Nature.com сайтына кергәнегез өчен рәхмәт.Сез чикләнгән CSS ярдәме белән браузер версиясен кулланасыз.Иң яхшы тәҗрибә өчен без яңартылган браузерны кулланырга киңәш итәбез (яки Internet Explorer'та туры килү режимын сүндерегез).Моннан тыш, дәвамлы ярдәмне тәэмин итү өчен, без сайтны стильләр һәм JavaScriptсыз күрсәтәбез.
Берьюлы өч слайд карусельен күрсәтә.Алдагы һәм Киләсе төймәләрне берьюлы өч слайд аша күчерү өчен кулланыгыз, яки ахырда слайдер төймәләрен берьюлы өч слайд аша күчерегез.
Кан-ми барьеры һәм кан-ми барьеры биотерапевтик агентларның үзәк нерв системасындагы максатларына ирешүләрен тыя, шуның белән неврологик авыруларны эффектив дәвалауга комачаулый.Вивода баш ми ташучыларны табу өчен, без T7 фаг пептид китапханәсен керттек һәм кан һәм цереброспиналь сыеклыкны (CSF) тупладык, тычканнарның зур бассейн моделе ярдәмендә.Дүрт тур сайлаудан соң конкрет фаз клоннары CSFда бик баетылды.Аерым кандидат пептидларын сынау CSFда 1000 тапкыр артык баету ачыклады.Пептид-мигә китерелгән биоактивлык, билгеле роман транзит пептиды белән бәйләнгән BACE1 пептид ингибиторы ярдәмендә цереброспиналь сыеклыктагы амилоид-of дәрәҗәсенең 40% кимүе белән расланды.Бу нәтиҗәләр шуны күрсәтә: виво фаз сайлау ысуллары белән билгеләнгән пептидлар терапевтик эффект белән макромолекулаларны мигә системалы китерү өчен файдалы транспорт булырга мөмкин.
Centralзәк нерв системасы (CNS) максатчан терапия тикшеренүләре күбесенчә оптимизацияләнгән даруларны һәм CNS-максатчан үзлекләрен күрсәтүче агентларны ачыклауга юнәлтелгән, баш миенә наркотикларның актив китерелү механизмнарын табу өчен аз көч куялар.Бу хәзер үзгәрә башлый, чөнки наркотиклар китерү, аеруча зур молекулалар, хәзерге нейрология фәненең үсешенең аерылгысыз өлеше.Centralзәк нерв системасының әйләнә-тирәсе цереброваскуляр барьер системасы белән яхшы сакланган, кан-ми барьерыннан (BBB) ​​һәм кан-ми барьерыннан (BCBB) 1, наркотиклар мигә китерүне кыенлаштыра.Барлык зур молекула препаратлары һәм 98% тан артык кечкенә молекула препаратлары баш миеннән юкка чыгарыла3.Шуңа күрә CNS 4,5 терапевтик препаратларны эффектив һәм конкрет китерүне тәэмин итүче яңа ми транспорт системаларын ачыклау бик мөһим.Ләкин, BBB һәм BCSFB шулай ук ​​наркотиклар китерү өчен искиткеч мөмкинлек бирә, чөнки алар киң кан тамырлары аша баш миенең барлык структураларына үтеп керәләр.Шулай итеп, мигә инвазив булмаган китерү ысулларын куллану өчен хәзерге тырышлык күбесенчә эндоген BBB6 рецепторы ярдәмендә рецептор-арадаш транспорт (PMT) механизмына нигезләнә.Трансферрин рецепторы юлын кулланып соңгы соңгы казанышларга карамастан, яхшыртылган характеристикалары булган яңа тапшыру системаларын алга таба үстерү таләп ителә.Бу максаттан, безнең максат CSF транспортында арадашлашырга сәләтле пептидларны ачыклау иде, чөнки алар макромолекулаларны CNSга җибәрү яки яңа рецептор юлларын ачу өчен кулланылырга мөмкин.Аерым алганда, цереброваскуляр системаның махсус рецепторлары һәм ташучылары (BBB һәм BSCFB) биотерапевтик препаратларны актив һәм конкрет китерү өчен потенциаль максат булып хезмәт итә ала.Ereереброспиналь сыеклык (CSF) - хороид плексусның (CS) яшерен продукты һәм субарахноид киңлеге һәм карын киңлеге аша баш миенең интерстиаль сыеклыгы белән туры элемтәдә тора4.Күптән түгел күрсәтелде, субарахноид цереброспиналь сыеклык ми интерстиумына артык тарала9.Паренхималь киңлеккә бу субарахноид агым тракты ярдәмендә яки турыдан-туры BBB аша керергә өметләнәбез.Бу максатка ирешү өчен, без vivo phage сайлау стратегиясен кулландык, бу ике төрле юлның икесе белән ташылган пептидларны идеаль рәвештә ачыклый.
Хәзер без Vivo phage дисплей скринклау ысулын тасвирлыйбыз, CSF үрнәге белән, югары үткәрү эзлеклелеге (HTS) белән иң югары китапханә төрлелеге белән башлангыч сайлау турын күзәтү өчен.Тикшерү аңлы тычканнарда даими имплантацияләнгән зур цистерна (CM) каннуласы белән кан пычранмасын өчен үткәрелде.Иң мөһиме, бу ысул баш миенә һәм пептидларны цереброваскуляр барьер аша транспорт активлыгы белән сайлый.Аларның зурлыгы (~ 60 нм) 10 аркасында без T7 этапларын кулландык һәм алар эндотелия һәм / яки эпителия-медулла барьерын трансселярия аша узарга мөмкинлек бирүче весикулалар ташу өчен яраклы дип тәкъдим иттек.Дүрт турдан соң, виво CSF баетуда һәм баш мие микроэссель ассоциациясендә көчле күрсәтеп, фаз популяциясе изоляцияләнде.Иң мөһиме, без өстенлекле һәм химик синтезланган иң яхшы кандидат пептидларының протеин йөкләрен цереброспиналь сыеклыкка ташый алуын күрсәтеп, табышларыбызны раслый алдык.Беренчедән, CNSның фармакодинамик эффектлары әйдәп баручы транзит пептидны BACE1 пептид ингибиторы белән берләштереп булдырылды.Vivo функциональ скринк стратегиясендә яңа ми транспорт пептидларын протеин йөк ташучы буларак ачыклый алуын күрсәтү белән беррәттән, без шундый ук функциональ сайлау алымнары яңа ми транспорт юлларын ачыклауда мөһим булыр дип көтәбез.
Тактаны формалаштыручы берәмлекләргә (PFU) нигезләнеп, фаз төрү адымыннан соң, якынча 109 төрлелеге булган очраклы 12-мер сызыклы T7 фаг пептидлары китапханәсе эшләнде һәм ясалды (материаллар һәм методлар кара).Әйтергә кирәк, без бу китапханәне җентекләп анализладык.Фаз китапханә үрнәкләрен PCR көчәйтү, үзгәртелгән праймерлар ярдәмендә ампликоннар тудырды, алар турыдан-туры HTS өчен кулланыла (өстәмә рәсем 1а).А) HTS11 эзләү хаталары аркасында, б) праймерларның сыйфаты (NNK) 1-12, һәм в) көтү китапханәсендә кыргый типтагы (wt) фаза (скелет кыстыргычлары) булганга, тикшерелгән эзлекле мәгълүматны алу өчен эзлекле фильтрлау процедурасы кертелде (өстәмә рәсем 1б).Бу фильтр адымнары барлык HTS эзлекле китапханәләренә кагыла.Стандарт китапханә өчен барлыгы 233,868 уку алынган, шуларның 39% фильтр критерийларын узган һәм киләсе тур өчен китапханә анализы һәм сайлау өчен кулланылган (өстәмә рәсем 1c - e).Укулар күбесенчә 3 төп парның озынлыгына, иң югары ноктасы 36 нуклеотидка (өстәмә рәсем 1с), китапханә дизайнын раслаучы (NNK) 1-12.Шунысы игътибарга лаек, китапханә әгъзаларының якынча 11% -ында 12 үлчәмле кыргый типтагы (wt) арка сөяге PAGISRELVDKL кертелгән, һәм эзлеклелекнең яртысы диярлек (49%) кертү яки бетерү бар.Китапханә китапханәсенең HTS китапханәдәге пептидларның күптөрлелеген раслады: пептид эзлеклелегенең 81% тан артыгы бер тапкыр гына табылды һәм 1,5% кына ≥4 данәдә булды (өстәмә рәсем 2а).Репертуардагы барлык 12 позициядә аминокислоталарның ешлыклары начарланган NKK репертуары тудырган кодлар саны өчен көтелгән ешлыклар белән яхшы бәйләнештә торалар (өстәмә рәсем 2б).Бу кыстыргычлар белән кодланган аа калдыкларының күзәтелгән ешлыгы исәпләнгән ешлык белән яхшы бәйләнештә тора (r = 0.893) (өстәмә рәсем 2c).Фаз китапханәләрен инъекциягә әзерләү эндотоксинны көчәйтү һәм бетерү адымнарын үз эченә ала.Бу моңа кадәр фаз китапханәләренең төрлелеген киметү өчен күрсәтелде12,13.Шуңа күрә, без эндотоксинны чыгарган тәлинкә-көчәйтелгән фей китапханәсен эзләдек һәм AA ешлыгын бәяләү өчен аны оригиналь китапханә белән чагыштырдык.Оригиналь бассейн белән көчәйтелгән һәм чистартылган бассейн арасында көчле корреляция күзәтелде (өстәмә рәсем 2d), бу T7 фазасы ярдәмендә тәлинкәләрдә көчәйтелгән клоннар арасындагы көндәшлекнең зур тискәре күренеш китермәвен күрсәтә.Бу чагыштыру һәр китапханәдәге трипептид мотивларының ешлыгына нигезләнә, чөнки китапханәләрнең төрлелеге (~ 109) хәтта HTS белән дә тулысынча кулга алына алмый.Positionәр позициядә ешлыкны анализлау кертелгән репертуарның соңгы өч позициясендә кечкенә позициягә бәйле икеләтүне күрсәтте (өстәмә рәсем 2e).Ахырда, без китапханәнең сыйфаты һәм төрлелеге кабул ителә дигән нәтиҗә ясадык, берничә тур сайлап алу арасындагы фаз китапханәләрен көчәйтү һәм әзерләү аркасында күптөрлелектә кечкенә үзгәрешләр генә күзәтелде.
