Дякуємо за відвідування Nature.com. Ви використовуєте версію браузера з обмеженою підтримкою CSS. Для найкращого досвіду рекомендуємо використовувати оновлений браузер (або вимкнути режим сумісності в Internet Explorer). Крім того, для забезпечення постійної підтримки ми показуємо сайт без стилів та JavaScript.
Відображає карусель із трьох слайдів одночасно. Використовуйте кнопки «Попередній» та «Наступний», щоб переходити між трьома слайдами одночасно, або скористайтеся кнопками-повзунками в кінці, щоб переходити між трьома слайдами одночасно.
Самоорганізуючі нейронні органели являють собою перспективну платформу in vitro для моделювання розвитку та захворювань людини. Однак органоїдам бракує зв'язку, який існує in vivo, що обмежує дозрівання та запобігає інтеграції з іншими ланцюгами, що контролюють поведінку. Тут ми показуємо, що кортикальні органоїди, отримані зі стовбурових клітин людини, трансплантовані в соматосенсорну кору новонароджених голих щурів, розвивають зрілі типи клітин, які інтегруються в сенсорні та мотиваційні ланцюги. МРТ виявила ріст органоїдів після трансплантації у кількох лініях стовбурових клітин та у тварин, тоді як одноядерний аналіз виявив прогресування кортикогенезу та появу програми транскрипції, залежної від активності. Дійсно, трансплантовані кортикальні нейрони демонструють складніші морфологічні, синаптичні та внутрішні мембранні властивості, ніж їхні аналоги in vitro, що дозволяє виявляти нейрональні дефекти у пацієнтів із синдромом Тімоті. Анатомічне та функціональне трасування показало, що трансплантовані органели отримують таламокортикальні та кортикокортикальні входи, а записи нейронної активності in vivo свідчать про те, що ці входи можуть генерувати сенсорні реакції в клітинах людини. Нарешті, кортикальні органоїди поширюють аксони по всьому мозку щурів, а їх оптогенетична активація призводить до поведінки, спрямованої на пошук винагороди. Таким чином, трансплантовані нейрони кори головного мозку людини дозрівають і беруть участь у ланцюгах організму-хазяїна, що контролюють поведінку. Ми очікуємо, що цей підхід сприятиме виявленню фенотипів на рівні ланцюгів у клітинах, отриманих від пацієнта, які неможливо виявити іншими способами.
Розвиток людського мозку – це дивовижний процес самоорганізації, в якому клітини проліферують, диференціюються, мігрують та з'єднуються, утворюючи функціональні нейронні ланцюги, які далі вдосконалюються завдяки сенсорному досвіду. Ключовою проблемою в розумінні розвитку людського мозку, особливо в контексті захворювань, є відсутність доступу до тканини мозку. Самоорганізовані органели, включаючи органоїди кори головного мозку людини (hCO; також відомі як сфера кори головного мозку людини), можуть генерувати 2,3,4,5,6. Однак, кілька обмежень обмежують їх ширше застосування для розуміння розвитку та функціонування нейронних ланцюгів. Зокрема, незрозуміло, чи дозрівання hCO обмежене відсутністю певних мікросередовищних та сенсорних входів, присутніх in vivo. Крім того, оскільки hCO не інтегровані в ланцюги, які можуть генерувати поведінкові результати, їхня корисність у моделюванні генетично складних та поведінкових нейропсихіатричних розладів наразі обмежена.
Трансплантація hCO у неушкоджений живий мозок може подолати ці обмеження. Попередні дослідження показали, що людські нейрони, трансплантовані в кору гризунів, здатні виживати, проектувати та спілкуватися з клітинами гризунів7,8,9,10,11,12. Однак ці експерименти зазвичай проводяться на дорослих тваринах, що може обмежувати синаптичну та аксональну інтеграцію. Тут ми описуємо парадигму трансплантації, в якій ми трансплантували 3D hCO, отриманий з клітин hiPS, у первинну соматосенсорну кору (S1) імунодефіцитних щурів на ранній стадії пластичного розвитку. Трансплантовані нейрони hCO (t-hCO) зазнають суттєвого дозрівання, отримують таламокортикальні та корково-кортикальні входи, які викликають сенсорні реакції, та поширюють аксональні проекції в мозок щурів, щоб стимулювати поведінку, спрямовану на пошук винагороди. Тривале дозрівання t-hCO виявило нейрональні дефекти у пацієнтів із синдромом Тімоті (TS), важким генетичним захворюванням, спричиненим мутаціями у вольтажно-чутливому кальцієвому каналі CaV1.2 L-типу (кодованому CACNA1C).
Для вивчення нейронів кори головного мозку людини в ланцюгах in vivo ми стереотаксично трансплантували інтактний 3D hCO в S1 ранніх постнатальних атимічних щурів (3-7 дні після народження) (рис. 1a та розширені дані рис. 1a-c). На цьому етапі таламокортикальні та кортикокортикальні аксональні проекції ще не завершили свою S1-іннервацію (посилання 13). Таким чином, цей підхід розроблений для максимізації інтеграції t-hCO, мінімізуючи вплив на ендогенні ланцюги. Щоб візуалізувати розташування t-hCO у живих тварин, ми виконали Т2-зважену МРТ-реконструкцію головного мозку щурів через 2–3 місяці після трансплантації (рис. 1b та ​​розширені дані, рис. 1d). t-hCO легко спостерігалися, а об'ємні вимірювання t-hCO були подібними до тих, що були розраховані з фіксованих зрізів (Розширені дані, рис. 1d,e; P > 0,05). t-hCO легко спостерігалися, а об'ємні вимірювання t-hCO були подібними до тих, що були розраховані з фіксованих зрізів (Розширені дані, рис. 1d,e; P > 0,05). t-hCO легко спостерігалися, а об'ємні вимірювання t-hCO були аналогічно розрахованими для фіксованих зрізів (розширені дані, рис. 1d, e; P> 0,05). t-hCO2 легко спостерігалися, а об'ємні вимірювання t-hCO2 були подібними до тих, що були розраховані для фіксованих перерізів (розширені дані, рис. 1d, e; P > 0,05).很容易观察到t-hCO，并且t-hCO的体积测量值与从固定切片计算的测量值相似（扩展数据图1d、e；P > 0,05）。很容易观察到t-hCO，并且t-hCO t-hCO легко спостерігався, а об'ємні вимірювання t-hCO були аналогічно розрахованими для фіксованих зрізів (розширені дані, рис. 1d, e; P> 0,05). t-hCO2 легко спостерігався, а об'ємні вимірювання t-hCO2 були подібними до тих, що були розраховані для фіксованих перерізів (розширені дані, рис. 1d, e; P > 0,05).Ми визначили t-hCO₂ у 81% трансплантованих тварин приблизно через 2 місяці після трансплантації (n = 72 тварини; hCO₂ з 10 клітинних ліній hiPS; клітинні лінії hiPS у Додатковій таблиці 1). З них 87% були розташовані в корі головного мозку (рис. 1c). Виконуючи серійні МРТ-сканування в кілька моментів часу у одного й того ж трансплантованого щура, ми виявили дев'ятикратне збільшення об'єму t-hCO₂ протягом 3 місяців (рис. 1d та розширені дані, рис. 1f). Трансплантовані тварини мали високий рівень виживання (74%) через 12 місяців після трансплантації (розширені дані, рис. 1g та Додаткова таблиця 2), і не було виявлено жодних явних рухових або пам'яттєвих порушень, гліозу або електроенцефалограми (ЕЕГ). Дані рис. 1g та додаткова таблиця 2). 1h–m та 3e).
a, Схема експериментального дизайну. hCO2, отриманий з клітин hiPS, був трансплантований у S1 новонароджених голих щурів на 30-60 день диференціації. b, T2-зважені корональні та горизонтальні МРТ-зображення, що показують t-hCO2 в S1 через 2 місяці після трансплантації. Масштабна шкала, 2 мм. c, Кількісна оцінка успішності приживлення показана для кожної лінії клітин hiPS (n = 108, числа в стовпчиках вказують на кількість t-hCO2 на лінію клітин hIPS) та коркового або субкіркового розташування (n = 88). d, МРТ-зображення коронарної артерії (ліворуч; масштабна шкала, 3 мм) та відповідна 3D-об'ємна реконструкція (масштабна шкала, 3 мм), що показує збільшення t-hCO2 протягом 3 місяців. e, Огляд структури t-hCO2 в корі головного мозку щурів. Масштабна шкала, 1 мм. f, Репрезентативні імуноцитохімічні зображення t-hCO, показані зверху зліва направо (під час диференціації): PPP1R17 (4 місяці), NeuN (8 місяців), SOX9 та GFAP (8 місяців), PDGFRα; (8 місяців), MAP2 (8 місяців) та IBA1 (8 місяців). Масштабна шкала, 20 мкм. Коекспресія HNA вказує на клітини людського походження. g, snRNA-seq: Уніфікована візуалізація зменшення розмірності та проекції (UMAP) усіх високоякісних ядер t-hCO після інтеграції Seurat (n=3 зразки t-hCO, n=2 клітинні лінії hiPS). Астроцити, клітини лінії астроцитів; cyc prog, циркулюючі попередники; GluN DL, глибокі глутаматергічні нейрони; GluN DL/SP, глибокі та субламелярні глутаматергічні нейрони; GluN UL, глутаматергічні нейрони верхнього шару; олігодендроцити, олігодендроцити; OPC, клітини-попередники олігодендроцитів; RELN, нейрони ріліну. h, аналіз збагачення за допомогою генної онтології (GO) генів, значно підвищений (скоригований P < 0,05, кратність зміни > 2, експресія щонайменше в 10% ядер) у глутаматергічних нейронах t-hCO порівняно з глутаматергічними нейронами hCO. h, аналіз збагачення за допомогою генної онтології (GO) генів, значно підвищений (скоригований P < 0,05, кратність зміни > 2, експресія щонайменше в 10% ядер) у глутаматергічних нейронах t-hCO порівняно з глутаматергічними нейронами hCO. h, обогащення термінів Gene Ontology (GO) для генів із значною активацією (коригований P <0,05, кратність зміни > 2, експресія по крайній мірі в 10% ядер) у глутаматергічних нейронах t-hCO порівняно з глутаматергічними нейронами hCO. h, Аналіз збагачення генів онтології генів (GO) для генів зі значною активацією (скоригований P <0,05, кратність зміни >2, експресія щонайменше в 10% ядер) у глутаматергічних нейронах t-hCO порівняно з глутаматергічними нейронами hCO. h，与hCO 谷氨酸能神经元相比，t-hCO 谷氨酸能神经元中基因显着上调（调整后P < 0,05，倍数变化> 2，在至少10% 的细胞核中表达＾)的基因本体论(GO) 术语富集分析。 h ， 与 hco 谷氨酸 能 元 相比 ， t-hco 谷氨酸 能 神经 元 基因 显着 上调 （后 后 p <0,05 ，变化 变化> 2 ， 至少 10% 的 核中 表达） 基因 基因 基因 的 的 的 的 的 的 的 的 的 的 的的 的 的 的本体论(GO) 术语富集分析。 h, гени значно активізувалися (коригований P <0,05, кратність вимірювання> 2, експресується надзвичайно по 10% ядер) у глутаматергічних нейронах t-hCO порівняно з глутаматергічними нейронами hCO Онтологічний (GO) аналіз терміна обогащення. h, гени були значно підвищені (скоригований P < 0,05, кратність зміни > 2, експресувалися щонайменше в 10% ядер) у t-hCO глутаматергічних нейронах порівняно з hCO глутаматергічними нейронами Онтологічний (GO) аналіз терміну збагачення.Пунктирна лінія вказує на значення aq 0,05. i, UMAP-візуалізація типів клітин GluN у t-hCO з використанням перенесення мітки з еталонного набору даних 22 snRNA-seq дорослої моторної кори. CT — кортикоталамічні клітини, ET — екстрацеребральні клітини, IT — внутрішні теленцефальні клітини, NP — ближня проекція.
Потім ми оцінили цитоархітектуру та загальний клітинний склад t-hCO. Фарбування антитіл ендотеліальних клітин щурів виявило васкуляризацію за допомогою t-hCO, тоді як фарбування IBA1 виявило наявність мікроглії щурів по всьому трансплантату (рис. 1f та розширені дані, рис. 3c,d). Імунофарбування виявило клітини, позитивні до людського ядерного антигену (HNA), що коекспресують PPP1R17 (кортикальні попередники), NeuN (нейрони), SOX9 та GFAP (гліальні клітини) або PDGFRα (олігодендроцитарні попередники) (рис. 1f). Для вивчення клітинного складу t-hCO з роздільною здатністю однієї клітини ми провели секвенування одноядерної РНК (snRNA-seq) приблизно через 8 місяців диференціації. Об'ємна фільтрація та видалення ядер щурів дали 21 500 високоякісних карт мононуклеарних клітин людини (рис. 1g та розширені дані, рис. 4a,b). Патерни експресії типових маркерів клітинного типу ідентифікували кластери основних класів кортикальних клітин, включаючи глибокі та поверхневі глутаматергічні нейрони, циркулюючі клітини-попередники, олігодендроцити та астроцитарну лінію (рис. 1g, розширені дані, рис. 4c та Додаткова таблиця 3). Імунофарбування на SATB2 та CTIP2 показало, що, незважаючи на наявність кортикальних підтипів, t-hCO не демонстрував чіткої анатомічної стратифікації (розширені дані, рис. 3a). Стадійно зіставлена ​​snRNA-seq hCO продукувала загалом подібні класи клітин, за кількома винятками, включаючи відсутність олігодендроцитів та наявність ГАМКергічних нейронів, що може відображати раніше повідомлені сприятливі умови in vitro для латеральних клітин-попередників15 (розширені дані, рис. 4f-i та Додаткова таблиця 4). Диференціальний аналіз експресії генів виявив значні відмінності в глутаматергічних нейронах між t-hCO та hCO (Додаткова таблиця 5), включаючи активацію наборів генів, пов'язаних з дозріванням нейронів, таких як синаптична сигналізація, дендритна локалізація та активність потенціалзалежних каналів (Рисунок 1h та Додаткова таблиця 5, таблиця 6). Відповідно, кортикальні глутаматергічні t-hCO нейрони демонстрували прискорене транскрипційне дозрівання.
