Nature.com сайтына кергәнегез өчен рәхмәт. Сез кулланган браузер версиясе CSS өчен чикләнгән ярдәмгә ия. Иң яхшы тәҗрибә өчен без яңартылган браузерны кулланырга киңәш итәбез (яки Internet Explorer'та яраклашу режимын сүндерегез). Шул ук вакытта, ярдәмне дәвам итәр өчен, без сайтны стильләр һәм JavaScriptсыз күрсәтәчәкбез.
Кеше эчәк морфогенезы 3D эпителия микроархитектурасы һәм киңлек оешмасының крипт-виллус үзенчәлекләрен билгели. Бу уникаль структура базаль крипттагы төп күзәнәк урынын экзоген микробиаль антиген һәм аларның метаболиталарыннан саклап, эчәк гомостазын саклап калу өчен кирәк. витро эчәк модельләрен төзү өчен бик мөһим. Игътибар белән, органик миметик эчәк-чип эчәк эпителиянең үз-үзеннән 3D морфогенезын көчәйтә ала, физиологик функцияләр һәм биомеханика белән. Монда без эчәк эчәк морфогенезын эчә торган микроблуидик чиптагы микроблюидик чипта урнаштырылган. Како-2 яки эчәк органоид эпителий күзәнәкләре гадәти шартларда, шулай ук ​​микрофлуидик платформада, 3D морфогенез индукциясе, һәм күп санлы сурәтләү ысуллары ярдәмендә урнаштырылган 3D эпителиягә характеристика .Бу протокол функциональ эчәк микроархитектурасының яңарышына ирешә, ул витро морфогенез ысулы белән эш итә. Без булган протокол биомедицина тикшеренүләре җәмгыяте өчен киң йогынты ясарга мөмкин, биомедицина, клиник һәм фармацевтика кушымталары өчен витрода 3D эчәк эпителия катламнарын торгызу ысулын тәкъдим итәбез.
Тикшеренүләр күрсәткәнчә, эчәк эпителий Како-2 күзәнәкләре эчәк-чипта культуралы 1,2,3,4,5 яки билайер микрофлуид җайланмалары6,7 төп механизмны аңламыйча, үз-үзеннән 3D морфогенез кичерергә мөмкин. Соңгы тикшеренүләребездә без базолатераль рәвештә яшерелгән морфоген антагонистларын культуралы җайланмалардан чыгару кирәклеген ачыкладык. Caco-2 һәм пациенттан алынган эчәк органоидлары. Эпителий күзәнәкләре расланган. Бу тикшеренүдә без махсус Wnt антагонисты, Диккопф-1 (DKK-1) күзәнәк җитештерүенә һәм концентрация бүленешенә игътибар иттек, "Гибрид Чип" дип аталган Transwell кыстыргычлары булган микрофлуидик приборлар. 1, яки Soggy-1) чиптагы эчәккә морфогенезны тыя яки преструктуралаштырылган 3D эпителия катламын боза, бу витродагы эчәк морфогенезы өчен культура вакытында антагонистик стресс өчен җаваплы булуын күрсәтә. яки гибрид-чип платформалары) яки диффузия .Басолотераль медиа (мәсәлән, Трансвелл скважиналардагы зур базололетлы сусаклагычларга кертә).
Бу протоколда без полимиметилсилоксан (PDMS) нигезендәге күзәнәк мембраналардагы эчәк эпителия күзәнәкләренә культуралы эчәк эпителия күзәнәкләрен (1-5 адым) яки Transwell кыстыргычларының полиэстер мембраналарын (6Б адымнары, 6Б адымнары) ) биомеханик микроэнергетика.in vitro. 2D эпителий монолайерлардан 3D морфогенез кертү өчен, без культураның ике яклы формасына морфоген антагонистларын чыгардык. Ахырда, без яңартыла торган 3D эпителия катламы, морфогенга бәйле эпителия катламы, морфоген-инфекцияле эпителия катламы моделен кулланырга мөмкин. эпителий барьер дисфункциясе, һәм пробиотик нигездә терапия Мисал.influences.
Безнең протокол киң галимнәр өчен файдалы булырга мөмкин (мәсәлән, эчәк шакалы биологиясе, тамыр күзәнәк биологиясе, һәм үсеш биологиясе) һәм гамәли тикшеренүләр (мәсәлән, преклиник наркотиклар сынау, авыруларны модельләштерү, тукымалар инженериясе, һәм гастроэнтерология) киң йогынты. Эчәк үсеше, яңару яки гомеостаз вакытында .Бу өстәвенә, безнең протокол Норовирус 8, Каты кискен сулыш синдромы Coronavirus 2 (SARS-CoV-2), Clostridium difficile, Salmonella Typhimurium 9 яки Vibrio holerae кебек инфекцияне сорау өчен файдалы. Авыру патологиясе һәм патогенезы аудиториясе дә файдалы. Чиптагы эчәк микрофизиология системасын куллану озын озын культураны һәм ашказаны-эчәк (GI) трактында патоген белән бәйле җәрәхәтләрне төзәтүне бәяләргә мөмкинлек бирә. 11. эпителия катламнары пациентның 3D эчәк эпителия катламнары ярдәмендә әзерләнә, бу авыруларга вилослы атрофия, крипт кыскарту, былжыр зарар яки эпителия киртәсе керә. Биопси яки тамырдан алынган эчәк органоидлары12,13. микроархитектура. тукымаларга хас иммун күзәнәкләр, 5.
