Nature.com сайтына кергәнегез өчен рәхмәт. Сез кулланган браузер версиясе CSS өчен чикләнгән ярдәмгә ия. Иң яхшы тәҗрибә өчен без яңартылган браузерны кулланырга киңәш итәбез (яки Internet Explorer'та яраклашу режимын сүндерегез). Шул ук вакытта, ярдәмне дәвам итәр өчен, без сайтны стильләр һәм JavaScriptсыз күрсәтәчәкбез.
Кеше эчәк морфогенезы 3D эпителия микроархитектурасы һәм киңлек оешмасының крипт-виллус үзенчәлекләрен билгели. Бу уникаль структура базаль крипттагы төп күзәнәк урынын экзоген микробиаль антиген һәм аларның метаболиталарыннан саклап, эчәк гомостазын саклап калу өчен кирәк. Искәртеп узабыз, органик миметик эчәк-чип эчәк эпителиянең үз-үзеннән 3D морфогенезын көчәйтә ала, көчәйтелгән физиологик функцияләр һәм биомеханика. Монда без эчәк эчәк морфогенезын эчә торган репродуктив протокол белән тәэмин итәбез. Эпителия күзәнәкләре гадәти шартларда, шулай ук ​​микрофлуидик платформада, 3D морфогенез индукциясе, һәм берничә сурәтләү модалы ярдәмендә урнаштырылган 3D эпителиягә характеристика .Бу протокол функциональ эчәк микроархитектурасының яңарышына ирешә. 5 в. биомедицина тикшеренүләре җәмгыяте өчен нәтиҗәләр, биомедицина, клиник һәм фармацевтика кушымталары өчен витрода 3D эчәк эпителия катламнарын яңарту ысулы белән тәэмин итү.
Тикшеренүләр күрсәткәнчә, эчәк эпителий Caco-2 күзәнәкләре 1,2,3,4,5 яки билайер микрофлуидик җайланмаларда эшкәртелгән6,7 төп механизмны аңламыйча витрода үз-үзеннән 3D морфогенез кичерергә мөмкин. Соңгы тикшеренүләребездә без базолатераль рәвештә яшерелгән морфоген антагонистларын культуралы индивидуаль морфоген антагонистларын бетерү кирәклеген ачыкладык. 2 һәм пациенттан алынган эчәк органоидлары.Эпителий күзәнәкләре расланган. Бу тикшеренүдә без махсус Wnt антагонисты, Диккопф-1 (DKK-1) күзәнәк җитештерүгә һәм концентрация бүленешенә игътибар иттек, "Гибрид Чип" дип аталган Трансвелл кыстыргычлары булган микрофлуидик җайланмалар. Без экзогеноз Wnt фронтовиклары, 1-нче Wnt серле антгонорлары, 1-нче Wnt фронтовиклары. -1) чиптагы эчәк морфогенезны тыя яки преструктуралаштырылган 3D эпителия катламын боза, культура вакытында антагонистик стресс витродагы эчәк морфогенезы өчен җаваплы булуын күрсәтә. Шуңа күрә, эпителия интерфейсында нык морфогенезга ирешү өчен практик алым, төп чип-гибрид платформаларында, яки чип-гибрид платформаларында, яки чип-гибрид платформаларында. диффузия .Басолетлы медиа (мәсәлән, Трансвелл скважиналардагы зур базололетлы сусаклагычларга кертә).
Бу протоколда без полимиметилсилоксан (PDMS) нигезендәге күзәнәк мембраналардагы эчәк эпителия күзәнәкләрен культуралы эчәк эпителия күзәнәкләренә (1A адымнары), шулай ук ​​Transwell кыстыргычлары (6Б адымнары, 8Б, 9Б адымнары, 6Б адымнары, 6Б адымнары). кәрәзле һәм молекуляр үзенчәлекләр тукымаларга хас гистогенезны һәм нәселгә бәйле кәрәзле дифференциацияне күрсәтәләр (11-24 адымнар) .Без кеше эчәк эпителия күзәнәкләрен кулланып морфогенез ясыйбыз, Caco-2 яки эчәк органоидлары кебек, ике культуралы форматта, күзәнәк мембраналарның өске модификациясе, биотехник микроэлементлары. 2D эпителия монолайерларыннан 3D морфогенез, без культураның төп өлешенә уртага агып, ике культуралы формадагы морфоген антагонистларны бетердек. Ахырда, без яңартыла торган 3D эпителия катламының файдалы булуын күрсәтәбез, ул морфогенга бәйле эпителия үсеше, микробиом инфекциясе, микробиом инфекциясе, микробиом инфекциясе, микробиом инфекциясе, микробиом инфекциясе, микробиом инфекциясе. luences.
