Дякуємо, що відвідали Nature.com.Версія браузера, яку ви використовуєте, має обмежену підтримку CSS.Для найкращої роботи радимо використовувати оновлений браузер (або вимкнути режим сумісності в Internet Explorer).Тим часом, щоб забезпечити постійну підтримку, ми відтворюємо сайт без стилів і JavaScript.
Неконтрольована кровотеча є однією з основних причин смерті.Досягнення швидкого гемостазу забезпечує виживання обстежуваного як засіб першої допомоги під час бойових дій, дорожньо-транспортних пригод, операцій зі зниження смертності.Нанопористий армований волокном композитний каркас (NFRCS), отриманий із простої гемостатичної плівкоутворюючої композиції (HFFC), як безперервна фаза, може запускати та посилювати гемостаз.Розробка NFRCS заснована на конструкції крила бабки.Структура крил бабки складається з поперечних і поздовжніх стулок, а перетинки крил з’єднані між собою для збереження цілісності мікроструктури.HFFC рівномірно покриває поверхню волокна плівкою нанометрової товщини та з’єднує довільно розподілену товщину бавовни (Ct) (дисперсну фазу), утворюючи нанопористу структуру.Поєднання безперервної та дисперсної фаз знижує собівартість продукту в десятки разів у порівнянні з комерційно доступними продуктами.Модифіковані NFRCS (тампони або браслети) можна використовувати в різних біомедичних цілях.Дослідження in vivo показали, що розроблений Cp NFRCS запускає та посилює процес згортання крові в місці застосування.NFRCS може модулювати мікрооточення та діяти на клітинному рівні завдяки своїй нанопористій структурі, що призводить до кращого загоєння ран у моделі ексцизійної рани.
Неконтрольована кровотеча під час бойових, інтраопераційних та невідкладних ситуацій може становити серйозну загрозу для життя пораненого1.Ці умови додатково призводять до загального підвищення опору периферичних судин, що призводить до геморагічного шоку.Відповідні заходи для контролю кровотечі під час і після операції вважаються потенційно небезпечними для життя2,3.Пошкодження великих судин призводить до масивної крововтрати, що призводить до смертності ≤ 50% у бою та 31% під час операції1.Масивна крововтрата призводить до зменшення об'єму тіла, що зменшує серцевий викид.Підвищення загального периферичного опору судин і прогресуюче порушення мікроциркуляції призводять до гіпоксії в органах життєзабезпечення.Геморагічний шок може виникнути, якщо стан триває без ефективного втручання1,4,5.Інші ускладнення включають прогресування гіпотермії та метаболічного ацидозу, а також порушення коагуляції, що перешкоджає процесу згортання.Важкий геморагічний шок пов’язаний з вищим ризиком смерті6,7,8.При шоку III ступеня (прогресуючому) переливання крові має важливе значення для виживання пацієнта під час інтраопераційної та післяопераційної захворюваності та смертності.Щоб подолати всі вищезазначені ситуації, що загрожують життю, ми розробили композитний каркас, армований нанопористим волокном (NFRCS), який використовує мінімальну концентрацію полімеру (0,5%) із використанням комбінації водорозчинних гемостатичних полімерів.
З використанням волокнистого армування можна створювати економічно ефективні продукти.Безладно розташовані волокна нагадують структуру крила бабки, врівноважену горизонтальними та вертикальними смугами на крилах.Поперечна і поздовжня жилки крила сполучаються з крильовою перетинкою (рис. 1).NFRCS складається з посиленого Ct як каркасної системи з кращою фізичною та механічною міцністю (рис. 1).Завдяки доступності та майстерності виготовлення хірурги віддають перевагу використанню бавовняних ниток (Ct) під час операцій та перев’язок. Отже, враховуючи численні переваги, включаючи > 90% кристалічної целюлози (сприяє посиленню гемостатичної активності), Ct використовувався як скелетна система NFRCS9,10. Отже, враховуючи численні переваги, включаючи > 90% кристалічної целюлози (сприяє посиленню гемостатичної активності), Ct використовувався як скелетна система NFRCS9,10. Таким чином, враховуючи його численні переваги, в тому числі > 90% кристалічної целюлози (бере участь у підвищенні гемостатичної активності), Ct використовували в якості скелетної системи NFRCS9,10. Тому, враховуючи його численні переваги, включаючи >90% кристалічної целюлози (бере участь у підвищенні гемостатичної активності), Ct використовувався як скелетна система NFRCS9,10.因此，考虑到它的多重益处，包括> 90% 的结晶纤维素（有助于增强止血活性，，Ct 被用作NFRCS9 ,10 的骨架系统。因此，考虑到它的多重益处，包括> 90%Тому, враховуючи його численні переваги, включаючи понад 90% кристалічної целюлози (допомагає посилити гемостатичну активність), Ct використовувався як каркас для NFRCS9,10.Ct був поверхнево покритий (спостерігалося утворення нанотовстої плівки) і з’єднаний з гемостатичною плівкоутворювальною композицією (HFFC).HFFC діє як матригель, утримуючи разом випадково розміщені Ct.Розроблена конструкція передає напругу в межах дисперсної фази (армуючих волокон).При мінімальних концентраціях полімеру важко отримати нанопористі структури з хорошою механічною міцністю.Крім того, непросто налаштувати різні форми для різних біомедичних застосувань.
На малюнку показано схему конструкції NFRCS на основі структури крила бабки (A).На цьому зображенні представлена ​​порівняльна аналогія будови крила бабки (пересічні та поздовжні жилки крила з’єднані між собою) та мікрофотографія поперечного перерізу Cp NFRCS (B).Схематичне зображення NFRCS.
