Деякі теми усунення несправностей рідких кристалів (РК) ніколи не застарівають, оскільки проблеми виникають у практиці РК, навіть попри те, що технологія приладобудування з часом удосконалюється. Існує багато способів виникнення проблем у системі РК, що призводить до поганої форми піку. Коли виникають проблеми, пов'язані з формою піку, короткий перелік можливих причин цих результатів допомагає спростити наш процес усунення несправностей.
Було весело писати цю колонку «Усунення несправностей рідинної хроматографії» та розмірковувати над темами щомісяця, адже деякі теми ніколи не виходять з моди. Хоча в галузі хроматографічних досліджень певні теми чи ідеї застарівають, оскільки їх замінюють новіші та кращі ідеї, у сфері усунення несправностей, з моменту появи першої статті про усунення несправностей у цьому журналі (на той час LC Journal), оскільки деякі теми досі актуальні) у 1983 році (1). Протягом останніх кількох років я зосередив кілька розділів про усунення несправностей рідинної хроматографії на сучасних тенденціях, що впливають на рідинну хроматографію (РХ) (наприклад, відносне порівняння нашого розуміння впливу тиску на утримання [2] Нові досягнення), нашій інтерпретації результатів РХ та способах усунення несправностей за допомогою сучасних приладів РХ. У цьому місячному випуску я продовжую свою серію (3), яка розпочалася в грудні 2021 року, в якій була зосереджена на деяких «життєво-смертельних» темах усунення несправностей РХ — елементи, які чудово підходять для будь-якого спеціаліста з усунення несправностей, є важливими, незалежно від віку системи, яку ми використовуємо. Основна тема цієї серії дуже актуальна для відомої настінної діаграми LCGC «Посібник з усунення несправностей РХ» (4), що висить у... багато лабораторій. У третій частині цієї серії я вирішив зосередитися на питаннях, пов'язаних з формою піку або характеристиками піку. Неймовірно, але настінна діаграма перелічує 44 різні потенційні причини поганої форми піку! Ми не можемо детально розглянути всі ці проблеми в одній статті, тому в цій першій частині на цю тему я зосереджуся на деяких з тих, які я бачу найчастіше. Я сподіваюся, що молоді та старі користувачі рідинної хроматографії знайдуть корисні поради та нагадування з цієї важливої ​​теми.
Я все частіше відповідаю на запитання щодо усунення несправностей словами «все можливо». Ця відповідь може здатися простою, коли розглядаються спостереження, які важко інтерпретувати, але я вважаю її часто доречною. З огляду на багато можливих причин поганої форми піку, важливо бути відкритим до нового, розглядаючи, в чому може бути проблема, і мати можливість пріоритезувати потенційні причини, щоб розпочати наші зусилля з усунення несправностей, зосереджуючись на найпоширеніших можливостях, цей момент дуже важливий.
Ключовий крок у будь-якій спробі усунення несправностей — але той, який, на мою думку, недооцінюють — це визнання наявності проблеми, яку потрібно вирішити. Визнання наявності проблеми часто означає визнання того, що те, що відбувається з інструментом, відрізняється від наших очікувань, які формуються теорією, емпіричними знаннями та досвідом (5). «Форма піку», про яку тут йдеться, насправді стосується не лише форми піку (симетрична, асиметрична, гладка, пухнаста, передній край, хвіст тощо), але й ширини. Наші очікування щодо фактичної форми піку прості. Теорія (6) добре підтверджує очікування з підручника, що в більшості випадків хроматографічні піки повинні бути симетричними та відповідати формі гауссового розподілу, як показано на рисунку 1a. Те, чого ми очікуємо від ширини піків, є більш складним питанням, і ми обговоримо цю тему в наступній статті. Інші форми піків на рисунку 1 показують деякі інші можливості, які можна спостерігати — іншими словами, деякі способи, якими все може піти не так. У решті цієї частини ми присвятимо час обговоренню деяких конкретних прикладів ситуацій, які можуть призвести до цих типів форми.
Іноді піки взагалі не спостерігаються на хроматограмі там, де вони, як очікується, елююються. Наведена вище настінна діаграма показує, що відсутність піку (за умови, що зразок фактично містить цільовий аналіт у концентрації, яка повинна зробити реакцію детектора достатньою, щоб побачити його вище шуму) зазвичай пов'язана з якоюсь проблемою приладу або неправильними умовами рухомої фази (якщо взагалі спостерігаються). Піки, зазвичай занадто «слабкі»). Короткий перелік потенційних проблем та рішень у цій категорії можна знайти в таблиці I.
Як згадувалося вище, питання про те, наскільки широке розширення піку слід допускати, перш ніж звертати на це увагу та намагатися його виправити, є складною темою, яку я обговорю в майбутній статті. Мій досвід показує, що значне розширення піку часто супроводжується значною зміною форми піку, а «хвіст» піку трапляється частіше, ніж передпіковий період або розщеплення. Однак номінально симетричні піки також розширені, що може бути спричинено кількома різними причинами:
Кожне з цих питань було детально обговорено в попередніх випусках журналу «Усунення несправностей LC», і читачі, які цікавляться цими темами, можуть звернутися до цих попередніх статей для отримання інформації про першопричини та можливі рішення цих проблем. Докладніше.
Хвости піків, фронт піків та розщеплення можуть бути спричинені хімічними або фізичними явищами, і перелік потенційних рішень цих проблем сильно варіюється залежно від того, чи маємо ми справу з хімічною чи фізичною проблемою. Часто, порівнюючи різні піки на хроматограмі, можна знайти важливі підказки щодо того, який з них є винуватцем. Якщо всі піки на хроматограмі мають подібну форму, причина, найімовірніше, не фізична. Якщо уражений лише один або кілька піків, але решта виглядають нормально, причина, найімовірніше, хімічна.
Хімічні причини появи хвостів піків занадто складні, щоб коротко їх обговорювати тут. Зацікавленому читачеві пропонується звернутися до нещодавнього випуску «Усунення несправностей LC» для більш глибокого обговорення (10). Однак, можна легко спробувати зменшити масу введеного аналіту та подивитися, чи покращиться форма піку. Якщо так, то це гарна ознака того, що проблема полягає в «перевантаженні масою». У цьому випадку метод має бути обмежений введенням малих мас аналіту або змінити хроматографічні умови таким чином, щоб можна було отримати хороші форми піків навіть при введених більших масах.
Існує також багато потенційних фізичних причин появи хвостів піків. Читачів, зацікавлених у детальному обговоренні можливостей, відсилаємо до іншого нещодавнього випуску «Усунення несправностей LC» (11). Однією з найпоширеніших фізичних причин появи хвостів піків є погане з'єднання в точці між інжектором та детектором (12). Екстремальний приклад показано на рисунку 1d, отриманому в моїй лабораторії кілька тижнів тому. У цьому випадку ми створили систему з новим інжекторним клапаном, який раніше не використовували, та встановили інжекторну петлю малого об'єму з наконечником, який був відлитий на капіляр з нержавіючої сталі. Після деяких початкових експериментів з усунення несправностей ми зрозуміли, що глибина отвору в статорі інжекторного клапана була набагато глибшою, ніж ми звикли, що призвело до великого мертвого об'єму внизу отвору. Цю проблему легко вирішити, замінивши інжекторну петлю іншою трубкою, ми можемо відрегулювати наконечник у належне положення, щоб усунути мертвий об'єм внизу отвору.
Фронти піків, подібні до показаних на рисунку 1e, також можуть бути спричинені фізичними або хімічними проблемами. Поширеною фізичною причиною переднього краю є те, що шар частинок колони недостатньо добре упакований або частинки з часом реорганізувалися. Як і у випадку з хвостами піків, спричиненими цим фізичним явищем, найкращий спосіб виправити це — замінити колону та продовжувати роботу. По суті, форми піків переднього краю хімічного походження часто виникають через те, що ми називаємо «нелінійними» умовами утримання. За ідеальних (лінійних) умов кількість аналіту, що утримується стаціонарною фазою (отже, коефіцієнт утримання), лінійно пов'язана з концентрацією аналіту в колоні. Хроматографічно це означає, що зі збільшенням маси аналіту, що вводиться в колону, пік стає вищим, але не ширшим. Цей зв'язок порушується, коли поведінка утримання нелінійна, і піки стають не тільки вищими, але й ширшими, оскільки вводиться більше маси. Крім того, нелінійні форми визначають форму хроматографічних піків, що призводить до передніх або задніх країв. Як і у випадку з перевантаженням масою, яке спричиняє хвости піків (10), випередження піків, спричинене Нелінійне затримування також можна діагностувати, зменшивши масу введеного аналіту. Якщо форма піку покращується, метод необхідно модифікувати, щоб не перевищувати якість введення, яка викликає передній фронт, або змінити хроматографічні умови, щоб мінімізувати цю поведінку.
Іноді ми спостерігаємо те, що виглядає як «розщеплений» пік, як показано на рисунку 1f. Першим кроком у вирішенні цієї проблеми є визначення, чи зумовлена ​​форма піку частковою коелюцією (тобто наявністю двох різних, але близько елюйованих сполук). Якщо насправді є два різні аналіти, що елююють близько один до одного, то питання полягає в покращенні їхньої роздільної здатності (наприклад, шляхом збільшення селективності, утримування або кількості пластин), а очевидні «розщеплені» піки пов'язані з фізичними характеристиками. Продуктивність не має нічого спільного з самою колонкою. Часто найважливішою підказкою для цього рішення є те, чи всі піки на хроматограмі мають розщеплену форму, чи лише один чи два. Якщо це лише один або два, це, ймовірно, проблема коелюції; якщо всі піки розщеплені, це, ймовірно, фізична проблема, найімовірніше, пов'язана з самою колонкою.