Безнең протокол төп галимнәр өчен файдалы булырга мөмкин (мәсәлән, эчәк шакалы биологиясе, тамыр күзәнәк биологиясе, һәм үсеш биологиясе) һәм гамәли тикшеренүләр (мәсәлән, преклиник препаратлар сынау, авыруларны модельләштерү, тукымалар инженериясе, һәм гастроэнтерология) киң йогынты ясау. Моннан тыш, безнең протокол Норовирус 8, Каты кискен сулыш синдромы Коронавирус 2 (SARS-CoV-2), Клостридиум диффицилы, Сальмонелла Тифимурий 9 яки Вибрио холера кебек төрле йогышлы агентлар астында инфекцияне сорау өчен файдалы.Авыру патологиясе һәм патогенезы аудиториясе дә файдалы. Чиптагы эчәк микрофизиология системасын куллану озын озын культураны һәм ашказаны-эчәк (GI) трактында патоген белән бәйле җәрәхәтләрне төзекләндерүне бәяләргә мөмкин. 11 .Бер башка GI бозылулары эчәк эчәк синдромы, ашказаны эчәк эпидемиясе. пациентның 3D эчәк эпителия катламнары, бу авыруларга явыз атрофия, крипт кыскарту, былжыр зарар яки эпителия киртәсе керә. Биопси яки тамырдан алынган эчәк органоидлары 12,13.тукымаларга хас иммун күзәнәкләр, 5.
3D эпителия микросруктурасы бүлеп бирү процессыннан башка үзгәртелергә һәм визуальләштерелергә мөмкин булганлыктан, киң транскриптомика һәм югары резолюцияле яки супер резолюцияле сурәтләү өстендә эшләүче тамашачылар безнең эпителия урыннарындагы геннар һәм аксымнарның спатиотемпораль динамикасын картасы белән кызыксынырга мөмкин.Технология белән кызыксыналар. Микробиаль яки иммун стимулга җавап. Моннан тыш, озынлыктагы хуҗа-микробиом кроссталь 10, 14 эчәк гомостазын координацияли торган 3D эчәк шакалы катламында төрле микробиаль төрләрне, микробиаль җәмгыятьләрне яки фекаль микробиота белән аеруча культураны булдырып була.Бу ысул былжыр иммунология, гастроэнтерология, кеше микробиомы, культуромика һәм лабораториядә элек культурасыз эчәк микробиотасын үстерергә омтылган аудитория өчен аеруча җәлеп итә. Әгәр дә безнең витро морфогенез протоколы масштаблы культура форматларына яраклаштырыла алса, ул шулай ук ​​24, 96 яки 384 скважиналарны тулыландыра. Азык-төлек сәнәгате өчен омедикаль яки югары үткәргеч скринка яки тикшерү платформалары. Принцип буларак, без күптән түгел 24 кое тәлинкә форматына кадәр киңәйтелә торган мультиплекслы югары морфогенез системасының мөмкинлеген күрсәттек. Моннан тыш, берничә орган-чип продуктлары коммерцияләштерелде, витро морфоген тикшеренүләре. Наркотикларны яки биотерапевтиканы сынау өчен транскриптом дәрәҗәсендә витро эчәк морфогенезы, наркотикларга кандидатларны үзләштерү һәм ташу 3D эчәк суррогатлары ярдәмендә яки эчәк морфогенез процессының репродуктивлыгын бәяләү өчен махсус яки коммерция орган-чип модельләрен кулланып бәяләнде.
Эчәк эпителия морфогенезын өйрәнү өчен чикләнгән санлы эксперименталь модельләр кулланылды, күбесенчә витрода 3D морфогенез кертү өчен кулланыла торган протоколлар булмау аркасында. Чынлыкта, эчәк морфогенезы турында хәзерге белемнәрнең күбесе хайваннарны өйрәнүгә нигезләнә (мәсәлән, зебрафиш20, тычканнар 21 яки тавыклар 22). модельләр шулай ук ​​күпкырлы масштаблы сынау мөмкинлеге белән бик чикле. Шуңа күрә, виво хайван модельләрендә витро формаларында 3D тукымалар структураларын торгызу өчен безнең протокол, шулай ук ​​башка традицион статик 2D күзәнәк культурасы модельләре. Элегерәк тасвирланганча, 3D эпителия структураларын куллану безгә крипт-виллус күчәрендәге дифференциацияләнгән күзәнәкләрнең киңлек локализациясен тикшерергә мөмкинлек бирде. хуҗа факторларга җавап итеп оологик эволюция (мәсәлән, тышкы былжыр катламнарына каршы, ИГА сигриясе һәм антимикробиаль пептидлар). Моннан тыш, 3D эпителия морфологиясе эчәк микробиота үз җәмгыятьләрен ничек төзегәнен һәм синергистик рәвештә микробиаль метаболитлар җитештергәнен аңларга ярдәм итә ала (мәсәлән, кыска чылбырлы май кислоталары) кәрәзле оешманы формалаштыра һәм базаль крипт күзәнәкләре.
