Nature.com сайтына кергәнегез өчен рәхмәт.Сез кулланган браузер версиясенең CSS ярдәме чикләнгән.Иң яхшы тәҗрибә өчен без яңартылган браузерны кулланырга киңәш итәбез (яки Internet Explorer'та туры килү режимын сүндерегез).Шул ук вакытта, дәвамлы ярдәмне тәэмин итү өчен, без сайтны стильләр һәм JavaScriptсыз күрсәтәчәкбез.
Сыек биопси (LB) - биомедицина өлкәсендә тиз популярлык казанган төшенчә.Концепция, нигездә, күзәнәктән тыш ДНК (ccfDNA) фрагментларын ачыклауга нигезләнә, алар төрле тукымаларда күзәнәк үлеменнән соң кечкенә фрагментлар булып чыгарыла.Бу фрагментларның аз өлеше чит (чит) тукымалардан яки организмнардан барлыкка килә.Хәзерге эштә без бу концепцияне мусельларга кулландык, диңгез суларының фильтрлау сыйфаты белән танылган сентинель төре.Без мускулларның табигый фильтрлар ролен үтибез, диңгез яры экосистемаларының биологик төрлелеге турында мәгълүмат бирү өчен төрле чыганаклардан экологик ДНК фрагментларын алу өчен.Безнең нәтиҗәләр шуны күрсәтә: мусель гемолимфында ДНК фрагментлары бар, алар зурлыгы 1 дән 5 кбга кадәр.Мылтык эзләнүләре күрсәткәнчә, күп санлы ДНК фрагментлары чит микробиаль.Алар арасында без бактерияләрдән, археадан һәм вируслардан ДНК фрагментларын таптык, шул исәптән вируслар, гадәттә, яр буендагы диңгез экосистемаларында очрый торган төрле хуҗаларны зарарлый.Ахырда, безнең тикшерү шуны күрсәтә: мускулларга кулланылган LB төшенчәсе диңгез яры экосистемаларында микробиаль төрлелек турында бай, ләкин әле өйрәнелмәгән белем чыганагын күрсәтә.
Климат үзгәрүенең (CC) диңгез экосистемаларының биологик төрлелегенә йогынтысы тиз үсә торган тикшеренү өлкәсе.Глобаль җылыну мөһим физиологик стресслар китереп кенә калмый, диңгез организмнарының җылылык тотрыклылыгының эволюцион чикләрен этәрә, берничә төрнең яшәү урынына тәэсир итә, аларны уңай шартлар эзләргә этәрә [1, 2].Метазоаннарның биологик төрлелегенә йогынты ясаудан тыш, CC хуҗа-микробиаль үзара бәйләнешнең нечкә балансын боза.Бу микробиаль дисбактериоз диңгез экосистемаларына җитди куркыныч тудыра, чөнки ул диңгез организмнарын йогышлы патогеннарга җиңелрәк итә [3, 4].Глобаль диңгез экосистемалары белән идарә итү өчен җитди проблема булган массакүләм үлемдә SS мөһим роль уйный дип санала [5, 6].Бу бик күп диңгез төрләренең икътисади, экологик һәм туклану йогынтысын исәпкә алып мөһим проблема.Бу аеруча поляр өлкәләрдә яшәүче бивальлар өчен дөрес, анда CK эффектлары тизрәк һәм каты була [6, 7].Чынлыкта, Митилус спп кебек бивальлар.CC-ның диңгез экосистемасына йогынтысын күзәтү өчен киң кулланыла.Гаҗәп түгел, чагыштырмача күп санлы биомарклар үз сәламәтлекләрен күзәтү өчен эшләнде, еш кына энзиматик активлык яки күзәнәкнең яшәешчәнлеге һәм фагоцитик активлыгы кебек кәрәзле функцияләр нигезендә функциональ биомарклар катнашында ике яруслы алым кулланып эшләнде [8].Бу ысуллар шулай ук ​​күп күләмдә диңгез суы сеңгәннән соң йомшак тукымаларда тупланган махсус басым күрсәткечләренең концентрациясен үлчәүне үз эченә ала.Ләкин, югары фильтрлау сыйдырышлыгы һәм бивальларның ярым ачык кан әйләнеше системасы пациентлар белән идарә итүгә гади һәм минималь инвазив ысул, сыек биопси (LB) төшенчәсен кулланып, яңа гемолимф биомаркерларын үстерергә мөмкинлек бирә.кан үрнәкләре [9, 10].Кеше LBда берничә әйләнеш молекуласы табылса да, бу концепция беренче чиратта плазмадагы күзәнәктән тыш ДНК (ccfDNA) фрагментларын ДНК эзләү анализына нигезләнгән.Чынлыкта, кеше плазмасында әйләнүче ДНК барлыгы XX гасыр уртасыннан билгеле [11], ләкин соңгы елларда гына югары үткәрү ысуллары барлыкка килү ccfDNA нигезендә клиник диагностикага китерде.Бу әйләнүче ДНК фрагментларының өлеше күзәнәк үлеменнән соң геном ДНКның (атом һәм митохондрия) пассив чыгарылуына бәйле. Сәламәт кешеләрдә ccfDNA концентрациясе гадәттә түбән (<10 ng / mL), ләкин төрле патологияләрдән интегүче яки стресска дучар булган пациентларда 5-10 тапкыр артырга мөмкин, нәтиҗәдә тукымалар зарарлана. Сәламәт кешеләрдә ccfDNA концентрациясе гадәттә түбән (<10 ng / mL), ләкин төрле патологияләрдән интегүче яки стресска дучар булган пациентларда 5-10 тапкыр артырга мөмкин, нәтиҗәдә тукымалар зарарлана. У здоровых людей гаран вккДНК в умеме низкая (<10 нг / гир), но может повышаться в 5-10 раз у больных с различной патоголией или подвергающихся аву, при эвящему к поврежидию тч. Сәламәт кешеләрдә cccDNA концентрациясе гадәттә түбән (<10 ng / mL), ләкин ул төрле патологияле пациентларда яки тукымалар зарарына китергән стресс астында 5-10 тапкыр артырга мөмкин.10 ng 个体 c ccfDNA 的 浓度 通常 10 10 10 ng / mL） ， 但 -10 -10 -10 -10 -10 -10 -10 -10 -10 -10在 健康 个体 c ccfdna 的 浓度 较 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10Концентрации ccfDNA обикно низкие (<10 нг / зира) у здоровых людей, ноябрь могут быть увеличены в 5-10 раз у удов с различными пидологиями или чисом, что при имитит к повреждению тканей. ccfDNA концентрацияләре сәламәт кешеләрдә гадәттә түбән (<10 нг / мл), ләкин төрле патология яки стресс булган пациентларда 5-10 тапкыр артырга мөмкин, нәтиҗәдә тукымалар зарарлана.CcfDNA фрагментларының зурлыгы төрлечә үзгәрә, ләкин гадәттә 150 дән 200 ат көченә кадәр.[12].Selfз-үзеннән алынган ccfDNA анализы, ягъни нормаль яки үзгәртелгән хуҗа күзәнәкләреннән ccfDNA, атом һәм / яки митохондрия геномында булган генетик һәм эпигенетик үзгәрешләрне ачыклау өчен кулланыла ала, шуның белән клиникларга молекуляр максатчан терапия сайларга булыша [13].Ләкин, ccfDNA йөклелек вакытында фетал күзәнәкләреннән яки күчерелгән органнардан ccfDNA кебек чит чыганаклардан алырга мөмкин [14,15,16,17].ccfDNA шулай ук ​​йогышлы агентның (чит ил) нуклеин кислоталарының булуын ачыклау өчен мөһим мәгълүмат чыганагы булып тора, бу кан культуралары белән билгеләнмәгән киң таралган инфекцияләрне инвазив булмаган рәвештә ачыкларга мөмкинлек бирә, зарарланган тукымаларның инвазив биопсиясеннән саклый [18].Соңгы тикшеренүләр чыннан да күрсәтте, кеше канында вируслы һәм бактерияле патогеннарны ачыклау өчен кулланыла торган бай мәгълүмат чыганагы бар, һәм кеше плазмасында табылган ccfDNAның якынча 1% чит илдән булган [19].Бу тикшеренүләр шуны күрсәтә: организмның әйләнүче микробиомының биологик төрлелеге ccfDNA анализы ярдәмендә бәяләнә ала.Ләкин күптән түгел генә бу төшенчә кешеләрдә һәм азрак дәрәҗәдә башка умырткалыларда кулланылды [20, 21].
