Nature.com сайтына кергәнегез өчен рәхмәт. Сез кулланган браузер версиясе CSS өчен чикләнгән ярдәмгә ия. Иң яхшы тәҗрибә өчен без яңартылган браузерны кулланырга киңәш итәбез (яки Internet Explorer'та яраклашу режимын сүндерегез). Шул ук вакытта, ярдәмне дәвам итәр өчен, без сайтны стильләр һәм JavaScriptсыз күрсәтәчәкбез.
Кремний кремний кисәкчәләре макропор кисәкчәләрен алу өчен кайбер модификацияләр белән эремчек-гель ысулы белән әзерләнгәннәр. Бу кисәкчәләр N-фенилмалеймид-метилвинилисокянат (PMI) һәм стирол белән N-фенилмалимид интеркалациясе (полимер) стационар полимер полосасы. ) пептид катнашмасының биш пептидтан торган (Гли-Тир, Гли-Лей-Тир, Гли-Гли-Тир-Арг, Тир-Иле-Гли-Сер-Арг, лейцин энкефалин) хроматографик эшләнмәсе) трипсин ашказаны, трипсин ашказаны, кеше серумы альбумины. .
Соңгы елларда биофармацевтика индустриясе базар өлешенең сизелерлек артуы белән киңәюче дөнья базарына әверелде. Биофармацевтика сәнәгатенең шартлаулы үсеше белән 1,2,3, пептидлар һәм протеиннар анализы бик кирәк. Максатлы пептидка өстәп, пептид синтезы вакытында берничә пычрак барлыкка килә. Масса. Сыек хроматография (LC) соңгы ун елда сизелерлек алга китте һәм протеомик анализда популяр техникага әйләнде7,8,9,10.
Кире фазалы сыек хроматография (RP-LC) октадецил-модификацияләнгән кремнийны (ОДС) стационар фаза буларак пептид катнашмаларын чистарту һәм аеру өчен киң кулланыла11,12,13. Шулай да, RP стационар этаплары пептидлар һәм аксымнар белән канәгатьләнерлек аерылуны тәэмин итмиләр, ампифилик табигате белән поляр булмаган анализлар. Бу аналитиклар белән саклагыз16. Мультимодаль үзара бәйләнешне тәэмин итүче катнаш режимлы хроматография, пептидларны, протеиннарны һәм башка катлаулы катнашмаларны аеру өчен RP-LC өчен альтернатива була ала. Төрле катнаш режимлы стационар этаплар әзерләнде, һәм бу этаплар белән тутырылган баганалар пептид һәм протеинны аеру өчен кулланылды17 / 18,19,20,21. поляр һәм поляр булмаган төркемнәр булу сәбәпле пептид һәм протеинны аеру өчен яраклы22,23,24,25,26,27,28 .Шушы охшаш поляр төркемнәр белән поляр үзара бәйләнешле стационар этаплар яхшы аеру көчен һәм поляр һәм поляр булмаган аналитиклар өчен уникаль сайлылыкны күрсәтәләр, чөнки аеру аналитик һәм стационар фазаның үзара бәйләнешенә бәйле.Мультимодаль үзара бәйләнеш 29, 30, 31, 32. Соңгы вакытта Чжан һәм башкалар.30 додецил белән беткән полиамин стационар фазасын әзерләделәр һәм углеводородлар, антидепрессантлар, флавоноидлар, нуклеозидлар, эстрогеннар һәм башка берничә аналитикны уңышлы аердылар. Поляр интеркалаторның поляр һәм поляр булмаган төркемнәре бар, шуңа күрә ул пептидлар һәм протеиннарны аеру өчен кулланылырга мөмкин, шулай ук ​​гидрофобик һәм гидрофилик муеннар. RP-Amide баганалары, ләкин бу баганалар амин 33 анализы өчен генә кулланыла.
