Дякуємо, що відвідали Nature.com.Ви використовуєте версію браузера з обмеженою підтримкою CSS.Для найкращої роботи радимо використовувати оновлений браузер (або вимкнути режим сумісності в Internet Explorer).Крім того, щоб забезпечити постійну підтримку, ми показуємо сайт без стилів і JavaScript.
Відображає карусель із трьох слайдів одночасно.Використовуйте кнопки «Попередній» і «Наступний», щоб переходити по трьох слайдах одночасно, або використовуйте кнопки повзунка в кінці, щоб переходити по трьох слайдах одночасно.
Гематоенцефалічний бар'єр і гематоенцефалічний бар'єр перешкоджають біотерапевтичним агентам досягти своїх цілей у центральній нервовій системі, тим самим перешкоджаючи ефективному лікуванню неврологічних захворювань.Щоб виявити нові мозкові транспортери in vivo, ми представили бібліотеку пептидів фага T7 і серійно збирали кров і спинномозкову рідину (СМР) за допомогою канюльованої моделі великого пулу щурів у свідомості.Специфічні фагові клони були сильно збагачені CSF після чотирьох раундів відбору.Тестування окремих пептидів-кандидатів виявило більш ніж 1000-кратне збагачення СМР.Біоактивність опосередкованої пептидом доставки в мозок була підтверджена 40% зниженням рівня амілоїду-β в спинномозковій рідині за допомогою інгібітора пептиду BACE1, пов’язаного з ідентифікованим новим транзитним пептидом.Ці результати свідчать про те, що пептиди, ідентифіковані методами відбору фагів in vivo, можуть бути корисними засобами для системної доставки макромолекул до мозку з терапевтичним ефектом.
Дослідження таргетної терапії центральної нервової системи (ЦНС) здебільшого зосереджено на виявленні оптимізованих ліків і агентів, які виявляють властивості націлювання на ЦНС, з меншими зусиллями на виявленні механізмів, які керують активною доставкою ліків у мозок.Зараз це починає змінюватися, оскільки доставка ліків, особливо великих молекул, є невід’ємною частиною сучасної нейронаукової розробки ліків.Середовище центральної нервової системи добре захищене системою цереброваскулярного бар’єру, що складається з гематоенцефалічного бар’єру (ГЕБ) ​​і гематоенцефалічного бар’єру (ГЕББ)1, що ускладнює доставку ліків до мозку1,2.Підраховано, що майже всі високомолекулярні ліки та понад 98% низькомолекулярних препаратів виводяться з мозку3.Тому дуже важливо визначити нові транспортні системи мозку, які забезпечують ефективну та специфічну доставку терапевтичних препаратів до ЦНС 4,5.Однак BBB і BCSFB також представляють чудову можливість для доставки ліків, оскільки вони проникають у всі структури мозку через його розгалужену судинну мережу.Таким чином, поточні спроби використовувати неінвазивні методи доставки в мозок значною мірою базуються на механізмі рецептор-опосередкованого транспорту (PMT) з використанням ендогенного рецептора BBB6.Незважаючи на останні ключові досягнення у використанні шляху рецептора трансферину7,8, необхідна подальша розробка нових систем доставки з покращеними властивостями.З цією метою наша мета полягала в тому, щоб ідентифікувати пептиди, здатні опосередковувати транспорт CSF, оскільки вони в принципі можуть бути використані для доставки макромолекул до ЦНС або для відкриття нових рецепторних шляхів.Зокрема, потенційними мішенями для активної та специфічної доставки біотерапевтичних препаратів можуть служити специфічні рецептори та транспортери цереброваскулярної системи (ГЕБ та БСКФБ).Цереброспінальна рідина (СМР) є секреторним продуктом судинного сплетення (КС) і знаходиться в прямому контакті з інтерстиціальною рідиною головного мозку через субарахноїдальний простір і шлуночковий простір4.Нещодавно було показано, що субарахноїдальна цереброспінальна рідина надмірно дифундує в інтерстицій головного мозку9.Ми сподіваємося отримати доступ до паренхіматозного простору за допомогою субарахноїдального вхідного тракту або безпосередньо через ГЕБ.Щоб досягти цього, ми запровадили надійну стратегію відбору фагів in vivo, яка ідеально ідентифікує пептиди, що транспортуються будь-яким із цих двох різних шляхів.
Зараз ми опишемо послідовний метод скринінгу фагового дисплея in vivo із відбором зразків CSF у поєднанні з високопродуктивним секвенуванням (HTS) для моніторингу початкових раундів відбору з найвищою різноманітністю бібліотек.Скринінг проводили на щурах у свідомості з постійно імплантованою канюлею великої цистерни (CM), щоб уникнути зараження крові.Важливо, що цей підхід вибирає як націлені на мозок, так і пептиди з транспортною активністю через цереброваскулярний бар’єр.Ми використовували фаги T7 через їхній малий розмір (~60 нм)10 і припустили, що вони придатні для транспортування везикул, які дозволяють трансцелюлярний перетин ендотеліального та/або епітеліально-мозкового бар’єру.Після чотирьох раундів панорамування були виділені популяції фагів, які показали сильне збагачення in vivo СМР та асоціацію церебральних мікросудин.Важливо те, що ми змогли підтвердити наші висновки, продемонструвавши, що переважні та хімічно синтезовані найкращі пептиди-кандидати здатні транспортувати білковий вантаж у спинномозкову рідину.По-перше, були встановлені фармакодинамічні ефекти ЦНС шляхом поєднання провідного транзитного пептиду з інгібітором пептиду BACE1.На додаток до демонстрації того, що стратегії функціонального скринінгу in vivo можуть ідентифікувати нові транспортні пептиди мозку як ефективні носії білкового вантажу, ми очікуємо, що подібні підходи до функціонального відбору також стануть важливими для виявлення нових шляхів транспорту мозку.
На основі бляшкоутворюючих одиниць (PFU) після етапу упаковки фагів була розроблена та створена бібліотека випадкових 12-мерних лінійних фагових пептидів T7 із різноманіттям приблизно 109 (див. Матеріали та методи).Важливо відзначити, що ми ретельно проаналізували цю бібліотеку перед панорамуванням in vivo.ПЛР-ампліфікація зразків фагової бібліотеки з використанням модифікованих праймерів створювала амплікони, які були безпосередньо застосовні до HTS (додатковий рис. 1а).Через a) помилки секвенування HTS11, b) вплив на якість праймерів (NNK) 1-12 і c) присутність фага дикого типу (wt) (скелетні вставки) у резервній бібліотеці, була реалізована процедура фільтрації послідовності, щоб отримати лише перевірену інформацію про послідовність (додатковий рис. 1b).Ці кроки фільтрування застосовуються до всіх бібліотек секвенування HTS.Для стандартної бібліотеки було отримано загалом 233 868 зчитувань, з яких 39% пройшли критерії фільтрації та були використані для аналізу бібліотеки та відбору для наступних раундів (додатковий малюнок 1c–e).Зчитування були переважно кратними 3 парам основ завдовжки з піком у 36 нуклеотидів (додатковий рис. 1c), що підтверджує дизайн бібліотеки (NNK) 1-12.Примітно, що приблизно 11% членів бібліотеки містили 12-вимірну вставку основного PAGISRELVDKL дикого типу (wt), і майже половина послідовностей (49%) містили вставки або видалення.HTS бібліотеки бібліотеки підтвердив високу різноманітність пептидів у бібліотеці: більше 81% пептидних послідовностей були знайдені лише один раз і лише 1,5% зустрічалися в ≥4 копіях (додаткова рис. 2а).Частоти амінокислот (aa) у всіх 12 положеннях репертуару добре корелювали з частотами, очікуваними для кількості кодонів, утворених виродженим репертуаром NKK (додатковий рис. 2b).Спостережувана частота залишків аа, кодованих цими вставками, добре корелювала з розрахованою частотою (r = 0,893) (додатковий рис. 2c).Підготовка бібліотек фагів для ін'єкції включає етапи ампліфікації та видалення ендотоксину.Раніше було показано, що це потенційно зменшує різноманітність фагових бібліотек12,13.Таким чином, ми секвенували ампліфіковану на пластині бібліотеку фагів, яка зазнала видалення ендотоксину, і порівняли її з вихідною бібліотекою, щоб оцінити частоту AA.Спостерігалася сильна кореляція (r = 0,995) між вихідним пулом і ампліфікованим і очищеним пулом (додаткова рис. 2d), що вказує на те, що конкуренція між клонами, ампліфікованими на чашках з використанням фага T7, не викликала значного відхилення.Це порівняння базується на частоті трипептидних мотивів у кожній бібліотеці, оскільки різноманітність бібліотек (~109) не може бути повністю охоплено навіть за допомогою HTS.Частотний аналіз aa в кожній позиції виявив невелике зміщення, залежне від позиції, в останніх трьох позиціях введеного репертуару (додатковий рис. 2e).На закінчення ми дійшли висновку, що якість і різноманітність бібліотеки були прийнятними, і спостерігалися лише незначні зміни в різноманітності через ампліфікацію та підготовку бібліотек фагів між кількома раундами відбору.
