kolonu ve kül koruyucu kolonu ile donatılmış HPLC ile analiz edildi. Kolon sıcaklığı 80°C'de tutuldu, su, 0,6 ml/dak akış hızıyla hareketli faz olarak kullanıldı. Oligosakkaritler, 41, 48, 49. referanslarda açıklanan yöntemlere göre 121°C'de seyreltik asitte hidroliz yoluyla belirlendi.
Sakkarit analizi, ham, AFEX ile önceden işlenmiş ve tüm hidrolize edilmemiş biyokütle kalıntıları üzerinde (seri hücre duvarı özütlerinin üretimi ve bunların mAb taraması dahil) daha önce açıklanan prosedürler 27, 43, 50, 51 kullanılarak gerçekleştirildi. Glikom analizi için, bitki hücre duvarı materyalinin alkolde çözünmeyen kalıntıları biyokütle kalıntılarından hazırlanır ve amonyum oksalat (50 mM), sodyum karbonat (50 mM ve %0,5 w/v), CON. (1M ve 4M, her ikisi de %1 w/v sodyum borohidrit ile) ve asit klorit gibi giderek daha agresif reaktiflerle seri ekstraksiyona tabi tutulur, daha önce açıklandığı gibi52,53. Ekstraktlar daha sonra hücre duvarı glikanına yönlendirilmiş karmaşık bir mAb50 paneline karşı ELISA'ya tabi tutuldu ve mAb bağlanma reaksiyonları bir ısı haritası olarak sunuldu. Bitki hücre duvarı glikanını hedef alan mAb'ler laboratuvar stoklarından (CCRC, JIM ve MAC serileri) satın alındı.
Oligosakkaritlerin tek adımlı biyotinilasyonu. Karbonhidratların biyotin-LC-hidrazit ile konjugasyonu aşağıdaki prosedür kullanılarak gerçekleştirildi. Biyotin-LC-hidrazit (4,6 mg/12 μmol), 65° C'de 1 dakika boyunca kuvvetlice karıştırılarak ve ısıtılarak dimetil sülfoksit (DMSO, 70 μl) içinde çözüldü. Buzlu asetik asit (30 μl) eklendi ve karışım sodyum siyanoborohidrit (6,4 mg/100 μmol) üzerine döküldü ve yaklaşık 1 dakika boyunca 65° C'de ısıtıldıktan sonra tamamen çözüldü. Daha sonra, reaksiyon karışımından 5 ila 8 μl kurutulmuş oligosakkarite (1-100 nmol) eklenerek indirgeyici uç üzerinde etiketin 10 kat veya daha fazla molar fazlalığı elde edildi. Reaksiyon 65° C'de 2 saat boyunca gerçekleştirildi ve ardından örnekler hemen saflaştırıldı. Etiketleme deneylerinde indirgeme yapılmadan sodyum siyanoborohidrit kullanılmadı ve örnekler 65°C’de 2,5 saat reaksiyona sokuldu.
Biyotinlenmiş oligosakkarit örneklerinin ELISA ile kaplanması ve yıkanması. Biyotinlenmiş örneklerin 25 μl'si (her konsantre örneğin 100 μl'si 5 ml 0,1 M Tris tampon çözeltisinde (TBS) seyreltilmiş) avidin kaplı plakanın her bir kuyusuna eklendi. Kontrol kuyuları 0,1 M TBS'de 10 μg/ml konsantrasyonda 50 μl biyotin ile kaplandı. Kör ölçümler için kaplama olarak deiyonize su kullanıldı. Tablet karanlıkta oda sıcaklığında 2 saat inkübe edildi. Grenier düz 3A için 11 numaralı programı kullanarak plakayı 0,1 M TBS'de %0,1 yağsız süt ile 3 kez yıkayın.
Birincil antikorların eklenmesi ve yıkanması. Her kuyuya 40 µl birincil antikor ekleyin. Mikroplakayı karanlıkta oda sıcaklığında 1 saat inkübe edin. Plakalar daha sonra Grenier Flat 3A için yıkama programı #11 kullanılarak 0,1 M TBS'de %0,1 süt ile 3 kez yıkandı.