NFRC були розроблені з використанням HFFC як безперервної фази для усунення вищезазначених обмежень.HFFC складається з різних плівкоутворюючих гемостатичних полімерів, включаючи хітозан (як основний гемостатичний полімер) з метилцелюлозою (MC), гідроксипропілметилцелюлозою (HPMC 50 cp) і полівініловим спиртом (PVA)) (125 кДа) як опорний полімер, який сприяє утворенню тромбу.формування.Додавання полівінілпіролідину K30 (PVP K30) покращило вологопоглинальну здатність NFRCS.Поліетиленгліколь 400 (PEG 400) був доданий для покращення зшивання полімерів у зв’язаних полімерних сумішах.Три різні гемостатичні композиції HFFC (Cm HFFC, Ch HFFC і Cp HFFC), а саме хітозан з MC (Cm), хітозан з HPMC (Ch) і хітозан з PVA (Cp), були застосовані до Ct.Різноманітні дослідження характеристик in vitro та in vivo підтвердили гемостатичну та ранозагоювальну активність NFRCS.Композитні матеріали, пропоновані NFRCS, можна використовувати для налаштування різних форм риштувань відповідно до конкретних потреб.
Крім того, NFRCS може бути модифікований як пов'язка або рулон для покриття всієї області пошкодження нижніх кінцівок та інших частин тіла.Спеціально для бойових травм кінцівок розроблену конструкцію NFRCS можна змінити на половину руки або всю ногу (додатковий малюнок S11).З NFRCS можна зробити браслет за допомогою тканинного клею, який можна використовувати для зупинки кровотечі внаслідок серйозних суїцидальних травм зап’ястя.Наша головна мета полягає в тому, щоб розробити NFRCS з якомога меншою кількістю полімеру, який можна доставити великій кількості населення (за межею бідності) і який можна помістити в аптечку першої допомоги.Проста, ефективна та економічна конструкція NFRCS приносить користь місцевим громадам і може мати глобальний вплив.
Хітозан (молекулярна маса 80 кДа) і амарант були придбані в Merck, Індія.Гідроксипропілметилцелюлоза 50 Cp, поліетиленгліколь 400 і метилцелюлоза були придбані у Loba Chemie Pvt.LLC, Мумбаї.Полівініловий спирт (молекулярна маса 125 кДа) (87-90% гідролізований) був придбаний у National Chemicals, Гуджарат.Полівінілпіролідин K30 був придбаний у Molychem, Мумбаї, стерильні тампони були придбані у Ramaraju Surgery Cotton Mills Ltd., Таміл Наду, з водою Milli Q (система очищення води Direct-Q3, Merck, Індія) як носій.
NFRCS був розроблений з використанням методу ліофілізації11,12.Усі композиції HFFC (табл. 1) готували за допомогою механічної мішалки.Приготуйте 0,5 % розчин хітозану з використанням 1 % розчину оцтової кислоти у воді безперервним перемішуванням зі швидкістю 800 об/хв на механічній мішалці.Точну масу завантаженого полімеру, вказану в таблиці 1, додавали до розчину хітозану та перемішували до отримання прозорого розчину полімеру.До отриманої суміші додавали PVP K30 і PEG 400 у кількостях, зазначених у таблиці 1, і перемішування продовжували до отримання прозорого в’язкого розчину полімеру.Отриману ванну з розчином полімеру обробляли ультразвуком протягом 60 хвилин для видалення захоплених бульбашок повітря з полімерної суміші.Як показано на додатковому малюнку S1(b), Ct був рівномірно розподілений у кожній лунці 6-лункового планшета (форми), доданого 5 мл HFFC.
Планшет із шести лунками обробляли ультразвуком протягом 60 хвилин для досягнення рівномірного змочування та розподілу HFFC у мережі Ct.Потім заморозьте шестилунковий планшет при -20°C на 8-12 годин.Пластини для заморожування ліофілізували протягом 48 годин для отримання різних композицій NFRCS.Така сама процедура використовується для виготовлення різних форм і структур, наприклад тампонів або циліндричних тампонів або будь-якої іншої форми для різних застосувань.
Точно зважений хітозан (80 кДа) (3%) розчиняють в 1% оцтовій кислоті за допомогою магнітної мішалки.До отриманого розчину хітозану додавали 1% PEG 400 і перемішували протягом 30 хвилин.Отриманий розчин перелийте в квадратну або прямокутну ємність і заморозьте при -80°C на 12 годин.Заморожені зразки ліофілізували протягом 48 годин для отримання пористого Cs13.
Розроблений NFRCS був підданий експериментам з використанням інфрачервоної спектроскопії з перетворенням Фур’є (FTIR) (Shimadzu 8400 s FTIR, Токіо, Японія) для підтвердження хімічної сумісності хітозану з іншими полімерами14,15.Спектри FTIR (ширина спектрального діапазону від 400 до 4000 см-1) усіх досліджуваних зразків були отримані шляхом виконання 32 сканувань.
