Дякуємо за відвідування Nature.com. Версія браузера, яку ви використовуєте, має обмежену підтримку CSS. Для найкращого досвіду рекомендуємо використовувати оновлений браузер (або вимкнути режим сумісності в Internet Explorer). Тим часом, щоб забезпечити постійну підтримку, ми відображатимемо сайт без стилів та JavaScript.
Плодючість птахів залежить від їхньої здатності зберігати достатню кількість життєздатних сперматозоїдів протягом тривалого періоду часу в канальцях зберігання сперми (SST). Точний механізм, за допомогою якого сперматозоїди потрапляють, перебувають у та залишають SST, залишається суперечливим. Сперма курей шаркасі демонструвала високу схильність до аглютинації, утворюючи рухливі ниткоподібні пучки, що містять багато клітин. Через складність спостереження за рухливістю та поведінкою сперматозоїдів у непрозорій фаллопієвій трубі ми використовували мікрофлюїдний пристрій з поперечним перерізом мікроканалу, подібним до поперечного перерізу сперматозоїдів, для вивчення аглютинації та рухливості сперматозоїдів. У цьому дослідженні обговорюється, як формуються пучки сперми, як вони рухаються та їхня можлива роль у продовженні перебування сперматозоїдів у SST. Ми досліджували швидкість сперматозоїдів та реологічну поведінку, коли потік рідини генерувався в мікрофлюїдному каналі гідростатичним тиском (швидкість потоку = 33 мкм/с). Сперматозоїди схильні плавати проти течії (позитивна реологія), а швидкість пучка сперматозоїдів значно знижується порівняно з окремими сперматозоїдами. Було помічено, що пучки сперми рухаються по спіралі та збільшуються в довжину та товщину, оскільки залучається більше окремих сперматозоїдів. Було виявлено, що пучки сперми наближаються та прилипають до бічних стінок мікрофлюїдних каналів, щоб уникнути їхнього зміщення швидкістю потоку рідини > 33 мкм/с. Було виявлено, що пучки сперми наближаються та прилипають до бічних стінок мікрофлюїдних каналів, щоб уникнути їхнього зміщення швидкістю потоку рідини > 33 мкм/с. Було помічено, що пучки сперматозоїдів наближаються і прилипають до бічних стенкам мікрофлюїдних каналів, щоб уникнути сметанія зі швидкістю потоку рідини> 33 мкм / с. Було помічено, що пучки сперми наближаються та прилипають до бічних стінок мікрофлюїдних каналів, щоб уникнути змивання при швидкостях потоку рідини >33 мкм/с.观察到精子束接近并粘附在微流体通道的侧壁上，以避免被流体流速> 33 мкм/с 扫过。33 мкм/с 扫过。 Було помічено, що пучки сперматозоїдів наближаються і прилипають до бічних стенках мікрожидкостного каналу, щоб уникнути метання потоку рідини зі швидкістю > 33 мкм/с. Було помічено, що пучки сперми наближаються та прилипають до бічних стінок мікрофлюїдного каналу, щоб уникнути змивання потоком рідини зі швидкістю >33 мкм/с.Скануюча та просвічуюча електронна мікроскопія показали, що пучки сперматозоїдів підтримувалися великою кількістю щільного матеріалу. Отримані дані демонструють унікальну рухливість сперматозоїдів курей Шарказі, а також здатність сперматозоїдів до аглютинації та утворення рухливих пучків, що сприяє кращому розумінню тривалого зберігання сперматозоїдів у СМТ.
Для досягнення запліднення у людей та більшості тварин сперматозоїди та яйцеклітини повинні потрапити до місця запліднення у потрібний час. Тому спарювання має відбуватися до або під час овуляції. З іншого боку, деякі ссавці, такі як собаки, а також види, що не є ссавцями, такі як комахи, риби, рептилії та птахи, зберігають сперму у своїх репродуктивних органах протягом тривалого періоду часу, поки їхні яйцеклітини не будуть готові до запліднення (асинхронне запліднення 1). Птахи здатні зберігати життєздатність сперматозоїдів, здатних запліднювати яйцеклітини, протягом 2-10 тижнів2.