Хәзерге тикшеренүдә поляр урнаштырылган стационар этап (N-фенилмалеймид белән урнаштырылган полистирол) әзерләнде һәм HSA пептидларын һәм трипсин ашламаларын аеру өчен бәяләнде. Стационар этап түбәндәге стратегия ярдәмендә әзерләнде. Силикат кисәкчәләре безнең алдагы басмада бирелгән процедура буенча әзерләнде. руда размеры. Икенче, яңа лиганд, фенилмалеймид-метил винил изокянат синтезланган һәм поляр кертелгән стационар фазаны әзерләү өчен кремний кисәкчәләрен чыгару өчен кулланылган. Нәтиҗәдә стационар этап тотрыксыз корыч баганага тутырылган (100 × 1,8 мм id) оптимизацияләнгән упаковка схемасы ярдәмендә формалашкан. биш пептидтан тора;. PMP баганасында яхшы чишелергә һәм эффектив булырга тиеш, бу Ascentis Express RP-Amide баганасына караганда эффективрак.
PEG (Полиэтилен Гликол), Уреа, Ацетик Кислота, Триметокси Ортосиликат (ТМОС), Триметил Хлоросилан (TMCS), Трипсин, Кеше Серумы Альбумин (HSA), Аммоний Хлорид, Уреа, Гексан Метилдисилазан (HMDS), Метакрил, ММ эроксид (BPO), HPLC класслы ацетонитрил (ACN), метанол, 2-пропанол, һәм ацетон Сигма-Алдричтан (Сент-Луис, МО, АКШ) сатып алынган.
Карбамид (8 г), полиэтилен гликол (8 г), һәм 8 мл 0,01 Н кислотасы кислотасы 10 минутка кайнатылды, аннары бозлы салкын шартларда аңа 24 мл ТМОС кушылды. Реакция катнашмасы 6 сәгать эчендә 40 ° C җылытылды, аннары 120 ° C дат басмаган корыч автоклавда. 1250 сәгать эчендә 550 ° C ка исәпләнде. Өч партия әзерләнде һәм кисәкчәләрнең зурлыгында, күзәнәк күләмендә һәм өслегендә үрчү мөмкинлеген тикшерү өчен характеристика бирелде.
Алдан синтезланган лиганд фенилмалеймид-метилвинилисокянат (PCMP) белән кремний кисәкчәләрен өслек модификациясе белән, аннары стирол белән радиаль полимеризация, поляр төркем булган кушылма әзерләнде.Агрегатлар һәм полистирол чылбырлары өчен стационар этап. Әзерлек процессы түбәндә тасвирланган.
Н-фенилмалеймид (200 мг) һәм метил винил изосянат (100 мг) коры толуенда эретелде, һәм 0,1 мл 2,2′-азоисобутиронитрил (AIBN) реакция флассасына фенилмалеймид-метил винил изокянат кополимеры (40 ° C) киптерелгән. 3 сәгать.
Кипкән кремний кисәкчәләре (2 г) коры толуенда (100 мл) таралдылар, 500 мл түгәрәк асты фласска 10 минутка таратылды. PMCP (10 мг) толуенда эретелде һәм тамчы функция аша реакция флассасына тамчы тамчы кушылды. ) толуенда (200 мл) эретелде һәм катализатор буларак 100 µL дибутилтин дилаты булганда 4-гидрокси-ТЕМПО (2 мл) кушылды.
Стирол (1 мл), бензойл пероксиды BPO (0,5 мл), һәм TEMPO-PMCP кушылган кремний кисәкчәләре (1,5 г) толуенда таралдылар һәм азот белән чистартылды. Стиролны полимеризацияләү 100 ° C температурада 12 сәгать дәвамында ясалды.
-3рнәкләр 10-3 Торрдан да ким булмаган калдык басымы алу өчен 393 К температурада деградацияләнде. P / P0 = 0.99 чагыштырмача басымда adsorbsed N2 күләме гомуми күзәнәк күләмен билгеләр өчен кулланылды. Ялан һәм бәйләнгән кремний кисәкчәләренең морфологиясе сканерланган электрон микроскопия (Хитачи High Technologies, Токио, Япония). углерод тасмасы. Алтын Q150T спуттер пальтеры белән капланган, һәм үрнәкләргә 5 нм Ау катламы салынган. Бу түбән көчәнеш ярдәмендә процесс нәтиҗәлелеген күтәрә һәм яхшы ашлык, салкын бөтерелү белән тәэмин итә. һәм лиганд белән бәйләнгән кремний кисәкчәләре (һәрберсе 5 мг) 5 мл изопропанолда таралдылар, 10 минутка соникалаштырылды, 5 минутка вортекска куелды һәм мастеризаторның оптик эскәмиясенә урнаштырылды.
