Дякуємо, що відвідали Nature.com.Версія браузера, яку ви використовуєте, має обмежену підтримку CSS.Для найкращої роботи радимо використовувати оновлений браузер (або вимкнути режим сумісності в Internet Explorer).Тим часом, щоб забезпечити постійну підтримку, ми відтворюємо сайт без стилів і JavaScript.
Еволюція мікробних паразитів включає протидію між природним відбором, який змушує паразитів розвиватися, та генетичним дрейфом, який змушує паразитів втрачати гени та накопичувати шкідливі мутації.Тут, щоб зрозуміти, як ця протидія відбувається в масштабі однієї макромолекули, ми описуємо структуру кріо-ЕМ рибосоми Encephalitozoon cuniculi, еукаріотичного організму з одним із найменших геномів у природі.Екстремальне зменшення рРНК у рибосомах E. cuniculi супроводжується безпрецедентними структурними змінами, такими як еволюція раніше невідомих злитих лінкерів рРНК і рРНК без опуклостей.Крім того, рибосома E. cuniculi пережила втрату фрагментів і білків рРНК, розвинувши здатність використовувати малі молекули як структурні імітатори деградованих фрагментів і білків рРНК.Загалом ми показуємо, що молекулярні структури, які довго вважалися редукованими, виродженими та схильними до виснажливих мутацій, мають низку компенсаторних механізмів, які підтримують їх активними, незважаючи на екстремальні молекулярні скорочення.
Оскільки більшість груп мікробних паразитів мають унікальні молекулярні інструменти для використання своїх господарів, нам часто доводиться розробляти різні терапевтичні засоби для різних груп паразитів1,2.Однак нові дані свідчать про те, що деякі аспекти еволюції паразитів є конвергентними та значною мірою передбачуваними, що вказує на потенційну основу для широких терапевтичних втручань у мікробних паразитів3,4,5,6,7,8,9.
Попередня робота виявила загальну еволюційну тенденцію мікробних паразитів, яка називається зменшенням або розпадом генома10,11,12,13.Сучасні дослідження показують, що коли мікроорганізми відмовляються від вільного способу життя і стають внутрішньоклітинними паразитами (або ендосимбіонтами), їхні геноми зазнають повільних, але дивовижних метаморфоз протягом мільйонів років9,11.У процесі, відомому як розпад геному, мікробні паразити накопичують шкідливі мутації, які перетворюють багато раніше важливих генів на псевдогени, що призводить до поступової втрати генів і мутаційного колапсу14,15.Цей колапс може знищити до 95% генів у найдавніших внутрішньоклітинних організмах порівняно з близькоспорідненими вільноживучими видами.Таким чином, еволюція внутрішньоклітинних паразитів — це перетягування канату між двома протиборчими силами: дарвінівським природним відбором, що веде до вдосконалення паразитів, і розпадом геному, що кидає паразитів у забуття.Як паразиту вдалося вийти з цього перетягування каната і зберегти активність своєї молекулярної структури, залишається незрозумілим.
Хоча механізм розпаду геному до кінця не вивчений, він, здається, відбувається в основному через частий генетичний дрейф.Оскільки паразити живуть у невеликих, нестатевих і генетично обмежених популяціях, вони не можуть ефективно усунути шкідливі мутації, які іноді виникають під час реплікації ДНК.Це призводить до необоротного накопичення шкідливих мутацій і зменшення геному паразита.У результаті паразит не тільки втрачає гени, які більше не потрібні для його виживання у внутрішньоклітинному середовищі.Саме нездатність популяцій паразитів ефективно усувати спорадичні шкідливі мутації спричиняє накопичення цих мутацій у всьому геномі, включаючи їхні найважливіші гени.
Значна частина нашого нинішнього розуміння зменшення генома базується виключно на порівняннях послідовностей генома з меншою увагою до змін у фактичних молекулах, які виконують господарські функції та служать потенційними мішенями для ліків.Порівняльні дослідження показали, що тягар шкідливих внутрішньоклітинних мікробних мутацій, очевидно, схиляє білки та нуклеїнові кислоти до неправильного згортання та агрегації, роблячи їх більш залежними від шаперонів і гіперчутливими до тепла19,20,21,22,23.Крім того, різні паразити — незалежна еволюція, іноді розділена 2,5 мільярдами років — зазнали подібної втрати центрів контролю якості в їхньому синтезі білка5,6 і механізмах відновлення ДНК24.Однак мало відомо про вплив внутрішньоклітинного способу життя на всі інші властивості клітинних макромолекул, включаючи молекулярну адаптацію до зростаючого тягаря шкідливих мутацій.
У цій роботі з метою кращого розуміння еволюції білків і нуклеїнових кислот внутрішньоклітинних мікроорганізмів ми визначили структуру рибосом внутрішньоклітинного паразита Encephalitozoon cuniculi.E. cuniculi — це грибоподібний організм, що належить до групи паразитичних мікроспоридій, які мають надзвичайно малі еукаріотичні геноми і тому використовуються як модельні організми для вивчення розпаду геному 25,26,27,28,29,30.Нещодавно було визначено структуру кріо-ЕМ рибосом для помірно зменшених геномів Microsporidia, Paranosema locustae та Vairimorpha necatrix31,32 (геном ~ 3,2 Mb).Ці структури припускають, що деяка втрата ампліфікації рРНК компенсується розвитком нових контактів між сусідніми рибосомальними білками або придбанням нових рибосомальних білків msL131,32.Вид Encephalitozoon (геном ~2,5 мільйона п.н.), разом із їхнім найближчим родичем Ordospora, демонструє граничний ступінь редукції генома в еукаріотах – вони мають менше 2000 генів, що кодують білок, і очікується, що їхні рибосоми не лише позбавлені фрагментів розширення рРНК (фрагменти рРНК, які відрізняють еукаріотичні рибосоми від бактеріальних рибосом), а також мають чотири ребра. осомальних білків через відсутність у них гомологів у геномі E. cuniculi26,27,28.Таким чином, ми дійшли висновку, що рибосома E. cuniculi може виявити раніше невідомі стратегії молекулярної адаптації до розпаду геному.