Хәзерге кәгазьдә без LB потенциалын кулланабыз, Аулакомия атрасының ccfDNA-ны анализлау өчен, Көньяк төр, гадәттә субантарктик Кергуелен утрауларында очрый, 35 миллион ел элек барлыкка килгән зур платодагы утраулар төркеме.вулкан атылуы.Витро эксперименталь система кулланып, без диңгез суларындагы ДНК фрагментларын тиз арада midies белән алып, гемолимф бүлмәсенә керүен ачыкладык.Мылтык эзләре күрсәткәнчә, гемолимф ccfDNA үзендә һәм үзе булмаган ДНК фрагментларын, шул исәптән симбиотик бактерияләрне һәм салкын вулкан диңгез яры экосистемаларына хас биомнардан ДНК фрагментларын үз эченә ала.Гемолимф ccfDNA шулай ук ​​төрле хост диапазоны булган вируслардан алынган вирус эзлеклелеген үз эченә ала.Без шулай ук ​​сөякле балык, диңгез анемоннары, алга һәм бөҗәкләр кебек күп күзәнәкле хайваннардан ДНК кисәкләрен таптык.Ахырда, безнең тикшерү шуны күрсәтә: LB концепциясе диңгез умырткасызларына уңышлы кулланыла ала, диңгез экосистемаларында бай геномик репертуар булдыру өчен.
Олылар (озынлыгы 55-70 мм) Митилус платенсисы (М. платенсис) һәм Аулакомия атра (A. atra) Порт-о-Франциянең аралар арасындагы таш ярларыннан җыелганнар (049 ° 21.235 S, 070 ° 13.490 E.).Кергуелен утраулары. Декабрь 2018.(ясалма диңгез тозы Риф кристалл, Тиз океан, Вирджиния, АКШ).Eachәр эксперимент өчен аерым кабыкларның озынлыгы һәм авырлыгы үлчәнде.
Бу программа өчен бушлай ачык протокол онлайн режимда бар (https://doi.org/10.17504/protocols.io.81wgb6z9olpk/v1).Кыскасы, LB гемолимфы урланган мускуллардан сурәтләнгәнчә җыелган [22].Гемолимф 1200 × г центрифугация белән 3 минутка ачыкланды, супернатант кулланылганчы туңдырылды (-20 ° C).CfDNA-ны изоляцияләү һәм чистарту өчен, үрнәкләр (1,5-2,0 мл) җитештерүче күрсәтмәсе буенча NucleoSnap cfDNA комплекты (Macherey-Nagel, Bethlehen, PA) эретелде һәм эшкәртелде.ccfDNA алдагы анализга кадәр -80 ° C сакланган.Кайбер экспериментларда ccfDNA изоляцияләнде һәм QIAamp DNA тикшерүче комплекты ярдәмендә чистартылды (QIAGEN, Торонто, Онтарио, Канада).Чистартылган ДНК стандарт PicoGreen анализы ярдәмендә бәяләнде.Изоляцияләнгән ccfDNA-ның фрагмент бүленеше югары сизгерлек ДНК комплекты ярдәмендә Agilent 2100 биоанализеры (Agilent Technologies Inc., Санта Клара, Калифорния) ярдәмендә капиллярлы электрофорез белән анализланган.Консервация җитештерүче күрсәтмәсе буенча 1 µl ccfDNA үрнәге ярдәмендә башкарылды.
Гемолимф ccfDNA фрагментларын эзләү өчен, Геном Квебек (Монреаль, Квебек, Канада) Illumina MiSeq PE75 комплектының Illumina DNA Mix комплекты ярдәмендә мылтык китапханәләрен әзерләде.Стандарт адаптер (BioO) кулланылды.Чимал файллары NCBI эзлеклелеген уку архивыннан (SRR8924808 һәм SRR8924809) бар.Укуның төп сыйфаты FastQC ярдәмендә бәяләнде [23].Тримматик [24] адаптерларны кисү һәм сыйфатсыз уку өчен кулланылган.Мылтык парлы очлары белән укылды, туры килмәү өчен, минимум 20 ат көче белән озынрак укуга FLASH кушылды [25]. Берләштерелгән укулар BLASTN белән бивальв NCBI таксономия базасы ярдәмендә аңлатылды (e кыйммәте <1e - 3 һәм 90% гомология), һәм аз катлаулылык эзлеклелеген масклау DUST ярдәмендә башкарылды [26]. Берләштерелгән укулар BLASTN белән бивальв NCBI таксономия базасы ярдәмендә аңлатылды (e кыйммәте <1e - 3 һәм 90% гомология), һәм аз катлаулылык эзлеклелеген масклау DUST ярдәмендә башкарылды [26]. Объединенные чтения были аннотированя с помощью БЛАСТН с использованием басызых так такомии двустворч чатх моллюсков NCBI (значение e <1e-3 и 90% чокловиди плос словогы) зованием ДУСТ [26]. Бозылган укулар BLASTN белән NCBI бивальве таксономия базасы ярдәмендә аңлатылды (e кыйммәт <1e-3 һәм 90% гомология), һәм түбән катлаулылык эзлеклелеге маскасы DUST ярдәмендә башкарылды [26].使用 双壳类 NCBI 分类 数据库 （e 值 <1e-3 和 90% 同源 性 AS BLASTN 注释 合并 的 读数 ， UST DUST [26] 进行 低使用 双 c ncbi 分类 （1 <1e-3 和 90% 同源） 使用 使用 使用 使用 使用 使用 使用 使用 使用 使用 使用 使用 使用 使用 使用 使用 使用 使用 使用 使用 使用 使用 使用 使用 使用 使用Объединенные чтения былы аннотированя с помощью Бластн с использованием так консомической басы чырных двустворч чех моллюсков NCBI (значение e <1e-3 и 90% схологии), пользованием ДУСТ [26]. Бастырылган укулар BLASTN белән NCBI бивальве таксономик мәгълүмат базасы ярдәмендә аңлатылды (e кыйммәте <1e-3 һәм 90% гомология), һәм түбән катлаулылык эзлеклелеге DUST ярдәмендә башкарылды [26].Укулар ике төркемгә бүленде: бивальв эзлеклелеге белән бәйле (монда үз-үзеңне уку дип атала) һәм бәйләнешсез (үз-үзеңне укымый).Ике төркем MEGAHIT ярдәмендә контиглар ясау өчен аерым җыелдылар [27].Шул ук вакытта, чит микробиом укуларның таксономик бүленеше Kraken2 [28] ярдәмендә классификацияләнде һәм Галактикада Крона бәлеше графикасы белән күрсәтелде [29, 30].Оптималь кмерс безнең башлангыч экспериментлардан kmers-59 булырга тәвәккәл. Соңгы аннотация өчен үз-үзеңне контиглар BLASTN (бивальв NCBI мәгълүмат базасы, e бәясе <1e - 10 һәм 60% гомология) белән тигезләү ярдәмендә ачыкланды. Соңгы аннотация өчен үз-үзеңне контиглар BLASTN (бивальв NCBI мәгълүмат базасы, e бәясе <1e - 10 һәм 60% гомология) белән тигезләү ярдәмендә ачыкланды. ЗАТЕМ собственные Бабтиги былы идентифицирован путем сопоставления с БЛАСТН (База чаных двустворч чех моллюсков NCBI, значение e <1e-10 и ижрология 60%) для окончательной аннотации. Соңгы аннотация өчен үз-үзен контиглар BLASTN (NCBI бивальв базасы, e кыйммәте <1e-10 һәм 60% гомология) белән туры китереп ачыкланды.B BI 与 BLASTN （双 贝类 贝类 NCBI 数据库 ， e 值 <1e-10 和 60% 同源 性） 对齐 来。。。。