3D эчәк эпителия структураларын булдыру ысулына өстәп, берничә витро ысулы бар. Эчәк органоид культурасы - заманча тукымалар инженериясе техникасы, махсус морфоген шартларында эчәк тамыр клеткаларын үстерүгә нигезләнгән23,24,25. Шулай да, транспорт анализы яки микробиом ко-культуралары эчендә 3D органоид модельләрен куллану еш авыр, чөнки эчәк микробиом кушылмалары. иал күзәнәкләре яки экзоген антигеннар чикләнгән.Органоид люменнарга керү 26,27 микроинжектор ярдәмендә яхшырырга мөмкин, ләкин бу ысул инвазив һәм хезмәт таләп итә һәм башкару өчен махсус белем таләп итә. Моннан тыш, статик шартларда гидрогель скафолдаларында сакланган традицион органоид культуралары виво биомеханикада актив чагылдырылмый.
Берничә тикшеренү төркеме кулланган бүтән алымнар гель өслегендә изоляцияләнгән эчәк күзәнәкләрен культуралау өчен эчәк эпителия структурасын охшату өчен преструктуралаштырылган 3D гидрогел скафолдларын кулланалар. 3D басма, микро тегермән яки литографик ясалган формалар ярдәмендә гидрогель скафолдлары ясагыз. Стромаль күзәнәкләрне скафолдка кертеп сабак. Ләкин, преструктуралаштырылган скафолдларның табигате үз-үзеннән морфогенетик процессны күрсәтергә комачаулый ала. Бу модельләр шулай ук ​​динамик луминаль яки интерстиаль агымны тәэмин итмиләр, эчәк күзәнәкләре морфогенезны кулланырга һәм физиологик функцияне кулланырга тиеш. Тычкан эчәк органоидлары эчәк труба структураларын формалаштыру өчен чистартылган үрнәкләргә иярәләр, һәм эчәклек сыеклык агымы микрофлюидика модуле ярдәмендә кабатланырга мөмкин. Шулай да, бу модель үз-үзеннән морфогенетик процессларны күрсәтми, эчәк механобиологик хәрәкәтләрен дә кертми. Сыеклык агымы һәм механик деформация. Өстәвенә, биопринтаж процессы тәмамланганнан соң, эксперименталь шартлар яки күзәнәк-күзәнәк үзара бәйләнешләр бозылырга мөмкин. Моның урынына, безнең тәкъдим ителгән протокол үз-үзеннән эчәк морфогенезын, физиологик яктан актуаль стрессны, биомеханиканы, биологик механизмны, биологик механизмны, мөстәкыйль апикаль һәм нигезле микроорганизмны булдыра. генезис протоколы булган ысулларның проблемаларын җиңәр өчен өстәмә алым тәкъдим итә ала.
Безнең протокол тулысынча 3D эпителия морфогенезына юнәлтелгән, культурада эпителий күзәнәкләр генә бар, месенчималь күзәнәкләр, эндотелия күзәнәкләре, иммун күзәнәкләр кебек тирә күзәнәкләр юк. Элегерәк тасвирланганча, безнең протоколның асылы эпителия морфогенезы индуктивлыгы, безнең гиприд-гипридның төп чипында яшерен. 3D эпителия катламын ашады, эпителий-месенчималь үзара бәйләнешләр кебек өстәмә биологик катлаулылыклар 33,34, күзәнәктән тыш матрица (ECM) 35 һәм безнең модельдә базаль криптларда төп күзәнәк урыннарын китерә торган крипт-вилл үзенчәлекләре алга таба каралырга тиеш. Стромаль күзәнәкләр (мәс. Энхималь күзәнәкләр безнең модельгә морфогенетик процессны һәм күзәнәкләрне бәйләү эффективлыгын көчәйттеләр. Эндотелия катламы (ягъни капиллярлар яки лимфатика) молекуляр транспортны көйләүдә мөһим роль уйный39 һәм эчәк микроэнергетикасында иммун күзәнәк туплау40. Моннан тыш, тукымалар модельләре белән тыгыз бәйләнештә булырга мөмкин. Резолюция. Пациенттан алынган иммун күзәнәкләр шулай ук ​​тумыштан килгән иммун реакцияләрне, антиген презентациясен, тумыштан адаптив иммун кросстальны, эчәк авыруларын охшату шартларында тукымаларга хас иммунитетны күрсәтү өчен бик кирәк.
Гибрид чипларны куллану эчәк-чипка караганда гадирәк, чөнки җайланма урнаштыру гадирәк һәм Transwell кыстыргычларын куллану эчәк эпителиясенең масштаблы культурасын булдырырга мөмкинлек бирә. Шулай да, полиэстер мембраналары белән коммерцияле булган Transwell кыстыргычлары эластик түгел һәм перистальтик охшаш хәрәкәтләрне симуляцияли алмый. гибрид чипларда озак вакытлы бактерияле культураны сирәк кулланырга мөмкинлек бирә. Гибрид чиплар кулланганда Трансвелл кыстыргычларында 3D морфогенезны китерә алсак та, физиологик яктан актуаль биомеханика һәм апик сыеклык агымы потенциаль кушымталар өчен гибрид чип платформаларының мөмкинлеген чикләргә мөмкин.