Наша кріо-ЕМ структура являє собою найменшу еукаріотичну цитоплазматичну рибосому, яку можна охарактеризувати, і дає уявлення про те, як кінцевий ступінь зменшення геному впливає на структуру, збірку та еволюцію молекулярного механізму, який є невід’ємною частиною клітини.Ми виявили, що рибосома E. cuniculi порушує багато широко збережених принципів згортання РНК і складання рибосом, і виявили новий, раніше невідомий рибосомний білок.Цілком несподівано ми показуємо, що рибосоми мікроспоридій розвинули здатність зв’язувати невеликі молекули, і висуваємо гіпотезу про те, що скорочення рРНК і білків викликають еволюційні інновації, які зрештою можуть надати рибосомам корисні якості.
Щоб покращити наше розуміння еволюції білків і нуклеїнових кислот у внутрішньоклітинних організмах, ми вирішили виділити спори E. cuniculi з культур інфікованих клітин ссавців, щоб очистити їхні рибосоми та визначити структуру цих рибосом.Отримати велику кількість паразитичних мікроспоридій важко, оскільки мікроспоридії не можна культивувати на живильному середовищі.Натомість вони ростуть і розмножуються лише всередині клітини-господаря.Тому, щоб отримати біомасу E. cuniculi для очищення рибосом, ми інфікували лінію клітин нирок ссавців RK13 спорами E. cuniculi та культивували ці інфіковані клітини протягом кількох тижнів, щоб дозволити E. cuniculi рости та розмножуватися.Використовуючи інфікований клітинний моношар площею близько половини квадратного метра, ми змогли очистити близько 300 мг спор мікроспоридій і використати їх для ізоляції рибосом.Потім ми розбили очищені спори скляними кульками та виділили неочищені рибосоми, використовуючи поетапне поліетиленглікольне фракціонування лізатів.Це дозволило нам отримати приблизно 300 мкг сирих рибосом E. cuniculi для структурного аналізу.
Потім ми зібрали кріо-ЕМ-зображення, використовуючи отримані зразки рибосом, і обробили ці зображення за допомогою масок, що відповідають великій рибосомній субодиниці, малій головці субодиниці та малій субодиниці.Під час цього процесу ми зібрали зображення приблизно 108 000 рибосомних частинок і обчислили кріо-ЕМ зображення з роздільною здатністю 2,7 Å (додаткові малюнки 1-3).Потім ми використали cryoEM-зображення для моделювання рРНК, рибосомального білка та фактора сплячки Mdf1, пов’язаного з рибосомами E. cuniculi (рис. 1a, b).
a Структура рибосоми E. cuniculi в комплексі з фактором сплячки Mdf1 (pdb id 7QEP).b Карта фактора сплячки Mdf1, пов’язаного з рибосомою E. cuniculi.c Карта вторинної структури, що порівнює відновлену рРНК у видів Microsporidian з відомими рибосомальними структурами.На панелях показано розташування ампліфікованих фрагментів рРНК (ES) і активних сайтів рибосом, включаючи сайт декодування (DC), сарциніцинову петлю (SRL) і центр пептидилтрансферази (PTC).d Електронна густина, що відповідає пептидилтрансферазному центру рибосоми E. cuniculi, свідчить про те, що ця каталітична ділянка має однакову структуру у паразита E. cuniculi та його господарів, включаючи H. sapiens.e, f Відповідна електронна щільність центру декодування (e) і схематична структура центру декодування (f) вказують на те, що E. cuniculi має залишки U1491 замість A1491 (нумерація E. coli) у багатьох інших еукаріот.Ця зміна свідчить про те, що E. cuniculi може бути чутливим до антибіотиків, які націлені на цей активний центр.
На відміну від раніше встановлених структур рибосом V. necatrix і P. locustae (обидві структури представляють одне й те саме сімейство мікроспоридій Nosematidae і дуже схожі одна на одну), 31,32 рибосоми E. cuniculi зазнають численних процесів рРНК і фрагментації білка.Подальша денатурація (додаткові малюнки 4-6).У рРНК найбільш вражаючі зміни включали повну втрату ампліфікованого фрагмента 25S рРНК ES12L і часткову дегенерацію спіралей h39, h41 і H18 (рис. 1c, додаткова рис. 4).Серед рибосомних білків найбільш вражаючі зміни включали повну втрату білка eS30 і скорочення білків eL8, eL13, eL18, eL22, eL29, eL40, uS3, uS9, uS14, uS17 і eS7 (додаткові малюнки 4, 5).
