Дякуємо, що відвідали Nature.com.Версія браузера, яку ви використовуєте, має обмежену підтримку CSS.Для найкращої роботи радимо використовувати оновлений браузер (або вимкнути режим сумісності в Internet Explorer).Тим часом, щоб забезпечити постійну підтримку, ми відтворюємо сайт без стилів і JavaScript.
Плодючість птахів залежить від їх здатності зберігати достатню кількість життєздатної сперми протягом тривалого періоду часу в канальцях для зберігання сперми (SST).Точний механізм, за допомогою якого сперматозоїди потрапляють, перебувають у SST і залишають його, залишається суперечливим.Сперма курей шаркаси виявила високу схильність до аглютинації, утворюючи рухливі ниткоподібні пучки, що містять багато клітин.Через складність спостереження за рухливістю та поведінкою сперматозоїдів у непрозорій матковій трубі ми використали мікрофлюїдний пристрій із поперечним перерізом мікроканалів, подібним до поперечного перерізу сперматозоїдів, для вивчення аглютинації та рухливості сперматозоїдів.У цьому дослідженні обговорюється, як утворюються пучки сперматозоїдів, як вони рухаються та їхня можлива роль у подовженні перебування сперматозоїдів у SST.Ми досліджували швидкість сперматозоїдів і реологічну поведінку, коли потік рідини генерувався в мікрофлюїдному каналі за допомогою гідростатичного тиску (швидкість потоку = 33 мкм/с).Сперматозоїди мають тенденцію плисти проти течії (позитивна реологія), і швидкість пучка сперматозоїдів значно знижена порівняно з одиничними сперматозоїдами.Було виявлено, що пучки сперматозоїдів рухаються по спіралі та збільшуються в довжину та товщину, коли набирається більше окремих сперматозоїдів. Спостерігали, як пучки сперматозоїдів наближаються до бічних стінок мікрофлюїдних каналів і прилипають до них, щоб уникнути занесення швидкістю потоку рідини > 33 мкм/с. Спостерігали, як пучки сперматозоїдів наближаються до бічних стінок мікрофлюїдних каналів і прилипають до них, щоб уникнути занесення швидкістю потоку рідини > 33 мкм/с. Було помічено, що пучки сперматозоїдів наближаються і прилипають до боковим стенкам мікрофлюїдних каналів, щоб уникнути сметанія зі швидкістю потоку рідини> 33 мкм / с. Було виявлено, що пучки сперматозоїдів наближаються до бічних стінок мікрофлюїдних каналів і прилипають до них, щоб уникнути змітання при швидкості потоку рідини >33 мкм/с.观察到精子束接近并粘附在微流体通道的侧壁上，以避免被流体流速> 33 мкм/с 扫过。33 мкм/с 扫过。 Було помічено, що пучки сперматозоїдів наближаються і прилипають до бічних стенках мікрожидкостного каналу, щоб уникнути метання потоку рідини зі швидкістю > 33 мкм/с. Було виявлено, що пучки сперматозоїдів наближаються до бічних стінок мікрофлюїдного каналу та прилипають до них, щоб уникнути їх змітання потоком рідини зі швидкістю >33 мкм/с.Скануюча та трансмісійна електронна мікроскопія показали, що пучки сперматозоїдів підтримувалися великою кількістю щільного матеріалу.Отримані дані демонструють унікальну рухливість сперматозоїдів курей породи Шарказі, а також здатність сперматозоїдів до аглютинації та утворення рухомих пучків, що сприяє кращому розумінню довготривалого зберігання сперматозоїдів при ЗПТ.
Щоб досягти запліднення у людей і більшості тварин, сперма і яйцеклітини повинні прибути до місця запліднення в потрібний час.Тому спарювання має відбуватися до або під час овуляції.З іншого боку, деякі ссавці, такі як собаки, а також види, що не належать до ссавців, такі як комахи, риби, рептилії та птахи, зберігають сперму у своїх репродуктивних органах протягом тривалого періоду часу, поки їх яйцеклітини не будуть готові до запліднення (асинхронне запліднення 1 ).Птахи здатні зберігати життєздатність сперматозоїдів, здатних запліднювати яйцеклітини, протягом 2-10 тижнів2.
Це унікальна особливість, яка відрізняє птахів від інших тварин, оскільки забезпечує високу ймовірність запліднення після одноразового запліднення протягом кількох тижнів без одночасного спаровування та овуляції.Основний орган зберігання сперми, який називається канальцем зберігання сперми (SST), розташований у внутрішніх складках слизової оболонки на матково-вагінальному з’єднанні.На сьогоднішній день механізми, за допомогою яких сперматозоїди потрапляють, перебувають і виходять з банку сперми, повністю не вивчені.На основі попередніх досліджень було висунуто багато гіпотез, але жодна з них не була підтверджена.
Forman4 припустив, що сперматозоїди зберігають своє перебування в порожнині SST завдяки безперервному коливальному руху проти напрямку потоку рідини через білкові канали, розташовані на епітеліальних клітинах SST (реологія).АТФ виснажується через постійну активність джгутиків, необхідну для утримання сперматозоїдів у просвіті SST, і рухливість зрештою знижується, доки сперматозоїди не будуть винесені з банку сперматозоїдів потоком рідини та не почнуть нову подорож по висхідній фаллопієвій трубі для запліднення сперми.Яйце (Форман4).Ця модель зберігання сперми підтверджується виявленням за допомогою імуноцитохімії аквапоринів 2, 3 і 9, присутніх в епітеліальних клітинах SST.На сьогоднішній день відсутні дослідження реології курячої сперми та її ролі в зберіганні SST, селекції вагінальної сперми та конкуренції сперми.У курей сперма потрапляє в піхву після природного спарювання, але більше 80% сперматозоїдів викидається з піхви незабаром після спарювання.Це свідчить про те, що піхва є основним місцем відбору сперми у птахів.Крім того, повідомлялося, що менше 1% сперматозоїдів, запліднених у піхві, потрапляють у SSTs2.При штучному заплідненні курчат у піхву кількість сперматозоїдів, що досягають SST, має тенденцію до збільшення через 24 години після осіменіння.Поки що механізм відбору сперматозоїдів під час цього процесу неясний, і рухливість сперматозоїдів може відігравати важливу роль у поглинанні SST сперми.Через товсті та непрозорі стінки фаллопієвих труб важко безпосередньо контролювати рухливість сперматозоїдів у фаллопієвих трубах птахів.Тому нам бракує базових знань про те, як сперматозоїди переходять у SST після запліднення.
