Деякі теми щодо усунення несправностей LC ніколи не застаріють, оскільки існують проблеми в практиці LC, навіть якщо технологія приладів з часом удосконалюється. Є багато способів, якими можуть виникати проблеми в системі LC і закінчуватися поганою формою піку. Коли виникають проблеми, пов’язані з формою піку, короткий список можливих причин цих результатів допомагає спростити наш досвід усунення несправностей.
Було цікаво писати цю колонку «Усунення несправностей LC» і думати про теми щомісяця, тому що деякі теми ніколи не виходять з моди. У той час як у галузі хроматографічних досліджень певні теми чи ідеї стають застарілими, оскільки їх замінюють нові та кращі ідеї, у сфері усунення несправностей перша стаття про усунення несправностей з’явилася в цьому журналі (тоді LC Journal), оскільки деякі теми все ще актуальні) у 1983 році(1). ).За останні кілька років я зосередив увагу на кількох розділах усунення несправностей РХ на сучасних тенденціях, що впливають на рідинну хроматографію (РХ) (наприклад, відносне порівняння нашого розуміння впливу тиску на утримування [2] Нові досягнення). Наша інтерпретація результатів РХ і способи усунення несправностей за допомогою сучасних інструментів РХ. У цьому місяці я продовжую свою серію (3), розпочату в грудні 2021 року, яка зосереджена на деякі з тем «життя і смерть» щодо усунення несправностей LC — елементи, які чудово підходять для будь-якого засобу усунення несправностей, є важливими, незалежно від віку системи, яку ми використовуємо. Основна тема цієї серії має велике відношення до відомої настінної таблиці LCGC «Посібник з усунення несправностей LC» (4), яка висить у багатьох лабораторіях. У третій частині цієї серії я вирішив зосередитися на питаннях, пов’язаних із формою піку або характеристиками піку. 44 різні потенційні причини поганої пікової форми! Ми не можемо детально розглянути всі ці проблеми в одній статті, тому в цій першій частині цієї теми я зосереджусь на деяких з тих, які я зустрічаю найчастіше. Сподіваюся, молоді та дорослі користувачі LC знайдуть корисні поради та нагадування щодо цієї важливої ​​теми.
Я все частіше відповідаю на запитання щодо усунення несправностей словами «все можливо». Ця відповідь може здатися легкою, коли розглядаються спостереження, які важко інтерпретувати, але я вважаю її часто доречною. З огляду на багато можливих причин поганої форми піку, важливо зберігати відкритість, розглядаючи, у чому може полягати проблема, і мати можливість визначити пріоритети потенційних причин, щоб розпочати наші зусилля з усунення несправностей, зосереджуючись на тих найпоширеніших можливостях, цей пункт дуже важливий. можливо.
Ключовий крок у будь-якій вправі з усунення несправностей — але, на мою думку, недооцінений — це визнання наявності проблеми, яку потрібно вирішити. Визнання наявності проблеми часто означає визнання того, що те, що відбувається з інструментом, відрізняється від наших очікувань, які сформовані теорією, емпіричними знаннями та досвідом (5). «Форма піку», про яку тут йдеться, насправді стосується не лише форми піку (симетричної, асиметричної, гладкої). , пухнастий, передній край, хвіст тощо), а також до ширини. Наші очікування щодо фактичної форми піку прості. Теорія (6) добре підтверджує очікування підручника про те, що в більшості випадків хроматографічні піки повинні бути симетричними та відповідати формі розподілу Гауса, як показано на малюнку 1a. Те, що ми очікуємо від ширини піку, є більш складним питанням, і ми обговоримо цю тему в наступній статті. Форма іншого піку s на малюнку 1 показують деякі інші можливості, які можна спостерігати, іншими словами, деякі способи, як щось може піти не так. У решті цієї частини ми витратимо час на обговорення деяких конкретних прикладів ситуацій, які можуть призвести до цих типів фігур.
Іноді піки взагалі не спостерігаються на хроматограмі там, де вони, як очікується, будуть елюйовані. Наведена вище діаграма вказує на те, що відсутність піку (припускаючи, що зразок фактично містить цільовий аналіт у концентрації, яка повинна зробити відповідь детектора достатньою, щоб побачити його вище шуму) зазвичай пов’язана з певною проблемою приладу або неправильними умовами рухомої фази (якщо вона взагалі спостерігається).піки, як правило, занадто «слабкі»). Короткий список потенційних проблем і рішень у цій категорії можна знайти в таблиці I.