Таким чином, екстремальна редукція геномів видів Encephalotozoon/Ordospora відображається на їхній рибосомній структурі: рибосоми E. cuniculi відчувають найбільш драматичну втрату вмісту білка в еукаріотичних цитоплазматичних рибосомах, що підлягають структурній характеристикі, і вони навіть не мають тих рРНК і білкових фрагментів, які широко зберігаються не лише в еукаріотах, але й у трьох сферах життя.Структура рибосоми E. cuniculi є першою молекулярною моделлю цих змін і розкриває еволюційні події, які були пропущені як порівняльною геномікою, так і дослідженнями внутрішньоклітинної біомолекулярної структури (додаткова рис. 7).Нижче ми описуємо кожну з цих подій, а також їх ймовірне еволюційне походження та їхній потенційний вплив на функцію рибосом.
Потім ми виявили, що на додаток до великих скорочень рРНК, рибосоми E. cuniculi мають варіації рРНК в одному зі своїх активних сайтів.Хоча пептидилтрансферазний центр рибосоми E. cuniculi має таку саму структуру, як і інші еукаріотичні рибосоми (рис. 1d), центр декодування відрізняється через варіацію послідовності в нуклеотиді 1491 (нумерація E. coli, рис. 1e, f).Це спостереження є важливим, оскільки сайт декодування еукаріотичних рибосом зазвичай містить залишки G1408 і A1491 порівняно з залишками бактеріального типу A1408 і G1491.Ця варіація лежить в основі різної чутливості бактеріальних та еукаріотичних рибосом до сімейства аміноглікозидів рибосомальних антибіотиків та інших малих молекул, які націлені на сайт декодування.У місці декодування рибосоми E. cuniculi залишок A1491 був замінений на U1491, потенційно створюючи унікальний інтерфейс зв’язування для малих молекул, націлених на цей активний сайт.Той самий варіант A14901 також присутній в інших мікроспоридіях, таких як P. locustae і V. necatrix, що свідчить про те, що він широко поширений серед видів мікроспоридій (рис. 1f).
Оскільки наші зразки рибосом E. cuniculi були виділені з метаболічно неактивних спор, ми перевірили кріо-ЕМ-карту E. cuniculi на раніше описане зв’язування рибосом в умовах стресу або голодування.Фактори гібернації 31,32,36,37, 38. Ми зіставили раніше встановлену структуру гібернаційної рибосоми з кріо-ЕМ-картою рибосоми E. cuniculi.Для докінгу використовували рибосоми S. cerevisiae в комплексі з фактором сплячки Stm138, рибосоми сарани в комплексі з фактором Lso232 і рибосоми V. necatrix в комплексі з факторами Mdf1 і Mdf231.У той же час ми знайшли кріо-ЕМ щільність, що відповідає фактору спокою Mdf1.Подібно до Mdf1, що зв’язується з рибосомою V. necatrix, Mdf1 також зв’язується з рибосомою E. cuniculi, де він блокує сайт E рибосоми, можливо, допомагаючи зробити рибосоми доступними, коли спори паразита стають метаболічно неактивними після інактивації організму (рис. 2).).
Mdf1 блокує ділянку E рибосоми, що, здається, допомагає інактивувати рибосому, коли спори паразита стають метаболічно неактивними.У структурі рибосоми E. cuniculi ми виявили, що Mdf1 утворює раніше невідомий контакт зі стовбуром рибосоми L1, частиною рибосоми, яка сприяє вивільненню деацильованої тРНК з рибосоми під час синтезу білка.Ці контакти припускають, що Mdf1 відокремлюється від рибосоми за допомогою того ж механізму, що й деацетильована тРНК, надаючи можливе пояснення того, як рибосома видаляє Mdf1 для реактивації синтезу білка.
Однак наша структура виявила невідомий контакт між Mdf1 і ніжкою рибосоми L1 (частина рибосоми, яка допомагає вивільняти деацильовану тРНК з рибосоми під час синтезу білка).Зокрема, Mdf1 використовує ті самі контакти, що й ліктьовий сегмент деацильованої молекули тРНК (рис. 2).Це раніше невідоме молекулярне моделювання показало, що Mdf1 дисоціює від рибосоми за допомогою того ж механізму, що й деацетильована тРНК, що пояснює, як рибосома видаляє цей фактор сплячки, щоб повторно активувати синтез білка.
При побудові моделі рРНК ми виявили, що рибосома E. cuniculi має аномально складені фрагменти рРНК, які ми назвали злитою рРНК (рис. 3).У рибосомах, які охоплюють три домени життя, рРНК згортається в структури, в яких більшість основ рРНК або утворюють пари основ і згортаються одна з одною, або взаємодіють з рибосомальними білками38,39,40.Однак у рибосомах E. cuniculi рРНК, схоже, порушують цей принцип згортання, перетворюючи деякі їхні спіралі на розгорнуті ділянки рРНК.
Структура спіралі H18 25S рРНК у S. cerevisiae, V. necatrix і E. cuniculi.Як правило, у рибосомах, що охоплюють три домени життя, цей лінкер згортається у спіраль РНК, яка містить від 24 до 34 залишків.У Microsporidia, навпаки, цей лінкер рРНК поступово скорочується до двох одноланцюгових лінкерів, багатих уридином, які містять лише 12 залишків.Більшість цих залишків піддаються впливу розчинників.На малюнку показано, що паразитичні мікроспоридії, мабуть, порушують загальні принципи згортання рРНК, де основи рРНК зазвичай з’єднуються з іншими основами або беруть участь у взаємодії рРНК-білок.У мікроспоридії деякі фрагменти рРНК набувають несприятливої ​​складки, в якій колишня спіраль рРНК стає одноланцюговим фрагментом, витягнутим майже по прямій лінії.Наявність цих незвичайних ділянок дозволяє рРНК мікроспоридій зв'язувати віддалені фрагменти рРНК, використовуючи мінімальну кількість основ РНК.