Реологія нещодавно була визнана важливим фактором, що контролює транспортування сперми в геніталіях ссавців.Ґрунтуючись на здатності рухомих сперматозоїдів мігрувати проти течії, Заферані та ін.8 використали мікрофлюїдну систему Corra для пасивної ізоляції рухомих сперматозоїдів із зразків сперми, що були заготовлені.Цей тип сортування сперми має важливе значення для медичного лікування безпліддя та клінічних досліджень і є кращим перед традиційними методами, які потребують багато часу та праці та можуть порушити морфологію та структурну цілісність сперми.Однак до теперішнього часу не проводилися дослідження впливу виділень із статевих органів курей на рухливість сперматозоїдів.
Незалежно від механізму, який підтримує сперматозоїди, що зберігаються в SST, багато дослідників спостерігали, що резидентні сперматозоїди агглютинують голова до голови в SST курей 9, 10, перепелів 2 та індиків 11, утворюючи аглютиновані пучки сперми.Автори припускають, що існує зв'язок між цією аглютинацією та тривалим зберіганням сперматозоїдів у SST.
Тінгарі та Лейк12 повідомили про сильний зв’язок між сперматозоїдами в сперматозоїдних залозах курки та поставили під сумнів, чи сперматозоїди птахів аглютинують так само, як сперматозоїди ссавців.Вони вважають, що глибокі зв'язки між сперматозоїдами в сім'явивідних протоках можуть бути наслідком стресу, викликаного присутністю великої кількості сперматозоїдів у малому просторі.
При оцінці поведінки сперматозоїдів на свіжих підвішених предметних стеклах можна побачити минущі ознаки аглютинації, особливо по краях крапель сперми.Однак аглютинація часто порушувалася обертальною дією, пов'язаною з безперервним рухом, що пояснює минущий характер цього явища.Дослідники також помітили, що при додаванні розчинника в сперму з’являються витягнуті «ниткоподібні» клітинні агрегати.
Ранні спроби імітувати сперматозоїд були зроблені шляхом видалення тонкого дроту з висячої краплі, що призвело до подовженого сперматозоїда, схожого на везикулу, що виступає з краплі сперми.Сперматозоїди негайно вишикувались паралельно всередині везикули, але вся одиниця швидко зникла через обмеження 3D.Тому для вивчення аглютинації сперматозоїдів необхідно спостерігати рухливість і поведінку сперматозоїдів безпосередньо в ізольованих сперматозоїдах, що важко досягти.Тому необхідно розробити інструмент, який імітує сперматозоїди, щоб підтримувати дослідження рухливості сперматозоїдів і поведінки аглютинації.Brillard та інші13 повідомили, що середня довжина канальців для зберігання сперми у дорослих курчат становить 400–600 мкм, але деякі SST можуть досягати 2000 мкм.Меро та Огасавара14 розділили сім'яні залози на збільшені та незбільшені канальці для зберігання сперми, обидва з яких були однаковими за довжиною (~500 мкм) і шириною шийки (~38 мкм), але середній діаметр просвіту канальців становив 56,6 та 56,6 мкм.., відповідно 11,2 мкм відповідно.У поточному дослідженні ми використовували мікрофлюїдний пристрій з розміром каналу 200 мкм × 20 мкм (Ш × В), поперечний переріз якого дещо близький до поперечного перерізу посиленого SST.Крім того, ми досліджували рухливість сперматозоїдів і поведінку аглютинації в рідині, що тече, що узгоджується з гіпотезою Формана про те, що рідина, що виробляється епітеліальними клітинами SST, утримує сперматозоїди в просвіті в протиточному (реологічному) напрямку.
Метою цього дослідження було подолання проблем спостереження за рухливістю сперматозоїдів у фаллопієвій трубі та уникнення труднощів вивчення реології та поведінки сперматозоїдів у динамічному середовищі.Було використано мікрофлюїдний пристрій, який створює гідростатичний тиск, щоб імітувати рухливість сперматозоїдів у статевих органах курки.
Коли краплю розведеного зразка сперми (1:40) завантажували в мікроканальний пристрій, можна було визначити два типи рухливості сперматозоїдів (ізольована сперма та зв’язана сперма).Крім того, сперматозоїди мали тенденцію плисти проти течії (позитивна реологія; відео 1, 2). Незважаючи на те, що пучки сперматозоїдів мали нижчу швидкість, ніж швидкість самотніх сперматозоїдів (p < 0,001), вони збільшили відсоток сперматозоїдів, що демонструють позитивний реотаксис (p < 0,001; таблиця 2). Незважаючи на те, що пучки сперматозоїдів мали нижчу швидкість, ніж швидкість самотніх сперматозоїдів (p < 0,001), вони збільшили відсоток сперматозоїдів, що демонструють позитивний реотаксис (p < 0,001; таблиця 2). Хоча пучки сперматозоїдів мали більш низьку швидкість, ніж у одиничних сперматозоїдів (p <0,001), вони збільшили відсоток сперматозоїдів, що демонструють позитивний реотаксис (p <0,001; таблиця 2). Хоча пучки сперматозоїдів мали нижчу швидкість, ніж швидкість окремих сперматозоїдів (p < 0,001), вони збільшували відсоток сперматозоїдів, що демонструють позитивний реотаксис (p < 0,001; таблиця 2).尽管精子束的速度低于孤独精子的速度（p < 0,001），但它们增加了显示阳性流变性的精子百分比（p < 0,001；表2）.尽管 精子束 的 速度 低于 孤独 的 速度 （p <0,001） ， 但 增加 了 显示 阳性 流变性 精子 百分比 （p <0,001 ； 2。。。。。。）)）))) Хоча швидкість пучков сперматозоїдів була нижчою, ніж у одиничних сперматозоїдів (p <0,001), вони збільшили відсоток сперматозоїдів з позитивною реологією (p <0,001; таблиця 2). Хоча швидкість пучків сперматозоїдів була нижчою, ніж швидкість окремих сперматозоїдів (p < 0,001), вони збільшили відсоток сперматозоїдів з позитивною реологією (p < 0,001; таблиця 2).Позитивна реологія для окремих сперматозоїдів і пучків оцінюється приблизно в 53% і 85% відповідно.