Пыяла белән капланган дат басмас корыч тар тарлы колонналар (100 × 1,8 мм id) пычрак төрү ысулы ярдәмендә тутырылган, Резюмеда кулланылган шул ук процедураны кулланып.31. Датланмаган корыч багана (пыяла белән капланган, 100 × 1,8 мм id) 1 мм фритны үз эченә алган розетка белән тоташтырылган (Аллтех Дирфилд, IL, АКШ) .Стационар фаза слурасын әзерләгез, 1,2 мл метанолда 150 мг стационар фазаны туктатып, саклагыч баганага җибәрегез. Колоннаның бердәм төрүен тәэмин итү өчен, 10 минутка, 15 минутка 80 MP, һәм 60 MP 30 минут эчендә. Управление вакытында механик тибрәнү ике GC баганасы белән кулланылды (Alltech, Deerfield, IL, АКШ). Колоннаны бертөрле төрүне тәэмин итү өчен.
LC насосы (10AD Шимадзу, Япония), инжектор (Валко (АКШ) C14 W.05) 50nL инъекция әйләнеше, мембрана дегассеры (Шимадзу DGU-14A), UV-VIS капиллярлы тәрәзә төзелде Махсус µLC җайланма детекторы (UV-2075) һәм пыяла тезелгән микроклумнар. illaries (50 μm) кыскарту союзының 1/16 out чыганагына урнаштырылды. Мәгълүмат җыю һәм хроматографик эшкәртү Multichro 2000 программа ярдәмендә эшләнде. 254 нм мониторинг UV сеңдерү өчен сынадылар. Хроматографик мәгълүматлар OriginPro8 (Нортгемптон, MA) тарафыннан анализланды.
Альбумин кеше зарарыннан, лиофилизацияләнгән порошок, ≥ 96% (агароза гели электрофорезы) 3 мг трипсин (1,5 мг), 4,0 М карбамид (1 мл), һәм 0,2 М аммиак биарбонаты (1 мл) белән кушылган. Эремә 10 минутка кайнатылды һәм 4 ° C температурада 1 мл.
Пептид катнашмаларын һәм HSA трипсин ашламаларын аеру PMP баганаларында аерым бәяләнде. Пептид катнашмасының һәм HSAның трипсин ашказанының PMP баганасы белән аерылуын тикшерегез һәм нәтиҗәләрне Ascentis Express RP-Amide баганасы белән чагыштырыгыз. Теоретик тәлинкә саны түбәндәгечә исәпләнә:
Ялан кремний кисәкчәләренең SEM рәсемнәре һәм бәйләнгән кремний кисәкчәләре.2 .Семик кремний кисәкчәләренең (A, B) рәсемнәре шуны күрсәтә: безнең алдагы тикшеренүләрдән аермалы буларак, бу кисәкчәләр сферик, аларда кисәкчәләр озын яки тәртипсез симметрия бар.
Ялан кремний кисәкчәләренең (А, В) һәм бәйләнгән кремний кисәкчәләренең (C, D) электрон микроскоп рәсемнәрен сканерлау.
Яланаяк кремний кисәкчәләренең һәм бәйләнешле кремний кисәкчәләренең кисәкчәләр үлчәме 3-нче рәсемдә күрсәтелгән .Күләм күләмендәге кисәкчәләрнең зурлыгы тарату кәкреләре химик модификациядән соң кремний кисәкчәләренең зурлыгы артуын күрсәттеләр. 3-нче рәсем. ) кыйммәте 3.05 мм (полистирол белән бәйләнгән кремний кисәкчәләре) 34. Бу партия реакция катнашмасындагы PEG, карбамид, ТМОС һәм кисотик кислотаның төрле катнашуы аркасында үткән өйрәнү белән чагыштырганда таррак кисәкчәләр бүленеше булган. Силикат өслегендә 7 мм, ә PMP фазасында катлам калынлыгы 1,38 мм булган.