B 通过 与 BLASTN （双 壳 贝类 NCBI 数据库 ， e 值 <1e-10 和 60% Затем были идент Сифицированя собственные бартиги для охончательной аннотации путем сопоставления с БЛАСТН (База чанных NCBI длу двустворчамех моллюсков, значение e <1e-10 и чингология 60%). Соңгы аннотация өчен BLASTN (NCBI бивальв мәгълүмат базасы, e кыйммәте <1e-10 һәм 60% гомология) белән үз-үзен контиглар ачыкладылар. Параллель рәвештә, группа булмаган контиглар BLASTN белән аңлатылды (NCBI мәгълүмат базасы, e кыйммәте <1e - 10 һәм 60% гомология). Параллель рәвештә, группа булмаган контиглар BLASTN белән аңлатылды (NCBI мәгълүмат базасы, e кыйммәте <1e - 10 һәм 60% гомология). Параллелельно чужеродные групповые кыртиги былы аннотированя с помощью BLASTN (База чаныхх NCBI, значение e <1e-10 и кидология 60%). Параллель рәвештә, чит төркем контиглары BLASTN белән аңлатылды (NT NCBI мәгълүмат базасы, e кыйммәте <1e-10 һәм 60% гомология).平行 地 ， 用 BLASTN （nt NCBI 数据库 ， e 值 <1e-10 和 60% 同源 性） 注释 非 自身。。。平行 地 ， 用 BLASTN （nt NCBI 数据库 ， e 值 <1e-10 和 60% 同源 性） 注释 非 自身。。。 Параллельно кәртиги, не относящиеся к собственной группе, былы аннотированя с помощуу БЛАСТН (База чаныхх NCBI, значение e <1e-10 и идология 60%). Параллель рәвештә, үз-үзеннән булмаган төркем контиглары BLASTN белән аңлатылды (NCBI мәгълүмат базасы, e кыйммәте <1e-10 һәм 60% гомология). BLASTX шулай ук ​​nr һәм RefSeq белок NCBI мәгълүмат базаларын кулланып үз-үзен контигларда үткәрде (e кыйммәт <1e - 10 һәм 60% гомология). BLASTX шулай ук ​​nr һәм RefSeq белок NCBI мәгълүмат базаларын кулланып үз-үзен контигларда үткәрде (e кыйммәт <1e - 10 һәм 60% гомология). БЛАСТС также был проведен на амамамостоятельных Абтитигах с использованием Базных белка nr һәм RefSeq NCBI (значение e <1e-10 и идология 60%). BLASTX шулай ук ​​nr һәм RefSeq NCBI белок базалары ярдәмендә үз-үзен контигларда башкарылды (e кыйммәт <1e-10 һәм 60% гомология).还 使用 nr 和 RefSeq 蛋白 NCBI 数据库 对 非 自身 了 了 了 BLASTX （e 值 <1e-10 和 60% 同源 性）。还 使用 nr 和 RefSeq 蛋白 NCBI 数据库 对 非 自身 了 了 了 BLASTX （e 值 <1e-10 和 60% 同源 性）。 BLASTX также выполняли на амамостоятельных констигах с использованием басянх белка nr һәм RefSeq NCBI (значение e <1e-10 и идология 60%). BLASTX шулай ук ​​nr һәм RefSeq NCBI белок базалары ярдәмендә үз-үзен контигларда башкарылды (e кыйммәт <1e-10 һәм 60% гомология).-З-үзен контиг булмаган BLASTN һәм BLASTX бассейннары соңгы контигларны күрсәтәләр (өстәмә файлны карагыз).
PCR өчен кулланылган праймериз S1 таблицасында күрсәтелгән.Так ДНК полимерасы (Bio Basic Канада, Маркхэм, ОН) ccfDNA максатлы геннарны көчәйтү өчен кулланылды.Түбәндәге реакция шартлары кулланылды: 3 минутта 95 ° C, 1 минутта 95 ° C, анналь температураны 1 минутка, 72 минутта 1 минутка, 35 цикл, һәм ниһаять, 10 минут эчендә 72 ° C..PCR продуктлары электрофорез белән агароза гельләрендә аерылды (1,5%), SYBRTM Куркынычсыз ДНК Гел таплары (Invitrogen, Burlington, ON, Канада) 95 V.
Мюссельләр (Mytilus spp.) 500 мл кислородлы диңгез суларында (32 PSU) 4 ° C тәүлек эчендә климатлаштырылган.Кеше галектин-7 cDNA эзлеклелеген кодлаган плазмид ДНК (NCBI кушылу номеры L07769) касәгә соңгы концентрациядә 190 μg / μl кушылды.Шул ук шартларда ДНК кушылмыйча инкубацияләнгән мусельлар контроль иде.Өченче контроль танкта мусельсыз ДНК бар.Диңгез суларындагы ДНК сыйфатын күзәтү өчен, күрсәтелгән вакытта һәр танктан диңгез сулары үрнәкләре (20 μл; өч тапкыр кабатлау) алынды.Плазмид ДНК эзләнү өчен, LB midies күрсәтелгән вакытта җыеп алынган һәм qPCR һәм ddPCR белән анализланган.Диңгез суларының тозы күп булганлыктан, аликотлар PCR сыйфатлы суда (1:10) барлык PCR анализлары алдыннан эретелгән.
Санлы тамчы PCR (ddPCR) BioRad QX200 протоколы ярдәмендә башкарылды (Миссисуга, Онтарио, Канада).Оптималь температураны билгеләү өчен температура профилен кулланыгыз (таблица S1).Тамчылар QX200 тамчы генераторы (BioRad) ярдәмендә ясалган.ddPCR түбәндәгечә башкарылды: 5 минутта 95 ° C, 30 циклда 95 циклдан 50 цикл һәм 30 минутта 72 ° C, 5 минут эчендә 4 ° C һәм 5 минут эчендә 90 ° C.Тамчылар саны һәм уңай реакцияләр саны (күчермәләр саны / µl) QX200 тамчы укучысы (BioRad) ярдәмендә үлчәнде.10,000 тамчыдан аз булган үрнәкләр кире кагылды.DdPCR эшләгән саен ternрнәк контроле башкарылмады.
qPCR Rotor-Gene® 3000 (Corbett Research, Сидней, Австралия) һәм LGALS7 махсус праймериз ярдәмендә башкарылды.Барлык санлы PCRлар 20 µлда QuantiFast SYBR Green PCR Kit (QIAGEN) ярдәмендә башкарылды.qPCR 15 минут инкубация белән 95 ° C белән башланды, аннары 40 цикл 95 ° C 10 секундта һәм 60 ° C 60 секунд эчендә бер мәгълүмат туплау белән башланды.Эретү кәкреләре бер-бер артлы үлчәүләр ярдәмендә 95 ° C 5 с, 65 ° C 60 s, һәм qPCR ахырында 97 ° C.Eachәр qPCR контроль үрнәкләрдән кала, өчпочмакта башкарылды.