Помічено, що сперматозоїди курей шаркаси відразу після еякуляції утворюють лінійні пучки, що складаються з десятків особин.Ці пучки з часом збільшуються в довжину та товщину та можуть залишатися in vitro протягом кількох годин, перш ніж розсіюватися (відео 3).Ці ниткоподібні пучки мають форму сперматозоїдів єхидни, які утворюються на кінці придатка яєчка.Було виявлено, що сперма курки Шаркаші має високу тенденцію до агглютинації та утворення сітчастого пучка менш ніж за одну хвилину після збору.Ці балки динамічні та здатні прилипати до будь-яких сусідніх стін або статичних об’єктів.Хоча пучки сперматозоїдів зменшують швидкість сперматозоїдів, зрозуміло, що макроскопічно вони збільшують свою лінійність.Довжина пучків змінюється залежно від кількості сперматозоїдів, зібраних у пучки.Виділяли дві частини пучка: початкову, що включає вільну голівку аглютинованого сперматозоїда, і кінцеву, що включає хвіст і весь дистальний кінець сперматозоїда.За допомогою високошвидкісної камери (950 кадрів/с) у початковій частині пучка спостерігали вільні головки агглютинованих сперматозоїдів, відповідальних за рух пучка за рахунок свого коливального руху, затягуючи решту в пучок гвинтовим рухом (Відео 4).Однак у довгих пучках було помічено, що деякі вільні голівки сперматозоїдів прилипають до тіла, а кінцева частина пучка діє як лопатка, щоб допомогти рухати пучок.
Під час повільного потоку рідини пучки сперматозоїдів рухаються паралельно один одному, однак вони починають перекриватися і прилипати до всього, що нерухомо, щоб не бути змитими струмом у міру збільшення швидкості потоку.Пучки утворюються, коли жменька сперматозоїдів наближається одна до одної, вони починають рухатися синхронно й обертаються одна навколо одної, а потім прилипають до липкої речовини.На малюнках 1 і 2 показано, як сперматозоїди наближаються один до одного, утворюючи з’єднання, коли хвостики обертаються один навколо одного.
Дослідники застосували гідростатичний тиск, щоб створити потік рідини в мікроканалі для вивчення реології сперми.Використовували мікроканал розміром 200 мкм × 20 мкм (Ш × В) і довжиною 3,6 мкм.Використовуйте мікроканали між контейнерами зі шприцами, встановленими на кінцях.Щоб зробити канали більш помітними, використовували харчові барвники.
Прив’яжіть з’єднувальні кабелі та аксесуари до стіни.Відео знято фазово-контрастним мікроскопом.З кожним зображенням представлені зображення фазово-контрастної мікроскопії та картування.(A) З’єднання між двома потоками чинить опір потоку через спіральний рух (червона стрілка).(B) З’єднання між пучком трубок і стінкою каналу (червоні стрілки), в той же час вони з’єднані з двома іншими пучками (жовті стрілки).(C) Пучки сперматозоїдів у мікрофлюїдному каналі починають з’єднуватися один з одним (червоні стрілки), утворюючи сітку з пучків сперматозоїдів.(D) Формування мережі пучків сперматозоїдів.
Коли краплю розведеної сперми завантажували в мікрофлюїдний пристрій і створювали потік, спостерігали, як пучок сперми рухається проти напрямку потоку.Пучки щільно прилягають до стінок мікроканалів, а вільні головки в початковій частині пучків щільно прилягають до них (відео 5).Вони також прилипають до будь-яких нерухомих частинок на своєму шляху, наприклад до сміття, щоб не бути знесеними течією.З часом ці пучки перетворюються на довгі нитки, що захоплюють інші поодинокі сперматозоїди та коротші пучки (відео 6).Коли потік починає сповільнюватися, довгі лінії сперми починають утворювати мережу ліній сперми (Відео 7; Малюнок 2).
При високій швидкості потоку (V > 33 мкм/с) спіральні рухи ниток посилюються, оскільки спроба зловити багато окремих сперматозоїдів, що утворюють пучки, краще протистоять дрейфовій силі потоку. При високій швидкості потоку (V > 33 мкм/с) спіральні рухи ниток посилюються, оскільки спроба зловити багато окремих сперматозоїдів, що утворюють пучки, краще протистоять дрейфовій силі потоку. При високій швидкості потоку (V > 33 мкм/с) спіралевидні рухи нитей усилюються, оскільки вони намагаються поймати безліч окремих сперматозоїдів, що утворюють сечки, які краще протистоять дрейфуючому потоку сили. При високих швидкостях потоку (V > 33 мкм/с) спіральні рухи ниток посилюються, оскільки вони намагаються захопити багато окремих сперматозоїдів, утворюючи пучки, які краще протистоять дрейфовій силі потоку.在高流速(V > 33 мкм/с) 时，螺纹的螺旋运动增加，以试图捕捉许多形成束的单个精子，从而更好地抵抗流动的漂移力。在 高 流速 (v> 33 мкм/с) 时 ， 的 螺旋 运动 增加 ， 以 试图 许多 形成 束 单 个 精子 ， 从而更 地 抵抗 的 漂移力。。。。。。。。。 При великих швидкостях потоку (V > 33 мкм/с) спіральний рух нитей збільшується в спробі захопити безліч окремих сперматозоїдів, що утворюють сечки, щоб краще утворювати протидію силам дрейфа потоку. При високих швидкостях потоку (V > 33 мкм/с) спіральний рух ниток збільшується в спробі захопити багато окремих сперматозоїдів, утворюючи пучки, щоб краще протистояти силам дрейфу потоку.Також спробували прикріпити мікроканали до бічних стінок.