Чип һәм гибрид-чип культураларында кеше крипт-вилл күчәрен тулы масштаблы реконструкцияләү тулысынча төзелмәгән. Морфогенез эпителия монолайерыннан башланганга күрә, 3D микроархитектура виво криптларына морфологик охшашлык тудырмый. Чиптагы өске каналлар микроинженер эпителийның биеклеген арттыруга китерә, максималь биеклек һаман да ~ 300–400 мм белән чикләнә. Кечкенә һәм зур эчәклектә кеше эчәк криптларының чын тирәнлеге тиешенчә ~ 135 µm һәм ~ 400 µm, һәм кечкенә эчәк виллының биеклеге ~ 600 µm41.
Тасвирлау күзлегеннән караганда, 3D микроархитектураның супер-резолюцияле имиджы чиптагы эчәк белән чикләнергә мөмкин, чөнки объектив линзадан эпителия катламына кадәр булган эш арасы берничә миллиметр тәртибендә. Бу проблеманы җиңәр өчен, ерак максат таләп ителергә мөмкин. Моннан тыш, PDMS.Fricric катламының югары эластиклыгы аркасында, гимнастика катламының югары эластиклыгы аркасында катлаулы кисәкләр ясау. катлам, эпителия катламының өслек структурасын тикшерү өчен өске катламны ачу яки чыгару бик авыр. Мисал өчен, сканерлау электрон микроскопы (SEM) ярдәмендә.
ПДМСның гидрофобиклыгы гидрофобик кечкенә молекулалар белән эш итүче микрофлуидик тикшеренүләрдә чикләүче фактор булды, чөнки PDMS андый гидрофобик молекулаларны махсус рәвештә үзләштерә ала. ПДМС алтернатлары башка полимер материаллар белән каралырга мөмкин.
Ниһаять, безнең ысул югары үткәргеч скринка яки "бер размерлы" барысына да файдалы эксперименталь платформа тәэмин итү ягыннан яхшы характерланмады. Хәзерге протокол микродевицага шприц насосын таләп итә, ул CO2 инкубаторында урын ала һәм зур масштаблы экспериментларны булдырмый. медиа).
Витрода кеше эчәк эпителиясенең 3D морфогенезын кертү өчен, без люмен-капиллярлы интерфейс булдыру өчен ике параллель микроканнель һәм эластик күзәнәк мембрананы үз эченә алган микрофлуидик чип эчәк җайланмасын кулландык. морфоген антагонистларны базолотацион бүлмәдән чыгару өчен агымның юнәлешле манипуляциясе ярдәмендә күрсәтелергә тиеш. Барлык эксперименталь процедура (1 нче рәсем) биш өлештән тора: (i) эчәк чипының микрофабрикасы яки трансвелл кертелгән гибрид чип (1-5 адым; 1 нче рамка), (ii) эчәк эпителия күзәнәкләрен (Како-2 күзәнәкләре) яки кеше эчәк органоидларын әзерләү;2-5 тартмалар), (iii) эчәк эпителия күзәнәкләренең эчәк чипларында яки гибрид чипларда (6-9 адымнар), (iv) 3D морфогенезны витрода (10 адым) һәм (v)) 3D эпителия микросруктурасына характеристика бирү өчен. контроль.
Без ике төрле культура платформасын кулландык: туры каналлар яки сызыксыз кушылган каналлар белән эчә торган чип, яки микрофлуидик җайланмада Transwell (TW) кыстыргычлары булган гибрид чиплар, 1 нче рамкада күрсәтелгәнчә эшләнгән һәм 1-5 адым. "Devайланма җитештерү" бер чип яки гибрид чип ясау культурасы. протокол. "Витро морфогенез" Caco-2 яки органоидтан алынган эпителия күзәнәкләренең эчәк чипында яки гибрид чипның Трансвелл кыстыргычларында культураланган гомуми адымнарын күрсәтә, аннары 3D морфогенез индуктивлыгы һәм характерлы эпителия структурасы формалаштыру. Программа адымнары саны, интеллектуаль катламнар, интеллектуаль интеллектуаль интеллектуаль интеллект, интеллектуаль интеллект. хуҗа-микробиом экосистемалары, һәм авыруларны модельләштерү. "Күзәнәк дифференциациясендә" иммунофлюоресцент рәсемнәр, эчәк чипында барлыкка килгән 3D Caco-2 эпителия катламында күрсәтелгән ядрәләр, F-актин һәм MUC2 сурәтләре. аглутинин. "Хост-Микроб Ко-Мәдәниятләре" ндә бер-берсенә охшаган ике рәсем чиптагы хуҗа-микробиом ко-культураларын күрсәтәләр. Сул панельдә Э.Коли яшел флуоресцент белок (GFP) микро-инженер 3D Caco-2 эпителий күзәнәкләре локализациясен күрсәтә. актин (кызыл) һәм ядрәләр (зәңгәр) .Бер авыруларны модельләштерү бактерия антигенләре (мәсәлән, липополисахарид, LPS) һәм иммун күзәнәкләре белән физиологик проблема астында эчәк ялкынсыну чипларында сәламәт эчәкне күрсәтә.яшел) .Како-2 күзәнәкләре 3D эпителия катламын булдыру өчен культуралы булганнар. Масштаб сызыгы, 50 мм.Оксфорд университеты матбугаты;5 нче рөхсәт белән кабатлана.NAS;"Хост-микроб ко-культурасы" 3-нче рөхсәт белән җайлаштырылган.NAS;"Авыруларны модельләштерү" сылтама рөхсәте белән җайлаштырылган.5.NAS.