Серия цереброспиналь сыеклык үрнәге хирургик канлы канны аңлы тычканнар КМга кертеп, BBB һәм / яки BCSFB аша (iv) венага кертелгән T7 фазасын ачыклауны җиңеләйтү өчен ясалырга мөмкин (1а-б).Виво сайлауда беренче өч турда без ике бәйсез сайлау кулы (А һәм В куллары) кулландык (1с рәсем).Сайлауның катгыйлыгын әкренләп арттырдык, сайлап алу беренче өч турында кертелгән фазаның гомуми күләмен киметеп.Дүртенче тур өчен без А һәм В филиалларыннан үрнәкләрне берләштердек һәм өч өстәмә бәйсез сайлау ясадык.Бу модельдәге T7 фаз кисәкчәләренең виво үзлекләрен өйрәнү өчен, кыргый типтагы фаг (PAGISRELVDKL мастер кертү) койрык тамыры аша тычканнарга укол салдылар.Төрле вакыт нокталарында цереброспиналь сыеклыктан һәм каннан этапларны торгызу күрсәтте, чагыштырмача кечкенә T7 икозаедраль этаплары кан бүлегеннән тиз арада чистарту этабы булган (өстәмә рәсем 3).Идарә ителгән титерларга һәм тычканнарның кан күләменә нигезләнеп, без якынча 1% вт дип исәпләдек.Административ дозадан фаг канга венага кертелгәннән соң 10 минуттан соң ачыкланды.Бу башлангыч тиз төшүдән соң, әкренрәк башлангыч чистарту 27,7 минут ярым гомер белән үлчәнде.Иң мөһиме, CSF бүлегеннән бик аз этаплар гына алынды, бу кыргый типтагы фаг миграциясенең CSF бүлегенә түбән фонын күрсәтте (Өстәмә рәсем 3).Уртача алганда, цереброспиналь сыеклыкта (0-250 мин) кандагы T7 фагының якынча 1 х 10-3% титары һәм башта кушылган этапларның 4 x 10-8% ачыкланган.Аерым алганда, цереброспиналь сыеклыктагы кыргый типтагы ярым гомер (25,7 мин) канда күзәтелгәнгә охшаган.Бу мәгълүматлар шуны күрсәтә: CSF бүлеген каннан аеручы киртә CM-каннуляцияләнгән тычканнарда сакланган, бу фаз китапханәләрен виво сайлауда каннан CSF бүлегенә җиңел ташылган клоннарны ачыкларга мөмкинлек бирә.
а) Зур бассейннан цереброспиналь сыеклыкны (CSF) кабат сайлау ысулын кую.б) centralзәк нерв системасы (CNS) барьерының кәрәзле урынын күрсәтүче схема һәм кан-ми барьерын (BBB) ​​һәм кан-ми барьерын кичерүче пептидларны ачыклау өчен кулланылган сайлау стратегиясе.в) виво-фейдж дисплей скринкасы.Сайлауның һәр турында этапларга (уклар эчендәге хайван идентификаторлары) венага кертелде.Ике бәйсез альтернатив филиал (А, В) 4 нче турга кадәр аерым саклана.3 һәм 4 сайлау турлары өчен, CSF-тан алынган һәр фаз клоны кул белән эзлеклеләнде.г) каннан (кызыл түгәрәкләрдән) һәм цереброспиналь сыеклыктан (яшел өчпочмаклардан) изоляцияләнгән фаз кинетикасы, T7 пептид китапханәсенә венага кертелгәннән соң (2 x 1012 фаза / хайван).Зәңгәр квадратлар кандагы фагның уртача концентрациясен күрсәтәләр, инъекцияләнгән фаза күләменнән исәпләнә, гомуми кан күләмен исәпкә алып.Кара квадратлар y фаз концентрацияләреннән экстраполяцияләнгән y сызыгы киселеш ноктасын күрсәтәләр.(e, f) пептидта табылган барлык трипептид мотивларының чагыштырма ешлыгын һәм таралышын күрсәтегез.1000 укылышта табылган мотивлар саны күрсәтелгән.Мөһим (p <0,001) баетылган мотивлар кызыл нокталар белән билгеләнгән.д) корреляция таркату инъекцияләнгән китапханәнең трипептид мотивының чагыштырма ешлыгын чагыштырып, # 1.1 һәм 1.2 1.2 хайваннардан кан алынган фаза белән чагыштыра.е) корреляцион тарату, кан һәм цереброспиналь сыеклыкта изоляцияләнгән хайван фаг трипептид мотивларының чагыштырма ешлыкларын чагыштырып.(g, h) Кан белән баетылган фазның эзлеклелеге күрсәтүе (g) инъекцияләнгән китапханәләргә каршы һәм CSF (h) белән баетылган фаҗ ике канда да виво сайлау турыннан соң.Бер хәрефле кодның зурлыгы шул аминокислотаның ничә тапкыр булачагын күрсәтә.Яшел = поляр, кызгылт = нейтраль, зәңгәр = төп, кызыл = кислоталы һәм кара = гидрофоб аминокислоталар.Рәсем 1а, б Эдуард Урич тарафыннан эшләнгән һәм җитештерелгән.
Без фаг пептид китапханәсен ике CM инструменты тычканына (А һәм В класслары) салдык һәм цереброспиналь сыеклыктан һәм каннан аерылган фаза (рәсем 1д).Китапханәнең тиз арада чистартылуы кыргый типтагы фаз белән чагыштырганда азрак күренде.Ике хайванга укол салынган китапханәнең уртача ярты гомере канда 24,8 минут, кыргый фазага охшаган, һәм CSFда 38,5 минут.Animalәрбер хайваннан кан һәм цереброспиналь сыеклык фаг үрнәкләре ХТСка дучар ителделәр һәм барлык ачыкланган пептидлар кыска трипептид мотивы булганы өчен анализланды.Трипептид мотивлары сайланган, чөнки алар структураны формалаштыру һәм пептид-протеин үзара бәйләнеш өчен минималь нигез бирә14,15.Без инъекцияләнгән фей китапханәсе белән ике хайванның каныннан алынган клоннар арасында мотивлар таратуда яхшы бәйләнеш таптык (1-нче рәсем).Мәгълүматлар шуны күрсәтә: китапханәнең составы кан бүлегендә генә баетылган.Веблого16 программасының адаптациясе ярдәмендә аминокислота ешлыклары һәм консенсус эзлеклелеге һәр позициядә анализланды.Кызык, без кан гликин калдыкларында көчле баету таптык (1 нче рәсем).Кан CSF-тан сайланган клоннар белән чагыштырганда, көчле сайлау һәм мотивларның кайбер сайлануы күзәтелде (1-нче рәсем), һәм кайбер аминокислоталар 12 кешедән алдан билгеләнгән урыннарда өстенлек бирделәр (1-нче рәсем).Аерым хайваннар цереброспиналь сыеклыкта аерылып тордылар, ә канда гликинны баету ике хайванда да күзәтелде (өстәмә рәсем 4a - j).1.1 һәм 1,2 хайваннарның цереброспиналь сыеклыгында эзлеклелектә каты фильтрланганнан соң, барлыгы 964 һәм 420 уникаль 12-пептидлар алынган (өстәмә рәсем 1d - e).Изоляцияләнгән фей клоннары көчәйтелде һәм виво сайлауда икенче турга дучар ителделәр.Сайлауның икенче этабыннан алынган фаза һәр хайванда ХТСка дучар ителде һәм барлык ачыкланган пептидлар трипептид мотивларының килеп чыгуын анализлау өчен мотив тану программасына кертү рәвешендә кулланылды (2а рәсем, б, эф).CSF-тан торгызылган этапның беренче циклы белән чагыштырганда, без А һәм В филиалларында CSF-та күп мотивларның сайлануын һәм сайлануын күзәттек (2 нче рәсем).Челтәр идентификациясе алгоритмы кулланылды, алар эзлекле эзлеклелектә төрле.CSF тарафыннан альтернатив клда (2-нче рәсем, г) һәм В классында (2-нче рәсем, з) 12-размерлы эзлеклелек арасында ачык охшашлык күзәтелде.Branchәр филиалда тупланган анализ 12-пептидлар өчен төрле сайлау профильләрен ачыклады (өстәмә рәсем 5c, d) һәм сайлау турының беренче этабы белән чагыштырганда икенче турдан соң тупланган клоннар өчен CSF / кан титерының артуы ачыкланды (өстәмә рәсем 5e).).