Щоб з'ясувати, чи пов'язані ці транскрипційні зміни в t-hCO з морфологічними відмінностями між hCO in vitro та t-hCO in vivo, ми реконструювали стадіально зіставлені hCO та hCO, заповнені біоцитином, у гострих зрізах після 7–8 місяців диференціації. Нейрони hCO (рис. 2a). Нейрони t-hCO були значно більшими, мали в 1,5 раза більший діаметр соми, вдвічі більше дендритів та загальне шестикратне збільшення загальної довжини дендритів порівняно з hCO in vitro (рис. 2b). Крім того, ми спостерігали значно вищу щільність дендритних шипиків у нейронах t-hCO, ніж у нейронах hCO (рис. 2c). Це свідчить про те, що нейрони t-hCO зазнають значного подовження та розгалуження дендритів, що в поєднанні з продовженням проліферації клітин може сприяти інтенсивному росту t-hCO після трансплантації (рис. 1d та розширені дані, рис. 1f). Це спонукало нас дослідити електрофізіологічні властивості. Ємність мембрани була у вісім разів вищою (розширені дані, рис. 8d), мембранний потенціал у стані спокою був більш гіперполяризованим (приблизно 20 мВ), а ін'єкція струму викликала вищу максимальну швидкість збудження в нейронах t-hCO, ніж у нейронах hCO. in vitro (рис. 2d), e), що узгоджується з більшими та складнішими морфологічними особливостями t-hCO. Крім того, частота спонтанних збуджуючих постсинаптичних струмових подій (EPSC) була значно вищою в нейронах t-hCO (рис. 2f), що свідчить про те, що підвищена щільність дендритних шипиків, що спостерігається в нейронах t-hCO, пов'язана з функціональною збудливістю. статевий синапс. Ми підтвердили незрілий характер нейронів hCO in vitro, реєструючи мічені глутаматергічні нейрони (розширені дані, рис. 6a-c).
a, 3D-реконструкція нейронів hCO та t-hCO, заповнених біоцитином, після 8 місяців диференціації. b, Кількісна оцінка морфологічних ознак (n = 8 нейронів hCO, n = 6 нейронів t-hCO; **P = 0,0084, *P = 0,0179 та ***P < 0,0001). b, Кількісна оцінка морфологічних ознак (n = 8 нейронів hCO, n = 6 нейронів t-hCO; **P = 0,0084, *P = 0,0179 та ***P < 0,0001). б, кількісна оцінка морфологічних признаків (n = 8 нейронів hCO, n = 6 нейронів t-hCO; ** P = 0,0084, * P = 0,0179 і *** P <0,0001). b, кількісна оцінка морфологічних ознак (n=8 нейронів hCO, n=6 нейронів t-hCO; **P=0,0084, *P=0,0179 та ***P<0,0001). b，形态学特征的量化（n = 8 个hCO 神经元, n = 6 个t-hCO 神经元；**P = 0,0084，*P = 0,0179 和***P < 0,0001). b，形态学特征的量化（n = 8 个hCO 神经元, n = 6 个t-hCO 神经元；**P = 0,0084，*P = 0,0179 和***P < 0,0001). б, кількісна оцінка морфологічних признаків (n = 8 нейронів hCO, n = 6 нейронів t-hCO; ** P = 0,0084, * P = 0,0179 і *** P <0,0001). b, кількісна оцінка морфологічних ознак (n=8 нейронів hCO, n=6 нейронів t-hCO; **P=0,0084, *P=0,0179 та ***P<0,0001).c, 3D-реконструкція дендритних гілок hCO та t-hCO після 8 місяців диференціації. Червоними зірочками позначені ймовірні дендритні шипики. Кількісне визначення щільності дендритних шипиків (n = 8 нейронів hCO, n = 6 нейронів t-hCO; **P = 0,0092). d, Кількісне визначення мембранного потенціалу спокою (n = 25 нейронів hCO, n = 16 нейронів t-hCO; ***P < 0,0001). d, Кількісне визначення мембранного потенціалу спокою (n = 25 нейронів hCO, n = 16 нейронів t-hCO; ***P < 0,0001). d, кількісна оцінка мембранного потенціалу покоя (n = 25 нейронів hCO, n = 16 нейронів t-hCO; *** P <0,0001). d, кількісне визначення мембранного потенціалу спокою (n = 25 нейронів hCO, n = 16 нейронів t-hCO; ***P < 0,0001). d，静息膜电位的量化（n = 25 hCO 神经元, n = 16 t-hCO 神经元；***P < 0,0001）. d，静息膜电位的量化（n = 25 hCO 神经元, n = 16 t-hCO 神经元；***P < 0,0001）. d, кількісна оцінка мембранного потенціалу покоя (n = 25 нейронів hCO, n = 16 нейронів t-hCO; *** P <0,0001). d, кількісне визначення мембранного потенціалу спокою (n = 25 нейронів hCO, n = 16 нейронів t-hCO; ***P < 0,0001). e, Повторне запалювання потенціалу дії в hCO та t-hCO, індуковане збільшенням ін'єкцій струму, та кількісне визначення максимальної швидкості запалювання (n = 25 нейронів hCO, n = 16 нейронів t-hCO; ***P < 0,0001). e, Повторне запалювання потенціалу дії в hCO та t-hCO, індуковане збільшенням ін'єкцій струму, та кількісне визначення максимальної швидкості запалювання (n = 25 нейронів hCO, n = 16 нейронів t-hCO; ***P < 0,0001). e, повторне збудження потенціалу дії в hCO і t-hCO, викликане збільшення току, і кількісна оцінка максимальної швидкості збудження (n = 25 нейронів hCO, n = 16 нейронів t-hCO; *** P <0,0001). e, повторне запалювання потенціалу дії в hCO та t-hCO, індуковане збільшенням струму та кількісним визначенням максимальної швидкості запалювання (n = 25 нейронів hCO, n = 16 нейронів t-hCO; *** P < 0,0001). e，通过增加电流注入诱导的hCO 和t-hCO 重复动作电位放电，以及最大放电率的量化（n = 25个hCO 神经元，n = 16 个t-hCO 神经元；***P < 0,0001）. E ， 通过 增加 电流 注入 的 的 hco 和 t-hco 重复 电位 放电 ， 以及 最 大 的 量化 （（n = 25个 hco 神经 ， n = 16 个 t-hco 神经 ； *** p <0,0001） 。 e, повторюване збудження потенціалу дії hCO і t-hCO, викликане збільшенням подачі току, і кількісна оцінка максимальної швидкості збудження (n = 25 нейронів hCO, n = 16 нейронів t-hCO; *** P <0,0001). e, повторюване збудження потенціалів дії hCO та t-hCO, індукованих збільшенням подачі струму та кількісним визначенням максимальної швидкості збудження (n = 25 нейронів hCO, n = 16 нейронів t-hCO; *** P < 0,0001). f, Спонтанні EPSC (sEPSC) у нейронах hCO та t-hCO через 8 місяців диференціації та кількісне визначення частоти синаптичних подій (n = 25 нейронів hCO, n = 17 нейронів t-hCO; ***P < 0,0001). f, Спонтанні EPSC (sEPSC) у нейронах hCO та t-hCO через 8 місяців диференціації та кількісне визначення частоти синаптичних подій (n = 25 нейронів hCO, n = 17 нейронів t-hCO; ***P < 0,0001). f, спонтанні EPSC (sEPSC) в нейронах hCO і t-hCO через 8 місяців диференціації та кількісна оцінка частоти синаптичних подій (n = 25 нейронів hCO, n = 17 нейронів t-hCO; *** P <0,0001). f, Спонтанні EPSC (sEPSC) у нейронах hCO та t-hCO через 8 місяців диференціації та кількісне визначення частоти синаптичних подій (n=25 нейронів hCO, n=17 нейронів t-hCO; ***P<0,0001). f，分化8 个月时hCO 和t-hCO 神经元中的自发性EPSCs (sEPSCs)，以及突触事件频率的量化（n = 25 hCO神经元，n = 17 t-hCO 神经元；***P <0,0001） . f，分化8 个月时hCO 和t-hCO 神经元中的自发性EPSCs (sEPSCs)，以及突触事件频率的量匼（n = 25 hCO神率的量匼（n = 25 hCO 神率的量匼（n = 25hCO P < 0,0001） . f, спонтанні EPSC (sEPSC) в нейронах hCO і t-hCO через 8 місяців диференціації та кількісна оцінка частоти синаптичних подій (n = 25 нейронів hCO, n = 17 нейронів t-hCO; *** P <0,0001). f, Спонтанні EPSC (sEPSC) у нейронах hCO та t-hCO через 8 місяців диференціації та кількісне визначення частоти синаптичних подій (n = 25 нейронів hCO, n = 17 нейронів t-hCO; *** P < 0,0001).Для bf, hCO та t-hCO у лінії 1208-2 були взяті з тієї ж партії для диференціації, що підтримувалася паралельно. g, Аналіз збагачення набору генів (односторонній точний тест Фішера) генів, значно підвищених (скоригований P < 0,05, кратність зміни > 2, експресія щонайменше в 10% ядер) у глутаматергічних нейронах t-hCO порівняно з глутаматергічними нейронами hCO з наборами генів як ранньої відповіді (ERG), так і пізньої відповіді (LRG), залежних від активності, ідентифікованих у дослідженні in vivo на мишах16, та специфічними для людини LRG з нейронів in vitro17. g, Аналіз збагачення набору генів (односторонній точний тест Фішера) генів, значно підвищених (скоригований P < 0,05, кратність зміни > 2, експресія щонайменше в 10% ядер) у глутаматергічних нейронах t-hCO порівняно з глутаматергічними нейронами hCO з наборами генів як ранньої відповіді (ERG), так і пізньої відповіді (LRG), залежних від активності, ідентифікованих у дослідженні in vivo на мишах16, та специфічними для людини LRG з нейронів in vitro17. g, аналіз обогащення набору генів (односторонній точний критерій Фішера) генів із значною активацією (скоригований P <0,05, кратність зміни > 2, експресія за меншою мірою в 10% ядер) у глутаматергічних нейронах t-hCO порівняно з глутаматергічними нейронами hCO набори генів як раннього (ERG), так і попереднього (LRG) генів, залежних від активності, ідентифікованої в дослідженні на мишах in vivo16, і специфічних для людини LRG з нейронів in vitro17. g, аналіз збагачення набору генів (односторонній точний тест Фішера) генів зі значною активацією (скоригований P <0,05, кратність зміни >2, експресія щонайменше в 10% ядер) у глутаматергічних нейронах t-hCO порівняно з наборами глутаматергічних нейронів hCO як ранніх (ERG), так і пізніх (LRG) генів, залежних від активності, ідентифікованих у мишей in vivo16 та специфічних для людини LRG з нейронів in vitro17. g，t-hCO谷氨酸能神经元与hCO谷氨酸能神经元相比，t -hCO谷氨酸能神经元显着上调（调整后P<0,05，倍数变化>2，在至少10% 的细胞核中表达＾)的基因集富集分析（单侧F isher精确检验）从体内小鼠研究中鉴定的早期反应(ERG)和晚期反应(LRG) 活性依赖性基因的基因组16 和体外神经元17 中的人类特异性LRG。 g ， t-hco 谷氨酸 神经 元 与 hco 谷氨酸 神经 元 相比 ， t-hco 谷氨酸 神经 元 上调 （调整 后 p <0,05 ， 倍数> 2 ， 至少 至少 10%的 细胞 核中 表达） 的 集富集 分析 （单侧 fisher 精确）)体内 小鼠 研究 中 的 早期 反应 反应 反应 和 晚期 反应 反应 (lrg) 活性 基因 的 基因组 16 和神经元 神经元 17 中 中 17 中 17的人类特异性LRG。 g, глутаматергічні нейрони t-hCO були значно активізовані в порівнянні з глутаматергічними нейронами hCO (коригований P<0,05, кратність зміни> 2, не менше 10% Аналіз обогащенія набору генів (односторонній точний тест Фішера) раннього відповіді (ERG) і попередніх генів, що залежать від активності відповіді (LRG), ідентифікованих у дослідженнях мишах in vivo16 і нейронах in vitro17, специфічні для людини. g, глутаматергічні нейрони t-hCO були значно підвищені порівняно з глутаматергічними нейронами hCO (скоригований P <0,05, кратність зміни >2, щонайменше 10% аналіз збагачення генів ранньої відповіді (ERG) та пізньої відповіді (односторонній точний тест Фішера) гени, залежні від активності відповіді (LRG), ідентифіковані у мишей in vivo16 та нейронів in vitro.17 Специфічні для людини LRG.Пунктирна лінія вказує на значення P 0,05, скориговане за Бонферроні. h, експресія гена GluN (псевдоупаковка та масштабування кожного гена) була значно підвищена в репліках snRNA-seq генів LRG у глутаматергічних нейронах t-hCO. i, імунофарбування, що показує експресію SCG2 у нейронах t-hCO (верхній) та hCO (нижній). Білі стрілки вказують на клітини SCG2+. Масштабна шкала, 25 мкм. Дані виражені як середнє значення ± стандартне відхилення.