За допомогою світлової мікроскопії (LM) пучки сперматозоїдів ідентифікували як скупчення голівок і закручених хвостиків сперматозоїдів.Пучки сперматозоїдів із різними агрегатами також були ідентифіковані як скручені головки та джгутикові агрегати, численні злиті хвостики сперматозоїдів, головки сперматозоїдів, прикріплені до хвоста, і головки сперматозоїдів із зігнутими ядрами як множинні злиті ядра.трансмісійна електронна мікроскопія (ТЕМ).Скануюча електронна мікроскопія (SEM) показала, що пучки сперматозоїдів являли собою вкриті оболонкою агрегати голівок сперматозоїдів, а агрегати сперматозоїдів показали прикріплену мережу загорнутих хвостиків.
Вивчали морфологію та ультраструктуру сперматозоїдів, формування пучків сперматозоїдів за допомогою світлової мікроскопії (напівзріз), скануючої електронної мікроскопії (РЕМ) та трансмісійної електронної мікроскопії (ТЕМ), мазки сперматозоїдів фарбували акридиновим оранжевим і досліджували за допомогою епіфлуоресцентної мікроскопії.
Фарбування мазка сперми акридиновим помаранчевим (рис. 3B) показало, що головки сперматозоїдів були злипнуті разом і вкриті секреторним матеріалом, що призвело до утворення великих пучків (рис. 3D).Пучки сперматозоїдів складалися з агрегатів сперми з мережею прикріплених хвостиків (рис. 4A-C).Пучки сперматозоїдів складаються з хвостиків багатьох сперматозоїдів, зчеплених разом (рис. 4D).Секрети (рис. 4E,F) вкривали головки пучків сперматозоїдів.
Формування пучка сперматозоїдів За допомогою фазово-контрастної мікроскопії та мазків сперматозоїдів, пофарбованих акридиновим помаранчевим, показано, що головки сперматозоїдів злипаються.(A) Раннє формування пучка сперми починається з сперматозоїда (біле коло) і трьох сперматозоїдів (жовте коло), причому спіраль починається з хвоста і закінчується на голівці.(B) Мікрофотографія мазка сперми, забарвленого акридиновим помаранчевим, що показує прикріплені головки сперми (стрілки).Виділення покривають голову(и).Збільшення × 1000. (C) Розвиток великого пучка, що переноситься потоком у мікрофлюїдному каналі (з використанням високошвидкісної камери зі швидкістю 950 кадрів в секунду).(D) Мікрофотографія мазка сперми, пофарбованого акридиновим помаранчевим, з великими пучками (стрілки).Збільшення: ×200.
Сканова електронна мікрофотографія пучка сперматозоїдів і мазка сперми, забарвленого акридиновим оранжевим.(A, B, D, E) – цифрові кольорові скануючі електронні мікрофотографії сперматозоїдів, а C і F – мікрофотографії мазків сперматозоїдів, забарвлених акридиновим помаранчевим, на яких показано прикріплення кількох сперматозоїдів, що огортають хвостову перетинку.(AC) Агрегати сперми показані у вигляді мережі прикріплених хвостиків (стрілки).(D) Злипання кількох сперматозоїдів (з клейкою речовиною, рожевий контур, стрілка), що обертаються навколо хвостика.(E і F) Агрегати головок сперматозоїдів (покажчики), покриті клейким матеріалом (покажчики).Сперматозоїди утворювали пучки з декількома вихроподібними структурами (F).(C) ×400 і (F) ×200 збільшення.
Використовуючи трансмісійну електронну мікроскопію, ми виявили, що пучки сперматозоїдів мають прикріплені хвости (рис. 6A, C), головки, прикріплені до хвостів (рис. 6B), або головки, прикріплені до хвостів (рис. 6D).Головки сперматозоїдів у пучку вигнуті, представляючи на розрізі дві ядерні області (рис. 6D).У пучку розрізів сперматозоїди мали скручену головку з двома ядерними областями та кількома джгутиковими областями (рис. 5А).
Цифрова кольорова електронна мікрофотографія, що показує сполучні хвостики в пучку сперматозоїдів і аглютинуючий матеріал, що з’єднує головки сперматозоїдів.(A) Прикріплений хвіст великої кількості сперматозоїдів.Зверніть увагу на те, як виглядає хвіст у книжковій (стрілка) і альбомній (стрілка) проекціях.(B) Головка (стрілка) сперматозоїда з’єднана з хвостом (стрілка).(C) Кілька хвостиків сперми (стрілки) прикріплені.(D) Матеріал аглютинації (AS, синій) з’єднує чотири головки сперматозоїдів (фіолетовий).
Скануючу електронну мікроскопію використовували для виявлення головок сперматозоїдів у пучках сперматозоїдів, вкритих виділеннями або мембранами (рис. 6B), що вказує на те, що пучки сперматозоїдів були закріплені позаклітинним матеріалом.Аглютинований матеріал концентрувався в голівці сперматозоїда (утворення, схоже на голову медузи; рис. 5B) і розширювався дистально, надаючи яскраво-жовтий вигляд під флуоресцентною мікроскопією при фарбуванні акридиновим помаранчевим (рис. 6C).Ця речовина добре видно під скануючим мікроскопом і вважається сполучною.Напівтонкі зрізи (рис. 5C) і мазки сперми, пофарбовані акридиновим помаранчевим, показали пучки сперми, що містять щільно упаковані голівки та закручені хвостики (рис. 5D).
