Дякуємо за відвідування Nature.com. Версія веб-переглядача, яку ви використовуєте, має обмежену підтримку CSS. Для найкращого досвіду ми рекомендуємо вам використовувати оновлений браузер (або вимкнути режим сумісності в Internet Explorer). Тим часом, щоб забезпечити постійну підтримку, ми відображатимемо сайт без стилів і JavaScript.
Морфогенез кишечника людини встановлює особливості тривимірної епітеліальної мікроархітектури та просторової організації крипт-ворсинок. Ця унікальна структура потрібна для підтримки кишкового гомеостазу шляхом захисту ніші стовбурових клітин у базальній крипті від екзогенних мікробних антигенів та їх метаболітів. Крім того, кишкові ворсинки та секретуючий слиз представляють функціонально диференційовані епітеліальні клітини із захисним бар’єром на поверхні слизової оболонки кишечника. Таким чином, відтворення 3D епітеліальних структур має вирішальне значення для побудови моделей кишківника in vitro. Зокрема, органічний міметик gut-on-a-chip може індукувати спонтанний 3D-морфогенез кишкового епітелію з покращеними фізіологічними функціями та біомеханікою. Тут ми надаємо відтворюваний протокол для надійної індукції кишкового морфогенезу в кишківнику. t на мікрофлюїдному чіпі, а також у вбудованому гібридному чіпі Transwell. Ми описуємо детальні методи виготовлення пристроїв, культивування епітеліальних клітин Caco-2 або кишкових органоїдів у звичайних умовах, а також на мікрофлюїдній платформі, індукцію 3D-морфогенезу та характеристику встановленого 3D-епітелію за допомогою кількох методів візуалізації. Цей протокол забезпечує регенерацію функціональної кишки. мікроархітектури, контролюючи базолатеральний потік рідини протягом 5 днів. Наш метод морфогенезу in vitro використовує фізіологічно релевантну напругу зсуву та механічний рух і не вимагає складної клітинної інженерії чи маніпуляцій, що може перевершити інші існуючі методи. Ми передбачаємо, що запропонований нами протокол може мати широкі наслідки для біомедичної дослідницької спільноти, забезпечуючи метод регенерації 3D шарів епітелію кишечника in vitro для біомедичних, клінічних та фармацевтичне застосування.
Експерименти демонструють, що кишкові епітеліальні клітини Caco-2, культивовані в мікрофлюїдних пристроях типу кишка-на-чіпі1,2,3,4,5 або двошарових мікрофлюїдних пристроях6,7, можуть піддаватися спонтанному 3D-морфогенезу in vitro без чіткого розуміння основного механізму. У нашому нещодавньому дослідженні ми виявили, що видалення базолатерально секретованих антагоністів морфогену з пристроїв для культивування є необхідним і достатнім для індукування 3D-морфогенезу епітелію. фогенез in vitro, що було продемонстровано за допомогою Caco-2 і кишкових органоїдів, отриманих пацієнтом.Епітеліальні клітини були підтверджені. У цьому дослідженні ми спеціально зосередилися на клітинному виробництві та розподілі концентрації потужного антагоніста Wnt, Dickkopf-1 (DKK-1), у кишківнику на чіпі та модифікованих мікрофлюїдних пристроях, що містять вставки Transwell, які називаються «гібридними чіпами». Ми демонструємо, що додавання екзогенних антагоністів Wnt (таких як DKK-1, репресор Wnt 1, секретований frizzled) -споріднений білок 1, або Soggy-1) в кишечнику на чіпі, пригнічує морфогенез або порушує попередньо структурований 3D-епітеліальний шар, що свідчить про те, що антагоністичний стрес під час культивування відповідає за кишковий морфогенез in vitro. Таким чином, практичний підхід до досягнення надійного морфогенезу на епітеліальному поєднанні полягає у видаленні або мінімальному підтримці рівнів антагоністів Wnt в базолатеральному відділі активним промиванням (наприклад, на платформах типу "кишка на чіпі" або "гібрид на чіпі") або дифузії. Базолатеральне середовище (наприклад, із вставок Transwell у великі базолатеральні резервуари в свердловинах).
У цьому протоколі ми надаємо детальний метод виготовлення мікропристроїв кишки на чіпі та гібридних чіпів Transwell, які можна вставляти (кроки 1-5) для культивування кишкових епітеліальних клітин на пористих мембранах на основі полідиметилсилоксану (PDMS) (кроки 6A, 7A, 8, 9) або поліефірних мембранах вставок Transwell (кроки 6B, 7B, 8, 9) та індукований 3D-морфогенез in vitro (етап 10). Ми також ідентифікували клітинні та молекулярні особливості, що вказують на тканиноспецифічний гістогенез і залежну від лінії клітинну диференціацію, застосовуючи кілька методів візуалізації (кроки 11-24). Ми індукуємо морфогенез за допомогою епітеліальних клітин кишечника людини, таких як Caco-2 або кишкових органоїдів, у двох форматах культури з технічними деталями, включаючи модифікації поверхні. іфікація пористих мембран, створення двовимірних моношарів, кишкова біохімічна та відтворення біомеханічного мікросередовища in vitro. Щоб індукувати 3D морфогенез із 2D епітеліальних моношарів, ми видалили антагоністи морфогену в обох культивованих формах шляхом введення середовища в базолатеральний відділ культури. Нарешті, ми надаємо уявлення про корисність відновлюваного 3D епітелію. теліального шару, який можна використовувати для моделювання морфоген-залежного росту епітелію, поздовжньої спільної культури хазяїна та мікробіому, патогенної інфекції, запального ураження, дисфункції епітеліального бар’єру та терапії на основі пробіотиків.