İkincil antikor ekleyin ve yıkayın. Her bir kuyuya 50 µl fare/sıçan ikincil antikoru (0,1 M TBS'de 0,1% sütte 1:5000 oranında seyreltilmiş) ekleyin. Mikroplakayı karanlıkta oda sıcaklığında 1 saat inkübe edin. Mikroplakalar daha sonra Grenier Flat 5A plaka yıkama programı #12 kullanılarak 0,1 M TBS'de 0,1% sütle 5 kez yıkandı.
Substrat ekleme. Baz substrata 50 µl 3,3′,5,5′-tetrametilbenzidin (TMB) ekleyin (15 ml deiyonize suya 2 damla tampon, 3 damla TMB, 2 damla hidrojen peroksit ekleyerek). TMB substratını hazırlayın. ve kullanmadan önce vorteksleyin). Mikroplakayı oda sıcaklığında 30 dakika inkübe edin. Karanlıkta.
Adımı tamamlayın ve tableti okuyun. Her bir kuyuya 50 µl 1 N sülfürik asit ekleyin ve bir ELISA okuyucusu kullanarak 450 ila 655 nm arasındaki absorbansı kaydedin.
Bu analitlerin deiyonize suda 1 mg/ml çözeltilerini hazırlayın: arabinoz, ramnoz, fükoz, ksiloz, galakturonik asit (GalA), glukuronik asit (GlcA), mannoz, glikoz, galaktoz, laktoz, N-asetilmannosamin (manNAc), N-asetilglukozamin (glcNAc), N-asetilgalaktozamin (galNAc), inozitol (dahili standart). Tablo 1'de gösterilen 1 mg/mL şeker çözeltileri eklenerek iki standart hazırlandı. Örnekler dondurulur ve tüm su uzaklaştırılana kadar (genellikle yaklaşık 12-18 saat) -80° C'de liyofilize edilir.
Analitik terazide vidalı kapaklı tüplere 100–500 µg numune ekleyin. Eklenen miktarı kaydedin. Numuneyi belirli bir çözücü konsantrasyonunda eritmek ve tüpe sıvı bir alikot olarak eklemek en iyisidir. Her numune tüpü için dahili standart olarak 20 µl 1 mg/ml inositol kullanın. Numuneye eklenen dahili standart miktarı, standart tüpe eklenen dahili standart miktarıyla aynı olmalıdır.
Vidalı kapaklı bir şişeye 8 ml susuz metanol ekleyin. Sonra 4 ml 3 N. metanollü HCl çözeltisi ekleyin, kapatın ve çalkalayın. Bu işlem su kullanmaz.
Oligosakkarit örneklerine ve standart TMS tüplerine 500 µl 1 M HCl metanol solüsyonu ekleyin. Örnekler termal blokta 80° C'de bir gece (168 saat) inkübe edildi. Metanoliz ürününü bir kurutma manifoldu kullanarak oda sıcaklığında kurutun. 200 µl MeOH ekleyin ve tekrar kurutun. Bu işlem iki kez tekrarlanır. Örneğe 200 µl metanol, 100 µl piridin ve 100 µl asetik anhidrit ekleyin ve iyice karıştırın. Örnekleri oda sıcaklığında 30 dakika inkübe edin. ve kurutun. 200 µl metanol ekleyin ve tekrar kurutun.
200 µl Tri-Sil ekleyin ve kapaklı tüpü 20 dakika ısıtın. 80°C, ardından oda sıcaklığına soğutulur. Numuneyi yaklaşık 50 µl'lik bir hacme daha fazla kurutmak için bir kurutma manifoldu kullanın. Numunelerin tamamen kurumasına izin vermediğimizi belirtmek önemlidir.
2 ml hekzan ekleyin ve vorteksleyerek iyice karıştırın. Pasteur pipetlerinin uçlarını (5-8 mm) bir parça cam yünü ile doldurun ve cam yünü 5-3/4 inç çapındaki bir pipetin üstüne yerleştirin. Örnekler 2 dakika boyunca 3000 g'de santrifüj edildi. Çözünmeyen kalıntılar çökeltildi. Örneği 100-150 µl'ye kurutun. Yaklaşık 1 µl'lik bir hacim GC-MS'e 80 °C'lik bir başlangıç ​​sıcaklığında ve 2,0 dakikalık bir başlangıç ​​süresinde enjekte edildi (Tablo 2).