Дякуємо, що відвідали Nature.com.Версія браузера, яку ви використовуєте, має обмежену підтримку CSS.Для найкращої роботи радимо використовувати оновлений браузер (або вимкнути режим сумісності в Internet Explorer).Тим часом, щоб забезпечити постійну підтримку, ми відтворюємо сайт без стилів і JavaScript.
Рідина біопсія (РБ) — це концепція, яка швидко набирає популярності в біомедичній галузі.Невелика частина цих фрагментів походить від чужорідних (чужорідних) тканин або організмів.У поточній роботі ми застосували цю концепцію до мідій, дозорного виду, відомого своєю високою здатністю фільтрації морської води.Наші результати показують, що гемолімфа мідій містить фрагменти ДНК, які сильно відрізняються за розміром, від 1 до 5 кб.Секвенування дробовика показало, що велика кількість фрагментів ДНК має чужорідне мікробне походження.
Вплив зміни клімату (ЗК) на біорізноманіття морських екосистем є областю досліджень, яка швидко зростає.На додаток до впливу на біорізноманіття багатоплідних, CC порушує тонкий баланс взаємодії хазяїн-мікроб.Не дивно, що було розроблено відносно велику кількість біомаркерів для моніторингу їхнього здоров’я, часто використовуючи дворівневий підхід із залученням функціональних біомаркерів на основі ферментативної активності або клітинних функцій, таких як життєздатність клітин і фагоцитарна активність [8].Ці методи також включають вимірювання концентрації показників специфічного тиску, які накопичуються в м'яких тканинах після поглинання великої кількості морської води.Проте висока фільтраційна здатність і напіввідкрита кровоносна система двостулкових молюсків дають можливість розробити нові біомаркери гемолімфи за допомогою концепції рідкої біопсії (LB), простого та мінімально інвазивного підходу до лікування пацієнтів.Хоча в LB людини можна знайти кілька типів циркулюючих молекул, ця концепція в основному базується на аналізі секвенування ДНК фрагментів циркулюючої позаклітинної ДНК (ccfDNA) у плазмі.Насправді про наявність циркулюючої ДНК у плазмі крові людини відомо з середини 20 століття [11], але лише в останні роки поява високопродуктивних методів секвенування привела до клінічної діагностики на основі ccfDNA.Наявність цих циркулюючих фрагментів ДНК частково зумовлена ​​пасивним вивільненням геномної ДНК (ядерної та мітохондріальної) після смерті клітини. У здорових людей концентрація сссДНК в нормі низька (<10 нг/мл), але може збільшуватися в 5-10 разів у пацієнтів з різними патологіями або при стресі, що призводить до пошкодження тканин.在 健康 个体 中 ， ccfdna 的 浓度 较 低 （（<10 нг/мл） 但 在 各 种 病理 或 承受 压力 患者 中可 增加 5-10 倍 ， 从而 组织。。。 损伤 损伤 损伤 损伤 损伤 损伤 损伤 损伤 损伤 损伤 Нещодавні дослідження дійсно показали, що кров людини містить багате джерело інформації, яка може бути використана для ідентифікації вірусних і бактеріальних патогенів, і що близько 1% ccfDNA, виявленої в плазмі людини, має чужорідне походження [19].
У цій статті ми використовуємо потенціал LB для аналізу ccfDNA Aulacomya atra, південного виду, який зазвичай зустрічається на субантарктичних островах Кергелен, групі островів на вершині великого плато, яке утворилося 35 мільйонів років тому.виверження вулкану.Використовуючи експериментальну систему in vitro, ми виявили, що фрагменти ДНК у морській воді швидко поглинаються мідіями та потрапляють у відділ гемолімфи.Секвенування дробовика показало, що ccfDNA гемолімфи мідії містить фрагменти ДНК власного та невласного походження, включаючи симбіотичні бактерії та фрагменти ДНК з біомів, типових для холодних вулканічних морських прибережних екосистем.