3D эпителия микросруктурасы бүлеп бирү процессыннан башка үзгәртелергә һәм визуальләштерелергә мөмкин булганлыктан, киң транскриптомика һәм югары резолюцияле яки супер резолюцияле сурәтләү өстендә эшләүче тамашачылар безнең эпителия урыннарындагы геннар һәм аксымнарның спатиотемпораль динамикасын картасы белән кызыксынырга мөмкин. Технология белән кызыксыналар. Микробиаль яки иммун стимулга җавап. Моннан тыш, озынлыктагы хуҗа-микробиом кроссталь 10, 14 эчәк гомостазын координацияли торган 3D эчәк шакалы катламында төрле микробиаль төрләрне, микробиаль җәмгыятьләрне яки фекаль микробиота белән аеруча культураны булдырып була. Бу ысул былжыр иммунология, гастроэнтерология, кеше микробиомы, культуромика һәм клиник микробиологияне өйрәнүче аудитория өчен аеруча җәлеп итә. Әгәр дә безнең витро морфогенез протоколы масштаблы культура форматларына яраклаштырылса, ул шулай ук ​​24, 96 яки 384 скважиналарны тулыландыра ала. Азык-төлек сәнәгате өчен фармацевтика, биомедицина яки югары үткәрү скринклау яки тикшерү платформаларын үстерү. Принцип буларак, без күптән түгел 24 кое тәлинкә форматына кадәр киңәйтелә торган мультиплекслы югары морфогенез системасының мөмкинлеген күрсәттек. Моннан тыш, күп орган-чип продуктлары коммерцияләштерелгән, водротехник методиканы тикшерү. Наркотиклар яки биотерапевтика сынау өчен транскриптом дәрәҗәсендә витро эчәк морфогенезының кәрәзле репрограммалашуын аңлау өчен контроль органнары наркотикларга кандидатларның үзләштерүе һәм ташуы 3D эчәк суррогатлары ярдәмендә яки эчәк морфогенез процессының репродуктивлыгын бәяләү өчен махсус яки коммерция орган-чип модельләрен кулланып бәяләнде.
Эчәк эпителия морфогенезын өйрәнү өчен чикләнгән санлы эксперименталь модельләр кулланылды, күбесенчә витрода 3D морфогенез кертү өчен кулланыла торган протоколлар булмау аркасында. Эчәк морфогенезы турында хәзерге белемнәрнең күбесе хайваннарны өйрәнүгә нигезләнә (мәсәлән, зебрафиш20, тычканнар 21 яки тавыклар 22). процесслар. Бу модельләр шулай ук ​​күпкырлы масштаблы сынау мөмкинлекләре белән бик чикле. Шуңа күрә, виво хайван модельләрендә витро формаларында 3D тукымалар структураларын торгызу өчен безнең протокол, шулай ук ​​башка традицион статик 2D күзәнәк культурасы модельләре. Элегерәк тасвирланганча, 3D эпителия структураларын куллану безгә крипт-виллус күчәренең дифференциацияләнгән күзәнәкләренең киңлек локализациясен тикшерергә мөмкинлек бирде. микробиаль күзәнәкләр хуҗа факторларына (мәсәлән, тышкы былжыр катламнарына каршы, ИГА сигнализациясе һәм антимикробиаль пептидлар) киңлек урыннары һәм экологик эволюция формалаштыру өчен көч сынаша. Моннан тыш, 3D эпителия морфологиясе эчәк микробиота үз җәмгыятьләрен ничек төзәтә һәм синергистик рәвештә микробиаль метаболитлар җитештерә ала (мәсәлән, кыска чылбырлы май кислоталары). витрода урнаштырылган.
3D эчәк эпителия структураларын булдыру ысулына өстәп, берничә витро ысул бар. Эчәк органоид культурасы - заманча тукымалар инженериясе техникасы, махсус морфоген шартларында эчәк тамыр клеткаларын үстерүгә нигезләнгән23,24,25. Шулай да, транспорт анализы яки хуҗа-микробиом ко-культуралары еш кына авыр, чөнки эчәклек һәм эчәк микробиом кушылмалары. микробиаль күзәнәкләр яки экзоген антиген кебек компонентлар чикләнгән. Органоид люменнарга керү 26,27 микроинжектор ярдәмендә яхшырырга мөмкин, ләкин бу ысул инвазив һәм хезмәт таләп итә һәм башкару өчен махсус белем таләп итә. Моннан тыш, статик шартларда гидрогель скафолдаларында сакланган традицион органоид культуралары виво биомеханикада актив чагылдырылмый.