Послідовний відбір зразків спинномозкової рідини можна виконати шляхом хірургічної імплантації канюлі в ЦМ щурів у свідомості, щоб полегшити ідентифікацію фага T7, введеного внутрішньовенно (в/в) через BBB та/або BCSFB (рис. 1a-b).Ми використовували дві незалежні групи селекції (групи A і B) у перших трьох раундах селекції in vivo (рис. 1c).Ми поступово підвищували жорсткість відбору, зменшуючи загальну кількість фага, введеного в перших трьох раундах відбору.Для четвертого раунду панорамування ми об’єднали зразки з гілок A і B і виконали три додаткових незалежних відбору.Для вивчення in vivo властивостей частинок фага T7 у цій моделі фаг дикого типу (основна вставка PAGISRELVDKL) вводили щурам через хвостову вену.Відновлення фагів із спинномозкової рідини та крові в різні моменти часу показало, що відносно невеликі ікосаедричні фаги T7 мали швидку початкову фазу очищення від кровоносного відділу (додатковий рис. 3).На підставі введених титрів та об’єму крові щурів ми підрахували, що лише приблизно 1% мас.фаг із введеної дози виявлявся в крові через 10 хвилин після внутрішньовенного введення.Після цього початкового швидкого зниження було зафіксовано більш повільний первинний кліренс з періодом напіввиведення 27,7 хвилини.Важливо, що лише дуже мало фагів було витягнуто з компартменту СМР, що вказує на низький фон для міграції фагів дикого типу в компартмент СМР (Додатковий рис. 3).У середньому лише близько 1 x 10-3% титрів фага T7 у крові та 4 x 10-8% початково введених фагів було виявлено в спинномозковій рідині протягом усього періоду відбору проб (0-250 хв).Примітно, що період напіврозпаду (25,7 хв) фага дикого типу в цереброспінальній рідині був подібним до того, що спостерігається в крові.Ці дані демонструють, що бар’єр, який відокремлює компартмент СМР від крові, є недоторканим у щурів із канюляцією ЦМ, що дозволяє відбирати бібліотеки фагів in vivo для ідентифікації клонів, які легко транспортуються з крові в компартмент СМР.
(a) Налаштування методу повторного відбору зразків спинномозкової рідини (ліквору) із великого басейну.(b) Діаграма, що показує клітинне розташування бар’єру центральної нервової системи (ЦНС) і стратегію вибору, яка використовується для ідентифікації пептидів, які перетинають гематоенцефалічний бар’єр (ГЕБ) і гематоенцефалічний бар’єр.(c) Блок-схема скринінгу фагового дисплея in vivo.У кожному раунді відбору фаги (ідентифікатори тварин усередині стрілок) вводили внутрішньовенно.Дві незалежні альтернативні гілки (A, B) зберігаються окремо до 4-го раунду відбору.Для раундів відбору 3 і 4 кожен клон фага, екстрагований із CSF, секвенували вручну.(d) Кінетика фага, виділеного з крові (червоні кружечки) і спинномозкової рідини (зелені трикутники) під час першого раунду відбору у двох щурів з канюлями після внутрішньовенної ін’єкції бібліотеки пептидів Т7 (2 х 1012 фагів/тварину).Сині квадрати вказують на середню початкову концентрацію фага в крові, розраховану з кількості введеного фага з урахуванням загального об’єму крові.Чорні квадрати вказують на точку перетину лінії y, екстрапольованої з концентрацій фагів крові.(e,f) Уявіть відносну частоту та розподіл усіх можливих трипептидних мотивів, що перекриваються, знайдених у пептиді.Показано кількість мотивів, знайдених у 1000 читаннях.Достовірно (p < 0,001) збагачені мотиви позначені червоними крапками.(e) Діаграма розсіювання кореляції, що порівнює відносну частоту трипептидного мотиву введеної бібліотеки з фагом, отриманим із крові тварин №1.1 і №1.2.(f) Кореляційна діаграма розсіювання, що порівнює відносні частоти трипептидних мотивів фагів тварин №1.1 і №1.2, виділених у крові та спинномозковій рідині.(g, h) Ідентифікаційне представлення послідовності фага, збагаченого кров’ю (g) проти введених бібліотек, і фага, збагаченого CSF (h) проти крові після раунду селекції in vivo в обох тварин.Розмір однолітерного коду вказує, як часто ця амінокислота зустрічається в цій позиції.Зелений = полярний, фіолетовий = нейтральний, синій = основний, червоний = кислотні і чорний = гідрофобні амінокислоти.Рисунок 1a, b був розроблений і створений Едуардом Уріхом.
Ми ввели бібліотеку фагових пептидів у двох щурів CM instrument (клади A і B) і виділили фаг із спинномозкової рідини та крові (рис. 1d).Початкове швидке очищення бібліотеки було менш вираженим порівняно з фагом дикого типу.Середній період напіврозпаду введеної бібліотеки в обох тварин становив 24,8 хвилини в крові, подібно до фага дикого типу, і 38,5 хвилин у спинномозковій рідині.Зразки фагів крові та спинномозкової рідини від кожної тварини піддавали HTS, і всі ідентифіковані пептиди аналізували на наявність короткого трипептидного мотиву.Трипептидні мотиви були обрані тому, що вони забезпечують мінімальну основу для формування структури та взаємодій пептид-білок14,15.Ми виявили хорошу кореляцію в розподілі мотивів між введеною бібліотекою фагів і клонами, виділеними з крові обох тварин (рис. 1e).Дані вказують на те, що склад бібліотеки лише незначно збагачений у відділі крові.Частоти амінокислот і консенсусні послідовності були додатково проаналізовані в кожній позиції з використанням адаптації програмного забезпечення Weblogo16.Цікаво, що ми виявили сильне збагачення крові залишками гліцину (рис. 1g).Коли кров порівнювали з клонами, відібраними з ЦСЖ, спостерігали сильний відбір і деяке скасування вибору мотивів (рис. 1f), і певні амінокислоти переважно були присутні в заздалегідь визначених положеннях у 12-члені (рис. 1h).Примітно, що окремі тварини суттєво відрізнялися за спинномозковою рідиною, тоді як збагачення крові гліцином спостерігалося в обох тварин (додатковий рис. 4a–j).Після суворої фільтрації даних про послідовність у спинномозковій рідині тварин №1.1 і №1.2 було отримано загалом 964 та 420 унікальних 12-мерних пептидів (додатковий рис. 1d–e).Виділені фагові клони ампліфікували та піддавали другому циклу відбору in vivo.Фаги, виділені з другого раунду відбору, піддавали HTS у кожної тварини, і всі ідентифіковані пептиди використовували як вхідні дані для програми розпізнавання мотивів для аналізу появи трипептидних мотивів (рис. 2a, b, ef).Порівняно з першим циклом фага, вилученого з CSF, ми спостерігали подальший відбір і скасування виділення багатьох мотивів у CSF у гілках A і B (рис. 2).Алгоритм ідентифікації мережі був застосований, щоб визначити, чи вони представляють різні шаблони узгодженої послідовності.Чітка подібність спостерігалася між 12-вимірними послідовностями, відновленими CSF в альтернативній кладі A (рис. 2c, d) і кладі B (рис. 2g, h).Об’єднаний аналіз у кожній гілці виявив різні профілі селекції для 12-мерних пептидів (додатковий рис. 5c, d) і збільшення співвідношення титру CSF/крові з часом для об’єднаних клонів після другого раунду відбору порівняно з першим раундом відбору (додатковий рис. 5e).).