Дорослі особини (55-70 мм завдовжки) Mytilus platensis (M. platensis) і Aulacomya atra (A. atra) були зібрані з литоральних скелястих берегів Порт-о-Франс (049°21.235 S, 070°13.490 E .).Острови Кергелен у грудні 2018 р. Інші дорослі блакитні мідії (Mytilus spp.) були отримані від комерційного постачальника (PEI Mussel King Inc., Острів Принца Едуарда, Канада) і поміщені в аерований резервуар з контрольованою температурою (4°C), що містить 10–20 л штучного розсолу 32‰.
Для виділення та очищення вкДНК зразки (1,5-2,0 мл) розморожували та обробляли за допомогою набору вкДНК NucleoSnap (Macherey-Nagel, Bethlehen, PA) відповідно до інструкцій виробника.
Для секвенування фрагментів ccfDNA гемолімфи компанія Génome Québec (Монреаль, Квебек, Канада) підготувала бібліотеки рушниць, використовуючи набір Illumina DNA Mix з набору Illumina MiSeq PE75. Об'єднані чтення були анотовані за допомогою BLASTN з використанням бази даних таксономії двостворених молюсків NCBI (значення e < 1e-3 і 90% гомології), а маскування послідовності низької складності було виконано за допомогою DUST [26]. BLASTX також був проведений на несамостійних контигах з використанням бази даних білка nr і RefSeq NCBI (значення e <1e-10 і гомологія 60%).
ДНК-полімеразу Taq (Bio Basic Canada, Markham, ON) використовували для ампліфікації цільових генів ccfDNA..
Мідії, інкубовані в тих самих умовах без додавання ДНК, були контролем.Третій контрольний резервуар містив ДНК без мідій.Для моніторингу якості ДНК у морській воді зразки морської води (20 мкл; три повтори) були взяті з кожного резервуара в зазначений час.Для відстеження плазмідної ДНК мідії LB збирали в зазначений час і аналізували за допомогою кПЦР та ддПЦР.Через високий вміст солі в морській воді аліквоти розводили у воді якості ПЛР (1:10) перед усіма аналізами ПЛР.
ddPCR проводили наступним чином: 95 °C протягом 5 хв, 50 циклів 95 °C протягом 30 с і заданої температури відпалу протягом 1 хв і 72 °C протягом 30 с, 4 °C протягом 5 хв і 90 °C протягом 5 хвилин.
КПЦР проводили з використанням Rotor-Gene® 3000 (Corbett Research, Сідней, Австралія) та специфічних праймерів LGALS7.Усі кількісні ПЛР проводили в 20 мкл за допомогою набору QuantiFast SYBR Green PCR (QIAGEN).Криві плавлення були створені за допомогою послідовних вимірювань при 95 °C протягом 5 с, 65 °C протягом 60 с і 97 °C наприкінці кПЦР.Кожну КПЦР проводили в трьох повторах, за винятком контрольних зразків.
Оскільки мідії відомі своєю високою швидкістю фільтрації, ми спочатку дослідили, чи можуть вони фільтрувати та утримувати фрагменти ДНК, присутні в морській воді.Нас також цікавило, чи накопичуються ці фрагменти в їхній напіввідкритій лімфатичній системі.Ми вирішили цю проблему експериментально, простеживши долю розчинних фрагментів ДНК, доданих до акваріумів з блакитними мідіями.Щоб полегшити відстеження фрагментів ДНК, ми використовували чужорідну (не власну) плазмідну ДНК, що містить ген галектину-7 людини.ddPCR відстежує фрагменти плазмідної ДНК у морській воді та мідіях.Наші результати показують, що якщо кількість фрагментів ДНК у морській воді залишалася відносно постійною протягом часу (до 7 днів) за відсутності мідій, то в присутності мідій цей рівень майже повністю зникав протягом 8 годин (рис. 1a,b).Фрагменти екзогенної ДНК легко виявлялися протягом 15 хв у внутрішньоклапанній рідині та гемолімфі (рис. 1в).Ці фрагменти можна було виявити протягом 4 годин після впливу.Ця фільтруюча активність по відношенню до фрагментів ДНК порівнянна з фільтруючою активністю бактерій і водоростей [31].Ці результати свідчать про те, що мідії можуть фільтрувати та накопичувати чужорідну ДНК у своїх рідинних відсіках.