Наш протокол може бути корисним широкому колу вчених у фундаментальних (наприклад, біологія слизової оболонки кишечника, біологія стовбурових клітин і біологія розвитку) і прикладних дослідженнях (наприклад, доклінічні випробування ліків, моделювання захворювань, тканинна інженерія та гастроентерологія). Завдяки відтворюваності та надійності нашого протоколу для індукування 3D-морфогенезу кишкового епітелію in vitro ми передбачаємо, що наші Технічну стратегію можна розповсюдити серед аудиторії, яка вивчає динаміку клітинної сигналізації під час кишкового розвитку, регенерації або гомеостазу. Крім того, наш протокол корисний для опитування про інфекцію внаслідок різних інфекційних агентів, таких як Норовірус 8, Коронавірус 2 тяжкого гострого респіраторного синдрому (SARS-CoV-2), Clostridium difficile, Salmonella Typhimurium 9 або Vibrio cholerae.Аудиторії патології та патогенезу захворювання також корисні. Використання мікрофізіологічної системи кишківника на чіпі може дозволити поздовжнє спільне культивування 10 та подальшу оцінку захисту організму, імунних відповідей і відновлення пов’язаних з патогенами пошкоджень у шлунково-кишковому тракті (ШКТ) 11. Інші розлади шлунково-кишкового тракту, пов’язані з синдромом негерметичної кишки, целіакією, хворобою Крона, виразковим колітом, резервуарним резервуаром або Синдром подразненого кишечника можна моделювати, коли 3D-шари кишкового епітелію готуються з використанням 3D-шарів кишкового епітелію пацієнта. Ці захворювання включають атрофію ворсинок, вкорочення крипт, пошкодження слизової оболонки або порушення епітеліального бар’єру. Біопсія або кишкові органоїди, отримані зі стовбурових клітин12,13. Щоб краще моделювати вищу складність середовища захворювання, читачі може розглянути можливість додавання релевантних для захворювання типів клітин, таких як мононуклеарні клітини периферичної крові пацієнта (PBMCs), до моделей, що містять 3D мікроархітектури кишкової ворсинки-крипти.тканиноспецифічні імунні клітини, 5.
Оскільки тривимірну епітеліальну мікроструктуру можна зафіксувати та візуалізувати без процесу розрізу, глядачі, які працюють над просторовою транскриптомікою та зображеннями високої або надвисокої роздільної здатності, можуть зацікавитися нашим картуванням просторово-часової динаміки генів і білків в епітеліальних нішах.Цікавиться технологіями. Відповідь на мікробні або імунні стимули. Крім того, поздовжні перехресні зв’язки між господарем і мікробіомом 10, 14, які координують гомеостаз кишечника, можуть бути встановлені в 3D-шарі слизової оболонки кишечника шляхом спільного культивування різних мікробних видів, мікробних спільнот або фекальної мікробіоти, особливо в кишечнику на чіпі.на платформі. Цей підхід особливо привабливий для аудиторії, яка вивчає імунологію слизової оболонки, гастроентерологію, мікробіом людини, культуроміку та клінічну мікробіологію, яка прагне культивувати раніше некультивовану кишкову мікробіоту в лабораторії. Якщо наш протокол морфогенезу in vitro можна адаптувати до культуральних форматів, що масштабуються, таких як багатолункові вставки в 24, 96 або 384-лункові планшети, які постійно поповнюють базо У бічних компартментах протокол також можна розповсюдити серед тих, хто розробляє фармацевтичні, біомедичні або високопродуктивні скринінгові або перевірочні платформи для харчової промисловості. Як доказ принципу, ми нещодавно продемонстрували можливість створення мультиплексної високопродуктивної системи морфогенезу, масштабованої до формату 24-лункового планшета. Крім того, кілька продуктів органу на чіпі були комерціалізовані16,17,18. Крім того, валідація нашого методу морфогенезу in vitro може бути прискорена та потенційно прийнята багатьма науково-дослідницькими лабораторіями, промисловістю чи державними та регуляторними органами для розуміння клітинного перепрограмування морфогенезу кишечника in vitro на транскриптомному рівні для тестування ліків або біотерапевтичних препаратів. Всмоктування та транспорт препаратів-кандидатів оцінювали за допомогою 3D-сурогатів кишківника або використання спеціальних або комерційних моделей органу на чіпі для оцінки відтворюваності процес морфогенезу кишечника.
Для вивчення морфогенезу кишкового епітелію було використано обмежену кількість релевантних для людини експериментальних моделей, головним чином через відсутність реалізованих протоколів для індукції 3D-морфогенезу in vitro. Фактично, значна частина поточних знань про морфогенез кишечника базується на дослідженнях на тваринах (наприклад, на рибках даніо20, мишах21 або курчатах22). Однак вони є трудомісткими та коштовними, можуть бути етично сумнівно, і, що найважливіше, не точно визначає процеси розвитку людини. Ці моделі також дуже обмежені у своїй здатності тестувати за допомогою багатостороннього масштабування. Тому наш протокол для регенерації 3D-структур тканин in vitro перевершує моделі тварин in vivo, а також інші традиційні статичні 2D-моделі культури клітин. Як описано раніше, використання 3D-епітеліальних структур дозволило нам вивчити просторові локалізація диференційованих клітин на осі крипта-ворсинка у відповідь на різні слизові або імунні стимули. Тривимірні епітеліальні шари можуть надати простір для вивчення того, як мікробні клітини конкурують за формування просторових ніш та екологічної еволюції у відповідь на фактори хазяїна (наприклад, внутрішні та зовнішні шари слизу, секреція IgA та антимікробних пептидів). Крім того, тривимірна морфологія епітелію може дозволити нам зрозуміти, як кишкова мікробіота структурує свої спільноти та синергетично виробляє мікробні метаболіти (наприклад, коротколанцюгові жирні кислоти), які формують клітинну організацію та ніші стовбурових клітин у базальних криптах. Ці особливості можна продемонструвати лише тоді, коли тривимірні епітеліальні шари створюються in vitro.