Збагачення мотивів і пептидів у спинномозковій рідині двома послідовними раундами відбору функціонального фагового дисплея in vivo.
Усі фаги спинномозкової рідини, виділені з першого раунду кожної тварини (тварини №1.1 і №1.2), об’єднували, ампліфікували, секвенували HT і повторно ін’єктували разом (2 х 1010 фагів/тварину) 2 щурам із канюлями SM (№1.1 → #).2.1 і 2.2, 1.2 → 2.3 і 2.4).(a, b, e, f) Кореляційні діаграми розсіювання, що порівнюють відносну частоту трипептидних мотивів усіх фагів, отриманих із CSF, у першому та другому раундах відбору.Відносна частота та розподіл мотивів, що представляють усі можливі трипептиди, що перекриваються, знайдені в пептидах в обох орієнтаціях.Показано кількість мотивів, знайдених у 1000 читаннях.Мотиви, які були значною мірою (p <0,001) обрані або виключені в одній із порівнюваних бібліотек, виділені червоними крапками.(c, d, g, h) Представлення логотипу послідовності всіх багатих CSF послідовностей із 12 амінокислот на основі раундів 2 і 1 селекції in vivo.Розмір однолітерного коду вказує, як часто ця амінокислота зустрічається в цій позиції.Щоб представити логотип, порівнюється частота послідовностей СМР, виділених з окремих тварин між двома раундами відбору, і показано збагачені послідовності у другому раунді: (c) #1.1–#2.1 (d) #1.1–#2.2 (g) #1.2–#2.3 та (h) #1.2–#2.4.Найбільш збагачених амінокислотами в даній позиції у (в, г) тварин немає.2.1 та №2.2 або (g, h) у тварин немає.2.3 та №2.4 зображені кольоровими.Зелений = полярний, фіолетовий = нейтральний, синій = основний, червоний = кислотні і чорний = гідрофобні амінокислоти.
Після третього раунду відбору ми ідентифікували 124 унікальні пептидні послідовності (№3.1 і №3.2) з 332 фагових клонів, відновлених CSF, виділених від двох тварин (додаткова рис. 6а).Послідовність LGSVS (18,7%) мала найвищу відносну частку, за якою йшли вставки дикого типу PAGISRELVDKL (8,2%), MRWFFSHASQGR (3%), DVAKVS (3%), TWLFSLG (2,2%) і SARGSWREIVSLS (2,2%).В останньому четвертому раунді ми об’єднали дві незалежно відібрані гілки від трьох окремих тварин (рис. 1c).З 925 секвенованих клонів фагів, вилучених із СМР, у четвертому раунді ми виявили 64 унікальні пептидні послідовності (додатковий рис. 6b), серед яких відносна частка фагів дикого типу впала до 0,8%.Найпоширенішими клонами CSF у четвертому раунді були LYVLHSRGLWGFKLAAALE (18%), LGSVS (17%), GFVRFRLSNTR (14%), KVAWRVFSLFWK (7%), SVHGV (5%), GRPQKINGARVC (3,6%) і RLSSVDSDLSGC (3, 2%).%)).Діапазон довжин вибраних пептидів обумовлений нуклеотидними вставками/делеціями або передчасними стоп-кодонами в праймерах бібліотеки при використанні вироджених кодонів для дизайну бібліотеки NNK.Передчасні стоп-кодони генерують коротші пептиди та вибираються, оскільки вони містять сприятливий мотив аа.Довші пептиди можуть бути результатом вставок/делецій у праймерах синтетичних бібліотек.Це розміщує розроблений стоп-кодон поза рамкою та зчитує його, доки новий стоп-кодон не з’явиться нижче.Загалом ми розрахували коефіцієнти збагачення для всіх чотирьох раундів відбору шляхом порівняння вхідних даних із вихідними даними вибірки.Для першого раунду скринінгу ми використовували титри фагів дикого типу як неспецифічний фоновий еталон.Цікаво, що негативний відбір фагів був дуже сильним у першому циклі CSF, але не в крові (рис. 3a), що може бути пов’язано з низькою ймовірністю пасивної дифузії більшості членів пептидної бібліотеки в компартмент CSF або відповідні фаги, як правило, більш ефективно утримуються або видаляються з кровотоку, ніж бактеріофаги.Однак у другому раунді панорамування спостерігався сильний відбір фагів у ЦСЖ в обох кладах, що свідчить про те, що попередній раунд був збагачений фагами, що демонструють пептиди, які сприяють поглинанню ЦСЖ (рис. 3а).Знову ж без значного збагачення крові.Також у третьому та четвертому раундах фагові клони були значно збагачені CSF.Порівнюючи відносну частоту кожної унікальної пептидної послідовності між останніми двома раундами відбору, ми виявили, що послідовності були ще більш збагачені в четвертому раунді відбору (рис. 3b).Загалом 931 трипептидний мотив було виділено з усіх 64 унікальних пептидних послідовностей з використанням обох пептидних орієнтацій.Найбільш збагачені мотиви в четвертому раунді були більш ретельно вивчені на їх профілі збагачення в усіх раундах порівняно з ін’єкційною бібліотекою (відсічення: 10% збагачення) (додатковий рис. 6c).Загальні закономірності відбору показали, що більшість досліджуваних мотивів були збагачені у всіх попередніх турах обох гілок відбору.Однак деякі мотиви (наприклад, SGL, VSG, LGS GSV) були переважно з альтернативної клади A, тоді як інші (наприклад, FGW, RTN, WGF, NTR) були збагачені альтернативною кладою B.
Перевірка транспорту CSF пептидів, збагачених фагом, і біотинільованих лідерних пептидів, кон’югованих зі стрептавідином.