Ясалма кремний кисәкчәләренең һәм бәйләнешле кремний кисәкчәләренең кисәкчәләр размеры (А) һәм күзәнәк зурлыгы бүленеше.
Агымдагы өйрәнүнең кремний кисәкчәләренең күзәнәк күләме, күзәнәк күләме һәм өслеге мәйданы 1 (В) таблицасында китерелгән. Ялан кремний кисәкчәләренең PSD профильләре һәм бәйләнешле кремний кисәкчәләре 3 нче рәсемдә күрсәтелгән. Нәтиҗә алдагы өйрәнүебез белән чагыштырыла. кәкре 3-нче рәсемдә күрсәтелгән .Бу охшаш, кремний кисәкчәләренең күзәнәк күләме химик модификациядән соң 0,67 дән 0,58 см3 / г га кадәр кимегән. Хәзерге вакытта өйрәнелгән кремний кисәкчәләренең конкрет өслеге мәйданы 116 м2 / г, бу безнең алдагы тикшерүебез белән чагыштырыла (124 м2 / г).
Стационар этапны элементаль анализлау нәтиҗәләре 2-нче таблицада күрсәтелгән. Хәзерге стационар этапның углерод белән йөкләнеше 6,35% тәшкил итә, бу безнең алдагы өйрәнүебезнең углерод йөкләнешеннән түбәнрәк (полистирол белән бәйләнгән кремний кисәкчәләре, тиешенчә, 7,93% 35 һәм 10,21%) 42. Хәзерге стационар фазаның углерод йөкләнеше түбән, чөнки хәзерге СПны әзерләгәндә, стилен плитины. 4) 35%, 2-нче таблицада күрсәтелгәнчә, авырлыкны югалту PMP стационар фазасы белән тикшерелде, һәм TGA сызыгы 4-нче рәсемдә күрсәтелде. TGA сызыгы 8,6% авырлыкны күрсәтә, бу углерод йөкләү белән яхшы килешә (6,35%), чөнки лигандларда C гына түгел, N, O, H да бар.
Фенилмалеймид-метилвинилисокянат лиганы кремний кисәкчәләренең өслеген модификацияләү өчен сайланган, чөнки аның поляр фенилмалеймид төркемнәре һәм винилисокянат төркемнәре бар. нормаль рНда виртуаль корылма юк. Стационар этапның полярлыгы оптималь стирол һәм ирекле радикал полимеризациянең реакция вакыты белән идарә ителергә мөмкин. Реакциянең соңгы адымы (ирекле радикаль полимеризация) критик һәм стационар этапның полярлыгын үзгәртә ала. Стиролның төрле углерод йөкләнеше бар. Моннан тыш, бу стационар этапларны пасовкасыз корыч баганаларга йөкләгез һәм аларның хроматографик күрсәткечләрен тикшерегез (сайлап алу, резолюция, N кыйммәте һ.б.). Бу экспериментлар нигезендә контроль полярлыкны һәм яхшы аналитик тотуны тәэмин итү өчен оптимальләштерелгән формуляция сайланды.
Биш пептид катнашмасы (Гли-Тир, Гли-Лей-Тир, Гли-Гли-Тир-Арг, Тир-Иле-Гли-Сер-Арг, лейцин энкефалин) шулай ук ​​күчмә фаза ярдәмендә PMP баганасы ярдәмендә бәяләнде;60/40 (v / v) ацетонитрил / су (0,1% TFA) 80 μL / мин. бер минут, N кыйммәтләре бик яхшы иде, баганага 13,500 ± 330 (100 × 1,8 мм id), 135,000 тәлинкәгә туры килә (5Б рәсем). Өч төрле зурлыктагы баганалар (100 × 1,8 мм id) репродуктивлыкны тикшерү өчен өч төрле PMP стационар этап белән тутырылган. 4 нче таблицада. PMP баганасының репродуктивлыгы бик түбән% RSD кыйммәтләре белән яхшы корреляцияләнә, таблицада күрсәтелгәнчә.