На додаток до нашого методу створення тривимірних кишкових епітеліальних структур існує кілька методів in vitro. Культивування кишкових органоїдів — це найсучасніша техніка тканинної інженерії, яка базується на культивуванні кишкових стовбурових клітин у певних морфогенних умовах23,24,25. Однак використання тривимірних моделей органоїдів для транспортного аналізу або спільного культивування хазяїна та мікробіому часто є складним, оскільки просвіт кишечника є складним. укладені всередині органоїду, і, отже, введення люмінальних компонентів, таких як мікробні клітини або екзогенні антигени, обмежене.Доступ до просвітів органоїдів можна покращити за допомогою мікроін’єктора,26,27, але цей метод є інвазивним і трудомістким і вимагає спеціальних знань для виконання. Крім того, традиційні культури органоїдів, які зберігаються в гідрогелевих каркасах у статичних умовах, не точно відображають активну біомеханіку in vivo.
Інші підходи, застосовувані декількома дослідницькими групами, використовують попередньо структуровані тривимірні гідрогелеві каркаси для імітації епітеліальної структури кишківника шляхом культивування ізольованих кишкових клітин людини на поверхні гелю. Виготовляйте гідрогелеві каркаси за допомогою 3D-друкованих, мікрофрезерованих або виготовлених за допомогою літографії форм. Цей метод показує самоорганізоване розташування ізольованих епітеліальних клітин in vitro з фізіологічно відповідними градієнтами морфогену. , встановлюючи епітеліальну структуру з високим співвідношенням сторін і строму-епітеліальний перехресний зв’язок шляхом включення стромальних клітин у каркас. Однак природа попередньо структурованих каркасів може перешкоджати відображенню самого спонтанного морфогенетичного процесу. Ці моделі також не забезпечують динамічний люмінальний або інтерстиціальний потік, не вистачає стресу зсуву рідини, необхідного кишковим клітинам для морфогенезу та отримання фізіологічної функції. В іншому недавньому дослідженні використовувалися гідрогелеві каркаси в мікрофлюїдній платформі та візерунки епітеліальних структур кишечника за допомогою методів лазерного травлення. Кишкові органоїди миші слідують за витравленими візерунками для формування кишкових трубчастих структур, а внутрішньопросвітний потік рідини можна повторити за допомогою мікрофлюїдного модуля. Однак ця модель не демонструє ані спонтанних морфогенетичних процесів, ані включає механобіологічні рухи кишечника Технології .3D-друку тієї ж групи дозволили створити мініатюрні кишкові трубки зі спонтанними морфогенетичними процесами. Незважаючи на складне виготовлення різних сегментів кишечника всередині трубки, ця модель також не має потоку рідини в просвіті та механічної деформації. Крім того, працездатність моделі може бути обмежена, особливо після завершення процесу біодруку, що порушує експериментальні умови або взаємодію між клітинами. Натомість запропонований нами протокол забезпечує спонтанний морфоген кишечника. esis, фізіологічно релевантне напруження зсуву, біомеханіка, яка імітує моторику кишечника, доступність незалежних апікальних і базолатеральних відділів і відтворення складних біологічних мікросередовища модульності. Таким чином, наш протокол 3D морфогенезу in vitro може забезпечити додатковий підхід для подолання проблем існуючих методів.
Наш протокол повністю зосереджений на тривимірному епітеліальному морфогенезі, лише з епітеліальними клітинами в культурі та без інших типів оточуючих клітин, таких як мезенхімальні клітини, ендотеліальні клітини та імунні клітини. Як було описано раніше, ядром нашого протоколу є індукція епітеліального морфогенезу шляхом видалення інгібіторів морфогену, що секретуються на базолатеральній стороні введеного середовища. Хоча надійна модульність наші кишки на чіпі та гібриди на чіпі дозволяють нам відтворити хвилястий 3D епітеліальний шар, додаткові біологічні складності, такі як епітеліально-мезенхімальні взаємодії33,34, відкладення позаклітинного матриксу (ECM) 35 і, у нашій моделі, особливості крипти-ворсинки, які передають ніші стовбурових клітин у базальних криптах, ще потрібно розглянути далі. Стромальні клітини (наприклад, фіброзні) бласти) у мезенхімі відіграють ключову роль у виробництві білків ECM та регуляції кишкового морфогенезу in vivo35,37,38. Додавання мезенхімальних клітин до нашої моделі посилило морфогенетичний процес та ефективність прикріплення клітин. Ендотеліальний шар (тобто капіляри або лімфатичні судини) відіграє важливу роль у регуляції молекулярного транспорту39 та залучення імунних клітин40 у кишечнику мікросередовище. Крім того, компоненти судинної системи, які можна з’єднати між моделями тканин, є обов’язковою умовою, коли моделі тканин розроблені для демонстрації взаємодії між кількома органами. Отже, ендотеліальні клітини можуть знадобитися включити для моделювання більш точних фізіологічних особливостей із роздільною здатністю на рівні органу. Імунні клітини, отримані від пацієнтів, також важливі для відображення вроджених імунних реакцій, презентації антигену, вродженого адаптивного імунного перехресного зв’язку та тканиноспецифічного перехресного впливу. c імунітет в контексті імітації кишкового захворювання.
Використання гібридних чіпів є більш простим, ніж кишка на чіпі, оскільки налаштування пристрою простіше, а використання вставок Transwell дозволяє масштабувати культуру кишкового епітелію. Однак доступні в продажу вставки Transwell з поліефірними мембранами не є еластичними та не можуть імітувати перистальтичні рухи. Крім того, апікальний відсік вставки Transwell, розміщеної в гібридному чіпі, залишався нерухомим. напруга на апікальній стороні. Очевидно, що статичні властивості в апікальному відділі рідко дозволяють довготривале спільне культивування бактерій у гібридних чіпах. Хоча ми можемо надійно індукувати 3D-морфогенез у вставках Transwell при використанні гібридних чіпів, дефіцит фізіологічно значущої біомеханіки та апікального потоку рідини може обмежити здійсненність платформ гібридних чіпів для потенційного застосування.
Повномасштабні реконструкції осі крипта-ворсинка людини в культурах кишківника на чіпі та гібридів на чіпі не були повністю встановлені. Оскільки морфогенез починається з епітеліального моношару, 3D-мікроархітектури не обов’язково забезпечують морфологічну подібність до крипт in vivo. Хоча ми охарактеризували популяцію проліферуючих клітин поблизу базального домену крипт в мікромоторі 3D-епітелій, крипта і ворсинчасті ділянки не були чітко розмежовані. Хоча вищі верхні канали на чіпі призводять до збільшення висоти мікроінженерного епітелію, максимальна висота все ще обмежена ~300–400 мкм. Фактична глибина людських кишкових крипт у тонкій і товстій кишках становить ~135 мкм і ~400 мкм відповідно, а висота ворсинки тонкої кишки ~600 мкм41.
З точки зору візуалізації, зображення надвисокої роздільної здатності in situ для 3D-мікроархітектур може бути обмежене кишкою на чіпі, оскільки необхідна робоча відстань від лінзи об’єктива до епітеліального шару становить близько кількох міліметрів. Щоб подолати цю проблему, може знадобитися віддалений об’єктив. Крім того, виготовлення тонких зрізів для підготовки зразків зображень є складним завданням через високу еластичність PDMS. Крім того, Оскільки пошарове мікровиготовлення кишечника на чіпі передбачає постійне зчеплення між кожним шаром, надзвичайно складно відкрити або видалити верхній шар, щоб дослідити структуру поверхні епітеліального шару. Наприклад, за допомогою скануючого електронного мікроскопа (SEM).
Гідрофобність PDMS була обмежувальним фактором у мікрофлюїдних дослідженнях, присвячених гідрофобним малим молекулам, оскільки PDMS може неспецифічно адсорбувати такі гідрофобні молекули. Альтернативи PDMS можна розглянути з іншими полімерними матеріалами. Крім того, можна розглянути модифікацію поверхні PDMS (наприклад, покриття ліпофільними матеріалами 42 або полі(етиленгліколем) 43) для мінімізації адсорбція гідрофобних молекул.
Нарешті, наш метод не був добре охарактеризований з точки зору забезпечення високопродуктивного скринінгу або «універсальної» зручної експериментальної платформи. Поточний протокол вимагає шприцевого насоса на мікропристрій, що займає місце в CO2-інкубаторі та запобігає широкомасштабним експериментам. Це обмеження можна значно покращити за рахунок масштабованості інноваційних форматів культур (наприклад, 24-лункових, 96-лункових або 384-лункових). добре пористі вставки, що дозволяють безперервно поповнювати та видаляти базолатеральне середовище).
Щоб індукувати 3D-морфогенез кишкового епітелію людини in vitro, ми використали кишковий пристрій із мікрофлюїдним чіпом, що містить два паралельні мікроканали та еластичну пористу мембрану між ними для створення інтерфейсу просвіт-капіляр. Ми також демонструємо використання одноканального мікрофлюїдного пристрою (гібридного чіпа), який забезпечує безперервний базолатеральний потік під вирощеними поляризованими епітеліальними шарами. на вставках Transwell. На обох платформах морфогенез різних кишкових епітеліальних клітин людини можна продемонструвати шляхом застосування спрямованої маніпуляції потоком для видалення антагоністів морфогену з базолатерального компартменту. Уся експериментальна процедура (рис. 1) складається з п’яти частин: (i) мікровиготовлення кишкового чіпа або вставного гібридного чіпа Transwell (кроки 1-5; блок 1), (ii) підготовка кишкові епітеліальні клітини (клітини Caco-2) або кишкові органоїди людини;поля 2-5), (iii) культура кишкових епітеліальних клітин на кишкових чіпах або гібридних чіпах (кроки 6-9), (iv) індукція 3D-морфогенезу in vitro (етап 10) і (v) ) для характеристики мікроструктури 3D-епітелію (кроки 11-24). Нарешті, відповідна контрольна група (обговорювана далі) була розроблена для перевірки ефективність морфогенезу in vitro шляхом порівняння епітеліального морфогенезу з просторовим, часовим, умовним або процедурним контролем.
Ми використовували дві різні культурні платформи: кишка на чіпі з прямими каналами або нелінійними звивистими каналами, або гібридні чіпи, що містять вставки Transwell (TW) у мікрофлюїдному пристрої, виготовлені, як описано у вставці 1, і крок 1-5 «Виготовлення пристрою» показує основні етапи створення одного чіпа або гібридного чіпа. «Культивування епітеліальних клітин кишечника людини» пояснює джерело клітин. (Caco-2 або кишкові органоїди людини) і процедура культивування, що використовується в цьому протоколі. «Морфогенез in vitro» показує загальні етапи, на яких Caco-2 або епітеліальні клітини, отримані з органоїдів, культивуються на кишковому чіпі або на вставках Transwell гібридного чіпа з подальшою індукцією 3D-морфогенезу та формуванням характерної епітеліальної структури. Номер кроку програми або номер поля відображається нижче кожна стрілка. Додаток надає приклади того, як можна використовувати встановлені кишкові епітеліальні шари, наприклад, для визначення характеристик клітинної диференціації, фізіологічних досліджень кишківника, створення екосистем господаря-мікробіому та моделювання захворювань. Імунофлуоресцентні зображення в «Диференціації клітин», що показують ядра, F-актин і MUC2, експресовані в 3D Caco-2 епітеліальному шарі, створеному в кишечнику чіп. Передача сигналу MUC2 присутня в келихоподібних клітинах і слизу, що виділяється з поверхонь слизової оболонки. Флуоресцентні зображення в Gut Physiology показують слиз, утворений фарбуванням на залишки сіалової кислоти та N-ацетилглюкозаміну з використанням флуоресцентного аглютиніну зародків пшениці. Два зображення, що перекриваються, у «Спільних культурах хазяїна та мікроба» демонструють репрезентативні спільні культури хазяїна та мікробіому в кишківнику. чіп. На лівій панелі показано спільне культивування E. coli, що експресує зелений флуоресцентний білок (GFP) з мікроінженерними 3D Caco-2 епітеліальними клітинами. Права панель показує локалізацію GFP E. coli, культивовану спільно з 3D Caco-2 епітеліальними клітинами, з подальшим імунофлуоресцентним фарбуванням F-актином (червоний) і ядрами (синій). Моделювання захворювання ілюструє здорові порівняно з негерметичною кишкою в чіпсах запалення кишківника при фізіологічному впливі бактеріальними антигенами (наприклад, ліпополісахаридом, LPS) та імунними клітинами (наприклад, PBMC;зелений). Клітини Caco-2 культивували для створення тривимірного епітеліального шару. Масштабна шкала, 50 мкм. Зображення в нижньому рядку: «Диференціація клітин» адаптовано з дозволу посилання.2.Oxford University Press;Відтворено з дозволу Ref.5.NAS;«Спільне культивування господаря та мікроба» адаптовано з дозволу з посилання 3.NAS;«Моделювання захворювань» адаптовано з дозволу reference.5.NAS.
І мікросхеми «кишка на чіпі», і гібридні чіпи були виготовлені з використанням копій PDMS, які були витягнуті з кремнієвих форм за допомогою м’якої літографії1,44 та нанесені візерунком SU-8. Конструкція мікроканалів у кожному чіпі визначається з урахуванням гідродинаміки, такої як напруга зсуву та гідродинамічний тиск1,4,12. Оригінальна конструкція «кишка на чіпі» (розширені дані, рис. 1а), яка складалася з з двох розташованих поруч паралельних прямих мікроканалів, перетворився на складну кишку на чіпі (Розширені дані, рис. 1b), яка включає пару вигнутих мікроканалів для індукції збільшення часу перебування рідини, нелінійних моделей потоку та багатовісної деформації культивованих клітин (рис. 2a–f). 12. Коли потрібно відтворити більш складну біомеханіку кишечника, складні gu Можна вибрати t-on-a-chips. Ми продемонстрували, що заплутаний Gut-Chip також сильно індукує 3D-морфогенез за аналогічний часовий проміжок із подібним ступенем росту епітелію порівняно з оригінальним Gut-Chip, незалежно від типу культивованої клітини. Тому, щоб індукувати 3D-морфогенез, лінійні та складні дизайни кишківника на чіпі є взаємозамінними. Репліки PDMS, витримані на молі кремнію ds з візерунками SU-8 забезпечили негативні характеристики після вилучення (рис.2a). Щоб виготовити кишку на чіпі, підготовлений верхній шар PDMS послідовно прикріплювали до пористої плівки PDMS, а потім вирівнювали з нижнім шаром PDMS шляхом незворотного з’єднання за допомогою коронного обробника (рис. 2b–f). Для виготовлення гібридних чіпів затверділі копії PDMS прикріплювали до предметних стекол для створення одноканальних мікрофлюїдних пристроїв, які могли б підтримувати змінні вставки Transwell (рис. 2h і розширені дані, рис. 2). Процес зв’язування виконується шляхом обробки поверхонь копії PDMS і скла кисневою плазмою або коронним розрядом. Після стерилізації мікрофабрикатного пристрою, прикріпленого до силіконової трубки, пристрій був готовий для виконання 3D-морфогенезу епітелію кишечника (рис. 2g).
a, Схематичне зображення підготовки частин PDMS із візерункових кремнієвих форм SU-8. Незатверділий розчин PDMS було вилито в силіконову форму (ліворуч), затверділо при 60 °C (посередині) і витягнуто з форми (праворуч). Вийнятий з форми PDMS було розрізано на частини та очищено для подальшого використання. b, Фотографія силіконової форми, використаної для підготовки верхнього шару PDMS.c, Фотографія силіконової форми d, який використовується для виготовлення пористої мембрани PDMS.d, Серія фотографій верхніх і нижніх компонентів PDMS і зібраного кишкового пристрою на чіпі.e, Схема вирівнювання верхнього, мембранного та нижнього компонентів PDMS. Кожен шар необоротно з’єднаний плазмовою або коронною обробкою.f, Схема виготовленого пристрою кишка-на-чіпі з накладеним звивистим мікроканом nels і вакуумні камери.g Налаштування кишки на чіпі для мікрофлюїдної клітинної культури. Виготовлену кишку на чіпі, зібрану з силіконової трубки та шприца, помістили на накривне скельце. Пристрій із чіпом помістили на кришку 150-міліметрової чашки Петрі для обробки. Сполучна речовина використовується для закриття силіконової трубки.h, Візуальні знімки виготовлення гібридного чіпа і 3D морфогенез з використанням гібридних чіпів. Вставки Transwell, підготовлені незалежно для культивування 2D моношарів кишкових епітеліальних клітин, були вставлені в гібридний чіп, щоб індукувати кишковий 3D морфогенез. Середовище перфузується через мікроканали під шаром клітин, встановленим на вставці Transwell. Масштабна шкала, 1 см. год. Передруковано з дозволу посилання.4.Elsevier.
У цьому протоколі клітинна лінія Caco-2 і кишкові органоїди використовувалися як епітеліальні джерела (рис. 3a). Обидва типи клітин культивували незалежно (вставка 2 і вставка 5) і використовували для посіву покритих ECM мікроканалів кишечника на чіпі або вставок Transwell. Коли клітини зливаються (>95% покриття у колбах), регулярно культивують клітини Caco-2 (між пасажами). 10 і 50) у Т-колбах збирають для приготування дисоційованих клітинних суспензій за допомогою рідини для трипсинізації (блок 2). Кишкові органоїди людини з кишкових біопсій або хірургічних резекцій культивували в куполах матриці Matrigel у 24-лункових планшетах для підтримки структурного мікрооточення. Середовище, що містить важливі морфогени (такі як Wnt, R-спондин і No ggin) і фактори росту, приготовлені, як описано у вставці 3, додавали через день, доки органоїди не виростали до ~500 мкм у діаметрі. Повністю вирощені органоїди збирають і розділяють на окремі клітини для посіву в кишківник або вставки Transwell на чіп (вставка 5). Як ми повідомляли раніше, його можна диференціювати відповідно до типу захворювання12,13 (наприклад, виразковий коліт, хвороба Крона, кольорова тального раку або нормального донора), місце ураження (наприклад, ураження порівняно з неураженою ділянкою) і розташування в шлунково-кишковому тракті (наприклад, дванадцятипала кишка, порожня кишка, клубова кишка, сліпа кишка, товста кишка або пряма кишка). Ми надаємо оптимізований протокол у Вставці 5 для культивування органоїдів товстої кишки (колоїдів), які зазвичай потребують вищих концентрацій морфогенів, ніж органоїди тонкої кишки.
a, Робочий процес для індукції кишкового морфогенезу в кишковому чіпі. Caco-2 людський кишковий епітелій і кишкові органоїди використовуються в цьому протоколі для демонстрації 3D-морфогенезу. Ізольовані епітеліальні клітини були висіяні в підготовлений пристрій кишки на чіпі (підготовка чіпа). Після того, як клітини висіяно (посіяно) і прикріплено (прикріплено) до PDMS пориста мембрана на день 0 (D0), апікальний (AP) потік ініціюється та підтримується протягом перших 2 днів (потік, AP, D0-D2). Базолатеральний (BL) потік також ініціюється разом із циклічними рухами розтягування (розтягнення, потік, AP та BL), коли утворюється повний 2D моношар. Кишковий 3D морфогенез відбувався спонтанно після 5 днів мікрофлюїдної культури (морфогенез, D 5). Зображення з фазовим контрастом показують репрезентативну морфологію клітин Caco-2 на кожному експериментальному етапі або в момент часу (гістограма, 100 мкм). Чотири схематичні діаграми, що ілюструють відповідні каскади кишкового морфогенезу (вгорі праворуч). Пунктирні стрілки на схемі представляють напрямок потоку рідини.b, SEM зображення, що показує топологію поверхні створеного 3D епітелію Caco-2 (ліворуч). Виділення вставки збільшена область (білий пунктирний прямокутник) показує регенеровані мікроворсинки на 3D-шарі Caco-2 (праворуч).c, горизонтальний вид спереду створеного Caco-2 3D, клаудину (ZO-1, червоний) і безперервної щіткової межі мембран, позначених F-актином (зелений) і ядрами (синій). Імунофлуоресцентна конфокальна візуалізація епітеліальних клітин на кишкових чіпах. Стрілки, що вказують на середній схемі вкажіть розташування фокальної площини для кожного конфокального зображення.d, Хід морфологічних змін в органоїдах, культивованих на чіпі, отриманих за допомогою фазово-контрастної мікроскопії на 3, 7, 9, 11 і 13 дні. Вставка (вгорі праворуч) показує велике збільшення наданого зображення.e, DIC-мікрофотографія органоїдного 3D-епітелію, встановленого в кишківнику на зрізі, зробленому на 7 день.f, Над закладені імунофлюоресцентні зображення, що показують маркери стовбурових клітин (LGR5;пурпуровий), келихоподібні клітини (MUC2; зелений), F-актин (сірий) і ядра (блакитний), вирощені на мікросхемах кишечника протягом 3 днів, відповідно (ліворуч) і 13 днів (посередині) органоїди на епітеліальному шарі. Див. також розширені дані, малюнок 3, на якому показано передачу сигналів LGR5 без передачі сигналів MUC2. Флуоресцентні зображення, що демонструють епітеліальну мікроструктуру (праворуч) 3D-органу оїдний епітелій, встановлений у кишечнику на чіпі шляхом фарбування плазматичної мембрани барвником CellMask (праворуч) на 13-й день культивування. Масштабна шкала становить 50 мкм, якщо не вказано інше.b Передруковано з дозволу посилання.2.Oxford University Press;c Адаптовано з дозволу Reference.2.Oxford University Press;e і f адаптовано з дозволу за посиланням.12 За ліцензією Creative Commons CC BY 4.0.
У кишківнику на чіпі необхідно модифікувати гідрофобну поверхню пористої мембрани PDMS для успішного покриття ECM. У цьому протоколі ми застосовуємо два різні методи для модифікації гідрофобності мембран PDMS. Для культивування клітин Caco-2 лише активація поверхні шляхом обробки УФ/озоном була достатньою, щоб зменшити гідрофобність поверхні PDMS, покрити ECM і прикріпити клітини Caco-2 до мембрани PDMS. Однак мікрофлюїдна культура органоїдного епітелію потребує хімічної функціональності поверхні для досягнення ефективного осадження білків ECM шляхом послідовного нанесення поліетиленіміну (PEI) і глутарового альдегіду на мікроканали PDMS. Після модифікації поверхні білки ECM були осаджені, щоб покрити функціоналізовану поверхню PDMS, а потім введені в ізольований органоїдний епітелій. Після прикріплення клітин розпочинається мікрофлюїдна культура клітин. шляхом перфузії лише середовища у верхній мікроканал, доки клітини не сформують повний моношар, у той час як нижній мікроканал підтримує статичні умови. Цей оптимізований метод активації поверхні та покриття ECM дозволяє прикріплювати органоїдний епітелій для індукування 3D-морфогенезу на поверхні PDMS.
Трансвеллові культури також потребують покриття ECM перед посівом клітин;однак культури Transwell не вимагають складних етапів попередньої обробки для активації поверхні пористих вставок. Для вирощування клітин Caco-2 на вставках Transwell покриття ECM на пористих вставках прискорює прикріплення дисоційованих клітин Caco-2 (<1 години) і формування бар’єру щільного з’єднання (<1-2 днів). Для культивування органоїдів на вставках Transwell ізольовані органоїди висівають на вставки з поверхнею ECM, прикріплені до мембрани. (<3 год) і зберігали до тих пір, поки органоїди не сформують повний моношар із цілісністю бар’єру. Трансвелл культур проводять у 24-лункових планшетах без використання гібридних чіпів.
Тривимірний морфогенез in vitro можна ініціювати, застосувавши потік рідини до базолатерального аспекту встановленого епітеліального шару. У кишківнику на чіпі епітеліальний морфогенез розпочався, коли середовище було перфузовано у верхній і нижній мікроканали (рис. 3a). Як описано раніше, важливо запровадити потік рідини в нижньому (базолатеральному) відділі для постійного видалення спрямованих інгібіторів морфогену, що виділяються. .Щоб забезпечити достатню кількість поживних речовин і сироватки для клітин, пов’язаних з пористими мембранами, і створити напругу зсуву просвіту, ми зазвичай застосовуємо подвійний потік у кишечнику на чіпі. У гібридних чіпах вставки Transwell, що містять епітеліальні моношари, були вставлені в гібридні чіпи. Потім середовище наносили під базолатеральний бік пористої вставки Transwell через мікроканал. Відбувався кишковий морфогенез 3 -5 днів після початку базолатерального потоку в обох культуральних платформах.
Морфологічні особливості мікроінженерних 3D епітеліальних шарів можна проаналізувати, застосовуючи різні методи візуалізації, включаючи фазово-контрастну мікроскопію, диференціально-інтерференційно-контрастну (DIC) мікроскопію, SEM або імунофлуоресцентну конфокальну мікроскопію (рис. 3 і 4). Фазове контрастування або DIC-зображення можна легко виконати в будь-який час під час культивування для моніторингу форми та виступу 3D-епітеліальних шарів.D Завдяки оптичній прозорості PDMS і поліефірних плівок, як платформи кишківника на чіпі, так і платформи гібридних чіпів можуть забезпечувати зображення на місці в режимі реального часу без необхідності розрізання або розбирання пристрою. Під час виконання імунофлуоресцентної візуалізації (рис. 1, 3c, f і 4b, c) клітини зазвичай фіксують 4% (маса/об’єм) параформальдегідом ( PFA), а потім Triton X-100 і 2% (мас./об.) бичачого сироваткового альбуміну (BSA) у порядку. Залежно від типу клітини можна використовувати різні фіксатори, пермеабілізатори та блокуючі агенти. Первинні антитіла, націлені на клітинні або регіональні маркери, що залежать від походження, використовуються для виділення клітин, іммобілізованих in situ на чіпі, за якими слідують вторинні антитіла разом із барвником протизабарвлення, націленим на будь-яке ядро. нас (наприклад, 4′,6-діамідіно-2-фенілен) індол, DAPI) або F-актин (наприклад, флуоресцентно мічений фалоідин). Живу візуалізацію на основі флуоресценції також можна виконувати in situ для виявлення утворення слизу (рис.1, «Диференціація клітин» і «Фізіологія кишківника»), випадкова колонізація мікробних клітин (рис. 1, «Спільне культивування хазяїна та мікроба»), залучення імунних клітин (рис. 1, «Моделювання захворювання») або контури тривимірної морфології епітелію (рис. 3c,f і 4b,c). При модифікації кишечника на чіп, щоб відокремити верхній шар від нижнього шару мікроканалів, як описано в посиланні. Як показано на рис. 2, тривимірну епітеліальну морфологію, а також мікроворсинки на апікальній межі щітки можна візуалізувати за допомогою СЕМ (рис. 3b). Експресію маркерів диференціації можна оцінити шляхом виконання кількісної ПЛР5 або секвенування одноклітинної РНК. У цьому випадку тривимірні шари епітеліальних клітин ростуть n у кишкових чіпсах або гібридних чіпсах збирають шляхом трипсинізації, а потім використовують для молекулярного або генетичного аналізу.
a, Робочий процес для індукції кишкового морфогенезу в гібридному чіпі. Caco-2 і кишкові органоїди використовуються в цьому протоколі для демонстрації 3D-морфогенезу на платформі гібридного чіпа. Дисоційовані епітеліальні клітини були висіяні в підготовлені вставки Transwell (TW prep; див. малюнок нижче). Після того, як клітини були висіяні (посіяні) і прикріплені до поліефірних мембран у Вставки Transwell, усі клітини культивувалися в статичних умовах (культура TW). Через 7 днів одна вставка Transwell, що містить 2D моношар епітеліальних клітин, була інтегрована в гібридний чіп для введення базолатерального потоку (Flow, BL), що зрештою призвело до генерації 3D епітеліального шару (морфогенез). Мікрофотографії фазового контрасту, що демонструють морфологічні особливості епітеліальних клітин органів людини, отриманих з нормальний донор (лінія C103) висхідна ободова кишка на кожному експериментальному етапі або в часовий момент. Схеми у верхніх шарах ілюструють експериментальну конфігурацію для кожного кроку.b Гібридні чіпи (ліва схема) можуть призводити до 3D-морфогенезу органоїдних епітеліальних клітин за допомогою конфокальної мікроскопії зверху вниз, зробленої в різних положеннях Z (верхня, середня та нижня);дивіться праву схему та відповідні пунктирні лінії).показали очевидні морфологічні характеристики. F-актин (блакитний), ядро ​​(сірий).c, Флуоресцентні конфокальні мікрофотографії (3D під кутом) епітеліальних клітин, отриманих з органоїдів, культивованих у статичному Transwell (TW; вставка в білій пунктирній рамці) проти гібридного чіпа (найбільший повний знімок), порівнюючи 2D і 3D морфологію відповідно. Пара 2D вертикальних перехресних розрізи (вставка у верхньому правому куті; «XZ») також показують 2D і 3D елементи. Масштабна шкала, 100 мкм.c Передруковано з дозволу посилання.4.Elsevier.
Контролі можна підготувати шляхом культивування тих самих клітин (Caco-2 або кишкових органоїдних епітеліальних клітин) у двовимірних моношарах у звичайних статичних умовах культивування. Примітно, що виснаження поживних речовин може виникнути через обмежену об’ємну ємність мікроканалів (тобто ~4 мкл у верхньому каналі на оригінальній конструкції кишкового чіпа). Таким чином, морфологія епітелію до та після застосування базолатерального потоку також може бути оцінена в порівнянні.
Процес м’якої літографії слід виконувати в чистому приміщенні. Для кожного шару на чіпі (верхній і нижній шари та мембрани) і гібридних чіпів використовувалися різні фотомаски та виготовляли їх на окремих кремнієвих пластинах, оскільки висота мікроканалів була різною. Цільова висота верхнього та нижнього мікроканалів кишки на чіпі становить 500 мкм і 200 мкм відповідно. Цільовий канал висота гібридного чіпа 200 мкм.
Помістіть 3-дюймову кремнієву пластину в чашу з ацетоном. Обережно покрутіть пластину протягом 30 секунд, потім висушіть пластину на повітрі. Перемістіть пластину на пластину з IPA, потім обертайте пластину протягом 30 секунд, щоб очистити.
Розчин піраньї (суміш перекису водню та концентрованої сірчаної кислоти, 1:3 (об’єм/об’єм)) можна додатково використовувати для максимального видалення органічних залишків із поверхні кремнієвої пластини.
Розчин Piranha є надзвичайно корозійним і виділяє тепло. Необхідні додаткові заходи безпеки. Для утилізації відходів дайте розчину охолонути та перемістіть його в чистий сухий контейнер для відходів. Використовуйте вторинні контейнери та належним чином маркуйте контейнери для відходів. Будь ласка, дотримуйтесь інструкцій з техніки безпеки підприємства, щоб дізнатися більше про процедури.
Зневодніть вафлі, помістивши їх на гарячу плиту при 200 °C на 10 хв. Після зневоднення вафлі п’ять разів струшували на повітрі для охолодження.
Налийте ~10 г фоторезисту SU-8 2100 на центр очищеної силіконової пластини. Використовуйте пінцет, щоб рівномірно розподілити фоторезист на пластині. Іноді кладіть пластину на 65°C гарячу плиту, щоб зробити фоторезист менш липким і легше намазувати. Не кладіть пластину безпосередньо на гарячу пластину.
SU-8 було рівномірно розподілено на пластині за допомогою спінювання. Запрограмуйте вхідне обертання SU-8 на 5–10 с, щоб воно поширювалося зі швидкістю 500 об/хв із прискоренням 100 об/хв. Встановіть основне обертання для нанесення візерунка товщиною 200 мкм на 1500 об/хв або досягніть товщини 250 мкм (зробивши висоту 500 мкм). для верхнього шару кишечника на чіпі (див. «Критичні кроки» нижче) встановити на прискорення 300 об/хв 30 секунд при 1200 об/хв.
Основну швидкість віджимання можна регулювати відповідно до цільової товщини візерунка SU-8 на кремнієвій пластині.
Щоб виготовити візерунки SU-8 висотою 500 мкм для верхнього шару кишки на чіпі, етапи нанесення покриття та м’якого випікання цього боксу (кроки 7 і 8) послідовно повторювали (див. крок 9), щоб отримати два шари товщиною 250 мкм шару SU-8, який можна нашаровувати та з’єднувати за допомогою ультрафіолетового опромінення на кроці 12 цього боксу, створюючи шар 500 мкм заввишки.
М’яко випікайте вафлі з покриттям SU-8, обережно помістивши вафлі на гарячу плиту при 65 °C на 5 хвилин, потім перемкніть налаштування на 95 °C та інкубуйте ще 40 хвилин.
Щоб досягти висоти 500 мкм візерунка SU-8 у верхньому мікроканалі, повторіть кроки 7 і 8, щоб створити два шари SU-8 товщиною 250 мкм.
Використовуючи UV Mask Aligner, виконайте перевірку лампою відповідно до інструкцій виробника, щоб обчислити час опромінення пластини. (час опромінення, мс) = (доза опромінення, мДж/см2)/(потужність лампи, мВт/см2).
Після визначення часу витримки помістіть фотошаблон на маскотримач УФ-маскоеклайнера і помістіть фотошаблон на пластину з покриттям SU-8.
Розмістіть друковану поверхню фотошаблона безпосередньо на стороні кремнієвої пластини з покриттям SU-8, щоб мінімізувати розсіювання УФ-променів.
Піддавайте пластину з покриттям SU-8 і фотошаблон вертикально ультрафіолетовому світлу з інтенсивністю 260 мДж/см2 протягом заздалегідь визначеного часу (див. крок 10 цього блоку).
Після ультрафіолетового опромінення кремнієві пластини з покриттям SU-8 випікалися при 65 °C протягом 5 хвилин і 95 °C протягом 15 хвилин на кожній гарячій плиті для виготовлення візерунків висотою 200 мкм. Збільште час після випікання при 95 °C до 30 хвилин, щоб виготовити візерунки висотою 500 мкм.
Проявник наливають у скляний посуд, а випечену вафлю кладуть у посуд. Об’єм проявника SU-8 може змінюватися залежно від розміру скляної пластини. Обов’язково використовуйте достатньо проявника SU-8, щоб повністю видалити неекспонований SU-8. Наприклад, якщо використовуєте скляний посуд діаметром 150 мм і об’ємом 1 л, використовуйте ~300 мл проявника SU-8. Проявіть форму протягом 25 хвилин, час від часу обережно обертання.
Промийте готову форму ~10 мл свіжого проявника, а потім IPA, розпилюючи розчин за допомогою піпетки.
Помістіть пластину в плазмовий очищувач і піддайте дії плазми кисню (атмосферний газ, цільовий тиск 1 × 10-5 Торр, потужність 125 Вт) протягом 1,5 хв.
Помістіть пластину у вакуумний ексикатор із предметним склом всередині. Пластини та предметні скла можна розміщувати поруч. Якщо вакуумний ексикатор поділено на кілька шарів пластиною, помістіть предметні скла в нижню камеру, а пластини – у верхню камеру. Капніть 100 мкл розчину трихлор(1H, 1H, 2H, 2H-перфтороктил)силану на склянку. посуньте та застосуйте вакуум для силанізації.
Розморозьте флакон із замороженими клітинами Caco-2 на водяній бані при 37 °C, потім перемістіть розморожені клітини в колбу T75, що містить 15 мл попередньо нагрітого до 37 °C середовища Caco-2.
Щоб пропустити клітини Caco-2 при ~90% конфлюентності, спочатку нагрійте середовище Caco-2, PBS і 0,25% трипсину/1 мМ EDTA на водяній бані при 37°C.
Аспіруйте середовище за допомогою вакуумної аспірації. Двічі промийте клітини 5 мл теплого PBS, повторюючи вакуумну аспірацію та додаючи свіжий PBS.