Захоплення та розподіл поживних речовин поєднує особливості пошуку їжі комахами та життєвий цикл. Щоб компенсувати дефіцит певних поживних речовин на різних стадіях життя, комахи можуть отримувати ці поживні речовини за допомогою додаткового харчування, наприклад, харчуючись виділеннями хребетних у процесі, відомому як калюжі. Комар Anopheles arabiani, схоже, недоїдає і тому потребує поживних речовин як для метаболізму, так і для розмноження. Метою цього дослідження було оцінити, чи покращує вплив An. arabiensis на коров'ячу сечу для отримання поживних речовин характеристики життєвого циклу.
Переконайтеся, що це безпечно. arabiensis приваблював запах свіжої, 24-годинної, 72-годинної та 168-годинної коров'ячої сечі, а самок, які шукали господаря та годували кров'ю (через 48 годин після ковтання крові), вимірювали за допомогою ольфактометра з Y-подібною пробіркою, а вагітних самок оцінювали для проведення тесту на нерест. Потім для ідентифікації біоактивних сполук у коров'ячій сечі всіх чотирьох вікових груп використовували комбінований хімічний та електрофізіологічний аналіз. Синтетичні суміші біоактивних сполук оцінювали в Y-подібних пробірках та польових випробуваннях. Для дослідження коров'ячої сечі та її основної азотовмісної сполуки сечовини як потенційних додаткових раціонів для переносників малярії вимірювали параметри годування та характеристики життєвого циклу. Була оцінена частка самок комарів та кількість поглиненої коров'ячої сечі та сечовини. Після годування самок оцінювали на виживання, прив'язаний політ та розмноження.
Шукають кров та поживу господаря. У лабораторних та польових дослідженнях арабів приваблював природний та синтетичний запах свіжої та витриманої коров'ячої сечі. Вагітні самки були байдужі до реакцій коров'ячої сечі в місцях нересту. Самки, що шукають господаря та пиють кров, активно поглинають коров'ячу сечу та сечовину та розподіляють ці ресурси відповідно до компромісів життєвого циклу як функції фізіологічного стану для польоту, виживання або розмноження.
Збір та розподіл коров'ячої сечі Anopheles arabinis для покращення характеристик життєвого циклу. Додаткове годування коров'ячою сечею безпосередньо впливає на продуктивність переносників, збільшуючи добову виживаність та щільність переносників, а також опосередковано, змінюючи активність польоту, тому це слід враховувати в майбутніх моделях.
Отримання та розподіл поживних речовин інтегрує характеристики пошуку їжі комахами та життєвого циклу [1,2,3]. Комахи здатні вибирати та здобувати їжу, а також здійснювати компенсаторне живлення залежно від наявності їжі та потреб у поживних речовинах [1, 3]. Розподіл поживних речовин залежить від життєвого циклу та може призвести до різних вимог до якості та кількості раціону на різних стадіях життя комах [1, 2]. Щоб компенсувати дефіцит певних поживних речовин, комахи можуть отримувати ці поживні речовини шляхом додаткового живлення, наприклад, мулом, різними екскрементами та виділеннями хребетних, а також падлом, процес, відомий як калюжі [2]. Хоча в основному описано різноманітні види метеликів та молі, водопої також зустрічаються в інших рядах комах, і приваблення до цих типів ресурсів та живлення ними може мати значний вплив на здоров'я та інші ознаки життєвого циклу [2, 4, 5, 6],7]. Малярійний комар Anopheles gambiae sensu lato (sl) перетворюється на «недоїдену» дорослу особину [8], тому поливання може відігравати важливу роль у його життєвому циклі, але ця поведінка досі не враховувалася. Використання ажіотажу як засобу збільшення споживання поживних речовин у цьому важливому засобі заслуговує на увагу, оскільки це може мати важливі епідеміологічні наслідки.
Споживання азоту дорослими самками комарів Anopheles обмежене через низькі калорійні запаси, що переносяться з личинкової стадії, та неефективне використання кров'яного борошна [9]. Самки Ann.gambiae sl зазвичай компенсують це, доповнюючи кров'яним харчуванням [10, 11], тим самим наражаючи більше людей на ризик зараження хворобою та підвищуючи ризик хижацтва для комарів. Як варіант, комарі можуть використовувати додаткове годування екскрементами хребетних для отримання азотистих сполук, які покращують адаптацію та маневреність польоту, як це продемонстровано іншими комахами [2]. У цьому відношенні цікава сильна та виразна привабливість одного з видів-споріднених у складі видового комплексу An.Gambian sl, Anopheles arabinis, до свіжої та витриманої коров'ячої сечі [12,13,14]. Anopheles arabinis є опортуністичним у своїх уподобаннях щодо господаря та, як відомо, асоціюється з великою рогатою худобою та харчується нею. Коров'яча сеча є ресурсом, багатим на азотисті сполуки, причому сечовина становить 50-95% від загального азоту у свіжій сечі [15, 16]. Зі старінням коров'ячої сечі, Мікроорганізми використовують ці ресурси для зменшення складності азотистих сполук протягом 24 годин [15]. Зі швидким збільшенням вмісту аміаку, пов'язаним зі зменшенням вмісту органічного азоту, процвітають алкалофільні мікроорганізми (багато з яких виробляють сполуки, токсичні для комарів) [15], що може бути ознакою того, що самки Ann.arabiensis переважно приваблюють сечу віком 24 години або менше [13, 14].
У цьому дослідженні шукали комарів-господарів та тих, хто харчувався кров’ю. Під час першого циклу гонадотропіну arabiensis оцінювали на предмет отримання азотистих сполук, включаючи сечовину, шляхом змішування сечі. Далі було проведено серію експериментів для оцінки того, як самки комарів розподіляють цей потенційний поживний ресурс для покращення виживання, розмноження та подальшого пошуку їжі. Нарешті, було оцінено запах свіжої та витриманої коров’ячої сечі, щоб визначити, чи надають вони надійні підказки для комарів-господарів та тих, хто харчувався кров’ю. У пошуках цього потенційного поживного ресурсу arabiensis виявив хімічні кореляції, що лежать в основі спостережуваної різної привабливості. Синтетичні суміші запахів летких органічних сполук (ЛОС), виявлені в 24-годинній витриманій сечі, були додатково оцінені в польових умовах, розширивши результати, отримані в лабораторних умовах, та продемонструвавши вплив запаху бичачої сечі на різні фізіологічні стани. Привабливість комарів. Отримані результати підтверджують, що An. arabiensis отримує та розподіляє азотисті сполуки, що містяться в сечі хребетних, щоб впливати на характеристики життєвого циклу. Ці результати обговорюються в контексті потенційних епідеміологічних наслідків та того, як їх можна використовувати для спостереження та контролю за переносниками.