Ereереброспиналь сыеклыктагы мотивларны һәм пептидларны виво функциональ фаг дисплей сайлауда бер-бер артлы ике тур белән баету.
Animalәрбер хайванның беренче этабыннан торгызылган барлык цереброспиналь сыеклык этаплары (хайваннар # 1.1 һәм 1.2 1.2) тупланган, көчәйтелгән, HT-эзлекле һәм бергә кушылган (2 x 1010 этап / хайван) 2 СМ каннуляцияләнгән тычканнар (# 1.1 → #).2.1 һәм 2.2, 1,2 → 2.3 һәм 2.4).(a, b, e, f) Беренче һәм икенче сайлау турларында барлык CSF-фазаларның трипептид мотивларының чагыштырма ешлыгын чагыштырган корреляцион таралышлар.Ике юнәлештә дә пептидларда табылган мөмкин булган бер-берсенә охшаган трипептидларны күрсәтүче мотивларның чагыштырма ешлыгы һәм бүленеше.1000 укылышта табылган мотивлар саны күрсәтелгән.Чагыштырылган китапханәләрнең берсендә сизелерлек сайланган (p <0,001) мотивлар кызыл нокталар белән күрсәтелә.(c, d, g, h) Барлык CSF бай 12 аминокислота озын эзлеклелегенең логотибы виво сайлап алу 2 һәм 1 турларына нигезләнеп.Бер хәрефле кодның зурлыгы шул аминокислотаның ничә тапкыр булачагын күрсәтә.Логотипны күрсәтү өчен, ике сайлау раунды арасында аерым хайваннардан алынган CSF эзлеклелеге чагыштырыла һәм икенче турда баетылган эзлеклелек күрсәтелә: (в) # 1.1– # 2.1 (г) # 1.1– # 2.2 (g) # 1.2– # 2.3 һәм (h) # 1.2– # 2.4.(C, d) хайваннарда бирелгән урында иң баетылган аминокислоталар.2.1 һәм юк.2.2 яки (g, h) хайваннарда.2.3 һәм юк.2.4 төсле күрсәтелгән.Яшел = поляр, кызгылт = нейтраль, зәңгәр = төп, кызыл = кислоталы һәм кара = гидрофоб аминокислоталар.
Өченче тур сайлаудан соң, без ике хайваннан изоляцияләнгән 332 CSF-реконструкцияләнгән фаз клоннарыннан 124 уникаль пептид эзлеклелеген ачыкладык (өстәмә рәсем 6а).LGSVS эзлеклелеге (18,7%) иң югары чагыштырма пропорциягә ия, аннары кыргый типтагы PAGISRELVDKL (8,2%), MRWFFSHASQGR (3%), DVAKVS (3%), TWLFSLG (2.2%), һәм SARGSWREIVSLS (2.2%).Соңгы дүртенче турда без өч аерым хайваннан мөстәкыйль сайланган ике ботак тупладык (1с рәсем).CSF-тан торгызылган 925 эзлекле флаг клоннарыннан, дүртенче турда без 64 ​​уникаль пептид эзлеклелеген таптык (өстәмә рәсем 6б), алар арасында кыргый типтагы фазаның чагыштырмача өлеше 0,8% ка кадәр төште.Дүртенче турда иң еш очрый торган CSF клоннары LYVLHSRGLWGFKLAAALE (18%), LGSVS (17%), GFVRFRLSNTR (14%), KVAWRVFSLFWK (7%), SVHGV (5%), GRPQKINGARVC (3.6%), RLSS.%)).Сайланган пептидларның озынлыгы диапазоны NNK китапханә дизайны өчен бозылган кодларны кулланганда нуклеотид кертү / бетерү яки китапханә праймерларында вакытыннан алда туктату кодлары аркасында.Вакытсыз тукталыш кодлары кыска пептидлар барлыкка китерәләр, чөнки аларда уңайлы мотив бар.Озын пептидлар синтетик китапханәләрнең праймерларына кертү / бетерү нәтиҗәсендә булырга мөмкин.Бу эшләнгән тукталыш кодын рамнан читтә урнаштыра һәм яңа тукталыш коды түбән агымга чыкканчы укый.Гомумән алганда, без кертү мәгълүматларын үрнәк чыгару мәгълүматлары белән чагыштырып, дүрт сайлау турының баету факторларын исәпләдек.Тикшерүнең беренче туры өчен без кыргый типтагы фаза титерларын специаль булмаган фон сылтамасы итеп кулландык.Кызык, тискәре фаз сайлау беренче CSF циклында бик көчле иде, ләкин канда түгел (3а рәсем), бу пептид китапханәсенең күпчелек әгъзаларының CSF бүлегенә пассив таралу ихтималлыгы аркасында булырга мөмкин, яки чагыштырмача этаплар бактериофагларга караганда эффектив саклана яки чыгарыла.Ләкин, икенче турда, CSF-та этапларның көчле сайлануы ике клэдта да күзәтелде, алдагы тур CSF алуга ярдәм итүче пептидларны күрсәтүче этапларда баетылганын күрсәтә (3а рәсем).Тагын, канны баетмыйча.Шулай ук ​​өченче һәм дүртенче турда фей клоннары CSFда шактый баетылды.Соңгы ике тур сайлау арасындагы уникаль пептид эзлеклелегенең чагыштырма ешлыгын чагыштырып, без сайлау эзлеклелегенең дүртенче турында тагын да баетылганын таптык (3б рәсем).Пептид юнәлешен кулланып, 64 уникаль пептид эзлеклелегеннән барлыгы 931 трипептид мотивы алынган.Дүртенче турдагы иң баетылган мотивлар инъекцияләнгән китапханә белән чагыштырганда, баету профильләрен җентекләп тикшерделәр (киселгән: 10% баету) (өстәмә рәсем 6с).Гомуми сайлау үрнәкләре күрсәткәнчә, өйрәнелгән мотивларның күбесе сайлау филиалларының алдагы турларында баетылган.Ләкин, кайбер мотивлар (мәсәлән, SGL, VSG, LGS GSV) күбесенчә А клэдыннан иде, калганнары (мәсәлән, FGW, RTN, WGF, NTR) альтернатив В классында баетылды.
Стрептавидин йөкләүләренә кушылган CSF белән баетылган фаг-пептидлар һәм биотинилатланган лидер пептидларын CSF транспортын тикшерү.