Це унікальна особливість, яка відрізняє птахів від інших тварин, оскільки вона забезпечує високу ймовірність запліднення після одноразового запліднення протягом кількох тижнів без одночасного спарювання та овуляції. Основний орган зберігання сперми, який називається сперматозоїдним канальцем (ССК), розташований у внутрішніх складках слизової оболонки на матково-піхвовому з'єднанні. На сьогоднішній день механізми, за допомогою яких сперматозоїди потрапляють, перебувають та виходять з банку сперми, до кінця не вивчені. На основі попередніх досліджень було висунуто багато гіпотез, але жодна з них не була підтверджена.
Форман4 висунув гіпотезу, що сперматозоїди зберігають своє місце перебування в порожнині SST завдяки безперервному коливальному руху проти напрямку потоку рідини через білкові канали, розташовані на епітеліальних клітинах SST (реологія). АТФ виснажується через постійну активність джгутиків, необхідну для утримання сперматозоїдів у просвіті SST, і рухливість зрештою знижується, доки сперматозоїди не виносяться з банку сперми потоком рідини та не починають нову подорож по висхідній фаллопієвій трубі для запліднення сперматозоїда. Яйцеклітина (Форман4). Ця модель зберігання сперматозоїдів підтверджується виявленням за допомогою імуноцитохімії аквапоринів 2, 3 та 9, присутніх в епітеліальних клітинах SST. На сьогоднішній день досліджень реології сперми курей та її ролі в зберіганні SST, вагінальному відборі сперматозоїдів та конкуренції сперматозоїдів бракує. У курей сперма потрапляє в піхву після природного спарювання, але понад 80% сперматозоїдів викидається з піхви невдовзі після спарювання. Це свідчить про те, що піхва є основним місцем для відбору сперматозоїдів у птахів. Крім того, повідомлялося, що менше 1% сперматозоїдів, запліднених у піхві, потрапляють у SST2. Під час штучного запліднення курчат у піхву кількість сперматозоїдів, які досягають SST, має тенденцію до збільшення через 24 години після запліднення. Поки що механізм відбору сперматозоїдів під час цього процесу незрозумілий, і рухливість сперматозоїдів може відігравати важливу роль у поглинанні сперматозоїдами SST. Через товсті та непрозорі стінки фаллопієвих труб важко безпосередньо контролювати рухливість сперматозоїдів у фаллопієвих трубах птахів. Тому нам бракує базових знань про те, як сперматозоїди переходять до SST після запліднення.
Реологію нещодавно визнали важливим фактором, що контролює транспортування сперматозоїдів у геніталіях ссавців. Ґрунтуючись на здатності рухомих сперматозоїдів мігрувати в протитечії, Заферані та ін.8 використали мікрофлюїдну систему Corra для пасивного виділення рухомих сперматозоїдів зі зразків сперми, що зберігаються у відведених місцях. Цей тип сортування сперми є важливим для лікування безпліддя та клінічних досліджень і є кращим за традиційні методи, які є трудомісткими та трудомісткими, і можуть поставити під загрозу морфологію та структурну цілісність сперматозоїдів. Однак на сьогоднішній день не проводилося жодних досліджень впливу виділень зі статевих органів курей на рухливість сперматозоїдів.
Незалежно від механізму, який підтримує зберігання сперматозоїдів у SST, багато дослідників спостерігали, що резидентні сперматозоїди аглютинують голова до голови в SST курей 9, 10, перепілок 2 та індиків 11, утворюючи аглютиновані пучки сперми. Автори припускають, що існує зв'язок між цією аглютинацією та тривалим зберіганням сперматозоїдів у SST.
Тінгарі та Лейк12 повідомили про сильний зв'язок між сперматозоїдами в сперматозоїдній залозі курки та поставили під сумнів, чи аглютинують сперматозоїди птахів так само, як і сперматозоїди ссавців. Вони вважають, що глибокі зв'язки між сперматозоїдами в сім'явивідній протоці можуть бути зумовлені стресом, спричиненим наявністю великої кількості сперматозоїдів у невеликому просторі.