Мюссельләр югары фильтрлау тизлеге белән билгеле булганлыктан, без башта диңгез суларында булган ДНК фрагментларын фильтрлый һәм саклый алуларын тикшердек.Без шулай ук ​​бу фрагментларның ярым ачык лимфа системасында туплануы белән кызыксындык.Без бу проблеманы эксперименталь рәвештә зәңгәр мусель танкларына кушылган ДНК фрагментлары язмышын эзләп чиштек.ДНК фрагментларын күзәтүне җиңеләйтү өчен, без кеше галектин-7 гены булган чит (плазмид) ДНК кулландык.ddPCR диңгез суларында һәм мускулларда плазмид ДНК фрагментларын эзли.Безнең нәтиҗәләр шуны күрсәтә: диңгез суындагы ДНК фрагментлары мусель булмаганда (7 көнгә кадәр) чагыштырмача тотрыклы булса, midies булганда бу дәрәҗә 8 сәгать эчендә бөтенләй юкка чыга (1а рәсем, б).Экзоген ДНКның фрагментлары 15 минут эчендә вравальвуляр сыеклыкта һәм гемолимфта җиңел табылды (1с рәсем).Бу фрагментлар экспозициядән соң 4 сәгатькә кадәр табылырга мөмкин.ДНК фрагментларына карата бу фильтрлау эшчәнлеге бактерия һәм алга фильтрлау активлыгы белән чагыштырыла [31].Бу нәтиҗәләр шуны күрсәтә: midies сыеклык бүлекчәләрендә чит ДНКны фильтрлый һәм туплый ала.
DdPCR белән үлчәнгән midies булганда (A) яки булмаганда (B) диңгез суларында плазмид ДНКның чагыштырма концентрацияләре.Ада, нәтиҗәләр процент рәвешендә күрсәтелә, сандыкларның чикләре 75 һәм 25 процентны күрсәтә.Lиһазландырылган логарифмик сызык кызыл төстә, соры төстәге мәйдан 95% ышаныч интервалын күрсәтә.Вда, кызыл сызык уртача, зәңгәр сызык концентрация өчен 95% ышаныч интервалын күрсәтә.C Плазмид ДНК кушылганнан соң төрле вакытта гемолимфта һәм мускулларның вальвуляр сыеклыгында плазмид ДНК туплануы.Нәтиҗә абсолют күчермәләр рәвешендә күрсәтелә / mL (± SE).
Алга таба, без антропоген йогынтысы чикләнгән утраулар төркеме булган Кергуелен утрауларындагы мускул караватларыннан җыелган мускулларда ccfDNA килеп чыгышын тикшердек.Моның өчен мусель гемолимфларыннан cccDNA изоляцияләнде һәм кеше cccDNA-ны чистарту өчен гадәттә кулланыла торган ысуллар белән чистартылды [32, 33].Без midiesдагы уртача гемолимф ccfDNA концентрацияләренең мл гемолимф диапазонында аз микрограммаларда булуын ачыкладык (карагыз таблица S2, өстәмә мәгълүмат).Бу концентрацияләр диапазоны сәламәт кешеләргә караганда күпкә зуррак (миллилитрга аз нанограмма), ләкин сирәк очракларда, яман шеш авыруларында, ccfDNA дәрәҗәсе миллилитрга берничә микрограммга җитә ала [34, 35].Гемолимф ccfDNA күләменең бүленешен анализлау күрсәткәнчә, бу фрагментлар зурлыгы белән аерылып тора, 1000 ат көченнән 1000 ат көченә кадәр.5000 ат көченә кадәр (2 нче рәсем).Охшаш нәтиҗәләр кремнийга нигезләнгән QIAamp Тикшерүче комплекты ярдәмендә алынган, бу геном ДНКны аз концентрацияләнгән ДНК үрнәкләреннән тиз изоляцияләү һәм чистарту өчен кулланыла торган ысул, шул исәптән ccfDNA [36].
Мусель гемолимфының ccfDNA вәкиле электрофореграммасы.NucleoSnap плазма комплекты (өстә) һәм QIAamp DNA тикшерүче комплекты белән алынган.В скрипка сюжеты гемолимф ccfDNA концентрацияләрен (± SE) midiesда таратуны күрсәтә.Кара һәм кызыл сызыклар уртача һәм беренче һәм өченче квартилларны күрсәтәләр.
Кешеләрдә һәм приматларда ccfDNAның якынча 1% чит чыганакка ия ​​[21, 37].Бивальвларның ярым ачык кан әйләнеше системасын, микробиаль бай диңгез суларын һәм мусель ccfDNA күләмен таратуны исәпкә алып, без гемолимф ccfDNA мускул микробиаль ДНК бассейны булырга мөмкин дип фаразладык.Бу гипотезаны сынап карау өчен, без Кергуелен утрауларыннан җыелган Аулакомия атра үрнәкләреннән гемолимф ccfDNA эзләдек, 10 миллионнан артык уку нәтиҗәсе, аларның 97,6% сыйфат контролен узган.Аннары укулар BLASTN һәм NCBI бивальв мәгълүмат базаларын кулланып, үз-үзеннән булмаган чыганаклар буенча классификацияләнде (С1 рәсем, өстәмә мәгълүмат).
Кешедә атом да, митохондрия ДНКсы да канга чыгарга мөмкин [38].Ләкин, хәзерге тикшеренүдә, A. atra геномының эзлекле яки тасвирланмаганын исәпкә алып, midiesнең атом геном ДНКсын җентекләп сурәтләү мөмкин булмады.Шулай да, без бивальв китапханәсе ярдәмендә үзебезнең килеп чыккан берничә ccfDNA фрагментын ачыклый алдык (С2 рәсем, өстәмә мәгълүмат).Без шулай ук ​​үзебезнең килеп чыккан ДНК фрагментларының булуын расладык, бу PCR атри геннарының эзлекле рәвештә көчәйтелүе (3 нче рәсем).Шулай ук, А. атраның митохондрия геномы җәмәгать мәгълүмат базаларында булганын исәпкә алып, A. atra гемолимфында митохондрия ccfDNA фрагментлары булуына дәлилләр табарга мөмкин.Митохондрия ДНК фрагментлары PCR көчәйтү белән расланган (3 нче рәсем).
А. атраның гемолимфында (кызыл нокталар - запас саны: SRX5705969) һәм М.Платенсис (зәңгәр нокталар - акция саны: SRX5705968) PCR көчәйтелгән төрле митохондрия геннары булган.Фретон Бретон һ.б.PCR катнашмасы булган PCR трубасына турыдан-туры өстәр өчен 3 мм штанга кулланыгыз.