Різні мікрофотографії, що демонструють агрегацію голівок і складених хвостиків сперматозоїдів за допомогою різних методів.(A) Цифрова кольорова електронна мікрофотографія поперечного перерізу пучка сперматозоїдів, що показує скручену головку сперматозоїда з ядром, що складається з двох частин (синій) і кількома джгутиковими частинами (зелений).(B) Цифрова кольорова скануюча електронна мікрофотографія, що показує скупчення медузоподібних голівок сперматозоїдів (стрілки), які здаються покритими.(C) Напівтонкий зріз, що показує агреговані головки сперматозоїдів (стрілки) і закручені хвостики (стрілки).(D) Мікрофотографія мазка сперми, забарвленого акридиновим помаранчевим, на якій видно агрегати голівок сперматозоїдів (стрілки) і закручені хвостики (стрілки).Зверніть увагу, що клейка речовина (S) покриває головку сперматозоїда.(D) × 1000 збільшення.
За допомогою трансмісійної електронної мікроскопії (рис. 7A) також було зазначено, що головки сперматозоїдів були скручені, а ядра мали спіральну форму, що підтверджено мазками сперматозоїдів, пофарбованими акридиновим помаранчевим і дослідженими за допомогою флуоресцентної мікроскопії (рис. 7B).
(A) Цифрова кольорова трансмісійна електронна мікрофотографія та (B) мазок сперми, пофарбований акридиновим помаранчевим, на якому видно скручені головки та прикріплення голівок і хвостиків сперматозоїдів (стрілки).(B) × 1000 збільшення.
Цікавим відкриттям є те, що сперма Шарказі збирається, утворюючи рухомі ниткоподібні пучки.Властивості цих пучків дозволяють зрозуміти їх можливу роль у поглинанні та зберіганні сперматозоїдів у SST.
Після спарювання сперматозоїди потрапляють у піхву та проходять інтенсивний процес відбору, у результаті чого лише обмежена кількість сперматозоїдів потрапляє в SST15,16.На сьогоднішній день механізми, за допомогою яких сперматозоїди потрапляють і виходять з SST, неясні.У домашньої птиці сперматозоїди зберігаються в SST протягом тривалого періоду від 2 до 10 тижнів, залежно від виду6.Про стан сперми під час зберігання в SST залишаються суперечки.Вони в русі чи в спокої?Іншими словами, як сперматозоїди зберігають своє положення в SST так довго?
Forman4 припустив, що перебування та викид SST можна пояснити з точки зору рухливості сперматозоїдів.Автори припускають, що сперматозоїди зберігають своє положення, пливучи проти потоку рідини, створеного епітелієм SST, і що сперматозоїди викидаються з SST, коли їх швидкість падає нижче точки, в якій вони починають рухатися назад через брак енергії.Zaniboni5 підтвердив наявність аквапоринів 2, 3 і 9 в апікальній частині епітеліальних клітин SST, що може опосередковано підтримувати модель зберігання сперми Формана.У поточному дослідженні ми виявили, що майже половина сперматозоїдів Шаркаші показує позитивну реологію в рідині, що тече, і що агглютиновані пучки сперми збільшують кількість сперматозоїдів з позитивною реологією, хоча аглютинація уповільнює їх.Як сперматозоїди подорожують по фаллопієвій трубі птаха до місця запліднення, до кінця не зрозуміло.У ссавців фолікулярна рідина хемопритягує сперматозоїди.Однак вважається, що хемоаттрактанти спрямовують сперматозоїди на великі відстані7.Тому за транспортування сперми відповідають інші механізми.Повідомлялося, що здатність сперматозоїдів орієнтуватися та текти проти рідини маткової труби, що вивільняється після спарювання, є основним фактором у націленні на сперму у мишей.Паркер 17 припустив, що сперматозоїди перетинають яйцепроводи, плаваючи проти циліарного струму у птахів і рептилій.Хоча це не було експериментально продемонстровано на птахах, Adolphi18 був першим, хто виявив, що пташина сперма дає позитивні результати, коли тонкий шар рідини між покривним і предметним склом створюється за допомогою смужки фільтрувального паперу.Реологія.Хіно та Янагімачі [19] помістили мишачий яєчниково-трубно-матковий комплекс у перфузійне кільце та ввели 1 мкл чорнила в перешийок, щоб візуалізувати потік рідини в фаллопієвих трубах.Вони помітили дуже активний рух скорочення і розслаблення в матковій трубі, при якому всі чорнильні кульки неухильно рухалися до ампули маткової труби.Автори підкреслюють важливість потоку трубної рідини з нижніх у верхні маткові труби для підйому сперми та запліднення.Brillard20 повідомив, що у курей та індиків сперматозоїди мігрують шляхом активного руху від вагінального входу, де вони зберігаються, до матково-вагінального з’єднання, де вони зберігаються.Однак цей рух не потрібний між матково-вагінальним з’єднанням і воронкою, оскільки сперматозоїди транспортуються шляхом пасивного переміщення.Знаючи ці попередні рекомендації та результати, отримані в поточному дослідженні, можна припустити, що здатність сперматозоїдів рухатися вгору (реологія) є однією з властивостей, на яких базується процес відбору.Це визначає проходження сперматозоїдів через піхву і їх надходження в ЦКТ для зберігання.Як припустив Forman4, це також може полегшити процес входу сперматозоїдів у SST та його середовище проживання протягом певного періоду часу, а потім виходу, коли їх швидкість починає сповільнюватися.
З іншого боку, Мацузакі та Сасанамі 21 припустили, що пташині сперматозоїди зазнають змін рухливості від стану спокою до рухливості в репродуктивних шляхах самців і самок.Інгібування резидентної рухливості сперматозоїдів у SST було запропоновано для пояснення тривалого часу зберігання сперми, а потім омолодження після виходу з SST.В умовах гіпоксії Matsuzaki et al.1 повідомили про високе виробництво та вивільнення лактату в SST, що може призвести до пригнічення рухливості резидентних сперматозоїдів.У цьому випадку важливість реології сперматозоїдів відображається на відборі та поглинанні сперматозоїдів, а не на їх зберіганні.