(a) Коефіцієнти збагачення, розраховані в усіх чотирьох раундах (R1-R4) на основі введених (вхід = I) титрів фагів (PFU) і визначених титрів фагів CSF (вихід = O).Фактори збагачення для останніх трьох раундів (R2-R4) були розраховані шляхом порівняння з попереднім раундом і першим раундом (R1) з ваговими даними.Незакриті смужки — спинномозкова рідина, заштриховані — плазма.(***p<0,001, на основі t-критерію Стьюдента).(b) Список найпоширеніших фагових пептидів, ранжованих відповідно до їх відносної частки до всіх фагів, зібраних у CSF після 4 раунду відбору.Шість найпоширеніших фагових клонів виділені кольором, пронумеровані та їхні коефіцієнти збагачення між 3 і 4 раундами відбору (вставки).(c, d) Шість найбільш збагачених фагових клонів, порожні фагові та батьківські фагові пептидні бібліотеки з раунду 4 аналізували індивідуально в моделі відбору проб CSF.Зразки спинномозкової рідини та крові збирали у вказані моменти часу.(c) Рівні кількості 6 фагових клонів-кандидатів (2 х 1010 фагів/тварин), порожніх фагів (#1779) (2 х 1010 фагів/тварин) і базових бібліотек фагових пептидів (2 х 1012 фагів/тварин). Ін’єкцію принаймні 3 CM вводять тварині з канюлею окремо через хвостову вену.Показано фармакокінетику CSF кожного введеного клону фага та бібліотеки фагових пептидів протягом певного часу.(d) показує середнє співвідношення ліквору/крові для всіх відновлених фагів/мл протягом часу відбору.(e) Чотири синтетичних лідерних пептиди та один зашифрований контроль були пов’язані з біотином зі стрептавідином через їх N-кінець (тетрамерний дисплей) з подальшою ін’єкцією (хвостова вена в/в, 10 мг стрептавідину/кг).Принаймні три інтубованих щури (N = 3).).Зразки спинномозкової рідини відбирали у зазначені моменти часу та вимірювали концентрацію стрептавідину за допомогою ELISA на анти-стрептавідинову рідину (nd = не виявлено).(*p<0,05, **p<0,01, ***p<0,001, на основі тесту ANOVA).(f) Порівняння амінокислотної послідовності найбільш збагаченого клону фагового пептиду №2002 (фіолетовий) з іншими відібраними клонами фагового пептиду з 4-го раунду відбору.Ідентичні та подібні амінокислотні фрагменти позначені кольором.
З усіх збагачених фагів у четвертому раунді (рис. 3b) було відібрано шість клонів-кандидатів для подальшого індивідуального аналізу в моделі відбору проб CSF.Рівні кількості бібліотек шести фагів-кандидатів, порожніх фагів (без вставки) і пептидних бібліотек профагів вводили трьом тваринам з канюлями CM, а фармакокінетику визначали в аналізах CSF (рис. 3c) і крові (додаткова рис. 7).Усі протестовані фагові клони націлювали компартмент СМР на рівні в 10-1000 разів вищому, ніж у порожнього контрольного фага (№1779).Наприклад, клони №2020 і №2077 мали приблизно в 1000 разів вищі титри CSF, ніж контрольний фаг.Фармакокінетичний профіль кожного вибраного пептиду різний, але всі вони мають високу здатність до самонаведення CSF.Ми спостерігали постійне зниження з часом для клонів № 1903 і № 2011, тоді як для клонів № 2077, № 2002 і № 2009 збільшення протягом перших 10 хвилин може вказувати на активний транспорт, але його потрібно перевірити.Клони №2020, №2002 і №2077 стабілізувалися на високих рівнях, тоді як концентрація ЦСР клону №2009 повільно знижувалася після початкового підвищення.Потім ми порівняли відносну частоту кожного кандидата в CSF з його концентрацією в крові (рис. 3d).Кореляція середнього титру кожного кандидата в CSF з його титром крові в усі часи відбору зразків показала, що три з шести кандидатів були значно збагачені кров'ю CSF.Цікаво, що клон №2077 продемонстрував більш високу стабільність крові (додатковий малюнок 7).Щоб підтвердити, що самі пептиди здатні активно транспортувати вантаж, відмінний від фагових частинок, у відділ CSF, ми синтезували чотири лідерні пептиди, дериватизовані біотином на N-кінці, де пептиди прикріплюються до фагової частинки.Біотинільовані пептиди (№ 2002, 2009, 2020 і 2077) були кон'юговані зі стрептавідином (SA) для отримання мультимерних форм, що дещо імітують геометрію фага.Цей формат також дозволив нам виміряти експозицію SA в крові та спинномозковій рідині як білкові пептиди, що транспортують вантаж.Важливо, що фагові дані часто можна було відтворити, коли синтетичні пептиди вводили в цьому SA-кон’югованому форматі (рис. 3e).Скрембловані пептиди мали меншу початкову експозицію та швидший очисний процес у спинномозковій рідині з невизначеними рівнями протягом 48 годин.Щоб отримати уявлення про шляхи доставки цих пептидних фагових клонів у простір спинномозкової рідини, ми проаналізували локалізацію окремих попадань фагового пептиду за допомогою імуногістохімії (IHC) для безпосереднього виявлення фагових частинок через 1 годину після внутрішньовенної ін’єкції in vivo.Примітно, що клони № 2002, № 2077 і № 2009 можна було виявити за допомогою сильного фарбування в капілярах мозку, тоді як контрольний фаг (№ 1779) і клон № 2020 не були виявлені (додатковий малюнок 8).Це свідчить про те, що ці пептиди сприяють впливу на мозок саме шляхом перетину ГЕБ.Щоб перевірити цю гіпотезу, необхідний подальший детальний аналіз, оскільки маршрут BSCFB також може бути залучений.При порівнянні амінокислотної послідовності найбільш збагаченого клону (#2002) з іншими відібраними пептидами було відзначено, що деякі з них мають подібні розширення амінокислот, що може вказувати на подібний механізм транспортування (рис. 3f).
Завдяки своєму унікальному профілю в плазмі та значному збільшенню CSF з часом, клон фагового дисплея №2077 було додатково досліджено протягом більш тривалого 48-годинного періоду, і він зміг відтворити швидке збільшення CSF, що спостерігалося у зв’язку зі стійкими рівнями SA (рис. 4a).Щодо інших ідентифікованих фагових клонів, № 2077 сильно забарвлювався на капіляри головного мозку та показав значну колокалізацію з лектином капілярного маркера при перегляді з вищою роздільною здатністю та, можливо, деяке фарбування в паренхіматозному просторі (Малюнок 4b).Щоб дослідити, чи можна отримати опосередковані пептидом фармакологічні ефекти в ЦНС, ми провели експеримент, у якому біотинільовані версії i) транзитного пептиду №2077 та ii) пептиду-інгібітора BACE1 змішували з SA у двох різних співвідношеннях.Для однієї комбінації ми використовували лише інгібітор пептиду BACE1, а для іншої ми використовували співвідношення 1:3 інгібітору пептиду BACE1 до пептиду №2077.Обидва зразки вводили внутрішньовенно, і з часом вимірювали рівні бета-амілоїдного пептиду 40 (Abeta40) у крові та спинномозковій рідині.Abeta40 вимірювали в CSF, оскільки він відображає інгібування BACE1 у паренхімі мозку.Як і очікувалося, обидва комплекси значно знизили рівні Abeta40 в крові (рис. 4c, d).Однак тільки зразки, що містять суміші пептидів, відсутні.2077 та інгібітор пептиду BACE1, кон’югованого з SA, викликали значне зниження Abeta40 у спинномозковій рідині (рис. 4c).Дані показують, що пептид №2077 здатний транспортувати білок SA вагою 60 кДа в ЦНС, а також індукує фармакологічні ефекти за допомогою SA-кон’югованих інгібіторів пептиду BACE1.