Диңгез суларындагы микробиаль эчтәлекне исәпкә алып, без башта гемолимфтагы микробиаль ДНК эзлеклелегенә характеристика бирдек.Моның өчен без ике төрле стратегия кулланабыз.Беренче стратегиядә алгоритмга нигезләнгән эзлекле классификация программасы Kraken2 кулланылды, ул микробиаль эзлеклелекне BLAST һәм башка кораллар белән чагыштырырлык төгәллек белән билгели ала [28].6719-тан артык уку бактериядән булган, 124 һәм 64-ләре археа һәм вируслардан булган (4 нче рәсем).Иң күп бактерияле ДНК фрагментлары Фирмикутлар (46%), Протеобактерияләр (27%), һәм Бактероидетлар (17%) (4а рәсем).Бу тарату диңгез зәңгәр мусель микробиомының алдагы тикшеренүләренә туры килә [39, 40].Гаммапротеобактерия Протеобактериянең төп сыйныфы булган (44%), шул исәптән күп Вибрионалес (4б рәсем).DdPCR ысулы A. atra гемолимфының ccfDNAында Vibrio DNA фрагментларының булуын раслады (4 нче рәсем) [41].CcfDNA бактерияләренең килеп чыгышы турында күбрәк мәгълүмат алу өчен өстәмә алым кабул ителде (С2 рәсем, өстәмә мәгълүмат). Бу очракта, бер-бер артлы кабатланган укулар рәвешендә җыелганнар һәм BLASTN кулланып, үз-үзен (бивальвалар) яки үз-үзеңнән килеп чыккан классификацияләнәләр, 1e - 3 бәясе һәм 90% гомология белән кисемтәләр. Бу очракта, бер-бер артлы кабатланган укулар рәвешендә җыелганнар һәм BLASTN кулланып, үз-үзен (бивальвалар) яки үз-үзеңнән килеп чыккан классификацияләнәләр, 1e - 3 бәясе һәм 90% гомология белән кисемтәләр. В этом случае перекрывающиеся чтения были собраня как чентия с парными концами и были мисифицированя как собственные (двустворчяе моллюски) или чужие по происхождению с сспользовы %. Бу очракта, кабатланган укулар парлы тәмамланган укулар рәвешендә җыелды һәм BLASTN һәм 1e-3 кыйммәтен кулланып туган (бивальв) яки оригиналь булмаган классификацияләнде һәм> 90% гомология белән кисү.在 这种 情况 使用 使用 使用 AST BLASTN 和 1e-3 的 e 值 和> 90% 同源 性 90 90 90。。。。。A 1e-3 使用 使用 使用 90 90 90 90 90 90 90 90 90 90 90 90 90 90 90 90 90 90 90 90 90 90 90 90 90 90 В инт случае з чәкия былны зти каканя зикузи кәкия с банми комранные по прозождениюи с конпол Снованием значений e brastn i 1e-3 и порологиии> 90%. Бу очракта, кабатланган укулар парлы тәмамланган укулар рәвешендә җыелды һәм e (BLALN) һәм 1e-3 кыйммәтләре һәм гомология бусагасы> 90% кулланып, үз (биваль) яки оригиналь булмаган классификацияләнде.A. atra геномы әле эзлекле булмаганга, без MEGAHIT Киләсе буын эзләү (NGS) җыючының де-ново җыю стратегиясен кулландык.Барлыгы 147,188 контиглар бәйләнешле (бивальвалар) булып билгеләнде.Аннары бу контиглар BLASTN һәм BLASTX кулланып 1e-10 электрон кыйммәтләре белән шартладылар.Бу стратегия безгә A. atra ccfDNAда булган 482 бивалив булмаган фрагментларны ачыкларга мөмкинлек бирде.Бу ДНК фрагментларының яртысыннан артыгы (57%) бактерияләрдән алынган, нигездә, гиль симфонияләреннән, шул исәптән сульфотрофик симфонияләрдән, һәм гиль симфонияләреннән Солемя велумыннан (5 нче рәсем).
Тип дәрәҗәсендә чагыштырма муллык.В Ике төп филаның микробиаль төрлелеге (Фирмикутлар һәм Протеобактерияләр).DdPCR C Vibrio spp вәкиллеген көчәйтү.A. Өч атра гемолимфында 16S rRNA ген (зәңгәр) фрагментлары.
Барлыгы 482 тупланган контиг анализланды.Метагеномик контиг аннотацияләренең таксономик бүленешенең гомуми профиле (прокариотлар һәм эукариотлар).В BLASTN һәм BLASTX белән билгеләнгән бактерияле ДНК фрагментларын җентекләп тарату.
Kraken2 анализы шулай ук ​​күрсәтте: ccfDNA мускулында археаль ДНК фрагментлары бар, шул исәптән Еюрархеота (65%), Кренархеота (24%), һәм Турмарчеота (11%) (6а рәсем).Эурярхеота һәм Кренархеотадан алынган ДНК фрагментлары, элек Калифорния midies микробиаль җәмгыятендә табылган, көтелмәгән хәл булырга тиеш түгел [42].Еурярхеота еш экстремаль шартлар белән бәйле булса да, хәзер Еурархеота һәм Кренархота диңгез криогеник мохитендә иң таралган прокариотлар арасында танылды [43, 44].Мюссельләрдә метаногеник микроорганизмнарның булуы гаҗәп түгел, чөнки Кергуелен тигезлегендә аскы агып чыккан метан [45] һәм Кергуелен утраулары ярында күзәтелгән микробиаль метан җитештерү турында хәбәрләр искә алына [46].
Аннары безнең игътибарыбыз ДНК вирусларын укуга күчте.Безнең белүебезчә, бу мускулларның вирус эчтәлеген беренче максатчан өйрәнү.Көтелгәнчә, без бактериофагларның ДНК фрагментларын таптык (Caudovirales) (6б рәсем).Ләкин, иң еш очрый торган вируслы ДНК нуклеоцитовируслар филумыннан килә, ул шулай ук ​​атом цитоплазмик зур ДНК вирусы (NCLDV), теләсә нинди вирусның иң зур геномы булган.Бу филум эчендә күпчелек ДНК эзлеклелеге Mimimidoviridae (58%) һәм Poxviridae (21%) гаиләләренә карый, аларның табигый хуҗалары умырткалылар һәм артроподлар, ә бу ДНК эзлеклелегенең аз өлеше билгеле вируслы алга.Диңгез эукариотик алга инфекциясен.Эзләү шулай ук ​​Пандора вирусыннан алынган, билгеле вирус төрләренең иң зур геном зурлыгы булган гигант вирус.Кызык, вирус белән зарарланган хуҗалар диапазоны, гемолимф ccfDNA эзлеклелеге белән билгеләнгән, чагыштырмача зур булган (С3 рәсем, өстәмә мәгълүмат).Анда Baculoviridae һәм Iridoviridae кебек бөҗәкләрне зарарлаучы вируслар, шулай ук ​​амиба, алга һәм умырткалы хайваннарны зарарлаучы вируслар бар.Без шулай ук ​​Питовирус сиберикум геномына туры килгән эзлеклелекне таптык.Питовируслар (шулай ук ​​"зомби вируслары" дип тә атала) Себердә 30,000 еллык пермафросттан аерылды [47].Шулай итеп, безнең нәтиҗәләр элеккеге докладларга туры килә, бу вирусларның хәзерге барлык төрләре дә юкка чыкмый [48] һәм бу вируслар ерак субарктик диңгез экосистемаларында булырга мөмкин.