Під час оцінки поведінки сперматозоїдів на свіжих підвішених скляних слайдах можна побачити тимчасові ознаки аглютинації, особливо на краях крапель сперми. Однак аглютинація часто порушувалася обертальним процесом, пов'язаним з безперервним рухом, що пояснює тимчасовий характер цього явища. Дослідники також помітили, що при додаванні розріджувача до сперми з'являлися видовжені «ниткоподібні» клітинні агрегати.
Ранні спроби імітувати сперматозоїд були зроблені шляхом видалення тонкого дроту з висячої краплі, в результаті чого з краплі сперми виступав видовжений спермоподібний міхур. Сперматозоїди одразу ж вишикувалися паралельно всередині міхура, але вся одиниця швидко зникла через обмеження 3D. Тому для вивчення аглютинації сперматозоїдів необхідно спостерігати за рухливістю та поведінкою сперматозоїдів безпосередньо в ізольованих канальцях для зберігання сперми, що важко досягти. Тому необхідно розробити інструмент, який імітує сперматозоїди, для підтримки досліджень рухливості сперматозоїдів та їхньої поведінки під час аглютинації. Бріллард та ін.13 повідомили, що середня довжина канальців для зберігання сперми у дорослих курчат становить 400–600 мкм, але деякі SST можуть сягати 2000 мкм. Меро та Огасавара14 розділили сім'яні залози на збільшені та незбільшені канальці для зберігання сперматозоїдів, обидві з яких були однакової довжини (~500 мкм) та ширини шийки (~38 мкм), але середній діаметр просвіту канальців становив 56,6 та 56,6 мкм, відповідно 11,2 мкм. У цьому дослідженні ми використовували мікрофлюїдний пристрій з розміром каналу 200 мкм × 20 мкм (Ш × В), поперечний переріз якого дещо близький до поперечного перерізу ампліфікованого SST. Крім того, ми досліджували рухливість сперматозоїдів та їхню аглютинаційну поведінку в рідині, що протікає, що узгоджується з гіпотезою Формана про те, що рідина, що виробляється епітеліальними клітинами SST, утримує сперматозоїди в просвіті в протитечійному (реологічному) напрямку.
Метою цього дослідження було подолати проблеми спостереження за рухливістю сперматозоїдів у фаллопієвих трубах та уникнути труднощів, пов'язаних з вивченням реології та поведінки сперматозоїдів у динамічному середовищі. Був використаний мікрофлюїдний пристрій, який створює гідростатичний тиск для імітації рухливості сперматозоїдів у статевих органах курки.
Коли краплю розведеного зразка сперми (1:40) завантажили в мікроканальний пристрій, можна було ідентифікувати два типи рухливості сперматозоїдів (ізольовані сперматозоїди та зв'язані сперматозоїди). Крім того, сперматозоїди мали тенденцію плавати проти течії (позитивна реологія; відео 1, 2). Хоча пучки сперматозоїдів мали нижчу швидкість, ніж у поодиноких сперматозоїдів (p < 0,001), вони збільшили відсоток сперматозоїдів, що демонстрували позитивний реотаксис (p < 0,001; Таблиця 2). Хоча пучки сперматозоїдів мали нижчу швидкість, ніж у поодиноких сперматозоїдів (p < 0,001), вони збільшили відсоток сперматозоїдів, що демонстрували позитивний реотаксис (p < 0,001; Таблиця 2). Хоча пучки сперматозоїдів мали більш низьку швидкість, ніж у одиничних сперматозоїдів (p <0,001), вони збільшили відсоток сперматозоїдів, що демонструють позитивний реотаксис (p <0,001; таблиця 2). Хоча пучки сперматозоїдів мали нижчу швидкість, ніж швидкість окремих сперматозоїдів (p < 0,001), вони збільшили відсоток сперматозоїдів, що демонструють позитивний реотаксис (p < 0,001; Таблиця 2).尽管精子束的速度低于孤独精子的速度（p < 0,001，但它们增加了显示阳性流变性的精子百分比，(p < 0,001；表2）).尽管 精子束 的 速度 低于 孤独 的 速度 （p <0,001） ， 但 增加 了 显示 阳性 流变性 精子百分比 （p <0,001 ； 2。。。。。。）））)）) Хоча швидкість пучков сперматозоїдів була нижчою, ніж у одиничних сперматозоїдів (p <0,001), вони збільшили відсоток сперматозоїдів з позитивною реологією (p <0,001; таблиця 2). Хоча швидкість руху пучків сперматозоїдів була нижчою, ніж у окремих сперматозоїдів (p < 0,001), вони збільшили відсоток сперматозоїдів з позитивною реологією (p < 0,001; Таблиця 2).Позитивна реологія для окремих сперматозоїдів та пучків оцінюється приблизно в 53% та 85% відповідно.