а) Барлык дүрт турда (R1-R4) инъекцияләнгән (кертү = I) фаза (PFU) титерлары һәм CSF фаза титерлары (чыгару = O) нигезендә исәпләнгән баету күрсәткечләре.Соңгы өч тур өчен баету факторлары (R2-R4) алдагы тур һәм беренче тур (R1) белән авырлык мәгълүматлары белән чагыштырганда исәпләнде.Ачык барлар - цереброспиналь сыеклык, күләгәле барлар - плазма.(*** p <0,001, Студентларның т-тестына нигезләнеп).б) 4-нче турдан соң CSF-та җыелган барлык этапларга чагыштырмача пропорция буенча иң күп фаг пептидлары исемлеге.Иң еш очрый торган алты флаг клоны төс белән күрсәтелә, номерланган һәм аларны баету факторлары 3 һәм 4 тур (инсетлар) арасында.(в, г) Дүртенче турдан иң баетылган алты флаг клоны, буш фаг һәм ата-ана фаг пептид китапханәләре CSF сайлау моделендә аерым анализланды.CSF һәм кан үрнәкләре күрсәтелгән вакыт пунктларында җыелган.в) тигез күләмдә 6 кандидат фаг клоны (2 x 1010 фаза / хайван), буш этаплар (# 1779) (2 x 1010 фаза / хайван) һәм запас фаг пептид китапханәләре (2 x 1012 фаза / хайван) ким дигәндә 3 CM каннуляцияләнгән хайванга койрык тамыры аша аерым бирелә.Вакыт узу белән һәр инъекцияләнгән фей клонның һәм фаг пептид китапханәсенең CSF фармакокинетикасы күрсәтелә.г) сайлау вакытында барлык торгызылган этаплар / мл өчен уртача CSF / кан коэффициентын күрсәтә.(e) Дүрт синтетик лидер пептид һәм бер кысылган контроль биотин белән стрептавидинга N-терминалы (тетрамер дисплей) аша бәйләнде, аннары инъекция (койрык тамыры iv, 10 мг стрептавидин / кг).Ким дигәндә өч интубацияләнгән тычкан (N = 3).).CSF үрнәкләре күрсәтелгән вакыт пунктларында җыелды һәм стрептавидин концентрацияләре CSF анти-стрептавидин ELISA белән үлчәнде (nd = табылмады).(* p <0.05, ** p <0.01, *** p <0,001, ANOVA тесты нигезендә).е) аминокислота эзлеклелеген иң баетылган фаг пептид клонының 2002 (кызгылт) 4-нче турдан сайлап алынган фаг пептид клоннары белән чагыштыру.Бер үк һәм охшаш аминокислота фрагментлары төсле.
Дүртенче турдагы барлык баетылган этаплардан (3б рәсем), CSF сайлау моделендә алга таба индивидуаль анализ өчен алты кандидат клоны сайланды.Тигез күләмдә алты кандидат фазасы, буш этап (кертү юк) һәм пептид китапханәләре өч каннуляцияләнгән CM хайваннарына укол ясалды, һәм фармакокинетика CSF (3 нче рәсем) һәм кан (өстәмә рәсем 7) анализларында билгеләнде.Сынап каралган барлык фаз клоннары CSF бүлеген буш контроль этапныкыннан 10-1000 тапкыр югарырак дәрәҗәдә максат иттеләр (# 1779).Мәсәлән, 2020 2020 һәм 77 2077 клоннары контроль этапка караганда 1000 тапкыр күбрәк CSF титерлары булган.Selectedәрбер сайланган пептидның фармакокинетик профиле төрле, ләкин аларның барысы да югары CSF урнаштыру сәләтенә ия.Вакыт узу белән без 1903 һәм # 2011 клоннар өчен даими кимүне күзәттек, 2077, # 2002 һәм 2009 2009 клоннары өчен беренче 10 минутта арту актив транспортны күрсәтергә мөмкин, ләкин тикшерелергә тиеш.2020, # 2002, һәм # 2077 клоннары югары дәрәҗәдә тотрыкланды, ә 2009-нчы клонның CSF концентрациясе беренче үсештән соң әкренләп кимеде.Аннары без һәр CSF кандидатының чагыштырма ешлыгын аның кан концентрациясе белән чагыштырдык (3 нче рәсем).CSәрбер кандидатның уртача титерының кан титеры белән бәйләнеше күрсәткәнчә, алты кандидатның өчесе CSF канында сизелерлек баетылган.Кызык, 2077 клон канның тотрыклылыгын күрсәтте (өстәмә рәсем 7).Пептидларның үзләре фаз кисәкчәләреннән башка йөкләрне CSF бүлегенә актив йөртә алуларын раслау өчен, без N-терминалда биотин белән алынган дүрт лидер пептидны синтезладык, анда пептидлар фаз кисәкчәсенә тоташалар.Биотинилатланган пептидлар (2002, 2009, 2020 һәм 2077) стрептавидин (SA) белән конфигурацияләнде, фаг геометриясен берникадәр охшаткан мультимерик формалар алу өчен.Бу формат безгә шулай ук ​​кандагы һәм цереброспиналь сыеклыктагы SA тәэсирен йөк ташучы белок пептидлары итеп үлчәргә мөмкинлек бирде.Иң мөһиме, синтетик пептидлар бу SA-конфигурацияләнгән форматта кулланылганда, фейг мәгълүматлары еш кабатланырга мөмкин (3-нче рәсем).Чистартылган пептидларның башлангыч тәэсире азрак һәм 48 сәгать эчендә ачыкланмаган дәрәҗәләр белән тизрәк CSF чистарту.Бу пептид фаг клоннарын CSF киңлегенә китерү юллары турында төшенү өчен, без иммунохистохимия (IHC) ярдәмендә фаг кисәкчәләрен локализацияләүне анализладык, вивога венага кертелгәннән соң 1 сәгатьтән соң фаг кисәкчәләрен турыдан-туры ачыклау.Шунысы игътибарга лаек, 2002 2002, 77 2077, һәм 2009 2009 клоннары баш ми капиллярларында булган буяу белән ачыкланырга мөмкин, ә контроль этап (1779) һәм 2020 2020 клоны табылмаган (Өстәмә рәсем 8).Бу бу пептидларның BBB аша узып, баш миенә тәэсир итүен күрсәтә.Бу гипотезаны сынап карау өчен тагын да җентекле анализ кирәк, чөнки BSCFB маршруты да катнашырга мөмкин.Иң баетылган клонның аминокислота эзлеклелеген (2002 2002) бүтән сайланган пептидлар белән чагыштырганда, аларның кайберләренең охшаш транспорт механизмын күрсәтә алган аминокислота киңәйтелүе билгеләнде (3ф рәсем).
Uniqueзенчәлекле плазма профиле һәм вакыт узу белән CSF-ның сизелерлек артуы аркасында, 2077 фаг дисплей клоны тагын 48 сәгать дәвамында өйрәнелде һәм тотрыклы SA дәрәҗәләре белән берлектә күзәтелгән CSF тиз үсүен күрсәтә алды (4а рәсем).Башка ачыкланган фей клоннарына килгәндә, 77 2077 ми капиллярлары өчен нык буялган һәм югары резолюциядә каралганда һәм, бәлкем, паренхималь киңлектә тап булганда, капиллярлы маркер лекциясе белән зур колокализация күрсәтте (4б рәсем).Пептид-арадаш фармакологик эффектлар CNSда алына аламы-юкмы икәнлеген тикшерү өчен, без эксперимент үткәрдек, анда биотинилатланган версияләр i) # 2077 транзит пептид һәм ii) BACE1 ингибиторы пептиды SA белән ике төрле катнашуда катнаштылар.Бер комбинация өчен без BACE1 пептид ингибиторын гына кулландык, икенчесе өчен BACE1 пептид ингибиторының # 2077 пептидына 1: 3 нисбәтен кулландык.Ике үрнәк тә венага кертелде, бета-амилоид пептид 40 (Abeta40) кан һәм цереброспиналь сыеклык дәрәҗәсе вакыт белән үлчәнде.Abeta40 CSF белән үлчәнде, чөнки ул баш ми паренхимасында BACE1 тыюлыгын чагылдыра.Көтелгәнчә, ике комплекс та Abeta40 кан дәрәҗәсен сизелерлек киметтеләр (4с рәсем, г).Ләкин, пептид катнашмасы булган үрнәкләр генә.2077 һәм SA белән кушылган BACE1 пептидының ингибиторы цереброспиналь сыеклыкта Abeta40ның сизелерлек кимүенә китерде (4с рәсем).Мәгълүматлар шуны күрсәтә: пептид юк.2077 60 kDa SA протеинын CNSга ташый ала, шулай ук ​​BACE1 пептидының SA-кониугатив ингибиторы белән фармакологик эффектлар китерә.