Ниһаять, без күп күзәнәкле хайваннардан ДНК фрагментларын таба алырбызмы дип сынадык.Барлыгы 482 чит ил контигы BLASTN һәм BLASTX тарафыннан nt, nr һәм RefSeq китапханәләре (геном һәм протеин) белән ачыкланган.Безнең нәтиҗәләр шуны күрсәтә: күп күзәнәкле хайваннарның ccfDNA чит фрагментлары арасында сөяк сөякләренең ДНКлары өстенлек итә (5 нче рәсем).Бөҗәкләрдән һәм башка төрләрдән ДНК кисәкләре дә табылды.ДНК фрагментларының чагыштырмача зур өлеше ачыкланмаган, мөгаен, җирдәге төрләр белән чагыштырганда, геном мәгълүмат базаларында күп санлы диңгез төрләренең аз күрсәтелүе аркасында [49].
Хәзерге кәгазьдә без LB концепциясен мусельларга кулланабыз, гемолимф ccfDNA ату эзлеклелеге диңгез яры экосистемалары составы турында мәгълүмат бирә ала дип бәхәсләшәбез.Аерым алганда, без таптык: 1) мусель гемолимфында чагыштырмача зур концентрацияләр (микрограмм дәрәҗәләре) чагыштырмача зур (~ 1-5 кб) әйләнүче ДНК фрагментлары бар;2) бу ДНК фрагментлары бәйсез дә, бәйсез дә түгел 3) Бу ДНК фрагментларының чит чыганаклары арасында без бактерия, археаль һәм вируслы ДНК, шулай ук ​​башка күп күзәнәкле хайваннарның ДНКларын таптык;4) Бу чит ccfDNA фрагментларының гемолимфта туплануы тиз була һәм мускулларның эчке фильтрлау эшчәнлегенә ярдәм итә.Ахырда, безнең тикшерү шуны күрсәтә: әлегә кадәр биомедицина өлкәсендә кулланылган LB концепциясе бай, ләкин өйрәнелмәгән белем чыганагын кодлый, бу сентинель төрләре һәм аларның әйләнә-тирә мохитен яхшырак аңлау өчен кулланыла ала.
Приматларга өстәп, имезүчеләрдә тычканнар, этләр, мәчеләр һәм атлар кебек ccfDNA изоляциясе хәбәр ителде [50, 51, 52].Ләкин, безнең белүебезчә, ачык тикшерү системасы булган диңгез төрләрендә ccfDNA-ны ачыклау һәм эзлеклелеге турында беренче булып хәбәр итәбез.Бу анатомик үзенчәлек һәм фильтрлау сәләте, ким дигәндә, бүтән төрләр белән чагыштырганда, ДНК фрагментларының әйләнешенең төрле зурлыкларын аңлатырга мөмкин.Кешедә, канда әйләнүче ДНК фрагментларының зурлыгы 150 дән 200 ат көченә кадәр булган кечкенә фрагментлар.максималь иң югары ноктасы 167 б.т. [34, 53].ДНК фрагментларының кечкенә, ләкин мөһим өлеше 300-500 ат көчендә, һәм якынча 5% 900 ат көченнән озынрак.[54].Бу зурлыкны таратуның сәбәбе - плазмадагы ccfDNAның төп чыганагы күзәнәк үлеме аркасында, яисә күзәнәкләрдә үлем гематопоиетик күзәнәкләренең некрозы аркасында яисә яман шеш авыруларындагы шеш күзәнәкләренең апоптозы аркасында (ДНК әйләнеше дип атала)., ctDNA).Без midiesда тапкан гемолимф ccfDNA күләменең бүленеше 1000 дән 5000 ат көченә кадәр булган, бу ccfDNA мускасының башка чыгышы булуын күрсәтә.Бу логик гипотеза, чөнки midies ярым ачык кан тамырлары системасына ия һәм микробиаль геном ДНК концентрацияләре булган диңгез су мохитендә яшиләр.Чынлыкта, безнең лаборатория экспериментлары күрсәткәнчә, midies диңгез суларында ДНК фрагментларын туплыйлар, ким дигәндә берничә сәгатьтән соң алар кәрәзле эләккәннән соң деградацияләнә һәм / яки төрле оешмаларда саклана.Күзәнәкләрнең сирәк булуын исәпкә алып (прокариотик та, эукариотик та), врач-вагон бүлмәләрен куллану ccfDNA күләмен үз-үзеннән һәм чит чыганаклардан киметәчәк.Бивальв тумыштан килгән иммунитетның һәм әйләнүче фагоцитларның күплеген исәпкә алып, без тагын фаразладык, хәтта чит ccfDNA микроорганизмнар һәм / яки кәрәзле калдыклар аша чит ДНК туплаган фагоцитлар әйләнешендә баетылган.Бергә тупланганнан соң, безнең нәтиҗәләр шуны күрсәтә: бивальв гемолимф ccfDNA молекуляр мәгълүматның уникаль саклагычы һәм сентинель төрләре статусын ныгыта.
Безнең мәгълүматлар шуны күрсәтә: бактериядән алынган гемолимф ccfDNA фрагментларын эзләү һәм анализлау хуҗа бактерия флорасы һәм әйләнә-тирә диңгез экосистемасында булган бактерияләр турында төп мәгълүмат бирә ала.Атыш эзләү техникасы A. atra gill бактерияләренең эзлеклелеген ачыклады, гадәти 16S rRNA идентификацияләү ысуллары кулланылган булса, сагынылган булыр иде, өлешчә белешмә китапханә битарафлыгы аркасында.Чынлыкта, Кергуелендагы бер үк мускул катламында М.Платенсисыннан җыелган LB мәгълүматларын куллануыбыз гиль белән бәйле бактерия симфонияләренең составының ике төр өчен дә бер үк булуын күрсәтте (С4 рәсем, өстәмә мәгълүмат).Ике генетик төрле мусельның бу охшашлыгы Кергуеленның салкын, күкерт һәм вулкан чыганакларында бактерия җәмгыятьләренең составын чагылдырырга мөмкин [55, 56, 57, 58].Күкерт киметүче микроорганизмнарның югары дәрәҗәсе биотурбатланган яр буйларыннан midies җыеп алганда яхшы сурәтләнгән, Порт-о-Франция яры кебек.Тагын бер мөмкинлек - горизонталь тапшыру аркасында мусель флорасы тәэсир итергә мөмкин [60, 61].Диңгез мохите, диңгез өслеге һәм мускулларда симбиотик бактерияләр составы арасындагы бәйләнешне ачыклау өчен күбрәк тикшеренүләр кирәк.Бу тикшеренүләр хәзерге вакытта дәвам итә.
Гемолимф ccfDNA озынлыгы һәм концентрациясе, аны чистарту җиңеллеге, һәм тиз мылтыктан эзләнү өчен югары сыйфат - диңгез яры экосистемаларында биологик төрлелекне бәяләү өчен мусель ccfDNA куллануның күп өстенлекләре.Бу ысул аеруча экосистемада вируслы җәмгыятьләрне (виромнарны) характерлау өчен эффектив [62, 63].Бактерия, археа һәм эукариотлардан аермалы буларак, вируслы геномнарда 16S эзлеклелеге кебек филогенетик сакланган геннар юк.Безнең нәтиҗәләр шуны күрсәтә: midy кебек индикатор төрләреннән сыек биопсигы чагыштырмача күп санлы ccfDNA вирус фрагментларын ачыклау өчен кулланыла ала, гадәттә яр буендагы диңгез экосистемаларында яшәүче хуҗаларны зарарлый.Бу протозоа, артроподлар, бөҗәкләр, үсемлекләр һәм бактерия вирусларын (мәсәлән, бактериофаглар) зарарлый торган вирусларны үз эченә ала.Кергуеленда шул ук мускул катламында җыелган зәңгәр midies (M. platensis) гемолимф ccfDNA вирусын тикшергәндә охшаш тарату табылды (таблица S2, өстәмә мәгълүмат).CcfDNA мылтыгын эзләү, чыннан да, кешеләрнең яки ​​башка төрләрнең вирусын өйрәнүдә көч ала торган яңа ысул [21, 37, 64].Бу ысул ике катлы ДНК вирусларын өйрәнү өчен аеруча файдалы, чөнки Балтимордагы вирусларның иң күп һәм киң классын күрсәтүче ике полосалы ДНК вируслары арасында бер ген дә сакланмый [65].Бу вирусларның күбесе классификацияләнмәгән булып, вирус дөньясының бөтенләй билгесез өлешеннән вируслар кертелергә мөмкин булса да, без вируслар һәм хуҗалар диапазоны A. atra һәм M. platensis ике төр арасында төшүен ачыкладык.охшаш (S3 рәсемен карагыз, өстәмә мәгълүмат).Бу охшашлык гаҗәп түгел, чөнки ул әйләнә-тирәдә булган ДНКны сайлап алу җитмәвен күрсәтергә мөмкин.Чистартылган РНК кулланып киләчәк тикшеренүләр хәзерге вакытта РНК вирусын характерлау өчен кирәк.