Відносні концентрації плазмідної ДНК у морській воді за наявності (A) або відсутності (B) мідій, виміряні методом ddPCR.У A результати виражені у відсотках, а межі прямокутників представляють 75-й і 25-й процентилі.Підігнана логарифмічна крива показана червоним кольором, а область, заштрихована сірим, представляє 95% довірчий інтервал.У B червона лінія позначає середнє значення, а синя лінія позначає 95% довірчий інтервал для концентрації.C Накопичення плазмідної ДНК у гемолімфі та клапанній рідині мідій у різний час після додавання плазмідної ДНК.Результати представлені як абсолютна кількість виявлених копій/мл (±SE).
Далі ми досліджували походження ccfDNA у мідій, зібраних з мідійних лож на островах Кергелен, віддаленій групі островів з обмеженим антропогенним впливом.Ми виявили, що середні концентрації ccfDNA гемолімфи в мідіях знаходяться в діапазоні низьких мікрограмів на мл гемолімфи (див. Таблицю S2, Додаткова інформація).Цей діапазон концентрацій значно ширший, ніж у здорових людей (низькі нанограми на мілілітр), але в окремих випадках у онкологічних хворих рівень ccfDNA може досягати кількох мікрограмів на мілілітр [34, 35].Аналіз розподілу ccfDNA гемолімфи за розмірами показав, що ці фрагменти сильно відрізняються за розміром, коливаючись від 1000 bp до 1000 bp.Подібні результати були отримані за допомогою QIAamp Investigator Kit на основі кремнезему, методу, який зазвичай використовується в криміналістиці для швидкого виділення та очищення геномної ДНК із зразків ДНК з низькою концентрацією, включаючи ccfDNA [36].
Репрезентативна електрофореграма ccfDNA гемолімфи мідій.Екстраговано за допомогою набору NucleoSnap Plasma Kit (угорі) та набору QIAamp DNA Investigator Kit.B Скрипковий графік, що показує розподіл концентрацій ccfDNA гемолімфи (±SE) у мідіях.Чорна та червона лінії представляють медіану та перший та третій квартилі відповідно.
Враховуючи напіввідкриту кровоносну систему двостулкових молюсків, багату мікробами морську воду та розподіл ccfDNA мідії за розміром, ми припустили, що ccfDNA гемолімфи мідій може містити багатий і різноманітний пул мікробної ДНК.Щоб перевірити цю гіпотезу, ми секвенували ccfDNA гемолімфи зі зразків Aulacomya atra, зібраних на островах Кергелен, давши понад 10 мільйонів зчитувань, 97,6% з яких пройшли контроль якості.Потім показання класифікували відповідно до власних і невласних джерел, використовуючи бази даних двостулкових BLASTN і NCBI (рис. S1, додаткова інформація).
Однак у цьому дослідженні було неможливо детально описати ядерну геномну ДНК мідій, враховуючи, що геном A. atra не був секвенований або описаний.Ми також підтвердили наявність фрагментів ДНК нашого власного походження шляхом спрямованої ПЛР-ампліфікації тих генів A. atra, які були секвеновані (рис. 3).Подібним чином, враховуючи, що мітохондріальний геном A. atra доступний у відкритих базах даних, можна знайти докази наявності мітохондріальних фрагментів ccfDNA у гемолімфі A. atra.Наявність фрагментів мітохондріальної ДНК підтверджено методом ПЛР-ампліфікації (рис. 3).