Патерн аглютинації сперматозоїдів вважається вірогідним поясненням тривалого періоду зберігання сперми в SST, оскільки це звичайна модель утримання сперми у домашньої птиці2,22,23.Бакст та ін.2 спостерігали, що більшість сперматозоїдів прилипають один до одного, утворюючи пучкові агрегати, а поодинокі сперматозоїди рідко зустрічаються в CCM перепелів.З іншого боку, Wen et al.24 спостерігали більше розсіяних сперматозоїдів і менше пучків сперматозоїдів у просвіті SST у курей.На підставі цих спостережень можна припустити, що схильність до аглютинації сперматозоїдів різна між птахами та сперматозоїдами в одному еякуляті.Крім того, Van Krey et al.9 припустив, що випадкова дисоціація аглютинованих сперматозоїдів відповідає за поступове проникнення сперматозоїдів у просвіт маткової труби.Згідно з цією гіпотезою, сперматозоїди з нижчою здатністю до аглютинації повинні бути спочатку вигнані з SST.У цьому контексті здатність сперматозоїдів до аглютинації може бути фактором, що впливає на результат конкуренції сперматозоїдів у брудних птахів.Крім того, чим довше аглютиновані сперматозоїди дисоціюють, тим довше зберігається фертильність.
Хоча агрегацію сперматозоїдів і агрегацію в пучки спостерігали в кількох дослідженнях2,22,24, вони не були детально описані через складність їх кінематичного спостереження в межах SST.Було зроблено кілька спроб вивчити аглютинацію сперматозоїдів in vitro.Велика, але тимчасова агрегація спостерігалася, коли тонкий дріт був видалений з висячої краплі насіння.Це призводить до того, що з краплі виступає витягнутий міхур, що імітує насіннєву залозу.Через обмеження 3D і короткий час висихання крапельним способом весь блок швидко занепав9.У поточному дослідженні, використовуючи курей Шаркаші та мікрофлюїдні чіпи, ми змогли описати, як ці пучки формуються та як вони рухаються.Було виявлено, що пучки сперматозоїдів утворилися одразу після збору сперми та рухалися по спіралі, демонструючи позитивну реологію, коли вони присутні в потоці.Крім того, при макроскопічному дослідженні було виявлено, що пучки сперматозоїдів підвищують лінійність рухливості порівняно з ізольованими сперматозоїдами.Це свідчить про те, що аглютинація сперматозоїдів може відбутися до проникнення SST і що виробництво сперматозоїдів не обмежується невеликою ділянкою через стрес, як було запропоновано раніше (Tingari and Lake12).Під час утворення пучка сперматозоїди пливуть синхронно, доки вони не з’єднаються, потім їхні хвостики обертаються один навколо одного, і голівка сперматозоїда залишається вільною, а хвостик і дистальна частина сперматозоїда злипаються липкою речовиною.Тому вільна головка зв'язки відповідає за рух, перетягуючи решту зв'язки.Скануюча електронна мікроскопія пучків сперматозоїдів показала прикріплені головки сперматозоїдів, вкриті великою кількістю липкого матеріалу, що свідчить про те, що головки сперматозоїдів були прикріплені в спочиваючих пучках, що могло статися після досягнення місця зберігання (SST).
Коли мазок сперми забарвлюється акридиновим помаранчевим, під флуоресцентним мікроскопом можна побачити позаклітинний клейкий матеріал навколо сперматозоїдів.Ця речовина дозволяє пучкам сперматозоїдів прилипати до будь-яких оточуючих поверхонь або частинок і чіплятися за них, щоб вони не дрейфували з навколишнім потоком.Таким чином, наші спостереження показують роль адгезії сперматозоїдів у вигляді рухомих пучків.Їхня здатність плисти проти течії та прилипати до прилеглих поверхонь дозволяє сперматозоїдам довше залишатися в SST.
Rothschild25 використовував гемоцитометричну камеру для вивчення плаваючого розподілу сперми великої рогатої худоби в краплі суспензії, зробивши мікрофотографії через камеру з вертикальною та горизонтальною оптичною віссю мікроскопа.Результати показали, що сперматозоїди притягувалися до поверхні камери.Автори припускають, що між сперматозоїдом і поверхнею можуть існувати гідродинамічні взаємодії.Враховуючи це, а також здатність сперми курчат Шаркаші утворювати липкі пучки, це може збільшити ймовірність того, що сперма буде прилипати до стінки SST і зберігатися протягом тривалого часу.
Bccetti і Afzeliu26 повідомили, що глікокалікс сперми необхідний для розпізнавання та аглютинації гамет.Forman10 спостерігав, що гідроліз α-глікозидних зв’язків у глікопротеїн-гліколіпідних покриттях шляхом обробки сперми птахів нейрамінідазою призводив до зниження фертильності, не впливаючи на рухливість сперматозоїдів.Автори припускають, що вплив нейрамінідази на глікокалікс порушує секвестрацію сперматозоїдів у матково-вагінальному з’єднанні, тим самим знижуючи фертильність.Їхні спостереження не можуть ігнорувати можливість того, що лікування нейрамінідазою може зменшити розпізнавання сперматозоїдів і ооцитів.Форман і Енгель10 виявили, що фертильність знижувалася, коли курей запліднювали інтравагінально спермою, обробленою нейрамінідазою.Однак ЕКЗ зі спермою, обробленою нейрамінідазою, не вплинуло на фертильність порівняно з контрольними курчатами.Автори дійшли висновку, що зміни в глікопротеїн-гліколіпідному покритті навколо мембрани сперматозоїдів знижують здатність сперматозоїдів до запліднення через порушення секвестрації сперматозоїдів у матково-вагінальному з’єднанні, що, у свою чергу, збільшує втрату сперматозоїдів через швидкість матково-вагінального з’єднання, але не впливає на розпізнавання сперми та яйцеклітини.
У індиків Bakst і Bauchan 11 виявили невеликі везикули та фрагменти мембрани в просвіті SST і спостерігали, що деякі з цих гранул злилися з мембраною сперми.Автори припускають, що ці відносини можуть сприяти тривалому зберіганню сперматозоїдів у SST.Однак дослідники не вказали джерело цих частинок, чи виділяються вони епітеліальними клітинами CCT, чи виробляються та виділяються чоловічою репродуктивною системою, чи виробляються самою спермою.Також ці частинки відповідають за аглютинацію.Grützner та ін.27 повідомили, що епітеліальні клітини придатка яєчка виробляють і секретують специфічний білок, необхідний для формування однопорових сім’яних шляхів.Автори також повідомляють, що дисперсія цих пучків залежить від взаємодії білків епідидиму.Nixon та інші28 виявили, що придатки секретують білок, багатий кислим цистеїном остеонектин;SPARC бере участь у формуванні пучків сперми у короткодзьобих єхидн і качкодзьобів.Розсіювання цих пучків пов'язане з втратою цього білка.