(a) Клональна ін’єкція (2 × 10 фагів/тварину) фага T7, що показує довгострокові фармакокінетичні профілі пептиду CSF № 2077 (RLSSVDSDLSGC) і неін’єкційного контрольного фага (№ 1779) принаймні у трьох щурів, інтубованих CM.(b) Конфокальне мікроскопічне зображення репрезентативних кортикальних мікросудин у щурів, яким ввели фаг (2 × 10 10 фагів/тварину), що демонструє контрфарбування пептиду № 2077 і судин (лектину).Ці фагові клони вводили 3 щурам і залишали циркулювати протягом 1 години перед перфузією.Головний мозок розрізали та фарбували поліклональними FITC-міченими антитілами проти капсиду фага Т7.За десять хвилин до перфузії та подальшої фіксації лектин, мічений DyLight594, вводили внутрішньовенно.Флуоресцентні зображення, що демонструють фарбування лектином (червоним) просвіту мікросудин і фагами (зеленим) у просвіті капілярів і периваскулярної тканини мозку.Масштабна шкала відповідає 10 мкм.(c, d) Біотинільований інгібіторний пептид BACE1 окремо або в комбінації з біотинільованим транзитним пептидом № 2077 з’єднували зі стрептавідином з подальшою внутрішньовенною ін’єкцією принаймні трьом щурам CM з канюлями (10 мг стрептавідину/кг).Зменшення Aβ40, опосередковане інгібітором пептиду BACE1, вимірювали за допомогою ELISA Aβ1-40 у крові (червоний) і спинномозковій рідині (помаранчевий) у вказані моменти часу.Для кращої наочності на графіку в масштабі 100% проведено пунктир.(c) Відсоткове зниження Aβ40 у крові (червоні трикутники) і спинномозковій рідині (помаранчеві трикутники) у щурів, які отримували стрептавідин, кон’югований з транзитним пептидом №2077 та інгібуючим пептидом BACE1 у співвідношенні 3:1.(d) Зменшення у відсотках крові Aβ40 (червоні кружечки) і спинномозкової рідини (помаранчеві кружечки) щурів, які отримували лише стрептавідин у поєднанні з інгібуючим пептидом BACE1.Концентрація Aβ у контролі становила 420 пг/мл (стандартне відхилення = 101 пг/мл).
Фаговий дисплей був успішно застосований у кількох областях біомедичних досліджень17.Цей метод використовувався для досліджень різноманітності судин in vivo 18, 19, а також для досліджень церебральних судин 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26.У цьому дослідженні ми розширили застосування цього методу відбору не лише для прямої ідентифікації пептидів, націлених на церебральні судини, але й для виявлення кандидатів з активними транспортними властивостями для проходження гематоенцефалічного бар’єру.Зараз ми описуємо розробку процедури відбору in vivo у щурів, інтубованих CM, і демонструємо її потенціал для ідентифікації пептидів із властивостями самонаведення ЦСЖ.Використовуючи фаг T7, який відображає бібліотеку 12-мерних випадкових пептидів, ми змогли продемонструвати, що фаг T7 досить малий (приблизно 60 нм у діаметрі)10, щоб адаптуватися до гематоенцефалічного бар’єру, таким чином безпосередньо перетинаючи гематоенцефалічний бар’єр або судинне сплетення.Ми спостерігали, що збір СМР у щурів CM з канюлями був добре контрольованим методом in vivo функціонального скринінгу, і що екстрагований фаг не лише зв’язувався з судинною системою, але й функціонував як транспортер через гематоенцефалічний бар’єр.Крім того, шляхом одночасного збору крові та застосування HTS до CSF і фагів, отриманих з крові, ми підтвердили, що на наш вибір CSF не вплинуло збагачення крові або придатність для розширення між раундами відбору.Проте відділ крові є частиною процедури відбору, оскільки фаги, здатні досягти відділу CSF, повинні вижити та циркулювати в кровотоці достатньо довго, щоб збагатитися в мозку.Щоб отримати надійну інформацію про послідовність із необроблених даних HTS, ми запровадили фільтри, адаптовані до помилок послідовності, пов’язаних із певною платформою, у робочому процесі аналізу.Включивши кінетичні параметри в метод скринінгу, ми підтвердили швидку фармакокінетику фагів Т7 дикого типу (t½ ~ 28 хв) у крові24, 27, 28, а також визначили їх період напіврозпаду в спинномозковій рідині (t½ ~ 26 хв) за хвилину).Незважаючи на схожі фармакокінетичні профілі в крові та спинномозковій рідині, лише 0,001% концентрації фага в крові можна було виявити в спинномозковій рідині, що вказує на низьку фонову рухливість фага Т7 дикого типу через гематоенцефалічний бар’єр.Ця робота підкреслює важливість першого раунду відбору при використанні стратегій панорамування in vivo, особливо для фагових систем, які швидко виводяться з кровообігу, оскільки небагато клонів здатні досягти компартменту ЦНС.Таким чином, у першому раунді зменшення різноманітності бібліотек було дуже великим, оскільки лише обмежена кількість клонів була зрештою зібрана в цій дуже суворій моделі CSF.Ця стратегія панорамування in vivo включала кілька етапів відбору, таких як активне накопичення в компартменті спинномозкової рідини, виживання клону в компартменті крові та швидке видалення клонів фага T7 з крові протягом перших 10 хвилин (рис. 1d і додатковий рис. 4M).).Таким чином, після першого раунду різні фагові клони були ідентифіковані в CSF, хоча той самий початковий пул використовувався для окремих тварин.Це свідчить про те, що кілька етапів суворого відбору для вихідних бібліотек із великою кількістю членів бібліотеки призводять до значного зменшення різноманітності.Таким чином, випадкові події стануть невід’ємною частиною початкового процесу відбору, суттєво впливаючи на результат.Ймовірно, що багато клонів у вихідній бібліотеці мали дуже схожу схильність до збагачення СМР.Однак навіть за однакових експериментальних умов результати селекції можуть відрізнятися через невелику кількість кожного конкретного клону в початковому пулі.
Мотиви, збагачені СМР, відрізняються від мотивів крові.Цікаво, що ми відзначили перший зсув до багатих гліцином пептидів у крові окремих тварин.(Рис. 1g, додаткові рис. 4e, 4f).Фаг, що містить гліцинові пептиди, може бути більш стабільним і менш імовірним для вилучення з циркуляції.Однак ці багаті гліцином пептиди не були виявлені у зразках спинномозкової рідини, що свідчить про те, що підібрані бібліотеки пройшли два різні етапи відбору: один у крові, а інший дозволив накопичуватися в спинномозковій рідині.Клони, збагачені CSF, отримані в результаті четвертого раунду відбору, були ретельно протестовані.Було підтверджено, що майже всі індивідуально протестовані клони збагачені CSF порівняно з порожнім контрольним фагом.Одне попадання пептиду (#2077) було досліджено більш детально.Він показав довший період напіврозпаду в плазмі порівняно з іншими хітами (Малюнок 3d і Додатковий малюнок 7), і що цікаво, цей пептид містив залишок цистеїну на С-кінці.Нещодавно було показано, що додавання цистеїну до пептидів може покращити їх фармакокінетичні властивості шляхом зв’язування з альбуміном 29 .Це наразі невідомо для пептиду № 2077 і потребує подальшого вивчення.Деякі пептиди продемонстрували валентну залежність у збагаченні CSF (дані не показані), що може бути пов’язано з відображеною геометрією поверхні капсиду T7.Система T7, яку ми використовували, показала 5-15 копій кожного пептиду на фагову частинку.IHC проводили на клонах фагів-кандидатів, які вводили внутрішньовенно в кору головного мозку щурів (додатковий рис. 8).Дані показали, що принаймні три клони (№ 2002, № 2009 і № 2077) взаємодіяли з BBB.Залишається визначити, чи ця взаємодія BBB призводить до накопичення CSF або руху цих клонів безпосередньо до BCSFB.Важливо, що ми показуємо, що вибрані пептиди зберігають свою транспортну здатність CSF під час синтезу та зв’язування з білковим вантажем.Зв'язування N-кінцевих біотинільованих пептидів із SA по суті повторює результати, отримані з їх відповідними фаговими клонами в крові та спинномозковій рідині (рис. 3e).Нарешті, ми показуємо, що провідний пептид № 2077 здатний стимулювати мозкову дію біотинільованого пептидного інгібітора BACE1, кон’югованого з SA, викликаючи виражені фармакодинамічні ефекти в ЦНС шляхом значного зниження рівнів Abeta40 у CSF (рис. 4).Ми не змогли ідентифікувати будь-які гомологи в базі даних, виконуючи пошук гомології пептидної послідовності всіх звернень.Важливо відзначити, що розмір бібліотеки T7 становить приблизно 109, тоді як теоретичний розмір бібліотеки для 12-mers становить 4 x 1015. Тому ми вибрали лише невелику частину простору різноманітності бібліотеки 12-mer пептидів, що може означати, що більш оптимізовані пептиди можна ідентифікувати шляхом оцінки суміжного простору послідовності цих ідентифікованих звернень.Гіпотетично однією з причин, чому ми не знайшли природних гомологів цих пептидів, може бути скасування селекції під час еволюції, щоб запобігти неконтрольованому входженню певних пептидних мотивів у мозок.