ПМП баганасында пептид катнашмасын аеру (B) һәм Ascentis Express RP-Amide баганасы (A);мобиль фаза 60/40 ACN / H2O (TFA 0,1%), PMP баганасы үлчәмнәре (100 × 1,8 мм id);аналитик Кушымталарның элитация тәртибе: 1 (Глы-Тир), 2 (Гли-Лей-Тир), 3 (Гли-Глы-Тир-Арг), 4 (Тир-Иле-Гли-Сер-Арг) һәм 5 (лейцин) кислотасы энкефалин).
PMP баганасы (100 × 1,8 мм идентификация) югары җитештерүчән сыек хроматографиядә кеше серумы альбуминының триптик ашламаларын аеру өчен бәяләнде. 6-нчы рәсемдәге хроматограмма үрнәкнең яхшы аерылганын һәм резолюциянең бик яхшы булуын күрсәтә. HSA ашказанындагы һәр биеклекнең аеру эффективлыгы исәпләнде һәм кыйммәтләр таблицада китерелгән.
PMP баганасында HSA (100 × 1,8 мм id) триптик ашказаны аерылды;агым тизлеге (100 µЛ / мин), күчмә фаза 60/40 ацетонитрил / су 0,1% TFA белән.
монда L - багана озынлыгы, η - мобиль фазаның ябышлыгы, ΔP - багананың арткы басымы, ә u - күчмә фазаның сызыклы тизлеге. PMP баганасының үткәрүчәнлеге 2,5 × 10-14 м2, агым тизлеге 25 μL / мин, һәм 60/40 v / v ACN / су кулланылды. PMP баганасының үткәрүчәнлеге 100 мм. иконик күзәнәк кисәкчәләр: 1,3 мм кисәкчәләр өчен 1,7 × 10-15, 1,7 мм кисәкчәләр өчен 3,1 × 10-15, 2,6 мм кисәкчәләр өчен 2,5 × 10-14 м2 5 мм кисәкчәләр өчен 43. Шуңа күрә, PMP фазасының үткәрүчәнлеге 5 мм үзәк-кабык кисәкчәләренә охшаган.
монда Wx - хлороформ белән тутырылган багананың авырлыгы, Wy - метанол белән тутырылган багананың авырлыгы, һәм ρ - эретүче тыгызлыгы. Метанол тыгызлыгы (ρ = 0.7866) һәм хлороформ (ρ = 1.484) .Силиканың ПАРТИКЛАР-C18 баганалары (100 × 1.8 мм). Карбамид лигандлары булу стационар этапның үткәрүчәнлеген киметә дигән сүз. Икенче яктан, PMP баганасының гомуми күзлелеге (100 × 1,8 мм id) 0,60. .Типик экспериментта багананың күзәнәклеге түбәндәгечә исәпләнә:
Рәсем 7A, B PMP баганасын күрсәтә (100 × 1.8 мм id) һәм Ascentis Express RP-Amide баганасы (100 × 1.8 мм id) шул ук элитация шартларын кулланып (ягъни, 60/40 ACN / H2O һәм 0,1% TFA).) вагон Демтер участогы.Сайланган пептид катнашмалары (Гли-Тир, Гли-Лей-Тир, Гли-Глы-Тир-Арг, Тир-Иле-Глы-Сер-Арг, Лейцин Энкефалин) 20 µL / ике багана өчен минималь агым тизлеге 800 µL / мин. 3.9 µm. HETP кыйммәтләре PMP баганасының (100 × 1,8 мм id) аеру эффективлыгы коммерцияле Ascentis Express RP-Amide баганасына караганда күпкә яхшырак булуын күрсәтә. хәзерге эштә кулланылган форма, зурлык, катлаулы багана төрү процедуралары34.
(А) ван Демтер сюжеты (HETP мобиль фаза сызыклы тизлеккә каршы) 60/40 ACN / H2O белән 0,1% TFA белән PMP баганасы (100 × 1,8 мм id) ярдәмендә алынган.