Эчке-чип та, гибрид чиплар да PDMS репликалары ярдәмендә ясалганнар, кремний формаларыннан йомшак литография белән демоляцияләнгән һәм SU-8 белән эшләнгән. Chәр чиптагы микроканнельләрнең дизайны кыру стрессы һәм гидродинамик басым кебек гидродинамиканы исәпкә алып билгеләнә. эчәк-чип (киңәйтелгән мәгълүматлар рәсеме 1б), сыеклыкның яшәү вакытын арттыру, сызыксыз агым формалары, һәм культуралы күзәнәкләрнең мультиаксиаль деформациясен кертү өчен парлы микроканнельләрне үз эченә ала. Эпителия үсешенең оригиналь Гут-Чип белән чагыштырганда, культуралы күзәнәк төренә карамастан. Шуңа күрә, 3D морфогенез тудыру өчен, сызыклы һәм катлаулы чип эчәк конструкцияләре алышынырга мөмкин.2а) .Чип өстендә эчәк ясау өчен, әзерләнгән югары PDMS катламы эзлекле PDMS пленкасына бәйләнде, аннары корона эшкәртүчесе ярдәмендә кире PDMS катламы белән тигезләнде. 2 г - ф). PDMS репликасы һәм пыяла өслекләрен кислород плазмасы яки корона белән эшкәртү белән башкарыла. Силикон трубасына тоташтырылган микрофабрикат җайланмасын стерилизацияләгәннән соң, җайланма урнаштыру эчәк эпителийның 3D морфогенезын ясарга әзер иде (2 нче рәсем).
а, ПДМС өлешләрен SU-8 үрнәкле кремний формаларыннан әзерләүнең схематик иллюстрациясе. Сакланмаган PDMS эремәсе кремний формасына (сулга) салынган, 60 ° C (урта) белән дәваланган һәм демолдланган (уңда) .Демолдланган PDMS кисәкләргә бүленде һәм алга таба куллану өчен чистартылды. өске һәм аскы PDMS компонентлары һәм җыелган чиптагы эчәк җайланмасы., өске, мембрана һәм аскы PDMS компонентларын тигезләү схемасы. Eachәр катлам плазма яки корона белән эшкәртелмәслек итеп бәйләнгән. Бер труба һәм шприц каплагычка куелган. Чип җайланмасы эшкәртү өчен 150 мм Петри савытының капкасына куелган. Бәйләүче силикон трубасын ябу өчен кулланыла. Гибрид чиплар ярдәмендә 3D морфогенезның визуаль снэпшотлары. Трансвелл кыстыргычында урнаштырылган күзәнәк катламы астында. Масштаб сызыгы, 1 см.Elsevier.
Бу протоколда Caco-2 күзәнәк сызыгы һәм эчәк органоидлары эпителия чыганаклары буларак кулланылды (3а рәсем) .Бер төрле күзәнәкләр дә мөстәкыйль культураланганнар (2 нче рамка һәм 5 нче рамка) һәм ECM белән капланган микроканнельләрне чип-эчәк яки Трансвелл кыстыргычлары чәчкәндә кулланалар. Трипсинизация сыеклыгы белән атед күзәнәк асылмалары (2 нче рамка). Эчәк биопсигы яки хирургик резекцияләрдән кеше эчәк органоидлары структур микроэнергетикага булышу өчен 24 кое тәлинкәләрдә Матригель скафолд гөмбәзләрендә культуралы булганнар. Вент, Р-спондин, һәм Ноггин кебек үсү факторлары. Эчәккә яки Трансвеллга чипка орлык салу өчен җыелган һәм бер күзәнәкләргә бүленгән (5 нче рамка). Элегерәк хәбәр иткәнчә, ул 12,13 авыру төре буенча дифференциацияләнергә мөмкин (мәсәлән, ульсератив колит, Хрон авыруы, колоректаль яман шеш, яки нормаль донор), лезония мәйданы (мәсәлән, лезония, эчәклек, эчәклек, эчәклек, эчәклек, эчәклек, эчәклек, эчәклек, эчәклек, эчәклек, эчәклек, эчәклек, эчәклек ) .Без колоник органоидларны (колоидлар) культуралау өчен оптимальләштерелгән протокол тәкъдим итәбез, гадәттә кечкенә эчәк органоидларына караганда морфоген концентрацияләрен таләп итә.