Тикшеренүләр вакытында без Коварски һәм хезмәттәшләренең эшеннән җайлаштырылган бик каты торба кулландык, алар туган ccfDNA җыю алдыннан һәм аннан соң ике этаплы бетерүне кулландылар, нәтиҗәдә каралмаган укуларның зур өлеше.Шуңа күрә, без бу каралмаган укуларның кайберләренең үз чыгышы булырга мөмкинлеген искәртә алмыйбыз, беренче чиратта, бездә бу мусель төрләре өчен белешмә геном юк.Без шулай ук ​​бу торбаны кулландык, чөнки без үз-үзеңне укымый торган һәм Illumina MiSeq PE75 чыгарган уку озынлыгы арасындагы химералар турында борчылдык.Дизайнсыз укуларның күпчелегенең тагын бер сәбәбе - диңгез микробларының күбесе, аеруча Кергуелен кебек ерак җирләрдә, аңлатма бирелмәгән.Illumina MiSeq PE75 кулландык, ccfDNA фрагментының озынлыгын кеше ccfDNAына охшатып.Киләчәк тикшеренүләр өчен, гемолимф ccfDNAның кешеләргә һәм / яки имезүчеләргә караганда озаграк укыганын күрсәткән нәтиҗәләрне исәпкә алып, без озын ccfDNA фрагментлары өчен кулайрак эзләү платформасын кулланырга киңәш итәбез.Бу практика тирән анализ өчен күбрәк күрсәткечләрне ачыклауны җиңеләйтәчәк.Хәзерге вакытта мөмкин булмаган тулы A. атра атом геном эзлеклелеген алу шулай ук ​​ccfDNA-ны үз-үзен һәм үз-үзен булмаган чыганаклардан аеруны җиңеләйтәчәк.Тикшеренүләребез сыек биопси төшенчәсен midies куллану мөмкинлегенә юнәлтелгәнен исәпкә алсак, бу концепция киләчәктә тикшеренүләрдә кулланылганлыктан, midies микробиаль төрлелеген өйрәнү өчен бу ысулның потенциалын арттыру өчен яңа кораллар һәм торба үткәргечләре эшләнер дип ышанабыз.диңгез экосистемасы.
Инвазив булмаган клиник биомаркер буларак, ccfDNA-ның кеше плазмасы дәрәҗәсе төрле авырулар, тукымаларның зарарлануы һәм стресс шартлары белән бәйле [67,68,69].Бу арту тукымалар зарарланганнан соң, үзеннән килгән ДНК фрагментларын чыгару белән бәйле.Без бу проблеманы кискен җылылык стрессын кулланып хәл иттек, анда мускуллар кыскача 30 ° C температурага дучар булдылар.Бу анализны өч мөстәкыйль экспериментта өч төрле midy өстендә үткәрдек.Ләкин, без кискен җылылык стрессыннан соң ccfDNA дәрәҗәсендә бернинди үзгәреш тапмадык (рәсемне карагыз S5, өстәмә мәгълүмат).Бу ачыш, ким дигәндә, өлешчә, midies ярым ачык кан әйләнеше системасына ия булуын һәм фильтрлау активлыгы аркасында күп күләмдә чит ДНК туплавын аңлатырга мөмкин.Икенче яктан, мускуллар, күп умырткасызлар кебек, стресска китерелгән тукымаларның зарарлыгына чыдамрак булырга мөмкин, шуның белән аларның гемолимфында ccfDNA чыгаруны чиклиләр [70, 71].
Бүгенге көнгә, су экосистемаларында биологик төрлелекнең ДНК анализы, нигездә, экологик ДНК (eDNA) метабаркодлауга юнәлтелгән.Ләкин, бу ысул, гадәттә, праймериз кулланылганда, биологик төрлелекне анализлау белән чикләнә.Мылтык эзләрен куллану PCR чикләрен һәм праймер комплектларын сайлап алудан арына.Шулай итеп, ниндидер мәгънәдә, безнең ысул күптән түгел кулланылган югары үткәргеч eDNA мылтыгын эзләү ысулына якынрак, ул турыдан-туры фрагментланган ДНКны эзли һәм барлык организмнарны диярлек анализлый ала [72, 73].Ләкин, LB-ны стандарт eDNA ысулларыннан аеручы берничә төп проблема бар.Әлбәттә, eDNA һәм LB арасында төп аерма - табигый фильтр хуҗаларын куллану.EDNA өйрәнү өчен табигый фильтр буларак губка һәм бивальв (Dresseina spp.) Кебек диңгез төрләренең кулланылуы хәбәр ителде [74, 75].Ләкин, Драйсенаның тикшерүендә тукымалар биопсигы кулланылган, алардан ДНК алынган.LB-тан ccfDNA анализы тукымалар биопсиясен, махсус һәм кайвакыт кыйммәтле җиһазларны һәм eDNA яки тукымалар биопсиясе белән бәйле логистиканы таләп итми.Чынлыкта, без күптән түгел хәбәр иттек, LB-тан ccfDNA салкын чылбырны сакламыйча, FTA ярдәме белән саклана һәм анализлана ала, бу ерак районнарда тикшеренүләр өчен зур проблема [76].CcfDNA-ны сыек биопсидан алу шулай ук ​​гади һәм мылтык эзләү һәм PCR анализы өчен югары сыйфатлы ДНК бирә.EDNA анализы белән бәйле кайбер техник чикләүләрне исәпкә алып, бу зур өстенлек.Сайлау ысулының гадилеге һәм аз бәясе шулай ук ​​озак вакытлы мониторинг программалары өчен аеруча яраклы.Highгары фильтрлау сәләтенә өстәп, бивальларның тагын бер билгеле үзенчәлеге - вирусларның үзләштерүенә ярдәм итүче аларның былжырының химик мукополисахарид составы [78, 79].Бу биаль төрлелекне һәм климат үзгәрүенең су экосистемасында йогынтысын характерлау өчен идеаль табигый фильтр ясый.Хосттан алынган ДНК фрагментлары eDNA белән чагыштырганда методның чикләнүе булып күренсә дә, eDNA белән чагыштырганда, мондый туган ccfDNA булу белән бәйле бәя бер үк вакытта сәламәтлекне өйрәнү өчен булган мәгълүмат өчен аңлашыла.офсет хост.Бу хуҗа геномына интеграцияләнгән вируслы эзлеклелекне үз эченә ала.Бивальваларда горизонталь таралган лейкоз ретровируслары булуын исәпкә алып, бу midies өчен аеруча мөһим [80, 81].LB-ның eDNA-ның тагын бер өстенлеге - ул микроорганизмнарны (һәм аларның геномнарын) үз эченә алган гемолимфада кан күзәнәкләренең әйләнешенең фагоцитик активлыгын куллана.