Як згадувалося вище, питання про те, наскільки розширення піку слід терпіти, перш ніж звернути увагу та спробувати його виправити, є складною темою, яку я обговорюватиму в наступній статті. Мій досвід показує, що значне розширення піку часто супроводжується значною зміною форми піку, а хвіст піку є більш поширеним, ніж попередній пік або розщеплення. Однак номінально симетричні піки також розширені, що може бути викликано декількома різними причинами:
Кожна з цих проблем детально обговорювалася в попередніх випусках Troubleshooting LC, і читачі, які цікавляться цими темами, можуть звернутися до цих попередніх статей, щоб отримати інформацію про основні причини та потенційні рішення цих проблем.Детальніше.
Хвости піків, фронти піків і розщеплення можуть бути спричинені хімічними чи фізичними явищами, і список потенційних рішень цих проблем значно варіюється залежно від того, чи ми маємо справу з хімічною чи фізичною проблемою. Часто, порівнюючи різні піки на хроматограмі, можна знайти важливі підказки про те, хто є винуватцем. Якщо всі піки на хроматограмі мають однакову форму, причина, швидше за все, не фізична. .Якщо уражено лише один або кілька піків, але решта виглядають добре, причина, швидше за все, хімічна.
Хімічні причини хвостового піку надто складні, щоб їх коротко обговорювати тут. Зацікавленого читача відсилаємо до останнього випуску «Усунення несправностей LC» для більш поглибленого обговорення (10). Однак можна легко спробувати зменшити масу введеного аналіту та побачити, чи покращиться форма піку. Якщо так, то це є хорошою підказкою, що проблема полягає в «перевантаженні маси». У цьому випадку метод має бути обмежений ін’єкцією. невеликі маси аналіту, або хроматографічні умови повинні бути змінені таким чином, щоб можна було отримати хороші форми піків навіть при введенні більших мас.
Існує також багато потенційних фізичних причин пікового хвоста. Читачів, зацікавлених у детальному обговоренні можливостей, можна звернутися до іншого нещодавнього випуску «Усунення несправностей LC» (11). Однією з найпоширеніших фізичних причин пікового хвоста є погане з’єднання в точці між інжектором і детектором (12). Надзвичайний приклад показано на малюнку 1d, отриманому в моїй лабораторії кілька тижнів тому. У цьому випадку ми створили систему з новою ін’єкцією. клапан, який ми раніше не використовували, і встановили інжекційну петлю невеликого об’єму з наконечником, який був відлитий на капіляр з нержавіючої сталі. Після деяких початкових експериментів з усунення несправностей ми зрозуміли, що глибина порту в статорі інжекційного клапана була набагато глибшою, ніж ми звикли, що призвело до великого мертвого об’єму в нижній частині порту. Цю проблему легко вирішити, замінивши ін’єкційну петлю на іншу трубку, ми можемо відрегулювати залізо переведіть у належне положення, щоб усунути мертвий об’єм у нижній частині порту.
Пікові фронти, подібні до тих, що показані на малюнку 1e, також можуть бути спричинені фізичними або хімічними проблемами. Поширеною фізичною причиною переднього краю є те, що шар частинок стовпа не добре упакований або частинки реорганізувалися з часом. Як і у випадку хвостового піку, спричиненого цим фізичним явищем, найкращий спосіб виправити це — замінити стовпчик і продовжувати працювати. По суті, форми піків переднього краю хімічного походження часто виникають через те, що ми називаємо «не- За ідеальних (лінійних) умов кількість аналіту, що утримується стаціонарною фазою (отже, коефіцієнт утримування), лінійно залежить від концентрації аналіту в колонці. Хроматографічно це означає, що зі збільшенням маси аналіту, введеного в колонку, пік стає вищим, але не ширшим. Цей зв’язок порушується, коли поведінка утримування є нелінійною, і піки не тільки стають ta менше, але також ширше, оскільки вводиться більша маса. Крім того, нелінійні форми визначають форму хроматографічних піків, що призводить до передніх або задніх країв. Як і у випадку з масовим перевантаженням, яке спричиняє хвіст піку (10), випередження піку, спричинене нелінійним утримуванням, також можна діагностувати шляхом зменшення маси введеного аналіту. Якщо форма піку покращується, метод потрібно змінити, щоб не перевищувати якість ін’єкції, яка викликає передній край, або хроматографічні умови повинні бути змінені, щоб мінімізувати цю поведінку.
Іноді ми спостерігаємо те, що здається «розділеним» піком, як показано на малюнку 1f. Першим кроком у вирішенні цієї проблеми є визначення того, чи є форма піку результатом часткового спільного елюювання (тобто наявності двох різних, але близько елюованих сполук). Якщо фактично є два різних аналіти, що елююють близько один до одного, то це питання покращення їх роздільної здатності (наприклад, шляхом збільшення селективності, утримування або підрахунку планшетів) і очевидного «розщеплені» піки пов’язані з фізичною продуктивністю не мають нічого спільного з самою колонкою. Часто найважливішою підказкою для прийняття цього рішення є те, чи мають усі піки на хроматограмі розділені форми, чи тільки один чи два. Якщо це лише один або два, це, ймовірно, проблема спільного виведення;якщо всі піки розділені, це, ймовірно, фізична проблема, швидше за все, пов’язана з самим стовпцем.