а, эчәк чипында морфогенез индуктивлыгы өчен эш процессы. Како-2 кеше эчәк эпителиясе һәм эчәк органоидлары бу протоколда 3D морфогенезны күрсәтү өчен кулланыла. Изоляцияләнгән эпителия күзәнәкләре чип җайланмасына чәчелгәннәр (чип әзерләү). беренче 2 көн. эчәк морфогенезының туры каскадларын сурәтләгән безнең схематик схемалар .Схематик сызылган уклар сыеклык агымының юнәлешен күрсәтәләр, SEM рәсеме билгеләнгән 3D Caco-2 эпителийының өске топологиясен күрсәтә (сулда). Зурланган мәйданны күрсәткән ак төс (ак сызылган тартма) 3D Caco фронтовиклары. (ZO-1, кызыл) һәм өзлексез чиста чик мембраналарында F-актин (яшел) һәм ядрәләр (зәңгәр) иммунофлуоресцент эпителия күзәнәкләренең эчәк чипларында конокаль визуализациясе. Урта схемага күрсәткән уклар һәр конокаль күренеш өчен фокаль яссылыкның урнашу урынын күрсәтәләр. бирелгән рәсемнең ификациясе, 7f көнне алынган кисәктә эчәклектә урнаштырылган органоид 3D эпителийның DIC фотомикрографы, төп күзәнәкләр өчен маркерларны күрсәтүче иммунофлюорсент рәсемнәрен каплагыз (LGR5;магнита), кәрәзле күзәнәкләр (MUC2; яшел), F-актин (соры) һәм ядрәләр (циан) эпителия катламында 3 көн дәвамында (Сул) һәм 13 көнлек (урта) органоидлар. Шулай ук ​​киңәйтелгән мәгълүматлар рәсемен карагыз. культураның 13-нче көнендә буяуны (уңда) сорагыз. Башкача әйтелмәгән булса, масштаб 50 мм. b белешмә рөхсәте белән бастырылган.Оксфорд университеты матбугаты;в Белешмә рөхсәте белән җайлаштырылган.2.Оксфорд университеты матбугаты;e һәм f сылтама белән рөхсәт белән җайлаштырылган.12 Creative Commons лицензиясе буенча CC BY 4.0.
Чиптагы эчәклектә, уңышлы ECM каплау өчен PDMS күзәнәк мембранасының гидрофобик өслеген үзгәртергә кирәк. Бу протоколда без PDMS мембраналарының гидрофобиклыгын үзгәртү өчен ике төрле ысул кулланабыз. Органоид эпителия культурасы полиэтиленимин (PEI) һәм глютаральдегидны PDMS микроканнельләренә эзлекле кулланып, ECM аксымнарының эффектив чүпләнүенә ирешү өчен химик нигезләнгән өслек функциональләштерүен таләп итә. Surfaceир өслеген модификацияләгәннән соң, ECM белгечләре функциональ PDMS өслеген каплау өчен салынган, аннары микрофлуид күзәнәкләре микрофлуид күзәнәкләре кушылганнан соң. , ә түбән микроканнель статик шартларны саклый. Бу өслекне активлаштыру һәм ECM каплау өчен оптимальләштерелгән ысул органоид эпителиясен PDMS өслегендә 3D морфогенезга китерергә мөмкинлек бирә.
Трансвелл культуралары шулай ук ​​күзәнәк орлыклары алдыннан ECM каплавын таләп итәләр.шулай да, Трансвелл культуралары күзәнәкле кыстыргычлар өслеген активлаштыру өчен катлаулы алдан ук адымнар таләп итмиләр. Трансвелл кыстыргычларында Caco-2 күзәнәкләрен үстерү өчен, күзәнәк кыстыргычларда ECM каплавы аерылган Caco-2 күзәнәкләрен (<1 сәгать) бәйләүне тизләтә (<1-2 көн). Оидлар барьер бөтенлеге белән тулы монолайер формалаштыралар .Трансвелл культуралары гибрид чиплар кулланмыйча 24 кое тәлинкәләрдә башкарыла.
Витро 3D морфогенезы эпителия катламының төп аспектына сыеклык агымын кулланып башланырга мөмкин. Чиптагы эчәклектә эпителия морфогенезы урта һәм аскы микроканнельләргә кушылганнан соң башланды. полосалар һәм луминаль кыру стрессын тудырабыз, без гадәттә эчәклектә икеләтә агымны чипка кулланабыз. Гибрид чипларда, гибрид чипларга эпителия монолайерлары булган Трансвелл кыстыргычлары кертелде. Аннары, микроаннель аша күзәнәкле Трансвеллның базолотацион ягы астында кулланылды.