Швидкість поглинання крові (BAR) для всіх композицій оцінювали за допомогою методу, описаного Chen et al.16 з невеликими змінами.Розроблені NFRK усіх композицій сушили у вакуумній печі при 105°C протягом ночі для видалення залишків розчинника.30 мг NFRCS (початкова маса зразка – W0) і 30 мг Ct (позитивний контроль) поміщали в окремі чашки, що містили премікс 3,8% цитрату натрію.Через заздалегідь визначені проміжки часу, тобто 5, 10, 20, 30, 40 і 60 секунд, NFRCS видаляли, а їх поверхні очищали від неабсорбованої крові шляхом розміщення зразків на КТ на 30 секунд.Остаточна вага крові, поглиненої NFRCS 16, розглядалася (W1) у кожній точці часу.Обчисліть відсоток BAR за такою формулою:
Час згортання крові (BCT) визначали згідно з даними Wang et al.17 .Час, необхідний для згортання цільної крові (кров щурів, попередньо змішаної з 3,8% цитратом натрію) у присутності NFRCS, розраховували як BCT тестового зразка.Різні компоненти NFRCS (30 мг) поміщали у флакони об’ємом 10 мл, що закручуються, та інкубували при 37°C.У флакон додавали кров (0,5 мл) і додавали 0,3 мл 0,2 М CaCl2 для активації згортання крові.Нарешті, перевертайте флакон кожні 15 секунд (до 180°), доки не утвориться міцний згусток.BCT зразка оцінюється за кількістю переворотів vails17,18.На основі BCT було обрано дві оптимальні композиції з NFRCS Cm, Ch та Cp для подальших досліджень характеристик.
BCT композицій Ch NFRCS і Cp NFRCS визначали шляхом впровадження методу, описаного Li et al.19 .Помістіть 15 x 15 мм2 Ch NFRCS, Cp NFRCS і Cs (позитивний контроль) в окремі чашки Петрі (37 °C).Кров, що містить 3,8% цитрату натрію, змішували з 0,2 М CaCl2 в об'ємному співвідношенні 10:1 для початку процесу згортання крові.20 мкл 0,2 М суміші крові щурів CACL2 наносили на поверхню зразка і поміщали в порожню чашку Петрі.Контролем була кров, налита в порожні чашки Петрі без Ct.З фіксованими інтервалами 0, 3 і 5 хвилин зупиніть згортання, додавши 10 мл деіонізованої (DI) води до зразка, що містить чашку, не порушуючи згусток.Нескоагентні еритроцити (еритроцити) проходять гемоліз у присутності деіонізованої води та вивільнення гемоглобіну.Гемоглобін у різні моменти часу (HA (T)) вимірювали при 540 нм (λmax гемоглобін) за допомогою ультрафіолетового спектрофотометра.Абсолютне поглинання гемоглобіну (AH (0)) за 0 хв 20 мкл крові в 10 мл деіонізованої води взяли як еталонний стандарт.Відносне поглинання гемоглобіну (RHA) згорнутої крові розраховували за співвідношенням HA(t)/HA(0) з використанням тієї самої партії крові.
За допомогою аналізатора текстури (Texture Pro CT V1.3 Build 15, Брукфілд, США) визначали адгезійні властивості НФРК до пошкодженої тканини.Притисніть циліндричний посуд з відкритим дном до внутрішньої сторони свинячої шкіри (без шару жиру).Зразки (Ch NFRCS і Cp NFRCS) наносили через канюлю в циліндричні форми для створення адгезії до шкіри свині.Після 3-хвилинної інкубації при кімнатній температурі (RT) (25°C) реєстрували міцність адгезії NFRCS з постійною швидкістю 0,5 мм/с.
Основна особливість хірургічних герметиків полягає у збільшенні згортання крові при зменшенні втрати крові.Коагуляцію без втрат у NFRC оцінювали за допомогою раніше опублікованого методу з незначними модифікаціями 19.Зробіть мікроцентрифужну пробірку (2 мл) (внутрішній діаметр 10 мм) з отвором 8 × 5 мм2 з одного боку центрифужної пробірки (що представляє відкриту рану).NFRC використовується для закриття отвору, а стрічка використовується для ущільнення зовнішніх країв.Додайте 20 мкл 0,2 М CACL2 до мікроцентрифугної трубки, що містить 3,8% цитрату натрію.Через 10 хвилин мікроцентрифужні пробірки виймали з чашок і визначали збільшення маси чашок за рахунок відтоку крові з НФРК (n = 3).Втрата крові CH NFRC та CP NFRC порівнювали з CS.
Цілісність NFRCS у вологому стані була визначена на основі методу, описаного Mishra та Chaudhary21 з незначними модифікаціями.Помістіть NFRCS у колбу Ерленмейєра на 100 мл з 50 мл води та перемішуйте протягом 60 с, не утворюючи верху.Візуальна перевірка та визначення пріоритетності зразків на фізичну цілісність на основі збору.
Міцність зв'язування HFFC з Ct вивчали за допомогою раніше опублікованих методів з незначними модифікаціями.Цілісність поверхневого покриття оцінювали шляхом впливу на NFRK акустичних хвиль (зовнішній стимул) у присутності води milliQ (Ct).Розроблені NFRCS Ch NFRCS і Cp NFRCS поміщали в склянку, наповнену водою, і оброблювали ультразвуком протягом 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 і 30 хвилин відповідно.Після сушіння різницю у відсотках між початковою та кінцевою вагою NFRCS використовували для розрахунку відсотка втрати матеріалу (HFFC).In vitro BCT додатково підтримував міцність зв'язування або втрату поверхневих матеріалів.Ефективність зв'язування HFFC з Ct забезпечує згортання крові та еластичне покриття на поверхні Ct22.