Різні мітохондріальні гени були присутні в гемолімфі A. atra (червоні крапки – запасний номер: SRX5705969) і M. platensis (блакитні крапки – запасний номер: SRX5705968), ампліфіковані за допомогою ПЛР.Рисунок адаптовано з Breton et al., 2011 B Ампліфікація супернатанту гемолімфи з A. atra Зберігається на папері FTA.Використовуйте перфоратор діаметром 3 мм, щоб додати безпосередньо в пробірку для ПЛР, що містить суміш для ПЛР.
Перша стратегія використовувала Kraken2, засновану на алгоритмі програму класифікації послідовностей, яка може ідентифікувати мікробні послідовності з точністю, порівнянною з BLAST та іншими інструментами [28].Гаммапротеобактерії були основним класом протеобактерій (44%), включаючи багато Vibrionales (рис. 4b).Методом ddPCR підтверджено наявність фрагментів ДНК Vibrio у ccfDNA гемолімфи A. atra (рис. 4в) [41].Щоб отримати більше інформації про бактеріальне походження ccfDNA, було використано додатковий підхід (рис. S2, додаткова інформація). У цьому випадку зчитування, які перекривалися, були зібрані як зчитування парних кінців і класифіковані як власні (двостулкові) або невласні походження за допомогою BLASTN і значення e 1e-3 і відсікання з >90% гомологією. У цьому випадку зчитування, які перекривалися, були зібрані як зчитування парних кінців і класифіковані як власні (двостулкові) або невласні походження за допомогою BLASTN і значення e 1e-3 і відсікання з >90% гомологією. В цьому випадку перекриваючі чтення були зібрані як чтення з парними кінцями і були класифіковані як власні (двотворчаті моллюски) або чужі за походженням з використанням BLASTN і значення e 1e-3 і відсіку з гомологією> 90%. У цьому випадку зчитування, що перекриваються, збирали як зчитування з парними кінцями та класифікували як нативні (двостулкові) або неоригінальні з використанням BLASTN і значення e 1e-3 та відсікання з гомологією >90%.在 这 种 情况 下 ， 重叠 读数 组装 为 配 末端 读数 ， 使用 使用 使用 blastn 和 1e-3 的 的 值和> 90% 同源性 的 分类 自身 （双 壳类） 非 自身。。。。。。。。。 В цьому випадку перекриваючі чтення були зібрані як чтення з парними кінцями та класифіковані як власні (двотворчаті моллюски) або невласні за походженням з використанням значення e BLASTN і 1e-3 і порога гомології> 90%. У цьому випадку зчитування, що перекриваються, були зібрані як зчитування з парними кінцями та класифіковані як власні (двостулкові) або неоригінальні з використанням значень e BLASTN та 1e-3 та порогу гомології >90%.Оскільки геном A. atra ще не був секвенований, ми використали стратегію складання de novo в асемблері MEGAHIT Next Generation Sequencing (NGS).Загалом 147 188 контигів було ідентифіковано як залежні (двостулкові) походження.Потім ці контиги були розбиті на e-значення 1e-10 за допомогою BLASTN і BLASTX.Ця стратегія дозволила нам ідентифікувати 482 недвостулкові фрагменти, присутні в ccfDNA A. atra.Більше половини (57%) цих фрагментів ДНК було отримано від бактерій, переважно від зябрових симбіонтів, у тому числі сульфотрофних симбіонтів, і від зябрових симбіонтів Solemya velum (рис. 5).
B Мікробне різноманіття двох основних типів (Firmicutes і Proteobacteria).Типова ампліфікація ddPCR C Vibrio spp.А. Фрагменти гена 16S рРНК (синій) у трьох атрагемолімфах.
Загальний профіль таксономічного розподілу метагеномних анотацій контигів (прокаріоти та еукаріоти).B Детальний розподіл фрагментів ДНК бактерій, ідентифікованих за допомогою BLASTN і BLASTX.