Микроэжинирланган 3D эпителия катламнарының морфологик үзенчәлекләрен төрле сурәтләү ысулларын кулланып анализларга мөмкин, шул исәптән фаз контраст микроскопиясе, дифференциаль интерфейс контрасты (DIC) микроскопия, SEM, яки иммунофлюоресцент конокаль микроскопия (3 һәм 4 нче рәсемнәр) .Фаза контрасты яки DIC тасвирламасы культура вакытында 3D эпителия катламының формасын һәм пропузиясен күзәтү өчен җиңел эшләнергә мөмкин. чип платформалары җайланманы бүлү яки сүтү кирәксез реаль-ситу сүрәтләүдә реаль вакыт бирә ала. Иммунофлюорсент күзаллау ясаганда (рәсемнәр 1, 3c, f һәм 4b, c), күзәнәкләр гадәттә 4% (wt / vol) параформалдегид (PFA) белән урнаштырыла, аннары Triton X-100 һәм 2% (wt / vol) кәрәзле труба, BSA серумы, Bizine альбомы. Эрслар, блоклау агентлары кулланылырга мөмкин. Нәселгә бәйле күзәнәк яки регион маркерларына каршы беренчел антителалар чиптагы ситуада имобилизацияләнгән күзәнәкләрне яктырту өчен кулланыла, аннары икенчел антителалар, яисә ядрога каршы контраст буяу белән (мәсәлән, 4 ′, 6-диамидино-2-фенилен) индол, DAPI) яки F-актин флюорецентлы флуцинлы флюоресинлы флуоресцентлы флуцентлы флуцинлы флуцинлы флюоресцентлы флюоресцентлы флуцентлы флуцентлы флуцинлы флуцентлы флюоресцентлы флуцентлы флуцинлы флюорецентлы флюорецентлы флюорецентлы флуцинлы. (Рәсем.1. эпителия морфологиясе, шулай ук ​​апикаль кисточка чикендәге микровилли SEM белән визуальләштерелергә мөмкин.
а, гибрид чипта эчәк морфогенезы индуктивлыгы өчен эш процессы. Како-2 һәм эчәк органоидлары бу протоколда гибрид чип платформасында 3D морфогенезны күрсәтү өчен кулланыла. Аерылган эпителия күзәнәкләре әзер Трансвелл кыстыргычларында чәчелгәннәр (TW алдан; астындагы рәсемне карагыз). Көннәрдә, эпителий күзәнәкләренең 2D монолайеры булган бер Трансвелл кыстыргыч гибрид чипка интеграцияләнде, ул төп агымны (агым, BL) кертүгә китерде, ахыр чиктә 3D эпителия катламы (морфогенез) барлыкка килүгә китерде. Фаза контраст микрографлары, кеше доноры (C103 сызыгы). фишкалар (сул схематик) органоид эпителий күзәнәкләренең 3D морфогенезына китерергә мөмкин, өстән-аста конокаль микроскопия күренеше белән төрле Z позицияләрендә (өске, урта һәм аскы);дөрес схематик һәм туры нокта сызыкларын карагыз).ачык морфологик характеристикалар күрсәтте. в Белешмә рөхсәте белән бастырылган.4.Elsevier.
Контрольләр бер үк күзәнәкләрне (Како-2 яки эчәк органоид эпителий күзәнәкләрен) гадәти статик культура шартларында ике үлчәмле монолайерларга эшкәртеп әзерләнергә мөмкин. Игътибарлы, микроканнельләрнең күләм күләме чикләнгәнлектән (ягъни, төп каналдагы ~ 4 µL, төп эчәк-чип дизайнындагы өске каналда), шулай ук ​​эпителия морфологиясе.
Йомшак литография процессы чиста бүлмәдә башкарылырга тиеш. Чиптагы һәр катлам (өске һәм аскы катламнар һәм мембраналар) һәм гибрид чиплар өчен төрле фотомаскалар кулланылды һәм аерым кремний вафаларда ясалды, чөнки микроканнель биеклекләре төрле иде.
3 дюймлы кремний вафинны ацетонлы савытка урнаштырыгыз. Тәлинкәне 30 секундка әкрен генә әйләндерегез, аннары вафинны һава киптерегез. Ваферны IPA белән тәлинкәгә күчерегез, аннары чистарту өчен тәлинкәне 30 с.
Пиранха эремәсе (водород пероксиды һәм концентрат күкерт кислотасы катнашмасы, 1: 3 (vol / vol)) кремний вафин өслегеннән органик калдыкларны чыгаруны максимумлаштыру өчен кулланылырга мөмкин.
Пиранха эремәсе бик коррозицион һәм җылылык китерә. Өстәмә куркынычсызлык чаралары кирәк. Калдыкларны утильләштерү өчен, чишелешне салкын һәм коры калдык контейнерына күчерергә рөхсәт итегез. Икенчел контейнерларны кулланыгыз һәм калдык контейнерларын дөрес билгеләгез. Зинһар өчен, объектның куркынычсызлык кагыйдәләрен үтәгез.