Було помічено, що сперматозоїди курей шаркасі одразу після еякуляції утворюють лінійні пучки, що складаються з десятків особин. Ці пучки з часом збільшуються в довжині та товщині і можуть залишатися in vitro протягом кількох годин, перш ніж розсіюватися (відео 3). Ці ниткоподібні пучки мають форму сперматозоїдів єхидни, що формуються на кінці придатка яєчка. Було виявлено, що сперма курей шаркаші має високу схильність до аглютинації та утворення сітчастого пучка менш ніж за одну хвилину після збору. Ці пучки є динамічними та здатні прилипати до будь-яких сусідніх стінок або статичних об'єктів. Хоча пучки сперматозоїдів знижують швидкість сперматозоїдів, очевидно, що макроскопічно вони збільшують їхню лінійність. Довжина пучків змінюється залежно від кількості сперматозоїдів, зібраних у пучках. Були виділені дві частини пучка: початкова частина, що включає вільну головку аглютинованого сперматозоїда, та кінцева частина, що включає хвіст та весь дистальний кінець сперматозоїда. За допомогою високошвидкісної камери (950 кадрів/с) у початковій частині пучка спостерігали вільні головки аглютинованих сперматозоїдів, які завдяки своєму коливальному руху відповідальні за рух пучка, затягуючи решту в пучок спіралеподібним рухом (Відео 4). Однак у довгих пучках було помічено, що деякі вільні головки сперматозоїдів прилипли до тіла, а кінцева частина пучка діяла як лопаті, допомагаючи рухати пучок.
Під час повільного потоку рідини пучки сперматозоїдів рухаються паралельно один одному, проте вони починають перекриватися та прилипати до всього, що нерухомо, щоб не бути змитими течією зі збільшенням швидкості потоку. Пучки утворюються, коли жменька сперматозоїдів наближається одна до одної, вони починають рухатися синхронно та обвиватися одна навколо одної, а потім прилипають до липкої речовини. На рисунках 1 та 2 показано, як сперматозоїди наближаються одна до одної, утворюючи з'єднання, коли хвости обвиваються один навколо одного.
Дослідники застосували гідростатичний тиск для створення потоку рідини в мікроканалі з метою вивчення реології сперматозоїдів. Був використаний мікроканал розміром 200 мкм × 20 мкм (Ш × В) та довжиною 3,6 мкм. Використовували мікроканали між контейнерами зі шприцами, встановленими на кінцях. Для покращення видимості каналів використовували харчовий барвник.
Прикріпіть з'єднувальні кабелі та аксесуари до стіни. Відео було знято за допомогою фазово-контрастного мікроскопа. З кожним зображенням представлені зображення фазово-контрастної мікроскопії та картування. (A) З'єднання між двома потоками чинить опір потоку через гвинтовий рух (червона стрілка). (B) З'єднання між пучком трубок та стінкою каналу (червоні стрілки), водночас вони з'єднані з двома іншими пучками (жовті стрілки). (C) Пучки сперматозоїдів у мікрофлюїдному каналі починають з'єднуватися один з одним (червоні стрілки), утворюючи сітку пучків сперматозоїдів. (D) Формування мережі пучків сперматозоїдів.
Коли краплю розведеної сперми завантажили в мікрофлюїдний пристрій і створили потік, спостерігали, як пучок сперми рухається проти напрямку потоку. Пучки щільно прилягають до стінок мікроканалів, а вільні головки в початковій частині пучків щільно прилягають до них (відео 5). Вони також прилипають до будь-яких нерухомих частинок на своєму шляху, таких як сміття, щоб протистояти змиванню течією. З часом ці пучки перетворюються на довгі нитки, що захоплюють інші поодинокі сперматозоїди, та коротші пучки (Відео 6). Коли потік починає сповільнюватися, довгі лінії сперми починають утворювати мережу ліній сперми (Відео 7; Рисунок 2).
При високій швидкості потоку (V > 33 мкм/с) спіральні рухи ниток посилюються, оскільки це спроба вловлювати багато окремих сперматозоїдів, що утворюють пучки, краще протистояти силі дрейфу потоку. При високій швидкості потоку (V > 33 мкм/с) спіральні рухи ниток посилюються, оскільки це спроба вловлювати багато окремих сперматозоїдів, що утворюють пучки, краще протистояти силі дрейфу потоку. При високій швидкості потоку (V > 33 мкм/с) спіралевидні рухи нитей усилюються, оскільки вони намагаються поймати безліч окремих сперматозоїдів, що утворюють сечки, які краще протистоять дрейфуючому потоку сили. При високих швидкостях потоку (V > 33 мкм/с) спіральні рухи ниток збільшуються, оскільки вони намагаються вловити багато окремих сперматозоїдів, утворюючи пучки, які краще здатні протистояти силі дрейфу потоку.在高流速 (V > 33 мкм/с)时，螺纹的螺旋运动增加，以试图捕捉许多形成束的单个精子，从而更好地抵抗流动的漂移力。在 高 流速 (v> 33 мкм/с) 时 ， 的 螺旋 运动 增加 ， 以 试图 许多 形成 束 单 个 精子 ，从而 更 地 抵抗 的 漂移力。。。。。。。。。 При великих швидкостях потоку (V > 33 мкм/с) спіральний рух нитей збільшується в спробі захопити безліч окремих сперматозоїдів, що утворюють сечки, щоб краще утворювати протидію силам дрейфа потоку. При високих швидкостях потоку (V > 33 мкм/с) спіральний рух філаментів збільшується в спробі захопити багато окремих сперматозоїдів, утворюючи пучки, щоб краще протистояти силам дрейфу потоку.Вони також спробували прикріпити мікроканали до бокових стінок.
Пучки сперматозоїдів були ідентифіковані як скупчення головок сперматозоїдів та завитих хвостів за допомогою світлової мікроскопії (СМ). Пучки сперматозоїдів з різними агрегатами також були ідентифіковані як закручені головки та агрегати джгутиків, множинні зрощені хвости сперматозоїдів, головки сперматозоїдів, прикріплені до хвоста, та головки сперматозоїдів із зігнутими ядрами як множинні зрощені ядра. Трансмісійна електронна мікроскопія (ТЕМ). Скануюча електронна мікроскопія (СЕМ) показала, що пучки сперматозоїдів були вкритими оболонкою агрегатами головок сперматозоїдів, а агрегати сперматозоїдів мали прикріплену мережу загорнутих хвостів.
Морфологію та ультраструктуру сперматозоїдів, формування пучків сперматозоїдів вивчали за допомогою світлової мікроскопії (півзрізу), скануючої електронної мікроскопії (СЕМ) та просвічувальної електронної мікроскопії (ТЕМ), мазки сперми забарвлювали акридиновим оранжевим та досліджували за допомогою епіфлуоресцентної мікроскопії.
Фарбування мазка сперми акридиновим оранжевим (рис. 3B) показало, що головки сперматозоїдів були злиплі та покриті секреторним матеріалом, що призвело до утворення великих пучків (рис. 3D). Пучки сперматозоїдів складалися з агрегатів сперматозоїдів з мережею прикріплених хвостів (рис. 4A-C). Пучки сперматозоїдів складаються з хвостів багатьох сперматозоїдів, злиплих разом (рис. 4D). Секрети (рис. 4E,F) покривали головки пучків сперматозоїдів.
Формування пучка сперматозоїдів. Використання фазово-контрастної мікроскопії та мазків сперматозоїдів, забарвлених акридиновим оранжевим, показало, що головки сперматозоїдів злипаються. (A) Раннє формування пучків сперматозоїдів починається зі сперматозоїда (біле коло) та трьох сперматозоїдів (жовте коло), причому спіраль починається біля хвоста та закінчується голівкою. (B) Мікрофотографія мазка сперматозоїдів, забарвленого акридиновим оранжевим, на якій видно прикріплені головки сперматозоїдів (стрілки). Розряд покриває головку(и). Збільшення × 1000. (C) Розвиток великого променя, що транспортується потоком у мікрофлюїдному каналі (за допомогою високошвидкісної камери зі швидкістю 950 кадрів/с). (D) Мікрофотографія мазка сперматозоїдів, забарвленого акридиновим оранжевим, на якому видно великі пучки (стрілки). Збільшення: ×200.
Скануюча електронна мікрофотографія пучка сперматозоїдів та мазка сперматозоїдів, забарвленого акридиновим оранжевим. (A, B, D, E) – це цифрові кольорові скануючі електронні мікрофотографії сперматозоїдів, а C та F – мікрофотографії мазків сперматозоїдів, забарвлених акридиновим оранжевим, що показують прикріплення кількох сперматозоїдів, що обгортають хвостову перетинку. (AC) Агрегати сперматозоїдів показано у вигляді мережі прикріплених хвостів (стрілки). (D) Адгезія кількох сперматозоїдів (з клейкою речовиною, рожевий контур, стрілка), що обгортаються навколо хвоста. (E та F) Агрегати головок сперматозоїдів (вказівники), покриті клейким матеріалом (вказівниками). Сперматозоїди утворили пучки з кількома вихроподібними структурами (F). (C) Збільшення ×400 та (F) ×200.
За допомогою просвічувальної електронної мікроскопії ми виявили, що пучки сперматозоїдів мали прикріплені хвости (рис. 6A, C), головки, прикріплені до хвостів (рис. 6B), або головки, прикріплені до хвостів (рис. 6D). Головки сперматозоїдів у пучку вигнуті, що на розрізі представляє дві ядерні області (рис. 6D). У розрізі пучка сперматозоїди мали скручену головку з двома ядерними областями та кількома джгутиковими областями (рис. 5A).
Цифрова кольорова електронна мікрофотографія, що показує з'єднувальні хвости у пучку сперматозоїдів та аглютинуючий матеріал, що з'єднує головки сперматозоїдів. (A) Прикріплений хвіст великої кількості сперматозоїдів. Зверніть увагу, як виглядає хвіст у портретній (стрілка) та альбомній (стрілка) проєкціях. (B) Головка (стрілка) сперматозоїда з'єднана з хвостом (стрілка). (C) Кілька хвостів сперматозоїдів (стрілки) прикріплені. (D) Аглютинуючий матеріал (AS, синій) з'єднує чотири головки сперматозоїдів (фіолетовий).
Для виявлення головок сперматозоїдів у пучках сперми, покритих секретами або мембранами (рис. 6B), було використано скануючу електронну мікроскопію, що вказує на те, що пучки сперми були закріплені позаклітинним матеріалом. Аглютинований матеріал був зосереджений у головці сперматозоїда (головоподібна структура медузи; рис. 5B) та розширений дистально, надаючи блискучо-жовтого вигляду під флуоресцентною мікроскопією при забарвленні акридиновим помаранчевим (рис. 6C). Ця речовина чітко видно під скануючим мікроскопом і вважається сполучною речовиною. Напівтонкі зрізи (рис. 5C) та мазки сперми, забарвлені акридиновим помаранчевим, показали пучки сперми, що містять щільно упаковані головки та закручені хвости (рис. 5D).
Різні мікрофотографії, що показують агрегацію головок сперматозоїдів та складених хвостів, отриманих за допомогою різних методів. (A) Поперечний переріз цифрової кольорової трансмісійної електронної мікрофотографії пучка сперматозоїдів, на якій зображена спіральна головка сперматозоїда з двочастинним ядром (синій) та кількома джгутиковими частинами (зелений). (B) Цифрова кольорова скануюча електронна мікрофотографія, що показує скупчення медузоподібних головок сперматозоїдів (стрілки), які, здається, покриті. (C) Напівтонкий зріз, що показує агреговані головки сперматозоїдів (стрілки) та закручені хвости (стрілки). (D) Мікрофотографія мазка сперми, забарвленого акридиновим оранжевим, що показує агрегати головок сперматозоїдів (стрілки) та закручені прикріплені хвости (стрілки). Зверніть увагу, що головку сперматозоїда покриває липка речовина (S). (D) Збільшення × 1000.
За допомогою просвічувальної електронної мікроскопії (рис. 7А) також було зазначено, що головки сперматозоїдів були скручені, а ядра мали спіралеподібну форму, що підтверджено мазками сперми, забарвленими акридиновим оранжевим та дослідженими за допомогою флуоресцентної мікроскопії (рис. 7B).
(A) Цифрова кольорова трансмісійна електронна мікрофотографія та (B) мазок сперми, забарвлений акридиновим оранжевим, що показує спіралізовані головки та прикріплення головок і хвостів сперматозоїдів (стрілки). (B) Збільшення × 1000.
Цікавим відкриттям є те, що сперматозоїди Шарказі агрегуються, утворюючи рухливі ниткоподібні пучки. Властивості цих пучків дозволяють нам зрозуміти їхню можливу роль у поглинанні та зберіганні сперматозоїдів у SST.
Після спарювання сперматозоїди потрапляють у піхву та проходять інтенсивний процес відбору, в результаті чого лише обмежена кількість сперматозоїдів потрапляє в SST15,16. На сьогоднішній день механізми, за допомогою яких сперматозоїди потрапляють і виходять з SST, незрозумілі. У свійської птиці сперматозоїди зберігаються в SST протягом тривалого періоду від 2 до 10 тижнів, залежно від виду6. Залишаються суперечки щодо стану сперми під час зберігання в SST. Чи перебувають вони в русі чи у стані спокою? Іншими словами, як сперматозоїди так довго зберігають своє положення в SST?
Форман4 припустив, що перебування та викид SST можна пояснити рухливістю сперматозоїдів. Автори висувають гіпотезу, що сперматозоїди зберігають своє положення, плаваючи проти потоку рідини, створеного епітелієм SST, і що сперматозоїди викидаються з SST, коли їхня швидкість падає нижче точки, в якій вони починають рухатися назад через брак енергії. Занібоні5 підтвердив наявність аквапоринів 2, 3 та 9 в апікальній частині епітеліальних клітин SST, що може опосередковано підтверджувати модель зберігання сперматозоїдів Формана. У цьому дослідженні ми виявили, що майже половина сперматозоїдів Шаркаші демонструють позитивну реологію в рідині, що тече, і що аглютиновані пучки сперматозоїдів збільшують кількість сперматозоїдів, які демонструють позитивну реологію, хоча аглютинація їх уповільнює. Як сперматозоїди рухаються по матковій трубі птаха до місця запліднення, до кінця не зрозуміло. У ссавців фолікулярна рідина хемоатрактує сперматозоїди. Однак вважається, що хемоатрактанти спрямовують сперматозоїди наближатися на великі відстані7. Отже, за транспортування сперматозоїдів відповідають інші механізми. Повідомлялося, що здатність сперматозоїдів орієнтуватися та текти проти рідини з фаллопієвих труб, що виділяється після спарювання, є основним фактором у націлюванні на сперматозоїди у мишей. Паркер17 припустив, що сперматозоїди перетинають яйцепроводи, плаваючи проти війкового потоку у птахів та рептилій. Хоча це не було експериментально продемонстровано у птахів, Адольфі18 першим виявив, що сперма птахів дає позитивні результати, коли тонкий шар рідини між покривним склом та предметним склом створюється за допомогою смужки фільтрувального паперу. Реологія. Хіно та Янагімачі [19] помістили комплекс яєчник-трубно-матковий комплекс миші в перфузійне кільце та ввели 1 мкл чорнила в перешийок, щоб візуалізувати потік рідини в фаллопієвих трубах. Вони помітили дуже активний рух скорочення та розслаблення в фаллопієвій трубі, при якому всі кульки чорнила стабільно рухалися до ампули фаллопієвої труби. Автори наголошують на важливості потоку трубної рідини з нижньої до верхньої частини фаллопієвих труб для підйому та запліднення сперматозоїдів. Брільяр20 повідомив, що у курей та індиків сперматозоїди мігрують шляхом активного руху від входу у піхву, де вони зберігаються, до матково-піхвового переходу, де вони зберігаються. Однак цей рух не є обов'язковим між матково-піхвовим переходом та воронкою, оскільки сперматозоїди транспортуються шляхом пасивного переміщення. Знаючи ці попередні рекомендації та результати, отримані в поточному дослідженні, можна припустити, що здатність сперматозоїдів рухатися вгору за течією (реологія) є однією з властивостей, на яких базується процес відбору. Це визначає проходження сперматозоїдів через піхву та їх потрапляння в ЦМТ для зберігання. Як припустив Форман4, це також може полегшити процес потрапляння сперматозоїдів у ПМТ та його середовище існування на певний період часу, а потім виходу, коли їхня швидкість починає сповільнюватися.