Омогенність розвинених NFRC визначали за допомогою BCT зразків (30 мг), взяті з випадково вибраних загальних місць NFRC.Дотримуйтесь раніше згаданої процедури BCT, щоб визначити відповідність NFRCS.Близькість між усіма п’ятьма зразками забезпечує рівномірне покриття поверхні та осадження HFFC у сітці КТ.
Номінальна площа контакту з кров’ю (NBCA) була визначена, як повідомлялося раніше, з деякими змінами.Згорніть кров, затиснувши 20 мкл крові між двома поверхнями Ct, Ch NFRCS, Cp NFRCS і Cs.Через 1 годину дві частини стента розділили і вручну виміряли площу згустку.Середнім значенням трьох повторень вважали NBCA NFRCS19.
Аналіз динамічної сорбції пари (DVS) використовувався для оцінки ефективності NFRCS для поглинання води із зовнішнього середовища або з місця пошкодження, відповідального за початок коагуляції.DVS оцінює або реєструє поглинання та втрати пари в зразку гравіметрично, використовуючи надчутливі ваги з роздільною здатністю маси ±0,1 мкг.Парціальний тиск пари (відносна вологість) створюється електронним контролером масової витрати навколо зразка шляхом змішування насиченого та сухого газів-носіїв. Згідно з рекомендаціями Європейської фармакопеї, на основі відсотка поглинання вологи зразками, зразки були класифіковані на 4 категорії (0–0,012% мас./мас. − негігроскопічні, 0,2–2% мас./мас. злегка гігроскопічні, 2–15% помірно гігроскопічні та > 15% дуже гігроскопічні)23. Відповідно до вказівок Європейської фармакопеї, на основі відсотка поглинання вологи зразками, зразки були класифіковані на 4 категорії (0–0,012 % мас./мас. − негігроскопічні, 0,2–2 % мас./мас. злегка гігроскопічні, 2–15 % помірно гігроскопічні та > 15 % дуже гігроскопічні)23.Відповідно до рекомендацій Європейської фармакопеї, залежно від відсотка поглинання вологи зразками, зразки були розподілені на 4 категорії (0–0,012 % мас. – негігроскопічні, 0,2–2 % мас. % слабогігроскопічні, 2–15 %).% помірно гігроскопічний і > 15% дуже гігроскопічний)23. % помірно гігроскопічних і > 15 % дуже гігроскопічних)23.根据欧洲药典指南，根据样品吸收水分的百分比，样品分为4 类（0-0,012% w/w- 非吸湿性、0,2-2% w/w /w 轻微吸湿性、2-15 % 适度吸湿，> 15% 非常吸湿）23。根据 欧洲 药典 指南 ， 根据 吸收 水分 的 百分比 样品 分为 分为 分为 类 （（(0-0,012% W/w- 吸)湿 性 、 、 、 、 0,2-2% В/В 轻微 、 2-15% 适度 吸湿 ，> 15 %非常吸湿）23。Відповідно до рекомендацій Європейської фармакопеї зразки поділяються на 4 класи залежно від відсотка вологи, яку поглинає зразок (0-0,012% мас. – негігроскопічні, 0,2-2% мас. слабогігроскопічні, 2-15% мас.).% Юреннон, Гигросопі,> 15 % Ойнья Чіросостопі) 23. % помірно гігроскопічний, > 15 % дуже гігроскопічний) 23.Гігроскопічну ефективність NFCS X NFCS та ЦН NFCS визначали на аналізаторі DVS TA TGA Q5000 SA.Під час цього процесу було отримано відносну вологість (RH) та вагу вибірки в режимі реального часу при 25 ° С24.Вміст вологи обчислюється за допомогою точного аналізу маси NFRCS за допомогою наступного рівняння:
MC – вологість NFRCS.m1 – суха маса НПЗП.m2 — маса NFRCS у реальному часі при заданій відносній вологості.
Загальну площу поверхні оцінювали за допомогою експерименту з адсорбції азоту рідким азотом після спорожнення зразків при 25 °C протягом 10 годин (<7 × 10–3 торр). Загальну площу поверхні оцінювали за допомогою експерименту з адсорбції азоту рідким азотом після спорожнення зразків при 25 °C протягом 10 годин (<7 × 10–3 торр). Загальна площа поверхні оцінювалася за допомогою експерименту з адсорбції азоту рідинним азотом після опорожнення зразків при 25 °С протягом 10 годин (< 7 × 10–3 Торр). Загальну площу поверхні оцінювали за допомогою експерименту з адсорбції азоту рідким азотом після того, як зразки спорожнювали при 25 °C протягом 10 годин (<7 × 10–3 торр).在 25 ° C 清空 样品 10 小时 （<7 × 10-3 Торр） ， 使用 液氮 的 氮 吸附 实验 估计 总表。。。。Температура 25°C Окуая Плохаде ПоВерьостер Оцеваласьє Спульвавадемксприми, а -кимпспопспорспотспорспорспорспспорспорспорспорспорспорспспорспорспорспорспорспорспорспойотом. Разцо В-Теніе 10 чАСОВ ПРІ 25 ° C (<7 × 10-3 Торрр). Загальну площу поверхні оцінювали за допомогою експериментів з адсорбції азоту з рідким азотом після того, як зразки випорожнювали протягом 10 годин при 25°C (<7 x 10-3 торр).Загальна площа поверхні, об'єм пор та розмір пор NFRCS визначали за допомогою Quantachrome з Nova 1000E, Австрія, використовуючи програмне забезпечення Rs 232.
Приготуйте 5% еритроцитів (фізіологічний розчин як розчинник) із цільної крові.Потім перенесіть аліквоту HFFC (0,25 мл) у 96-лунковий планшет і 5% маси еритроцитів (0,1 мл).Інкубуйте суміш при 37 ° С протягом 40 хвилин.Суміш еритроцитів і сироватки вважали позитивним контролем, а суміш фізіологічного розчину і еритроцитів — негативним контролем.Гемаглютинацію визначали за шкалою Стажицького.Пропоновані масштаби наступні: + + + + щільні зернисті агрегати;+ + + гладкі нижні колодки з вигнутими краями;+ + гладкі нижні колодки з розірваними краївами;+ вузькі червоні кільця по краях гладких подушечок;– (негативний) дискретна червона кнопка 12 у центрі нижнього колодязя.
Гемосумісність NFRCS вивчали за методикою Міжнародної організації зі стандартизації (ISO) (ISO10993-4, 1999)26,27.Гравіметричний метод, описаний Singh et al.Були внесені незначні модифікації для оцінки утворення тромбу в присутності або на поверхні NFRCS.500 мг Cs, Ch NFRCS і Cp NFRCS інкубували у фосфатно-сольовому буфері (PBS) протягом 24 годин при 37°C.Через 24 години PBS видаляли, а NFRCS обробляли 2 мл крові, що містить 3,8% цитрату натрію.На поверхні NFRCS додайте 0,04 мл 0,1 М CaCl2 до інкубованих зразків.Через 45 хвилин додають 5 мл дистильованої води для припинення коагуляції.Згорнуту кров на поверхні НФРК обробляли 36-38% розчином формальдегіду.Фіксовані формальдегідом згустки висушували і зважували.Відсоток тромбозу оцінювали шляхом обчислення ваги скла без крові та зразка (негативного контролю) та скла з крові (позитивний контроль).
В якості первинного підтвердження зразки візуалізували під оптичним мікроскопом, щоб зрозуміти здатність поверхневого покриття HFFC, з’єднаних між собою Ct і мережі Ct утворювати пори.Тонкі зрізи СН та CP від ​​NFRCS обрізали лезом скальпеля.Отриманий розділ поміщали на скляну гірку, покриту кришкою, а краї фіксували клеєм.Підготовлені слайди переглядали під оптичним мікроскопом, а фотографії були зроблені при різних збільшеннях.
Полімерне осадження в мережах КТ візуалізували за допомогою флуоресцентної мікроскопії на основі методу, описаного Rice et al.29. Композицію HFFC, використану для композиції, змішували з флуоресцентним барвником (амарант), і NFRCS (Ch & Cp) готували згідно з згаданим раніше методом. Композицію HFFC, використану для композиції, змішували з флуоресцентним барвником (амарант), і NFRCS (Ch & Cp) готували згідно з згаданим раніше методом.Композицію HFFC, використану для складання, змішували з флуоресцентним барвником (амарант) і NFRCS (Ch і Cp) отримували згідно з раніше згаданим способом.将用于配方的HFFC 组合物与荧光染料（苋菜）混合，并按照前面提到的方法制备NFRCS（Ch & Cp）。将用于配方的HFFC 组合物与荧光染料（苋菜）混合，并按照前面提到的方法制备NFRCS（Ch & Cp）。Склад HFFC, що використовується в рецептурі, змішували з флуоресцентним барвником (амарант) і отримували NFRC (CH і CP), як згадувалося раніше.З отриманих зразків вирізали тонкі зрізи НФРК, поміщали на предметне скло та накривали покривними скельцями.Спостерігайте за підготовленими предметними стеклами під флуоресцентним мікроскопом, використовуючи зелений фільтр (310-380 нм).Зображення були зроблені при 4-кратному збільшенні, щоб зрозуміти співвідношення Ct і надлишкове відкладення полімеру в мережі Ct.
Поверхневу топографію NFRCS CH та CP визначали за допомогою мікроскопа атомної сили (AFM) з ультра гострим консонею в режимі постукування: 42 н/м, 320 кГц, ROC 2-5 нм, Брукер, Тайвань.Шорсткість поверхні визначали середньоквадратичним методом (RMS) за допомогою програмного забезпечення (Scanning Probe Image Processor).Для перевірки однорідності поверхні на 3D-зображеннях було відтворено різні місця NFRCS.Стандартне відхилення оцінки для даної області визначається як шорсткість поверхні.Рівняння RMS було використано для кількісного визначення шорсткості поверхні NFRCS31.
Дослідження на основі FESEM проводили з використанням FESEM, SU8000, HI-0876-0003, Hitachi, Tokyo, щоб зрозуміти морфологію поверхні Ch NFRCS і Cp NFRCS, які показали кращий BCT, ніж Cm NFRCS.Дослідження FESEM проводили за методикою, описаною Zhao et al.32 з незначними модифікаціями.NFRCS Від 20 до 30 мг Ch NFRCS і Cp NFRCS попередньо змішували з 20 мкл 3,8% цитрату натрію, попередньо змішаного з кров’ю щурів.20 мкл 0,2 М CaCl2 додавали до оброблених зразків крові для ініціації коагуляції та зразки інкубували при кімнатній температурі протягом 10 хвилин.Крім того, надлишки еритроцитів видаляли з поверхні NFRCS шляхом промивання сольовим розчином.