У поточному дослідженні ультраструктурний аналіз за допомогою електронної мікроскопії показав, що сперматозоїди прилипли до великої кількості щільного матеріалу.Вважається, що ці речовини є відповідальними за аглютинацію, яка конденсується між і навколо приклеєних головок, але в нижчих концентраціях в області хвоста.Ми припускаємо, що ця аглютинуюча речовина виділяється з чоловічої репродуктивної системи (придатка яєчка або сім’явивідної протоки) разом із спермою, оскільки ми часто спостерігаємо відділення сперми від лімфи та насінної плазми під час еякуляції.Повідомлялося, що коли сперматозоїди птахів проходять через придаток яєчка та сім’явиносну протоку, вони зазнають змін, пов’язаних із дозріванням, які підтримують їх здатність зв’язувати білки та отримувати глікопротеїни, асоційовані з лемою плазми.Стійкість цих білків на резидентних мембранах сперматозоїдів у SST свідчить про те, що ці білки можуть впливати на набуття стабільності мембрани сперматозоїдів 30 і визначати їх фертильність 31 .Ahammad et al32 повідомили, що сперматозоїди, отримані з різних частин чоловічої репродуктивної системи (від яєчок до дистального відділу сім’явивідної протоки), показали прогресивне збільшення життєздатності в умовах зберігання в рідині, незалежно від температури зберігання, і життєздатність у курей також збільшується в маткових трубах після штучного запліднення.
Пучки сперми курей Шаркаші відрізняються характеристиками та функціями, ніж інші види, такі як єхидни, качкодзьоби, лісові миші, оленячі щури та морські свинки.У курей шаркаси утворення пучків сперматозоїдів зменшувало швидкість їх плавання порівняно з одиночними сперматозоїдами.Однак ці пучки збільшували відсоток реологічно позитивних сперматозоїдів і збільшували здатність сперматозоїдів стабілізуватися в динамічному середовищі.Таким чином, наші результати підтверджують попереднє припущення, що аглютинація сперматозоїдів у SST пов'язана з тривалим зберіганням сперми.Ми також припускаємо, що схильність сперматозоїдів утворювати пучки може контролювати швидкість втрати сперматозоїдів у SST, що може змінити результат конкуренції сперматозоїдів.Згідно з цим припущенням, сперматозоїди з низькою здатністю до аглютинації виділяють першими SST, тоді як сперматозоїди з високою здатністю до аглютинації дають більшу частину потомства.Утворення однопорових пучків сперматозоїдів є корисним і впливає на співвідношення батьків і дітей, але використовує інший механізм.У єхидни та качкодзьоба сперматозоїди розташовані паралельно один одному, щоб збільшити швидкість руху пучка вперед.Пучки єхидни рухаються приблизно втричі швидше, ніж окремі сперматозоїди.Вважається, що утворення таких пучків сперматозоїдів у єхидни є еволюційним пристосуванням до збереження домінування, оскільки самки є безладними статевими зв’язками і зазвичай спаровуються з кількома самцями.Тому сперматозоїди з різних еякулятів гостро конкурують за запліднення яйцеклітини.
Аглютиновані сперматозоїди курей шаркаси легко візуалізувати за допомогою фазово-контрастної мікроскопії, що вважається перевагою, оскільки дозволяє легко вивчати поведінку сперматозоїдів in vitro.Механізм, за допомогою якого утворення пучка сперматозоїдів сприяє розмноженню курчат шаркасі, також відрізняється від механізму, який спостерігають у деяких плацентарних ссавців, що представляють кооперативну поведінку сперматозоїдів, таких як лісові миші, де деякі сперматозоїди досягають яєць, допомагаючи іншим спорідненим особинам дістатися до їхніх яєць і пошкодити їх.довести себе.альтруїстична поведінка.Самозапліднення 34. Інший приклад кооперативної поведінки сперматозоїдів був виявлений у оленів-мишей, де сперматозоїди були здатні ідентифікувати та поєднуватися з найбільш генетично спорідненими сперматозоїдами та формувати кооперативні групи для збільшення їх швидкості порівняно з неспорідненими сперматозоїдами35.
Результати, отримані в цьому дослідженні, не суперечать теорії Фомана про довготривале зберігання сперматозоїдів у SWS.Дослідники повідомляють, що сперматозоїди продовжують рухатися в потоці епітеліальних клітин, що вистилають SST, протягом тривалого періоду часу, і після певного періоду часу запаси енергії сперматозоїдів виснажуються, що призводить до зниження швидкості, що дозволяє виштовхувати речовини з низькою молекулярною масою.енергії сперматозоїдів з потоком рідини з просвіту ССТ Порожнина маткової труби.У поточному дослідженні ми спостерігали, що половина одиночних сперматозоїдів продемонструвала здатність плавати проти текучих рідин, а їх адгезія в пучку збільшила їхню здатність демонструвати позитивну реологію.Крім того, наші дані узгоджуються з даними Matsuzaki et al.1, який повідомив, що підвищена секреція лактату при SST може пригнічувати рухливість резидентних сперматозоїдів.Проте наші результати описують формування рухливих зв’язок сперматозоїдів та їх реологічну поведінку в присутності динамічного середовища всередині мікроканалу в спробі з’ясувати їх поведінку в SST.Майбутні дослідження можуть бути зосереджені на визначенні хімічного складу та походження агента аглютинації, що, безсумнівно, допоможе дослідникам розробити нові способи зберігання рідкої сперми та збільшити тривалість фертильності.