Берничә тикшеренү төркеме кулланган бүтән алымнар преструктуралаштырылган 3D гидрогель скафолдларын кулланалар, эчәк эпителия структурасын охшаталар, гель өслегендә изоляцияләнгән эчәк күзәнәкләрен эшкәртәләр. 3D басма, микро тегермән яки литографик ясалган формалар ярдәмендә гидрогель скафолдлары ясыйлар. Строма-эпителия кросстокы, стромаль күзәнәкләрне скафолдка кертеп. Шулай да, преструктуралаштырылган скафолдларның табигате үз-үзеннән морфогенетик процессны күрсәтергә комачаулый ала. Бу модельләр шулай ук ​​динамик луминаль яки интерстиаль агымны тәэмин итмиләр, эчәк эчәк күзәнәкләре гидродиф микрофогенезы. һәм лазер эшкәртү ысулларын кулланып эчәк эпителия структуралары. Тычкан эчәк органоидлары эчәк труба структураларын формалаштыру өчен сызылган үрнәкләргә иярәләр, һәм эчәклек сыеклык агымы микрофлуидика модуле ярдәмендә кабатланырга мөмкин. Ләкин бу модель үз-үзеннән морфогенетик процесслар күрсәтми һәм эчәк механобиологик хәрәкәтләр кертә. Труба эчендә төрле эчәк сегментларының катлаулы ясалышы, бу модельдә луминаль сыеклык агымы һәм механик деформация дә җитми. Өстәвенә, биопринтаж процессы тәмамланганнан соң, эксперимент шартлары яки күзәнәк-күзәнәк үзара бәйләнешне бозганнан соң, модельнең оперативлыгы чикләнергә мөмкин. катлаулы биологик микроэнергетика модулитарлыгын яңадан булдыру. Шуңа күрә безнең витро 3D морфогенез протоколы булган ысулларның проблемаларын җиңәр өчен өстәмә ысул тәкъдим итә ала.
Безнең протокол тулысынча 3D эпителия морфогенезына юнәлтелгән, культурада эпителий күзәнәкләр генә бар, месенчималь күзәнәкләр, эндотелия күзәнәкләре, иммун күзәнәкләр кебек әйләнә-тирә күзәнәкләр юк. Элегерәк тасвирланганча, безнең протоколның асылы эпителия морфогенезы индуктивлыгы булып тора. гибрид-на-чип безгә 3D эпителия катламын ясарга мөмкинлек бирә, эпителия-месенчималь үзара бәйләнешләр кебек өстәмә биологик катлаулылыклар33,34, күзәнәктән тыш матрица (ECM) 35 һәм безнең модельдә базаль криптларда төп күзәнәк урыннарын китерә торган крипт-вилл үзенчәлекләре алга таба каралырга тиеш. vivo 35,37,38 морфогенезы. Месенчималь күзәнәкләрнең безнең модельгә кушылуы морфогенетик процессны һәм күзәнәкләрне бәйләү эффективлыгын көчәйтте. Эндотелия катламы (ягъни капиллярлар яки лимфатика) молекуляр транспортны көйләүдә мөһим роль уйный39 һәм эчәк микроэнергиядә иммунитет күзәнәкләрен туплау 40. үзара бәйләнеш. Шуңа күрә, организм дәрәҗәсендәге төгәл физиологик үзенчәлекләрне модельләштерү өчен эндотелия күзәнәкләрен кертергә кирәк булырга мөмкин. Пациенттан алынган иммун күзәнәкләр тумыштан килгән иммун реакцияләрне, антиген презентациясен, тумыштан килгән адаптив иммун кросстальны, эчәк авыруларын охшату шартларында тукымаларга хас иммунитетны күрсәтү өчен бик кирәк.
Гибрид чипларны куллану эчәк-чипка караганда гадирәк, чөнки җайланма урнаштыру гадирәк һәм Transwell кыстыргычларын куллану эчәк эпителийының масштаблы культурасын булдырырга мөмкинлек бирә. Ләкин полиэстер мембраналары белән коммерцияле булган Transwell кыстыргычлары эластик түгел һәм перистальтик охшаш хәрәкәтләрне охшата алмый. Апик бүлмәдәге статик үзенчәлекләр сирәк гибрид чипларда озак вакытлы бактерия культурасын булдырырга мөмкинлек бирә. Без гибрид чиплар кулланганда Трансвелл кыстыргычларында 3D морфогенезны кертә алабыз, физиологик яктан актуаль биомеханика һәм апик сыеклык агымы потенциаль кушымталар өчен гибрид чип платформаларының мөмкинлеген чикләргә мөмкин.
Кеше крипт-вилл күчәренең тулы масштаблы реконструкциясе эчәк-чип һәм гибрид-чип культураларында тулысынча төзелмәгән. Морфогенез эпителия монолайерыннан башланганга күрә, 3D микроархитектура виво криптларына морфологик охшашлык тудырмый. Чиптагы югары каналлар микроинженер эпителийның биеклеген арттыруга китерсәләр дә, максималь биеклек һаман да ~ 300–400 мм белән чикләнә. Кечкенә һәм зур эчәклектә кеше эчәк криптларының чын тирәнлеге тиешенчә ~ 135 µm һәм ~ 400 µm, һәм кечкенә эчәк виллының биеклеге ~ 600 µm41.
Тасвирлау күзлегеннән караганда, 3D микроархитектураның супер-резолюцияле имиджы чиптагы эчәк белән чикләнергә мөмкин, чөнки объектив линзадан эпителия катламына кадәр булган эш арасы берничә миллиметр тәртибендә. Бу проблеманы җиңәр өчен, ерак максат таләп ителергә мөмкин. һәр катлам арасында ябышу, эпителия катламының өслек структурасын тикшерү өчен өске катламны ачу яки чыгару бик авыр. Мисал өчен, сканерлау электрон микроскопы (SEM) ярдәмендә.
ПДМС гидрофобиклыгы гидрофобик кечкенә молекулалар белән эш итүче микрофлуидик тикшеренүләрдә чикләүче фактор булды, чөнки PDMS андый гидрофобик молекулаларны махсус рәвештә үзләштерә ала. ПДМС алтернатлары башка полимер материаллар белән каралырга мөмкин. молекулалары.
Ниһаять, безнең ысул югары үткәргеч скринка яки "бер размерлы-барсы да" кулланучыларга файдалы эксперименталь платформа белән тәэмин ителү ягыннан яхшы характеристика бирелмәгән. Хәзерге протокол микродевицага шприц насосын таләп итә, ул CO2 инкубаторында урын ала һәм зур масштаблы экспериментларны булдырмый. төп мәгълүмат чараларын бетерү).
Витродагы кеше эчәк эпителиясенең 3D морфогенезын кертү өчен, без люмен-капиллярлы интерфейс булдыру өчен ике параллель микроканнель һәм эластик күзәнәк мембрананы үз эченә алган микрофлуидик чип эчәк җайланмасын кулландык. эпителия күзәнәкләре морфоген антагонистларны базололетлы бүлмәдән чыгару өчен агымның юнәлешле манипуляциясе ярдәмендә күрсәтелергә мөмкин. Барлык эксперименталь процедура (1 нче рәсем) биш өлештән тора: 2-5 тартмалар), (iii) эчәк эпителия күзәнәкләренең эчәк чипларында яки гибрид чипларда (6-9 адымнар), (iv) 3D морфогенез индуктивлыгы витрода (10 адым) һәм (v)) 3D эпителия микроструктурасын характерлау өчен (11-24 адымнар). Ниһаять, тиешле контроль төркем (витро морфелозы эффективлыгын тикшерү өчен). шартлы, яки процессуаль контроль.
Без ике төрле культура платформасын кулландык: туры каналлар яки сызыксыз җыелган каналлар белән эчәк-чип, яки микрофлюидик җайланмада Transwell (TW) кыстыргычлары булган гибрид чиплар, 1 нче рамкада күрсәтелгәнчә эшләнгән һәм 1-5 адым. "Devайланма җитештерү" бер чип яки гибрид чип ясауның төп адымнарын күрсәтә. Бу протоколда кулланылган культура процедурасы. "Витро морфогенез" Caco-2 яки органоидтан алынган эпителия күзәнәкләренең эчәк чипта яки гибрид чипның Трансвелл кыстыргычларында культуралы булган гомуми адымнарын күрсәтә. Соңыннан 3D морфогенез индуктивлыгы һәм характерлы эпителия структурасы формалашуы. дифференциацияләү характеристикасы, эчәк физиология тикшеренүләре, хуҗа-микробиом экосистемаларын булдыру, һәм авыруларны модельләштерү. "Күзәнәк дифференциациясендә" иммунофлуоресцент рәсемнәр, эчәк чипында барлыкка килгән 3D Caco-2 эпителия катламында күрсәтелгән ядрәләр, F-актин һәм MUC2. Н-ацетилглукозамин калдыклары флуоресцент бодай микробы агглутинин кулланалар. "Хост-микроб ко-культуралары" ндагы ике капма-каршы рәсем эчәк эчендәге хуҗа-микробиом культураларын күрсәтә. Сул панельдә Э.Коли культурасы күрсәтелә, яшел флуоресцент белок (GFP) микроэлементлы 3D Caco-2 эпителиясе. 3D Caco-2 эпителий күзәнәкләре, аннан соң F-актин (кызыл) һәм ядрәләр (зәңгәр) белән иммунофлюорсент буяу .Disease модельләштерү бактерия антигенләре (мәсәлән, липополисахарид, LPS) һәм иммун күзәнәкләр (мәсәлән, ПБМК; яшел) .Caco-2 күзәнәкләре булган. аскы рәттә: "Күзәнәкләрне дифференциацияләү" сылтама рөхсәте белән җайлаштырылган. Оксфорд университеты матбугаты; 5 нче рөхсәт белән кабатлана. NAS; "Хост-микроб ко-культурасы" 3-нче рөхсәт белән җайлаштырылган. NAS; "Авыруларны модельләштерү" сылтама рөхсәте белән җайлаштырылган.5. NAS.
Эчке чип та, гибрид чиплар да кремний формаларыннан йомшак литография белән демолдланган һәм SU-8 белән бизәлгән PDMS репликалары ярдәмендә ясалганнар. Eachәр чиптагы микроканнельләрнең дизайны кыру стрессы һәм гидродинамик басым кебек гидродинамиканы исәпкә алып билгеләнә. катлаулы эчәк-чипка әверелде (киңәйтелгән мәгълүматлар рәсеме 1б), бу парлы микроканнельләрне үз эченә ала, сыеклыкның яшәү вакытын арттыру, сызыксыз агым формалары, һәм культуралы күзәнәкләрнең мультиаксиаль деформациясе. Морфогенез охшаш вакыт эчендә эпителия үсешенең охшаш дәрәҗәсе булган, культуралы күзәнәк төренә карамастан, оригиналь Гут-Чип белән чагыштырганда. Шуңа күрә, 3D морфогенезны кертү өчен, сызыклы һәм катлаулы чип эчәк конструкцияләре алышынып тора. күзәнәк PDMS пленкасы, аннары корона эшкәртмәсе ярдәмендә кире кайтарылмый торган бәйләнеш белән аскы PDMS катламы белән тигезләнде. Гибрид чиплар ясау өчен, дәваланган PDMS репликалары пыяла слайдларга бәйләнде, алар Трансвелл кыстыргычларын урнаштыра ала (2-нче рәсем һәм плазманы эшкәртү плазмасы белән эшкәртелә. Силикон трубасына тоташтырылган микрофабрикат җайланманы стерилизацияләү, җайланма урнаштыру эчәк эпителийның 3D морфогенезын ясарга әзер иде (2 нче рәсем).
а, ПДМС өлешләрен SU-8 үрнәк кремний формаларыннан әзерләүнең схематик иллюстрациясе. Сакланмаган PDMS эремәсе кремний формасына (сулга) салынган, 60 ° C (урта) белән дәваланган һәм демолдланган (уңда) .Демолдланган PDMS кисәкләргә киселгән һәм алга таба куллану өчен чистартылган. membrane.d, өске һәм аскы PDMS компонентларының һәм җыелган чиптагы эчәк җайланманың фотосурәтләре сериясе, өске, мембрана һәм аскы PDMS компонентларының тигезләнү схемасы. Eachәр катлам плазма яки корона белән эшкәртү белән кире кайтарылмый. культурасы. Силикон труба һәм шприц белән җыелган чиптагы эчәк каплагычка урнаштырылды. Чип җайланмасы эшкәртү өчен 150 мм Петри савытының капкасына куелды. Бәйләүче силикон трубасын ябу өчен кулланыла. эчәк 3D морфогенезы. Трансвелл кыстыргычында урнаштырылган күзәнәк катламы астындагы микроканнельләр ярдәмендә парфюмерияләнә. Масштаб сызыгы, 1 см. Elsevier.
Бу протоколда Caco-2 күзәнәк линиясе һәм эчәк органоидлары эпителия чыганаклары буларак кулланылды (3а рәсем) .Бер төрле күзәнәкләр дә мөстәкыйль культураланганнар (2 нче рамка һәм 5 нче рамка) һәм ECM белән капланган микроканнельләрне чип-эчәк яки Transwell кыстыргычлары чәчү өчен кулланылганнар. Трипсинизация сыеклыгы (2 нче рамка) белән аерылган күзәнәк асылмаларын әзерләү өчен җыелган. Эчәк биопсиясеннән яки хирургик резекцияләрдән кеше эчәк органоидлары структур микроэнергетикага булышу өчен 24 кое тәлинкәләрдә Матригель скафолд гөмбәзләрендә культуралы булганнар. Диаметрда. Тулы үскән органоидлар җыеп, эчәккә яки Трансвеллга чипка чәчү өчен бер күзәнәкләргә бүленәләр (5 нче рамка). Элегерәк хәбәр иткәнчә, ул 12,13 авыру төре буенча дифференциацияләнергә мөмкин (мәсәлән, ульсератив колит, Хрон авыруы, колоректаль яман шеш, яки гади донор) jejunum, ileum, cecum, colon, яки rectum) .Без 5-нче рамкада колоник органоидларны (колоидларны) үстерү өчен оптимальләштерелгән протокол тәкъдим итәбез, гадәттә кечкенә эчәк органоидларына караганда морфоген концентрацияләрен таләп итә.
а, эчәк чипында эчәк морфогенезы индуктивлыгы өчен эш процессы. Како-2 кеше эчәк эпителиясе һәм эчәк органоидлары бу протоколда 3D морфогенезны күрсәтү өчен кулланыла. Изоляцияләнгән эпителия күзәнәкләре чип җайланмасына чәчелгән (чип әзерләнгән). беренче 2 көн эчендә башланган һәм сакланган (агым, AP, D0-D2) .Басолотераль (BL) агым шулай ук ​​тулы 2D монолайеры барлыкка килгәндә цикл сузу хәрәкәтләре белән башлана. Эчке 3D морфогенезы 5 көн микрофлуидик культураның (морфогенез, морфогенез, D5) күрсәтелгән. нокта (штрих график, 100 µм). Эчәк морфогенезының тиешле каскадларын күрсәтүче дүрт схематик схема (өске уңда) .Схематик сызылган уклар сыеклык агымының юнәлешен күрсәтәләр. Caco-2 3D горизонталь фронталь күренеше, клаудин (ZO-1, кызыл) һәм F-актин (яшел) һәм ядрәләр (зәңгәр) иммунофлюоресцент эчәк эпителия күзәнәкләренең конфокаль визуализациясе дип аталган өзлексез чик чик мембраналары. 3, 7, 9, 11, һәм 13. (Сулда) һәм эпителия катламында 13 көнлек (урта) органоидлар. Шулай ук ​​киңәйтелгән Мәгълүматны карагыз. 3-нче рәсемдә күрсәтелгән, ул MUC2 сигнализациясез LGR5 сигнализациясен күрсәтә. Оксфорд университеты матбугаты; в Белешмә рөхсәте белән җайлаштырылган.2. Оксфорд университеты матбугаты; e һәм f сылтама белән рөхсәт белән җайлаштырылган.12 Creative Commons лицензиясе буенча CC BY 4.0.
Чиптагы эчәклектә, уңышлы ECM каплау өчен PDMS күзәнәк мембранасының гидрофобик өслеген үзгәртергә кирәк. Бу протоколда без PDMS мембраналарының гидрофобиклыгын үзгәртү өчен ике төрле ысул кулланабыз. Органоид эпителийының микрофлуидик культурасы полиэтиленимин (PEI) һәм глютаральдегидны PDMS микроканнельләренә эзлекле кулланып, ECM аксымнарының эффектив чүпләнүенә ирешү өчен химик нигезләнгән өслек функциональләштерүен таләп итә. күзәнәкләр тулы монолайер формалашканчы, аскы микроканнель статик шартларны саклый. Бу өслекне активлаштыру һәм ECM каплау өчен оптимальләштерелгән ысул органоид эпителиясен PDMS өслегендә 3D морфогенезга китерергә мөмкинлек бирә.
Трансвелл культуралары шулай ук ​​күзәнәк орлыклары алдыннан ECM каплавын таләп итәләр. шулай да, Трансвелл культуралары күзәнәк кыстыргычлар өслеген активлаштыру өчен катлаулы алдан ук адымнар таләп итмиләр. Трансвелл кыстыргычларында Caco-2 күзәнәкләрен үстерү өчен, күзәнәк кыстыргычларда ECM каплавы аерылган Caco-2 күзәнәкләрен (<1 сәгать) бәйләүне тизләтә (<1-2 көн). һәм органоидлар барьер бөтенлеге белән тулы монолайер формалашканчы саклана .Трансвелл культуралары гибрид чиплар кулланмыйча 24 кое тәлинкәләрдә башкарыла.
Витро 3D морфогенезы эпителия катламының төп аспектына сыеклык агымын кулланып башланырга мөмкин. Чиптагы эчәклектә эпителия морфогенезы урта һәм аскы микроканнельләргә кушылганнан соң башланды. күзәнәк мембраналарда һәм луминаль кыру стрессын тудырабыз, без гадәттә чипка эчәклектә икеләтә агым кулланабыз. Гибрид чипларда, гибрид чипларга эпителия монолайерлары булган Трансвелл кыстыргычлары кертелде. Аннары, урта микроаннель аша күзәнәкле Трансвелл кертү базолотацион ягы астында кулланылды.
Микроэжинирланган 3D эпителия катламнарының морфологик үзенчәлекләрен төрле сурәтләү ысулларын кулланып анализларга мөмкин, шул исәптән фаза контраст микроскопиясе, дифференциаль интерфейс контрасты (DIC) микроскопия, SEM, яки иммунофлюоресцент конокаль микроскопия (3 һәм 4 нче рәсемнәр) .Фаза контрасты яки DIC тасвирламасы культура вакытында 3D эпителия полюсының оптик оптикасы. эчәк-чип һәм гибрид чип платформалары җайланманы бүлү яки сүтү кирәксез реаль-ситу картинасында реаль вакыт бирә ала. Иммунофлюорсент күзаллау ясаганда (рәсемнәр 1, 3c, f һәм 4b, c), күзәнәкләр гадәттә 4% (wt / vol) параформалдегид (PFA), аннары Тритон X-100 һәм 2% бод (wtine). күзәнәк тибында төрле фиксиваторлар, пермабилизаторлар һәм блокировкалаучы агентлар кулланылырга мөмкин. Нәселгә бәйле күзәнәк яки регион маркерларына каршы беренчел антителалар чиптагы ситуада иммобилизацияләнгән күзәнәкләрне яктырту өчен кулланыла, аннары икенчел антителалар, яисә ядрога каршы контраст буяу (мәсәлән, 4 ′, 6-диамидино-2-фенилин), DAPin, актилин, DAPinin, 2-фенилин). фаллоидин) .Флуоресцентка нигезләнгән тере сурәтләү шулай ук ​​былжыр җитештерүне ачыклау өчен ситуада башкарылырга мөмкин (1 нче рәсем, "Күзәнәк дифференциациясе" һәм "Гут физиологиясе"), микробиаль күзәнәкләрне очраклы колонизацияләү (1 нче рәсем, "Хост-микроб ко-культурасы"), иммун күзәнәкләрен туплау (1 нче рәсем, 'Авыру модельләштерү') һәм 3D эпителы. Чиптагы эчәк өске катламны аскы микроканнель катламыннан аеру өчен, 2 нче рәсемдә күрсәтелгәнчә, 3D эпителия морфологиясе, шулай ук ​​апикаль кисточка чикендәге микровилли SEM (3б рәсем) белән визуальләштерелергә мөмкин. молекуляр яки генетик анализ өчен кулланыла.
а, гибрид чипта эчәк морфогенезын индукцияләү өчен эш процессы. Бу протоколда гибрид чип платформасында 3D морфогенезны күрсәтү өчен кулланыла. культура). 7 көннән соң, эпителия күзәнәкләренең 2D монолайеры булган бер Трансвелл кыстыргыч гибрид чипка интеграцияләнде, ул төп агымны (агым, BL) барлыкка китерде, ахыр чиктә 3D эпителия катламы (морфогенез) барлыкка килүенә китерде. һәр адым өчен эксперименталь конфигурация, гибрид чиплар (сул схематик) органоид эпителий күзәнәкләренең 3D морфогенезына китерергә мөмкин, төрле Z позицияләрендә (өске, урта һәм аскы; уң схематик һәм туры нокта сызыкларын карагыз). ачык морфологик характеристикаларны күрсәтте. бар, 100 µm.c Белешмәлек рөхсәте белән бастырылган.4. Elsevier.
Контрольләр бер үк күзәнәкләрне (Како-2 яки эчәк органоид эпителий күзәнәкләрен) гадәти статик культура шартларында ике үлчәмле монолайерларга эшкәртеп әзерләнергә мөмкин. Игътибарлы, микроканнельләрнең күләм күләме чикләнгәнлектән туклыклы матдәләр бетүгә китерергә мөмкин (ягъни төп каналда ~ 4 µL төп эчәк-чип дизайнында).
Йомшак литография процессы чиста бүлмәдә башкарылырга тиеш. Чиптагы һәр катлам (өске һәм аскы катламнар һәм мембраналар) һәм гибрид чиплар өчен төрле фотомаскалар кулланылды һәм аерым кремний вафаларда ясалды, чөнки микроканнель биеклекләре төрле иде.
3 дюймлы кремний вафинны ацетонлы савытка урнаштырыгыз. Тәлинкәне 30 секундка әкрен генә әйләндерегез, аннары вафинны һава киптерегез. Ваферны IPA белән тәлинкәгә күчерегез, аннары чистарту өчен тәлинкәне 30 с.
Пиранха эремәсе (водород пероксиды һәм концентрат күкерт кислотасы катнашмасы, 1: 3 (vol / vol)) кремний вафин өслегеннән органик калдыкларны чыгаруны максимумлаштыру өчен кулланылырга мөмкин.
Пиранха эремәсе бик коррозицион һәм җылылык китерә. Өстәмә куркынычсызлык чаралары кирәк. Калдыкларны утильләштерү өчен, чишелешне салкын һәм коры калдык контейнерына күчерергә рөхсәт итегез. Икенчел контейнерларны кулланыгыз һәм калдык контейнерларын дөрес билгеләгез. Зинһар өчен, объектның куркынычсызлык кагыйдәләрен үтәгез.
Ваферларны 200 ° C кайнар тәлинкәгә 10 минутка куеп дегидратлагыз. Сусызланудан соң, вафин салкын булыр өчен биш тапкыр һавада селкетелде.
Чистартылган кремний вафатның үзәгенә ~ 10 г фоторезист куегыз. Фоторезистны ваферга тигез итеп таратыр өчен, кистергеч кулланыгыз.
SU-8 спин каплау белән ваферда тигез бүленде. СУ-8нең 5-10 с га керә торган әйләнеше 100 әйләнештә тизләнештә 500 әйләнештә таралу өчен программа. Төп әйләнешне 200 мм калынлыкта 1500 әйләнештә урнаштырыгыз, яки 250 мм калынлыкта (500 мм биеклектә ясагыз) секунд 1200 секундта.
Төп әйләнү тизлеге кремний вафатындагы SU-8 үрнәгенең максат калынлыгына карап көйләнергә мөмкин.
Чиптагы эчәкнең өске катламы өчен 500 мм биеклектәге SU-8 үрнәкләрен ясау өчен, бу тартманың әйләндергеч каплавы һәм йомшак пешерү адымнары (7 һәм 8 адымнар) эзлекле рәвештә кабатланды (9 адымны карагыз), 250 мм калынлыктагы ике катлам чыгару өчен, бу катламның 12 адымында UV экспозициясе белән кушылырга мөмкин, 500 мм биеклектә.
Йомшак пешерегез SU-8 капланган ваферларны ваферларны 65 ° C кайнар тәлинкәгә 5 минутка куеп, аннары көйләнүне 95 ° C ка күчерегез һәм өстәмә 40 минут инкубацияләгез.
Upperгары микроканнельдә SU-8 үрнәгенең 500 мм биеклегенә ирешү өчен, 7 һәм 8 адымнарны кабатлагыз, ике 250 мм калынлыктагы SU-8 катламы.
UV маска тигезләүчене кулланып, ваферның экспозиция вакытын исәпләү өчен җитештерүче күрсәтмәсе буенча лампа сынавын үткәрегез.
Экспозиция вакытын билгеләгәннән соң, фотомаскны UV маска тигезләүченең маска тоткычына куегыз һәм фотомасканы SU-8 капланган ваферга урнаштырыгыз.
УВ дисперсиясен киметү өчен, фотомаскның басылган өслеген кремний вафиның SU-8 капланган ягына урнаштырыгыз.
Алдан билгеләнгән экспозиция вакыты өчен SU-8 капланган ваферны һәм фотомасканы вертикаль рәвештә 260 mJ / см2 UV яктылыгына күрсәтегез (бу тартманың 10 адымын карагыз).
УВ тәэсиреннән соң, SU-8 белән капланган кремний вафлары 65 минутта 5 минутта һәм 95 минутта 15 минутта пешерелде, һәр кайнар тәлинкәдә 200 μм биеклектәге үрнәкләр ясау өчен.
Эшләүче пыяла савытка салына, һәм пешкән вафин савытка урнаштырыла. SU-8 эшкәртүченең күләме пыяла тәлинкәнең зурлыгына карап төрле булырга мөмкин. Мисал өчен, көтелмәгән SU-8не тулысынча бетерү өчен җитәрлек SU-8 эшкәртүчене кулланыгыз.
Developed 10 мл яңа эшкәртүче белән эшләнгән форманы чайкагыз, аннары IPA белән торбаны кулланып эремә сиптерегез.
Вафаны плазма чистарткычка урнаштырыгыз һәм кислород плазмасына (атмосфера газы, максат басымы 1 × 10−5 Торр, көче 125 Вт) 1,5 минутка тәэсир итегез.
Вафинны вакуум десикаторына пыяла слайд белән урнаштырыгыз. Ваферлар һәм слайдлар янәшә урнаштырылырга мөмкин. Әгәр вакуум десикатор тәлинкә белән берничә катламга бүленсә, слайдларны аскы палатага һәм ваферларны өске палатага урнаштырыгыз.
37 ° C су мунчасында туңдырылган Како-2 күзәнәкләрен касәгә эретегез, аннары эретелгән күзәнәкләрне T75 флассасына күчерегез, 15 мл 37 ° C алдан әзерләнгән Caco-2 уртача.
Caco-2 күзәнәкләрен ~ 90% кушылу өчен, беренче җылы Caco-2 урта, ПБС, һәм 37 ° C су мунчасында 0,25% трипсин / 1 мм EDTA.
Вакуум аспирациясе белән уртага омтылыгыз. Вакуум омтылышын кабатлап һәм яңа ПБС өстәп, күзәнәкләрне 5 мл җылы ПБС белән ике тапкыр юыгыз.