Наступні зразки обробляли 0,1% глутаровим альдегідом і потім сушили в духовці з гарячим повітрям при 37°C для видалення вологи.Висушені зразки покривали та аналізували 32.Іншими зображеннями, отриманими під час аналізу, були утворення згустку на поверхні окремих волокон бавовни, відкладення полімеру між Ct, морфологія (форма) еритроцитів, цілісність згустку та морфологія еритроцитів у присутності NFRCS.Необроблені ділянки NFRCS і ділянки NFRCS, оброблені Ch і Cp, інкубовані з кров’ю, сканувалися на елементарні іони (натрій, калій, азот, кальцій, магній, цинк, мідь і селен)33.Порівняйте відсоток елементарних іонів між обробленими та необробленими зразками, щоб зрозуміти накопичення елементарних іонів під час утворення згустку та однорідність згустку.
Товщина покриття поверхні Cp HFFC на поверхні Ct була визначена за допомогою FESEM.Поперечні зрізи Cp NFRCS були вирізані з каркаса та покриті напиленням.Отримані зразки напиленого покриття спостерігали за допомогою FESEM і вимірювали товщину поверхневого покриття 34, 35, 36.
Рентгенівська мікроКТ забезпечує 3D неруйнівне зображення високої роздільної здатності та дозволяє досліджувати внутрішнє структурне розташування НФРК.Мікро-КТ використовує промінь рентгенівського випромінювання, що проходить через зразок, для реєстрації локального лінійного коефіцієнта ослаблення рентгенівського випромінювання в зразку, що допомагає отримати морфологічну інформацію.Внутрішнє розташування Ct у Cp NFRCS і Cp NFRCS, оброблених кров’ю, було досліджено за допомогою мікроКТ, щоб зрозуміти ефективність поглинання та згортання крові в присутності NFRCS37,38,39.Тривимірні структури оброблених і необроблених крові зразків Cp NFRCS були реконструйовані за допомогою мікро-КТ (V|tome|x S240, Фенікс, Німеччина).Використовуючи програмне забезпечення VG STUDIO-MAX версії 2.2, було зроблено кілька рентгенівських знімків під різними кутами (в ідеалі охоплення 360°) для створення 3D-зображень для NFRCS.Зібрані дані проекції були реконструйовані в 3D-об’ємні зображення за допомогою відповідного простого програмного забезпечення 3D ScanIP Academic.
Крім того, для розуміння розподілу згустку до NFRC додавали 20 мкл переміщеної цитраної крові та 20 мкл 0,2 М Cacl2 для ініціювання згортання крові.Підготовлені зразки залишаються затверденими.Поверхню NFRK обробляли 0,5% глутаровим альдегідом і сушили в духовці з гарячим повітрям при 30–40 °C протягом 30 хв.Згусток крові, що утворився на NFRCS, сканували, реконструювали та візуалізували 3D-зображення тромбу.
Антибактеріальні аналізи проводили на NFRC CP (найкраще порівняно з НФРС) за допомогою описаного раніше методу з незначними модифікаціями.Антибактеріальну активність Cp NFRCS і Cp HFFC визначали за допомогою трьох різних тест-мікроорганізмів [S.aureus (грампозитивні бактерії), E.coli (грамнегативні бактерії) і білі Candida (C.albicans)], що вирощувалися на агарі в чашках Петрі в інкубаторі.Рівномірно посіяти 50 мл розведеної суспензії бактеріальної культури в концентрації 105-106 КУО мл-1 на агаризоване середовище.Перелийте середовище в чашку Петрі та дайте йому застигнути.На поверхні планшета з агаром зробили лунки для заповнення HFFC (3 лунки для HFFC і 1 для негативного контролю).Додайте 200 мкл HFFC до 3 лунок і 200 мкл pH 7,4 PBS до 4-ї лунки.З іншого боку чашки Петрі помістіть диск 12 мм Cp NFRCS на затверділий агар і змочіть PBS (pH 7,4).Таблетки ципрофлоксацину, ампіциліну та флуконазолу вважаються еталонними стандартами для Staphylococcus aureus, Escherichia coli та Candida albicans.Виміряйте зону інгібування вручну та зробіть цифрове зображення зони інгібування.
Після інституційного етичного схвалення дослідження було проведено в Медичному коледжі освіти та досліджень Кастурби в Маніпалі, штат Карнатака, на півдні Індії.Експериментальний протокол in vitro TEG був розглянутий і схвалений Інституційним етичним комітетом Медичного коледжу Кастурба, Маніпал, Карнатака (IEC: 674/2020).Суб'єктів набирали з добровольчих донорів крові (у віці від 18 до 55 років) з банку крові лікарні.Крім того, від волонтерів було отримано інформовану форму згоди для збору зразків крові.Ративне TEG (N-TEG) ​​використовувався для вивчення впливу рецептури CP HFFC на цільну кров, вказану цитратом натрію.N-TEG широко визнаний своєю роллю в реанімації в точці догляду, що створює проблеми для клініцистів через потенціал клінічно значущої затримки результатів (звичайні тести на коагуляцію).Аналіз N-TEG проводили за допомогою цільної крові.Від усіх учасників було отримано інформовану згоду та детальну історію хвороби.Дослідження не включало учасників з гемостатичними або тромботичними ускладненнями, такими як вагітність/після пологів або захворювання печінки.Суб'єкти, які приймали препарати, що впливають на каскад коагуляції, також були виключені з дослідження.Основні лабораторні тести (гемоглобін, протромбіновий час, активований тромбопластин та кількість тромбоцитів) проводили для всіх учасників відповідно до стандартних процедур.N-TEG визначає в'язкопружність згустку крові, початкову структуру згустку, взаємодію частинок, зміцнення згустку та лізис згустку.Аналіз N-TEG надає графічні та числові дані про сукупні ефекти кількох клітинних елементів і плазми.Аналіз N-TEG проводили на двох різних об’ємах Cp HFFC (10 мкл і 50 мкл).У результаті до 10 мкл Cp HFFC додавали 1 мл цільної крові з лимонною кислотою.Додайте 1 мл (Cp HFFC + цитратна кров), 340 мкл змішаної крові до 20 мкл 0,2 М CaCl2, що містить чашку для ТЕГ.Після цього страви TEG завантажували в TEG® 5000, США для вимірювання R, K, Alpha Congle, MA, G, CI, TPI, EPL, LY 30% зразків крові в присутності CP HFFC41.