П'ятнадцять 30-тижневих самців шаркасі з голою шиєю (гомозиготний домінант; Na Na) були обрані в якості донорів сперми в дослідженні.Птахів вирощували на науково-дослідній птахофабрикі факультету сільського господарства Університету Ашит, провінція Ашит, Єгипет.Птахів розміщували в окремих клітках (30 x 40 x 40 см), піддавали освітленій програмі (16 годин світла та 8 годин темряви) і годували раціоном, що містив 160 г сирого протеїну, 2800 ккал метаболізованої енергії та 35 г кальцію кожна.5 грамів доступного фосфору на кілограм раціону.
За даними 36, 37 сперму відбирали у самців шляхом масажу живота.Загалом було зібрано 45 зразків сперми у 15 чоловіків протягом 3 днів.Сперму (n = 15/день) одразу розводили 1:1 (об’єм:об’єм) розчинником сперми Belsville Poultry Semen, який містить дифосфат калію (1,27 г), моногідрат глутамату натрію (0,867 г), фруктозу (0,5 d) безводного натрію.ацетат (0,43 г), трис(гідроксиметил)амінометан (0,195 г), моногідрат цитрату калію (0,064 г), монофосфат калію (0,065 г), хлорид магнію (0,034 г) і H2O (100 мл), рН = 7, 5, осмолярність 333 мОсм/кг38.Розведені зразки сперми спочатку досліджували під світловим мікроскопом, щоб переконатися в хорошій якості сперми (вологість), а потім зберігали на водяній бані при 37°C до використання протягом півгодини після збору.
Кінематику та реологію сперматозоїдів описано за допомогою системи мікрофлюїдних пристроїв.Зразки сперми були додатково розведені до 1:40 у Beltsville Avian Semen Diluent, завантажені в мікрофлюїдний пристрій (див. нижче), і кінетичні параметри були визначені за допомогою системи комп’ютеризованого аналізу сперми (CASA), розробленої раніше для мікрофлюїдних характеристик.про рухливість сперматозоїдів у рідких середовищах (Кафедра машинобудування, Інженерний факультет, Університет Асьют, Єгипет).Плагін можна завантажити за адресою: http://www.assiutmicrofluidics.com/research/casa39.Вимірювали криву швидкість (VCL, мкм/с), лінійну швидкість (VSL, мкм/с) і середню траєкторну швидкість (VAP, мкм/с).Відео сперматозоїдів було зроблено за допомогою інвертованого фазово-контрастного мікроскопа Optika XDS-3 (з об’єктивом 40x), підключеного до камери Tucson ISH1000 зі швидкістю 30 кадрів в секунду протягом 3 с.Використовуйте програмне забезпечення CASA для дослідження принаймні трьох областей і 500 траєкторій сперми на зразок.Записане відео було оброблено за допомогою саморобного CASA.Визначення рухливості в плагіні CASA базується на швидкості плавання сперми порівняно зі швидкістю потоку та не включає інші параметри, такі як рух із боку в бік, оскільки це було визнано надійнішим у потоці рідини.Реологічний рух описується як рух сперматозоїдів проти напрямку потоку рідини.Сперматозоїди з реологічними властивостями ділили на кількість рухливих сперматозоїдів;сперматозоїди, які перебували в стані спокою, і сперматозоїди, що рухаються конвективно, були виключені з підрахунку.
Усі використані хімічні речовини були отримані від Elgomhoria Pharmaceuticals (Каїр, Єгипет), якщо не зазначено інше.Пристрій було виготовлено, як описано El-sherry et al.40 з деякими змінами.Матеріали, використані для виготовлення мікроканалів, включали скляні пластини (Howard Glass, Worcester, MA), негативний резист SU-8-25 (MicroChem, Newton, CA), діацетоновий спирт (Sigma Aldrich, Steinheim, Німеччина) і поліацетон.-184, Dow Corning, Мідленд, Мічіган).Мікроканали виготовлені за допомогою м'якої літографії.Спочатку прозору захисну маску для обличчя з бажаним мікроканальним дизайном надрукували на принтері з високою роздільною здатністю (Prismatic, Cairo, Egypt and Pacific Arts and Design, Markham, ON).Майстри виготовляли із використанням скляних пластин як підкладок.Пластини очищали в ацетоні, ізопропанолі та деіонізованій воді, а потім покривали 20 мкм шаром SU8-25 методом центрифугування (3000 об/хв, 1 хв).Потім шари SU-8 обережно висушували (65°C, 2 хв і 95°C, 10 хв) і піддавали УФ-випромінюванню протягом 50 с.Випікайте після витримки при 65°C і 95°C протягом 1 хвилини та 4 хвилин для зшивання відкритих шарів SU-8 з подальшим проявом у діацетоновому спирті протягом 6,5 хвилин.Випікати вафлі (200°C 15 хв) для подальшого затвердіння шару SU-8.
PDMS готували шляхом змішування мономеру та затверджувача у ваговому співвідношенні 10:1, потім дегазували у вакуумному ексикаторі та виливали на основну раму SU-8.PDMS затверджували в духовці (120°C, 30 хв), потім канали вирізали, відокремлювали від основного матеріалу та перфорували, щоб дозволити прикріпити трубки на вході та виході мікроканалу.Нарешті, мікроканали PDMS були назавжди прикріплені до предметних стекол мікроскопа за допомогою портативного коронного процесора (Electro-Technic Products, Чикаго, Іллінойс), як описано в іншому місці.Мікроканал, використаний у цьому дослідженні, має розміри 200 мкм × 20 мкм (Ш × В) і довжину 3,6 см.
Потік рідини, викликаний гідростатичним тиском всередині мікроканалу, досягається шляхом підтримки рівня рідини у вхідному резервуарі вище різниці висот Δh39 у вихідному резервуарі (рис. 1).
де f – коефіцієнт тертя, визначений як f = C/Re для ламінарного потоку в прямокутному каналі, де C – константа, що залежить від співвідношення сторін каналу, L – довжина мікроканалу, Vav – середня швидкість всередині мікроканалу, Dh – гідравлічний діаметр каналу, g – прискорення сили тяжіння.Використовуючи це рівняння, середню швидкість каналу можна розрахувати за допомогою наступного рівняння: