Nature.com نى زىيارەت قىلغىنىڭىزغا رەھمەت.سىز چەكلىك CSS قوللىشى بىلەن توركۆرگۈ نۇسخىسىنى ئىشلىتىۋاتىسىز.ئەڭ ياخشى تەجرىبە ئۈچۈن يېڭىلانغان تور كۆرگۈچنى ئىشلىتىشىڭىزنى تەۋسىيە قىلىمىز (ياكى Internet Explorer دىكى ماسلىشىشچان ھالەتنى چەكلەڭ).ئۇنىڭدىن باشقا ، داۋاملىق قوللاشقا كاپالەتلىك قىلىش ئۈچۈن ، ئۇسلۇب ۋە JavaScript بولمىغان تور بېكەتنى كۆرسىتىمىز.
بىرلا ۋاقىتتا ئۈچ تام تەسۋىر كارۇسېلنى كۆرسىتىدۇ.ئالدىنقى ۋە كېيىنكى كۇنۇپكىلارنى ئىشلىتىپ بىر قېتىمدا ئۈچ تام تەسۋىردىن ئۆتۈڭ ياكى ئاخىرىدا سىيرىلما كۇنۇپكىلارنى ئىشلىتىپ بىر قېتىمدا ئۈچ تام تەسۋىردىن ئۆتۈڭ.
قان-مېڭە توسىقى ۋە قان-مېڭە توسىقى بىئولوگىيىلىك داۋالاش دورىلىرىنىڭ مەركىزى نېرۋا سىستېمىسىدىكى نىشانغا يېتىشىنىڭ ئالدىنى ئالىدۇ ، بۇ ئارقىلىق نېرۋا كېسەللىكلىرىنى ئۈنۈملۈك داۋالاشقا توسالغۇ بولىدۇ.Vivo دىكى يېڭى مېڭە توشۇغۇچىلارنى بايقاش ئۈچۈن ، بىز T7 فازا پېپتىد كۈتۈپخانىسىنى تونۇشتۇردۇق ۋە چاشقانلارنىڭ زەمبۇرۇغ ئاڭلانغان چوڭ كۆلچەك مودېلى ئارقىلىق قان ۋە چوڭ مېڭە سۇيۇقلۇقى (CSF) نى تەرتىپلىك توپلىدۇق.كونكىرىت باسقۇچلۇق كلونلار تۆت ئايلانما تاللاشتىن كېيىن CSF دا يۇقىرى دەرىجىدە بېيىدى.يەككە كاندىدات پېپتىدلارنى سىناق قىلغاندا CSF دا 1000 ھەسسىدىن ئارتۇق بېيىغانلىقى ئاشكارىلاندى.پېپتىد ئارقىلىق ۋاسىتىلىك ھالدا مېڭىگە يەتكۈزۈلۈشنىڭ بىئولوگىيىلىك ئاكتىپلىقى ئېنىقلانغان روماننىڭ ئۆتكۈنچى پېپتىد بىلەن باغلانغان BACE1 پېپتىد چەكلىگۈچ ئارقىلىق چوڭ مېڭە سۇيۇقلۇقىدىكى ئامىلوئىد سەۋىيىسىنىڭ% 40 تۆۋەنلىگەنلىكى ئىسپاتلاندى.بۇ نەتىجىلەر vivo فازا تاللاش ئۇسۇلىدا ئېنىقلانغان پېپتىدلارنىڭ داۋالاش ئۈنۈمى بىلەن ماكرو مولېكۇلانىڭ مېڭىگە سىستېمىلىق يەتكۈزۈلۈشىدە پايدىلىق ماشىنا بولۇشى مۇمكىنلىكىنى كۆرسىتىپ بەردى.
مەركىزىي نېرۋا سىستېمىسى (CNS) نىشانلىق داۋالاش تەتقىقاتى ئاساسلىقى ئەلالاشتۇرۇلغان دورا ۋە CNS نىشانلاش خۇسۇسىيىتىنى نامايان قىلىدىغان ۋاكالەتچىلەرنى ئېنىقلاشقا مەركەزلەشتى ، بۇنىڭ بىلەن مېڭىگە ئاكتىپ دورا يەتكۈزۈشنى ئىلگىرى سۈرىدىغان مېخانىزملارنى بايقاشقا ئازراق كۈچ سەرپ قىلىندى.دورا يەتكۈزۈش ، بولۇپمۇ چوڭ مولېكۇلا زامانىۋى نېرۋا ئىلمى دورا تەرەققىياتىنىڭ كەم بولسا بولمايدىغان بىر قىسمى بولغاچقا ، بۇ ھازىر ئۆزگىرىشكە باشلىدى.مەركىزىي نېرۋا سىستېمىسىنىڭ مۇھىتى مېڭە قان تومۇر توسۇلۇش سىستېمىسى تەرىپىدىن ياخشى قوغدىلىدۇ ، ئۇ قان-مېڭە توسالغۇسى (BBB) ​​ۋە قان-مېڭە توسىقى (BCBB) 1 دىن تەركىب تاپقان بولۇپ ، زەھەرلىك چېكىملىكنى مېڭىگە يەتكۈزۈش قىيىن.مۆلچەرلىنىشىچە ، چوڭ تىپتىكى مولېكۇلا دورىلىرى ۋە% 98 تىن كۆپرەك كىچىك مولېكۇلا دورىلىرى چوڭ مېڭىدىن يوقىتىلىدۇ.شۇڭلاشقا CNS 4,5 گە داۋالاش دورىلىرىنى ئۈنۈملۈك ۋە كونكرېت يەتكۈزۈش بىلەن تەمىنلەيدىغان يېڭى مېڭە توشۇش سىستېمىسىنى پەرقلەندۈرۈش تولىمۇ مۇھىم.قانداقلا بولمىسۇن ، BBB ۋە BCSFB يەنە كەڭ قان تومۇر ئارقىلىق مېڭىنىڭ بارلىق قۇرۇلمىلىرىغا سىڭىپ كىرىپ ، زەھەرلىك چېكىملىك ​​يەتكۈزۈش ئۈچۈن ناھايىتى ياخشى پۇرسەت بىلەن تەمىنلەيدۇ.شۇڭا ، نۆۋەتتىكى مېڭىگە تاجاۋۇز قىلمايدىغان ئۇسۇللارنى قوللىنىشتىكى تىرىشچانلىقلار كۆپىنچە ئىچكى مەنبەلىك BBB6 قوبۇللىغۇچنى ئىشلىتىپ قوبۇل قىلغۇچى ۋاسىتىچى توشۇش (PMT) مېخانىزىمىنى ئاساس قىلىدۇ.گەرچە يۆتكىلىشچان قوبۇللىغۇچ يولىنى ئىشلىتىپ يېقىنقى مۇھىم ئىلگىرىلەشلەرگە ئېرىشكەن بولسىمۇ ، ئەمما خۇسۇسىيىتى ياخشى بولغان يېڭى يەتكۈزۈش سىستېمىسىنى يەنىمۇ تەرەققىي قىلدۇرۇش تەلەپ قىلىنىدۇ.بۇنىڭ ئۈچۈن بىزنىڭ مەقسىتىمىز CSF تىرانسپورتىنى مۇرەسسە قىلالايدىغان پېپتىدلارنى ئېنىقلاش ، چۈنكى ئۇلار پىرىنسىپ جەھەتتىن ماكرو مولېكۇلانى CNS غا يەتكۈزۈشكە ياكى يېڭى قوبۇل قىلىش يولىنى ئېچىشقا ئىشلىتىلىدۇ.بولۇپمۇ مېڭە قان تومۇر سىستېمىسى (BBB ۋە BSCFB) نىڭ ئالاھىدە قوبۇللىغۇچىسى ۋە توشۇغۇچىلىرى بىئولوگىيىلىك داۋالاش دورىلىرىنى ئاكتىپ ۋە كونكرېت يەتكۈزۈشتىكى يوشۇرۇن نىشان بولالايدۇ.چوڭ مېڭە سۇيۇقلۇقى (CSF) خوروئىد ئەۋرىشىم (CS) نىڭ مەخپىي مەھسۇلاتى بولۇپ ، مېڭە ئاستى بېزى بوشلۇقى ۋە دالانچە بوشلۇقى ئارقىلىق چوڭ مېڭىنىڭ ئارىلىق سۇيۇقلۇقى بىلەن بىۋاسىتە ئۇچرىشىدۇ.يېقىندا ئىسپاتلىنىشىچە ، مېڭە ئاستى بېزى سۇيۇقلۇقى چوڭ مېڭىنىڭ ئارىلىقىغا ھەددىدىن زىيادە تارقىلىدۇ.بىز بۇ سۇبراخنوئىد ئېقىش يولى ئارقىلىق ياكى بىۋاسىتە BBB ئارقىلىق پارنىك بوشلۇقىغا ئېرىشىشنى ئۈمىد قىلىمىز.بۇنى ئەمەلگە ئاشۇرۇش ئۈچۈن ، بىز vivo فازا تاللاش ئىستراتېگىيىسىدە پۇختا يولغا قويدۇق ، بۇ ئىككى پەرقلىق يولنىڭ ھەر بىرىدە توشۇلىدىغان پېپتىدلارنى ئەڭ ياخشى پەرقلەندۈرىدۇ.
بىز ھازىر vivo باسقۇچلۇق كۆرسىتىش ئېكرانىنى تەكشۈرۈش ئۇسۇلىنى CSF ئەۋرىشكىسى بىلەن يۇقىرى كىرگۈزۈش تەرتىپى (HTS) بىلەن بىرلەشتۈرۈپ ، كۇتۇپخانىنىڭ كۆپ خىللىقى بىلەن دەسلەپكى تاللاش باسقۇچىنى نازارەت قىلىمىز.قاننىڭ بۇلغىنىشىدىن ساقلىنىش ئۈچۈن ، مەڭگۈلۈك كۆچۈرۈلگەن چوڭ سىستېرنا (CM) زەمبىرەك بىلەن ئاڭلىق چاشقانلاردا تەكشۈرۈش ئېلىپ بېرىلدى.مۇھىمى ، بۇ ئۇسۇل چوڭ مېڭە قان تومۇرىدىن ھالقىغان توشۇش پائالىيىتى بىلەن مېڭىنى نىشان قىلىدىغان ۋە پېپتىدلارنى تاللايدۇ.بىز كىچىكلىكى (~ 60 nm) 10 بولغانلىقتىن T7 باسقۇچلىرىنى ئىشلەتتۇق ۋە ئۇلارنىڭ بالىياتقۇ ئىچكى پەردىسى ۋە ياكى ئېپىتېلىيە-مېدۇللا توسىقىدىن ھالقىپ ئۆتەلەيدىغان تومۇرلارنى توشۇشقا ماس كېلىدىغانلىقىنى ئوتتۇرىغا قويدۇق.تۆت ئايلانما تەكشۈرۈشتىن كېيىن ، باسقۇچلۇق كىشىلەر ئايرىۋېتىلگەن بولۇپ ، vivo CSF ​​موللاش ۋە چوڭ مېڭە مىكرو ئېلېمېنتلار بىرلەشمىسىدە كۈچلۈك ئىپادىلەنگەن.مۇھىمى ، بىز ئەڭ ياخشى كۆرىدىغان ۋە خىمىيىلىك بىرىكتۈرۈلگەن ئەڭ ياخشى كاندىدات پېپتىدلارنىڭ ئاقسىل يۈكلىرىنى چوڭ مېڭە سۇيۇقلۇقىغا توشۇيدىغانلىقىنى كۆرسىتىپ ، بايقاشلىرىمىزنى ئىسپاتلىيالىدۇق.ئالدى بىلەن ، CNS نىڭ دورىلىق دىنامىكىلىق رولى ئالدىنقى قاتاردىكى ئۆتكۈنچى پېپتىد بىلەن BACE1 پېپتىدنىڭ چەكلىگۈچىنى بىرلەشتۈرۈش ئارقىلىق قۇرۇلدى.Vivo ئىقتىدار تەكشۈرۈش ئىستراتېگىيىسىدە يېڭى مېڭە توشۇش پېپتىدلىرىنى ئۈنۈملۈك ئاقسىل يۈك توشۇغۇچى دەپ پەرقلەندۈرەلەيدىغانلىقىنى نامايەن قىلغاندىن باشقا ، بىزمۇ مۇشۇنىڭغا ئوخشاش ئىقتىدار تاللاش ئۇسۇلىنىڭ يېڭى مېڭە توشۇش يولىنى پەرقلەندۈرۈشتە موھىم بولۇشىنى ئۈمىد قىلىمىز.
تاختاي شەكىللەندۈرۈش ئورۇنلىرى (PFU) نى ئاساس قىلىپ ، باسقۇچلۇق ئوراپ قاچىلاش باسقۇچىدىن كېيىن ، تەخمىنەن 109 خىل كۆپ خىللىق تاسادىپىي 12-mer سىزىقلىق T7 فازا پېپتىد كۇتۇپخانىسى لايىھەلەنگەن ۋە قۇرۇلدى (ماتېرىيال ۋە ئۇسۇلغا قاراڭ).دىققەت قىلىشقا تېگىشلىكى شۇكى ، بىز vivo ئامبىرىدا بۇ كۇتۇپخانىنى ئەستايىدىل تەھلىل قىلغان.PCR كۈچەيتىلگەن باسقۇچلۇق كۇتۇپخانا ئەۋرىشكىسىنى ئىشلىتىپ ، HTS غا بىۋاسىتە ماس كېلىدىغان ئامپلون ھاسىل قىلدى (قوشۇمچە رەسىم 1a).A) HTS11 تەرتىپلەش خاتالىقى ، b) پىرىمېرلارنىڭ سۈپىتىگە تەسىر كۆرسىتىش (NNK) 1-12 ، ۋە c) كۈتۈپخانىدا ياۋا تىپتىكى (wt) فازا (ئىسكىلىت قىستۇرمىسى) نىڭ بولۇشى ، تەرتىپلىك سۈزۈش تەرتىپى يولغا قويۇلۇپ ، پەقەت دەلىللەنگەن تەرتىپ ئۇچۇرلىرىلا چىقىرىلدى (قوشۇمچە رەسىم 1b).بۇ سۈزگۈچ باسقۇچلار بارلىق HTS تەرتىپلىك كۈتۈپخانىلارغا ماس كېلىدۇ.ئۆلچەملىك كۇتۇپخانىغا جەمئىي 233 مىڭ 868 پارچە ئوقۇشقا ئېرىشكەن ، بۇنىڭ% 39 ى سۈزگۈچ ئۆلچىمىدىن ئۆتۈپ ، كېيىنكى باسقۇچلار ئۈچۈن كۇتۇپخانا ئانالىزى ۋە تاللاشقا ئىشلىتىلگەن (قوشۇمچە 1c - e).بۇ ئوقۇشلار ئاساسەن ئۇزۇنلۇقى 3 ئاساسى جۈپ بولۇپ ، چوققا چوققىسى 36 يادرو (قوشۇمچە رەسىم 1c) بولۇپ ، كۈتۈپخانىنىڭ لايىھىلىنىشى (NNK) 1-12.تىلغا ئېلىشقا ئەرزىيدىغىنى ، تەخمىنەن% 11 كۇتۇپخانا ئەزالىرىدا 12 ئۆلچەملىك ياۋا تىپتىكى (wt) ئومۇرتقا تۈۋرۈكى PAGISRELVDKL قىستۇرۇلغان بولۇپ ، تەرتىپنىڭ يېرىمى دېگۈدەك (% 49) قىستۇرما ياكى ئۆچۈرۈلگەن.كۇتۇپخانا كۈتۈپخانىسىنىڭ HTS كۇتۇپخانىدىكى پېپتىدلارنىڭ كۆپ خىللىقىنى ئىسپاتلىدى: پېپتىد تەرتىپىنىڭ% 81 تىن كۆپرەكى پەقەت بىرلا قېتىم تېپىلغان ، پەقەت 1.5% ≥ 4 نۇسخا يۈز بەرگەن (قوشۇمچە 2a رەسىم).رېپېرتوردىكى 12 ئورۇننىڭ ھەممىسىدە ئامىنو كىسلاتاسىنىڭ (aa) چاستوتىسى بۇزۇلغان NKK مۇزىكا ئەترىتىنىڭ ھاسىل قىلغان كود سانىغا مۆلچەرلەنگەن چاستوتا بىلەن ياخشى مۇناسىۋەتلىك (قوشۇمچە 2b رەسىم).بۇ قىستۇرمىلار كودلاشتۇرۇلغان a قالدۇقلىرىنىڭ كۆزىتىلگەن چاستوتىسى ھېسابلانغان چاستوتا (r = 0.893) بىلەن ياخشى مۇناسىۋەتلىك (قوشۇمچە 2c رەسىم).ئوكۇل ئۈچۈن باسقۇچلۇق كۈتۈپخانىلارنى تەييارلاش ئېندوكسىننى كۈچەيتىش ۋە يوقىتىش باسقۇچلىرىنى ئۆز ئىچىگە ئالىدۇ.بۇ ئىلگىرى باسقۇچلۇق كۈتۈپخانىلارنىڭ كۆپ خىللىقىنى تۆۋەنلىتىدىغانلىقى كۆرسىتىلدى.شۇڭلاشقا ، بىز ئېندوكسىننى ئېلىۋەتكەن تەخسە كۈچەيتىلگەن فازا كۈتۈپخانىسىنى رەتلەپ ، ئۇنى ئەسلى كۇتۇپخانا بىلەن سېلىشتۇرۇپ ، AA نىڭ چاستوتىنى مۆلچەرلىدۇق.ئەسلى كۆلچەك بىلەن كۈچەيتىلگەن ۋە ساپلاشتۇرۇلغان كۆلچەك ئوتتۇرىسىدا كۈچلۈك باغلىنىشلىق (r = 0.995) بايقالغان (قوشۇمچە 2d رەسىم) ، بۇ T7 باسقۇچى ئارقىلىق تەخسىلەردە كۈچەيتىلگەن كلونلار ئوتتۇرىسىدىكى رىقابەتنىڭ بىر تەرەپلىمە قاراشنى كەلتۈرۈپ چىقارمىغانلىقىنى كۆرسىتىپ بېرىدۇ.بۇ سېلىشتۇرۇش ھەر بىر كۇتۇپخانىدىكى تىرىپتىد موتىفنىڭ چاستوتىسىنى ئاساس قىلغان ، چۈنكى كۇتۇپخانىلارنىڭ كۆپ خىللىقى (~ 109) ھەتتا HTS بىلەنمۇ تولۇق تۇتۇلمايدۇ.ھەر بىر ئورۇندىكى چاستوتا ئانالىزى كىرگۈزۈلگەن رېپېرتورنىڭ ئاخىرقى ئۈچ ئورنىدىكى كىچىك ئورۇنغا باغلىق بىر تەرەپلىمە قاراشنى ئاشكارىلىدى (قوشۇمچە 2-رەسىم).خۇلاسە قىلغاندا ، بىز كۇتۇپخانىنىڭ سۈپىتى ۋە كۆپ خىللىقىنى قوبۇل قىلىشقا بولىدىغانلىقى ، بىر نەچچە باسقۇچلۇق تاللاش باسقۇچىدىكى باسقۇچلۇق كۈتۈپخانىلارنىڭ كۈچەيتىلىشى ۋە تەييارلىنىشى سەۋەبىدىن كۆپ خىللىقنىڭ كىچىككىنە ئۆزگىرىشى كۆرۈلگەنلىكىنى يەكۈنلىدۇق.
تەرتىپلىك چوڭ مېڭە سۇيۇقلۇقى ئەۋرىشكىسىنى ئوپېراتسىيە ئارقىلىق ئاڭلىق چاشقاننىڭ CM غا كۆچۈرۈپ ، BBB ۋە / ياكى BCSFB ئارقىلىق تومۇرغا ئوكۇل قىلىنغان T7 باسقۇچنى پەرقلەندۈرۈشكە قۇلايلىق يارىتىشقا بولىدۇ (رەسىم 1a-b).بىز vivo تاللاشتا ئالدىنقى ئۈچ ئايلانما مۇسابىقىدە ئىككى مۇستەقىل تاللاش قورالى (A ۋە B) نى ئىشلەتتۇق (رەسىم 1c).ئالدىنقى ئۈچ باسقۇچلۇق تاللاشتا تونۇشتۇرۇلغان باسقۇچنىڭ ئومۇمىي مىقدارىنى ئازايتىش ئارقىلىق تاللاشنىڭ قاتتىقلىقىنى تەدرىجىي ئاشۇردۇق.تۆتىنچى ئايلانما قازان ئۈچۈن ، بىز A ۋە B تارماق شاخلارنىڭ ئەۋرىشكىسىنى بىرلەشتۈرۈپ ، ئۈچ مۇستەقىل مۇستەقىل تاللاش ئېلىپ باردۇق.بۇ مودېلدىكى T7 فازا زەررىچىلىرىنىڭ vivo خۇسۇسىيىتىنى تەتقىق قىلىش ئۈچۈن ، قۇيرۇق تومۇرى ئارقىلىق ياۋا تىپتىكى فازا (PAGISRELVDKL ئۇستا قىستۇرمىسى) چاشقانغا ئوكۇل قىلىندى.ئوخشىمىغان ۋاقىت نۇقتىلىرىدا چوڭ مېڭە سۇيۇقلۇقى ۋە قاندىكى باسقۇچلارنىڭ ئەسلىگە كېلىشى بىر قەدەر كىچىك T7 مۇزسىمان باسقۇچنىڭ قان بۆلۈمىدىن دەسلەپكى تازىلاش باسقۇچىنىڭ بارلىقىنى كۆرسەتتى (قوشۇمچە 3-رەسىم).باشقۇرۇلىدىغان ماتىرىياللار ۋە چاشقانلارنىڭ قان مىقدارىغا ئاساسەن ، بىز پەقەت% 1 wt دەپ ھېسابلىدۇق.قاندىكى ئوكۇل ئوكۇلى ئوكۇل قىلىنىپ 10 مىنۇتتىن كېيىن قاندا بايقالغان.بۇ دەسلەپكى تېز سۈرئەتتە تۆۋەنلىگەندىن كېيىن ، ئاستا-ئاستا دەسلەپكى تازىلاش يېرىم ئۆمرى 27.7 مىنۇت بىلەن ئۆلچەنگەن.مۇھىمى ، CSF بۆلۈمىدىن پەقەت ناھايىتى ئاز بىر قىسىم باسقۇچلارلا يىغىۋېلىندى ، بۇ ياۋا تىپتىكى باسقۇچلارنىڭ CSF بۆلۈمچىسىگە كۆچۈشىنىڭ تۆۋەن ئارقا كۆرۈنۈشىنى كۆرسىتىپ بەردى (قوشۇمچە 3-رەسىم).ئوتتۇرا ھېساب بىلەن ، پۈتۈن ئەۋرىشكە مەزگىلىدە (0-250 مىنۇت) چوڭ مېڭە سۇيۇقلۇقىدا قاندىكى T7 باسقۇچنىڭ تەخمىنەن 1 x 10-3% لىك T7 باسقۇچلىرى ۋە دەسلەپكى 4% 10-8% دەسلەپكى قەدەمدە يۇقۇملانغان باسقۇچلار بايقالغان.دىققەت قىلىشقا ئەرزىيدىغىنى ، چوڭ مېڭە سۇيۇقلۇقىدىكى ياۋا تىپتىكى فازانىڭ يېرىم ئۆمرى (25.7 مىنۇت) قاندىكىگە ئوخشاش.بۇ سانلىق مەلۇماتلار CSF بۆلۈمىنىڭ قان بىلەن ئايرىلىشىدىكى توساقنىڭ CM ئارقىلىق ياسالغان چاشقانلاردا مۇكەممەل ئىكەنلىكىنى كۆرسىتىپ بېرىدۇ ، vivo ئارقىلىق فازا كۈتۈپخانىلىرىنى تاللىغاندا ، قاندىن CSF بۆلۈمىگە ئاسانلا توشۇلىدىغان كلونلارنى پەرقلەندۈرگىلى بولىدۇ.
(1) چوڭ كۆلچەكتىن چوڭ مېڭە سۇيۇقلۇقى (CSF) نى قايتا ئەۋرىشكە ئېلىش ئۇسۇلىنى ئورنىتىش.(2) مەركىزى نېرۋا سىستېمىسى (CNS) توسىقىنىڭ ھۈجەيرە ئورنى ۋە قان-مېڭە توسىقى (BBB) ​​ۋە قان-مېڭە توسىقىدىن ھالقىغان پېپتىدلارنى پەرقلەندۈرۈشتە قوللىنىلغان تاللاش ئىستراتېگىيىسى كۆرسىتىلگەن دىئاگرامما.(3) vivo باسقۇچلۇق كۆرسىتىش ئېكرانىدا.ھەر بىر تاللاش باسقۇچىدا باسقۇچلار (ئوق ئىچىدىكى ھايۋان پەرقلىگۈچىلەر) تومۇرغا ئوكۇل قىلىندى.مۇستەقىل مۇستەقىل ئىككى شاخ (A, B) 4-باسقۇچلۇق تاللاشقىچە ئايرىم ساقلىنىدۇ.3-ۋە 4-باسقۇچلۇق تاللاش ئۈچۈن ، CSF دىن ئېلىنغان ھەر بىر باسقۇچلۇق كلون قولدا تەرتىپلەندى.(4) T7 پېپتىد كۈتۈپخانىسىغا (2 x 1012 باسقۇچ / ھايۋان) تومۇردىن ئوكۇل قىلىنغاندىن كېيىن ، ئىككى تال چاشقاننى تاللاشتا بىرىنچى باسقۇچلۇق تاللاش جەريانىدا قان (قىزىل چەمبىرەك) ۋە چوڭ مېڭە سۇيۇقلۇقى (يېشىل ئۈچبۇلۇڭ) دىن ئايرىلغان فازا ھەرىكەتلىرى.كۆك كۋادرات قاننىڭ ئومۇمىي مىقدارىنى ئويلاشقاندا ، ئوكۇل قىلىنغان باسقۇچنىڭ مىقدارىدىن ھېسابلانغان قاندىكى ئوتتۇرىچە دەسلەپكى قويۇقلۇقىنى كۆرسىتىدۇ.قارا كۋادراتلار قان باسقۇچىنىڭ قويۇقلۇقىدىن چىقىرىۋېتىلگەن y سىزىقنىڭ كېسىشىش نۇقتىسىنى كۆرسىتىدۇ..1000 ئوقۇشلۇقتا تېپىلغان نەقىشلەرنىڭ سانى كۆرسىتىلدى.كۆرۈنەرلىك (p <0.001) موللاشتۇرۇلغان نەقىشلەرگە قىزىل چېكىتلەر يېزىلغان.(5) ئوكۇل قىلىنغان كۇتۇپخانىنىڭ ترىپتېپتىد موتىفنىڭ نىسپىي چاستوتىسىنى سېلىشتۇرۇش 1.1 ۋە # 1.2.(6) قان ۋە مېڭە سۇيۇقلۇقىدا ئايرىۋېتىلگەن ھايۋانلارنىڭ فازا ترىپتېپتىد موتىفلىرىنىڭ نىسپىي چاستوتىنى سېلىشتۇرۇش باغلىنىشى.(g)بىر ھەرىپلىك كودنىڭ چوڭ-كىچىكلىكى شۇ ئورۇندا ئامىنو كىسلاتاسىنىڭ قانچە قېتىم پەيدا بولىدىغانلىقىنى كۆرسىتىپ بېرىدۇ.يېشىل = قۇتۇپ ، بىنەپشە = نېيترال ، كۆك = ئاساسىي ، قىزىل = كىسلاتالىق ۋە قارا = گىدروپوبىك ئامىنو كىسلاتاسى.1a ، b رەسىمنى Eduard Urich لايىھىلىگەن ۋە ئىشلەپچىقارغان.
بىز بىر باسقۇچلۇق پېپتىد كۈتۈپخانىسىنى ئىككى CM ئەسۋاب چاشقىنىغا (A ۋە B كلاسسىك) ئوكۇل قىلىپ ، چوڭ مېڭە سۇيۇقلۇقى ۋە قاندىن ئايرىپ تاشلىدۇق (1d رەسىم).كۇتۇپخانىنىڭ دەسلەپكى تېز تازىلىنىشى ياۋا تىپتىكى باسقۇچقا سېلىشتۇرغاندا ئانچە كۆرۈنەرلىك ئەمەس.ھەر ئىككى ھايۋانغا ئوكۇل قىلىنغان كۇتۇپخانىنىڭ ئوتتۇرىچە ئۆمرى 24.8 مىنۇت بولۇپ ، ياۋا تىپتىكى باسقۇچقا ئوخشايدۇ ، CSF دە 38.5 مىنۇت.ھەر بىر ھايۋاننىڭ قېنى ۋە چوڭ مېڭە سۇيۇقلۇقى فازا ئەۋرىشكىسى HTS نىڭ تەسىرىگە ئۇچرىغان بولۇپ ، ئېنىقلانغان پېپتىدلارنىڭ ھەممىسىدە قىسقا ئۈچبۇلۇڭلۇق نەقىش بارلىقى ئانالىز قىلىنغان.Tripeptide نەقىشلىرى تاللانغان ، چۈنكى ئۇلار قۇرۇلما شەكىللىنىش ۋە پېپتىد-ئاقسىل ئۆز-ئارا تەسىر كۆرسىتىش ئۈچۈن ئەڭ تۆۋەن ئاساس بىلەن تەمىنلەيدۇ.بىز ئوكۇل قىلىنغان فازا كۈتۈپخانىسى بىلەن ھەر ئىككى ھايۋاننىڭ قېنىدىن ئېلىنغان كلونلار ئارىسىدا نەقىشلەرنىڭ تارقىلىشىدا ياخشى باغلىنىشنى بايقىدۇق (1e رەسىم).سانلىق مەلۇماتلاردا كۆرسىتىلىشىچە ، كۈتۈپخانىنىڭ تەركىبى پەقەت قان بۆلۈمىدە ئازراقلا بېيىغان.Weblogo16 يۇمشاق دېتالىنىڭ ماسلىشىشى ئارقىلىق ھەر بىر ئورۇندا ئامىنو كىسلاتا چاستوتىسى ۋە ئورتاق تونۇش تەرتىپى يەنىمۇ تەھلىل قىلىندى.قىزىقارلىق يېرى ، بىز قاندىكى گلىكسىن قالدۇقىدا كۈچلۈك بېيىشنى بايقىدۇق (رەسىم 1g).قاننى CSF دىن تاللانغان كلونلار بىلەن سېلىشتۇرغاندا ، كۈچلۈك تاللاش ۋە نەقىشلەرنىڭ بىر قىسىم يوقىتىلىشى كۆرۈلگەن (1-رەسىم) ، بەزى ئامىنو كىسلاتالىرى 12 ئەزانىڭ ئالدىن بېكىتىلگەن ئورۇنلىرىدا ئەڭ ياخشىسى بار (1h رەسىم).دىققەت قىلىشقا ئەرزىيدىغىنى ، يەككە ھايۋانلار چوڭ مېڭە سۇيۇقلۇقىدا كۆرۈنەرلىك پەرقلىنىدۇ ، ھالبۇكى ھەر ئىككى ھايۋاندا قاندىكى گلىكسىننىڭ موللىنىشى كۆرۈلدى (قوشۇمچە 4a - j).# 1.1 ۋە # 1.2 ھايۋانلارنىڭ چوڭ مېڭە سۇيۇقلۇقىدىكى تەرتىپ سانلىق مەلۇماتلىرىنى قاتتىق سۈزگەندىن كېيىن ، جەمئىي 964 ۋە 420 ئۆزگىچە 12 مېر پېپتىدقا ئېرىشتى (قوشۇمچە رەسىم 1d - e).ئايرىۋېتىلگەن فازا كلونلىرى كۈچەيتىلگەن ۋە vivo تاللاشتا ئىككىنچى باسقۇچلۇق بولغان.ئىككىنچى باسقۇچلۇق تاللاشتىن ئېلىنغان باسقۇچ ھەر بىر ھايۋاندا HTS نىڭ تەسىرىگە ئۇچرىغان بولۇپ ، ئېنىقلانغان پېپتىدلارنىڭ ھەممىسى موتىف پەرقلەندۈرۈش پروگراممىسىغا كىرگۈزۈلۈپ ، ترىپتېپتىد موتىفنىڭ پەيدا بولغانلىقىنى تەھلىل قىلغان (2a رەسىم ، b ، ef).CSF دىن ئەسلىگە كەلتۈرۈلگەن باسقۇچنىڭ بىرىنچى دەۋرىگە سېلىشتۇرغاندا ، بىز A ۋە B تارماق ئاپپاراتلاردا CSF دىكى نۇرغۇن نەقىشلەرنىڭ تېخىمۇ كۆپ تاللىنىشى ۋە ئۆچۈرۈلگەنلىكىنى كۆردۇق (2-رەسىم).تور پەرقلەندۈرۈش ھېسابلاش ئۇسۇلى قوللىنىلىپ ، ئۇلارنىڭ ئوخشاش بولمىغان تەرتىپنىڭ ئوخشىمىغان ئەندىزىسىگە ۋەكىللىك قىلىدىغان ياكى قىلىنمايدىغانلىقى ئېنىقلاندى.CSF تەرىپىدىن ئەسلىگە كەلتۈرۈلگەن 12 ئۆلچەملىك تەرتىپنىڭ A (2c رەسىم ، d) ۋە B گۇرۇپپىدا ئېنىق ئوخشاشلىقى بايقالدى (2g ، h).ھەر بىر تارماقتىكى بىرلەشتۈرۈلگەن ئانالىزدا 12 مېر پېپتىد (قوشۇمچە رەسىم 5c ، d) نىڭ ئوخشىمىغان تاللاش ئارخىپى ۋە بىرىنچى باسقۇچلۇق تاللاش بىلەن سېلىشتۇرغاندا ئىككىنچى باسقۇچلۇق تاللاشتىن كېيىن بىرلەشتۈرۈلگەن كلونلارنىڭ ۋاقىتنىڭ ئۆتۈشىگە ئەگىشىپ CSF / قان دەرىجىسىنىڭ ئۆسۈشى ئاشكارىلاندى (قوشۇمچە 5e رەسىم).).
چوڭ مېڭە سۇيۇقلۇقىدىكى موتىف ۋە پېپتىدلارنى vivo فۇنكسىيەلىك باسقۇچلۇق تاللاشتا ئۇدا ئىككى ئايلانما بېيىتىش.
ھەر بىر ھايۋاننىڭ بىرىنچى ئايلانمىسىدىن ئەسلىگە كەلتۈرۈلگەن چوڭ مېڭە سۇيۇقلۇقى باسقۇچلىرى (ھايۋانلار # 1.1 ۋە # 1.2) بىرلەشتۈرۈلۈپ ، كۈچەيتىلگەن ، HT تەرتىپلىك ۋە قايتا بىرلەشتۈرۈلگەن (2 x 1010 باسقۇچ / ھايۋان) 2 SM كاناي چاشقان (# 1.1 → #).2.1 ۋە 2.2 ، 1.2 → 2.3 ۋە 2.4).a)نەقىشلەرنىڭ نىسپىي چاستوتىسى ۋە تارقىلىشى ھەر ئىككى يۆنىلىشتىكى پېپتىدتىن تېپىلغان بارلىق قاپلىنىشچان ئۈچبۇلۇڭنى كۆرسىتىدۇ.1000 ئوقۇشلۇقتا تېپىلغان نەقىشلەرنىڭ سانى كۆرسىتىلدى.سېلىشتۇرما كۇتۇپخانىلارنىڭ بىرىدە كۆرۈنەرلىك ياكى تاللانغان (p <0.001) نەقىشلەر قىزىل چېكىت بىلەن گەۋدىلىنىدۇ..بىر ھەرىپلىك كودنىڭ چوڭ-كىچىكلىكى شۇ ئورۇندا ئامىنو كىسلاتاسىنىڭ قانچە قېتىم پەيدا بولىدىغانلىقىنى كۆرسىتىپ بېرىدۇ.لوگوغا ۋەكىللىك قىلىش ئۈچۈن ، ئىككى تاللاش ئايلانما ئارىلىقىدىكى يەككە ھايۋانلاردىن ئېلىنغان CSF تەرتىپلىرىنىڭ چاستوتىسى سېلىشتۇرۇلۇپ ، ئىككىنچى باسقۇچتىكى موللاشتۇرۇلغان تەرتىپلەر كۆرسىتىلدى: (c) # 1.1– # 2.1 (d) # 1.1– # 2.2 (g) # 1.2– # 2.3 ۋە (h) # 1.2– # 2.4.(C, d) ھايۋانلاردىكى مەلۇم ئورۇندا ئەڭ مول بولغان ئامىنو كىسلاتاسى.2.1 and no.2.2 ياكى (g, ​​h) ھايۋانلاردا.2.3 and no.2.4 رەڭدە كۆرسىتىلدى.يېشىل = قۇتۇپ ، بىنەپشە = نېيترال ، كۆك = ئاساسىي ، قىزىل = كىسلاتالىق ۋە قارا = گىدروپوبىك ئامىنو كىسلاتاسى.
ئۈچىنچى باسقۇچلۇق تاللاشتىن كېيىن ، بىز ئىككى ھايۋاندىن ئايرىۋېتىلگەن 332 CSF قايتا قۇرۇلغان فازا كلوندىن 124 ئۆزگىچە پېپتىد تەرتىپىنى (# 3.1 ۋە # 3.2) ئېنىقلىدۇق (قوشۇمچە 6a رەسىم).رەت تەرتىپى LGSVS (% 18.7) نىڭ نىسپىي نىسبىتى ئەڭ يۇقىرى ، ئۇنىڭدىن قالسا ياۋا تىپتىكى قىستۇرمىلار PAGISRELVDKL (% 8.2) ، MRWFFSHASQGR (% 3) ، DVAKVS (% 3) ، TWLFSLG (% 2.2) ۋە SARGSWREIVSLS (% 2.2).ئەڭ ئاخىرقى تۆتىنچى ئايلانما مۇسابىقىدە ، بىز ئايرىم ئۈچ ھايۋاندىن مۇستەقىل تاللانغان ئىككى شاخنى بىرلەشتۈردۇق (رەسىم 1c).CSF دىن ئەسلىگە كەلتۈرۈلگەن 925 تەرتىپلىك باسقۇچلۇق كلون ئىچىدە ، تۆتىنچى ئايلانمىدا بىز 64 ئۆزگىچە پېپتىد تەرتىپىنى بايقىدۇق (قوشۇمچە 6b رەسىم) ، بۇنىڭ ئىچىدە ياۋا تىپتىكى باسقۇچنىڭ نىسپىي نىسبىتى% 0.8 كە چۈشۈپ قالدى.تۆتىنچى ئايلانمىدا ئەڭ كۆپ ئۇچرايدىغان CSF كلونلىرى LYVLHSRGLWGFKLAAALE (% 18) ، LGSVS (17%) ، GFVRFRLSNTR (% 14) ، KVAWRVFSLFWK (7%) ، SVHGV (5%) ، GRPQKINGARVC (3.6%) ۋە RLS.%)).تاللانغان پېپتىدلارنىڭ ئۇزۇنلۇقى NNK كۈتۈپخانىسىنىڭ لايىھىلىنىشىدە بۇزۇلغان كودلارنى ئىشلەتكەندە ، كۇتۇپخانا باشلىغۇچلىرىدىكى يادرونى قىستۇرۇش / ئۆچۈرۈش ياكى مۇددەتتىن بۇرۇن توختىتىش كودى سەۋەبىدىن بولىدۇ.مۇددەتتىن بۇرۇن توختايدىغان كودلار قىسقا پېپتىد ھاسىل قىلىدۇ ۋە ئۇنىڭدا پايدىلىق a موتىف بولغانلىقى ئۈچۈن تاللىنىدۇ.ئۇزۇن پېپتىدلار بىرىكمە كۈتۈپخانىلارنىڭ باش قىسمىغا قىستۇرۇلۇش ياكى ئۆچۈرۈشتىن كېلىپ چىقىشى مۇمكىن.بۇ لايىھەلەنگەن توختاش كودىنى رامكىنىڭ سىرتىغا قويۇپ ، تۆۋەنكى ئېقىندا يېڭى توختاش كودى كۆرۈنگۈچە ئوقۇيدۇ.ئادەتتە ، بىز كىرگۈزۈش سانلىق مەلۇماتلىرىنى ئەۋرىشكە چىقىرىش سانلىق مەلۇماتلىرى بىلەن سېلىشتۇرۇش ئارقىلىق تۆت تاللاشنىڭ ھەممىسىنىڭ بېيىش ئامىللىرىنى ھېسابلىدۇق.بىرىنچى باسقۇچلۇق تەكشۈرۈش ئۈچۈن ، بىز ياۋا تىپتىكى فازا تىترىتىنى ئالاھىدە بولمىغان ئارقا كۆرۈنۈش سۈپىتىدە قوللاندۇق.قىزىقارلىق يېرى ، تۇنجى CSF دەۋرىدە مەنپىي باسقۇچنى تاللاش ئىنتايىن كۈچلۈك بولغان ، ئەمما قاندا ئەمەس (3a رەسىم) ، بۇ بەلكىم پېپتىد كۈتۈپخانىسىنىڭ كۆپ قىسىم ئەزالىرىنىڭ CSF بۆلۈمچىسىگە پاسسىپ تارقىلىش ئېھتىماللىقىنىڭ تۆۋەن بولۇشى ياكى مۇناسىۋەتلىك باسقۇچلارنىڭ باكتېرىيەگە قارىغاندا تېخىمۇ ئۈنۈملۈك ساقلىنىشى ياكى چىقىرىۋېتىلىشى مۇمكىن.قانداقلا بولمىسۇن ، ئىككىنچى باسقۇچلۇق تاختايدا ، ھەر ئىككى گۇرۇپپىدا CSF دىكى باسقۇچلارنىڭ كۈچلۈك تاللىنىشى كۆرۈلدى ، بۇ ئالدىنقى ئايلانمىنىڭ CSF نىڭ قوبۇل قىلىنىشىنى ئىلگىرى سۈرىدىغان پېپتىدلارنى كۆرسىتىدىغان باسقۇچلاردا بېيىغانلىقىنى كۆرسىتىپ بېرىدۇ (3a رەسىم).يەنە كېلىپ ، كۆرۈنەرلىك قان موللاشمىغان.ئۈچىنچى ۋە تۆتىنچى ئايلانما مۇسابىقىدە ، باسقۇچلۇق كلونلار CSF دا كۆرۈنەرلىك بېيىدى.يېقىنقى ئىككى ئايلانما تاللاش ئارىسىدىكى ھەر بىر ئۆزگىچە پېپتىد تەرتىپىنىڭ نىسپىي چاستوتىسىنى سېلىشتۇرۇپ ، تۆتىنچى باسقۇچلۇق تاللاشتا بۇ تەرتىپنىڭ تېخىمۇ بېيىغانلىقىنى بايقىدۇق (3b رەسىم).پېپتىد يۆنىلىشىدىن پايدىلىنىپ 64 ئۆزگىچە پېپتىد تەرتىپىنىڭ ھەممىسىدىن جەمئىي 931 تىرىپتىد نەقىش ئېلىنغان.تۆتىنچى ئايلانمىدىكى ئەڭ مول مەزمۇنلۇق نەقىشلەر ئوكۇل قىلىنغان كۇتۇپخانىغا سېلىشتۇرغاندا (ئۈزۈلۈپ قېلىش:% 10 بېيىتىش) (6-قوشۇمچە رەسىم) گە سېلىشتۇرغاندا ، ئۇلارنىڭ ھەرقايسى تەرەپلەردىكى بېيىش ئارخىپى تېخىمۇ ئىنچىكە تەكشۈرۈلدى.ئومۇمىي تاللاش ئەندىزىسىدە كۆرسىتىلىشچە ، تەتقىق قىلىنغان مۇددىئالارنىڭ كۆپىنچىسى ئالدىنقى ئىككى باسقۇچتىكى بارلىق تاللاش تارماقلىرىدا بېيىغان.قانداقلا بولمىسۇن ، بەزى نەقىشلەر (مەسىلەن SGL ، VSG ، LGS GSV) ئاساسلىقى A گۇرۇپپىدىن كەلگەن ، يەنە بەزىلىرى (مەسىلەن FGW ، RTN ، WGF ، NTR) B گۇرۇپپىدا بېيىغان.
CSF موللاشتۇرۇلغان باسقۇچلۇق پېپتىد ۋە بىئوتىن بىرىكتۈرۈلگەن لىدېر پېپتىدلارنىڭ سترېپتاۋىدىن يۈك يۈكىگە تۇتاشتۇرۇلغان CSF تىرانسپورتىنى دەلىللەش.
(a) ئوكۇل (كىرگۈزۈش = I) باسقۇچ (PFU) ئۆلچىمى ۋە بېكىتىلگەن CSF باسقۇچلۇق بەلگە (چىقىرىش = O) ئاساسىدا تۆت ئايلانما (R1-R4) نىڭ ھەممىسىدە ھېسابلانغان بېيىش نىسبىتى.يېقىنقى ئۈچ ئايلانما (R2-R4) نىڭ بېيىش ئامىلى ئالدىنقى ئايلانما ۋە بىرىنچى ئايلانما (R1) بىلەن ئېغىرلىق سانلىق مەلۇماتلىرى بىلەن سېلىشتۇرۇش ئارقىلىق ھېسابلىنىدۇ.ئوچۇق بالداق چوڭ مېڭە سۇيۇقلۇقى ، سايە تاياقچە پلازما.(*** p <0.001 ، ئوقۇغۇچىلارنىڭ T سىنىقىغا ئاساسەن).(2) 4-باسقۇچلۇق تاللاشتىن كېيىن CSF دا توپلانغان بارلىق باسقۇچلارنىڭ نىسپىي نىسبىتىگە ئاساسەن رەتكە تىزىلغان ئەڭ مول فازا پېپتىدلىرى تىزىملىكى.ئەڭ كۆپ ئۇچرايدىغان ئالتە باسقۇچلۇق كلون رەڭ (سان) ۋە تاللاشنىڭ 3-ۋە 4-ئايلانمىلىرى ئارىسىدىكى رەڭ ، سان ۋە ئۇلارنىڭ بېيىش ئامىللىرى بىلەن گەۋدىلىنىدۇ..كۆرسىتىلگەن ۋاقىت نۇقتىلىرىدا CSF ۋە قان ئەۋرىشكىسى توپلاندى..ۋاقىتنىڭ ئۆتۈشىگە ئەگىشىپ ھەر بىر ئوكۇل قىلىنغان فازا كلون ۋە فازا پېپتىد كۈتۈپخانىسىنىڭ CSF دورىگەرلىكى كۆرسىتىلدى.(4) ئەۋرىشكە ئېلىنغان ۋاقىتتىكى ئەسلىگە كەلگەن بارلىق باسقۇچلارنىڭ ئوتتۇرىچە CSF / قان نىسبىتىنى كۆرسىتىدۇ.(5) تۆت خىل بىرىكمە رەھبەر پېپتىد ۋە بىر تال تىزگىنەك كونترول قىلىش ئۇلارنىڭ N تېرمىنالى (تېترامېر ئېكرانى) ئارقىلىق بىئوتىن بىلەن سترېپتاۋىدېنغا ئۇلانغاندىن كېيىن ئوكۇل (قۇيرۇق تومۇر iv ، 10 mg streptavidin / kg).كەم دېگەندە ئۈچ يوشۇرۇن چاشقان (N = 3).).CSF ئەۋرىشكىسى كۆرسىتىلگەن ۋاقىت نۇقتىسىدا يىغىۋېلىندى ۋە سترېپتاۋىدىن قويۇقلۇقى CSF سترېپتاۋىدىن ELISA تەرىپىدىن ئۆلچەندى (nd = بايقالمىدى).(* p <0.05 ، ** p <0.01 ، *** p <0.001 ، ANOVA سىنىقى ئاساسىدا).(6) 4-باسقۇچلۇق تاللاشتىكى ئەڭ مول بولغان فازا پېپتىد كلون # 2002 (بىنەپشە) نىڭ ئامىنو كىسلاتا تەرتىپىنى سېلىشتۇرۇش.ئوخشاش ۋە ئوخشىشىپ كېتىدىغان ئامىنو كىسلاتا پارچىلىرى رەڭلىك.
تۆتىنچى ئايلانمىدىكى بارلىق بېيىغان باسقۇچلارنىڭ ئىچىدە (3b رەسىم) ، CSF ئەۋرىشكە ئەندىزىسىدە يەنىمۇ ئىلگىرىلىگەن ھالدا تەھلىل قىلىش ئۈچۈن ئالتە كاندىدات كلون تاللاندى.ئوخشاش مىقداردىكى ئالتە كاندىدات باسقۇچى ، قۇرۇق باسقۇچ (قىستۇرۇلمايدۇ) ۋە پېپتىد پېپتىد كۈتۈپخانىلىرى ئۈچ خىل كانايلانغان CM ھايۋانلىرىغا ئوكۇل قىلىندى ، CSF (3c رەسىم) ۋە قان (قوشۇمچە 7-رەسىم) تەكشۈرۈشىدە دورىلىق دورا بېكىتىلدى.سىناق قىلىنغان بارلىق باسقۇچلۇق كلونلار CSF بۆلۈمىنى نىشانلاپ ، قۇرۇق كونترول باسقۇچىنىڭكىدىن 10-1000 ھەسسە يۇقىرى (# 1779).مەسىلەن ، # 2020 ۋە # 2077 كلونلارنىڭ كونترول باسقۇچىغا قارىغاندا 1000 ھەسسە يۇقىرى CSF ئۆلچىمى بار.تاللانغان ھەر بىر پېپتىدنىڭ دورىلىق ئارخىپى ئوخشىمايدۇ ، ئەمما ئۇلارنىڭ ھەممىسىنىڭ يۇقىرى CSF ئۆيگە كىرىش ئىقتىدارى بار.بىز 1903-ۋە # 2011-يىللاردىكى كلونلارنىڭ ۋاقىتنىڭ ئۆتۈشىگە ئەگىشىپ توختىماي تۆۋەنلىگەنلىكىنى كۆردۇق ، ئەمما 2077 ، # 2002 ۋە # 2009-يىللاردىكى كلونلارنىڭ ئالدىنقى 10 مىنۇت ئىچىدە كۆپىيىشى بەلكىم ئاكتىپ قاتناشنى كۆرسىتىشى مۇمكىن ، ئەمما دەلىللەش كېرەك.كلون # 2020 ، # 2002 ۋە # 2077 يۇقىرى سەۋىيىدە مۇقىملاشتى ، دەسلەپكى قەدەمدە ئۆسكەندىن كېيىن 2009-يىلدىكى كلوننىڭ CSF قويۇقلۇقى ئاستا-ئاستا تۆۋەنلىدى.ئاندىن بىز ھەر بىر CSF كاندىداتنىڭ نىسپىي چاستوتىنى ئۇنىڭ قان قويۇقلۇقى بىلەن سېلىشتۇردۇق (3d رەسىم).ھەر قېتىملىق CSF كاندىداتلىرىنىڭ ئوتتۇرىچە قان ئەۋرىشكىسى قان ئەۋرىشكىسى بىلەن مۇناسىۋەتلىك بولۇپ ، ئالتە كاندىداتنىڭ ئۈچىنىڭ قان CSF دا كۆرۈنەرلىك بېيىغانلىقى كۆرسىتىلدى.قىزىقارلىق يېرى ، كلون # 2077 تېخىمۇ يۇقىرى قاننىڭ مۇقىملىقىنى كۆرسەتتى (قوشۇمچە 7-رەسىم).پېپتىدلارنىڭ ئۆزى فازا زەررىچىلىرىدىن باشقا يۈكلەرنى ئاكتىپلىق بىلەن CSF بۆلۈمچىسىگە توشۇش ئىقتىدارىغا ئىگە ئىكەنلىكىنى جەزملەشتۈرۈش ئۈچۈن ، بىز N تېرمىنالىدا پېپتىدلار فازا زەررىچىسىگە تۇتىشىدىغان بىئوتىن بىلەن ھاسىل قىلىنغان تۆت رەھبەر پېپتىدنى بىرىكتۈردۇق.بىئوتىن بىرىكتۈرۈلگەن پېپتىدلار (2002-يىل ، 2009-يىل ، 2020-يىل ۋە 2077-يىللار) سترېپتاۋىدىن (SA) بىلەن بىرىكتۈرۈلۈپ ، فازا گېئومېتىرىيىسىگە تەقلىد قىلىنغان كۆپ خىل شەكىلگە ئېرىشتى.بۇ فورمات يەنە SA نىڭ قان ۋە چوڭ مېڭە سۇيۇقلۇقىدىكى تەسىرىنى توشۇغۇچى ئاقسىل پېپتىدلىرى سۈپىتىدە ئۆلچەشكە شارائىت ھازىرلاپ بەردى.مۇھىمى ، بۇ SA بىرىكتۈرۈلگەن فورماتىدا بىرىكمە پېپتىدلار ئىشلىتىلگەندە ، باسقۇچلۇق سانلىق مەلۇماتلارنى دائىم كۆپەيتكىلى بولىدۇ (3e رەسىم).بىر تەرەپ قىلىنغان پېپتىدلارنىڭ دەسلەپكى ئاشكارلىنىشى ئاز بولۇپ ، 48 سائەت ئىچىدە ئېنىقلىغىلى بولمايدىغان سەۋىيىدىكى CSF تازىلاش سۈرئىتى تېخىمۇ تېز بولغان.بۇ پېپتىد فازا كلونلىرىنىڭ CSF بوشلۇقىغا يەتكۈزۈش يوللىرى ھەققىدە چۈشەنچىگە ئېرىشىش ئۈچۈن ، بىز ئىممۇنىتېت ئوپېراتسىيەسى (IHC) ئارقىلىق يەككە باسقۇچلۇق پېپتىد زەربىسىنىڭ يەرلىكلەشتۈرۈلۈشىنى ئانالىز قىلىپ ، ۋىرۇسقا ئوكۇل ئۇرۇپ 1 سائەتتىن كېيىن فازا زەررىچىلىرىنى بىۋاسىتە بايقىدۇق.دىققەت قىلىشقا ئەرزىيدىغىنى ، 2002-يىلى ، # 2077-ۋە # 2009-يىللاردىكى كلونلار مېڭە قىل قان تومۇرلىرىدا كۈچلۈك داغ پەيدا بولۇپ ، كونترول باسقۇچى (# 1779) ۋە 2020-يىلدىكى كلون بايقالمىغان (قوشۇمچە 8-رەسىم).بۇ بۇ پېپتىدلارنىڭ BBB دىن ئۆتۈش ئارقىلىق مېڭىگە تەسىر كۆرسىتىدىغانلىقىنى كۆرسىتىپ بېرىدۇ.بۇ پەرەزنى سىناش ئۈچۈن تېخىمۇ تەپسىلىي تەھلىل قىلىش تەلەپ قىلىنىدۇ ، چۈنكى BSCFB يولىمۇ قاتناشقان بولۇشى مۇمكىن.ئەڭ مول بولغان كلون (# 2002) نىڭ ئامىنو كىسلاتا تەرتىپىنى باشقا تاللانغان پېپتىدلار بىلەن سېلىشتۇرغاندا ، ئۇلارنىڭ بەزىلىرىنىڭ ئامىنو كىسلاتاسىنىڭ كېڭىيىشىنىڭ ئوخشىشىپ كېتىدىغانلىقى كۆرسىتىلدى ، بۇ بەلكىم مۇشۇنىڭغا ئوخشاش توشۇش مېخانىزمىنى كۆرسىتىشى مۇمكىن (3-رەسىم).
ئۆزگىچە پلازما ئارخىپى ۋە ۋاقىتنىڭ ئۆتۈشىگە ئەگىشىپ CSF نىڭ كۆرۈنەرلىك ئېشىشىغا ئەگىشىپ ، 2077-نومۇرلۇق باسقۇچلۇق كلون تېخىمۇ ئۇزۇن 48 سائەت ئىچىدە تېخىمۇ ئىزدىنىلىپ ، سىجىل SA سەۋىيىسى بىلەن بىرلەشتۈرۈلۈپ كۆزىتىلگەن CSF نىڭ تېز ئېشىشىنى كۆپەيتەلەيدىغان بولدى (4a رەسىم).باشقا ئېنىقلانغان فازا كلونلىرىغا كەلسەك ، # 2077 چوڭ مېڭە قىل قان تومۇرلىرىغا كۈچلۈك بويالغان بولۇپ ، يۇقىرى ئېنىقلىقتا كۆرگەندە قىل قان تومۇر بەلگىسى لېكسىيەسى بىلەن كۆرۈنەرلىك كوكوللاشتۇرۇلغانلىقىنى كۆرسىتىپ بەرگەن ، بەلكىم پارنىك بوشلۇقىدا داغ بولۇشى مۇمكىن (4b رەسىم).CNS دا پېپتىد ۋاسىتىلىك دورىلىق ئۈنۈمگە ئېرىشكىلى بولىدىغان-بولمايدىغانلىقىنى تەكشۈرۈش ئۈچۈن ، بىز سىناق ئېلىپ باردۇق ، بۇنىڭدا i) # 2077 ئۆتكۈنچى پېپتىد ۋە ii) BACE1 چەكلىگۈچى پېپتىد SA بىلەن ئوخشىمىغان ئىككى نىسبەتتە ئارىلاشتۇرۇلدى.بىر بىرىكتۈرۈش ئۈچۈن بىز پەقەت BACE1 پېپتىد چەكلىگۈچنىلا ئىشلەتتۇق ، يەنە بىرى ئۈچۈن BACE1 پېپتىد چەكلىگۈچىنىڭ # 2077 پېپتىد بىلەن 1: 3 نىسبىتىنى ئىشلەتتۇق.ھەر ئىككى ئەۋرىشكە تومۇردىن ياسالغان بولۇپ ، ۋاقىتنىڭ ئۆتۈشىگە ئەگىشىپ بىتا-ئامىلوئىد پېپتىد 40 (Abeta40) نىڭ قان ۋە چوڭ مېڭە سۇيۇقلۇقى مىقدارى ئۆلچەم قىلىنغان.Abeta40 چوڭ مېڭە پاراشوكىدىكى BACE1 چەكلىمىسىنى ئەكس ئەتتۈرگەنلىكى ئۈچۈن CSF دا ئۆلچەنگەن.ئويلىغىنىدەك ، ھەر ئىككى مۇرەككەپ Abeta40 نىڭ قان سەۋىيىسىنى كۆرۈنەرلىك تۆۋەنلەتتى (رەسىم 4c ، d).قانداقلا بولمىسۇن ، پەقەت پېپتىد ئارىلاشمىسى بار ئەۋرىشكە.2077-يىلى ۋە SA غا ئۇلانغان BACE1 پېپتىدنىڭ چەكلىگۈچىسى چوڭ مېڭە سۇيۇقلۇقىدىكى Abeta40 نىڭ كۆرۈنەرلىك تۆۋەنلىشىنى كەلتۈرۈپ چىقاردى (4c رەسىم).سانلىق مەلۇماتتا كۆرسىتىلىشىچە ، پېپتىد يوق.2077-يىلى 60 kDa SA ئاقسىلىنى CNS غا توشۇيالايدۇ ، شۇنداقلا BACE1 پېپتىدنىڭ SA بىرىكتۈرۈلگەن تورمۇزلىغۇچىسى بىلەن دورىلىق ئۈنۈم پەيدا قىلىدۇ.
(a) T7 باسقۇچىدىكى كلون ئوكۇلى (2 × 10 باسقۇچ / ھايۋان) كەم دېگەندە ئۈچ CM سىڭدۈرۈلگەن چاشقاننىڭ CSF پېپتىد # 2077 (RLSSVDSDLSGC) ۋە ئوكۇل قىلىنمىغان كونترول باسقۇچى (# 1779) نىڭ ئۇزۇن مۇددەتلىك دورىلىق ئارخىپىنى كۆرسىتىدۇ.(2) فاكتور ئوكۇل قىلىنغان چاشقان (2 × 10 10 باسقۇچ / ھايۋان) دىكى ۋەكىللىك پوستلاق مىكرو مىكرو ئېلېمېنتلارنىڭ ئۆز ئارا ماسلاشتۇرۇلغان مىكروسكوپ تەسۋىرى.بۇ باسقۇچلۇق كلونلار 3 چاشقانغا بېرىلگەن بولۇپ ، خۇش پۇراقتىن ئىلگىرى 1 سائەت ئايلىنىشقا رۇخسەت قىلىنغان.چوڭ مېڭە بۆلۈنگەن ۋە كۆپ قۇتۇپلۇق FITC ماركىلىق ئانتىتېلا بىلەن T7 باسقۇچلۇق قاپقا قارشى بويالغان.خۇشپۇراق قىلىش ۋە ئۇنىڭدىن كېيىنكى ئوڭشاشتىن ئون مىنۇت بۇرۇن ، DyLight594 ماركىلىق لېكسىيە تومۇردىن باشقۇرۇلدى.قىل قان تومۇر ۋە يۈرەك قان تومۇر توقۇلمىلىرىدىكى مىكرو ئېلېمېنتلار ۋە باسقۇچلار (يېشىل) نىڭ نۇرلۇق تەرىپىدىكى لېكتور داغ (قىزىل) كۆرسىتىلگەن فلۇئورېسسېنسىيە رەسىملىرى.كۆلەم بالدىقى 10 µm غا ماس كېلىدۇ.(c) d.Aβ40 دىكى BACE1 پېپتىد چەكلىگۈچى ۋاسىتىلىك ئازايتىش Aβ1-40 ELISA تەرىپىدىن كۆرسىتىلگەن ۋاقىت نۇقتىسىدا قان (قىزىل) ۋە چوڭ مېڭە سۇيۇقلۇقى (ئاپېلسىن) بىلەن ئۆلچەنگەن.تېخىمۇ ئېنىقراق ​​بولۇش ئۈچۈن ، گرافىكتا چېكىتلىك سىزىق% 100 ئۆلچەمدە سىزىلىدۇ.(3) قاندىكى (قىزىل ئۈچبۇلۇڭ) ۋە چوڭ مېڭە سۇيۇقلۇقى (ئاپېلسىن ئۈچبۇلۇڭ) دىكى چاشقاننىڭ% 20 تۆۋەنلىشى پېپتىد # 2077 ۋە BACE1 تورمۇزلاش پېپتىد بىلەن تۇتاشتۇرۇلغان چاشقانلاردا.(4) قاندىكى Aβ40 (قىزىل چەمبىرەك) ۋە چوڭ مېڭە سۇيۇقلۇقى (ئاپېلسىن چەمبىرىكى) نىڭ سترېپتاۋىدىن بىلەن داۋالانغان چاشقانلارنىڭ پەقەت BACE1 تورمۇزلاش پېپتىد بىلەن قوشۇلۇشى.كونترولدىكى Aβ قويۇقلۇقى 420 pg / ml (ئۆلچەملىك ئايلىنىش = 101 pg / ml).
باسقۇچلۇق كۆرسىتىش بىئولوگىيىلىك داۋالاش تەتقىقاتىنىڭ بىر قانچە ساھەسىدە مۇۋەپپەقىيەتلىك قوللىنىلدى.بۇ ئۇسۇل vivo قان تومۇرنىڭ كۆپ خىللىقى تەتقىقاتى 18،19 شۇنداقلا مېڭە قان تومۇرلىرىنى نىشان قىلغان تەتقىقاتلاردا 20،21،22،23،24،25،26،26.بۇ تەتقىقاتتا ، بىز بۇ تاللاش ئۇسۇلىنىڭ قوللىنىلىشىنى چوڭ مېڭە قان تومۇرلىرىنى نىشان قىلغان پېپتىدلارنى بىۋاسىتە پەرقلەندۈرۈش بىلەنلا قالماي ، يەنە ئاكتىپ توشۇش خۇسۇسىيىتى بار كاندىداتلارنىڭ قان-مېڭە توسىقىدىن ئۆتۈشىنى كېڭەيتتۇق.بىز ھازىر CM سىڭدۈرۈلگەن چاشقانلاردا vivo تاللاش تەرتىپىنىڭ تەرەققىياتىنى تەسۋىرلەپ ، ئۇنىڭ CSF ئۆي خۇسۇسىيىتى بار پېپتىدلارنى پەرقلەندۈرۈش يوشۇرۇن كۈچىنى نامايان قىلىمىز.T7 باسقۇچىدىن پايدىلىنىپ ، 12-mer تاسادىپىي پېپتىدلار كۈتۈپخانىسىنى كۆرسىتىپ ، T7 باسقۇچىنىڭ كىچىك (دىئامېتىرى تەخمىنەن 60 nm) 10 نىڭ قان-مېڭە توسىقىغا ماسلىشالايدىغانلىقىنى ، بۇ ئارقىلىق قان-مېڭە توسىقى ياكى خوروئىد ئەۋرىشىمىدىن بىۋاسىتە ئۆتەلەيدىغانلىقىنى ئىسپاتلىدۇق.بىز تەكشۈرۈلگەن CSF چاشقاندىن CSF يىغىۋېلىشنىڭ vivo فۇنكسىيەلىك تەكشۈرۈش ئۇسۇلىدا ياخشى كونترول قىلىنغانلىقىنى ، ئېلىنغان باسقۇچنىڭ قان تومۇرغا باغلىنىپلا قالماي ، يەنە قان-مېڭە توسىقىدىن ھالقىپ توشۇغۇچى رولىنى ئوينايدىغانلىقىنى بايقىدۇق.ئۇندىن باشقا ، بىرلا ۋاقىتتا قان يىغىش ۋە HTS نى CSF ۋە قاندىن ھاسىل بولغان باسقۇچلارغا ئىشلىتىش ئارقىلىق ، بىزنىڭ CSF نى تاللىشىمىزنىڭ قاننى موللاش ياكى تاللاشنىڭ كېڭىيىشىنىڭ تەسىرىگە ئۇچرىمىغانلىقىنى جەزملەشتۈردۇق.قانداقلا بولمىسۇن ، قان بۆلۈمى تاللاش تەرتىپىنىڭ بىر قىسمى ، چۈنكى CSF بۆلۈمچىسىگە يېتەلەيدىغان باسقۇچلار چوقۇم ھايات قېلىشى ۋە قان ئايلىنىشىدا مېڭىدە ئۆزىنى موللاشتۇرۇشى كېرەك.خام HTS سانلىق مەلۇماتلىرىدىن ئىشەنچلىك تەرتىپ ئۇچۇرلىرىنى چىقىرىش ئۈچۈن ، ئانالىز خىزمەت ئېقىمىدا سۇپا مەخسۇس تەرتىپلەش خاتالىقىغا ماسلاشتۇرۇلغان سۈزگۈچلەرنى يولغا قويدۇق.تەكشۈرۈش ئۇسۇلىغا ھەرىكەتچان پارامېتىرلارنى كىرگۈزۈش ئارقىلىق ، 24 ، 27 ، 28 ، قاندىكى ياۋا تىپتىكى T7 باسقۇچلىرىنىڭ (t½ ~ 28 مىنۇت) تېز دورا ياساشنى جەزملەشتۈردۇق ، شۇنداقلا ئۇلارنىڭ يېرىم ئۆمرىنى ھەر مىنۇتتا چوڭ مېڭە سۇيۇقلۇقى (t½ ~ 26 مىنۇت) قىلىپ بېكىتتۇق).قان ۋە CSF دىكى دورىغا ئوخشاش ئارخىپلارغا قارىماي ، CSF دا پەقەت% 0.001 لىك قان قويۇقلۇقى بايقالدى ، بۇ ياۋا تىپتىكى T7 باسقۇچىنىڭ قان-مېڭە توسىقىدىن ھالقىغان تۆۋەن ھەرىكەتچانلىقىنى كۆرسىتىپ بېرىدۇ.بۇ ئەسەر vivo panning ئىستراتېگىيىسىنى قوللانغاندا بىرىنچى باسقۇچلۇق تاللاشنىڭ مۇھىملىقىنى گەۋدىلەندۈردى ، بولۇپمۇ ئاز ساندىكى كلونلار CNS بۆلۈمىگە يېتەلەيدىغان بولغاچقا ، ئايلىنىشتىن تېز تازىلىنىدىغان باسقۇچلۇق سىستېمىلار ئۈچۈن.شۇنداق قىلىپ ، بىرىنچى باسقۇچتا ، كۇتۇپخانىنىڭ كۆپ خىللىقىنىڭ ئازىيىشى ئىنتايىن چوڭ بولدى ، چۈنكى ئەڭ چەكلىك CSF مودېلىدا پەقەت چەكلىك ساندىكى كلونلارلا توپلاندى.Vivo panning ئىستراتېگىيىسىدىكى بۇ CSF بۆلۈمىدە ئاكتىپ يىغىلىش ، قان بۆلۈمىدە كلون ھايات قېلىش ۋە ئالدىنقى 10 مىنۇت ئىچىدە T7 فازا كلونلىرىنى قاندىن تېز يوقىتىش قاتارلىق بىر قانچە تاللاش باسقۇچلىرىنى ئۆز ئىچىگە ئالدى (1d رەسىم ۋە قوشۇمچە 4M رەسىم).).شۇنداق قىلىپ ، بىرىنچى باسقۇچتىن كېيىن ، CSF دا ئوخشىمىغان باسقۇچلۇق كلونلار ئېنىقلاندى ، گەرچە ئوخشاش دەسلەپكى كۆلچەك يەككە ھايۋانلارغا ئىشلىتىلگەن.بۇ كۆپ ساندىكى كۇتۇپخانا ئەزالىرى بار مەنبە كۈتۈپخانىلارنى تاللاشنىڭ كۆپ خىل تاللاش قەدەملىرىنىڭ كۆپ خىللىقنى كۆرۈنەرلىك ئازايتىدىغانلىقىنى كۆرسىتىپ بېرىدۇ.شۇڭلاشقا ، تاسادىپىي ۋەقەلەر دەسلەپكى تاللاش جەريانىنىڭ ئايرىلماس بىر قىسمىغا ئايلىنىپ ، نەتىجىگە زور تەسىر كۆرسىتىدۇ.ئەسلى كۇتۇپخانىدىكى نۇرغۇن كلونلارنىڭ CSF موللاشتۇرۇش خاھىشى ئوخشاش بولۇشى مۇمكىن.قانداقلا بولمىسۇن ، ئوخشاش تەجرىبە شارائىتىدا ، دەسلەپكى كۆلچەكتىكى ھەر بىر ئالاھىدە كلوننىڭ سانى ئاز بولغاچقا ، تاللاش نەتىجىسى ئوخشىماسلىقى مۇمكىن.
CSF دا موللاشتۇرۇلغان نەقىشلەر قاندىكىگە ئوخشىمايدۇ.قىزىقارلىق يېرى ، بىز يەككە ھايۋانلارنىڭ قېنىدىكى گلىكسىن مول پېپتىدلارغا قاراپ تۇنجى ئۆزگىرىشنى بايقىدۇق.(1g رەسىم ، قوشۇمچە رەسىملەر 4e ، 4f).تەركىبىدە گلىكسىن پېپتىدلىرى بار باسقۇچ تېخىمۇ مۇقىم بولۇپ ، ئايلىنىشتىن چىقىرىلىشى مۇمكىن ئەمەس.قانداقلا بولمىسۇن ، بۇ خىل گلىتسىن مول پېپتىدلار چوڭ مېڭە سۇيۇقلۇقى ئەۋرىشكىسىدە بايقالمىدى ، بۇ ئەگرى-توقاي كۈتۈپخانىلارنىڭ ئوخشىمىغان ئىككى خىل تاللاش باسقۇچىنى باشتىن كەچۈرگەنلىكىنى كۆرسىتىپ بېرىدۇ: بىرى قاندىكى ، يەنە بىرى چوڭ مېڭە سۇيۇقلۇقىدا يىغىلىشقا رۇخسەت قىلىنغان.تۆتىنچى باسقۇچلۇق تاللاشتىن كېلىپ چىققان CSF موللاشتۇرۇلغان كلونلار كەڭ كۆلەمدە سىناق قىلىندى.يەككە سىناق قىلىنغان كلونلارنىڭ ھەممىسى دېگۈدەك قۇرۇق كونترول باسقۇچىغا سېلىشتۇرغاندا CSF دا بېيىغانلىقى جەزملەشتۈرۈلدى.بىر پېپتىد ئۇرغان (# 2077) تېخىمۇ تەپسىلىي تەكشۈرۈلگەن.ئۇ باشقا زەربەلارغا سېلىشتۇرغاندا پلازما يېرىم ئۆمرىنى كۆرسەتتى (3d رەسىم ۋە قوشۇمچە 7-رەسىم) ، قىزىقارلىق يېرى ، بۇ پېپتىدنىڭ C تېرمىنالىدا سىستېن قالدۇقى بار.يېقىندا پېپتىدلارغا سىستايىننىڭ قوشۇلۇشىنىڭ 29-نومۇرلۇق پىلاستىنكىنى باغلاش ئارقىلىق ئۇلارنىڭ دورىلىق خۇسۇسىيىتىنى ياخشىلايدىغانلىقى كۆرسىتىلدى.بۇ ھازىر پېپتىد # 2077 ئۈچۈن نامەلۇم بولۇپ ، يەنىمۇ ئىلگىرىلىگەن ھالدا تەتقىق قىلىشنى تەلەپ قىلىدۇ.بەزى پېپتىدلار CSF بېيىتىشتا ۋالېنسقا تايىنىشچانلىقىنى كۆرسەتتى (سانلىق مەلۇماتلار كۆرسىتىلمىدى) ، بۇ بەلكىم T7 قاپقىقىنىڭ كۆرسىتىلگەن يەر يۈزى گېئومېتىرىيىسى بىلەن مۇناسىۋەتلىك بولۇشى مۇمكىن.بىز ئىشلەتكەن T7 سىستېمىسى ھەر بىر باسقۇچتىكى ھەر بىر پېپتىدنىڭ 5-15 نۇسخىسىنى كۆرسەتتى.IHC چاشقانلارنىڭ چوڭ مېڭە پوستلاق قەۋىتىگە تومۇرغا ئوكۇل قىلىنغان كاندىدات قوغۇشۇن فازا كلونلىرىدا ئېلىپ بېرىلدى (قوشۇمچە 8-رەسىم).سانلىق مەلۇماتتا كۆرسىتىلىشىچە ، كەم دېگەندە ئۈچ كلون (2002-يىل ، 2009-يىل ۋە 2077-نومۇر) BBB بىلەن ئۆز-ئارا تەسىر كۆرسەتكەن.بۇ BBB ئۆز-ئارا تەسىرنىڭ CSF نىڭ يىغىلىشى ياكى بۇ كلونلارنىڭ بىۋاسىتە BCSFB غا يۆتكىلىشىنى كەلتۈرۈپ چىقىرىدىغانلىقى ئېنىق ئەمەس.مۇھىمى ، تاللانغان پېپتىدلارنىڭ بىرىكتۈرۈلگەن ۋە ئاقسىل يۈكلىرىگە باغلانغان ۋاقىتتا CSF توشۇش ئىقتىدارىنى ساقلاپ قالىدىغانلىقىنى كۆرسىتىمىز.N تېرمىنالىدىكى بىئوتىن بىرىكتۈرۈلگەن پېپتىدلارنىڭ SA غا باغلىنىشى ماھىيەتتە قان ۋە مېڭە قان سۇيۇقلۇقىدىكى فازا كلونلىرى بىلەن ئېرىشكەن نەتىجىنى تەكرارلايدۇ (3e رەسىم).ئاخىرىدا ، بىز قوغۇشۇن پېپتىد # 2077 نىڭ SA بىلەن بىرىكتۈرۈلگەن BACE1 نىڭ بىئوتىن بىرىكتۈرۈلگەن پېپتىد چەكلىگۈچىنىڭ چوڭ مېڭىنىڭ ھەرىكىتىنى ئىلگىرى سۈرۈپ ، CSF دىكى Abeta40 سەۋىيىسىنى كۆرۈنەرلىك تۆۋەنلىتىش ئارقىلىق CNS دا كۆرۈنەرلىك دورا دىنامىك تەسىرىنى كەلتۈرۈپ چىقىرىدىغانلىقىنى كۆرسىتىمىز (4-رەسىم).بىز بارلىق hit لارنى پېپتىد تەرتىپلىك گومولوگىيەلىك ئىزدەش ئارقىلىق سانداندىكى ھېچقانداق گومولوگىيىنى پەرقلەندۈرەلمىدۇق.دىققەت قىلىشقا تېگىشلىكى شۇكى ، T7 كۈتۈپخانىسىنىڭ ھەجىمى تەخمىنەن 109 ، 12-نومۇرلۇق نەزەرىيىۋى كۇتۇپخانىنىڭ چوڭلۇقى 4 x 1015.قىياس جەھەتتىن ئېيتقاندا ، بىزنىڭ بۇ پېپتىدلارنىڭ تەبىئىي گومولوگىيىسىنى بايقىماسلىقىمىزدىكى سەۋەبلەرنىڭ بىرى ، تەدرىجىي تەرەققىيات جەريانىدا يوقىتىش بولۇپ ، بەزى پېپتىد نەقىشلىرىنىڭ مېڭىگە كونترولسىز كىرىشىنىڭ ئالدىنى ئالىدۇ.
يىغىپ ئېيتقاندا ، بىزنىڭ نەتىجىلىرىمىز كەلگۈسىدىكى خىزمەتلەرنى vivo دىكى چوڭ مېڭە قان تومۇر توساقلىرىنىڭ قاتناش سىستېمىسىنى ئېنىقلاش ۋە خاراكتېرلەندۈرۈش ئۈچۈن ئاساس بىلەن تەمىنلەيدۇ.بۇ خىل ئۇسۇلنىڭ ئاساسىي ئورۇنلاشتۇرۇلۇشى ئىقتىدار تاللاش ئىستراتېگىيىسىنى ئاساس قىلغان بولۇپ ، چوڭ مېڭە قان تومۇرنى باغلاش خۇسۇسىيىتى بار كلونلارنى پەرقلەندۈرۈپلا قالماستىن ، يەنە مۇۋەپپەقىيەتلىك كلونلارنىڭ vivo دىكى بىئولوگىيىلىك توساقلارنى CNS بۆلۈمىگە بۆسۈپ ئۆتۈشتىكى ئىچكى ھەرىكەتنى ئۆز ئىچىگە ئالىدۇ.بۇ پېپتىدلارنىڭ توشۇش مېخانىزمىنى ۋە ئۇلارنىڭ چوڭ مېڭە رايونىغا خاس مىكرو قان تومۇرنى باغلاشقا مايىللىقىنى ئايدىڭلاشتۇرۇش.بۇ بەلكىم BBB ۋە قوبۇللىغۇچنى توشۇشنىڭ يېڭى يوللىرىنىڭ بايقىلىشىنى كەلتۈرۈپ چىقىرىشى مۇمكىن.بىز ئېنىقلانغان پېپتىدلارنىڭ چوڭ مېڭە قان تومۇر قوبۇللىغۇچىسى ياكى BBB ياكى BCSFB ئارقىلىق توشۇلىدىغان ئايلانما لەگلەك بىلەن بىۋاسىتە باغلىنىشىنى ئۈمىد قىلىمىز.بۇ ئەسەردە بايقالغان CSF توشۇش پائالىيىتىدىكى پېپتىد ۋېكتورلىرى تېخىمۇ ئىچكىرلەپ تەكشۈرۈلىدۇ.بىز ھازىر بۇ پېپتىدلارنىڭ چوڭ مېڭىنىڭ BBB ۋە / ياكى BCSFB دىن ھالقىش ئىقتىدارىنى تەكشۈرۈۋاتىمىز.بۇ يېڭى پېپتىدلار يېڭى قوبۇللىغۇچ ياكى يوللارنى يوشۇرۇن بايقاش ۋە بىئولوگىيە قاتارلىق ماكرو مولېكۇلانى مېڭىگە يەتكۈزۈش ئۈچۈن يېڭى يۇقىرى ئۈنۈملۈك سۇپىلارنى تەرەققىي قىلدۇرۇش ئۈچۈن ئىنتايىن قىممەتلىك قورال بولۇپ قالىدۇ.
ئىلگىرى تەسۋىرلەنگەن ئۇسۇلنى ئۆزگەرتىش ئارقىلىق چوڭ سىستېرنا (CM) نى كونترول قىلالايسىز.ناركوز قىلىنغان ۋىستار چاشقانلىرى (200-350 گرام) ئىستېرېئولۇق ئۈسكۈنىگە ئورنىتىلغان بولۇپ ، ساقال ئالدۇرۇلغان ۋە ئاستىنقى شەكىلدە ياسالغان باش تېرىسى ئۈستىدە ئوتتۇرا كېسىلگەن بولۇپ ، باش سۆڭىكىنى ئاشكارلىغان.ئۈستۈنكى تاسما رايونىغا ئىككى تۆشۈك تېشىپ ، تۆشۈكتىكى ئوڭشاش ئېغىزىنى چىڭىتىڭ.داتلاشماس پولات كاناينى CM غا سىتراتىگىيىلىك يېتەكلەش ئۈچۈن قوشۇمچە ئومۇرتقا ئارىلىق تەخسىسى قېزىۋېلىندى.زەمبىرەكنىڭ ئەتراپىغا چىش سېمونت سۈرۈپ ، بۇرمىلاش ئارقىلىق بىخەتەر قىلىڭ.سۈرەتنى ئەسلىگە كەلتۈرۈش ۋە سېمونت قاتتىقلاشقاندىن كېيىن ، 4/0 دەرىجىدىن تاشقىرى تىكىش ئارقىلىق تېرە جاراھەتلىرى ئېتىۋېتىلدى.زەمبىرەكنىڭ مۇۋاپىق ئورۇنلاشتۇرۇلۇشى چوڭ مېڭە سۇيۇقلۇقى (CSF) نىڭ ئۆزلۈكىدىن ئېقىپ كېتىشى بىلەن ئىسپاتلىنىدۇ.چاشقاننى ئىستېرېئولۇق ئۈسكۈنىدىن ئېلىۋېتىڭ ، ئوپېراتسىيىدىن كېيىنكى مۇۋاپىق داۋالاش ۋە ئاغرىقنى باشقۇرۇشنى قوبۇل قىلىڭ ، چوڭ مېڭە سۇيۇقلۇقىدا قان ئالامەتلىرى كۆرۈلمىگۈچە كەم دېگەندە بىر ھەپتە ئەسلىگە كېلىشىگە يول قويۇڭ.ۋىستار چاشقان (Crl: WI / Han) چارلېس دەرياسىدىن (فرانسىيە) ئېلىنغان.بارلىق چاشقانلار ئالاھىدە كېسەللىك پەيدا قىلغۇچى شارائىتتا ساقلانغان.بارلىق ھايۋانات تەجرىبىسى شىۋىتسارىيە باسېل شەھرىنىڭ مال دوختۇرلۇق ئىشخانىسى تەرىپىدىن تەستىقلانغان ۋە 2474-نومۇرلۇق ھايۋانات ئىجازەتنامىسى (چوڭ مېڭە سۇيۇقلۇقى ۋە چاشقان مېڭىسىدىكى داۋالاش كاندىداتلىرىنىڭ دەرىجىسىنى ئۆلچەش ئارقىلىق ئاكتىپ مېڭە تىرانسپورتىنى باھالاش) بويىچە ئېلىپ بېرىلغان.
قولىدىكى CM كاناي بىلەن چاشقاننى ئېھتىياتچانلىق بىلەن ساقلاڭ.كانايدىن داتۇرانى ئېلىۋېتىڭ ۋە 10 µl ئۆزلۈكىدىن ئېقىۋاتقان چوڭ مېڭە سۇيۇقلۇقىنى يىغىڭ.كاناينىڭ پاتېنت ھوقۇقى ئەڭ ئاخىرىدا بۇزۇلغان بولغاچقا ، پەقەت ئېنىق بولغان مېڭە قان سۇيۇقلۇقى ئەۋرىشكىسى ئەۋرىشكە ئېلىپ ، قاننىڭ بۇلغىنىشى ۋە رەڭگىنىڭ ئىسپاتى يوق.پاراللېل ھالدا ، قۇيرۇقنىڭ ئۇچىدىكى كىچىك كېسىشتىن گېپارىن (سىگما-ئالدرىچ) بىلەن تەخمىنەن 10 ~ 20 مىللىمېتىر قان ئېلىنغان.CSF ۋە قان T7 باسقۇچىغا تومۇردىن ئوكۇل قىلىنغاندىن كېيىن ھەر خىل ۋاقىتلاردا يىغىۋېلىندى.ھەر بىر CSF ئەۋرىشكىسى توپلىنىشتىن ئىلگىرى تەخمىنەن 5-10 مىللىمېتىر سۇيۇقلۇق تاشلىۋېتىلدى ، بۇ كاتېتېرنىڭ ئۆلۈك مىقدارىغا ماس كېلىدۇ.
كۈتۈپخانىلار T7Select سىستېمىسى قوللانمىسىدا تەسۋىرلەنگەندەك T7Select 10-3b ۋېكتورى ئارقىلىق بارلىققا كەلگەن (نوۋاگېن ، روسېنبېرگ قاتارلىقلار. InNovations 6 ، 1-6 ، 1996).قىسقىچە قىلىپ ئېيتقاندا ، تاسادىپىي 12-mer DNA قىستۇرمىسى تۆۋەندىكى فورماتتا بىرىكتۈرۈلدى:
NNK كودلىغۇچ قىستۇرما قوش كود ۋە ئامىنو كىسلاتاسىنىڭ ھەددىدىن زىيادە بېسىم قىلىشىدىن ساقلىنىش ئۈچۈن ئىشلىتىلگەن.N بولسا ھەر بىر يادرونىڭ قولدا ئارىلاشتۇرۇلغان تەڭپۇڭلۇق نىسبىتى ، K بولسا ئادېنېن بىلەن سىتوسىن يادروسىنىڭ قولدا ئارىلاشما تەڭپۇڭلۇق نىسبىتى.تاق قاپلانغان رايونلار كلېنوف بۇففېر (يېڭى ئېنگلاند بىئولاب) دىكى DNTP (نوۋاگېن) ۋە كلېنوۋ ئېنزىم (يېڭى ئېنگىلاند بىئولاب) بىلەن تېخىمۇ كۆپ يوشۇرۇن ھالەتتە قوش يۆنىلىشلىك DNA غا ئۆزگەرتىلدى.ئىنكاستىن كېيىن ، EtOH ھۆل-يېغىن ئارقىلىق قوش لىنىيىلىك DNA ئەسلىگە كەلتۈرۈلدى.نەتىجىدە DNA چەكلەش فېرمېنتى EcoRI ۋە HindIII (ھەر ئىككىسى روچېدىن) ھەزىم قىلىنغان.ساپلاشتۇرۇلغان ۋە ساپلاشتۇرۇلغان (QIAquick, Qiagen) قىستۇرمىسى (T4 ligase, New England Biolabs) ئاندىن 10B كاپسۇد گېنىنىڭ ئامىنو كىسلاتاسى 348 دىن كېيىن ئالدىن ياسالغان T7 ۋېكتورىغا رامكا بىلەن باغلاندى.ۋىتامىن ئورالمىسىدىن بۇرۇن 18 سائەت C سېلسىيە گرادۇس 16 سېلسىيە گرادۇسلۇق ھالەتتە ساقلانغان.ۋىرۇسنىڭ باسقۇچلۇق ئورالمىسى T7Select 10-3b كلونلاش زاپچىسى (Novagen) بىلەن تەمىنلەنگەن كۆرسەتمە بويىچە ئېلىپ بېرىلغان بولۇپ ، ئورالما ئېرىتمىسى Escherichia coli (BLT5615 ، نوۋاگېن) ئارقىلىق لىزغا بىر قېتىم كۈچەيتىلگەن.لىزا گلىتسېرىننىڭ زاپاس ئېرىتمىسى سۈپىتىدە -80 سېلسىيە گرادۇستا مەركەزلەشتۈرۈلۈپ ، ئۇنتۇلدى ۋە توڭلىتىلدى.
باسقۇچلۇق ئۆزگىرىشچان رايونلارنىڭ بىۋاسىتە PCR كۈچەيتىلىشى شورپا ياكى تەخسە ئىگىدارچىلىقىدىكى 454 / Roche-amplicon بىرىكتۈرۈش پىرىسلىغۇچ ئارقىلىق كۈچەيتىلگەن.ئالدى تەرەپ بىرىكتۈرۈش قەغىزىدە ئۆزگىرىشچان رايون (NNK) 12 (قېلىپقا خاس) ، GS FLX Titanium ماسلاشتۇرغۇچ A ۋە تۆت ئاساسى كۇتۇپخانا ئاچقۇچ تەرتىپى (TCAG) يان تەرەپتىكى تەرتىپلەر بار (قوشۇمچە 1a رەسىم):
تەتۈر بىرىكتۈرۈش ئەسۋابىدا يەنە تۇتقۇچقا تۇتاشتۇرۇلغان بىئوتىن ۋە ئېمۇلسىيىلىك PCR مەزگىلىدە كلون كۈچەيتكۈچكە ئېھتىياجلىق GS FLX Titanium Adapter B بار:
ئاندىن ئامپلونلار 454 GS-FLX تىتان كېلىشىمنامىسىگە ئاساسەن 454 / Roche pyrosequencing نىڭ تەسىرىگە ئۇچرىغان.قولدا سانگېر تەرتىپى (قوللىنىشچان بىئولوگىيىلىك سىستېما Hitachi 3730 xl DNA ئانالىزچىسى) ئۈچۈن ، T7 باسقۇچلۇق DNA PCR تەرىپىدىن كۈچەيتىلگەن ۋە تۆۋەندىكى دەسلەپكى جۈپلەر بىلەن تەرتىپلەنگەن:
ئايرىم تاختايلارنىڭ قىستۇرۇلۇشى Roche Fast Start DNA Polymerase Kit (ئىشلەپچىقارغۇچىنىڭ كۆرسەتمىسى بويىچە) ئارقىلىق PCR كۈچەيتىلگەن.ئىسسىق باشلىنىش (95 سېلسىيە گرادۇستا 10 مىنۇت) ۋە 35 ئۆرلەش دەۋرى (95 سېلسىيە گرادۇستا 50 سېلسىيە گرادۇس ، 50 سېلسىيە گرادۇستا 1 مىنۇت ، 72 سېلسىيە گرادۇستا 1 مىنۇت).
كۈتۈپخانىلارنىڭ باسقۇچلىرى ، ياۋا تىپتىكى باسقۇچلار ، CSF ۋە قاندىن قۇتۇلغان باسقۇچلار ياكى يەككە كلونلار Escherichia coli BL5615 تۇبېركۇليوز شورپىسى (Sigma Aldrich) ياكى 500 cm2 قاچا-قۇچىلاردا (تېرمو ئىلمىي) 37 سېلسىيە گرادۇستا 4 سائەت كۈچەيتىلدى.تەخسە Tris-EDTA بۇففېر (Fluka Analytical) بىلەن تەخسىنى چايقاش ياكى ستېرېلېل تۇرۇبا ئۇچى بىلەن تاختايلارنى يىغىش ئارقىلىق تەخسىدىن ئېلىنغان.فازا مەدەنىيەت خاسىيەتلىك ياكى ئېلىش بۇففېردىن بىر ئايلانما پولىئېتىلېن گلىكول (PEG 8000) ھۆل-يېغىن (Promega) بىلەن ئايرىۋېتىلىپ ، Tris-EDTA بۇففېردا توختىتىلدى.
كۈچەيتىلگەن باسقۇچ تومۇرغا (IV) ئوكۇل سېلىشتىن ئىلگىرى (500 مىللىمېتىر)بىرىنچى ئايلانمىدا 2 × 1012 باسقۇچ تونۇشتۇرۇلدى.ئىككىنچى ، 2 × 1010 باسقۇچ.ئۈچىنچى ۋە تۆتىنچى تاللاش باسقۇچىدا ، ھەر بىر ھايۋانغا 2 × 109 باسقۇچ.CSF دىكى باسقۇچلۇق ماددىلار ۋە كۆرسىتىلگەن ۋاقىت نۇقتىلىرىدا يىغىلغان قان ئەۋرىشكىسى ئىشلەپچىقارغۇچىلارنىڭ كۆرسەتمىسى (T7Select سىستېما قوللانمىسى) بويىچە تاختاي ھېسابلاش ئارقىلىق بېكىتىلدى.باسقۇچلۇق تاللاش ساپلاشتۇرۇلغان كۈتۈپخانىلارنىڭ تومۇرغا قۇيۇلۇشى ياكى قۇيرۇق تومۇرغا ئوكۇل قىلىنىشى ياكى ئالدىنقى تاللاش باسقۇچىدىن CSF دىن ئېلىنغان فازا قايتا ئوكۇل قىلىنىشى ئارقىلىق ئېلىپ بېرىلدى ، كېيىنكى ھوسۇل ئايرىم-ئايرىم ھالدا 10 مىنۇت ، 30 مىنۇت ، 60 مىنۇت ، 90 مىنۇت ، 120 مىنۇت ، 180 مىنۇت ۋە 240 مىنۇتتا ئېلىپ بېرىلدى.Vivo تاختىسىدا جەمئىي تۆت ئايلانما ئېلىپ بېرىلغان بولۇپ ، ئالدىنقى ئۈچ ئايلانما تاللاش جەريانىدا تاللانغان ئىككى شاخ ئايرىم ساقلانغان ۋە تەھلىل قىلىنغان.ئالدىنقى ئىككى باسقۇچلۇق تاللاشتىن CSF دىن ئېلىنغان بارلىق باسقۇچ قىستۇرمىلىرى 454 / Roche pyrosequencing نىڭ تەسىرىگە ئۇچرىغان ، CSF دىن يېقىنقى ئىككى باسقۇچلۇق تاللاشتىن ئېلىنغان بارلىق كلونلار قولدا تەرتىپلەنگەن.بىرىنچى باسقۇچلۇق تاللاشتىكى بارلىق قان باسقۇچلىرىمۇ 454 / Roche pyrosequencing نىڭ تەسىرىگە ئۇچرىغان.فازا كلونلىرىنى ئوكۇل قىلىش ئۈچۈن ، تاللانغان باسقۇچلار E. coli (BL5615) دا 500 cm2 تەخسە 37 سېلسىيە گرادۇستا 4 سائەت كۈچەيتىلدى.يەككە تاللانغان ۋە قولدا تەرتىپلەنگەن كلونلار تۇبېركۇليوزدا تارقالغان.باسقۇچنى ئېلىش ، تازىلاش ۋە ئېندوتوكسىننى ئېلىۋەتكەندىن كېيىن (يۇقىرىدا بايان قىلىنغاندەك) ، 300 مىللىمېتىردىكى 2 × 1010 باسقۇچ / ھايۋان بىر قۇيرۇق تومۇرغا تومۇردىن ئوكۇل قىلىندى.
تەرتىپلىك سانلىق مەلۇماتلارنى پىششىقلاپ ئىشلەش ۋە سۈپەتلىك سۈزۈش.خام 454 / Roche سانلىق مەلۇماتلىرى ساتقۇچىلار يۇمشاق دېتالى ئارقىلىق ئىككىلىك ئۆلچەملىك ئاقما خەرىتە فورماتى (sff) دىن Pearson ئىنسانلارنىڭ ئوقۇغىلى بولىدىغان فورماتىغا (fasta) غا ئۆزگەرتىلدى.يادرولۇق تەرتىپنى يەنىمۇ بىر تەرەپ قىلىش تۆۋەندە بايان قىلىنغان شەخسىي C پروگراممىلىرى ۋە ئورگىناللىرى (تارقىتىلمىغان يۇمشاق دېتال بولىقى) ئارقىلىق ئېلىپ بېرىلدى.دەسلەپكى سانلىق مەلۇماتلارنى ئانالىز قىلىش قاتتىق باسقۇچلۇق سۈزۈش تەرتىپلىرىنى ئۆز ئىچىگە ئالىدۇ.ئىناۋەتلىك 12mer قىستۇرما DNA تەرتىپىنى ئۆز ئىچىگە ئالمىغان ئوقۇشلارنى سۈزۈش ئۈچۈن ، ئوقۇشلار تەرتىپلىك ھالدا بەلگە (GTGATGTCGGGGATCCGAATTCT) ، بەلگە بەلگىسى (TAAGCTTGCGGCCGCACTCGAGTA) ۋە تەگلىك قىستۇرمىسى (CCCTGCAGGGATATCCCGGGAGCTCGTCGACG)توغرىلاش ھەر بىر توغرىلىنىشتا 2 ماس كەلمەسلىككە يول قويىدۇ 31.شۇڭلاشقا ، باشلىماي ئوقۇش ۋە خەتكۈچلەرنى توختىتىش ۋە تەگلىك قىستۇرما مەزمۇنلارنى ئۆز ئىچىگە ئالغان ئوقۇشلۇق ، يەنى رۇخسەت قىلىنغان ماس كەلمەيدىغان ساندىن ئېشىپ كەتكەن توغرىلاشلار كۈتۈپخانىدىن چىقىرىۋېتىلدى.قالغان ئوقۇشقا كەلسەك ، N-mer DNA تەرتىپى باشلىنىش بەلگىسىدىن سوزۇلۇپ ، توختاش بەلگىسى ئەسلى ئوقۇش تەرتىپىدىن قېزىۋېلىنىپ ، بىر تەرەپ قىلىنغان (تۆۋەندە «قىستۇرۇش» دېيىلىدۇ).قىستۇرما تەرجىمە قىلىنغاندىن كېيىن ، دەسلەپكى بېكەتنىڭ 5 ′ ئاخىرىدىكى بىرىنچى توختاش كودىدىن كېيىنكى قىسمى قىستۇرمىدىن چىقىرىۋېتىلىدۇ.ئۇنىڭدىن باشقا ، پىرىمېرنىڭ 3 ′ ئۇچىدىكى تولۇق بولمىغان كودلارنى كەلتۈرۈپ چىقىرىدىغان يادرو ماددىلىرىمۇ چىقىرىۋېتىلدى.پەقەت تەگلىك تەرتىپىنى ئۆز ئىچىگە ئالغان قىستۇرمىلارنى چىقىرىۋېتىش ئۈچۈن ، ئامىنو كىسلاتا ئەندىزىسى «PAG» دىن باشلانغان تەرجىمە قىستۇرمىلارمۇ چىقىرىۋېتىلدى.تەرجىمە قىلىنغاندىن كېيىنكى ئۇزۇنلۇقى 3 ئامىنو كىسلاتاغا يەتمەيدىغان پېپتىدلار كۈتۈپخانىدىن چىقىرىۋېتىلدى.ئاخىرىدا ، قىستۇرما كۆلچىكىدىكى ئارتۇقچىلىقنى چىقىرىپ ، ھەر بىر ئۆزگىچە قىستۇرمىنىڭ چاستوتىنى بەلگىلەڭ.بۇ ئانالىزنىڭ نەتىجىسى يادرونىڭ رەت تەرتىپى (قىستۇرما) ۋە ئۇلارنىڭ (ئوقۇش) چاستوتىسى (قوشۇمچە رەسىم 1c ۋە 2) نى ئۆز ئىچىگە ئالدى.
گۇرۇپپا N-mer DNA رەت تەرتىپى ئوخشاشلىقى بىلەن قىستۇرۇلىدۇ: 454 / Roche بەلگىلىك تەرتىپلەش خاتالىقىنى تۈگىتىش (گوموپولىمېر كېڭەيتىش تەرتىپىدىكى مەسىلىلەر دېگەندەك) ۋە مۇھىم بولمىغان ئارتۇقچىلىقلارنى چىقىرىپ تاشلاش ، ئىلگىرى سۈزۈلگەن N-mer DNA رەت تەرتىپى (قىستۇرما) ئوخشاشلىق بويىچە رەتلىنىدۇ.قىستۇرما (ماس كەلمەيدىغان 2 بازىغا رۇخسەت قىلىنغان) تەكرارلانغان ئالگورىزىمنى ئىشلىتىپ تۆۋەندىكىدەك ئېنىقلىما بېرىلگەن: قىستۇرمىلار ئالدى بىلەن ئۇلارنىڭ چاستوتىسى (ئەڭ يۇقىرىدىن تۆۋەنگە) ، ئەگەر ئوخشاش بولسا ، ئۇلارنىڭ ئۇزۇنلۇقى (ئۇزۇنلۇقى ئەڭ قىسقا) بويىچە رەتلىنىدۇ.شۇڭا ، ئەڭ كۆپ ۋە ئەڭ ئۇزۇن قىستۇرما بىرىنچى «گۇرۇپپا» غا ئېنىقلىما بېرىدۇ.گۇرۇپپا چاستوتىسى ئاچقۇچلۇق چاستوتىغا تەڭشەلدى.ئاندىن ، تەرتىپلەنگەن تىزىملىكتە قالغان ھەر بىر قىستۇرما قوش يۆنىلىشلىك يىڭنە-ۋونش ماسلاشتۇرۇش ئارقىلىق گۇرۇپپىغا قوشۇلماقچى بولدى.ئەگەر ماسلاشماسلىق ، قىستۇرۇش ياكى ئۆچۈرۈش قېتىم سانى 2 چەكتىن ئېشىپ كەتمىسە ، گۇرۇپپىغا قىستۇرما قوشۇلىدۇ ، ئومۇمىي گۇرۇپپا چاستوتىسى قانچە قېتىم قوشۇلغانلىقى بىلەن كۆپىيىدۇ.گۇرۇپپىغا قوشۇلغان قىستۇرمىلار ئىشلىتىلگەن دەپ بەلگە قويۇلغان ۋە كېيىنكى بىر تەرەپ قىلىشتىن چىقىرىۋېتىلگەن.ئەگەر بار بولغان گۇرۇپپىغا قىستۇرۇش تەرتىپىنى قوشقىلى بولمىسا ، قىستۇرۇش تەرتىپى مۇناسىپ قىستۇرۇش چاستوتىسى بىلەن يېڭى گۇرۇپپا قۇرۇش ئۈچۈن ئىشلىتىلىدۇ.ھەر بىر قىستۇرما تەرتىپى يېڭى گۇرۇپپا قۇرۇشقا ئىشلىتىلگەن ياكى ئاللىبۇرۇن بار بولغان گۇرۇپپىغا كىرگۈزۈلگەندە تەكرارلىنىش ئاخىرلىشىدۇ.نېمىلا دېگەنبىلەن ، يادرودىن تەركىب تاپقان گۇرۇپپا قىستۇرمىلار ئاخىرىدا پېپتىد تەرتىپى (پېپتىد كۈتۈپخانىسى) غا تەرجىمە قىلىنىدۇ.بۇ ئانالىزنىڭ نەتىجىسى ئۇدا ئوقۇش قېتىم سانىنى تەشكىل قىلىدىغان بىر يۈرۈش قىستۇرمىلار ۋە ئۇلارنىڭ ماس چاستوتىسى (قوشۇمچە 2-رەسىم).
Motif ئەۋلاد: ئۆزگىچە پېپتىدلار تىزىملىكىگە ئاساسەن ، تۆۋەندە كۆرسىتىلگەن بارلىق ئاممىنو كىسلاتا ئەندىزىسىنى ئۆز ئىچىگە ئالغان كۇتۇپخانا قۇرۇلدى.ئۇزۇنلۇقى 3 بولغان ھەر بىر ئەندىزە پېپتىدتىن ئېلىنغان ۋە ئۇنىڭ تەتۈر ئەندىزىسى بارلىق نەقىشلەر (تىرىپتېپتىدلار) نى ئۆز ئىچىگە ئالغان ئورتاق نەقىش ئامبىرى بىلەن قوشۇلغان.يۇقىرى تەكرارلانغان نەقىشلەرنىڭ كۈتۈپخانىلىرى تەرتىپلىك ۋە ئارتۇقچە چىقىرىۋېتىلدى.ئاندىن موتىف كۈتۈپخانىسىدىكى ھەر بىر تىرىپتىد ئۈچۈن ھېسابلاش قوراللىرى ئارقىلىق ئۇنىڭ كۇتۇپخانىدا بار-يوقلۇقىنى تەكشۈردۇق.بۇ خىل ئەھۋالدا ، تېپىلغان موتىف ترىپتېپتىدنى ئۆز ئىچىگە ئالغان پېپتىدنىڭ چاستوتىسى قوشۇلۇپ موتىف كۈتۈپخانىسىدىكى موتىفقا تەقسىملىنىدۇ («نەقىش سانى»).نەقىش ھاسىل قىلىشنىڭ نەتىجىسى ئۈچ ئۆلچەملىك سانلار گۇرپىسى بولۇپ ، تىرىپتېپتىد (موتىف) نىڭ بارلىق ھادىسىلىرى ۋە ئۇلارنىڭ مۇناسىپ قىممەتلىرىنى ئۆز ئىچىگە ئالىدۇ.يۇقىرىدا تەپسىلىي بايان قىلىنغان ئۆلچەملەر.
نەقىش ۋە ماس چېچىلىش سانىنىڭ نورماللىشىشى: ھەر بىر ئەۋرىشكە ئۈچۈن نەقىش سانى نورماللاشتۇرۇلدى
بۇ يەردە ni بولسا تېما بولغان ئوقۇش سانى.شۇڭا ، vi ئەۋرىشكىدە موتىف بولغان ئوقۇش (ياكى پېپتىد) نىڭ پىرسەنت چاستوتىسىغا ۋەكىللىك قىلىدۇ.نورمال بولمىغان موتىفلارنىڭ P قىممىتى Fisher نىڭ ئېنىق سىنىقىدىن پايدىلىنىپ ھېسابلىنىدۇ.مۇددىئا سانىنىڭ مۇناسىۋەتلىك پروگراممىلىرىغا كەلسەك ، نەيزەنىڭ باغلىنىشى R. بىلەن نورماللاشقان مۇددىئا سانى ئارقىلىق ھېسابلىنىدۇ.
پېپتىد كۈتۈپخانىسىدىكى ھەر بىر ئورۇندىكى ئامىنو كىسلاتاسىنىڭ مەزمۇنىنى تەسۋىرلەش ئۈچۈن ، 32 ، 33 (http://weblogo.threeplusone.com) تور خاتىرىسى قۇرۇلدى.بىرىنچىدىن ، 12 مېر پېپتىدنىڭ ھەر بىر ئورنىدىكى ئامىنو كىسلاتاسىنىڭ مىقدارى 20 × 12 ماترىسسادا ساقلىنىدۇ.ئاندىن كېيىن ، ھەر بىر ئورۇندا ئوخشاش نىسپىي ئامىنو كىسلاتاسى بار 1000 پېپتىد تېز سۈرئەتلىك تەرتىپ شەكلىدە ھاسىل بولىدۇ ۋە تور بەلگىسى 3 گە كىرگۈزۈش شەكلىدە تەمىنلىنىدۇ ، بۇ ھەر بىر ئورۇندىكى نىسپىي ئامىنو كىسلاتاسىنىڭ گرافىكلىق ئىپادىسىنى ھاسىل قىلىدۇ.بېرىلگەن پېپتىد كۈتۈپخانىسى ئۈچۈن.كۆپ ئۆلچەملىك سانلىق مەلۇماتلارنى تەسۋىرلەش ئۈچۈن ، R دا ئىچكى قىسىمدا ياسالغان قورال (biosHeatmap ، تېخى ئېلان قىلىنمىغان R بولىقى) ئارقىلىق ئىسسىقلىق خەرىتىسى قۇرۇلدى.ئىسسىقلىق خەرىتىسىدە كۆرسىتىلگەن داندروگراممىلار ۋاردنىڭ قاتلاملىق گۇرۇپپىلاش ئۇسۇلى ئارقىلىق ئېۋكلىد ئارىلىقى ئۆلچىمى بىلەن ھېسابلىنىدۇ.نەقىش نومۇرى سانلىق مەلۇماتلىرىنى ستاتىستىكىلىق تەھلىل قىلىش ئۈچۈن ، فىشېرنىڭ ئېنىق سىنىقىدىن پايدىلىنىپ نورمالسىز نومۇرنىڭ P قىممىتى ھېسابلىنىدۇ.باشقا سانلىق مەلۇماتلارنىڭ P قىممىتى R دىكى ئوقۇغۇچىلارنىڭ T سىنىقى ياكى ANOVA ئارقىلىق ھېسابلىنىدۇ.
تاللانغان فازا كلونلىرى ۋە قىستۇرۇلمىغان باسقۇچلار قۇيرۇق تومۇرى ئارقىلىق تومۇرغا ئوكۇل قىلىندى (300 مىللىمېتىر PBS دىكى 2 × 1010 باسقۇچ / ھايۋان).خۇشپۇراق ۋە ئۇنىڭدىن كېيىنكى ئوڭشاشتىن ئون مىنۇت بۇرۇن ، ئوخشاش ھايۋانلار تومۇرغا 100 مىللىمېتىرلىق DyLight594 ماركىلىق لېكتور بىلەن ئوكۇل قىلىنغان (Vector Laboratories Inc., DL-1177).باسقۇچلۇق ئوكۇلدىن 60 مىنۇت كېيىن ، چاشقانلار يۈرەك ئارقىلىق 50 مىللىلېتىر PBS بىلەن 50 مىللىلېتىر% 4 لىك PFA / PBS بىلەن ساپلاشتۇرۇلغان.مېڭە ئەۋرىشكىسى% 4 PFA / PBS دا بىر كېچىدىلا مۇقىملاشتۇرۇلۇپ ،% 30 لىك ساخاروزاغا 4 سېلسىيە گرادۇسقا چىلانغان.ئەۋرىشكەلەر OCT ئارىلاشمىسىدا توڭلىتىلغان.توڭلىتىلغان ئەۋرىشكەلەرنىڭ ئىممۇنىتېتلىق خىمىيىلىك ئانالىزى ئۆي تېمپېراتۇرىسىدا% 30 لىك BSA بىلەن توسۇلۇپ ، 30 سېلسىيە گرادۇسلۇق كرىستاللىقتا ئېلىپ بېرىلىپ ، 4 سېلسىيە گرادۇسلۇق T7 باسقۇچى (Novus NB 600-376A) غا قارشى كۆپ قۇتۇپلۇق FITC ماركىلىق ئانتىتېلا سىڭدۈرۈلدى.بىر كېچىدىلا يوشۇرۇن.ئاخىرىدا ، بۆلەكلەر PBS بىلەن 3 قېتىم يۇيۇلدى ۋە ماسلاشتۇرۇلغان لازېر مىكروسكوپ (Leica TCS SP5) بىلەن تەكشۈرۈلدى.
ئەڭ تۆۋەن ساپلىقى% 98 بولغان بارلىق پېپتىدلار ئامېرىكا GenScript تەرىپىدىن بىرىكتۈرۈلگەن ، بىئوتىن بىرىكتۈرۈلگەن ۋە لىمفىللانغان.بىئوتىن N تېرمىنالىدا قوشۇمچە ئۈچ خىل گلىكسىن بوشلۇق ئارقىلىق باغلىنىدۇ.ئاممىۋى سپېكترى ئارقىلىق بارلىق پېپتىدلارنى تەكشۈرۈڭ.
سترېپتاۋىدىن (Sigma S0677) بىئوتىن بىرىكتۈرۈلگەن پېپتىد ، بىئوتىن بىرىكتۈرۈلگەن BACE1 تورمۇزلاش پېپتىد ياكى BBSE1 تورمۇزلاش پېپتىدنىڭ بىرىكمىسى (3: 1 نىسبىتى) بىلەن PBS دا 5-10% لىك ئارىلاشما پېپتىد ئارىلاشتۇرۇلغان.ئوكۇل سېلىشتىن بۇرۇن ئۆي تېمپېراتۇرىسىدا 1 سائەت.سترېپتاۋىدىن بىرىكتۈرۈلگەن پېپتىدلار چوڭ مېڭە بوشلۇقى بىلەن چاشقاننىڭ قۇيرۇق تومۇرلىرىنىڭ بىرىگە 10 مىللىگىرام / كىلوگىرام دورا بىلەن تومۇرغا ئوكۇل قىلىندى.
سترېپتاۋىدىن-پېپتىد مۇرەككەپ ماددىلىرىنىڭ قويۇقلۇقى ELISA تەرىپىدىن باھالانغان.Nunc Maxisorp مىكرو تىپلىق پىلاستىنكا (Sigma) بىر كېچىدىلا 4 سېلسىيە گرادۇستا 1.5 mgg / ml چاشقانغا قارشى تۇرغۇچى ئانتىتېلا (تېرمو ، MA1-20011) بىلەن سىرلانغان.ئۆي تېمپېراتۇرىسىدا 2 سائەت توسۇۋالغاندىن كېيىن (بۇففېرنى توسۇش: 140 nM NaCL ، 5 mM EDTA ،% 0.05 NP40 ،% 0.25 ھايۋانات يىلىمى ،% 1 BSA) ئۆي تېمپېراتۇرىسىدا 2 سائەت تۇرغۇزغاندىن كېيىن ، تاختاينى توسۇش بۇففېر بىلەن سۇيۇلدۇرۇلغان قۇدۇقلارغا CSF ۋە پلازما ئەۋرىشكىسى قوشۇلدى (پلازما 1: 10,000 ، CSF 1: 115).ئاندىن بۇ تەخسە 4 سېلسىيە گرادۇسلۇق كېچىدە تەكشۈرۈش ئانتىتېلاسى (1 mgg / ml ، سترېپتاۋىدىنغا قارشى HRP ، نوۋۇس NB120-7239) بىلەن بىر كېچىدىلا سىلىندى.ئۈچ قېتىم يۇيۇش باسقۇچىدىن كېيىن ، streptavidin TMB تارماق بالا ئېرىتمىسى (Roche) دىكى يوشۇرۇن ھالەتتە 20 مىنۇتقىچە بايقالغان.1M H2SO4 بىلەن رەڭ تەرەققىياتىنى توختاتقاندىن كېيىن ، سۈمۈرۈلۈش مىقدارىنى 450 nm.
The streptavidin-peptide-BACE1 inhibitor complex نىڭ ئىقتىدارى ئىشلەپچىقارغۇچىنىڭ كېلىشىمنامىسىگە ئاساسەن Aβ (1-40) ELISA تەرىپىدىن باھالانغان (ۋاكو ، 294-64701).قىسقىچە قىلىپ ئېيتقاندا ، CSF ئەۋرىشكىسى ئۆلچەملىك سۇيۇقلۇقتا سۇيۇلدۇرۇلدى (1:23) ھەمدە BNT77 تۇتۇلغان ئانتىتېلا بىلەن سىرلانغان 96 قۇدۇق تاختىسىدا بىر كېچە ° C 4 قا چىقتى.بەش يۇيۇش باسقۇچىدىن كېيىن ، HRP بىرىكتۈرۈلگەن BA27 ئانتىتېلاسى قوشۇلۇپ ، ° C4 قا 2 سائەت سىڭدۈرۈلدى ، ئاندىن بەش يۇيۇش باسقۇچى.Aβ (1-40) ئۆي تېمپېراتۇرىسىدا TMB ئېرىتمىسىدە 30 مىنۇت يوشۇرۇن ھالەتتە بايقالغان.توختىتىش ھەل قىلىش ئۇسۇلى بىلەن رەڭ ئېچىش توختىتىلغاندىن كېيىن ، سۈمۈرۈلۈشنى 450 nm غا ئۆلچەڭ.پلازما ئەۋرىشكىسى Aβ (1-40) ELISA دىن ئىلگىرى قاتتىق فازا ئېلىشقا ئۇچرىغان.پلازما 96 قۇدۇق تەخسىگە% 0.2 DEA (Sigma) غا قوشۇلدى ۋە ئۆي تېمپېراتۇرىسىدا 30 مىنۇت سىڭدۈرۈلدى.SPE تاختىسىنى (Oasis ، 186000679) ئارقا-ئارقىدىن سۇ ۋە% 100 مېتانول بىلەن يۇيغاندىن كېيىن ، SPE تەخسىلىرىگە پلازما ئەۋرىشكىسى قوشۇلدى ۋە بارلىق سۇيۇقلۇقلار چىقىرىۋېتىلدى.ئەۋرىشكەلەر يۇيۇلدى (ئالدى بىلەن% 5 مېتانول ، ئاندىن% 30 مېتانول) ۋە% 2 NH4OH / 90% مېتانول بىلەن ئېرىتىلدى.تۇراقلىق N2 ئېقىمىدا 55 سېلسىيە گرادۇسلۇق سۇيۇقلۇقنى 99 مىنۇت قۇرۇتقاندىن كېيىن ، ئۆلچەملىك سۇيۇقلۇقتا ئەۋرىشكە ئازايتىلدى ۋە Aβ (1-40) يۇقىرىدا بايان قىلىنغاندەك ئۆلچەم قىلىندى.
بۇ ماقالىنى قانداق نەقىل كەلتۈرۈش: Urich ، E. قاتارلىقلار.Vivo دا ئېنىقلانغان ئۆتكۈنچى پېپتىد ئارقىلىق مېڭىگە يۈك يەتكۈزۈش.the science.5, 14104;doi: 10.1038 / srep14104 (2015).
Likhota J., Skjorringe T., Thomsen LB ۋە Moos T. نىشانلىق داۋالاش ئارقىلىق چوڭ مېڭىگە ماكرو مولېكۇلا دورىلىرىنى يەتكۈزۈش.نېرۋا خىمىيىلىك ژورنىلى 113 ، 1–13 ، 10.1111 / j.1471-4159.2009.06544.x (2010).
Brasnjevic, I., Steinbusch, HW, Schmitz, C., and Martinez-Martinez, P. پېپتىد ۋە ئاقسىل دورىلىرىنى قان-مېڭە توسىقىدىن يەتكۈزۈش.Prog Neurobiol 87 ، 212–251 ، 10.1016 / j.pneurobio.2008.12.002 (2009).
پاردرىج ، WM قان-مېڭە توسىقى: مېڭە زەھەرلىك چېكىملىك ​​تەرەققىياتىدىكى توسالغۇ.NeuroRx 2, 3–14, 10.1602 / neurorx.2.1.3 (2005).
يوھانسون ، KE ، دونكان ، JA ، ستوپا ، EG ۋە Byrd ، A. خوروئىد ئەۋرىشىم CSF يولى ئارقىلىق زەھەرلىك چېكىملىك ​​يەتكۈزۈشنى ياخشىلاش ۋە مېڭىگە نىشان قىلىش ئىستىقبالى.دورىگەرلىك تەتقىقاتى 22 ، 1011–1037 ، 10.1007 / s11095-005-6039-0 (2005).
پاردرىج ، WM مېڭىنى يەتكۈزۈش ئۈچۈن مولېكۇلا ترويا ئاتلىرى بىلەن بىئولوگىيىلىك دورىلارنى زامانىۋىلاشتۇرۇش.Bioconjug Chem 19, 1327–1338, 10.1021 / bc800148t (2008).
پاردرىج ، WM قوبۇل قىلغۇچى ۋاسىتىچى پېپتىد قان-مېڭە توسىقىدىن ئۆتىدۇ.Endocr Rev. 7, 314–330 (1986).
Niewoehner, J. et al.مونوپوللۇق مولېكۇلا توشۇغۇچى ئارقىلىق داۋالاش ئانتىتېلاسىنىڭ مېڭىگە سىڭىپ كىرىش ۋە ئۈنۈمىنى ئاشۇرۇش.Neuron 81, 49–60, 10.1016 / j.neuron.2013.10.061 (2014).
Bien-Lee, N. et al.Transferrin قوبۇللىغۇچىسى (TfR) توشۇش TfR ئانتىتېلاسىنىڭ يېقىنلىق ۋارىيانتلىرىنىڭ مېڭىنىڭ قوبۇل قىلىنىشىنى بەلگىلەيدۇ.J Exp Med 211 ، 233–244 ، 10.1084 / jem.20131660 (2014).