Протокол дослідження in vivo було розглянуто та схвалено Інституційним комітетом з етики тварин (IAEC), Медична школа Кастурби, Інститут вищої освіти Маніпал, Маніпал (IAEC/KMC/69/2020).Усі досліди на тваринах проводили відповідно до рекомендацій Комітету з контролю та нагляду за експериментами на тваринах (CPCSEA).Усі дослідження NFRCS in vivo (2 × 2 см2) проводили на самках щурів Wistar (вагою від 200 до 250 г).Всі тварини акліматизувалися при температурі 24-26°С, тварини мали вільний доступ до стандартного корму та води ad libitum.Усіх тварин випадковим чином розділили на різні групи, кожна група складалася з трьох тварин.Усі дослідження проводилися відповідно до Дослідження на тваринах: звіт про експерименти in vivo 43 .Перед дослідженням тварин анестезували шляхом внутрішньоочеревинного (в/б) введення суміші 20-50 мг кетаміну (на 1 кг маси тіла) і 2-10 мг ксилазину (на 1 кг маси тіла).Після дослідження розраховували об’єм кровотечі, оцінюючи різницю між початковою та кінцевою вагою зразків, середнє значення, отримане за трьома пробами, брали за об’єм кровотечі зразка.
Модель ампутації хвоста щура була реалізована, щоб зрозуміти потенціал NFRCS для модулювання кровотечі під час травми, бою або дорожньо-транспортної пригоди (модель травми).Відріжте 50% хвоста лезом скальпеля та помістіть на повітря на 15 с, щоб забезпечити нормальну кровотечу.Крім того, тестові зразки розміщували на хвості щура, застосовуючи тиск (CT, CS, CH NFRCS та CP NFRC).Кровотечі та ПКТ повідомлялися для тестових зразків (n = 3) 17,45.
Ефективність контролю тиску NFRC в бою досліджувалася на моделі поверхневої стегнової артерії.Стегнова артерія піддається оголенню, проколюється 24 г трокара і кровоточить протягом 15 секунд.Після того, як спостерігається неконтрольована кровотеча, тестовий зразок розміщується в місці проколу з нанесеним тиском.Відразу після застосування тестового зразка був записаний час згортання та гемостатичну ефективність спостерігали протягом наступних 5 хвилин.Ту ж процедуру повторювали з Cs і Ct46.
Доулінг та ін.47 запропонували модель пошкодження печінки для оцінки гемостатичного потенціалу гемостатичних матеріалів у контексті інтраопераційної кровотечі.BCT реєстрували для зразків Ct (негативний контроль), каркасу Cs (позитивний контроль), зразків Ch NFRCS та зразків Cp NFRCS.Надпечінкову порожнисту вену щура оголювали шляхом серединної лапаротомії.Після цього ножицями вирізали дистальну частину лівої частки.Зробіть надріз печінки лезом скальпеля і дайте їй потекти кров'ю протягом декількох секунд.Точно зважені досліджувані зразки Ch NFRCS і Cp NFRCS поміщали на пошкоджену поверхню без будь-якого позитивного тиску та записували BCT.Контрольна група (Ct) потім застосувала тиск, а потім Cs 30 s47, не порушуючи пошкодження.
Дослідження загоєння ран in vivo проводили з використанням моделі ексцизійної рани для оцінки ранозагоювальних властивостей розроблених NFRCS на основі полімерів.Моделі ексцизійних ран були відібрані та виконані згідно з раніше опублікованими методами з незначними модифікаціями19,32,48.Всі тварини знеболювали, як описано раніше.Використовуйте біопсію (12 мм), щоб зробити круглий глибокий розріз у шкірі спини.Підготовлені ділянки рани були пов’язані Cs (позитивний контроль), Ct (визнаючи, що ватні диски заважають загоєнню), Ch NFRCS і Cp NFRCS (експериментальна група) і негативний контроль без будь-якої обробки.Кожен день дослідження площу рани вимірювали у всіх щурів.Використовуйте цифрову камеру, щоб сфотографувати область рани та надіти нову заправку.Відсоток закриття рани вимірювали наступною формулою:
Виходячи з відсотка закриття рани на 12-й день дослідження, шкіру щурів найкращої групи вирізали ((Cp NFRCS) і контрольну групу) і досліджували фарбуванням H&E і трихромним фарбуванням за Массоном. Виходячи з відсотка закриття рани на 12-й день дослідження, шкіру щурів найкращої групи вирізали ((Cp NFRCS) і контрольну групу) і досліджували фарбуванням H&E і трихромним фарбуванням за Массоном.За відсотком закриття рани на 12-ту добу дослідження у щурів кращої групи ((Cp NFRCS) і контрольної групи) вирізали шкіру та досліджували її забарвленням гематоксилін-еозином і трихромом Массона.根据研究第12天的伤口闭合百分比，切除最佳组((Cp NFRCS)和对照组)的大鼠皮肤，进行H&E染色和Mas син三色染色研究。根据 研究 第 12 天 伤口 闭合 百分比 百分比 ， 切除 佳组 佳组 ((cp nfrcs) 和 对照组) 的 皮肤 ， 进行 h & e 染色 和 眳组）））））Щурів у найкращій групі ((Cp NFRCS) і контрольні групи) вирізали для фарбування гематоксилін-еозином і трихромного фарбування за Массоном на основі відсотка закриття рани на 12 день дослідження.Впроваджену процедуру фарбування проводили згідно з раніше описаними методами49,50.Коротко, після фіксації в 10% формаліні зразки зневоднювали за допомогою ряду градуйованих спиртів.Використовуйте міктом для отримання тонких зрізів (товщиною 5 мкм) висіченої тканини.Тонкі послідовні зрізи контролю та CP NFRC обробляли гематоксиліном та еозином для вивчення гістопатологічних змін.Трихромна пляма Массона була використана для виявлення утворення колагенових фібрил.Отримані результати сліпо вивчали патологами.