Розщеплення піків, пов'язане з фізичними властивостями самої колони, зазвичай зумовлене частково заблокованими фритами на вході або виході, або реорганізацією частинок у колоні, що дозволяє рухомій фазі текти швидше, ніж рухома фаза в певних областях формування каналу колони в інших областях (11). Частково заблокований фрит іноді можна очистити, змінивши напрямок потоку через колону; однак, з мого досвіду, це зазвичай короткострокове, а не довгострокове рішення. Це часто є фатальним для сучасних колон, якщо частинки рекомбінують у колоні. На цьому етапі найкраще замінити колону та продовжити.
Пік на рисунку 1g, також з нещодавнього випадку в моїй власній лабораторії, зазвичай вказує на те, що сигнал настільки високий, що досяг верхньої межі діапазону відгуку. Для оптичних детекторів абсорбції (у цьому випадку УФ-видимого діапазону), коли концентрація аналіту дуже висока, аналіт поглинає більшу частину світла, що проходить через проточну комірку детектора, залишаючи дуже мало світла для виявлення. За цих умов на електричний сигнал від фотодетектора сильно впливають різні джерела шуму, такі як розсіяне світло та «темновий струм», що робить сигнал дуже «розмитим» на вигляд і незалежним від концентрації аналіту. Коли це трапляється, проблему часто можна легко вирішити, зменшивши об'єм ін'єкції аналіту — зменшивши об'єм ін'єкції, розбавивши зразок або і те, й інше.
У школі хроматографії ми використовуємо сигнал детектора (тобто вісь y на хроматограмі) як індикатор концентрації аналіту у зразку. Тому здається дивним бачити хроматограму із сигналом нижче нуля, оскільки проста інтерпретація полягає в тому, що це вказує на негативну концентрацію аналіту, що, звичайно, фізично неможливо. За моїм досвідом, негативні піки найчастіше спостерігаються при використанні оптичних детекторів абсорбції (наприклад, УФ-видимого діапазону).
У цьому випадку негативний пік просто означає, що молекули, що елююються з колонки, поглинають менше світла, ніж сама рухома фаза безпосередньо перед і після піку. Це може статися, наприклад, при використанні відносно низьких довжин хвиль детектування (<230 нм) та добавок рухомої фази, які поглинають більшу частину світла на цих довжинах хвиль. Такими добавками можуть бути компоненти розчинника рухомої фази, такі як метанол, або буферні компоненти, такі як ацетат або форміат. Насправді можна використовувати негативні піки для побудови калібрувальної кривої та отримання точної кількісної інформації, тому немає фундаментальної причини уникати їх як таких (цей метод іноді називають «непрямим УФ-детектуванням») (13). Однак, якщо ми дійсно хочемо взагалі уникнути негативних піків у випадку детектування абсорбції, найкращим рішенням є використання іншої довжини хвилі детектування, щоб аналіт поглинав більше, ніж рухома фаза, або зміна складу рухомої фази таким чином, щоб вони поглинали менше світла, ніж аналіти.
Негативні піки також можуть з'являтися при використанні детектування показника заломлення (ПЗ), коли показник заломлення компонентів, відмінних від аналіту у зразку, таких як матриця розчинника, відрізняється від показника заломлення рухомої фази. Це також відбувається при детектуванні в УФ-видимому діапазоні, але цей ефект, як правило, послаблюється порівняно з детектуванням ПЗ. В обох випадках негативні піки можна мінімізувати, більш точно підібравши склад матриці зразка до складу рухомої фази.
У третій частині, присвяченій основній темі усунення несправностей LC, я обговорив ситуації, коли спостережувана форма піку відрізняється від очікуваної або нормальної форми піку. Ефективне усунення несправностей таких проблем починається зі знання очікуваних форм піків (на основі теорії або попереднього досвіду роботи з існуючими методами), тому відхилення від цих очікувань очевидні. Проблеми з формою піків мають багато різних потенційних причин (занадто широкі, хвости, передній фронт тощо). У цій частині я детально обговорюю деякі причини, які я бачу найчастіше. Знання цих деталей є гарною відправною точкою для початку усунення несправностей, але не охоплює всіх можливостей. Читачі, зацікавлені в більш детальному списку причин та рішень, можуть звернутися до настінної діаграми LCGC «Посібник з усунення несправностей LC».
(4) Настінна таблиця LCGC «Посібник з усунення несправностей LC». https://www.chromatographyonline.com/view/troubleshooting-wallchart (2021).
(6) А. Фелінгер, Аналіз даних та обробка сигналів у хроматографії (Elsevier, Нью-Йорк, штат Нью-Йорк, 1998), с. 43-96.
(8) Вахаб М.Ф., Дасгупта П.К., Каджо А.Ф. та Армстронг Д.В., Anal.Chim.Journal.Rev. 907, 31–44 (2016). https://doi.org/10.1016/j.aca.2015.11.043.