а) Клональ инъекция (2 × 10 фаза / хайван) T7 фазасының озак вакытлы фармакокинетик профилен күрсәтә CS 2077 (RLSSVDSDLSGC) һәм инжекцияләнмәгән контроль этап (# 1779) ким дигәндә өч CM-интубацияләнгән тычканда.б) фаг-инъекцияле тычканнардагы (2 × 10 10 этап / хайван) вәкиллекле корталь микровессельләрнең конфокаль микроскопик образы, пептид # 2077 һәм суднолар (лекция) каршы торуын күрсәтә.Бу фей клоннары 3 тычканга бирелгән һәм парфюция алдыннан 1 сәгать әйләнергә рөхсәт ителгән.Баш миләре T7 фаге капсидына каршы поликлональ FITC маркалы антителалар белән бүлеп, буялган.Парфюциягә һәм аннан соң төзәтүгә ун минут кала, DyLight594 маркалы лекция венага кертелде.Капиллярлар һәм периваскуляр ми тукымасында микроэлементларның һәм фагларның (яшел) луминаль ягының лекин боеклыгын (кызыл) күрсәтүче флуоресцент рәсемнәр.Масштаб сызыгы 10 ммга туры килә.(в, г) Биотинилатланган BACE1 ингибитор пептиды берүзе яки биотинилатланган транзит пептид белән берлектә # 2077 стрептавидинга кушылды, аннары ким дигәндә өч каннуляцияләнгән CM тычканнары (10 мг стрептавидин / кг).Aβ40дагы BACE1 пептид ингибиторы-арадаш кимү Aβ1-40 ELISA белән канда (кызыл) һәм цереброспиналь сыеклыкта (кызгылт сары) күрсәтелгән вакыт пунктларында үлчәнде.Яхшырак аңлаешлы булу өчен, графикка нокта сызыгы 100% шкаласында сызылган.в) кандагы Aβ40 процентын киметү (кызыл өчпочмаклар) һәм цереброспиналь сыеклык (кызгылт сары өчпочмак) стрептавидин белән эшкәртелгән тычканнарда # 2077 һәм BACE1 ингибитор пептид 3: 1 нисбәтендә.г) стрептавидин белән эшкәртелгән тычканнарның Aβ40 (кызыл түгәрәкләр) һәм цереброспиналь сыеклык (кызгылт сары түгәрәкләр) процентын киметү, BACE1 ингибитор пептиды белән кушылган.Контрольдә Aβ концентрациясе 420 пг / мл булган (стандарт тайпылыш = 101 пг / мл).
Фаз дисплей биомедицина тикшеренүләренең берничә өлкәсендә уңышлы кулланылды17.Бу ысул виво-кан тамырлары төрлелеген өйрәнү өчен кулланылды18,19, шулай ук ​​баш мие тамырларына юнәлтелгән тикшеренүләр20,21,22,23,24,25,26.Бу тикшеренүдә без бу сайлау ысулын куллануны баш мие тамырларына юнәлтелгән пептидларны турыдан-туры ачыклауга гына түгел, ә кан-ми барьерын кичерү өчен актив транспорт характеристикасы булган кандидатларны ачуга да киңәйттек.Хәзер без CM интубацияләнгән тычканнарда виво сайлау процедурасының үсешен тасвирлыйбыз һәм CSF хоминг үзенчәлекләре булган пептидларны ачыклау потенциалын күрсәтәбез.12-нче очраклы пептидлар китапханәсен күрсәтүче T7 фазасын кулланып, без T7 этапның кан-ми барьерына яраклашырлык дәрәҗәдә кечкенә булуын күрсәтә алдык, шуның белән турыдан-туры кан-ми барьерын яки хороид плексусны кичеп.Каннуляцияләнгән CM тычканнарыннан CSF җыеп алу виво функциональ тикшерү ысулы белән яхшы контрольдә тотылган, һәм алынган фаз кан тамырлары белән генә чикләнмичә, кан-ми барьеры аша ташучы булып та эшләгән.Моннан тыш, бер үк вакытта кан җыеп, HTSны CSF һәм каннан алынган этапларга кулланып, без CSF сайлавыбыз канны баету яки сайлау турлары арасындагы киңәйтү фитнесы тәэсир итмәвен расладык.Ләкин, кан бүлеге сайлау процедурасының бер өлеше, чөнки CSF бүлмәсенә барып җитә алган этаплар яшәргә һәм канда озак яшәргә тиеш, үзләрен мидә баетыр өчен.Чимал HTS мәгълүматларыннан ышанычлы эзлеклелектә мәгълүмат алу өчен, без анализ эш процессында платформадагы эзлекле хаталарга яраклаштырылган фильтрлар керттек.Кинетик параметрларны скринка ысулына кертеп, без 24, 27, 28 кандагы кыргый типтагы T7 этапларының (t½ min 28 мин) тиз фармакокинетикасын расладык, һәм шулай ук ​​аларның ярты гомерен цереброспиналь сыеклыкта (t½ min 26 мин) билгеләдек.Кан һәм CSFдагы охшаш фармакокинетик профильләргә карамастан, CSF-та фагның концентрациясенең 0,001% гына табылырга мөмкин, бу кан-ми барьеры аша кыргый типтагы T7 фазасының түбән фон хәрәкәтен күрсәтә.Бу эш виво паннинг стратегияләрен кулланганда сайлауның беренче этабының мөһимлеген күрсәтә, аеруча әйләнештән тиз арада чистартылган фаг системалары өчен, чөнки берничә клон CNS бүлегенә барып җитә ала.Шулай итеп, беренче турда китапханә төрлелегенең кимүе бик зур булды, чөнки чикләнгән санлы клоннар гына ахыр чиктә бу бик каты CSF моделендә җыелдылар.Бу виво паннинг стратегиясендә CSF бүлегендә актив туплау, кан бүлмәсендә клонның исән калуы, беренче 10 минут эчендә каннан T7 фаз клоннарын тиз арада чыгару кебек берничә сайлау адымы кертелде (1-нче рәсем һәм өстәмә рәсем 4М).).Шулай итеп, беренче турдан соң CSF-та төрле фей клоннары ачыкланды, бер үк бассейн аерым хайваннар өчен кулланылса да.Бу шуны күрсәтә: күп санлы китапханә әгъзалары булган чыганак китапханәләр өчен берничә катгый сайлау адымнары күптөрлелекнең сизелерлек кимүенә китерә.Шуңа күрә очраклы вакыйгалар башлангыч сайлау процессының аерылгысыз өлешенә әйләнәчәк, нәтиҗәгә зур йогынты ясый.Мөгаен, оригиналь китапханәдәге клоннарның күбесе CSF баету охшашлыгына охшаган.Ләкин, шул ук эксперимент шартларында, башлангыч бассейндагы һәрбер клонның аз булуы аркасында сайлау нәтиҗәләре төрле булырга мөмкин.
CSF белән баетылган мотивлар кандагыдан аерылып тора.Кызык, без аерым хайваннар канындагы гликинга бай пептидларга таба беренче сменаны күрдек.(1г рәсем, өстәмә рәсемнәр. 4e, 4f).Гликин пептидлары булган фаза тотрыклырак булырга һәм әйләнештән азрак чыгарга мөмкин.Ләкин, бу гликинга бай пептидлар цереброспиналь сыеклык үрнәкләрендә табылмады, бу китапханәләрнең ике төрле сайлау адымын үткәнен күрсәтә: берсе канда, икенчесе цереброспиналь сыеклыкта тупланырга рөхсәт ителә.Дүртенче сайлау нәтиҗәсендә CSF белән баетылган клоннар киң сынадылар.Индивидуаль тикшерелгән клоннарның барысы да диярлек буш контроль этап белән чагыштырганда CSF белән баетылганлыгы расланды.Бер пептид сугу (# 2077) җентекләп тикшерелде.Бу бүтән хитлар белән чагыштырганда озынрак плазмалы ярым гомер күрсәтте (3 нче рәсем һәм өстәмә рәсем 7), һәм кызык, бу пептидта C-терминалда цистин калдыклары бар.Күптән түгел пептидларга цистин кушылу аларның фармакокинетик үзлекләрен 29 альбуминга бәйләп яхшырта алуы күрсәтелде.Бу хәзерге вакытта 2077 пептид өчен билгеле түгел һәм алга таба өйрәнүне таләп итә.Кайбер пептидлар CSF баетуда валентка бәйләнеш күрсәттеләр (мәгълүматлар күрсәтелмәгән), бу T7 капсидының күрсәтелгән өслеге геометриясе белән бәйле булырга мөмкин.Без кулланган T7 системасы бер фаз кисәкчәсенә һәр пептидның 5-15 данә копиясен күрсәтте.IHC тычканнарның баш мие кортексына венага кертелгән кандидат кургаш фаг клоннарында башкарылды (өстәмә рәсем 8).Мәгълүматлар күрсәткәнчә, ким дигәндә өч клон (No. 2002, No. 2009 һәм 77 2077) BBB белән үзара бәйләнгән.Бу BBB үзара бәйләнеш CSF туплануга яки бу клоннарның турыдан-туры BCSFB хәрәкәтенә китерүен ачыкларга кирәк.Иң мөһиме, без сайланган пептидларның синтезланган һәм протеин йөкләренә бәйләнгәндә CSF транспорт куәтен саклап калуларын күрсәтәбез.N-терминал биотинилатланган пептидларны SA белән бәйләү, нигездә, кан һәм цереброспиналь сыеклыктагы фаг клоннары белән алынган нәтиҗәләрне кабатлый (3-нче рәсем).Ниһаять, без күрсәтәбез, 2077 кургашлы пептид SA белән конфигурацияләнгән BACE1 биотинилатланган пептид ингибиторының баш мие эшчәнлеген алга этәрә ала, CSF-та Abeta40 дәрәҗәсен сизелерлек киметеп CNSда фармакодинамик эффектлар китерә (4 нче рәсем).Барлык хитларны да пептид эзлеклелеге буенча гомология эзләү белән базада бернинди гомологны да таба алмадык.Шунысын да әйтергә кирәк, T7 китапханәсенең күләме якынча 109, ә 12 мер өчен теоретик китапханә күләме 4 x 1015. Шуңа күрә без 12-пептид китапханәсенең күптөрлелек киңлегенең кечкенә өлешен генә сайлап алдык, бу билгеле булган хитларның күрше эзлеклелеген бәяләп, оптимальләштерелгән пептидларны ачыклау мөмкинлеген аңлатырга мөмкин.Гипотетик яктан, бу пептидларның табигый гомологларын тапмавыбызның бер сәбәбе эволюция вакытында баш миенә кайбер пептид мотивларының контрольсез керүен булдырмас өчен сайлау булырга мөмкин.
Бергә тупланганнан соң, безнең нәтиҗәләр киләчәктә цереброваскуляр барьерның транспорт системаларын ачыклау һәм характерлау өчен нигез бирә.Бу ысулның төп көйләнеше функциональ сайлау стратегиясенә нигезләнгән, ул баш мие кан тамырларын бәйләү үзенчәлекләре булган клоннарны ачыклый гына түгел, ә уңышлы клоннарның биологик киртәләрне CNS бүлегенә кертү өчен критик адымны да үз эченә ала.бу пептидларны ташу механизмын һәм аларның ми өлкәсенә хас микроваскульатурага бәйләү өстенлеген аңлату.Бу BBB һәм рецепторлар ташу өчен яңа юллар табуга китерергә мөмкин.Ачыкланган пептидлар турыдан-туры цереброваскуляр рецепторларга яки BBB яки BCSFB аша ташылган әйләнешле лигандларга бәйләнергә мөмкин дип көтәбез.Бу эштә ачылган CSF транспорт активлыгы булган пептид векторлары алга таба тикшереләчәк.Хәзерге вакытта без бу пептидларның ми үзенчәлеген тикшерәбез, аларның BBB һәм / яки BCSFB аша уза алулары.Бу яңа пептидлар яңа рецепторларны яки юлларны потенциаль ачу һәм биология кебек макромолекулаларны мигә китерү өчен яңа югары эффектив платформалар булдыру өчен бик кыйммәтле корал булачак.
Элегерәк тасвирланган ысулның модификациясе ярдәмендә зур цистернаны (CM) каннуляцияләгез.Анестезланган Вистар тычканнары (200-350 г) стереотаксик аппаратка куелганнар һәм баш сөяген фаш итү өчен кырылган һәм асептик рәвештә әзерләнгән баш тиресенә уртача кисү ясалган.Upperгары полоса өлкәсендә ике тишек борагыз һәм тишекләргә винталарны бәйләгез.СМга дат басмаган корыч каннуланы стереотактик җитәкчелек итү өчен, каптал оксипиталь крестта өстәмә тишек борауланды.Каннула тирәсендә теш цементын кулланыгыз һәм винталар белән саклагыз.Фото-дәвалау һәм цемент каты булганнан соң, тире ярасы 4/0 супрамид сутурасы белән ябылды.Каннуланы дөрес урнаштыру цереброспиналь сыеклыкның (CSF) үз-үзеннән агып китүе белән раслана.Стереотаксик аппараттан тычканны чыгарыгыз, операциядән соң тиешле кайгырту һәм авырту белән идарә итегез, һәм цереброспиналь сыеклыкта кан билгеләре күренгәнче ким дигәндә бер атна торгызылырга рөхсәт итегез.Вистар тычканнары (Crl: WI / Han) Чарльз елгасыннан (Франция) алынган.Барлык тычканнар да махсус патогенсыз шартларда сакланган.Барлык хайван тәҗрибәләре дә Базель шәһәренең Ветеринария офисы тарафыннан расланган һәм 2474-нче хайван лицензиясе нигезендә башкарылган (ereереброспиналь сыеклыкта һәм тычкан миендә терапевтик кандидатларның дәрәҗәләрен үлчәп актив ми транспортын бәяләү).
Кычытканны CM каннуласы белән йомшак кына саклагыз.Датураны каннуладан чыгарып, 10 µл үзеннән-үзе агып торган цереброспиналь сыеклыкны җыегыз.Каннуланың патентлыгы ахыр чиктә бозылганлыктан, бу тикшеренүдә канның пычрануы яки төссезләнүе турында бернинди дәлилләре булмаган ачык цереброспиналь сыеклык үрнәкләре кертелде.Параллель рәвештә, якынча 10–20 μл кан койрык очындагы кечкенә кисәктән гепарин (Сигма-Алдрич) трубаларына алынды.CSF һәм кан T7 фагына венага кертелгәннән соң төрле вакыт пунктларында җыелган.CSәр CSF үрнәге җыелганчы якынча 5-10 μл сыеклык ташланды, бу катетерның үлгән күләменә туры килә.
T7Select 10-3b векторы ярдәмендә китапханәләр T7Select системасы кулланмасында күрсәтелгәнчә ясалган (Новаген, Розенберг һ.б., InNovations 6, 1-6, 1996).Кыскасы, очраклы 12-ДНК кертү түбәндәге форматта синтезланган:
NNK кодоны икеләтә тукталыш кодларын һәм кыстыргычта аминокислотаны чиктән тыш кысу өчен кулланылды.N - һәр нуклеотидның кул белән катнаш эквимоляр коэффициенты, ә К - аденин һәм цитозин нуклеотидларының кул белән катнаш эквимоляр катнашлыгы.Бер катлы регионнар ике катлы ДНКга әверелделәр, алга таба dNTP (Новаген) һәм Кленов ферменты (Яңа Англия Биолаблары) белән Кленов буферында (Яңа Англия Биолаблары) 3 сәгать 37 ° C.Реакциядән соң, ике катлы ДНК EtOH явым-төшеме белән торгызылды.Нәтиҗә ясалган ДНК EcoRI һәм HindIII чикләү ферментлары белән эшкәртелде (икесе дә Рочедан).Чистартылган һәм чистартылган (QIAquick, Qiagen) кыстыргыч (T4 лигаз, Яңа Англия биолаблары) аннары 10B капсидлы генның 348 аминокислотасыннан соң алдан киселгән T7 векторына бәйләнде.Витро упаковкага кадәр 18 сәгать дәвамында суд процесслары 16 ° C температурада инкубацияләнде.Витродагы фаза төрү T7Select 10-3b клонлау комплекты (Новаген) белән бирелгән күрсәтмәләр буенча башкарылды һәм төрү эремәсе бер тапкыр Эчеричия Коли (BLT5615, Новаген) ярдәмендә лизиска көчәйтелде.Лизатлар центрифугацияләнгән, титрланган һәм глицерол запасы эремәсе буларак -80 ° C градусында туңдырылган.
454 / Roche-amplicon кушылу праймеризы ярдәмендә чүпрәк яки тәлинкәдә көчәйтелгән фаза үзгәрүчән регионнарны туры PCR көчәйтү.Алга кушылу праймерында үзгәрүчән регион (NNK) 12 (шаблонга хас), GS FLX Титан Адаптеры, һәм дүрт базалы китапханә ачкычы эзлеклелеге (TCAG) бар (өстәмә рәсем 1а):
Кире кушылу праймерында шулай ук ​​мишәрләрне тоту өчен тоташтырылган биотин һәм эмульсия PCR вакытында клональ көчәйтү өчен кирәк булган GS FLX Титан Адаптеры бар:
Аннары ампликоннар 454 GS-FLX Титан протоколы нигезендә 454 / Roche пиросеквенциясенә дучар ителделәр.Sanger кул белән эзләү өчен (Гамәли биосистемалар Hitachi 3730 xl DNA анализаторы), T7 фаза ДНК PCR көчәйтелде һәм түбәндәге пример парлары белән чиратлашты:
Аерым такталардан кертелгәннәр Roche Fast Start DNA полимераз комплекты ярдәмендә PCR көчәйтү көченә дучар ителделәр (җитештерүче күрсәтмәсе буенча).Кайнар стартны башкарыгыз (10 минут 95 ° C) һәм 35 күтәрү циклын (50 с 95 ° C, 1 ° 50 ° C, 1 минут 72 ° C).