У сукупності наші результати створюють основу для майбутньої роботи з більш детального визначення та характеристики транспортних систем цереброваскулярного бар’єру in vivo.Основна установка цього методу базується на стратегії функціонального відбору, яка не тільки ідентифікує клони з церебральними судинними властивостями, але також включає критичний етап, на якому успішні клони мають внутрішню активність для проходження біологічних бар’єрів in vivo в компартмент ЦНС.полягає в тому, щоб з’ясувати механізм транспорту цих пептидів і їх перевагу зв’язуватися з мікроциркуляторним руслом, специфічним для області мозку.Це може призвести до відкриття нових шляхів транспортування ГЕБ і рецепторів.Ми очікуємо, що ідентифіковані пептиди можуть безпосередньо зв'язуватися з цереброваскулярними рецепторами або з циркулюючими лігандами, що транспортуються через BBB або BCSFB.Виявлені в цій роботі пептидні вектори з транспортною активністю СМР будуть додатково досліджені.Наразі ми досліджуємо мозкову специфічність цих пептидів щодо їх здатності перетинати BBB та/або BCSFB.Ці нові пептиди будуть надзвичайно цінними інструментами для потенційного відкриття нових рецепторів або шляхів і для розробки нових високоефективних платформ для доставки макромолекул, таких як біопрепарати, до мозку.
Канюлюйте велику цистерну (ВМ) за допомогою модифікації раніше описаного методу.Анестезованих щурів Вістар (200-350 г) встановлювали на стереотаксичний апарат і робили серединний розріз на поголеній і асептично підготовленій шкірі голови, щоб відкрити череп.Просвердліть два отвори в районі верхньої стулки і закрутіть в отвори кріпильні гвинти.У латеральному потиличному гребені просвердлили додатковий отвір для стереотаксичного наведення канюлі з нержавіючої сталі в CM.Нанесіть стоматологічний цемент навколо канюлі та закріпіть гвинтами.Після фотозатвердіння та затвердіння цементу шкірну рану зашили супрамідним швом 4/0.Правильне розміщення канюлі підтверджується спонтанним витоком спинномозкової рідини (ліквору).Витягніть щура зі стереотаксичного апарату, отримайте відповідний післяопераційний догляд і лікування болю та дайте йому відновитися протягом принаймні одного тижня, поки в спинномозковій рідині не з’являться ознаки крові.Щури Wistar (Crl:WI/Han) були отримані з Charles River (Франція).Усіх щурів утримували в специфічних умовах, вільних від патогенів.Усі експерименти на тваринах були схвалені Ветеринарним управлінням міста Базель, Швейцарія, і проводилися відповідно до Ліцензії на тварин № 2474 (Оцінка активного транспорту мозку шляхом вимірювання рівнів терапевтичних препаратів у спинномозковій рідині та мозку щурів).
Обережно тримайте щура у свідомості, тримаючи в руках канюлю CM.Вийміть дурман з канюлі та наберіть 10 мкл спинномозкової рідини, що спонтанно витікає.Оскільки прохідність канюлі була остаточно порушена, у це дослідження були включені лише прозорі зразки спинномозкової рідини без ознак зараження крові або зміни кольору.Паралельно приблизно 10–20 мкл крові брали з невеликого розрізу на кінчику хвоста в пробірки з гепарином (Sigma-Aldrich).CSF і кров збирали в різні моменти часу після внутрішньовенної ін'єкції фага T7.Приблизно 5–10 мкл рідини відкидали перед кожним забором зразка СМР, що відповідає мертвому об’єму катетера.
Бібліотеки були створені за допомогою вектора T7Select 10-3b, як описано в посібнику до системи T7Select (Novagen, Rosenberg та ін., InNovations 6, 1-6, 1996).Коротко, випадкова 12-мерна вставка ДНК була синтезована в такому форматі:
Кодон NNK використовувався, щоб уникнути подвійних стоп-кодонів і надмірної експресії амінокислот у вставці.N — змішане вручну еквімолярне співвідношення кожного нуклеотиду, а K — змішане вручну еквімолярне співвідношення нуклеотидів аденіну та цитозину.Одноланцюгові ділянки перетворювали на дволанцюгову ДНК шляхом подальшої інкубації з dNTP (Novagen) і ферментом Klenow (New England Biolabs) у буфері Klenow (New England Biolabs) протягом 3 годин при 37°C.Після реакції дволанцюгову ДНК відновлювали осадженням EtOH.Отриману ДНК розщеплювали ферментами рестрикції EcoRI і HindIII (обидва від Roche).Розщеплену та очищену (QIAquick, Qiagen) вставку (лігаза T4, New England Biolabs) потім лігували в рамці в попередньо розщеплений вектор T7 після амінокислоти 348 гена капсиду 10B.Реакції лігування інкубували при 16°C протягом 18 годин перед упаковкою in vitro.Упаковку фагів in vitro проводили згідно з інструкціями, що додаються до набору для клонування T7Select 10-3b (Novagen), і розчин для упаковки один раз ампліфікували для лізису за допомогою Escherichia coli (BLT5615, Novagen).Лізати центрифугували, титрували і заморожували при -80°C як вихідний розчин гліцерину.
Пряма ПЛР-ампліфікація варіабельних ділянок фагів, ампліфікованих у бульйоні або планшеті з використанням запатентованих злитих праймерів 454/Roche-amplicon.Праймер прямого злиття містить послідовності, що обрамляють варіабельну область (NNK) 12 (специфічну для шаблону), GS FLX Titanium Adapter A та ключову послідовність бібліотеки чотирьох основ (TCAG) (додатковий малюнок 1a):
Праймер зворотного злиття також містить біотин, прикріплений до кульок захоплення, і GS FLX Titanium Adapter B, необхідний для клональної ампліфікації під час емульсійної ПЛР:
Потім амплікони піддавали піросеквенуванню 454/Roche згідно з протоколом 454 GS-FLX Titanium.Для ручного секвенування за Сенгером (Applied Biosystems Hitachi 3730 xl DNA Analyzer) ДНК фага T7 ампліфікували за допомогою ПЛР і секвенували за такими парами праймерів:
Вставки з окремих бляшок піддавали ПЛР-ампліфікації за допомогою Roche Fast Start DNA Polymerase Kit (відповідно до інструкції виробника).Виконайте гарячий старт (10 хв при 95 °C) і 35 циклів посилення (50 с при 95 °C, 1 хв при 50 °C і 1 хв при 72 °C).