Полярлы урнаштырылган полистирол стационар этап әзерләнде һәм синтетик пептид катнашмаларын һәм трипсин ашламаларын югары җитештерүчән сыек хроматографиядә аеру өчен бәяләнде. Пептид катнашмалары өчен PMP баганаларының хроматографик эшләнеше аеру эффективлыгы һәм резолюциясе. Separateгары аеру эффективлыгына өстәп, югары агым темпларында түбән багана басымы бу стационар этапның тагын бер өстенлеге. ПМП колонкалары яхшы үрчүчәнлекне күрсәтәләр һәм төрле протеиннарның пептид катнашмаларын һәм трипсин ашказаны анализлау өчен кулланылырга мөмкин. Без бу багананы табигый продуктларны аеру өчен кулланырга уйлыйбыз, дару үсемлекләреннән биоактив кушылмалар һәм гөмбә экстрактлары шулай ук ​​сыек хроматография.
Кыр, ДжК, Эверби, М.Р., Лау, Дж., Тøгерсен, Х. & Питерсон, П.Хрестоматия.1603, 113–129.https: //doi.org/10.1016/j.chroma.2019.05.038 (2019).
Гомес, Б. һ.б. Йогышлы авыруларны дәвалау өчен эшләнгән яхшыртылган актив пептидлар. Биотехнологияләр.
Влиеге, П., Лисовски, В., Мартинес, Дж.
Си, Ф., Смит, РД & Шен, Y. Протеомик сыек хроматография.Хрестоматия. 1261, 78–90 (2012).
Лю, В.
Чеснут, СМ & Солсбери, Дж. Наркотиклар үсешендә UHPLC роле.30 сентябрь (8), 1183-1190 (2007).
Ву, Н. & Клаузен, AM Тиз аерылу өчен ультра югары басымлы сыек хроматографиянең төп һәм практик аспектлары.30 сентябрь (8), 1167-1182.https: //doi.org/10.1002/jssc.200700026 (2007).
Wren, SA & Tchelitcheff, P. Наркотиклар үсешендә ультра югары җитештерүчән сыек хроматографияне куллану.J.Хрестоматия.1119 (1-2), 140-146.https: //doi.org/10.1016/j.chroma.2006.02.052 (2006).
Гу, Х. һ.б. Монолит макропорозлы гидрогеллар, судагы югары эчке фаза эмульсияләреннән энтеровирусларны эффектив чистарту өчен әзерләнгән. Химик.Британ.J.401, 126051 (2020).
Ши, Y .., Сян, Р., Хорват, С. & Вилкинс, ЯА Протеомикада сыек хроматографиянең роле.Хрестоматия.А 1053 (1-2), 27-36 (2004).
Фекете, С., Вейтей, Дж.Даруханә.Биомедицина Фән.анус.69, 9-27 (2012).
Гилар, М., Оливова, П.28 нче сентябрь (14), 1694-1703 (2005).
Фелетти, С. һ.б. Масса-күләм тапшыру характеристикалары һәм C18 суб-2 мм тулы һәм өстән тыш күзәнәк кисәкчәләр белән тутырылган югары эффектив хроматографик баганаларның кинетик эшләнеше тикшерелде.Сентябрь 43 (9-10), 1737-1745 (2020).
Пиовесана, С. һ.б. үсемлекләр биоактив пептидларын изоляцияләү, ачыклау һәм раслаудагы соңгы тенденцияләр һәм аналитик проблемалар. Химик.410 (15), 3425–3444.https: //doi.org/10.1007/s00216-018-0852-x (2018).
Мюллер, Дж.Б. Тормыш патшалыгының протеомик пейзажы. Табигать 582 (7813), 592-596.https: //doi.org/10.1038/s41586-020-2402-x (2020).
ДеЛука, С.
Янг, Y .. & Генг, X. Катнаш режимлы хроматография һәм аны биополимерларга куллану.J.Хрестоматия.А 1218 (49), 8813–8825 (2011).
Чжао, Г., Донг, X.- Й. & Кояш, Й.Биотехнология.144 (1), 3-11 (2009).