Найбільш яскравий приклад цього еволюційного переходу можна спостерігати в спіралі H18 25S рРНК (рис. 3).У видів від кишкової палички до людини основи цієї спіралі рРНК містять 24-32 нуклеотиди, утворюючи дещо неправильну спіраль.У раніше ідентифікованих рибосомних структурах V. necatrix і P. locustae 31, 32 основи спіралі H18 частково розкручені, але спарювання нуклеотидних основ зберігається.Однак у E. cuniculi цей фрагмент рРНК стає найкоротшим лінкером 228UUUGU232 і 301UUUUUUUUU307.На відміну від типових фрагментів рРНК, ці багаті уридином лінкери не згортаються і не контактують з рибосомними білками.Натомість вони приймають відкриті для розчинника та повністю розгорнуті структури, у яких ланцюги рРНК витягнуті майже прямо.Ця розтягнута конформація пояснює, як E. cuniculi використовує лише 12 основ РНК, щоб заповнити проміжок 33 Å між спіралями рРНК H16 і H18, тоді як інші види потребують принаймні вдвічі більше основ рРНК, щоб заповнити проміжок.
Таким чином, ми можемо продемонструвати, що через енергетично несприятливе згортання паразитичні мікроспоридії розробили стратегію скорочення навіть тих сегментів рРНК, які залишаються в основному консервативними для видів у трьох сферах життя.Очевидно, шляхом накопичення мутацій, які перетворюють спіралі рРНК в короткі полі-U лінкери, E. cuniculi може утворювати незвичайні фрагменти рРНК, що містять якомога менше нуклеотидів для лігування дистальних фрагментів рРНК.Це допомагає пояснити, як мікроспоридії досягли різкого зменшення своєї базової молекулярної структури без втрати своєї структурної та функціональної цілісності.
Іншою незвичайною особливістю рРНК E. cuniculi є поява рРНК без потовщень (рис. 4).Випуклості — це нуклеотиди без пар основ, які виходять із спіралі РНК замість того, щоб ховатися в ній.Більшість виступів рРНК діють як молекулярні адгезиви, допомагаючи зв’язувати сусідні рибосомальні білки або інші фрагменти рРНК.Деякі з опуклостей діють як шарніри, дозволяючи спіралі рРНК оптимально згинатися та складатися для продуктивного синтезу білка 41 .
a Виступ рРНК (нумерація S. cerevisiae) відсутній у структурі рибосоми E. cuniculi, але присутній у більшості інших еукаріот b E. coli, S. cerevisiae, H. sapiens і E. cuniculi внутрішні рибосоми.паразитам не вистачає багатьох давніх, висококонсервативних випинань рРНК.Ці потовщення стабілізують структуру рибосом;тому їх відсутність у мікроспоридії вказує на знижену стабільність згортання рРНК у паразитів мікроспоридії.Порівняння зі стеблами Р (стебла L7/L12 у бактерій) показує, що втрата горбків рРНК іноді збігається з появою нових горбків поруч із втраченими горбками.Спіраль H42 у 23S/28S рРНК має давню опуклість (U1206 у Saccharomyces cerevisiae), вік якої оцінюється щонайменше в 3,5 мільярда років через її захист у трьох сферах життя.При мікроспоридії ця опуклість усувається.Однак поруч із втраченою опуклістю з’явилася нова опуклість (A1306 у E. cuniculi).
Вражаюче те, що ми виявили, що в рибосомах E. cuniculi відсутні більшість випинань рРНК, які зустрічаються в інших видів, включаючи понад 30 випинань, збережених в інших еукаріотів (рис. 4а).Ця втрата усуває багато контактів між субодиницями рибосом і суміжними спіралями рРНК, іноді створюючи великі порожнисті порожнечі в рибосомі, роблячи рибосому E. cuniculi більш пористою порівняно з більш традиційними рибосомами (рис. 4b).Примітно, що ми виявили, що більшість цих опуклостей також були втрачені в раніше ідентифікованих рибосомних структурах V. necatrix і P. locustae, які були пропущені в попередніх структурних аналізах 31, 32.
Іноді втрата виступів рРНК супроводжується розвитком нових виступів поруч із втраченим виступом.Наприклад, рибосомальний Р-стебло містить опуклість U1208 (у Saccharomyces cerevisiae), яка збереглася від E. coli до людини, і тому її вік оцінюється в 3,5 мільярда років.Під час синтезу білка ця опуклість допомагає ніжці P переміщатися між відкритою та закритою конформаціями, щоб рибосома могла рекрутувати фактори трансляції та доставляти їх до активного центру.У рибосом E. cuniculi це потовщення відсутнє;однак нове потовщення (G883), розташоване лише в трьох парах основ, може сприяти відновленню оптимальної гнучкості ніжки P (рис. 4c).
Наші дані про рРНК без опуклостей свідчать про те, що мінімізація рРНК не обмежується втратою елементів рРНК на поверхні рибосоми, але також може включати ядро ​​рибосоми, створюючи специфічний для паразита молекулярний дефект, який не був описаний у вільноживучих клітинах.спостерігаються живі види.