Китапханәләрдән фаза, кыргый типтагы фаза, CSF һәм каннан коткарылган фаза, яки аерым клоннар Эчеричия коли BL5615 туберкулезында (Сигма Алдрич) яки 500 см2 савытта (Термо Фәнни) 4 сәг 37 ° C.Фаза тәлинкәләрдән Tris-EDTA буферы (Fluka Analytical) белән чайкап яки стериль пипетка очлары белән такталарны җыеп алынган.Фаза полиэтилен гликол (PEG 8000) явым-төшеме (Промега) белән культура супернатанты яки чыгару буферыннан изоляцияләнде һәм Tris-EDTA буферында реанимацияләнде.
Күчерелгән этап эндотоксинны чыгару өчен 2-3 раунд эндотоксин чыгаруга дучар ителде (Милтений Биотек), венага (IV) инъекциягә кадәр (500 μл / хайван).Беренче турда 2 × 1012 этап кертелде;икенчесендә 2 × 1010 этап;өченче һәм дүртенче сайлау турларында, бер хайванга 2 × 109 этап.CSF-ның фаз эчтәлеге һәм күрсәтелгән вакыт пунктларында җыелган кан үрнәкләре җитештерүче күрсәтмәсе буенча (T7Select системасы кулланмасы) тактаны санау белән билгеләнде.Фаз сайлау чистартылган китапханәләрнең койрык тамырына венага кертелүе яки алдагы сайлау турыннан CSF-тан алынган фагны яңадан инъекцияләү белән башкарылды, һәм соңрак уңыш 10 минут, 30 мин, 60 мин, 90 мин, 120 мин, 180 мин, һәм 240 мин CSF һәм кан үрнәкләрендә башкарылды.Барлыгы дүрт тур виво паннинг үткәрелде, анда сайланган ике филиал аерым сакланды һәм беренче өч турда анализланды.Сайлауның беренче ике турыннан CSF-тан алынган барлык фейдж кыстыргычлары 454 / Roche пиросеквенциясенә дучар ителделәр, соңгы ике турдан CSF-тан алынган барлык клоннар кул белән эзлекле.Сайлауның беренче этабыннан барлык кан этаплары шулай ук ​​454 / Roche pyrosequencing тәэсиренә дучар ителделәр.Фаз клоннарын инъекцияләү өчен, сайланган этаплар Э.Колида (BL5615) 500 см2 тәлинкәләрдә 37 ° C тәүлек эчендә көчәйтелде.Индивидуаль сайланган һәм кул белән эзлекле клоннар туберкулезда таралдылар.Фазны чыгару, чистарту һәм эндотоксинны чыгарганнан соң (югарыда әйтелгәнчә), 300 μлда 2 × 1010 фаза / хайван бер койрык тамырына венага кертелде.
Эзләү мәгълүматларын эшкәртү һәм сыйфатлы фильтрлау.Чимал 454 / Roche мәгълүматлары икеләтә стандарт агым картасы форматыннан (sff) сатучы программа ярдәмендә Pearson кеше укый торган форматына (фаста) үзгәртелде.Алга таба нуклеотид эзлеклелеген эшкәртү C программалары һәм сценарийлары (чыгарылмаган программа пакеты) ярдәмендә башкарылды.Беренчел мәгълүматларга анализ каты этаплы фильтрлау процедураларын үз эченә ала.ДНК эзлеклелеген кертмәгән укуларны фильтрлау өчен, укулар ярлыкны (GTGATGTCGGGGATCCGAATTCT) башлау, ярлыкны туктату (TAAGCTTGCGGCCGCACTCGAGTA) һәм фон кертү (CCCTGCAGGGATATCCCGGGAGCTCGTCGACman).тигезләү өчен 2 кадәр туры килмәүче рөхсәт тигезләү31.Шуңа күрә, башлангычсыз укуны туктату һәм тегларны туктату һәм фон кыстыргычлары булган укулар, ягъни рөхсәт ителгән саннан арткан тигезләүләр китапханәдән алынды.Калган укуларга килгәндә, N-mer ДНК эзлеклелеге башлангыч билгесеннән сузылып, тукталыш билгесе оригиналь уку эзлеклелегеннән чыгарылып, алга таба эшкәртелә (алга таба "кертү" дип атала).Керү тәрҗемә ителгәннән соң, праймерның 5 ′ очындагы беренче тукталыш кодыннан соң өлеш кертүдән чыгарыла.Моннан тыш, праймерның 3 ′ очында тулы булмаган кодларга китерүче нуклеотидлар да алынды.Фон эзлеклелеге булган кыстыргычларны чыгару өчен, "PAG" аминокислота үрнәгеннән тәрҗемә ителгән кыстыргычлар да алынды.Тәрҗемәдән соң озынлыгы 3 аминокислоталардан аз булган пептидлар китапханәдән алынды.Ниһаять, кертү бассейнындагы артыклыкны бетерегез һәм һәр уникаль кертү ешлыгын билгеләгез.Бу анализ нәтиҗәләре нуклеотид эзлеклелеге (кыстыргычлар) һәм аларның (уку) ешлыклары исемлеген кертте (өстәмә рәсемнәр 1c һәм 2).
Группа N-mer ДНК эзлеклелеге буенча кертә: 454 / Roche-специфик хаталарны бетерү өчен (мәсәлән, гомополимер киңәйтү проблемалары) һәм азрак мөһим артыклыкларны бетерү өчен, элек чистартылган N-mer DNA эзлеклелеге (кыстыргычлар) охшашлык буенча сортланган.түбәндәгечә билгеләнгән iterative алгоритм кулланып кертүләр (2 туры килмәгән база рөхсәт ителә): кертүләр иң ешлыгы буенча (иң югарыдан иң түбәнгә), һәм алар бер үк булса, озынлыгы буенча икенчел сортлары буенча (иң озыннан кыска)).Шулай итеп, иң еш һәм иң озын кертүләр беренче “төркемне” билгели.Төркем ешлыгы төп ешлыкка куелган.Аннары, сортланган исемлектә калган һәрбер кертү группага Нидлеман-Вунш тигезләнеше белән кушылырга тырышылды.Әгәр дә тигезлектә туры килмәү, кертү яки бетерү саны 2 бусагасыннан артмаса, төркемгә кертү өстәлә, һәм төркемнең гомуми ешлыгы кертү ешлыгы белән арта.Төркемгә өстәлгән керемнәр кулланылган дип билгеләнәләр һәм алга таба эшкәртүдән чыгарыла.Әгәр дә булган эзлеклелектә кертү эзлеклелеген өстәп булмый икән, кертү эзлеклелеге тиешле кертү ешлыгы белән яңа төркем булдыру өчен кулланыла һәм кулланылганча билгеләнә.Eachәрбер кертү эзлеклелеге яңа төркем формалаштыру өчен кулланылган яисә инде булган төркемгә кертелгәч, кабатлау тәмамлана.Нуклеотидлардан торган төркемләнгән кыстыргычлар ахыр чиктә пептид эзлеклелегенә тәрҗемә ителә (пептид китапханәләре).Бу анализ нәтиҗәләре эзлекле уку санын тәшкил иткән кертүләр җыелмасы һәм аларның ешлыклары (өстәмә рәсем 2).
Motif Generation: уникаль пептидлар исемлегенә нигезләнеп, аста күрсәтелгәнчә барлык мөмкин булган аминокислота үрнәкләрен үз эченә алган китапханә булдырылды.3 озынлыкның мөмкин булган һәрбер үрнәге пептидтан алынган һәм аның кире үрнәге барлык мотивлар (трипептидлар) булган гомуми мотив китапханәсе белән өстәлгән.Highlyгары кабатланган мотивларның китапханәләре эзлеклелектә һәм артык арындырылды.Аннары, мотив китапханәсендәге һәр трипептид өчен без исәпләү кораллары ярдәмендә аның китапханәдә булуын тикшердек.Бу очракта, трипептид мотивы булган пептидның ешлыгы өстәлә һәм мотив китапханәсендә мотивка билгеләнә (“мотивлар саны”).Мотив ясау нәтиҗәсе - трипептидларның (мотивларның) барлык очракларын һәм аларның кыйммәтләрен үз эченә алган ике үлчәмле массив, укулар фильтрланган, төркемләнгән һәм тәрҗемә ителгәндә тиешле мотивка китергән эзлекле уку саны.Aboveгарыда җентекләп сурәтләнгәнчә метрика.
Мотивлар һәм тиешле таралышлар санын нормалаштыру: eachәрбер үрнәк өчен мотивлар саны нормальләштерелде.