Фагоцитоз - бивальларда кан күзәнәкләренең төп функциясе.Ниһаять, метод midies-ның югары фильтрлау сыйфатыннан (уртача 1,5 л / с диңгез сулары) һәм ике көнлек әйләнештән файдалана, бу төрле диңгез суларының катнашуын арттыра, гетерологик eDNA тотарга мөмкинлек бирә.[83, 84].Шулай итеп, midc ccfDNA анализы - midy-ның туклану, икътисадый һәм экологик йогынтысын исәпкә алып кызыклы юл.Кешеләрдән җыелган ЛБ анализына охшаган, бу ысул шулай ук ​​экзоген матдәләргә җавап итеп кабул итүче ДНКдагы генетик һәм эпигенетик үзгәрешләрне үлчәү мөмкинлеген ача.Мәсәлән, өченче буын эзләү технологияләре нанопор эзлеклелеге ярдәмендә туган ccfDNAда геном киң метилизация анализы ясарга мөмкин.Бу процесс җиңеләйтелергә тиеш, ccfDNA мускулларының озынлыгы озын укылган эзлекле платформалар белән туры килә, бу геном киң ДНК метилизациясен анализларга мөмкинлек бирә, бер эзлеклелектә химик үзгәрүләр кирәксез.85,86] Бу кызыклы мөмкинлек, чөнки ДНК метиляция үрнәкләренең экологик стресска җавап бирүе һәм күп буыннарда дәвам итүе күрсәтелгән.Шуңа күрә, ул климат үзгәрүенә яки пычраткыч матдәләргә тәэсир иткәннән соң җавапны җайга салучы төп механизмнар турында кыйммәтле мәгълүмат бирә ала [87].Ләкин, LB куллану чиксез түгел.Әйтергә кирәк, моның өчен экосистемада күрсәткеч төрләре булырга тиеш.Aboveгарыда әйтелгәнчә, бирелгән экосистеманың биологик төрлелеген бәяләү өчен LB куллану шулай ук ​​чыганактан ДНК фрагментлары булуын исәпкә алып каты биоинформатика торбасын таләп итә.Тагын бер төп проблема - диңгез төрләре өчен белешмә геномнарның булуы.Диңгез имезүчеләрнең геномнары проекты һәм күптән түгел төзелгән Fish10k проекты кебек инициативалар киләчәктә мондый анализны җиңеләйтер дип өметләнәбез.LB концепциясен диңгез фильтры белән тукландыручы организмнарга куллану шулай ук ​​эзлекле технологиянең соңгы казанышларына туры килә, бу экологик стресска каршы диңгез яшәешенең сәламәтлеге турында мөһим мәгълүмат бирү өчен күп охлы биомарклар үсешенә яраклы.
Геном эзләү мәгълүматлары NCBI эзлеклелеген уку архивында урнаштырылган https://www.ncbi.nlm.nih.gov/sra/SRR8924808 Bioprojects SRR8924808.
Брайерли АС, Кингсфорд М.Ж. Климат үзгәрүенең диңгез тормышына һәм экосистемаларга йогынтысы.Биология.2009;19: P602 - P614.
Gissi E, Manea E, Mazaris AD, Fraschetti S, Almpanidou V, Bevilacqua S, һ.б.Климат үзгәрүенең һәм башка җирле стрессорларның диңгез мохитенә булган йогынтысын карагыз.гомуми фәнни мохит.2021; 755: 142564.
Карелла Ф, Антуофермо Е, Фарина С, Салати Ф, Мандас Д, Прадо П һ.б.).Беренче март фәне.2020; 7: 48.
Серонт Л, Никастро CR, Зарди Г.И, Гобервиль Э.Фәнни доклад 2019;9: 17498.
Fey SB, Siepielski AM, Nussle S, Cervantes-Yoshida K, Hwan JL, Huber ER һ.б.Хайваннар үлеменең ешлыгында, сәбәпләрендә һәм күләмендә соңгы үзгәрешләр.Процесс Натл Акад США.2015; 112: 1083-8.
Скарпа Ф, Санна Д, Аззена I, Мугетти Д, Серрути Ф, Хоссейни С һ.б.Төрле булмаган специфик патогеннар Пинна нобилисының күпләп үлеменә китерергә мөмкин.Тормыш.2020; 10: 238.
Брэдли М, Коттс С., Дженкинс Э, О'Хара ТМ.Климат үзгәрүенең Арктика зоонотик авыруларына потенциаль йогынтысы.Int J циркумполяр сәламәтлек.2005;64: 468-77.
Бейер Дж., Грин Н.В., Брукс С., Аллан И., Руус А., Гомес Т. һ.б.Зәңгәр midies (Mytilus edulis spp.) Яр буендагы пычрануны мониторинглауда сигнал организмнары: күзәтү.Mar Environ Res 2017;130: 338-65.
Сиравегна Г, Марсони С, Сиена С, Барделли А. Ракны дәвалауда сыек биопсиянең интеграциясе.Чиста Онкол.2017;14: 531–48.
Wan JCM, Massie C, Garcia-Corbacho J, Mouliere F, Brenton JD, Caldas C һ.б.Сыек биопси җитлеккәнлеге: шеш ДНКсын әйләндерергә мөмкинлек бирә.Нат Рев.2017; 17: 223–38.
Мандель П, Метаис П. Кеше плазмасында нуклеин кислоталары.Soc Biol бүлекчәләренең очрашу минутлары.1948;142: 241-3.
Bronkhorst AJ, Ungerer W, Holdenrieder S. Ракны дәвалау өчен молекуляр маркер буларак күзәнәксез ДНК өчен яңа роль.Биомоляр анализ күләме.2019; 17: 100087.
Игнатидис М., Чана GW, Джеффри СС сыек биопси клиникага керә - тормышка ашыру проблемалары һәм киләчәк проблемалар.Нат Рев Клин Онкол.2021;18: 297-312.
Lo YM, Corbetta N., Chamberlain PF, Rai W., Sargent IL, Redman CW һәм башкалар.Бала тудыру ДНК ана плазмасында һәм зарарда бар.Ланцет.1997;350: 485-7.
Mufarray MN, Wong RJ, Shaw GM, Stevenson DK, Quake SR Йөклелек барышын өйрәнү һәм йөклелек вакытында хатын-кызлар канында күзәнәктән тыш РНК әйләнешен куллану.Допедиатрия.2020; 8: 605219.
Оллерич М, Шервуд К, Киун П, Шюц Е, Бек Дж, Стегбауэр Дж, һ.б.Сыек биопси: донор күзәнәксез ДНК бөер прививкасында аллогеник тән җәрәхәтләрен ачыклау өчен кулланыла.Нат Рев Нефрол.2021;17: 591–603.
Хуан ФК, Lo YM Бала табу диагностикасында инновацияләр: ана плазмасы геном эзлеклелеге.Анна М.Д.2016; 67: 419-32.
Gu W, Deng X, Lee M, Sucu YD, Arevalo S, Stryke D һ.б.Вируслы тән сыеклыкларының киләсе буын метагеномик эзлеклелеге белән тиз патоген ачыклау.Медицина.2021; 27: 115-24.