Після моделювання канонічних рибосомальних білків і рРНК ми виявили, що звичайні рибосомальні компоненти не можуть пояснити три частини кріо-ЕМ зображення.Два з цих фрагментів мають невеликі молекули (рис. 5, додаткова рис. 8).Перший сегмент затиснутий між рибосомальними білками uL15 і eL18 у положенні, яке зазвичай займає С-кінець eL18, який у E. cuniculi вкорочений.Хоча ми не можемо визначити ідентичність цієї молекули, розмір і форма цього острова щільності добре пояснюється наявністю молекул спермідину.Його зв’язування з рибосомою стабілізується специфічними для мікроспоридій мутаціями в білках uL15 (Asp51 і Arg56), які, здається, збільшують спорідненість рибосоми з цією маленькою молекулою, оскільки вони дозволяють uL15 обертати малу молекулу в рибосомну структуру.Додатковий малюнок 2).8, додаткові дані 1, 2).
Кріо-ЕМ зображення, що показує присутність нуклеотидів за межами рибози, зв’язаної з рибосомою E. cuniculi.У рибосомі E. cuniculi цей нуклеотид займає те саме місце, що й нуклеотид 25S рРНК A3186 (нумерація Saccharomyces cerevisiae) у більшості інших еукаріотичних рибосом.b У рибосомній структурі E. cuniculi цей нуклеотид розташований між рибосомальними білками uL9 і eL20, тим самим стабілізуючи контакт між двома білками.Аналіз збереження послідовності cd eL20 серед видів мікроспоридій.Філогенетичне дерево видів Microsporidia (c) і множинне вирівнювання послідовностей білка eL20 (d) показують, що нуклеотид-зв’язувальні залишки F170 і K172 збережені в більшості типових Microsporidia, за винятком S. lophii, за винятком ранніх розгалужених Microsporidia, які зберегли подовження рРНК ES39L.e Цей малюнок показує, що нуклеотидзв’язувальні залишки F170 і K172 присутні лише в eL20 геному мікроспоридій із сильною редукцією, але не в інших еукаріотах.Загалом, ці дані свідчать про те, що рибосоми мікроспоридій розвинули сайт зв’язування нуклеотидів, який, здається, зв’язує молекули AMP і використовує їх для стабілізації білок-білкових взаємодій у структурі рибосом.Висока збереженість цього сайту зв’язування в Microsporidia та його відсутність в інших еукаріотів свідчить про те, що цей сайт може забезпечити селективну перевагу виживання для Microsporidia.Таким чином, кишеня зв’язування нуклеотидів у рибосомі мікроспоридії не виглядає дегенеративною особливістю або кінцевою формою деградації рРНК, як описано раніше, а скоріше є корисною еволюційною інновацією, яка дозволяє рибосомі мікроспоридії безпосередньо зв’язувати невеликі молекули, використовуючи їх як молекулярні будівельні блоки.будівельні блоки для рибосом.Це відкриття робить рибосому мікроспоридії єдиною відомою рибосомою, яка використовує один нуклеотид як структурний блок.f Гіпотетичний еволюційний шлях, що походить від зв’язування нуклеотидів.
Друга низькомолекулярна щільність розташована на межі між рибосомними білками uL9 і eL30 (рис. 5а).Цей інтерфейс був раніше описаний у структурі рибосоми Saccharomyces cerevisiae як сайт зв’язування для 25S нуклеотиду рРНК A3186 (частина розширення рРНК ES39L)38.Було показано, що в вироджених рибосомах P. locustae ES39L цей інтерфейс зв’язує невідомий єдиний нуклеотид 31, і передбачається, що цей нуклеотид є відновленою кінцевою формою рРНК, у якій довжина рРНК становить ~130-230 основ.ES39L скорочується до одного нуклеотиду 32,43.Наші кріо-ЕМ зображення підтверджують ідею, що щільність можна пояснити нуклеотидами.Однак більш висока роздільна здатність нашої структури показала, що цей нуклеотид є екстрарибосомальною молекулою, можливо, AMP (рис. 5a, b).
Потім ми запитали, чи з'явився сайт зв'язування нуклеотидів у рибосомі E. cuniculi або він існував раніше.Оскільки зв'язування нуклеотидів в основному опосередковується залишками Phe170 і Lys172 у рибосомному білку eL30, ми оцінили збереження цих залишків у 4396 типових еукаріотів.Як і у випадку uL15 вище, ми виявили, що залишки Phe170 і Lys172 є висококонсервативними лише в типових мікроспоридіях, але відсутні в інших еукаріотах, включаючи атипові мікроспоридії Mitosporidium і Amphiamblys, у яких фрагмент рРНК ES39L не відновлений 44, 45, 46 (рис. 5c).-e).
У сукупності ці дані підтверджують ідею про те, що E. cuniculi та, можливо, інші канонічні мікроспоридії розвинули здатність ефективно захоплювати велику кількість малих метаболітів у структурі рибосом, щоб компенсувати зниження рівнів рРНК та білка.Роблячи це, вони розвинули унікальну здатність зв’язувати нуклеотиди поза рибосомою, показуючи, що паразитичні молекулярні структури компенсують це шляхом захоплення великої кількості малих метаболітів і використання їх як структурних імітаторів деградованих фрагментів РНК і білка..