Фаг із бібліотек, фаг дикого типу, фаг, вилучений із спинномозкової рідини та крові, або окремі клони ампліфікували в Escherichia coli BL5615 у туберкульозному бульйоні (Sigma Aldrich) або в чашках 500 см2 (Thermo Scientific) протягом 4 годин при 37°C.Фаги екстрагували з планшетів, промиваючи планшети буфером Tris-EDTA (Fluka Analytical) або збираючи бляшки стерильними наконечниками піпеток.Фаг виділяли з культурального супернатанту або екстракційного буфера з одним раундом осадження поліетиленгліколем (PEG 8000) (Promega) і ресуспендували в трис-EDTA буфері.
Ампліфікований фаг піддавали 2-3 раундам видалення ендотоксину за допомогою кульок для видалення ендотоксину (Miltenyi Biotec) перед внутрішньовенною (IV) ін’єкцією (500 мкл/тварина).У першому раунді було введено 2×1012 фагів;у другому 2×1010 фагів;у третьому та четвертому раундах відбору 2×109 фагів на тварину.Вміст фагів у зразках спинномозкової рідини та крові, зібраних у зазначені моменти часу, визначали шляхом підрахунку бляшок згідно з інструкціями виробника (посібник системи T7Select).Відбір фагів проводили шляхом внутрішньовенної ін’єкції очищених бібліотек у хвостову вену або шляхом повторної ін’єкції фага, екстрагованого з СМР із попереднього раунду відбору, а наступні збори проводили через 10 хв, 30 хв, 60 хв, 90 хв, 120 хв, 180 хв і 240 хв відповідно для зразків ЦСР і крові.Загалом було проведено чотири раунди панорамування in vivo, у яких дві вибрані гілки зберігалися окремо та аналізувалися протягом перших трьох раундів відбору.Усі фагові вставки, екстраговані з CSF з перших двох раундів відбору, піддавали піросеквенуванню 454/Roche, тоді як усі клони, екстраговані з CSF з останніх двох раундів відбору, секвенували вручну.Усі фаги крові з першого раунду відбору також піддавали піросеквенуванню 454/Roche.Для ін'єкції фагових клонів відібрані фаги ампліфікували в E.coli (BL5615) на чашках площею 500 см2 при 37°C протягом 4 годин.Індивідуально відібрані та секвеновані вручну клони розмножували в середовищі TB.Після екстракції фагів, очищення та видалення ендотоксину (як описано вище) 2×1010 фагів/тварину в 300 мкл вводили внутрішньовенно в одну хвостову вену.
Попередня обробка та якісна фільтрація даних послідовності.Необроблені дані 454/Roche були перетворені з двійкового стандартного формату карти потоку (sff) у зрозумілий людині формат Pearson (fasta) за допомогою програмного забезпечення постачальника.Подальшу обробку нуклеотидної послідовності виконували за допомогою власних програм і сценаріїв на С (невипущений пакет програмного забезпечення), як описано нижче.Аналіз первинних даних включає сувору багатоетапну фільтрацію.Щоб відфільтрувати зчитування, які не містили дійсну послідовність 12-мерної вставки ДНК, зчитування послідовно вирівнювали за початковою міткою (GTGATGTCGGGGATCCGAATTCT), кінцевою міткою (TAAGCTTGCGGCCGCACTCGAGTA) і фоновою вставкою (CCCTGCAGGGATATCCCGGGAGCTCGTCGAC) за допомогою глобального тесту Нідлмена-Вунша.вирівнювання, що допускає до 2 невідповідностей на вирівнювання31.Таким чином, зчитування без тегів початку та зупинки та зчитування, що містять фонові вставки, тобто вирівнювання, що перевищує дозволену кількість невідповідностей, було видалено з бібліотеки.Що стосується решти зчитувань, то послідовність ДНК N-mer, що тягнеться від початкової мітки і закінчується перед міткою стоп, була вирізана з оригінальної послідовності зчитування та додатково оброблена (надалі іменована «вставка»).Після трансляції вставки частина після першого стоп-кодону на 5'-кінці праймера видаляється зі вставки.Крім того, нуклеотиди, що призводять до неповних кодонів на 3'-кінці праймера, також були видалені.Щоб виключити вставки, що містять лише фонові послідовності, трансльовані вставки, що починаються з шаблону амінокислоти «PAG», також були видалені.Пептиди з посттрансляційною довжиною менше 3 амінокислот були видалені з бібліотеки.Нарешті, видаліть надмірність у пулі вставок і визначте частоту кожної унікальної вставки.Результати цього аналізу включали список нуклеотидних послідовностей (вставок) та їх (прочитаних) частот (додаткові малюнки 1c і 2).
Згрупуйте вставки ДНК N-mer за подібністю послідовності: щоб усунути специфічні для 454/Roche помилки секвенування (наприклад, проблеми із секвенуванням розширень гомополімерів) і видалити менш важливі надмірності, попередньо відфільтровані вставки послідовності N-mer ДНК (вставки) сортуються за подібністю.вставки (дозволено до 2 невідповідних баз) з використанням ітераційного алгоритму, визначеного таким чином: вставки сортуються спочатку за частотою (від найвищого до найнижчого), а якщо вони однакові, за їх вторинним сортуванням за довжиною (від найдовшого до найкоротшого) .Таким чином, найчастіші та найдовші вставки визначають першу «групу».Частота групи встановлюється на ключову частоту.Потім кожну вставку, що залишилася в відсортованому списку, намагалися додати до групи шляхом попарного вирівнювання Нідлмена-Вунша.Якщо кількість невідповідностей, вставок або видалень у вирівнюванні не перевищує порогове значення 2, до групи додається вставка, а загальна частота групи збільшується на частоту додавання вставки.Вкладиші, додані до групи, позначаються як використані та виключаються з подальшої обробки.Якщо послідовність вставки не можна додати до вже існуючої групи, послідовність вставки використовується для створення нової групи з відповідною частотою вставки та позначається як використана.Ітерація закінчується, коли кожна послідовність вставки була використана для формування нової групи або може бути включена до вже існуючої групи.Зрештою, згруповані вставки, що складаються з нуклеотидів, з часом транслюються в пептидні послідовності (бібліотеки пептидів).Результатом цього аналізу є набір вставок і відповідних їм частот, які складають кількість послідовних читань (додатковий рис. 2).
Генерація мотиву: на основі списку унікальних пептидів була створена бібліотека, що містить усі можливі моделі амінокислот (aa), як показано нижче.Кожен можливий патерн довжиною 3 був витягнутий з пептиду, і його зворотний патерн був доданий разом із загальною бібліотекою мотивів, що містить усі патерни (трипептиди).Бібліотеки дуже повторюваних мотивів були секвеновані та видалені надмірності.Потім для кожного трипептиду в бібліотеці мотивів ми перевірили його присутність у бібліотеці за допомогою обчислювальних інструментів.У цьому випадку частота пептиду, що містить трипептид знайденого мотиву, додається і призначається мотиву в бібліотеці мотивів («кількість мотивів»).Результатом генерації мотиву є двовимірний масив, що містить усі входження трипептидів (мотивів) та їхні відповідні значення, які є кількістю зчитувань послідовності, які призводять до відповідного мотиву, коли зчитування фільтруються, групуються та транслюються.Метрики, як описано вище.
Нормалізація кількості мотивів і відповідних діаграм розсіювання: кількість мотивів для кожного зразка була нормалізована за допомогою
де ni — кількість читань, які містять тему i.Таким чином, vi являє собою процентну частоту зчитувань (або пептидів), що містять мотив i у зразку.P-значення для ненормованої кількості мотивів розраховували за допомогою точного критерію Фішера.Щодо корелограм кількості мотивів, то кореляції Спірмена були розраховані з використанням нормалізованої кількості мотивів з R.