Анофелеса арабікана (штам Dongola) утримували при температурі 25 ± 2 °C, відносної вологості 65 ± 5% та циклі світло:темрява 12:12 год. Личинок вирощували у пластикових лотках (20 см × 18 см × 7 см), заповнених дистильованою водою, та годували кормом для риб Tetramin® (Tetra Werke, Мелле, Німеччина). Лялечок збирали в чашки об'ємом 30 мл (Nolato Hertila, Осторп, СЕ), а потім переносили в клітки Bugdorm (30 см × 30 см × 30 см; MegaView Science, Тайчжун, Тайвань) для виходу дорослих особин. Дорослим особинам давали 10% розчин сахарози досхочу до 4 днів після появи (dpe), після чого самкам, які шукали господаря, пропонували дієту безпосередньо перед експериментом або морили голодом протягом ночі з дистильованою водою перед експериментом, як описано нижче. Самок, яких використовували для експериментів з льотною трубкою, морили голодом лише 4-6 днів. години з водою досхочу. Для підготовки кровосисних комарів до подальших біологічних аналізів, 4 самкам dpe давали дефіброзну баранячу кров (Håtunalab, Bro, SE) за допомогою мембранної системи годування (Hemotek Discovery Workshops, Accrington, UK). Повністю перевантажених самок потім переносили в окремі клітки та давали їм безпосередній раціон, як описано нижче, або 10% сахарозу досхочу протягом 3 днів до описаних нижче експериментів. Останніх самок використовували для біологічних аналізів у пробірках для польоту та переносили до лабораторії, а потім отримували дистильовану воду досхочу протягом 4-6 годин перед експериментом.
Для кількісної оцінки споживання сечі та сечовини дорослими самками An.Arab використовували аналізи годування. Самкам, які шукали господаря та отримували кров, протягом 48 годин забезпечували раціон, що містив 1% розведеної свіжої та витриманої коров'ячої сечі, різні концентрації сечовини та два контрольні екземпляри (10% сахароза та вода). Крім того, до раціону додавали харчовий барвник (1 мг мл-1 ксиленціанід FF; CAS 2650-17-1; Sigma-Aldrich, Стокгольм, Швеція) та подавали в матриці 4 × 4 у мікроцентрифужних пробірках об'ємом 250 мкл (Axygen Scientific, Юніон-Сіті, Каліфорнія, США; Рисунок 1A). Заповнювали до краю (~300 мкл). Щоб уникнути конкуренції між комарами та потенційного впливу кольору барвника, помістіть 10 комарів у велику чашку Петрі (діаметром 12 см та висотою 6 см; Семадені, Остермундиген, Швейцарія; Рисунок 1A) у повній темряві при температурі 25 ± 2 см °C та відносній вологості 65 ± 5%. Ці експерименти повторювали від 5 до 10 разів. Після впливу дієти комарів поміщали при температурі -20 °C до подальшого аналізу.
Зверніть увагу на поглинання бичачої сечі та сечовини хазяїном та кровосисною самкою Anopheles arabianus. У дослідженні годування (A) самкам комарів забезпечували раціон, що складався зі свіжої та витриманої коров'ячої сечі, різних концентрацій сечовини, сахарози (10%) та дистильованої води (H2O). Самки, що шукають хазяїна (B), та самки, що харчуються кров'ю (C), поглинали більше сахарози, ніж будь-який інший протестований раціон. Зауважте, що самки, що шукають хазяїна, поглинали 72-годинну коров'ячу сечу менше, ніж 168-годинну коров'ячу сечу (B). Середній загальний вміст азоту (± стандартне відхилення) сечі представлено на вставці. Самки, що шукають хазяїна (D, F), та самки, що смокчуть кров (E, G), поглинають сечовину дозозалежним чином. Середні об'єми вдихання (D, E) з різними літерними назвами суттєво відрізнялися один від одного (однофакторний дисперсійний аналіз з використанням постфактумного аналізу Тьюкі; p < 0,05). Смуги похибки представляють стандартну похибку середнього значення (BE). Пряма пунктирна лінія представляє логарифмічну лінійну регресію (F, G).
Для вивільнення поглиненої їжі комарів окремо поміщали в 1,5 мл мікроцентрифужні пробірки, що містили 230 мкл дистильованої води, і тканину руйнували за допомогою одноразового товкача та бездротового двигуна (VWR International, Лунд, СЕ), після чого центрифугували при 10 кр/хв протягом 10 хвилин. Супернатант (200 мкл) переносили на 96-лунковий мікропланшет (Sigma-Aldrich), і поглинання (λ620) визначали за допомогою спектрофотометричного планшетного рідера (SPECTROStar® Nano, BMG Labtech, Ортенберг, Німеччина) (2 нм). Альтернативно, комарів подрібнювали в 1 мл дистильованої води, 900 мкл якої переносили в кювету для спектрофотометричного аналізу (λ620 нм; UV 1800, Shimadzu, Кіста, СЕ). Для кількісного визначення споживання їжі стандартну криву будували шляхом серійного розведення, отримуючи від 0,2 мкл до 2,4 мкл ксилолу 1 мг/мл. ціанід. Потім оптичну густину відомих концентрацій барвника використовували для визначення кількості їжі, яку поглинув кожен комар.
Дані щодо об'єму аналізували за допомогою однофакторного дисперсійного аналізу (ANOVA) з подальшим попарним порівнянням за методом post hoc за методом Тьюкі (JMP Pro, v14.0.0, SAS Institute Inc., Кері, Північна Кароліна, США, 1989–2007). Лінійний регресійний аналіз описував залежне від концентрації споживання сечовини та порівнював реакції між комарами, що шукають хазяїна, та кровоссальними комарами (GraphPad Prism v8.0.0 для Mac, GraphPad Software, Сан-Дієго, Каліфорнія, США).
Приблизно 20 мкл зразків сечі з кожної вікової групи зв'язували на Chromosorb® W/AW (10 мг 80/100 меш, Sigma Aldrich) та інкапсулювали в жерстяні капсули (8 мм × 5 мм). Капсули вставляли в камеру згоряння аналізатора CHNS/O (Flash 2000, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, США) для визначення вмісту азоту у свіжій та витриманій сечі згідно з протоколом виробника. Загальний азот (г N л-1) кількісно визначали на основі відомих концентрацій сечовини, що використовувалися як стандарт.