Стабільність зразків Cp NFRCS вивчали при кімнатній температурі (25°C ± 2°C/60% RH ± 5%) протягом 12 місяців51.Cp NFRCS (знебарвлення поверхні та ріст мікроорганізмів) було візуально перевірено та перевірено на стійкість до згортання та BCT відповідно до вищезазначених методів, викладених у розділі «Матеріали та методи».
Масштабованість і відтворюваність Cp NFRCS перевіряли шляхом приготування Cp NFRCS розміром 15×15 см2.Крім того, 30 мг зразків (n = 5) вирізали з різних фракцій Cp NFRCS і BCT досліджуваних зразків оцінювали, як описано раніше в розділі «Методи».
Ми намагалися розробити різні форми та структури, використовуючи композиції Cp NFRCS для різних біомедичних застосувань.Такі форми або конфігурації включають конічні тампони для носових кровотеч, стоматологічних процедур і циліндричні тампони для вагінальних кровотеч.
Усі набори даних виражено як середнє ± стандартне відхилення та проаналізовано за допомогою дисперсійного аналізу з використанням Prism 5.03 (GraphPad, Сан-Дієго, Каліфорнія, США) з подальшим тестом множинних порівнянь Бонферроні (*p<0,05).
Усі процедури, проведені в дослідженнях на людях, відповідали стандартам Інституту та Національної дослідницької ради, а також Гельсінкській декларації 1964 року та її подальшим поправкам або подібним етичним стандартам.Всіх учасників повідомили про особливості дослідження та його добровільну природу.Після збору дані про учасників залишаються конфіденційними.Експериментальний протокол in vitro TEG був розглянутий і схвалений Інституційним етичним комітетом Медичного коледжу Кастурба, Маніпал, Карнатака (IEC: 674/2020).Волонтери підписали поінформовану згоду на збір зразків крові.
Усі процедури, проведені в дослідженнях на тваринах, проводилися відповідно до медичного факультету Кастуби Інституту вищої освіти Маніпала (IAEC/KMC/69/2020).Усі розроблені експерименти на тваринах проводилися відповідно до вказівок Комітету з контролю та нагляду за експериментами на тваринах (CPCSEA).Усі автори дотримуються вказівок щодо прийому.
Спектри FTIR усіх NFRCS були проаналізовані та порівняні зі спектром хітозану, показаним на малюнку 2A.Додаткова таблиця S1 показує значення спектру поглинання FTIR NFRCS для хітозану (репортера), чистого хітозану, CM, CH та CP.Спектри FTIR усіх NFRCS (Cm, Ch та Cp) показали такі самі характерні смуги поглинання, що й чистий хітозан, без будь-яких значних змін (рис. 2A).Результати FTIR підтвердили відсутність хімічних або фізичних взаємодій між полімерами, використаними для розробки NFRCS, що вказує на те, що використані полімери є інертними.
Характеристика in vitro Cm NFRCS, Ch NFRCS, Cp NFRCS та Cs.(A) представляє комбіновані спектри FTIR композицій хітозану та Cm NFRCS, Ch NFRCS та Cp NFRCS під час стиснення.(B) a) Швидкість поглинання NFRCS Cm, Ch, Cp і Cg (n = 3);Зразки Ct показали вищий BAR, оскільки ватний тампон має вищу ефективність поглинання;b) Кров після поглинання крові. Ілюстрація поглиненого зразка.Графічне представлення BCT тестового зразка C (Cp NFRCS мав найкращий BCT (15 с, n = 3)). Дані в C, D, E та G були показані як середнє ± стандартне відхилення, а смуги помилок представляють стандартне відхилення, ***p < 0,0001. Дані в C, D, E та G були показані як середнє ± стандартне відхилення, а смуги помилок представляють стандартне відхилення, ***p < 0,0001. Дані в C, D, E і G представлені як середнє ± стандартне відхилення, а планки погрішностей представляють стандартне відхилення, ***p <0,0001. Дані в C, D, E та G представлені як середнє значення ± стандартне відхилення, а стовпчики помилок представляють стандартне відхилення, ***p<0,0001. C、D、E 和G 中的数据显示为平均值± SD，误差线代表SD，***p < 0,0001。 C、D、E 和G 中的数据显示为平均值± SD，误差线代表SD，***p < 0,0001。 Дані в C, D, E та G наведено як середнє значення ± стандартне відхилення, стовпчики помилок представляють стандартне відхилення, ***p<0,0001.