Щоб візуалізувати вміст амінокислот у кожній позиції бібліотеки пептидів, були створені веб-логограми 32, 33 (http://weblogo.threeplusone.com).По-перше, вміст амінокислот у кожному положенні 12-мерного пептиду зберігається в матриці 20×12.Потім набір із 1000 пептидів, що містять однаковий відносний вміст амінокислот у кожній позиції, генерується у форматі швидкої послідовності та надається як вхідні дані для веб-логотипу 3, який генерує графічне представлення відносного вмісту амінокислот у кожній позиції.для даної бібліотеки пептидів.Щоб візуалізувати багатовимірні набори даних, теплові карти були створені за допомогою внутрішньо розробленого інструменту в R (biosHeatmap, пакет R, який ще не випущено).Дендрограмми, представлені на теплових картах, були розраховані за допомогою методу ієрархічної кластеризації Уорда з метрикою евклідової відстані.Для статистичного аналізу даних оцінки мотивів, значення P для ненормализованої оцінки були розраховані за допомогою точного критерію Фішера.P-значення для інших наборів даних були розраховані в R за допомогою t-критерію Стьюдента або ANOVA.
Відібрані клони фагів і фаги без вставок вводили внутрішньовенно через хвостову вену (2×1010 фагів/тварину в 300 мкл PBS).За десять хвилин до перфузії та наступної фіксації тим же тваринам внутрішньовенно вводили 100 мкл лектину, міченого DyLight594 (Vector Laboratories Inc., DL-1177).Через 60 хвилин після ін’єкції фага щурам перфузували через серце 50 мл PBS, а потім 50 мл 4% PFA/PBS.Зразки мозку додатково фіксували протягом ночі в 4% PFA/PBS і замочували в 30% сахарозі протягом ночі при 4°C.Зразки швидко заморожуються в суміші OCT.Імуногістохімічний аналіз заморожених зразків проводили при кімнатній температурі на кріозрізах 30 мкм, блокованих 1% BSA та інкубованих з поліклональними FITC-міченими антитілами проти фага T7 (Novus NB 600-376A) при 4 °C.Інкубуйте протягом ночі.Нарешті, зрізи промивали 3 рази PBS і досліджували за допомогою конфокального лазерного мікроскопа (Leica TCS SP5).
Усі пептиди з мінімальною чистотою 98% були синтезовані за допомогою GenScript USA, біотинільовані та ліофілізовані.Біотин зв'язується через додатковий потрійний гліциновий спейсер на N-кінці.Перевірте всі пептиди за допомогою мас-спектрометрії.
Стрептавідин (Sigma S0677) змішували з 5-кратним еквімолярним надлишком біотинільованого пептиду, біотинільованого інгібіторного пептиду BACE1 або комбінації (співвідношення 3:1) біотинільованого інгібіторного пептиду BACE1 та інгібіторного пептиду BACE1 у 5–10% ДМСО/інкубували в PBS.1 годину при кімнатній температурі перед ін'єкцією.Стрептавідин-кон'юговані пептиди вводили внутрішньовенно в дозі 10 мг/кг в одну з хвостових вен щурів із порожниною головного мозку.
Концентрацію комплексів стрептавідин-пептид оцінювали методом ІФА.Планшети мікротитратора Nunc Maxisorp (Sigma) покривали протягом ночі при 4°C 1,5 мкг/мл мишачого антитіла проти стрептавідину (Thermo, MA1-20011).Після блокування (блокуючий буфер: 140 нМ NaCL, 5 мМ EDTA, 0,05% NP40, 0,25% желатин, 1% BSA) при кімнатній температурі протягом 2 годин, промийте планшет 0,05% Tween-20/PBS (промивний буфер) протягом 3 секунд, CSF і зразки плазми додали в лунки, розведені блокуючим буфером (плазма 1: 10 000, CSF 1:115).Потім планшет інкубували протягом ночі при 4°C з антитілом для виявлення (1 мкг/мл, анти-стрептавідин-HRP, Novus NB120-7239).Після трьох етапів промивання стрептавідин був виявлений шляхом інкубації в розчині субстрату ТМВ (Roche) протягом до 20 хв.Після зупинки розвитку забарвлення за допомогою 1М H2SO4 виміряйте абсорбцію при 450 нм.
Функцію комплексу стрептавідин-пептид-інгібітор BACE1 оцінювали за допомогою Aβ(1-40) ELISA згідно з протоколом виробника (Wako, 294-64701).Коротко, зразки СМР розводили стандартним розчинником (1:23) та інкубували протягом ночі при 4°C у 96-лункових планшетах, покритих антитілом BNT77.Після п'яти етапів промивання додавали HRP-кон'юговане антитіло BA27 та інкубували протягом 2 годин при 4°C, після чого проводили п'ять етапів промивання.Aβ(1–40) виявляли шляхом інкубації в розчині ТМВ протягом 30 хвилин при кімнатній температурі.Після зупинки розвитку забарвлення стоп-розчином виміряйте абсорбцію при 450 нм.Зразки плазми піддавали твердофазній екстракції перед Aβ(1–40) ELISA.Плазму додавали до 0,2% DEA (Sigma) у 96-лункові планшети та інкубували при кімнатній температурі протягом 30 хвилин.Після послідовного промивання пластин SPE (Oasis, 186000679) водою і 100% метанолом зразки плазми додавали до пластин SPE і всю рідину видаляли.Зразки промивали (спочатку 5% метанолом, потім 30% метанолом) і елюювали 2% NH4OH/90% метанолом.Після сушіння елюату при 55°C протягом 99 хвилин при постійному струмі N2 зразки відновлювали стандартними розчинниками та вимірювали Aβ(1–40), як описано вище.
Як цитувати цю статтю: Urich, E. et al.Доставка вантажу до мозку за допомогою транзитних пептидів, ідентифікованих in vivo.наука.5, 14104;doi:10.1038/srep14104 (2015).
Lihota J., Skjorringe T., Thomsen LB і Moos T. Доставка високомолекулярних препаратів у мозок за допомогою таргетної терапії.Журнал нейрохімії 113, 1–13, 10.1111/j.1471-4159.2009.06544.x (2010).
Brasnjevic, I., Steinbusch, HW, Schmitz, C., і Martinez-Martinez, P. Доставка пептидних і білкових препаратів через гематоенцефалічний бар'єр.Prog Neurobiol 87, 212–251, 10.1016/j.pneurobio.2008.12.002 (2009).
Pardridge, WM Гематоенцефалічний бар'єр: вузьке місце в розробці ліків для мозку.NeuroRx 2, 3–14, 10.1602/neurorx.2.1.3 (2005).
Йохансон, К.Е., Дункан, Д.А., Стопа, Е.Г., і Берд, А. Перспективи покращення доставки ліків і націлювання на мозок через шлях судинного сплетення-ліквору.Фармацевтичні дослідження 22, 1011–1037, 10.1007/s11095-005-6039-0 (2005).
Пардрідж, В. М. Модернізація біофармацевтичних препаратів за допомогою молекулярних троянських коней для доставки мозку.Bioconjug Chem 19, 1327–1338, 10.1021/bc800148t (2008).
Пардрідж, опосередкований рецептором WM пептидний транспорт через гематоенцефалічний бар'єр.Endocr Rev. 7, 314–330 (1986).
Niewoehner, J. та ін.Збільшити проникнення в мозок і ефективність терапевтичних антитіл за допомогою моновалентних молекулярних човників.Нейрон 81, 49–60, 10.1016/j.neuron.2013.10.061 (2014).
Bien-Lee, N. та ін.Транспорт рецептора трансферину (TfR) визначає поглинання мозком афінних варіантів антитіл TfR.J Exp Med 211, 233–244, 10.1084/jem.20131660 (2014).