Ваферларны 200 ° C кайнар тәлинкәгә 10 минутка куеп дегидратлагыз. Сусызланудан соң, вафин салкын булыр өчен биш тапкыр һавада селкетелде.
Чистартылган кремний вафатның үзәгенә ~ 10 г фоторезист куегыз. Фоторезистны ваферга тигез итеп таратыр өчен, кистергеч кулланыгыз.
SU-8 спин каплау белән ваферда тигез бүленде. Су-8нең 5-10 с га керә торган әйләнеше 100 әйләнештә тизләнештә 500 әйләнештә таралу өчен программа. Төп әйләнешне 1500 әйләнештә 200 мм калынлыкта урнаштырыгыз, яки 250 мм калынлыкта (500 мм биеклектә, тизлектә 300 мм биеклектә) кич.
Төп әйләнү тизлеге кремний вафатындагы SU-8 үрнәгенең максат калынлыгына карап көйләнергә мөмкин.
Чиптагы эчәкнең өске катламы өчен 500 мм биеклектәге SU-8 үрнәкләрен ясау өчен, бу тартманың әйләндергеч каплавы һәм йомшак пешерү адымнары (7 һәм 8 адымнар) эзлекле рәвештә кабатланды (9 адымны карагыз), 250 мм калынлыктагы ике катлам чыгару өчен, бу катламның 12 адымында UV экспозициясе белән кушылырга мөмкин, 500 мм биеклектә.
Йомшак пешерегез SU-8 капланган ваферларны ваферларны 65 ° C кайнар тәлинкәгә 5 минутка куеп, аннары көйләнүне 95 ° C ка күчерегез һәм өстәмә 40 минут инкубацияләгез.
Upperгары микроканнельдә SU-8 үрнәгенең 500 мм биеклегенә ирешү өчен, 7 һәм 8 адымнарны кабатлагыз, ике 250 мм калынлыктагы SU-8 катламы.
UV маска тигезләүчене кулланып, ваферның экспозиция вакытын исәпләү өчен җитештерүче күрсәтмәсе буенча лампа сынавын үткәрегез.
Экспозиция вакытын билгеләгәннән соң, фотомаскны UV маска тигезләүченең маска тоткычына куегыз һәм фотомасканы SU-8 капланган ваферга урнаштырыгыз.
УВ дисперсиясен киметү өчен, фотомаскның басылган өслеген кремний вафиның SU-8 капланган ягына урнаштырыгыз.
Алдан билгеләнгән экспозиция вакыты өчен SU-8 капланган ваферны һәм фотомасканы вертикаль рәвештә 260 mJ / см2 UV яктылыгына күрсәтегез (бу тартманың 10 адымын карагыз).
УВ тәэсиреннән соң, SU-8 белән капланган кремний вафлары 65 минутта 5 минутта һәм 95 минутта 15 минутта пешерелде, һәр кайнар тәлинкәдә 200 μм биеклектәге үрнәкләр ясау өчен.
Эшләүче пыяла савытка салына, һәм пешкән вафин савытка урнаштырыла. SU-8 эшкәртүченең күләме пыяла тәлинкәнең зурлыгына карап төрле булырга мөмкин. Мисал өчен, көтелмәгән SU-8не тулысынча бетерү өчен җитәрлек SU-8 эшкәртүчене кулланыгыз.
Developed 10 мл яңа эшкәртүче белән эшләнгән форманы чайкагыз, аннары IPA белән торбаны кулланып эремә сиптерегез.
Вафаны плазма чистарткычка урнаштырыгыз һәм кислород плазмасына (атмосфера газы, максат басымы 1 × 10−5 Торр, көче 125 Вт) 1,5 минутка тәэсир итегез.
Вафинны вакуум десикаторына пыяла слайд белән урнаштырыгыз. Ваферлар һәм слайдлар янәшә урнаштырылырга мөмкин. Әгәр вакуум десикатор тәлинкә белән берничә катламга бүленсә, слайдларны аскы палатага һәм ваферларны өске палатага урнаштырыгыз.
37 ° C су мунчасында туңдырылган Како-2 күзәнәкләрен касәгә эретегез, аннары эретелгән күзәнәкләрне T75 флассасына күчерегез, 15 мл 37 ° C алдан әзерләнгән Caco-2 уртача.
Caco-2 күзәнәкләрен ~ 90% кушылу өчен, беренче җылы Caco-2 урта, ПБС, һәм 37 ° C су мунчасында 0,25% трипсин / 1 мм EDTA.
Вакуум аспирациясе белән уртага омтылыгыз. Вакуум омтылышын кабатлап һәм яңа ПБС өстәп, күзәнәкләрне 5 мл җылы ПБС белән ике тапкыр юыгыз.