монда ni - i темасы булган укулар саны.Шулай итеп, vi үрнәктә i мотивы булган укуларның (яки пептидларның) процент ешлыгын күрсәтә.Нормалашмаган мотивларның P-кыйммәтләре Фишерның төгәл сынаулары ярдәмендә исәпләнде.Мотивлар санының коррелограммаларына килгәндә, Спирманның корреляцияләре нормальләштерелгән мотивлар саны белән Р. белән исәпләнде.
Пептид китапханәсенең һәр позициясендә аминокислоталарның эчтәлеген күз алдына китерү өчен, 32, 33 (http://weblogo.threeplusone.com) веб логограммалары булдырылды.Беренчедән, 12-пептидның һәр позициясендә аминокислоталарның эчтәлеге 20 × 12 матрицада саклана.Аннары, һәр позициядә бер үк чагыштырма аминокислота булган 1000 пептидлар җыелмасы фаста-эзлеклелек форматында ясала һәм веб-логотип 3 кертү рәвешендә бирелә, бу һәр позициядә чагыштырмача аминокислота эчтәлеген график яктан күрсәтә.бирелгән пептид китапханәсе өчен.Күп үлчәмле мәгълүматлар базасын күз алдына китерү өчен, R эчендә эчке эшләнгән корал ярдәмендә җылылык карталары ясалды (biosHeatmap, әле чыгарылмаган R пакеты).Heatылылык карталарында күрсәтелгән дендрограммалар Вардның иерархик кластерлау ысулы ярдәмендә Евклид дистанциясе белән исәпләнде.Мотив туплау мәгълүматларына статистик анализ ясау өчен, гадәти булмаган балл өчен P кыйммәтләре Фишерның төгәл сынаулары ярдәмендә исәпләнде.Башка мәгълүматлар өчен P-кыйммәтләр R-та Студентларның т-тесты яки ANOVA ярдәмендә исәпләнде.
Сайланган фей клоннары һәм этаплар кертелмичә койрык тамыры аша венага кертелде (300 μл ПБСта 2 × 1010 этап / хайван).Парфюциягә һәм аннан соң төзәтүгә ун минут кала, шул ук хайваннарга 100 μl DyLight594 маркалы лекция (Вектор лабораторияләре, DL-1177) кертелгән.Фаз инъекциясеннән 60 минут үткәч, тычканнар йөрәк аша 50 мл ПБС белән майланганнар, аннары 50 мл 4% PFA / PBS.Баш мие үрнәкләре өстәмә рәвештә төнлә 4% PFA / PBS белән төзәтелде һәм 30% сакрозада төнлә 4 ° C.ОКТ катнашмасында үрнәкләр туңдырылган.Туңдырылган үрнәкләргә иммунохистохимик анализ 30 мм криосекциядә 1% BSA белән блокланган һәм T7 фазасына (Новус NB 600-376A) каршы поликлональ FITC маркалы антителалар белән инкубацияләнгән.Төнлә инкубат.Ниһаять, бүлекләр ПБС белән 3 тапкыр юылды һәм конокаль лазер микроскопы белән тикшерелде (Leica TCS SP5).
Минималь чисталыгы 98% булган барлык пептидлар GenScript USA синтезланган, биотинилатланган һәм лиофилизацияләнгән.Биотин N-терминалда өстәмә өч гликин спасеры аша бәйләнгән.Масса спектрометриясен кулланып барлык пептидларны тикшерегез.
Стрептавидин (Сигма S0677) биотинилатланган пептидның 5 тапкыр эквимоляр артымы, биотинилатланган BACE1 ингибитор пептиды яки биотинилатланган BACE1 ингибитор пептиды һәм BACE1 ингибитор пептиды белән 5-10% DMSO / инкубацияләнгән.Инъекция алдыннан бүлмә температурасында 1 сәгать.Стрептавидин-коньигуацияләнгән пептидлар 10 мг / кг дозада, баш мие куышлыгы булган тычканнарның койрык тамырларының берсенә кертелде.
Стрептавидин-пептид комплексларының концентрациясе ELISA тарафыннан бәяләнде.Нунк Максисорп микротитер тәлинкәләре (Сигма) төнлә 4 ° C температурада 1,5 μг / мл тычканга каршы стрептавидин антителасы белән капланган (Термо, MA1-20011).2 сәгать бүлмә температурасында блокланганнан соң (буферны блоклау: 140 nM NaCL, 5 мм EDTA, 0,05% NP40, 0,25% гелатин, 1% BSA), тәлинкәне 0,05% Tween-20 / PBS (юу буферы) белән 3 секунд эчендә юыгыз, CSF һәм плазма үрнәкләре блоклау буферы белән эретелгән коеларга кушылды (плазма 1: 10,000, CSF 1: 115).Аннары тәлинкә төнлә 4 ° C температурада антитела белән инкубацияләнде (1 μг / мл, анти-стрептавидин-HRP, Новус NB120-7239).Өч юу адымыннан соң, стрептавидин ТМБ субстрат эремәсендә (Роче) 20 минутка кадәр инкубация ярдәмендә ачыкланды.1M H2SO4 белән төс үсешен туктатканнан соң, сеңдерүне 450 нм үлчәгез.
Стрептавидин-пептид-BACE1 ингибитор комплексының функциясе Aβ (1-40) ELISA җитештерүче протоколы нигезендә бәяләнде (Вако, 294-64701).Кыскасы, CSF үрнәкләре стандарт эремчектә эретелде (1:23) һәм төнлә 4 ° C температурада инкубацияләнде, 96 кое тәлинкәләрдә BNT77 антителасы белән капланган.Биш юу адымыннан соң, HRP-конфигурацияләнгән BA27 антителасы кушылды һәм 2 сәгать 4 ° C инкубацияләнде, аннары биш юу адымы.Aβ (1-40) TMB эремәсендә 30 минут бүлмә температурасында инкубация ярдәмендә ачыкланган.Тукталыш эремәсе белән төс үсеше туктатылганнан соң, сеңдерүне 450 нм үлчәгез.Плазма үрнәкләре Aβ (1-40) ELISA алдыннан каты фаза чыгаруга дучар ителделәр.Плазма 96 кое тәлинкәләрдә 0,2% DEA (Сигма) өстәлде һәм 30 минут бүлмә температурасында инкубацияләнде.SPE тәлинкәләрен (Оазис, 186000679) бер-бер артлы су һәм 100% метанол белән юганнан соң, SPE тәлинкәләренә плазма үрнәкләре кушылды һәм барлык сыеклык алынды.Samрнәкләр юылган (башта 5% метанол белән, аннары 30% метанол белән) һәм 2% NH4OH / 90% метанол белән чистартылган.Элуатны 55 ° C температурада 99 минутта N2 токында киптергәннән соң, үрнәкләр стандарт эремчекләрдә киметелде һәм Aβ (1-40) югарыда күрсәтелгәнчә үлчәнде.
Бу мәкаләне ничек китерергә: Урич, Э. һ.б.Vivo белән билгеләнгән транзит пептидлар ярдәмендә мигә йөк җибәрү.фән.5, 14104;doi: 10.1038 / srep14104 (2015).
Лихота Дж., Скорринге Т., Томсен Л.Б. һәм Мус Т. Максомолекуляр препаратларны мигә максатчан терапия ярдәмендә китерү.Нейрохимия журналы 113, 1–13, 10.1111 / j.1471-4159.2009.06544.x (2010).
Брасневич, И.Prog Neurobiol 87, 212-251, 10.1016 / j.pneurobio.2008.12.002 (2009).
Пардридж, WM Кан-ми киртәсе: баш миендәге наркотиклар үсешендәге киртә.NeuroRx 2, 3–14, 10.1602 / neurorx.2.1.3 (2005).
Йохансон, К.Е., Дункан, ЯА, Стопа, Е.Г., Берд, А. Наркотиклар китерүне яхшырту һәм хороид плексус-CSF юлы аша мигә юнәлтү перспективалары.Фармацевтика тикшеренүләре 22, 1011-1037, 10.1007 / s11095-005-6039-0 (2005).
Пардридж, WM Баш ми китерү өчен молекуляр троян атлары белән биофармацевтика модернизациясе.Bioconjug Chem 19, 1327–1338, 10.1021 / bc800148t (2008).
Пардридж, WM рецепторы-арадаш пептид кан-ми барьеры аша ташу.Эндокр Рев. 7, 314-330 (1986).
Niewoehner, J. һ.б.Моновалент молекуляр шаттллар кулланып, баш миенең үтеп керүен һәм терапевтик антителаларның эффективлыгын арттыру.Нейрон 81, 49–60, 10.1016 / j.neuron.2013.10.061 (2014).
Биен-Ли, Н. һ.б.Трансферрин рецепторы (TfR) транспорт TFR антителаларының якынлык вариантларының баш миен алуын билгели.J Exp Med 211, 233–244, 10.1084 / jem.20131660 (2014).