Третя немодельована частина нашої кріо-ЕМ-карти, знайдена у великій рибосомній субодиниці.Відносно висока роздільна здатність (2,6 Å) нашої карти свідчить про те, що ця щільність належить білкам з унікальними комбінаціями великих залишків бічних ланцюгів, що дозволило нам ідентифікувати цю щільність як раніше невідомий рибосомний білок, який ми ідентифікували як msL2 (специфічний білок L2 для мікроспоридій) (методи, рис. 6).Наш пошук гомології показав, що msL2 зберігається в кладі Microsporidia роду Encephaliter і Orosporidium, але відсутній в інших видах, включаючи інші Microsporidia.У рибосомній структурі msL2 займає щілину, утворену втратою розширеної рРНК ES31L.У цій порожнечі msL2 допомагає стабілізувати згортання рРНК і може компенсувати втрату ES31L (рис. 6).
Електронна щільність і модель специфічного для мікроспоридій рибосомального білка msL2, знайденого в рибосомах E. cuniculi.b Більшість еукаріотичних рибосом, включаючи рибосому 80S Saccharomyces cerevisiae, мають ампліфікацію рРНК ES19L, втрачену у більшості видів мікроспоридій.Раніше встановлена ​​структура рибосоми мікроспоридії V. necatrix свідчить про те, що втрата ES19L у цих паразитів компенсується еволюцією нового рибосомального білка msL1.У цьому дослідженні ми виявили, що рибосома E. cuniculi також виробила додатковий білок-імітатор рибосомної РНК як очевидну компенсацію втрати ES19L.Однак msL2 (наразі анотований як гіпотетичний білок ECU06_1135) і msL1 мають різне структурне та еволюційне походження.c Це відкриття генерації еволюційно неспоріднених рибосомальних білків msL1 і msL2 свідчить про те, що якщо рибосоми накопичують згубні мутації у своїй рРНК, вони можуть досягти безпрецедентного рівня композиційної різноманітності навіть у невеликій підмножині близькоспоріднених видів.Це відкриття може допомогти прояснити походження та еволюцію мітохондріальної рибосоми, яка відома своєю сильно зниженою рРНК і аномальною мінливістю білкового складу між видами.
Потім ми порівняли білок msL2 з раніше описаним білком msL1, єдиним відомим рибосомним білком, специфічним для мікроспоридій, знайденим у рибосомі V. necatrix.Ми хотіли перевірити, чи є msL1 і msL2 еволюційно пов’язаними.Наш аналіз показав, що msL1 і msL2 займають одну і ту ж порожнину в рибосомній структурі, але мають різні первинну і третинну структури, що свідчить про їх незалежне еволюційне походження (рис. 6).Таким чином, наше відкриття msL2 надає докази того, що групи компактних еукаріотичних видів можуть незалежно виробляти структурно відмінні рибосомальні білки, щоб компенсувати втрату фрагментів рРНК.Цей висновок примітний тим, що більшість цитоплазматичних еукаріотичних рибосом містять інваріантний білок, включаючи те саме сімейство з 81 рибосомального білка.Поява msL1 і msL2 у різних кладах мікроспоридій у відповідь на втрату розширених сегментів рРНК свідчить про те, що деградація молекулярної архітектури паразита змушує паразитів шукати компенсаторні мутації, які в кінцевому підсумку можуть призвести до їх придбання в різних популяціях паразитів.структур.
Нарешті, коли наша модель була завершена, ми порівняли склад рибосоми E. cuniculi з тим, що було передбачено з послідовності геному.Раніше вважалося, що кілька рибосомних білків, включаючи eL14, eL38, eL41 і eS30, відсутні в геномі E. cuniculi через очевидну відсутність їх гомологів у геномі E. cuniculi.Втрата багатьох рибосомних білків також передбачена у більшості інших внутрішньоклітинних паразитів і ендосимбіонтів із високою редукцією.Наприклад, хоча більшість вільноживучих бактерій містять ту саму сімейство з 54 рибосомальних білків, лише 11 із цих сімейств білків мають гомологи, які можна виявити в кожному аналізованому геномі бактерій, обмежених у хазяїні.На підтвердження цього уявлення втрата рибосомальних білків була експериментально виявлена ​​в мікроспоридіях V. necatrix і P. locustae, у яких відсутні білки eL38 і eL4131,32.
Однак наші структури показують, що лише eL38, eL41 і eS30 фактично втрачені в рибосомі E. cuniculi.Білок eL14 був збережений, і наша структура показала, чому цей білок не вдалося знайти під час пошуку гомології (рис. 7).У рибосомах E. cuniculi більша частина сайту зв’язування eL14 втрачається через деградацію ES39L, ампліфікованої рРНК.За відсутності ES39L eL14 втратив більшу частину своєї вторинної структури, і лише 18% послідовності eL14 були ідентичними в E. cuniculi та S. cerevisiae.Таке погане збереження послідовності вражає тим, що навіть Saccharomyces cerevisiae і Homo sapiens — організми, які еволюціонували з різницею в 1,5 мільярда років — мають більше 51% однакових залишків в eL14.Ця аномальна втрата збереження пояснює, чому E. cuniculi eL14 наразі анотовано як передбачуваний білок M970_061160, а не як рибосомний білок eL1427.
Рибосома Microsporidia втратила подовження рРНК ES39L, що частково усунуло сайт зв’язування рибосомального білка eL14.За відсутності ES39L білок мікроспори eL14 зазнає втрати вторинної структури, в якій колишня рРНК-зв’язуюча α-спіраль вироджується в петлю мінімальної довжини.b Вирівнювання множинних послідовностей показує, що білок eL14 є висококонсервативним в еукаріотичних видах (57% ідентичності послідовності між гомологами дріжджів і людини), але погано консервативним і розбіжним у мікроспоридіях (у яких не більше 24% залишків є ідентичними до гомолога eL14).від S. cerevisiae або H. sapiens).Це погане збереження послідовності та варіабельність вторинної структури пояснює, чому гомолог eL14 ніколи не був знайдений у E. cuniculi і чому вважається, що цей білок був втрачений у E. cuniculi.Навпаки, E. cuniculi eL14 раніше анотували як передбачуваний білок M970_061160.Це спостереження свідчить про те, що різноманітність геномів мікроспоридій на даний момент переоцінена: деякі гени, які зараз вважаються втраченими в мікроспоридіях, насправді збереглися, хоча й у високодиференційованих формах;натомість, вважають, що деякі з них кодують гени мікроспоридії для специфічних для хробаків білків (наприклад, гіпотетичний білок M970_061160), які насправді кодують дуже різноманітні білки, знайдені в інших еукаріотах.
Це відкриття свідчить про те, що денатурація рРНК може призвести до різкої втрати збереження послідовності в сусідніх рибосомальних білках, роблячи ці білки невиявленими для пошуку гомології.Таким чином, ми можемо переоцінити фактичний ступінь молекулярної деградації в організмах з малим геномом, оскільки деякі білки, які вважаються втраченими, насправді зберігаються, хоча й у сильно зміненій формі.
Як паразити можуть зберегти функцію своїх молекулярних машин в умовах екстремального зменшення геному?Наше дослідження відповідає на це питання, описуючи складну молекулярну структуру (рибосому) E. cuniculi, організму з одним із найменших еукаріотичних геномів.
Вже майже два десятиліття відомо, що молекули білків і РНК у мікробних паразитів часто відрізняються від своїх гомологічних молекул у вільноживучих видів, оскільки вони не мають центрів контролю якості, зменшуються до 50% свого розміру у вільноживучих мікробів тощо.багато виснажливих мутацій, які погіршують згортання та функціонування.Наприклад, очікується, що рибосоми організмів з малим геномом, включаючи багатьох внутрішньоклітинних паразитів і ендосимбіонтів, не мають кількох рибосомальних білків і до однієї третини нуклеотидів рРНК порівняно з вільноживучими видами 27, 29, 30, 49. Однак те, як ці молекули функціонують у паразитах, залишається в основному загадкою, вивченою в основному за допомогою порівняльної геноміки.
Наше дослідження показує, що структура макромолекул може виявити багато аспектів еволюції, які важко витягти з традиційних порівняльних геномних досліджень внутрішньоклітинних паразитів та інших організмів, обмежених у хазяїнах (додаткова рис. 7).Наприклад, приклад білка eL14 показує, що ми можемо переоцінити фактичний ступінь деградації молекулярного апарату у паразитичних видів.Зараз вважається, що енцефалітичні паразити мають сотні генів, специфічних для мікроспоридії.Проте наші результати показують, що деякі з цих, здавалося б, специфічних генів насправді є просто дуже різними варіантами генів, поширених в інших еукаріотів.Крім того, приклад білка msL2 показує, як ми не помічаємо нових рибосомних білків і недооцінюємо вміст паразитичних молекулярних машин.Приклад малих молекул показує, як ми можемо не помічати найгеніальніші інновації в паразитичних молекулярних структурах, які можуть надати їм нову біологічну активність.
Взяті разом, ці результати покращують наше розуміння відмінностей між молекулярними структурами організмів, які живуть обмежено, та їхніми аналогами у вільноживучих організмах.Ми показуємо, що молекулярні машини, які довгий час вважалися такими, що зменшуються, вироджуються та піддаються різноманітним виснажливим мутаціям, натомість мають набір незвичайних структурних особливостей, які систематично забувають.
З іншого боку, необ’ємні фрагменти рРНК і злиті фрагменти, які ми знайшли в рибосомах E. cuniculi, припускають, що зменшення генома може змінити навіть ті частини основного молекулярного механізму, які збереглися в трьох сферах життя – майже через 3,5 мільярда років.самостійна еволюція видів.
Злиті фрагменти рРНК без опуклості в рибосомах E. cuniculi представляють особливий інтерес у світлі попередніх досліджень молекул РНК в ендосимбіотичних бактеріях.Наприклад, було показано, що в ендосимбіонті попелиці Buchnera aphidicola молекули рРНК і тРНК мають чутливі до температури структури через зміщення складу A+T і високу частку неканонічних пар основ20,50.Вважається, що ці зміни в РНК, а також зміни в білкових молекулах є відповідальними за надмірну залежність ендосимбіонтів від партнерів і нездатність ендосимбіонтів передавати тепло 21, 23 .Хоча рРНК паразитичних мікроспоридій має структурно відмінні зміни, природа цих змін свідчить про те, що знижена термічна стабільність і більша залежність від білків-шаперонів можуть бути загальними рисами молекул РНК в організмах зі зменшеним геномом.
З іншого боку, наші структури показують, що мікроспоридії паразитів розвинули унікальну здатність протистояти широко збереженим рРНК і білковим фрагментам, розвиваючи здатність використовувати рясні та легкодоступні невеликі метаболіти як структурну імітацію дегенерованих рРНК і білкових фрагментів.Деградація молекулярної структури..Ця думка підтверджується тим фактом, що малі молекули, які компенсують втрату фрагментів білка в рРНК і рибосомах E. cuniculi, зв'язуються зі специфічними для мікроспоридій залишками в білках uL15 і eL30.Це свідчить про те, що зв’язування малих молекул з рибосомами може бути продуктом позитивного відбору, в якому специфічні для мікроспоридій мутації рибосомальних білків були відібрані через їх здатність підвищувати спорідненість рибосом до малих молекул, що може призвести до більш ефективних рибосомних організмів.Це відкриття демонструє розумну інновацію в молекулярній структурі мікробних паразитів і дає нам краще розуміння того, як молекулярні структури паразитів зберігають свою функцію, незважаючи на відновну еволюцію.
Наразі ідентифікація цих малих молекул залишається неясною.Незрозуміло, чому зовнішній вигляд цих малих молекул у рибосомній структурі відрізняється між видами мікроспоридій.Зокрема, незрозуміло, чому зв'язування нуклеотидів спостерігається в рибосомах E. cuniculi і P. locustae, а не в рибосомах V. necatrix, незважаючи на наявність залишку F170 в білках eL20 і K172 V. necatrix.Ця делеція може бути спричинена залишком 43 uL6 (розташованим поруч із кишенею зв’язування нуклеотидів), який є тирозином у V. necatrix, а не треоніном у E. cuniculi та P. locustae.Об’ємний ароматичний бічний ланцюг Tyr43 може заважати зв’язуванню нуклеотидів через стеричне перекривання.З іншого боку, очевидна делеція нуклеотидів може бути пов’язана з низькою роздільною здатністю кріо-ЕМ візуалізації, що перешкоджає моделюванню рибосомальних фрагментів V. necatrix.
З іншого боку, наша робота свідчить про те, що процес розпаду геному може бути винахідницькою силою.Зокрема, структура рибосоми E. cuniculi свідчить про те, що втрата рРНК і фрагментів білка в рибосомі мікроспоридії створює еволюційний тиск, який сприяє зміні структури рибосоми.Ці варіанти виникають далеко від активного центру рибосоми і, здається, допомагають підтримувати (або відновлювати) оптимальне збирання рибосоми, яке в іншому випадку було б порушено через зменшення рРНК.Це свідчить про те, що головне нововведення рибосоми мікроспоридії, мабуть, перетворилося на необхідність буферизації дрейфу генів.
Можливо, це найкраще ілюструє зв’язування нуклеотидів, яке досі ніколи не спостерігалося в інших організмів.Той факт, що залишки зв’язування нуклеотидів присутні в типових мікроспоридіях, але не в інших еукаріотах, свідчить про те, що сайти зв’язування нуклеотидів є не просто реліктами, які чекають свого зникнення, або кінцевим місцем для відновлення рРНК до форми окремих нуклеотидів.Натомість цей сайт здається корисною функцією, яка могла розвиватися протягом кількох раундів позитивного відбору.Місця зв’язування нуклеотидів можуть бути побічним продуктом природного відбору: як тільки ES39L деградує, мікроспоридії змушені шукати компенсацію для відновлення оптимального біогенезу рибосом за відсутності ES39L.Оскільки цей нуклеотид може імітувати молекулярні контакти нуклеотиду A3186 в ES39L, молекула нуклеотиду стає будівельним блоком рибосоми, зв’язування якої додатково покращується мутацією послідовності eL30.
Що стосується молекулярної еволюції внутрішньоклітинних паразитів, наше дослідження показує, що сили дарвінівського природного відбору та генетичного дрейфу розпаду геному не діють паралельно, а коливаються.По-перше, генетичний дрейф усуває важливі особливості біомолекул, що робить компенсацію вкрай необхідною.Лише тоді, коли паразити задовольнять цю потребу завдяки дарвінівському природному відбору, їхні макромолекули матимуть шанс розвинути свої найбільш вражаючі та інноваційні риси.Важливо відзначити, що еволюція сайтів зв’язування нуклеотидів у рибосомі E. cuniculi свідчить про те, що ця модель молекулярної еволюції, що змінює втрату, не тільки амортизує шкідливі мутації, але іноді надає абсолютно нові функції паразитичним макромолекулам.
Ця ідея узгоджується з теорією рухомої рівноваги Сьюелла Райта, яка стверджує, що сувора система природного відбору обмежує здатність організмів до інновацій51,52,53.Однак, якщо генетичний дрейф порушує природний відбір, ці дрейфи можуть спричинити зміни, які самі по собі не є адаптивними (або навіть згубними), але призводять до подальших змін, які забезпечують кращу пристосованість або нову біологічну активність.Наша структура підтримує цю ідею, ілюструючи, що той самий тип мутації, який зменшує згортання та функцію біомолекули, здається, є головним пусковим механізмом для її вдосконалення.Відповідно до еволюційної моделі взаємовигідних результатів, наше дослідження показує, що розпад геному, який традиційно розглядається як дегенеративний процес, також є основним рушієм інновацій, іноді і, можливо, навіть часто дозволяючи макромолекулам набувати нових паразитичних активностей.може використовувати їх.