Ґрунтуючись на підвищеній активності t-hCO, що спостерігалася в зрізах ex vivo, секвенування однонуклеотидної РНК (snRNA-seq) виявило залежну від активності підвищену регуляцію генних транскриптів у t-hCO порівняно з hCO in vitro. Глутаматергічні t-hCO нейрони експресували вищі рівні генів, що регулюють активність пізньої відповіді (рис. 2g,h), які були виявлені в попередніх дослідженнях на нейронах мишей та людини16,17. Наприклад, BDNF18, SCG2 та OSTN, специфічний для приматів ген, що регулює активність, показали підвищену експресію в t-hCO нейронах порівняно з hCO нейронами (рис. 2g-i). Таким чином, t-hCO нейрони демонстрували покращені характеристики дозрівання порівняно з hCO нейронами за результатами транскрипційного, морфологічного та функціонального аналізів.
Для подальшої оцінки зв'язку дозрівання t-hCO з розвитком мозку людини ми провели транскриптомні порівняння типів кортикальних клітин плода та дорослих [19, 20] та дорослих [21, 22], а також отримали великі дані про експресію генів кори [23] під час розвитку (розширені дані, рис. 5). Згідно з попередньою роботою [24], глобальний стан дозрівання транскриптома hCO та t-hCO на 7–8 місяцях диференціації загалом узгоджується з часом розвитку in vivo та найбільш еквівалентний пізньому періоду розвитку плода (розширені дані, рис. 5a). Примітно, що ми спостерігали підвищену зрілість транскриптома в t-hCO порівняно з hCO відповідного віку, а також активацію транскриптома, пов'язану з синаптогенезом, астрогенезом та мієлінізацією (розширені дані, рис. 5b-d). На клітинному рівні ми виявили ознаки тоншого підтипу кори в t-hCO, з кластерами глутаматергічних нейронів, що перекриваються з підтипами нейронів L2/3, L5 та L6 дорослих (рис. 1i). На противагу цьому, перекриття кластерів між глутаматергічними t-hCO нейронами та фетальними кортикальними нейронами було більш обмеженим у середині вагітності (розширені дані, рис. 5e-j). Щоб визначити, чи функціонально подібні t-hCO нейрони до постнатальних неокортикальних нейронів людини, ми провели електрофізіологічні записи та анатомічні реконструкції пірамідних нейронів L2/3 людини в гострих зрізах постнатальної кори людини (розширені дані, рис. 7a). Електрофізіологічні властивості пірамідних нейронів L2/3 були подібними до властивостей пірамідних нейронів t-hCO (розширені дані, рис. 7e). Морфологічно нейрони L2/3 з постнатальних зразків людини були більш схожими на t-hCO, ніж на hCO, хоча клітини L2/3 були довшими, містили більше гілок загалом і мали вищу щільність шипиків (рис. 3g та розширені дані, рис. 7b-). G).
a, трансплантація hCO, продукованого контрольними та TS hiPS клітинними лініями, новонародженим щурам. b, 3D-реконструкція біоцитин-заповнених t-hCO нейронів після 8 місяців диференціації. c, кількісне визначення середньої довжини дендритів (n = 19 контрольних нейронів, n = 21 TS нейрон; **P = 0,0041). d, 3D-реконструйовані дендритні гілки з контрольної групи та групи TS t-hCO₂ через 8 місяців диференціації та кількісне визначення щільності дендритних шипиків (n = 16 контрольних нейронів, n = 21 нейрон групи TS, ***P < 0,0001). d, 3D-реконструйовані дендритні гілки з контрольної групи та групи TS t-hCO₂ через 8 місяців диференціації та кількісне визначення щільності дендритних шипиків (n = 16 контрольних нейронів, n = 21 нейрон групи TS, ***P < 0,0001). d, 3D-реконструкція дендритних ветвей з контролю і TS t-hCO через 8 місяців диференціації та кількісна оцінка плотності дендритних шипов (n = 16 контрольних нейронів, n = 21 TS нейронів, *** P <0,0001). d, 3D-реконструкція дендритних гілок з контрольної групи та групи t-hCO TS через 8 місяців диференціації та кількісне визначення щільності дендритних хребців (n=16 контрольних нейронів, n=21 нейрон TS, ***P<0,0001). d，分化8 个月时对照和TS t-hCO 的3D 重建树突分支，以及树突棘密度的量化（n = 16个对照神经元，n = 21 个TS 神经元，***P <0,0001）. d ， 分化 8 个 时 对照 和 ts t-hco 的 3d 重建 分支 分支 以及 树突棘 密度 量化 （n = 16 个神经 元 ， n = 21 个 ts 神经 ， *** p <0,0001 ）. d, 3D-реконструкція дендритних ветвей контролю та TS t-hCO через 8 місяців диференціації та кількісна оцінка плотності дендритних шипов (n = 16 контрольних нейронів, n = 21 TS нейронів, *** P <0,0001). d, 3D-реконструкція контрольних дендритних гілок та TS t-hCO₂ через 8 місяців диференціації та кількісне визначення щільності дендритних хребців (n=16 контрольних нейронів, n=21 TS нейрон, ***P<0,0001).Червоними зірочками позначені ймовірні дендритні шипики. e, спонтанні EPSC у контрольних нейронах та нейронах TS t-hCO після 8 місяців диференціації. f, графік кумулятивної частоти та кількісне визначення частоти та амплітуди синаптичних подій (n=32 контрольні нейрони, n=26 нейронів TS; **P=0,0076 та P=0,8102). g, аналіз Шолля TS та контрольних нейронів у hCO та t-hCO. Пунктирні лінії показують постнатальні пірамідні нейрони L2/3 людини для порівняння (n = 24 контрольні нейрони t-hCO, n = 21 нейрон TS t-hCO, n = 8 контрольних нейронів hCO та n = 7 нейронів TS hCO). Дані виражені як середнє значення ± стандартне відхилення.
Здатність t-hCO2 відтворювати морфологічні та функціональні особливості нейронів кори людини на високому рівні спонукала нас дослідити, чи можна використовувати t-hCO2 для виявлення фенотипів захворювань. Ми зосередилися на синдромі Тошкар-Рі, тяжкому нейророзвитковому розладі, спричиненому мутаціями з посиленням функції в гені, що кодує CaV1.2, який ініціює транскрипцію генів, залежну від активності, в нейронах. Ми отримали hCO2 від трьох пацієнтів з синдромом Тошкар-Рі, які мали найпоширенішу заміну (p.G406R), та трьох контрольних груп (рис. 3a). Після трансплантації ми виявили, що морфологія дендритів була змінена в нейронах синдрому Тошкар-Рі порівняно з контрольними (рис. 3b та розширені дані, рис. 8a,b), з дворазовим збільшенням кількості первинних дендритів та загальним збільшенням середнього та загального зменшення довжини дендритів (рис. 3c та розширені дані, рис. 8c). Це було пов'язано зі збільшенням щільності шипиків та збільшенням частоти спонтанних EPSCs у нейронах Тошкар-Рі порівняно з контрольними нейронами (рис. 3d–f та розширені дані, рис. 8g). Подальший аналіз виявив закономірності аномального дендритного розгалуження в t-hCO TS порівняно з контрольною групою, але не в in vitro TS hCO на подібній стадії диференціації (рис. 3g). Це узгоджується з нашими попередніми повідомленнями про залежне від активності зменшення дендритів у TS та підкреслює здатність цієї трансплантаційної платформи виявляти фенотипи захворювань in vivo.
Потім ми запитали, якою мірою t-hCO клітини функціонально інтегровані в S1 щура. S1 у гризунів отримує сильні синаптичні сигнали від іпсилатеральних вентральних базальних та задніх таламічних ядер, а також від іпсилатеральної рухової та вторинної соматосенсорної кори та контралатерального S1 (рис. 4a). Щоб відновити іннерваційний патерн, ми інфікували hCO вірусом сказу-dG-GFP/AAV-G та трансплантували hCO щуру S1 через 3 дні. Ми спостерігали щільну експресію GFP у нейронах іпсилатерального S1 та вентральних базальних гангліїв через 7–14 днів після трансплантації (рис. 4b, c). Крім того, фарбування таламічного маркера нетрину G1 антитілами виявило наявність таламічних закінчень у t-hCO (рис. 4d, e). Щоб оцінити, чи можуть ці аферентні проекції викликати синаптичні відповіді в клітинах t-hCO, ми провели записи цілих клітин людини в гострих зрізах таламокортикального шару. Електрична стимуляція S1 щура, внутрішньої капсули, білої речовини, волокон поблизу t-hCO або оптогенетична активація опсин-експресуючих таламічних закінчень у t-hCO індукувала коротколатентні EPSC у нейронах t-hCO, що піддалися впливу антагоніста рецептора AMPA NBQX (рис. 4f, g та розширені дані, рис. 9a–g). Ці дані демонструють, що t-hCO анатомічно інтегрований у мозок щура та здатний активуватися тканиною хазяїна щура.
a, Схематична діаграма експерименту з відстеження сказу. b, GFP та експресія специфічного для людини STEM121 між t-hCO та корою головного мозку щура (верхня панель). Також показано експресію GFP в іпсилатеральному вентральному базальному ядрі (VB) щура (внизу ліворуч) та іпсилатеральному S1 (внизу праворуч). Масштабна шкала, 50 мкм. Червоні квадрати представляють ділянки мозку, де були отримані зображення. c, кількісне визначення клітин, що експресують GFP (n = 4 щури). d, e — таламічні терміналі Netrin G1+ у t-hCO. d показує корональний зріз, що містить ядра t-hCO та VB. Масштабна шкала, 2 мм. e показує експресію Netrin G1 та STEM121 у нейронах t-hCO (ліворуч) та VB (праворуч). Масштабна шкала, 50 мкм. Помаранчева пунктирна лінія позначає межу t-hCO. f, g, Сліди струму нейронів t-hCO після електричної стимуляції у S1 щура (f) або внутрішньої капсули (g), з (фіолетовий) або без (чорний) NBQX (ліворуч). Амплітуди EPSC з та без NBQX (n = 6 S1 нейронів, *P = 0,0119; та n = 6 нейронів внутрішньої капсули, **P = 0,0022) (у центрі). Відсоток t-hCO нейронів, що демонструють EPSC у відповідь на електричну стимуляцію S1 щура (f) або внутрішньої капсули (g) (праворуч). aCSF, штучна спинномозкова рідина. h, схематична діаграма експерименту з 2P-візуалізації (ліворуч). Експресія GCaMP6s у t-hCO (посередині). Масштабна шкала, 100 мкм. Інтервал флуоресценції GCaMP6s (праворуч). i, Z-оцінка спонтанної активності флуоресценції. j, схематична ілюстрація стимуляції вусів. k, траєкторії флуоресценції 2P з z-оцінкою в одному випробуванні, вирівняні з відхиленням вусів у момент часу нуль (пунктирна лінія) у зразках клітин. l, усереднені за популяцією z-оцінки всіх клітин, вирівняні з відхиленням вусів у момент часу нуль (пунктирна лінія) (червоний) або випадково згенеровані позначки часу (сірий). m. Схема експерименту з оптичного маркування. n, Необроблені криві напруги з прикладу комірки t-hCO під час стимуляції синім лазером або відхилення вусів. Червоні стрілки вказують на перші спайки, спричинені світлом (зверху) або спричинені відхиленням вусів (знизу). Сіре затінення вказує на періоди відхилення вусів. o, Пікові форми світлових хвиль та реакції відхилення вусів. p, спайки однієї спроби, вирівняні з відхиленням вусів у клітинах прикладу. 0 вказує на відхилення вусів (пунктирна лінія). q, усереднена за популяцією z-оцінка швидкості спрацьовування для всіх фоточутливих клітин, вирівняна з відхиленням вусів у момент часу нуль (пунктирна лінія) (червоний) або випадково згенеровані позначки часу (сірий). r, Частка фоточутливих одиниць, що значно модульовані відхиленням вусів (n = 3 щури) (ліворуч). Пікова латентність z-показника (n = 3 щури; n = 5 (світло-зелений), n = 4 (темно-зелений) та n = 4 (блакитний) одиниць модуляції відхилення вусів на щура) (праворуч). Дані виражені як середнє значення ± стандартне відхилення.
Потім ми запитали, чи може t-hCO активуватися сенсорними стимулами in vivo. Ми трансплантували hCO, що експресує генетично кодовані кальцієві індикатори GCaMP6, щурам S1. Через 150 днів ми провели волоконну фотометрію або двофотонну кальцієву візуалізацію (рис. 4h та розширені дані, рис. 10a). Ми виявили, що клітини t-hCO демонстрували синхронізовану ритмічну активність (рис. 4i, розширені дані, рис. 10b та додаткове відео 1). Щоб охарактеризувати пікову активність t-hCO, ми провели позаклітинні електрофізіологічні записи у анестезованих трансплантованих щурів (розширені дані, рис. 10c-f). Ми згенерували стереотаксичні координати з МРТ-зображень; таким чином, ці записані одиниці представляють ймовірні людські нейрони, хоча сама лише електрофізіологія не дозволяє визначити видове походження. Ми спостерігали синхронізовані сплески активності (розширені дані, рис. 10d). Сплески тривали близько 460 мс і були розділені періодами мовчання близько 2 с (розширені дані, рис. 10d, e). Окремі одиниці вистрілювали в середньому близько трьох пострілів за чергу, що становить приблизно 73% від зареєстрованих одиниць за чергу. Активність окремих одиниць була високо корельованою, і ці кореляції були вищими, ніж у одиниць, виявлених у невакцинованих тварин, зареєстрованих за тих самих умов (розширені дані, рис. 10f). Для подальшої характеристики спайкових відповідей ідентифікованих нейронів людського походження ми провели експерименти зі світловим міченням на анестезованих щурах, яким трансплантували hCO, що експресує світлочутливий катіонний канал родопсин 2 (hChR2), через який t-hCO нейрони розпізнають з короткою латентністю (менше 10 мс) у відповідь на сині світлові стимули (рис. 4m–o). t-hCO нейрони демонстрували сплески спонтанної активності на частотах, подібних до тих, що спостерігаються при кальцієвій візуалізації, а також електрофізіологічні записи, виконані в t-hCO за відсутності світлового мічення (розширені дані, рис. 10c-g). На відповідних стадіях hCO, зареєстрованих in vitro, спонтанної активності не спостерігалося. Щоб оцінити, чи може t-hCO активуватися сенсорними стимулами, ми ненадовго відхилили вуса щурів від t-hCO (рис. 4j,m та розширені дані, рис. 10h,k). Згідно з попередніми дослідженнями8,10, підмножина клітин t-hCO демонструвала підвищену активність у відповідь на відхилення вусів, чого не спостерігалося при порівнянні даних з випадковими часовими мітками (рис. 4k–q та розширені дані, рис. 10h–q). Дійсно, близько 54% ​​опто-мічених окремих одиниць показали значно підвищену швидкість збудження після стимуляції вусів, досягаючи піку приблизно на 650 мс (рис. 4r). У сукупності ці дані свідчать про те, що t-hCO отримує відповідні функціональні вхідні дані та може активуватися стимулами навколишнього середовища.
Потім ми досліджували, чи може t-hCO активувати нейронні нейрони у щурів для контролю поведінки. Спочатку ми дослідили, чи аксони нейронів t-hCO проектуються в навколишні тканини щура. Ми інфікували hCO лентивірусом, що кодує hChR2, злитий з EYFP (hChR2-EYFP). Через 110 днів ми спостерігали експресію EYFP в іпсилатеральних ділянках кори, включаючи слухову, рухову та соматосенсорну кору, а також у підкіркових ділянках, включаючи стріатум, гіпокамп і таламус (рис. 5a). Щоб оцінити, чи можуть ці еферентні проекції викликати синаптичні реакції в клітинах щурів, ми оптично активували клітини t-hCO, що експресують hChR2-EYFP, записуючи клітини кори головного мозку щурів на чітких зрізах мозку. Активація аксонів t-hCO синім світлом індукувала коротколатентні EPSC у нейронах пірамідальної кори щурів, які були блоковані NBQX (рис. 5b–g). Крім того, ці реакції могли бути заблоковані тетродотоксином (TTX) та відновлені 4-амінопіридином (4-AP), що свідчить про їхню спричиненість моносинаптичними зв'язками (рис. 5e).
a, Схематична діаграма відстеження аксонів (ліворуч). Експресія t-hCO EYFP (праворуч). Масштабна шкала, 100 мкм. A1, слухова кора, ACC, передня поясна кора, d. striatum, дорсальний стріатум, HPC, гіпокамп; Діафрагма, латеральна перегородка, mPFC, медіальна префронтальна кора, пірі, грушоподібна кора, v. striatum, вентральний стріатум, VPM, вентропостомедіальне ядро ​​таламуса, VTA, вентральна тегментальна область. Червоні квадрати представляють ділянки мозку, де були отримані зображення. b, Схематична діаграма експерименту зі стимуляцією. c, d, Приклади реакції фотоструму (зверху) та напруги (знизу), індукованих синім світлом, у клітинах EYFP+ людини (c) або EYFP- щура (d). e, f, Поточні сліди нейронів щурів після стимуляції синім світлом аксонів t-hCO за допомогою TTX та 4-AR (зелений), TTX (сірий) або aCSF (чорний) (e), з (фіолетовий) або без (чорний) ) ) NBQX (e). g, латентність відповідей, індукованих синім світлом у клітинах щурів (n = 16 клітин); горизонтальні смуги вказують на середню латентність (7,13 мс) (ліворуч). Амплітуда світлоіндукованих EPSC, записаних з NBQX або без нього (n = 7 клітин; ***P < 0,0001) (посередині). Амплітуда світлоіндукованих EPSC, записаних з NBQX або без нього (n = 7 клітин; ***P < 0,0001) (посередині). Амплітуда визваних світом EPSC, зареєстрованих з або без NBQX (n = 7 клітин; ***P <0,0001) (в центрі). Амплітуда світлоіндукованих EPSC, записаних з NBQX або без нього (n = 7 клітин; ***P < 0,0001) (у центрі).使用或不使用NBQX 记录的光诱发 EPSC 的振幅（n = 7 个细胞；***P < 0,0001）（中）。使用或不使用NBQX 记录的光诱发 EPSC 的振幅（n = 7 个细胞；***P < 0,0001）（中）。 Амплітуда визваних світом EPSC, зареєстрованих з або без NBQX (n = 7 клітин; ***P <0,0001) (в центрі). Амплітуда світлоіндукованих EPSC, записаних з NBQX або без нього (n = 7 клітин; ***P < 0,0001) (у центрі).Відсоток клітин щурів, що показують EPSC, що реагують на синє світло (праворуч). h, Схематична діаграма поведінкового завдання. d0, день 0. i. Показники поведінки тварин-експозиторів на 1-й (ліворуч) або 15-й (праворуч) день навчання. Середня кількість облизувань, виконаних на 1-й день (ліворуч) або 15-й день (праворуч по центру) (n = 150 спроб синього світла, n = 150 спроб червоного світла; ***P < 0,0001). Середня кількість облизувань, виконаних на 1-й день (ліворуч) або 15-й день (праворуч по центру) (n = 150 спроб синього світла, n = 150 спроб червоного світла; ***P < 0,0001). Середня кількість облицювань, виконаних в день 1 (зліва) або день 15 (в центрі справи) (n = 150 випробувань з синім світлом, n = 150 випробувань з червоним світлом; ***P <0,0001). Середня кількість облизувань, виконаних на 1-й день (ліворуч) або 15-й день (праворуч у центрі) (n = 150 спроб синього світла, n = 150 спроб червоного світла; ***P < 0,0001).第1 天（左）或第15 天（右中）执行的平均舔次数（n = 150 次蓝光试验，n = 150次红光试验；***P < 0,0001）。第1 天（左）或第15 天（右中）执行的平均舔次数（n = 150 次蓝光试验，n = 150次红光试验；***P < 0,001 Середня кількість облицювань, виконаних в день 1 (зліва) або день 15 (в центрі справи) (n = 150 випробувань з синім світлом, n = 150 випробувань з червоним світлом; ***P <0,0001). Середня кількість облизувань, виконаних на 1-й день (ліворуч) або 15-й день (праворуч у центрі) (n = 150 спроб синього світла, n = 150 спроб червоного світла; ***P < 0,0001).Кумулятивні лизання для випробувань червоного та синього світла на 1-й день (ліворуч у центрі) або на 15-й день (праворуч). NS, незначне. j,k, Поведінкові характеристики всіх тварин, яким трансплантували t-hCO, що експресує hChR2-EYFP (j), або контрольний флуорофор (k) на 1-й або 15-й день (hChR2-EYFP: n = 9 щурів, ** P = 0,0049; контроль: n = 9, P = 0,1497). l, Еволюція показника переваги (n = 9 hChR2, n = 9 контроль; **P < 0,001, ***P < 0,0001). l, Еволюція показника переваги (n = 9 hChR2, n = 9 контроль; **P < 0,001, ***P < 0,0001). l, Еволюція показника переваги (n = 9 hChR2, n = 9 контрольних; **P <0,001, ***P <0,0001). l, Еволюція показника переваги (n = 9 hChR2, n = 9 контрольних груп; **P < 0,001, ***P < 0,0001). l，偏好评分的演变８(n = 9 hChR2，n=9 对照；**P < 0,001，***P < 0,0001）). l，偏好评分的演变８(n = 9 hChR2，n=9 对照；**P < 0,001，***P < 0,0001）). l, Еволюція показників переваг (n = 9 hChR2, n = 9 контролів; **P <0,001, ***P <0,0001). l, Еволюція балів уподобань (n = 9 hChR2, n = 9 контрольних груп; **P < 0,001, ***P < 0,0001).m, експресія FOS у відповідь на оптогенетичну активацію t-hCO в S1. Показано зображення експресії FOS (ліворуч) та кількісне визначення (n = 3 на групу; *P < 0,05, **P < 0,01 та ***P < 0,001) (праворуч). Показано зображення експресії FOS (ліворуч) та кількісне визначення (n = 3 на групу; *P < 0,05, **P < 0,01 та ***P < 0,001) (праворуч). Показані зображення експресії FOS (рівень) і кількісного визначення (n = 3 на групу; * P <0,05, ** P <0,01 і *** P <0,001) (справа). Зображення експресії FOS (ліворуч) та кількісного визначення (n = 3 на групу; *P<0,05, **P<0,01 та ***P<0,001) показано (праворуч).显示了FOS 表达（左）和量化（每组n = 3；*P < 0,05、**P < 0,01 和***P < 0,001）（右）的图像。显示了FOS 表达（左）和量化（每组n = 3；*P < 0,05、**P < 0,01 和***P < 0,001）（右）的图像。 Показані зображення експресії FOS (рівень) і кількісного визначення (n = 3 на групу; * P <0,05, ** P <0,01 і *** P <0,001) (справа). Зображення експресії FOS (ліворуч) та кількісного визначення (n = 3 на групу; *P<0,05, **P<0,01 та ***P<0,001) показано (праворуч).Масштабна шкала, 100 мкм. Дані виражені як середнє значення ± стандартна похибка BLA, базолатерального мигдалика, MDT, дорсомедіального ядра таламуса, PAG, періакведуктального сірого кольору.
Зрештою, ми запитали, чи може t-hCO модулювати поведінку щурів. Щоб перевірити це, ми трансплантували hCO, що експресує hChR2-EYFP, в S1, а через 90 днів імплантували оптичні волокна в t-hCO для доставки світла. Потім ми навчили щурів за допомогою модифікованої парадигми оперантного кондиціонування (рис. 5h). Ми помістили тварин у камеру для поведінкового тестування та випадковим чином застосували 5-секундні лазерні стимули синім (473 нм) та червоним (635 нм). Тварини отримували водну винагороду, якщо вони облизували під час стимуляції синім світлом, але не облизували під час стимуляції червоним світлом. У перший день навчання тварини не виявляли різниці в облизуванні при стимуляції синім або червоним світлом. Однак на 15-й день тварини, яким трансплантували hCO, що експресує hChR2-EYFP, демонстрували більш активне облизування при стимуляції синім світлом порівняно зі стимуляцією червоним світлом. Ці зміни в поведінці облизування не спостерігалися у контрольних тварин, яким трансплантували hCO, що експресує контрольний флуорофор (коефіцієнт успішного навчання: hChR2 89%, EYFP 0%, Рисунок 5i-1 та Додаткове відео 2). Ці дані свідчать про те, що t-hCO клітини можуть активувати нейрони щурів для стимуляції поведінки, спрямованої на пошук винагороди. Щоб з'ясувати, які нейронні ланцюги t-hCO щурів можуть бути задіяні в цих поведінкових змінах, ми оптогенетично активували t-hCO у навчених тварин та зібрали тканини через 90 хвилин. Імуногістохімія виявила експресію залежного від активності білка FOS у кількох ділянках мозку, задіяних у мотивованій поведінці, включаючи медіальну префронтальну кору, медіальний таламус та періакведутальну сіру речовину, яка експресувалася або у нестимульованих контрольних тварин, або у тварин (рис. 5m). У сукупності ці дані свідчать про те, що t-hCO може модулювати нейрональну активність щурів для стимуляції поведінки.
Нейронні органоїди являють собою перспективну систему для вивчення розвитку та захворювань людини in vitro, але вони обмежені відсутністю зв'язків між ланцюгами, що існують in vivo. Ми розробили нову платформу, на якій ми трансплантували hCO в S1 імунокомпрометованих щурів у ранньому постнатальному віці для вивчення розвитку та функціонування клітин людини in vivo. Ми показали, що t-hCO розвиває зрілі типи клітин, які не спостерігаються in vitro28, і що t-hCO анатомічно та функціонально інтегрований у мозок гризунів. Інтеграція t-hCO в нейронні ланцюги гризунів дозволила нам встановити зв'язок між клітинною активністю людини та поведінкою досліджуваних тварин, показуючи, що нейрони t-hCO можуть модулювати нейрональну активність щурів для стимуляції поведінкових реакцій.
Описана нами платформа має кілька переваг порівняно з попередніми дослідженнями трансплантації клітин людини в мозок гризунів. По-перше, ми трансплантували hCO у кору головного мозку щурів у ранньому постнатальному періоді, що може сприяти анатомічній та функціональній інтеграції. По-друге, МРТ-моніторинг t-hCO дозволив нам вивчити положення та ріст трансплантата у живих тварин, що дозволило нам проводити довгострокові дослідження на багатьох тваринах та встановлювати надійність кількох клітинних ліній hiPS. Нарешті, ми трансплантували інтактні органоїди, а не ізольовані суспензії окремих клітин, які менш руйнівні для клітин людини та можуть сприяти інтеграції та генерації нейронів кори головного мозку людини в мозку щурів.
Ми визнаємо, що, незважаючи на досягнення в цій платформі, часові, просторові та міжвидові обмеження перешкоджають формуванню людських нейронних ланцюгів з високою точністю, навіть після трансплантації на ранній стадії розвитку. Наприклад, незрозуміло, чи спонтанна активність, що спостерігається в t-hCO, являє собою фенотип розвитку, подібний до ритмічної активності, що спостерігається під час розвитку кори, чи це пов'язано з відсутністю супресивних типів клітин, присутніх у t-hCO. Аналогічно, незрозуміло, якою мірою відсутність ламінації в t-hCO впливає на зв'язність ланцюга30. Подальша робота буде зосереджена на інтеграції інших типів клітин, таких як мікроглія людини, ендотеліальні клітини людини та різні пропорції ГАМКергічних інтернейронів, як показано за допомогою збірки 6 in vitro, а також на розумінні того, як нейронна інтеграція та обробка можуть відбуватися у змінених t-hCO на транскрипційних, синаптичних та поведінкових рівнях у клітинах, отриманих від пацієнтів.
Загалом, ця платформа in vivo являє собою потужний ресурс, який може доповнити дослідження розвитку людського мозку та захворювань in vitro. Ми очікуємо, що ця платформа дозволить нам виявити нові фенотипи на рівні ланцюгів у інакше недосяжних клітинах, отриманих від пацієнтів, та протестувати нові терапевтичні стратегії.
Ми генерували hCO2.5 з клітин HiPS, як описано раніше. Щоб ініціювати виробництво hCO з клітин hiPS, культивованих на шарах-живильниках, інтактні колонії клітин hiPS видаляли з культуральних чашок за допомогою диспази (0,35 мг/мл) та переносили в пластикові культури з наднизьким прикріпленням, що містили чашки з середовищем для культивування клітин hiPS (Corning), доповненим двома інгібіторами SMAD: дорсоморфіном (5 мкМ; P5499, Sigma-Aldrich) та SB-431542 (10 мкМ; 1614, Tocris) та інгібітором ROCK Y-27632 (10 мкМ; S1049, Selleckchem). Протягом перших 5 днів середовище для клітин hiPS змінювали щодня, додаючи дорсоморфін та SB-431542. На шостий день у суспензії нейронні сфероїди переносили в нейронне середовище, що містило нейробазал-А (10888, Life Technologies), добавку B-27 без вітаміну А (12587, Life Technologies), GlutaMax (1:100, Life Technologies), пеніцилін та стрептоміцин (1:100, Life Technologies) та доповнювали епідермальним фактором росту (EGF; 20 нг мл−1; R&D Systems) та фактором росту фібробластів 2 (FGF2; 20 нг мл−1; R&D Systems) до 24-го дня. З 25-го по 42-й день середовище доповнювали нейротрофічним фактором, отриманим з мозку (BDNF; 20 нг мл−1, Peprotech) та нейротрофіном 3 (NT3; 20 нг мл−1; Peprotech) зі зміною середовища через день. На шостий день у суспензії нейронні сфероїди переносили в нейронне середовище, що містило нейробазал-А (10888, Life Technologies), добавку B-27 без вітаміну А (12587, Life Technologies), GlutaMax (1:100, Life Technologies), пеніцилін та стрептоміцин (1:100, Life Technologies) та доповнювали епідермальним фактором росту (EGF; 20 нг мл−1; R&D Systems) та фактором росту фібробластів 2 (FGF2; 20 нг мл−1; R&D Systems) до 24-го дня. З 25-го по 42-й день середовище доповнювали нейротрофічним фактором, отриманим з мозку (BDNF; 20 нг мл−1, Peprotech) та нейротрофіном 3 (NT3; 20 нг мл−1; Peprotech) зі зміною середовища через день.На шостий день у суспензії нейронні сфероїди перенесли в нейронне середовище, що містило Neurobasal-A (10888, Life Technologies), добавку B-27 без вітаміну А (12587, Life Technologies), GlutaMax (1:100, Life Technologies) та пеніцилін.і стрептоміцин (1:100, Life Technologies) і доповнений епідермальним фактором росту (EGF; 20 нг/мл; R&D Systems) і фактором росту фібробластів 2 (FGF2; 20 нг/мл; R&D Systems) до 24-го дня. та стрептоміцин (1:100, Life Technologies) та доповнювали епідермальним фактором росту (EGF; 20 нг/мл; R&D Systems) та фактором росту фібробластів 2 (FGF2; 20 нг/мл; R&D Systems) до 24-го дня.З 25-го по 42-й день до середовища додавали нейротрофічний фактор мозку (BDNF; 20 нг/мл, Peprotech) та нейротрофін 3 (NT3; 20 нг/мл, Peprotech), змінюючи середовище через день.在悬浮的第6 天，将神经球体转移到含有нейробазальний-A（10888，Life Technologies）、不含维生素A 的B-27补充剂（12587，Life Technologies）、GlutaMax（1:100，Life Technologies）、青霉素的神经培养基中和链霉素（1:100，Life Technologies）并辅以表皮生长因子（EGF；20 нг мл-1；R&D Systems）和成纤维细胞生长因子2（FGF2；20 нг мл-1；R&D Системи) 直至第24 天.在 悬浮 的 第 第 6 天 将 神经 球体 转移 含有 含有 neurobasal-a （10888 ， Life Technologies） 不 含 维生素 a的 b-27 补充剂 （12587 ， Life Technologies） Glutamax （1: 100 ， Life TechNOGIS青霉素 的 神经 培养 基 中 链霉素（（1: 100 ， Life Technologies） 表皮 生长 因子 （（（20 нг мл-1 ； R & D Systems） 成 纤维 细胞 生长 2 （fgf2 ； 20 нг мл-1；НДДКР Системи) 直至第24天. На 6-й день суспензії нейросфери були переведені на добавку, що містить нейробазал-А (10888, Life Technologies), добавку В-27 без вітаміну А (12587, Life Technologies), GlutaMax (1:100, Life Technologies), пеніцилін-нейтралізований стрептоміцин (1:100, Life). Technologies) з додаванням епідермального фактора росту (EGF; 20 нг мл-1; R&D Systems) і фактора росту фібробластів 2 (FGF2; 20 нг мл-1) 1; На 6-й день суспензії нейросфер були переведені на добавку, що містила нейробазал-А (10888, Life Technologies), добавку B-27 без вітаміну А (12587, Life Technologies), GlutaMax (1:100, Life Technologies), стрептоміцин, нейтралізований пеніциліном (1:100, Life Technologies), доповнений епідермальним фактором росту (EGF; 20 нг/мл; R&D Systems) та фактором росту фібробластів 2 (FGF2; 20 нг/мл)1; R&D Systems) до 24-го дня. Системи досліджень та розробок) до 24-го дня.З 25-го по 42-й день до культурального середовища через день додавали нейротрофічний фактор мозку (BDNF; 20 нг/мл, Peprotech) та нейротрофічний фактор 3 (NT3; 20 нг/мл, Peprotech). Середовище змінювали один раз.Починаючи з 43-го дня, hCO2 підтримували в недобутому нейробазальному середовищі A (NM; 1088022, Thermo Fisher) зі зміною середовища кожні 4–6 днів. Для отримання hCO2 з клітин hiPS, культивованих в умовах без годівниці, клітини hiPS інкубували з Accutase (AT-104, Innovate Cell Technologies) при 37°C протягом 7 хвилин, дисоціювали на окремі клітини та висівали на планшети AggreWell 800 (34815, STEMCELL Technologies) при щільності 3 × 106 окремих клітин на лунку в середовищі Essential 8, доповненому інгібітором ROCK Y-27632 (10 мкМ; S1049, Selleckchem). Через 24 години середовище в лунках піпеткою переносили в середовище, що містило середовище Essential 6 (A1516401, Life Technologies), доповнене дорсоморфіном (2,5 мкМ; P5499, Sigma-Aldrich) та SB-431542 (10 мкМ; 1614). (Tocrida). З 2-го по 6-й день середовище Essential 6 щодня замінювали дорсоморфіном та добавкою SB-431542. З шостого дня суспензії нейросфер переносили в нейробазальне середовище та підтримували, як описано вище.
Усі процедури з тваринами проводили відповідно до рекомендацій щодо догляду за тваринами, затверджених Адміністративним комітетом з догляду за лабораторними тваринами Стенфордського університету (APLAC). Вагітних еутимічних щурів RNU (rnu/+) було придбано (Charles River Laboratories) або розміщено у них. Тварин утримували на 12-годинному циклі світло-темрява з їжею та водою ad libitum. Дитинчат голих щурів (FOXN1–/–) віком від трьох до семи днів ідентифікували за ростом незрілих вусів перед вибракуванням. Цуценят (самців і самок) анестезували 2-3% ізофлураном та поміщали на стереотаксичну раму. Була проведена трепанація черепа діаметром приблизно на 2-3 мм вище S1, зберігаючи цілісність твердої мозкової оболонки. Потім використовували голку 30-G (приблизно 0,3 мм) безпосередньо за межами краніотомії, щоб проколоти тверду мозкову оболонку. Потім нанесіть HCO3 на тонку параплівку розміром 3×3 см та видаліть надлишок середовища. За допомогою шприца Гамільтона, прикріпленого до голки 23 G під кутом 45°, обережно наберіть hCO₃ у найдистальніший кінець голки. Потім встановіть шприц на шприцевий насос, підключений до стереотаксічного пристрою. Далі помістіть кінчик голки над попередньо зробленим отвором для проколу шириною 0,3 мм у твердій мозковій оболонці (z = 0 мм) та звужуйте шприц на 1–2 мм (z = приблизно –1,5 мм), доки голка не опиниться між A твердої мозкової оболонки. Не утвориться щільне ущільнення. Потім підніміть шприц до центру кіркової поверхні при z = -0,5 мм та введіть hCO₃ зі швидкістю 1-2 мкл за хвилину. Після завершення ін'єкції hCO₃ голку витягують зі швидкістю 0,2-0,5 мм за хвилину, шкіру зашивають, і цуценя негайно поміщають на теплу грілку до повного одужання. Деяким тваринам проводили пересадку двосторонньо.
Усі процедури на тваринах проводили відповідно до рекомендацій щодо догляду за тваринами, затверджених APLAC Стенфордського університету. Щурам (більше 60 днів після трансплантації) індукували 5% ізофлурановий наркоз та анестезували 1-3% ізофлураном під час візуалізації. Для візуалізації використовували активно екранований горизонтальний свердловинний сканер потужністю 7 Тесла з градієнтним приводом International Electric Company (IECO), екранованою градієнтною вставкою з внутрішнім діаметром 120 мм (600 мТл/м, 1000 Тл/м/с) з використанням AVANCE.III, восьмиканального багатокотушкового радіочастотного та багатоядерного програмного забезпечення, а також супутньої платформи Paravision 6.0.1. Запис проводився за допомогою активно розв'язаної об'ємної радіочастотної котушки з внутрішнім діаметром 86 мм та чотириканальної кріогенної радіочастотної котушки лише для прийому. Осьовий 2D Turbo-RARE (час повторення = 2500 мс, час відлуння = 33 мс, 2 усереднення) з 16 захопленнями зрізів, товщина зрізу 0,6–0,8 мм, що містить 256 × 256 зразків. Сигнали отримували за допомогою квадратурної приймачо-передаючої об'ємної радіочастотної котушки з внутрішнім діаметром 2 см (Rapid MR International, LLC). Нарешті, використовували вбудовані функції оцінки поверхні Imaris (BitPlane) для 3D-рендерингу та аналізу об'єму. Успішна трансплантація визначалася як така, при якій у трансплантованій півкулі утворилися області безперервного Т2-зваженого МРТ-сигналу. Відторгнення трансплантата визначалося як трансплантат, який не утворював області безперервного Т2-зваженого МРТ-сигналу у трансплантованій півкулі. Підкірковий t-hCO₂ був виключений з подальшого аналізу.
Для стабільної експресії GCaMP6s у hCO2 для двофотонної кальцієвої візуалізації, клітини hiPS інфікували pLV[Exp]-EF1a::GcaMP6s-WPRE-Puro з подальшим відбором антибіотиків. Коротко, клітини дисоціювали з EDTA та суспендували в 1 мл середовища Essential 8 при щільності приблизно 300 000 клітин у присутності полібрену (5 мкг/мл) та 15 мкл вірусу. Потім клітини інкубували в суспензії протягом 60 хвилин та висівали при щільності 50 000 клітин на лунку. Після злиття клітини обробляли 5-10 мкг мл-1 пуроміцину протягом 5-10 днів або до появи стабільних колоній. Гостру інфекцію hCO2 проводили, як описано раніше5, з деякими модифікаціями. Коротко, hCO2 на 30-45 день перенесли у 1,5 мл мікроцентрифужні пробірки Eppendorf, що містять 100 мкл нервового середовища. Потім приблизно 90 мкл середовища видаляють, до пробірки додають 3-6 мкл лентивірусу з високим титром (від 0,5 x 108 до 1,2 x 109), а hCO3 переносять в інкубатор на 30 хвилин. Потім додають 90–100 мкл середовища в кожну пробірку та повертають пробірки в інкубатор на ніч. Наступного дня переносять hCO3 у свіже нервове середовище в планшетах з низьким ступенем прикріплення. Через 7 днів hCO3 переносять у 24-лункові планшети зі скляним дном для візуалізації та оцінки якості інфекції. pLV[Exp]-SYN1::EYFP-WPRE та pLV[Exp]-SYN1::hChR2-EYFP-WPRE були згенеровані за допомогою VectorBuilder. Лентивірус використовується в більшості експериментів, оскільки він інтегрований у геном хазяїна, що дозволяє експресію репортерного гена в інфікованих клітинних лініях. Для подальшого спостереження за сказом, на 30-45 день hCO коінфікували вірусом сказу-ΔG-eGFP та AAV-DJ-EF1a-CVS-G-WPRE-pGHpA (плазміда №67528, Addgene), ретельно промивали протягом 3 днів, трансплантували щурам у S1 та підтримували in vivo протягом 7-14 днів.
Для імуноцитохімії тварин анестезували та транскардіально перфузували PBS, а потім 4% параформальдегідом (PFA у PBS; Electron Microscopy Sciences). Мозок фіксували у 4% PFA протягом 2 годин або протягом ночі при 4°C, кріоконсервували у 30% сахарозі у PBS протягом 48-72 годин та заливали у розчин 1:1, 30% сахарози:OCT (Tissue-Tek OCT Compound 4583, Sakura Finetek), та робили корональні зрізи товщиною 30 мкм за допомогою кріостата (Leica). Для імуногістохімії товстих зрізів тварин перфузували PBS, а мозок препарували та робили корональні зрізи товщиною 300–400 мкм за допомогою вібратома (Leica), та зрізи фіксували 4% PFA протягом 30 хвилин. Потім кріозрізи або товсті зрізи промивали PBS, блокували протягом 1 години за кімнатної температури (10% нормальної сироватки осла (NDS) та 0,3% Triton X-100, розведеного в PBS) та блокували блокуючим розчином за 4°C. – Інкубація Кріозрізи інкубували протягом ночі, а товсті зрізи інкубували протягом 5 днів. Основними використаними антитілами були: анти-NeuN (миша, 1:500; ab104224, abcam), анти-CTIP2 (щур, 1:300; ab18465, abcam), анти-GFAP (кролик, 1:1000; Z0334, Dako), анти-GFP (курка, 1:1000; GTX13970, GeneTex), анти-HNA (миша, 1:200; ab191181, abcam), анти-NeuN (кролик, 1:500; ABN78, Millipore), анти-PDGFRA (кролик, 1:200; sc-338, Santa Cruz), анти-PPP1R17 (кролик, 1:200; HPA047819, Atlas Antibodies), анти-RECA-1 (миша, 1:50; ab9774, abcam), анти-SCG2 (кролик, 1:100; 20357-1-AP, Proteintech), анти-SOX9 (коза, 1:500; AF3075, R&D Systems), Netrin G1a (коза, 1:100; AF1166, R&D Systems), анти-STEM121 (миша, 1:200; Y40410, Takara Bio), анти-SATB2 (миша, 1:50; ab51502, abcam), анти-GAD65/67 (кролик, 1:400; ABN904, Millipore) та анти-IBA1 (коза, 1:100; ab5076, abcam). Основними використаними антитілами були: анти-NeuN (миша, 1:500; ab104224, abcam), анти-CTIP2 (щур, 1:300; ab18465, abcam), анти-GFAP (кролик, 1:1000; Z0334, Dako), анти-GFP (курка, 1:1000; GTX13970, GeneTex), анти-HNA (миша, 1:200; ab191181, abcam), анти-NeuN (кролик, 1:500; ABN78, Millipore), анти-PDGFRA (кролик, 1:200; sc-338, Santa Cruz), анти-PPP1R17 (кролик, 1:200; HPA047819, Atlas Antibodies), анти-RECA-1 (миша, 1:50; ab9774, abcam), анти-SCG2 (кролик, 1:100; 20357-1-AP, Proteintech), анти-SOX9 (коза, 1:500; AF3075, R&D Systems), Netrin G1a (коза, 1:100; AF1166, R&D Systems), анти-STEM121 (миша, 1:200; Y40410, Takara Bio), анти-SATB2 (миша, 1:50; ab51502, abcam), анти-GAD65/67 (кролик, 1:400; ABN904, Millipore) та анти-IBA1 (коза, 1:100; ab5076, abcam). Використовувалися наступні первинні антитела: анти-NeuN (мишині, 1:500; ab104224, abcam), анти-CTIP2 (криші, 1:300; ab18465, abcam), анти-GFAP (кроличі, 1:1000; Z0334, Dako), анти- -GFP (курица, 1:1000; GTX13970, GeneTex), анти-HNA (мишь, 1:200; ab191181, abcam), анти-NeuN (кролик, 1:500; ABN78, Millipore), анти-PDGFRA (кролик, 1:200; sc-338, Санта-Круз), анти-PPP1R17 (кролик, 1:200; HPA047819, Atlas Antibodies), анти-RECA-1 (мишь, 1:50; ab9774, abcam), анти-SCG2 (кролик, 1:100; 20357-1-AP, Proteintech), анти-SOX9 (козій, 1:500; AF3075, R&D Systems), нетрин G1a (козий, 1:100; AF1166, R&D Systems), анти-STEM121 (мишиний , 1:200; Y40410, Takara Bio), анти-SATB2 (мишь, 1:50; ab51502, abcam), анти-GAD65/67 (кролик, 1:400; ABN904, Millipore) і анти-IBA1 (коза, 1:100; аб5076, абкам). Основними використаними антитілами були: анти-NeuN (миша, 1:500; ab104224, abcam), анти-CTIP2 (щур, 1:300; ab18465, abcam), анти-GFAP (кролик, 1:1000; Z0334, Dako), анти-GFP (курка, 1:1000; GTX13970, GeneTex), анти-HNA (миша, 1:200; ab191181, abcam), анти-NeuN (кролик, 1:500; ABN78, Millipore), анти-PDGFRA (кролик, 1:200; sc-338, Santa Cruz), анти-PPP1R17 (кролик, 1:200; HPA047819, Atlas Antibodies), анти-RECA-1 (миша, 1:50; ab9774). abcam), анти-SCG2 (кролик, 1:100; 20357-1-AP, Proteintech), анти-SOX9 (коза, 1:500; AF3075, R&D Systems), нетрин G1a (коза, 1:100; AF1166, R&D Systems), анти-STEM121 (миша, 1:200; Y40410, Takara Bio), анти-SATB2 (миша, 1:50; ab51502, abcam), анти-GAD65/67 (кролик, 1:400; ABN904, Millipore) та анти-IBA1 (коза, 1:100; ab5076, abkam).使用的一抗是: 抗NeuN（小鼠，1:500；ab104224，abcam）抗CTIP2（大鼠，1:3 00；ab18465，abcam），抗GFAP（兔，1:1000；Z0334，Dako，抗-GF P（鸡，1:1000；GTX13970，GeneTex），抗HNA（小鼠，1:200；ab1911 81，abcam），抗NeuN（兔，1:500；ABN78，Millipore），抗PDGFRA（兔， 1:200；sc-338，Santa Cruz），抗PPP1R17（兔，1:200；HPA047819，Atlas抗体），抗RECA-1(小鼠，1:50；ab9774，abcam），抗SCG2(兔）), 1:100；20357-1-AP，Proteintech），抗SOX9（山羊＊1:500；AF3075，R&D Systems），Netrin G1a（山羊＊,1:100；AF1166，R&D Systems），抗STEM121＠(小鼠, 1:200;使用的一抗是：抗NeuN（小鼠，1:500；ab104224，abcam）抗CTIP2（大鼠，1 :300；ab18465，abcam），抗GFAP(兔，1:1000；Z0334，Dako），抗-GFP（鸡，1:1000；GTX13970，GeneTex），抗HNA（小鼠，1:200；ab 191181，abcam），抗NeuN（兔，1:500；ABN78，Millipore％弔４４抗1: 200；sc-338，Santa Cruz），抗PPP1R17（兔，1:200；HPA047819，Atlas抗体），抗RECA-1（小鼠，1:50；ab9774，abcam），抗SCG2 100；20357-1-AP，Proteintech），抗SOX9（山羊，1:500；AF3075，R&D Systems，Netrin G1a（山羊，1:100；AF1166，R&D Системи）頏1:20, ;Y40410, Takara Bio), анти-SATB2 (миша, 1:50; ab51502, abcam), анти-GAD65/67 (кролик, 1:400; ABN904, Millipore) та анти-IBA1 (коза, 1:100; ab5076, abcam).Основними використаними антитілами були: анти-NeuN (миша, 1:500; ab104224, abcam), анти-CTIP2 (щур, 1:300; ab18465, abcam), анти-GFAP (кролик, 1:1000; Z0334, Dako). , анти-GFP (курка, 1:1000; GTX13970, GeneTex), анти-HNA (миша, 1:200; ab191181, abcam), анти-NeuN (кролик, 1:500; ABN78, Millipore), анти-PDGFRA (кролик, 1:200; sc-338, Santa Cruz), анти-PPP1R17 (кролик, 1:200; HPA047819, антитіло Atlas), анти-RECA-1 (миша, 1:50; ab9774, abcam), анти-SCG2 (кролик), 1:100;20357-1-AP, Proteintech), анти-SOX9 (коза, 1:500; AF3075, R&D Systems), Нетрин G1a (коза, 1:100; AF1166, R&D Systems), анти-STEM121 (мишь, 1:200; Y40410, Takara Bio), анти-SATB2 (мишь, 1:50; ab51502, abcam), анти-GAD65/67 (кролик, 1:400; ABN904, Millipore) і анти-IBA1 (коза, 1:100; аб5076, абкам). 20357-1-AP, Proteintech), анти-SOX9 (коза, 1:500; AF3075, R&D Systems), Netrin G1a (коза, 1:100; AF1166, R&D Systems), анти-STEM121 (миша, 1:200; Y40410, Takara Bio), анти-SATB2 (миша, 1:50; ab51502, abcam), анти-GAD65/67 (кролик, 1:400; ABN904, Millipore) та анти-IBA1 (коза, 1:100; ab5076, abkam).Потім зрізи промивали PBS та інкубували з вторинними антитілами протягом 1 години при кімнатній температурі (заморожені зрізи) або протягом ночі при 4°C (товсті зрізи). Використовували вторинні антитіла Alexa Fluor (Life Technologies), розведені 1:1000 у блокуючому розчині. Після промивання PBS ядра візуалізували за допомогою Hoechst 33258 (Life Technologies). Нарешті, слайди поміщали на мікроскоп з покривними скельцями (Fisher Scientific) за допомогою Aquamount (Polysciences) та аналізували на флуоресцентному мікроскопі Keyence (аналізатор BZ-X) або конфокальному мікроскопі Leica TCS SP8 (Las-X) на зображенні. Зображення обробляли за допомогою програми ImageJ (Фіджі). Для кількісної оцінки частки нейронів людини в t-hCO2 та корі головного мозку щура були зроблені прямокутні зображення шириною 387,5 мкм у центрі t-hCO2, на краю кори головного мозку щура або поблизу нього. Межі трансплантата визначали, оцінюючи зміни прозорості тканин, ядер HNA+ та/або наявність аутофлуоресценції тканин. На кожному зображенні загальну кількість клітин NeuN+ та HNA+ було поділено на загальну кількість клітин NeuN+ в тій самій області. Щоб гарантувати, що враховуються лише клітини з ядрами в площині зображення, до розрахунку включаються лише клітини, які також є Hoechst+. Для зменшення статистичної похибки було усереднено два зображення, розділені щонайменше 1 мм.
За тиждень до збору зразків тварин з трансплантацією hCO3 (приблизно 8 місяців диференціації) помістили в темну кімнату з підстриженими вусами, щоб мінімізувати сенсорну стимуляцію. Виділення ядер проводили, як описано раніше, з деякими модифікаціями. Коротко, t-hCO3 та hCO3 руйнували за допомогою детергентно-механічного лізису клітин та 2-мл скляного тканинного подрібнювача (D8938, Sigma-Aldrich/KIMBLE). Неочищені ядра потім відфільтрували за допомогою фільтра 40 мкм та центрифугували при 320 g протягом 10 хвилин при 4 °C перед проведенням градієнта щільності сахарози. Після етапу центрифугування (320 g протягом 20 хвилин при 4 °C) зразки ресуспендували в 0,04% BSA/PBS з додаванням 0,2 одиниць інгібітора РНКази мкл-1 (40 од. мкл-1, AM2682, Ambion) та пропускали через проточний фільтр 40 мкм. Дисоційовані ядра потім ресуспендували в PBS, що містив 0,02% BSA, та завантажували на чіп Chromium Single Cell 3′ (орієнтовне відновлення 8000 клітин на доріжку). Бібліотеки snRNA-seq були підготовлені за допомогою набору Chromium Single cell 3′ GEM, Library & Gel Bead Kit v3 (10x Genomics). Бібліотеки snRNA-seq були підготовлені за допомогою набору Chromium Single cell 3′ GEM, Library & Gel Bead Kit v3 (10x Genomics). Бібліотеки snRNA-seq були приготовлені за допомогою Chromium Single cell 3′ GEM, Library & Gel Bead Kit v3 (10x Genomics). Бібліотеки snRNA-seq були підготовлені з використанням набору Chromium Single cell 3′ GEM, Library & Gel Bead Kit v3 (10x Genomics). snRNA-seq 文库是使用Chromium Single cell 3′ GEM、Library & Gel Bead Kit v3 (10x Genomics) 制备的。 snRNA-seq 文库是使用Chromium Single cell 3′ GEM、Library & Gel Bead Kit v3 (10x Genomics) 制备的。 Бібліотеку snRNA-seq підготували за допомогою Chromium Single Cell 3′ GEM, Library & Gel Bead Kit v3 (10x Genomics). Бібліотеку snRNA-seq було підготовлено з використанням набору Chromium Single Cell 3′ GEM, Library & Gel Bead Kit v3 (10x Genomics).Бібліотеки з різних зразків були об'єднані та секвеновані за допомогою Admera Health на NovaSeq S4 (Illumina).
Рівні експресії генів для кожного передбачуваного ядерного штрих-коду були кількісно визначені за допомогою пакету програмного забезпечення для аналізу 10x Genomics CellRanger (версія 6.1.2). Зокрема, зчитування були зіставлені з комбінацією референсних геномів людини (GRCh38, Ensemble, версія 98) та щура (Rnor_6.0, Ensemble, версія 100), створених за допомогою команди mkref та використання команди count з командою –include-introns=TRUE для кількісного визначення, включаючи зчитування, зіставлені з інтронніми ділянками. Для зразків t-hCO ядра людини були ідентифіковані на основі консервативної вимоги, щоб принаймні 95% усіх зіставлених зчитувань відповідали геному людини. Всі наступні аналізи були виконані на відфільтрованому масиві штрих-кодів, отриманому з CellRanger, за допомогою пакета R (версія 4.1.2) Seurat (версія 4.1.1)32.
Щоб забезпечити включення до подальшого аналізу лише високоякісних ядер, для кожного зразка було застосовано ітеративний процес фільтрації. Спочатку ідентифікуються та видаляються низькоякісні ядра з менш ніж 1000 знайденими унікальними генами та понад 20% загальної кількості мітохондрій. Згодом, матрицю кількості необроблених генів нормалізували за допомогою регуляризованої негативної біноміальної регресії з використанням функції sctransform(vst.flavor=”v2″), яка також ідентифікувала 3000 найбільш мінливих генів з використанням параметрів за замовчуванням. Зменшення розмірності було проведено для генів верхніх варіабельних груп за допомогою аналізу головних компонентів (PCA) з параметрами за замовчуванням, використовуючи розмірність набору даних 30 (dims = 30 було обрано на основі візуального огляду ділянок колін та використано для всіх зразків та ансамблевих аналізів). Потім ми виконали кілька раундів ітеративної кластеризації (роздільна здатність = 1) для класифікації генів на основі аномально низької кількості генів (медіана нижче 10-го процентиля), аномально високої кількості мітохондріальних генів (медіана вище 95-го процентиля) для ідентифікації та видалення передбачуваних клітин низької якості, кластерів та/або високої частки підозрюваних близнюків, ідентифікованих за допомогою пакета DoubletFinder33 (середній бал DoubletFinder вище 95-го процентиля). Зразки t-hCO (n=3) та зразки hCO (n=3) інтегрували окремо за допомогою функції IntegrateData з вищезазначеними параметрами. Потім Ще один раунд якісної фільтрації інтегрованого набору даних було виконано, як описано вище.
Після видалення ядер низької якості, інтегрований набір даних був згрупований (роздільна здатність = 0,5) та вбудований для візуалізації UMAP34. Маркерні гени для кожного кластера були визначені за допомогою функції FindMarkers з параметрами за замовчуванням, розрахованими з нормалізованих даних експресії генів. Ми ідентифікуємо та класифікуємо основні класи клітин, об'єднуючи референтні набори даних фетальної та дорослої кори з експресією маркерних генів 19,20,21,35 та анотацією. Зокрема, циркулюючі попередники були ідентифіковані за експресією MKI67 та TOP2A. Кластери-попередники визначалися відсутністю мітотичних транскриптів, високим перекриттям з мультипотентними гліальними кластерами-попередниками, описаними в пізній метафазі фетальної кори, та експресією EGFR та OLIG1. Ми використовуємо термін астроцит, щоб охопити кілька станів диференціації астроцитів, від пізньої радіальної глії до дозрівання астроцитів. Кластери астроцитів експресують високі рівні SLC1A3 та AQP4 і, як було показано, відповідають підтипам фетальної радіальної глії та/або дорослим астроцитам. ОПК експресують PDGFRA та SOX10, тоді як олігодендроцити експресують маркери мієлінізації (MOG та MYRF). Глутаматергічні нейрони були ідентифіковані за наявністю нейрональних транскриптів (SYT1 та SNAP25), відсутністю ГАМКергічних маркерів (GAD2) та експресією NEUROD6, SLC17A7, BCL11B або SATB2. GluN-нейрони були додатково розділені на верхні (експресія SATB2 та втрата BCL11B) та глибокі (експресія BCL11B) підкласи. Передбачувані нейрони підпластинок (SP) експресують відомі маркери SP18, такі як ST18 та SORCS1, на додаток до глибоких маркерів GluN. Клітини, подібні до судинного сплетення, були ідентифіковані за експресією TTR, а менінгеоподібні клітини експресували гени, пов'язані з фібробластами, та картували піальні/судинні клітини з довідкового набору даних.
Диференціальний аналіз експресії генів між підкласами t-hCO та hCO було проведено з використанням нещодавно розробленого псевдопакетного методу, відтвореного у зразках, реалізованого за допомогою пакета Libra R (версія 1.0.0). Зокрема, для груп було проведено логарифмічні тести правдоподібності edgeR (версія 3.36.0, пакет R) шляхом підсумовування кількості генів у клітинах для заданого класу клітин для кожної реплікації зразка. Для візуалізації теплової карти нормалізовані значення на мільйон (CPM) обчислюються за допомогою edgeR (функція cpm()) та масштабуються (для досягнення середнього значення = 0, стандартного відхилення = 1). Було проведено аналіз збагачення Gene Ontology (GO) значно підвищених генів t-hCO GluN (скориговане за Бенджаміні-Хохбергом значення P менше 0,05, що експресується щонайменше у 10% клітин t-hCO GluN та кратне збільшення зміни щонайменше у 2 рази), виконаний за допомогою ToppGene Suite (https://toppgene.cchmc.org/)37. Ми використовуємо застосунок ToppFun зі стандартними параметрами та повідомляємо про P-значення, скориговані за Бенджаміні-Хохбергом, розраховані за допомогою гіпергеометричних тестів з анотацією GO.
Щоб зіставити наші кластери одноклітинної РНК-секвенування з анотованими кластерами клітин з референтних досліджень первинної одноклітинної РНК-секвенування або дорослої одноклітинної РНК-секвенування19,20,21,22, ми застосували підхід інтеграції парних наборів даних. Ми використовували робочий процес нормалізації SCTransform (v2) у Seurat для інтеграції та порівняння перекриттів кластерів між наборами даних (використовуючи ті ж параметри, що й вище). Окремі набори даних були випадковим чином підмножені до 500 клітин або ядер на вихідний кластер для обчислювальної ефективності. Використовуючи подібний підхід, як описано раніше, перекриття кластерів було визначено як частку клітин або ядер у кожному об'єднаному кластері, яка перекривалася з міткою референтного кластера. Для подальшої класифікації GluN ми використовували робочий процес TransferData Seurat для даних підмножини GluN, щоб призначити мітки референтного набору даних нашим клітинам GluN.
Щоб оцінити стан дозрівання глобального транскриптома зразків t-hCO та hCO, ми порівняли наші псевдооб'ємні зразки з BrainSpan/psychENCODE23, який складається з великої послідовності РНК, що охоплює розвиток людського мозку. Ми провели PCA на комбінованій матриці експресії генів, нормалізованій за патерном, з кіркових зразків через 10 тижнів після зачаття та пізніше, у 5567 генах (разом з нашими даними), які раніше були ідентифіковані як активні в кіркових зразках BrainSpan (визначені як більше 50% у дисперсії розвитку, поясненій віком, за допомогою кубічної моделі)38. Крім того, ми отримали гени, пов'язані з основними транскриптомними сигнатурами нейророзвитку, використовуючи невід'ємну матричну факторизацію, як описано раніше. Ваги вибірки, розраховані за допомогою процедури невід'ємної матричної факторизації, зображені на рис. 5b з розширеними даними для кожної з п'яти сигнатур, описаних Zhu et al.38. Знову ж таки, транскрипційні маркери, залежні від активності, були отримані з раніше опублікованих досліджень. Зокрема, ERG та LRG були значно підвищені в глутаматергічних нейронах, ідентифікованих за допомогою колекції однофакторної РНК (snRNA-seq) зорової кори миші після візуальної стимуляції з Додаткової таблиці 3 Hrvatin et al.16. LRG, збагачені людиною, були отримані з культур людського плодового мозку, активованих KCl, та зібрані через 6 годин після стимуляції, і відфільтровані гени були значно підвищені у людей, але не у гризунів (Додаткова таблиця 4). Аналіз збагачення набору генів з використанням цих наборів генів був проведений за допомогою однофакторного точного тесту Фішера.
Анестезуйте щурів ізофлураном, видаліть мозок та помістіть його в холодний (приблизно 4°C) оксигенований (95% O2 та 5% CO2) розчин сахарози для зрізів, що містять: 234 мМ сахарози, 11 мМ глюкози, 26 мМ NaHCO3, 2,5 мМ KCl, 1,25 мМ NaH2PO4, 10 мМ MgSO4 та 0,5 мМ CaCl2 (близько 310 мОсм). Корональні зрізи мозку щурів (300–400 мкм), що містять t-hCO2, були зроблені за допомогою вібратома Leica VT1200, як описано раніше39. Потім зрізи перенесли в камеру для секціонування з безперервною оксигенацією при кімнатній температурі, що містить аксіальний розчин рідини з ниркової рідини (aCSF), приготований з: 10 мМ глюкози, 26 мМ NaHCO3, 2,5 мМ KCl, 1,25 мМ NaHPO4, 1 мМ MgSO4, 2 мМ CaCl2 та 126 мМ NaCl (298 мОсм). принаймні за 45 хвилин до запису. Зрізи записували у зануреній камері, де їх безперервно перфузували ацетилсиропом (95% O2 та 5% CO2 у флаконі). Всі дані записували за кімнатної температури. t-hCO нейрони термінували за допомогою боросилікатної скляної піпетки, заповненої розчином, що містив 127 мМ глюконату калію, 8 мМ NaCl, 4 мМ АТФ магнію, 0,3 мМ ГТФ натрію, 10 мМ HEPES та 0,6 мМ EGTA, pH 7,2, внутрішній розчин доводили до KOH (290 мОсм). Для відновлення до розчину для запису додавали біоцитин (0,2%).
Дані були отримані за допомогою підсилювача MultiClamp 700B (Molecular Devices) та дигітайзера Digidata 1550B (Molecular Devices), низькочастотного фільтра на частоті 2 кГц, оцифровані на частоті 20 кГц та проаналізовані за допомогою Clampfit (Molecular Devices), Origin (OriginPro). 2021b, OriginLab) та користувацьких функцій MATLAB (Mathworks). Потенціал переходу був розрахований за допомогою JPCalc, а записи були скориговані до розрахункового значення -14 мВ. Операція IV складається з серії кроків струму з кроком 10-25 пА, від -250 до 750 пА.
Таламус, біла речовина та аферентні нерви S1 електрично стимулювали в таламокортикальних зрізах під час запису нейронів hCO за допомогою патч-клемпу, як описано раніше. Коротко кажучи, мозок розміщували на столі для 3D-друку, нахиленому під кутом 10°, а передню частину мозку розрізали під кутом 35°. Потім мозок приклеювали до поверхні розрізу та робили зріз, зберігаючи виступаючі аксони таламокортикалу. Біполярні вольфрамові електроди (0,5 МОм) встановлювали на другий мікроманіпулятор та стратегічно розташовували для стимуляції чотирьох областей на клітину (внутрішня капсула, біла речовина, S1 та hCO). Записували синаптичні відповіді після фазової стимуляції 300 мкА на частоті 0,03–0,1 Гц.
Нейрони hChR2, що експресують hCO, активували при 480 нм, і світлові імпульси, згенеровані світлодіодом (Prizmatix), подавали через об'єктив ×40 (0,9 NA; Olympus) для реєстрації експресії hChR2 поблизу клітин. Діаметр освітленого поля становить приблизно 0,5 мм, а загальна потужність – 10-20 мВт. Ширину імпульсу встановлювали на 10 мс, що відповідає імпульсу, що подається під час експерименту з поведінкового навчання. Використовували різні частоти стимуляції, від 1 до 20 Гц, але для кількісного визначення використовували лише перший імпульс із серії. Інтервали між ланцюжками зазвичай перевищують 30 с, щоб мінімізувати вплив на синаптичні гальмівні або полегшувальні шляхи. Щоб перевірити, чи була відповідь hChR2 моносинаптичною, ми наносили TTX (1 мкМ) на ванну до зникнення реакції EPSC, а потім наносили 4-амінопіридин (4-AP; 100 мкМ). Як правило, відповідь повертається протягом кількох хвилин, з дещо більшою затримкою між спрацьовуванням світлодіода та генерацією EPSC. NBQX (10 мкМ) використовували для перевірки того, чи зумовлена ​​реакція AMPA-рецепторами.
Чіткі зрізи hCO були створені, як описано раніше. Коротко кажучи, зрізи hCO були залиті в 4% агарозу та перенесені в клітини, що містили 126 мМ NaCl, 2,5 мМ KCl, 1,25 мМ NaH2PO4, 1 мМ MgSO4, 2 мМ CaCl2, 26 мМ NaHCO3 та 10 мМ d-(+)-глюкози. Зрізи нарізали товщиною 200–300 мкм за кімнатної температури за допомогою вібратора Leica VT1200 та зберігали в ASF за кімнатної температури. Потім на зрізах hCO було проведено патч-кемп запис цілих клітин під прямим мікроскопом SliceScope (Scientifica). Зрізи перфузували аксіомою колоїдного рідини (aCSF) (95% O2 та 5% CO2), а сигнали клітин реєстрували за кімнатної температури. Нейрони hCO наносили за допомогою боросилікатної скляної піпетки, заповненої розчином, що містив 127 мМ глюконату калію, 8 мМ NaCl, 4 мМ АТФ магнію, 0,3 мМ ГТФ натрію, 10 мМ HEPES та 0,6 мМ EGTA, внутрішній pH 7,2, відрегульований KOH (осмолярність 290). Для відновлення до внутрішнього розчину додавали 0,2% біоцитину.
Дані були отримані за допомогою програми Clampex (Clampex 11.1, Molecular Devices) з використанням підсилювача MultiClamp 700B (Molecular Devices) та дигітайзера Digidata 1550B (Molecular Devices), низькочастотного фільтра на частоті 2 кГц, оцифровані на частоті 20 кГц та проаналізовані за допомогою програми Clampfit (версія 10.6) для аналізу (Molecular Devices) та користувацьких функцій MATLAB (MATLAB 2019b, Mathworks). Потенціал переходу був розрахований за допомогою JPCalc, а записи були скориговані відповідно до розрахованого потенціалу переходу -14 мВ. Операція IV складається з серії кроків струму з кроком 5-10 пА від -50 до 250 пА.
Для морфологічної реконструкції защемлених нейронів до внутрішнього розчину додавали 0,2% біоцитину (Sigma-Aldrich). Після зрізання клітини праймували щонайменше на 15 хвилин. Потім піпетку повільно втягували протягом 1–2 хвилин, доки зареєстрована мембрана повністю не загерметизується. Після процедури фізіології зрізів, зрізи фіксували протягом ночі при 4°C у 4% PFA, промивали PBS X3 та розводили 1:1000 стрептавідин-кон'югованим DyLight 549 або DyLight 405 (Vector Labs). Клітини, заповнені біоцитином (2%; Sigma-Aldrich), мітили під час запису з використанням патч-клемпа при кімнатній температурі протягом 2 годин. Потім зрізи монтували на предметні стекла за допомогою Aquamount (Thermo Scientific) та візуалізували наступного дня на конфокальному мікроскопі Leica TCS SP8 з використанням масляного імерсійного об'єктива з числовою апертурою ×40 1,3, збільшенням ×0,9–1,0, xy. Частота дискретизації становить приблизно 7 пікселів на мікрон. Z-стеки з інтервалом 1 мкм отримували послідовно, а також виконували мозаїку z-стеків та автоматичне зшивання на основі Leica для покриття всього дендритного дерева кожного нейрона. Потім нейрони відстежували напівручним способом за допомогою інтерфейсу neuTube 40 та генерували SWC-файли. Файли потім завантажували до плагіна SimpleNeuriteTracer41 Fiji (ImageJ, версія 2.1.0; NIH).
Тканину кори головного мозку людини було отримано за інформованою згодою відповідно до протоколу, затвердженого Інституційною етичною радою Стенфордського університету. Два зразки тканини людини після пологів (3 та 18 років) було отримано шляхом резекції лобової кори (середньої лобової звивини) в рамках хірургічного втручання з приводу рефрактерної епілепсії. Після резекції тканину збирали в крижаному NMDG-aCSF, що містить: 92 мМ NMDG, 2,5 мМ KCl, 1,25 мМ NaH2PO4, 30 мМ NaHCO3, 20 мМ HEPES, 25 мМ глюкози, 2 мМ тіосечовини, 5 мМ аскорбату натрію, 3 мМ пірувату натрію, 0,5 мМ CaCl2 4H2O та 10 мМ MgSO4 7H2O. Титрували до pH 7,3-7,4 концентрованою соляною кислотою. Тканини доставляли до лабораторії протягом 30 хвилин, а корональні зрізи брали згідно з описаною вище процедурою.
Усі процедури на тваринах виконували відповідно до рекомендацій щодо догляду за тваринами, затверджених APLAC Стенфордського університету. Щурам (більше 140 днів після трансплантації) індукували анестезію 5% ізофлураном та анестезували 1-3% ізофлураном інтраопераційно. Тварин поміщали у стереотаксичну рамку (Kopf) та підшкірно вводили бупренорфін пролонгованої дії (SR). Череп оголювали, очищали та вставляли 3-5 кісткових гвинтів. Для впливу на t-hCO3 ми генерували стереотаксичні координати з МРТ-зображень. У місці дослідження просвердлювали отвір для бормашини, а волокна (діаметром 400 мкм, NA 0,48, Doric) опускали на 100 мкм нижче поверхні hCO3 та закріплювали до черепа за допомогою стоматологічного цементу, що твердне під дією УФ-випромінювання (Relyx).
Волоконно-фотометричні записи виконували, як описано раніше42. Для реєстрації спонтанної активності щурів поміщали в чисту клітку, а до імплантованого оптоволоконного кабелю підключали оптоволоконний патч-кабель діаметром 400 мкм (Doric), підключений до волоконно-оптичної системи збору фотометричних даних. Під час 10-хвилинного запису рухової активності тварини могли вільно досліджувати клітку. Для реєстрації викликаної активності щурів (більше ніж через 140 днів після трансплантації) анестезували 5% ізофлураном для індукції та 1-3% ізофлураном для підтримки. Тварину поміщали в стереотаксичну рамку (Kopf), а вуса на протилежному боці t-hCO2 обрізали приблизно до 2 см та пропускали через сітку, підключену до п'єзоелектричного актуатора (PI). До імплантованого волокна підключали оптоволоконний патч-кабель діаметром 400 мкм (Doric) та до системи збору даних. Вуса на протилежному боці t-hCO потім відхилялися 50 разів (2 мм при 20 Гц, 2 с на презентацію) у випадкові моменти часу за допомогою п'єзоелектричного приводу протягом 20-хвилинного періоду запису. Використовуйте пакет підтримки Arduino MATLAB для керування часом відхилення за допомогою спеціального коду MATLAB. Події синхронізуються з програмним забезпеченням для збору даних за допомогою імпульсів транзисторно-транзисторної логіки (TTL).
Щурам (більше 140 днів після трансплантації) проводили анестезію 5% ізофлураном та анестезували 1-3% ізофлураном інтраопераційно. Тварин поміщали у стереотаксичну рамку (Kopf) та підшкірно вводили бупренорфін SR та дексаметазон. Череп оголювали, очищали та вводили 3-5 кісткових гвинтів. Для впливу на t-hCO3 ми генерували стереотаксичні координати на основі МРТ-зображень. Кругову краніотомію (діаметром приблизно 1 см) виконували за допомогою високошвидкісного свердла безпосередньо над трансплантованою hCO3. Як тільки кістка стала якомога тоншою, але перед свердлінням усієї кістки, за допомогою щипців видаляли залишки неушкодженого тазового диска, щоб виявити t-hCO3, що знаходиться під нею. Краніотомію заповнювали стерильним фізіологічним розчином, а покривне скло та спеціальний головний штифт прикріплювали до черепа за допомогою стоматологічного цементу, затверділого під дією ультрафіолету (Relyx).
Двофотонну візуалізацію виконували за допомогою багатофотонного мікроскопа Bruker з об'єктивом Nikon LWD (×16, 0,8 NA). Візуалізацію GCaMP6 виконували при 920 нм з 1,4-кратним збільшенням в одній z-площині та 8-кратним середнім значенням 7,5 кадрів/с. Щурам індукували 5% ізофлурановою анестезією та підтримували її 1-3% ізофлураном. Щурів поміщали у спеціально виготовлене кріплення для голови та розташовували під лінзою. Був отриманий 3-хвилинний фоновий запис рухової активності. Протягом 20 хвилин запису 50 вдихів (кожна презентація тривалістю 100 мс) випадковим чином доставляли на подушечку вуса навпроти t-hCO3 за допомогою пікосприцера. Використовуйте пакет підтримки Arduino MATLAB для керування часом пакетної генерації за допомогою спеціального коду MATLAB. Синхронізуйте події з програмним забезпеченням для збору даних (PrairieView 5.5) за допомогою TTL-імпульсів. Для аналізу зображення коригували на рух xy за допомогою афінної корекції в програмі MoCo, запущеній на Фіджі. Екстракція флуоресцентних слідів з окремих клітин за допомогою CNMF-E43. Флуоресценцію екстрагували для кожної області інтересу, перетворювали на криві dF/F, а потім перетворювали на z-показники.
Щурам (більше 140 днів після трансплантації) проводили анестезію 5% ізофлураном та анестезували 1-3% ізофлураном інтраопераційно. Тварин поміщали в стереотаксичну рамку (Kopf) та підшкірно вводили бупренорфін SR та дексаметазон. Вуса на протилежному боці t-hCO2 обрізали приблизно до 2 см та протягували через сітку, з'єднану з п'єзоелектричним приводом. Череп оголювали та очищали. До черепа прикріплювали заземлювальний гвинт з нержавіючої сталі. Для впливу на t-hCO2 ми генерували стереотаксичні координати з МРТ-зображень. Виконували кругову краніотомію (діаметром приблизно 1 см) за допомогою високошвидкісного свердла трохи вище t-hCO2. Як тільки кістка стала якомога тоншою, але перед тим, як свердлити всю кістку, за допомогою щипців видаляли залишок неушкодженого тазового диска, щоб виявити t-hCO2, що знаходиться під нею. Окремі клітини реєстрували за допомогою 32-канальних або 64-канальних кремнієвих зондів високої щільності (Cambridge Neurotech), заземлених на гвинти заземлення та попередньо посилених підсилювачами RHD (Intan). Використовуйте маніпулятор для опускання електродів до цільового місця через краніотомію, яка заповнена стерильним фізіологічним розчином. Збір даних проводився на частоті 30 кГц за допомогою системи збору даних Open Ephys. Запис продовжувався лише тоді, коли ми виявляли висококорельовану ритмічну спонтанну активність у більш ніж 10 каналах, що свідчить про розташування електродів у трансплантаті (на основі даних двофотонної кальцієвої візуалізації). Було отримано 10-хвилинний фоновий запис рухової активності. Потім вуса на протилежному боці t-hCO2 відхилялися 50 разів (2 мм при 20 Гц, 2 с на презентацію) у випадкові моменти часу за допомогою п'єзоелектричного приводу протягом 20-хвилинного періоду запису. Використовуючи пакет підтримки MATLAB для Arduino (MATLAB 2019b), керуйте часом відхилення за допомогою спеціального коду MATLAB. Використовуйте імпульси TTL для синхронізації подій з програмним забезпеченням для збору даних.
Для експериментів з оптичного маркування оптичний патч-корд 200 мкм (Doric), підключений до лазера 473 нм (Omicron), був підключений до оптичного волокна 200 мкм, розміщеного над краніотомією. Безпосередньо перед цим встановіть потужність перемички на 20 мВт. За допомогою маніпулятора опустіть електроди до цільової ділянки через краніотомію, яка заповнена стерильним фізіологічним розчином. На початку запису було випромінено десять імпульсів світла 473 нм (частота 2 Гц, тривалість імпульсу 10 мс). Фоточутливі клітини визначалися як клітини, які демонстрували спайкову реакцію протягом 10 мс світла у 70% або більше випробувань.