Розділені піки, пов’язані з фізичними властивостями самої колони, зазвичай пов’язані з частково заблокованими фриттами на вході чи виході, або реорганізацією частинок у колонці, що дозволяє рухомій фазі текти швидше, ніж рухома фаза в певних областях утворення каналу колонки, в інших регіонах (11). Частково засмічену фритту іноді можна очистити шляхом реверсування потоку через колонку;однак, з мого досвіду, це, як правило, короткотермінове, а не довгострокове рішення. У сучасних колонках це часто фатально, якщо частинки рекомбінуються всередині колонки. На цьому етапі найкраще замінити колонку та продовжити.
Пік на малюнку 1g, також нещодавно отриманий у моїй власній лабораторії, зазвичай вказує на те, що сигнал настільки високий, що він досяг верхньої межі діапазону відповіді. Для детекторів оптичного поглинання (у цьому випадку УФ-вид), коли концентрація аналіту дуже висока, аналіт поглинає більшу частину світла, що проходить через проточну комірку детектора, залишаючи дуже мало світла для виявлення. За цих умов на електричний сигнал від фотодетектора сильно впливають різні джерела. шумів, таких як розсіяне світло та «темновий струм», що робить сигнал дуже «нечітким» на вигляд і не залежить від концентрації аналіту.Коли це трапляється, проблему часто можна легко вирішити, зменшивши об’єм впорскування аналіту — зменшивши об’єм впорскування, розбавивши зразок або обидва разом.
У школі хроматографії ми використовуємо сигнал детектора (тобто осі y в хроматограмі) як показник концентрації аналіту в вибірці. Тому, здається, дивно бачити хроматограму з сигналом нижче нуля, оскільки проста інтерпретація полягає в тому, що це вказує на негативну концентрацію аналіту-що, звичайно, не є фізично можливим.
У цьому випадку негативний пік просто означає, що молекули, що елююються з колонки, поглинають менше світла, ніж сама рухома фаза безпосередньо перед і після піку. Це може статися, наприклад, при використанні відносно низьких довжин хвиль виявлення (<230 нм) і добавок рухомої фази, які поглинають більшу частину світла на цих довжинах хвиль. Такими добавками можуть бути компоненти розчинника рухомої фази, такі як метанол, або буферні компоненти, такі як ацетат або форміат. Фактично можна використовувати негативні піки для підготовки калібрувальної кривої та отримання точної кількісної інформації, тому немає принципових причин уникати їх як таких (цей метод іноді називають «непрямим УФ-детектуванням») (13). Однак, якщо ми справді хочемо взагалі уникнути негативних піків, у випадку виявлення абсорбції найкращим рішенням є використання іншої довжини хвилі виявлення, щоб аналіт поглинав більше, ніж рухома фаза, або змінити склад рухомої фази таким чином. що вони поглинають менше світла, ніж аналіти.
Негативні піки також можуть з’являтися під час визначення показника заломлення (RI), коли показник заломлення компонентів зразка, крім аналіту, наприклад матриці розчинника, відрізняється від показника заломлення рухомої фази. Це також трапляється з детектуванням ультрафіолетового випромінювання, але цей ефект, як правило, послаблюється порівняно з виявленням RI. В обох випадках негативні піки можна мінімізувати шляхом більш точної відповідності складу матриці зразка. до рухомої фази.
У частині третій, присвяченій основній темі усунення несправностей LC, я обговорив ситуації, коли спостережувана форма піку відрізняється від очікуваної або нормальної форми піку. Ефективне усунення таких проблем починається зі знання очікуваних форм піків (на основі теорії або попереднього досвіду використання існуючих методів), тому відхилення від цих очікувань очевидні. Проблеми з формою піку мають багато різних потенційних причин (занадто широкі, хвости, передній край тощо). У цьому розділі я детально обговорюю деякі причини Я бачуся найчастіше. Знання цих деталей є хорошим місцем для початку пошуку несправностей, але не охоплює всіх можливостей. Читачі, які цікавляться детальнішим списком причин і рішень, можуть звернутися до настінної таблиці LCGC «Посібник з усунення несправностей LC».
(4) Настінна таблиця LCGC «Посібник з усунення несправностей LC». https://www.chromatographyonline.com/view/troubleshooting-wallchart (2021).
(6) A. Felinger, Аналіз даних і обробка сигналів у хроматографії (Elsevier, Нью-Йорк, Нью-Йорк, 1998), стор. 43-96.
(8) Wahab MF, Dasgupta PK, Kadjo AF і Armstrong DW, Anal.Chim.Journal.Rev.907, 31–44 (2016). https://doi.org/10.1016/j.aca.2015.11.043.