Щоб оцінити вплив дієти на виживання самок, що шукають господаря та пишуть кров, комарів окремо поміщали у великі чашки Петрі (діаметром 12 см та висотою 6 см; Semadeni) з отвором у кришці, покритим сіткою (діаметром 3 см), для вентиляції та постачання їжі. Дієти видавали безпосередньо після 4 днів після еякуляції та включали 1% розведену свіжу та витриману коров'ячу сечу, чотири концентрації сечовини та два контрольні розчини: 10% сахарозу та воду. Кожен раціон піпеткою наносили на стоматологічний тампон (DAB Dental AB, Upplands Väsby, SE), вставляли у 5-мл шприц (Thermo Fisher Scientific, Gothenburg, SE), знімали поршень та поміщали на чашку Петрі (рис. 1).1A). Змінюйте свій раціон щодня. Підтримуйте лабораторію, як описано вище. Комарів, що вижили, підраховували двічі на день, а мертвих комарів викидали, доки не загинув останній комар (n = 40 на обробку). Виживання комарів, яких годували різними дієтами, статистично аналізували за допомогою кривих виживання Каплана-Мейєра та логарифмічних рангових тестів. порівняти розподіл виживання між дієтами (IBM SPSS Statistics 24.0.0.0).
Спеціально розроблений літаючий млин для комарів, заснований на працях Аттісано та ін. [17], виготовлений з прозорих акрилових панелей товщиною 5 мм (10 см завширшки x 10 см завдовжки x 10 см заввишки) без передньої та задньої панелей (рис. 3: зверху). Поворотний вузол з вертикальною трубкою, виготовленою з колонки газової хроматографії (внутрішній діаметр 0,25 мм; довжина 7,5 см), кінці якої приклеєні до голки для комах, підвішеної між парою неодимових магнітів на відстані 9 см один від одного. Горизонтальна трубка, виготовлена ​​з того ж матеріалу (довжина 6,5 см), розділяла вертикальну трубку, утворюючи прив'язану рукоятку та рукоятку, на якій був невеликий шматочок алюмінієвої фольги як світлоперериваючий сигнал.
Самкам, яких голодували 24 години, давали вищезгаданий раціон протягом 30 хвилин перед фіксацією. Повністю нагодованих самок комарів потім окремо анестезували на льоду протягом 2-3 хвилин і прикріплювали до шпильок для комах бджолиним воском (Joel Svenssons Vaxfabrik AB, Munka Ljungby, SE), а потім прив'язували до кронштейнів горизонтальних трубок. Літаючий млин. Оберти за політ реєстрували за допомогою спеціально створеного реєстратора даних, потім зберігали та відображали за допомогою програмного забезпечення PC-Lab 2000™ (версія 4.01; Velleman, Gavere, BE). Літаючий млин розміщували в кімнаті з регульованим кліматом (12 год:12 год, світло: темрява, 25 ± 2 °C, 65 ± 5% відносної вологості).
Для візуалізації характеру польотної активності було розраховано загальну пройдену відстань (м) та загальну кількість послідовних польотів за годину протягом 24-годинного періоду. Крім того, середні відстані, пройдені окремими самками, порівнювали між різними методами лікування та аналізували за допомогою однофакторного дисперсійного аналізу (ANOVA) та постфактумного аналізу Тьюкі (JMP Pro, v14.0.0, SAS Institute Inc.), де середня відстань вважалася залежною змінною, тоді як метод лікування – незалежним фактором. Крім того, середня кількість раундів розраховується з 10-хвилинним кроком.
Щоб оцінити вплив дієти на репродуктивну функцію An.arabiensis, шість самок (4 дні на тиждень) були переведені безпосередньо в клітки Bugdorm (30 см × 30 см × 30 см) після забору крові, а потім забезпечені експериментальним раціоном протягом 48 годин, як описано вище. Потім раціони були видалені, а на третій день на 48 годин були забезпечені нерестові чашки (30 мл; Nolato Hertila), наповнені 20 мл дистильованої води, які мінялися кожні 24 години. Кожен режим харчування повторювали 20-50 разів. Ікру підраховували та записували для кожної експериментальної клітки. Підвибірки ікринок використовували для оцінки середнього розміру та варіації довжини окремих ікринок (n ≥ 200 на раціон) за допомогою мікроскопа Dialux-20 (DM1000; Ernst Leitz Wetzlar, Wetzlar, DE), оснащеного камерою Leica (DFC) 320 R2; Leica Microsystems Ltd., Німеччина). Решту яєць зберігали в кімнаті з контрольованим кліматом за стандартних умов вирощування протягом 24 годин, і вимірювали підвибірку нещодавно виведених личинок 1-го віку (n ≥ 200 на раціон), як описано вище. Кількість яєць та розмір яєць і личинок порівнювали між варіантами обробки за допомогою однофакторного дисперсійного аналізу (ANOVA) та постфакторного аналізу Тьюкі (JMP Pro, v14.0.0, SAS Institute Inc.).
Леткі речовини у вільному просторі з кожного зразка сечі великої рогатої худоби породи зебу та арсі збирали зі зразків, зібраних у великої рогатої худоби породи арсі, зі свіжої (через 1 годину після відбору проб), витриманої через 24 години, 72 години та 168 годин. Для зручності зразки сечі збирали рано вранці, поки корови ще перебували в стайні. Зразки сечі збирали у 10 особин, і 100-200 мл кожного зразка переносили в індивідуальні поліамідні мішки для запікання (Toppits Cofresco, Frischhalteprodukte GmbH and Co., Мінден, Німеччина) у 3-літрових поліамідних бочках з кришкою у вінілхлоридних пластикових бочках. Леткі речовини у вільному просторі з кожного зразка сечі великої рогатої худоби збирали або безпосередньо (зі свіжої), або після дозрівання при кімнатній температурі протягом 24 годин, 72 годин та 168 годин, тобто кожен зразок сечі був репрезентативним для кожної вікової групи.
Для збору летких речовин у газовому просторі використовували замкнуту систему для циркуляції потоку газу, фільтрованого активованим вугіллям (100 мл хв-1), через поліамідний мішок до адсорбційної колони протягом 2,5 годин за допомогою діафрагмового вакуумного насоса (KNF Neuberger, Фрайбург, Німеччина). Як контроль, збір у газовому просторі проводили з порожнього поліамідного мішка. Адсорбційна колонка була виготовлена ​​з тефлонової трубки (5,5 см x 3 мм внутрішній діаметр), що містила 35 мг Porapak Q (50/80 меш; Waters Associates, Мілфорд, Массачусетс, США) між заглушками зі скловати. Перед використанням колонку промивали 1 мл повторно дистильованого н-гексану (Merck, Дармштадт, Німеччина) та 1 мл пентану (99,0% чистий розчинник, клас ГХ, Sigma Aldrich). Адсорбовані леткі речовини елюювали 400 мкл пентану. Збірки у газовому просторі об'єднували та зберігали при температурі -20°C до використання для подальшого аналізу.
Поведінкові реакції комарів An, що шукають господаря та харчуються кров’ю. Леткі екстракти головної оболонки, зібрані зі свіжої, 24-годинної, 72-годинної та 168-годинної сечі, були проаналізовані на наявність летких екстрактів комарів Arabidopsis за допомогою прямого скляного ольфактометра [18]. Експерименти проводилися протягом 13-15 жовтня, пікового періоду активності An, що шукає хазяїна. Arab [19]. Скляний ольфактометр (80 см × 9,5 см внутрішній діаметр) освітлювали зверху 3 ± 1 лк червоного світла. Потік повітря, відфільтрований через вугілля та зволожений (25 ± 2 °C, 65 ± 2% відносної вологості), пройшов біоаналіз зі швидкістю 30 см/с. Повітря пропускали через серію сітчастих екранів з нержавіючої сталі, створюючи ламінарний потік та однорідну структуру шлейфу. Диспенсер для стоматологічних тампонів (4 см × 1 см; L:D; DAB Dental AB), підвішений на 5-см котушці на навітряному кінці. ольфактометр зі зміною стимулятора кожні 5 хвилин. Для аналізу 10 мкл кожного екстракту з простору над головою, розведеного 1:10, використовували як стимул. Рівну кількість пентану використовували як контроль. Окремих комарів, що шукають господаря або кровосисних комарів, поміщали в індивідуальні клітки для випуску за 2-3 години до початку експерименту. Клітку для випуску розміщували на підвітряному боці ольфактометра, і комарям давали акліматизуватися протягом 1 хвилини, а потім відкривали дросельний клапан клітки для випуску. Залучення до обробки або контролю аналізували як частку комарів, які контактували з джерелом протягом 5 хвилин після випуску. Кожен леткий екстракт з простору над головою та контроль реплікували щонайменше 30 разів, і щоб уникнути впливу будь-якого одного дня, у кожен експериментальний день тестували однакову кількість обробок та контролів. Відповіді на пошук від господаря та кровоносних Ans. Набори Arabic проти головної групи аналізували за допомогою номінальної логістичної регресії з подальшим попарним порівнянням для коефіцієнтів непарності (JMP Pro, v14.0.0, SAS Institute Inc.).
Нерестова реакція сечі Ан. Екстракти з парової фази свіжої та витриманої коров'ячої сечі аналізували в клітках Bugdorm (30 см × 30 см × 30 см; MegaView Science). Пластикові чашки (30 мл; Nolato Hertila), наповнені 20 мл дистильованої води, слугували нерестовим субстратом і розміщували в протилежних кутах клітки на відстані 24 см одна від одної. Чашки для обробки регулювали, додаючи по 10 мкл кожного екстракту з парової фази у розведенні 1:10. Для регулювання контрольної чашки використовували рівну кількість пентану. Чашки для обробки та контрольні чашки обмінювали місцями між кожним експериментом для контролю впливу положення. Десять самок, яких годували кров'ю, випускали в експериментальні клітки о 9-11 ранку неділі, а яйця в чашках підраховували через 24 години. Формула для розрахунку індексу нересту: (кількість ікринок, відкладених у чашку для обробки – кількість ікринок, відкладених у контрольну чашку) / (загальна кількість відкладених ікринок). Кожну обробку повторювали 8 разів.
Газохроматографічний аналіз та аналіз електронної антенної діаграми (GC-EAD) самок An.arabiensis проводили, як описано раніше [20]. Коротко кажучи, свіжі леткі екстракти з парової фази розділяли за допомогою газового хроматографа Agilent Technologies 6890 (Санта-Клара, Каліфорнія, США), оснащеного колонкою HP-5 (30 м × 0,25 мм внутрішній діаметр, товщина плівки 0,25 мкм, Agilent Technologies). і старіння сечі. Водень використовували як рухому фазу із середньою лінійною швидкістю потоку 45 см/с. Кожен зразок (2 мкл) вводили протягом 30 секунд у режимі без поділу з температурою на вході 225 °C. Температура печі ГХ була запрограмована від 35 °C (3-хвилинна витримка) до 300 °C (10-хвилинна витримка) при 10 °C/хв. У роздільник витікаючих потоків ГХ додавали 4 psi азоту та розділяли його у співвідношенні 1:1 у кросовері Gerstel 3D/2 з низьким мертвим об'ємом (Gerstel, Мюльхайм, Німеччина) між детектором іонізації полум'я та електромагнітним детектором (ЕАД). Капіляр витікаючих потоків ГХ для ЕАД пропускали через передавальний лінію Gerstel ODP-2, яка відстежує температуру печі ГХ плюс 5 °C, у скляну трубку (10 см × 8 мм), де його змішували з зволоженим повітрям, фільтрованим через вугільний фільтр (1,5 л/хв). Антену розміщували на відстані 0,5 см від... вихідний отвір трубки. Кожен окремий комар становив одну повторність, а для комарів, які шукають господаря, було виконано щонайменше три повторності на зразках сечі кожного віку.
Ідентифікація біоактивних сполук у колекціях свіжої та витриманої бичачої сечі в просторі над поверхнею за допомогою комбінованого ГХ та мас-спектрометра (ГХ-МС; 6890 ГХ та 5975 МС; Agilent Technologies) для отримання антенних відповідей в ГХ-ЕАД аналізі, що працює в режимі іонізації електронним ударом при 70 еВ. ГХ був оснащений капілярною колонкою з плавленого кварцу HP-5MS UI з покриттям (внутрішній діаметр 60 м × 0,25 мм, товщина плівки 0,25 мкм) з використанням гелію як рухомої фази із середньою лінійною швидкістю потоку 35 см/с. Зразок об'ємом 2 мкл вводили з використанням тих самих налаштувань інжектора та температури печі, що й для ГХ-ЕАД аналізу. Сполуки ідентифікували на основі їхнього часу утримування (індекс Ковата) та мас-спектрів порівняно з користувацькою бібліотекою та бібліотекою NIST14 (Agilent). Ідентифіковані сполуки підтверджували введенням автентичних стандартів (Додатковий файл 1: Таблиця S2). Для кількісного визначення використовували гептилацетат (10 нг, Як зовнішній стандарт вводили розчинник (хімічна чистота 99,8%, Aldrich).
Оцінка ефективності синтетичної суміші запахів, що складається з біоактивних сполук, виявлених у свіжій та витриманій сечі Ans.arabiensis, для приваблення хазяїна, що шукає хазяїна та кровосисних комарів, з використанням того ж ольфактометра та протоколу, що й вище. Синтетичні суміші імітували склад та пропорції сполук у змішаних летких екстрактах у вільному просторі свіжої, 24-годинної, 48-годинної, 72-годинної та 168-годинної витриманої сечі (Рисунок 5D-G; Додатковий файл 1: Таблиця S2). Для аналізу використовують 10 мкл розведення 1:100 повністю синтетичної суміші із загальною швидкістю вивільнення приблизно від 140 до 2400 нг/год для оцінки привабливості для хазяїна та кровосисних комарів. Після цього тест проводять на повних сумішах, в яких видаляють субтрактивні суміші окремих сполук повної суміші. Пошукові реакції від хазяїна та Ans, що харчувалися кров’ю. Arab проти синтетичних та субтрактивних сумішей аналізували за допомогою номінальної логістичної регресії з подальшим попарним порівнянням для коефіцієнтів непарності (JMP Pro, v14.0.0, SAS Institute Inc.).
Щоб оцінити, чи може коров'яча сеча служити сигналом для середовища існування малярійних комарів, свіжу та витриману коров'ячу сечу, зібрану, як описано вище, та воду поміщали у сітчасті 3-літрові відра (100 мл) та встановлювали у пастки-приманки для хазяїв (версія BG-HDT; BioGents, Регенсбург, Німеччина). Десять пасток розміщували на відстані 50 м одна від одної на пасовищі, за 400 м від сільської громади (Сілай, Ефіопія, 5°53´24´´ пн. ш., 37°29´24´´ сх. д.) та без великої рогатої худоби, на постійних місцях розмноження та в селах. П'ять пасток нагрівали для імітації присутності хазяїна, тоді як п'ять пасток залишали неопалюваними. Кожне місце обробки змінювали щоночі протягом загалом п'яти ночей. Кількість комарів, спійманих у пастках з приманкою з сечею різного віку, порівнювали за допомогою логістичної регресії з бета-біноміальним розподілом (JMP Pro, v14.0.0, SAS Institute Inc.).
У селі, ендемічному з малярії, поблизу міста Макі, регіон Оромія, Ефіопія (8° 11′ 08″ пн. ш., 38° 81′ 70″ сх. д.; рис. 6А). Дослідження проводилося з середини серпня до середини вересня перед щорічним обприскуванням залишками інсектицидів у приміщеннях, а також під час тривалого сезону дощів. Для дослідження було обрано п'ять пар будинків (на відстані 20–50 м один від одного), розташованих на околиці села (рис. 6А). Критерії вибору будинків були такими: заборона перебування тварин у будинку, заборона приготування їжі в приміщенні (розпалювання дров або вугілля) (принаймні протягом випробувального періоду) та будинки максимум з двома мешканцями, що сплять у приміщеннях без інсектицидів. під обробленою москітною сіткою. Етичне схвалення було надано Радою з етики досліджень (IRB/022/2016) факультету природничих наук (CNS-IRB) Аддис-Абебського університету відповідно до рекомендацій, встановлених Гельсінською декларацією Всесвітньої медичної асоціації. Згода від кожного голови домогосподарства була отримана за допомогою персоналу з поширення медичних знань. Весь процес схвалено місцевими адміністраціями на рівні району та виборчої дільниці («кебеле»). Експериментальний дизайн відповідав схемі латинського квадрата 2 × 2, в якій синтетичні суміші та контрольні групи були призначені парним будинкам у першу ніч і обмінювалися місцями між будинками наступної експериментальної ночі. Цей процес повторювався десять разів. Крім того, для оцінки активності комарів у вибраних будинках пастки CDC були налаштовані на роботу п'ять ночей поспіль на початку, в середині та в кінці польового випробування в один і той самий час доби.
Синтетичну суміш, що містила шість біоактивних сполук, розчинили в гептані (97,0% розчинник, клас GC, Sigma Aldrich) та вивільнили зі швидкістю 140 нг/год за допомогою дозатора з бавовняним ґнотом [20]. Дозатор з ґнотом дозволяв вивільняти всі сполуки в постійних пропорціях протягом 12-годинного експерименту. Гептан використовували як контроль. Флакон підвішували поруч із точкою входу світлової пастки Центрів контролю та профілактики захворювань (CDC) (John W. Hock Company, Гейнсвілл, Флорида, США; Рисунок 6A). Пастки підвішували на висоті 0,8–1 м над землею, біля підніжжя ліжка, а доброволець спав під необробленою москітною сіткою та працював з 18:00 до 06:30. Комарів, спійманих за статтю та фізіологічним станом (негодовані, годовані, напіввагітні та вагітні [21]), згодом обстежили за допомогою полімеразної ланцюгової реакції (ПЛР) для ідентифікації видів, морфологічно ідентифікованих як A. gambiae sl. Члени комплексу [23]. У польових умовах У дослідженні, захоплення парних будинків у пастки було проаналізовано за допомогою номінальної логістичної моделі підгонки, де приваблення було залежною змінною, а обробка (синтетична суміш проти контролю) була фіксованим ефектом (JMP® 14.0.0. SAS Institute Inc.). Тут ми повідомляємо про значення χ2 та p з тесту на відношення правдоподібності.
Оцініть, чи це безпечно. arabiensis зміг отримати сечу, своє основне джерело азоту, сечовину, шляхом прямого годування, протягом 48 годин після введення протягом 4 днів після (dpe) випробувань годування самок, що шукають господаря, та самок, що харчуються кров’ю (рис. 1A). Як самки, що шукають господаря, так і самки, що смокчуть кров, поглинали значно більше сахарози, ніж будь-який інший раціон або воду (F(5,426) = 20,15, p < 0,0001 та F(5,299) = 56,00, p < 0,0001 відповідно; рис. 1B,C). Крім того, самки, що шукають господаря, споживали менше сечі через 72 години порівняно з сечею через 168 годин (рис. 1B). Коли їм пропонували раціон, що містив сечовину, самки, що шукають господаря, поглинали значно більшу кількість сечовини при 2,69 мМ порівняно з усіма іншими концентраціями та водою, водночас не відрізняючись від 10% сахарози (F(10,813) = 15,72, p < 0,0001; Рисунок 1D). Це контрастувало з реакцією самок, яких годували кров’ю, які зазвичай поглинали значно більше раціону, що містить сечовину, ніж води, хоча й значно менше 10% сахарози (F(10,557) = 78,35, p < 0,0001; Рисунок 1).1E). Крім того, при порівнянні двох фізіологічних станів, флеботомізовані самки поглинали більше сечовини, ніж самки, що шукають господаря, при найнижчих концентраціях, і ці самки поглинали подібну кількість сечовини при вищих концентраціях (F(1,953) = 78,82, p < 0,0001; Рисунок 1F, G). Хоча споживання з раціону, що містить сечовину, мало оптимальні значення (рис. 1D, E), самки в обох фізіологічних станах змогли модулювати кількість поглиненої сечовини у всьому діапазоні концентрацій сечовини логарифмічно (рис. 1F, G). ). Аналогічно, комарі, здається, контролюють поглинання азоту, регулюючи кількість поглиненої сечі, оскільки кількість азоту в сечі відображається на кількості, що поглинається (вставки на рисунку 1B, C та B).
Щоб оцінити вплив сечі та сечовини на виживання комарів, що шукають господаря, та кровоссальних комарів, самок годували сечею всіх чотирьох вікових груп (свіжою, через 24 години, 72 години та 168 годин після осадження), а також різноманітними концентраціями сечовини, а також дистильованою водою та 10% сахарозою, що слугували контролем (Рисунок 2A). Цей аналіз виживання показав, що дієта мала значний вплив на загальну виживаність самок, що шукають господаря (сеча: χ2 = 108,5, df = 5, p < 0,0001; сечовина: χ2 = 122,8, df = 5, p < 0,0001; Рис. 2B, C), та самок, що харчувалися кров’ю (сеча: χ2 = 93,0, df = 5, p < 0,0001; сечовина: χ2 = 137,9, df = 5, p < 0,0001;). Рисунок 2D,E). У всіх експериментах самки, яких годували раціоном із сечі, сечовини та води, мали значно нижчі показники виживання порівняно з самками, яких годували сахарозою (рисунок 2B-E). Самки, що шукають господаря та годували свіжою та несвіжою сечею, демонстрували різні показники виживання, причому ті, що годували 72-годинною несвіжою сечею (p = 0,016), мали найнижчу ймовірність виживання (рис. 2B). Крім того, самки, що шукають господаря та годували 135 мМ сечовиною, виживали довше, ніж контрольна група з водою (p < 0,04) (рис. 2C). Порівняно з водою, жінки, яких годували свіжою сечею та 24-годинною сечею, виживали довше (p = 0,001 та p = 0,012 відповідно; рисунок 2D), тоді як жінки, яких годували 72-годинною сечею, виживали довше, ніж ті, кого годували малою кількістю свіжої сечі та 24-годинної сечі (p < 0,0001 та p = 0,013 відповідно; рисунок 2D). При годуванні 135 мМ сечовиною, Самки, яких годували кров’ю, виживали довше, ніж при всіх інших концентраціях сечовини та води (p < 0,013; Рисунок 2E).
Виживання хазяїна та кровосисних самок Anopheles arabinis, які харчувалися коров'ячою сечею та сечовиною. У біоаналізі (A) самкам комарів забезпечували раціон, що складався зі свіжої та витриманої коров'ячої сечі, різних концентрацій сечовини, сахарози (10%) та дистильованої води (H2O). Виживання комарів, що шукають хазяїна (B, C), та кровосисних (D, E), реєстрували кожні 12 годин, доки всі самки, які харчувалися сечею (B, D) та сечовиною (C, E), а також контрольна група, яка отримувала сахарозу та воду, не загинули.
Загальна відстань та кількість раундів, визначені в тесті польотного млина протягом 24-годинного періоду, відрізнялися між комарами, що шукають господаря, та комарами, що ссають кров, які демонстрували меншу загальну активність польоту (рис. 3). Комарі, що шукають господаря та надавали свіжу та витриману сечу або сахарозу та воду, демонстрували чіткі схеми польоту (рис. 3), причому самки, що харчувалися свіжою сечею, були більш активними на світанку, тоді як ті, що харчувалися 24- та 168-годинною сечею. Комарі, що харчувалися сечею, демонстрували різні схеми польоту та були переважно денними. Самки комарів, що надавали сахарозу або 72-годинну сечу, демонстрували активність протягом усього 24-годинного періоду, тоді як самки, що надавали воду, були більш активними в середині періоду. Комарі, що харчувалися сахарозою, демонстрували найвищий рівень активності пізно вночі та рано вранці, тоді як ті, що споживали 72-годинну сечу, спостерігали стабільне зниження активності протягом 24 годин (рис. 3).
Польотні характеристики самок Anopheles arabinis, що шукають хазяїна та харчуються коров'ячою сечею та сечовиною. У тесті льотного млина самки комарів, що харчувалися свіжою та витриманою коров'ячою сечею, різними концентраціями сечовини, сахарози (10%) та дистильованої води (H2O), були прив'язані до горизонтальних, вільно обертових лап (угорі). Для самок, що шукають хазяїна (ліворуч), та самок, що смокчуть кров (праворуч), реєстрували загальну відстань та кількість польотів за годину для кожного раціону протягом 24-годинного періоду (темний: сірий; світлий: білий). Середня відстань та середня кількість польотів показані праворуч від графіка циркадної активності. Смуги похибки представляють стандартну похибку середнього значення. Статистичний аналіз див. у тексті.
Загалом, загальна активність польоту самок, що шукають господаря, відповідала схемі, подібній до дальності польоту протягом 24-годинного періоду. На середню дальність польоту значно впливав спожитий раціон (F(5, 138) = 28,27, p < 0,0001), а самки, що шукають господаря, які споживали 72 години сечі, пролітали значно більші відстані порівняно з усіма іншими раціонами (p < 0,0001), а комарі, що харчувалися сахарозою, літали довше, ніж комарі, що харчувалися свіжою (p = 0,022) та 24-годинною сечею (p = 0,022). На відміну від схеми активності польоту, описаної для раціону з сечею, самки, що шукають господаря, які харчувалися сечовиною, демонстрували стійку активність польоту протягом 24-годинного періоду, досягаючи піку у другій половині темряви (рис. 3). Хоча схеми активності були подібними, самки, що шукають господаря, які годували сечовиною, значно збільшували середню дальність польоту залежно від поглиненої концентрації (F(5, 138) = 1310,91, p < 0,0001). Самки, що шукають господаря та отримували будь-яку концентрацію сечовини, літали довше, ніж самки, яких годували або водою, або сахарозою (p < 0,03).
Загальна активність польоту кровоссальних комарів була стабільною та підтримувалася протягом 24 годин на всіх раціонах, зі збільшенням активності сечі протягом другої половини темного періоду у самок, яких годували водою, а також у самок, яких годували свіжою та 24-годинною їжею (зображення 3). Хоча раціон з сечею суттєво впливав на середню дальність польоту у самок, яких годували кров’ю (F(5, 138) = 4,83, p = 0,0004), раціон з сечовиною цього не робив (F(5, 138) = 1,36, p = 0,24) у порівнянні з іншою сечею та контрольним раціоном (свіжий, p = 0,0091; 72 години, p = 0,0022; 168 годин, p = 0,001; сахароза, p = 0,0017; dH2O, p = 0,036).
Вплив годування сечею та сечовиною на репродуктивні параметри оцінювали в біотестах на відкладання яєць (Рисунок 4A) та досліджували залежно від кількості яєць, відкладених кожною самкою, розміру яєць та щойно вилуплених личинок першого віку. Кількість відкладених яєць. Арабські самки, яких годували сечею, варіювалися залежно від раціону (F(5,222) = 4,38, p = 0,0008; Рис. 4B). Самки, яких годували 24-годинною сечею та кров'яним борошном, відкладали значно більше яєць, ніж самки, яких годували іншими дієтами з сечею, і були подібними до тих, яких годували сахарозою (Рис. 4B). Аналогічно, розмір яєць, відкладених самками, яких годували сечею, варіювався залежно від раціону (F(5,209) = 12,85, p < 0,0001), причому самки, яких годували 24-годинною сечею та сахарозою, відкладали значно більші яйця, ніж самки, яких годували водою, тоді як яйця самок, яких годували 168 годин сечею, були значно меншими (Рис. 4C). Крім того, дієта з сечею значно впливала на розмір личинок (F(5, 187) = 7,86, p < 0,0001), причому з яєць, відкладених 24- та 72-годинними самками, яких годували сечею, вилуплювалися значно більші личинки, ніж з яєць, відкладених личинками яєць. Самки, яких годували водою та 168 годин тому, яких годували сечею (Рисунок 4D).
Репродуктивна продуктивність самок Anopheles arabinis, які харчувалися коров'ячою сечею та сечовиною. Самок комарів, яких годували кров'ю, протягом 48 годин годували раціоном, що складався зі свіжої та витриманої коров'ячої сечі, різних концентрацій сечовини, сахарози (10%) та дистильованої води (H2O), перед тим як помістити їх у біоаналізи та отримати субстрати для відкладання яєць протягом 48 годин (A). Кількість яєць (B, E), розмір яєць (C, F) та розмір личинок (D, G) значно залежали від наданого раціону (коров'яча сеча: BD; сечовина: EG). Середні значення для кожного параметра, виміряного за допомогою різних літерних назв, суттєво відрізнялися один від одного (однофакторний дисперсійний аналіз з використанням post hoc аналізу Тьюкі; p < 0,05). Смуги похибки представляють стандартну похибку середнього значення.
Як основний азотистий компонент сечі, сечовина, коли її дають самкам, що харчуються кров’ю, значно впливала на репродуктивні параметри у всіх дослідженнях. Кількість яєць, відкладених самками, яких годували сечовиною, після кров'яного харчування, залежно від концентрації сечовини (F(11, 360) = 4,69; p < 0,0001), самки, яких годували сечовиною в концентрації від 134 мкМ до 1,34 мМ, відкладали більше яєць (рис. 4E). Самки, яких годували сечовиною в концентрації 134 мкМ або вище, відкладали більші яйця, ніж самки, яких годували водою (F(10, 4245) = 36,7; p < 0,0001; рис. 4F), а розмір личинок, хоча на нього впливали подібні концентрації сечовини у матерів (F(10, 3305) = 37,9; p < 0,0001), був більш мінливим (рис. 4G).
Загальна привабливість для летких екстрактів з простору над ґрунтом великої рогатої худоби, що шукають господаря. На Arabiensis, оцінений у скляній трубці ольфактометра (рис. 5A), значно впливав вік сечі (χ2 = 15,9, df = 4, p = 0,0032; рис. 5B). Post hoc аналіз показав, що запах несвіжої сечі через 24 години викликав значно вищий рівень привабливості порівняно з усіма іншими методами обробки (72 години: p = 0,0060, 168 годин: p = 0,012, пентан: p = 0,00070), за винятком запаху свіжої сечі (p = 0,13; рис. 5B). Хоча загальна привабливість кровосисних комарів до запаху сечі суттєво не відрізнялася (χ2 = 8,78, df = 4, p = 0,067; рис. 5C), ці самки виявилися значно привабливішими для летких екстрактів з простору над ґрунтом порівняно з 72-годинною сечею у порівнянні з контрольною групою (p = 0,0066; Рисунок 5C).
Поведінкові реакції на запахи натуральної та синтетичної коров'ячої сечі в пошуках господаря та кровоносних комарів Anopheles arabianus. Схема скляного ольфактометра (A). Приваблення летких екстрактів з простору над рідиною зі свіжої та витриманої коров'ячої сечі до комарів-господарів (B) та кровососів (C). Знайдіть реакцію щупалець комара Lord An. Показано екстракти з простору над рідиною, виділені зі свіжої (D), 24-годинної (E), 72-годинної (F) та 168-годинної (G) витриманої коров'ячої сечі. Сліди електронної антенної детекції (EAD) показують зміни напруги у відповідь на біоактивні сполуки у просторі над рідиною, елюйовані з газового хроматографа та виявлені полум'яно-іонізаційним детектором (FID). Масштабна шкала представляє амплітуду відгуку (мВ) у залежності від часу утримування (с). Показано властивості та швидкості вивільнення (мкг/год) біологічно активних сполук. Одинарна зірочка (*) вказує на послідовну низькоамплітудну відповідь. Подвійні зірочки (**) вказують на невідтворювані відповіді. Знайдіть господаря (H) та кровососів. (I) An.arabiensis по-різному сприймає синтетичні суміші запахів свіжої та витриманої коров'ячої сечі. Середні частки комарів, яких приваблюють різні літерні назви, суттєво відрізнялися один від одного (однофакторний дисперсійний аналіз з використанням постфактумного аналізу Тьюкі; p < 0,05). Смуги похибки представляють стандартну похибку шкали.
Самка Ann.arabiensis, через 72 та 120 годин після кров'яного борошна, під час нересту, не виявила переваги для летких екстрактів з парової фази свіжої та витриманої коров'ячої сечі порівняно з пентановими контрольними особинами (χ2 = 3,07, p > 0,05; Додатковий файл 1: Рис. S1).
Для самок Ann.arabiensis аналізи GC-EAD та GC-MS виявили вісім, шість, три та три біоактивні сполуки (Рисунок 5D-G). Хоча спостерігалися відмінності в кількості сполук, що викликали електрофізіологічні реакції, більшість цих сполук були присутні в кожному леткому екстракті, зібраному зі свіжої та витриманої сечі, у вільному просторі. Тому для кожного екстракту в подальші аналізи були включені лише сполуки, які викликали фізіологічну реакцію від самок-антен вище порогового значення.
Загальна швидкість вивільнення летких біоактивних сполук у колекції з пари сечі збільшилася з 29 мкг/год у свіжій сечі до 242 мкг/год у сечі, витриманій 168 годин, головним чином завдяки підвищенню вмісту п-крезолу та м-формальдегіду. Збільшення вмісту фенолу, а також фенолу, зменшувалися зі збільшенням віку сечі, що корелювало зі спостережуваним зниженням інтенсивності (кількості) сигналу на хроматограмі (рис. 5D)-G ліва панель) та фізіологічними реакціями на ці сполуки (рис. 5D-G права панель).
Загалом, синтетична суміш мала подібне природне співвідношення біоактивних сполук, виявлених у летких екстрактах свіжої та витриманої сечі (рис. 5D–G), і, схоже, не викликала значної привабливості в пошуку хазяїна (χ2 = 8,15, df = 4, p = 0,083; рис. 5H) або кровоссальних комарів (χ2 = 4,91, df = 4, p = 0,30; рис. 5I). Однак, попарні порівняння post hoc між варіантами обробки показали, що комарі, які шукають хазяїна, були значно привабливішими для синтетичної суміші 24-годинної витриманої сечі порівняно з пентановими контролями (p = 0,0086; рис. 5H).
Для оцінки ролі окремих компонентів у синтетичних сумішах 24-годинної сечі було проведено порівняння шести субтрактивних сумішей з повними сумішами в Y-подібному аналізі, в якому окремі сполуки були видалені. Для комарів, що шукають господаря, віднімання окремих сполук з повної суміші мало значний вплив на поведінкові реакції (χ2 = 19,63, df = 6, p = 0,0032; Додатковий файл 1: Рисунок S2A), всі субтрактивні суміші були більш привабливими, ніж повністю змішані. Навпаки, видалення окремих сполук з повністю синтетичної суміші не вплинуло на поведінкові реакції кровоссальних комарів (χ2 = 11,38, df = 6, p = 0,077), за винятком деканалу, який призвів до нижчих рівнів привабливості порівняно з повною сумішшю (p = 0,022; Додатковий файл 1: Рисунок S2B).
У селі Ефіопії, ендемічному з малярії, ефективність синтетичної суміші 24-годинної коров'ячої сечі для приваблення комарів у польових умовах оцінювалася протягом десяти ночей (рис. 6A). Загалом було спіймано та ідентифіковано 4861 комарів, з яких 45,7% становили Anthropus.gambiae sl, 18,9% - Anopheles pharoensis та 35,4% - Culex spp. (Додатковий файл 1: Таблиця S1). Anopheles arabinis - єдиний представник видового комплексу An.Gambian, ідентифікований за допомогою ПЛР-аналізу. В середньому за ніч було спіймано 320 комарів, і протягом цього часу пастки із синтетичними сумішшю приманок ловили більше комарів, ніж парні пастки без суміші (χ2(0, 3196) = 170,0, p < 0,0001). Пастки без приманки встановлювалися кожної з п'яти контрольних ночей на початку, в середині та в кінці випробування. У кожній парі пасток було спіймано однакову кількість комарів, що свідчить про... відсутність зміщення між будинками (χ2(0, 1665) = 9 × 10-13, p > 0,05) та відсутність скорочення популяції протягом періоду дослідження. Порівняно з контрольними пастками, кількість комарів, спійманих у пастках, що містили синтетичну суміш, значно збільшилася: пошук господаря (χ2(0, 2107) = 138,7, p < 0,0001), нещодавнє кровохаркання (χ2(0, 650) = 32,2, p < 0,0001) та вагітність (χ2(0, 228) = 6,27, p = 0,0123; Додатковий файл 1: Таблиця S1). Це також відображається на загальній кількості спійманих комарів: пошук господаря > кровоссальні > вагітні > напіввагітні > самець.
Польова оцінка ефективності 24-годинної суміші запаху синтетичної коров'ячої сечі. Польові випробування проводилися в південно-центральній Ефіопії (карта), поблизу міста Макі (вставка), з використанням світлової пастки Центрів контролю та профілактики захворювань (CDC) (праворуч) у парних будиночках, з латинською квадратною конструкцією (аерофотознімок) (A). Синтетичні фотопастки CDC з запаховою приманкою приваблюють та ловлять самок Anopheles arabesques (B), але не Anopheles farroes (C), по-іншому, залежно від фізіологічного стану. Крім того, ці пастки ловлять значно більшу кількість комарів-господарів Culex. (D) Порівняно з контролем. Стовпчики ліворуч представляють середній індекс селекції комарів, спійманих у парах пасток з запаховою приманкою (зелений) та контрольних (відкритих) пасток (N = 10), тоді як стовпчики праворуч представляють середній індекс селекції в парах контрольних пасток (відкритих; N = 5). Зірочки вказують на рівні статистичної значущості (*p = 0,01 та ***p < 0,0001).
Три види були по-різному відловлені в пастках, що містили синтетичні суміші. Пошук господаря (χ2(1, 1345) = 71,7, p < 0,0001), кровохарчування (χ2(1, 517) = 16,7, p < 0,0001) та вагітність (χ2(1, 180) = 6,11, p = 0,0134) показав, що .arabiensis був спійманий у пастці, вивільняючи синтетичну суміш (рис. 6B), тоді як кількість An не відрізнялася. Були виявлені Pharoensis у різних фізіологічних станах (рис. 6C). Для Culex було виявлено лише значне збільшення кількості комарів, які шукають господарів, у пастках з приманкою із синтетичної суміші (χ2(1,1319) = 12,6, p = 0,0004; рис. 6D) порівняно з контрольними пастками.
Для оцінки того, чи використовують малярійні комарі запах коров'ячої сечі як сигнал для середовища існування хазяїна, використовувалися пастки-приманки, розташовані поза межами потенційних хазяїв між місцями розмноження та сільськими громадами в Ефіопії. За відсутності сигналів для хазяїна, тепла, а також за наявності чи без запаху коров'ячої сечі, жодного комаря не було спіймано (Додатковий файл 1: Рисунок S3). Однак, за наявності високої температури та запаху коров'ячої сечі, самок малярійних комарів було приваблено та спіймано, хоча й у невеликій кількості, незалежно від віку сечі (χ2(5, 25) = 2,29, p = 0,13; Додатковий файл 1: Рисунок S3). На противагу цьому, контрольні угруповання з водою не спіймали малярійних комарів за високих температур (Додатковий файл 1: Рисунок S3).
Малярійні комарі отримують та розповсюджують азотовмісні сполуки шляхом компенсаторного живлення коров'ячою сечею (тобто калюжами) для покращення життєвих характеристик, подібно до інших комах [2, 4, 24, 25, 26]. Коров'яча сеча є легкодоступним відновлюваним ресурсом, тісно пов'язаним з місцями відпочинку переносників малярії, такими як корівники та висока рослинність поблизу сільських будинків та місць нересту. Самки комарів знаходять цей ресурс за запахом і здатні регулювати поглинання азотовмісних сполук із сечею, включаючи сечовину, основний азотовмісний компонент сечі [15, 16]. Залежно від фізіологічного стану самки комара, поживні речовини з сечі виділяються для посилення льотної активності та виживання самок комарів, що шукають господаря, а також для виживання та репродуктивних характеристик особин, що харчуються кров'ю, протягом першого гонадотропного циклу. Таким чином, змішування сечі відіграє важливу харчову роль для переносників малярії, які є закритими, як і дорослі особини, що страждають на недоїдання [8], оскільки це забезпечує самкам комарів можливість отримувати важливі азотовмісні сполуки, займаючись харчуванням з низьким ризиком. Це відкриття має значні епідеміологічні наслідки, оскільки самки збільшують тривалість свого життя, активність та репродуктивна здатність, що впливає на здатність переносників. Крім того, така поведінка може бути метою майбутніх програм боротьби з переносниками.