Аналіз Kraken2 також показав, що ccfDNA мідії містить фрагменти ДНК архей, включаючи фрагменти ДНК Euryarchaeota (65%), Crenarchaeota (24%) і Thaurmarcheota (11%) (рис. 6a).Наявність фрагментів ДНК, отриманих від Euryarchaeota та Crenarchaeota, раніше знайдених у мікробному співтоваристві каліфорнійських мідій, не повинно викликати подиву [42].Хоча Euryarchaeota часто асоціюється з екстремальними умовами, тепер визнано, що і Euryarchaeota, і Crenarcheota є одними з найпоширеніших прокаріотів у морському кріогенному середовищі [43, 44].Наявність метаногенних мікроорганізмів у мідіях не є дивним, враховуючи нещодавні повідомлення про значні витоки метану з донних витоків на плато Кергелен [45] і можливе мікробне виробництво метану, яке спостерігалося біля узбережжя островів Кергелен [46].
Проте найпоширеніша вірусна ДНК походить із типу нуклеоцитовірусів, також відомого як вірус ядерної цитоплазматичної великої ДНК (NCLDV), який має найбільший геном серед усіх вірусів.У цьому типі більшість послідовностей ДНК належать до сімейств Mimimidoviridae (58%) і Poxviridae (21%), природними господарями яких є хребетні тварини та членистоногі, тоді як невелика частка цих послідовностей ДНК належить до відомих вірусологічних водоростей.Цікаво, що діапазон господарів, які, як відомо, інфіковані вірусом, як визначено секвенуванням ccfDNA гемолімфи, був відносно великим (Малюнок S3, Додаткова інформація).Таким чином, наші результати узгоджуються з попередніми звітами, які показують, що не всі сучасні види цих вірусів вимерли [48] і що ці віруси можуть бути присутніми у віддалених субарктичних морських екосистемах.
Відносно велика частина фрагментів ДНК не була визначена, можливо, через недостатню представлення великої кількості морських видів у геномних базах даних порівняно з наземними видами [49].
У цій статті ми застосовуємо концепцію LB до мідій, стверджуючи, що секвенування ccfDNA гемолімфи може дати розуміння складу морських прибережних екосистем.Зокрема, ми виявили, що 1) гемолімфа мідій містить відносно високі концентрації (мікрограмові рівні) відносно великих (~1-5 кб) циркулюючих фрагментів ДНК;2) ці фрагменти ДНК є як самостійними, так і незалежними. 3) Серед чужорідних джерел цих фрагментів ДНК ми знайшли бактеріальну, архейну та вірусну ДНК, а також ДНК інших багатоклітинних тварин;4) Накопичення цих чужорідних фрагментів ccfDNA у гемолімфі відбувається швидко та сприяє внутрішній фільтраційній активності мідій.На завершення наше дослідження демонструє, що концепція LB, яка досі застосовувалася в основному в галузі біомедицини, кодує багате, але невивчене джерело знань, яке можна використовувати для кращого розуміння взаємодії між дозорними видами та їх середовищем.
Однак, наскільки нам відомо, наше дослідження є першим, у якому повідомляється про виявлення та секвенування ccfDNA у морських видів із відкритою системою циркуляції.Ця анатомічна особливість і фільтруюча здатність мідій можуть, принаймні частково, пояснити різні розмірні характеристики циркулюючих фрагментів ДНК порівняно з іншими видами.[54].Причина такого розподілу за розміром полягає в тому, що основне джерело ccfDNA у плазмі виникає в результаті загибелі клітин, або через загибель клітин, або через некроз циркулюючих гемопоетичних клітин у здорових людей, або через апоптоз пухлинних клітин у хворих на рак (відомий як циркулююча пухлинна ДНК)., ctDNA).Розподіл ccfDNA гемолімфи за розміром, який ми знайшли в мідіях, коливався від 1000 до 5000 bp, що свідчить про те, що ccfDNA мідії має інше походження.Це логічна гіпотеза, оскільки мідії мають напіввідкриту судинну систему і живуть у морських водних середовищах, що містять високі концентрації мікробної геномної ДНК.Насправді наші лабораторні експерименти з використанням екзогенної ДНК показали, що мідії накопичують фрагменти ДНК у морській воді, принаймні через кілька годин вони руйнуються після поглинання клітинами та/або вивільняються та/або зберігаються в різних організаціях.Враховуючи рідкість клітин (як прокаріотичних, так і еукаріотичних), використання внутрішньоклапанних компартментів зменшить кількість ccfDNA з власних джерел, а також із чужих джерел.Враховуючи важливість двостулкового вродженого імунітету та великої кількості циркулюючих фагоцитів, ми додатково гіпотезували, що навіть іноземна CCFDNA збагачується циркулюючими фагоцитами, які накопичують іноземну ДНК при прийомі мікроорганізмів та/або клітинних сміття.У сукупності наші результати показують, що ccfDNA гемолімфи двостулкових молюсків є унікальним сховищем молекулярної інформації та зміцнює їх статус як дозорного виду.
Наші дані вказують на те, що секвенування та аналіз фрагментів ccfDNA гемолімфи бактеріального походження може надати ключову інформацію про бактеріальну флору господаря та бактерії, присутні в навколишній морській екосистемі.Методи секвенування стрілок виявили послідовності комменсальних бактерій A. atra gill, які були б пропущені, якби використовувалися звичайні методи ідентифікації 16S рРНК, частково через зміщення довідкової бібліотеки.Фактично, наше використання даних LB, зібраних з M. platensis у тому самому шарі мідій у Кергелені, показало, що склад асоційованих із зябрами бактеріальних симбіонтів був однаковим для обох видів мідій (рис. S4, додаткова інформація).Ця схожість двох генетично різних мідій може відображати склад бактеріальних угруповань у холодних, сірчаних і вулканічних відкладеннях Кергелена [55, 56, 57, 58].Більш високі рівні мікроорганізмів, що знижують вміст сірки, були добре описані під час збирання мідій у біотурбованих прибережних районах [59], таких як узбережжя Порт-о-Франс.Необхідні додаткові дослідження, щоб визначити взаємозв’язок між морським середовищем, поверхнею морського дна та складом симбіотичних бактерій у мідіях.
Довжина та концентрація ccfDNA гемолімфи, її легкість очищення та висока якість, що дозволяє швидко секвенувати рушницю, є одними з багатьох переваг використання ccfDNA мідій для оцінки біорізноманіття в морських прибережних екосистемах.Наші результати показують, що рідкі біопсії індикаторних видів, таких як мідії, можна використовувати для ідентифікації відносно великої кількості фрагментів вірусу ccfDNA, які, як відомо, інфікують господарів, які зазвичай населяють прибережні морські екосистеми.Подібний розподіл було виявлено, коли ми досліджували віром ccfDNA гемолімфи блакитних мідій (M. platensis), зібраних у тому самому шарі мідій у Кергелені (таблиця S2, додаткова інформація).Стрілка секвенування ccfDNA дійсно є новим підходом, який набирає обертів у вивченні вірому людини або інших видів [21, 37, 64].Цей підхід особливо корисний для вивчення дволанцюгових ДНК-вірусів, оскільки жоден ген не зберігається серед усіх дволанцюгових ДНК-вірусів, що представляють найрізноманітніший і широкий клас вірусів у Балтіморі [65].Хоча більшість цих вірусів залишаються некласифікованими та можуть включати віруси з абсолютно невідомої частини вірусного світу [66], ми виявили, що віроми та діапазони хазяїв мідій A. atra та M. platensis знаходяться між цими двома видами.аналогічно (див. малюнок S3, додаткова інформація).Ця подібність не є дивною, оскільки вона може відображати відсутність вибірковості в поглинанні ДНК, присутньої в навколишньому середовищі.Наразі потрібні майбутні дослідження з використанням очищеної РНК, щоб охарактеризувати віром РНК.
У нашому дослідженні ми використовували дуже строгий конвеєр, адаптований на основі роботи Коварського та його колег [37], які використовували двоетапне видалення об’єднаних зчитувань і контигів до та після складання нативної ccfDNA, що призвело до високої частки некартованих зчитувань.Тому ми не можемо виключити, що деякі з цих некартованих зчитувань все ще можуть мати власне походження, насамперед тому, що у нас немає еталонного генома для цього виду мідій.Ми також використовували цей конвеєр, оскільки нас хвилювали химери між власними та невласними зчитуваннями та довжинами зчитування, створеними Illumina MiSeq PE75.Інша причина більшості неврахованих показань полягає в тому, що більшість морських мікробів, особливо у віддалених районах, таких як Кергелен, не анотовані.Ми використовували Illumina MiSeq PE75, припускаючи, що довжина фрагментів ccfDNA подібна до ccfDNA людини.Для майбутніх досліджень, враховуючи наші результати, які показують, що ccfDNA гемолімфи зчитується довше, ніж люди та/або ссавці, ми рекомендуємо використовувати платформу секвенування, більш придатну для довших фрагментів ccfDNA.Ця практика значно полегшить виявлення додаткових ознак для глибшого аналізу.Отримання наразі недоступної повної послідовності ядерного геному A. atra також значно полегшило б розрізнення ccfDNA від власних і невласних джерел.Враховуючи те, що наше дослідження було зосереджено на можливості застосування концепції рідкої біопсії до мідій, ми сподіваємося, що в міру використання цієї концепції в майбутніх дослідженнях будуть розроблені нові інструменти та конвеєри для збільшення потенціалу цього методу для вивчення мікробного різноманіття мідій.Морська екосистема.
Як неінвазивний клінічний біомаркер, підвищені рівні ccfDNA у плазмі крові людини пов’язані з різними захворюваннями, пошкодженням тканин і стресовими станами [67,68,69].Це відкриття може пояснити, принаймні частково, той факт, що мідії мають напіввідкриту систему кровообігу та накопичують велику кількість чужорідної ДНК завдяки своїй високій фільтраційній активності.З іншого боку, мідії, як і багато безхребетних, можуть бути більш стійкими до пошкодження тканин, спричиненого стресом, тим самим обмежуючи вивільнення ccfDNA у їхній гемолімфі [70, 71].
На сьогоднішній день ДНК-аналіз біорізноманіття у водних екосистемах в основному зосереджений на меташтрихкодуванні екологічної ДНК (еДНК).Однак цей метод зазвичай обмежений в аналізі біорізноманіття, коли використовуються праймери.Таким чином, в певному сенсі наш метод ближче до нещодавно використовуваного методу секвенування рушниць EDNA з високою пропускною здатністю, який здатний безпосередньо послідовно фрагментована ДНК та проаналізувати майже всі організми [72, 73].Аналіз ccfDNA з LB не потребує біопсії тканини, спеціального та іноді дорогого обладнання та логістики, пов’язаної з eDNA або біопсією тканини.Насправді ми нещодавно повідомляли, що ccfDNA з LB можна зберігати та аналізувати за підтримки FTA без підтримки холодового ланцюга, що є серйозною проблемою для досліджень у віддалених районах [76].Окрім високої фільтруючої здатності, ще однією загальновідомою особливістю двостулкових молюсків є хімічний мукополісахаридний склад їх слизу, який сприяє поглинанню вірусів [78, 79].Хоча наявність фрагментів ДНК, отриманих від хазяїна, можна розглядати як обмеження методу порівняно з еДНК, вартість, пов’язана з наявністю такої нативної ccfDNA порівняно з еДНК, водночас зрозуміла через величезну кількість інформації, доступної для досліджень здоров’я.офсетний хост.Ще одна перевага LB над eDNA полягає в тому, що він використовує фагоцитарну активність циркулюючих клітин крові в гемолімфі, яка поглинає мікроорганізми (та їхні геноми).Нарешті, метод використовує високу фільтруючу здатність мідій (у середньому 1,5 л/год морської води) і дводенну циркуляцію, що збільшує змішування різних шарів морської води, що дозволяє захоплювати гетерологічну еДНК.[83, 84].Подібно до аналізу LB, зібраного у людей, цей метод також відкриває можливість вимірювання генетичних та епігенетичних змін у ДНК господаря у відповідь на екзогенні речовини.Наприклад, можна передбачити технології секвенування третього покоління для виконання загальногеномного аналізу метилювання в нативній ccfDNA з використанням секвенування нанопор.Цьому процесу має сприяти той факт, що довжина фрагментів ccfDNA мідії ідеально сумісна з довгозчитуваними платформами секвенування, які дозволяють аналізувати метилювання ДНК у всьому геномі з одного циклу секвенування без необхідності хімічних перетворень.85,86] Це цікава можливість, оскільки було показано, що моделі метилювання ДНК відображають відповідь на стрес навколишнього середовища та зберігаються протягом багатьох поколінь.Таким чином, це може дати цінну інформацію про механізми, що лежать в основі реакції після впливу зміни клімату або забруднюючих речовин [87].Як згадувалося вище, використання LB для оцінки біорізноманіття даної екосистеми також вимагає суворого біоінформаційного трубопроводу, який враховує присутність фрагментів ДНК з джерела.Можна сподіватися, що такі ініціативи, як проект «Геномс морських ссавців» та нещодавно створений проект FISH10K [88], сприятимуть таким аналізом у майбутньому.Застосування концепції LB до морських організмів, які харчуються фільтрами, також сумісно з останніми досягненнями в технології секвенування, що робить її добре придатною для розробки багатоомних біомаркерів для надання важливої ​​інформації про здоров’я морських середовищ існування у відповідь на екологічний стрес.
Дані секвенування генома зберігаються в NCBI Sequence Read Archive https://www.ncbi.nlm.nih.gov/sra/SRR8924808 під Bioprojects SRR8924808.
Brierley AS, Kingsford MJ Вплив зміни клімату на морське життя та екосистеми.
Gissi E, Manea E, Mazaris AD, Fraschetti S, Almpanidou V, Bevilacqua S та ін.Розглянемо сукупний вплив зміни клімату та інших місцевих факторів стресу на морське середовище.
).2020; 7:48.
Seront L, Nicastro CR, Zardi GI, Goberville E. Знижена стійкість до тепла в умовах повторного теплового стресу пояснює високу літню смертність блакитних мідій.9:17498.
Proc Natl Acad Sci США.
Скарпа Ф., Санна Д., Аззена І., Мугетті Д., Черруті Ф., Хоссейні С. та ін.Численні неспецифічні патогени могли спричинити масову загибель Pinna nobilis.життя.2020; 10: 238.
2005 рік;64:468–77.
130:338-65.

Nat Rev Рак.2017; 17: 223-38.
1948 рік;142:241-3.
Кількісне визначення біомолярного аналізу.2019;17:100087.
Nat Rev Clin Oncol.2021 рік;18: 297–312.
Ло Ю.М., Корбетта Н., Чемберлен П.Ф., Рай В., Сарджент І.Л., Редман С.В. та інші.Фетальна ДНК присутня в плазмі та сироватці крові матері.Ланцет.350: 485-7.
Mufarray MN, Wong RJ, Shaw GM, Stevenson DK, Quake SR Дослідження перебігу вагітності та її ускладнень за допомогою циркулюючої позаклітинної РНК у крові жінок під час вагітності.Допедіатія.2020; 8: 605219.
Ollerich M, Sherwood K, Keown P, Schütz E, Beck J, Stegbauer J та ін.Рідинна біопсія: безклітинна ДНК донора використовується для виявлення алогенних уражень у трансплантаті нирки.Nat Rev Nephrol.2021;17: 591–603.
Хуан Ф. К., Ло Ю. М. Інновації в пренатальній діагностиці: секвенування генома плазми матері.Анна доктор медицини.2016; 67: 419-32.
Нац медицина.2021; 27: 115-24.