З іншого боку, Мацудзакі та Сасанамі21 припустили, що сперматозоїди птахів зазнають змін у рухливості від стану спокою до рухливості в чоловічих та жіночих репродуктивних трактах. Пригнічення рухливості резидентних сперматозоїдів у SST було запропоновано пояснити тривалий час зберігання сперми, а потім її омолодження після виходу з SST. В умовах гіпоксії Мацудзакі та ін.1 повідомили про високе вироблення та вивільнення лактату в SST, що може призвести до пригнічення рухливості резидентних сперматозоїдів. У цьому випадку важливість реології сперматозоїдів відображається у відборі та поглинанні сперматозоїдів, а не в їх зберіганні.
Характер аглютинації сперматозоїдів вважається правдоподібним поясненням тривалого періоду зберігання сперми в ССТ, оскільки це поширена модель затримки сперматозоїдів у свійської птиці2,22,23. Бакст та ін.2 спостерігали, що більшість сперматозоїдів злипалися один з одним, утворюючи пучкові агрегати, а поодинокі сперматозоїди рідко зустрічалися в ККМ перепілок. З іншого боку, Вен та ін.24 спостерігали більше розсіяних сперматозоїдів та менше пучків сперматозоїдів у просвіті ССТ у курей. На основі цих спостережень можна припустити, що схильність до аглютинації сперматозоїдів відрізняється між птахами та між сперматозоїдами в одному еякуляті. Крім того, Ван Крей та ін.9 припустили, що випадкова дисоціація аглютинованих сперматозоїдів відповідає за поступове проникнення сперматозоїдів у просвіт фаллопієвої труби. Згідно з цією гіпотезою, сперматозоїди з нижчою аглютинаційною здатністю повинні бути вигнані з ССТ першими. У цьому контексті здатність сперматозоїдів до аглютинації може бути фактором, що впливає на результат конкуренції сперматозоїдів у брудних птахів. Крім того, чим довше дисоціюють аглютиновані сперматозоїди, тим довше зберігається фертильність.
Хоча агрегація сперматозоїдів та їхнє утворення в пучки спостерігалися в кількох дослідженнях2,22,24, вони не були детально описані через складність їх кінематичного спостереження в рамках SST. Було зроблено кілька спроб вивчити аглютинацію сперматозоїдів in vitro. Значна, але тимчасова агрегація спостерігалася, коли тонкий дріт видаляли з краплі насіння, що звисала. Це призводить до того, що з краплі виступає видовжена бульбашка, що імітує сім'яну залозу. Через 3D-обмеження та короткий час висихання весь блок швидко прийшов у непридатність9. У поточному дослідженні, використовуючи курчат Шаркаші та мікрофлюїдні чіпи, ми змогли описати, як утворюються ці пучки та як вони рухаються. Пучки сперматозоїдів утворювалися одразу після збору сперми та, як було виявлено, рухалися по спіралі, демонструючи позитивну реологію, коли були присутні в потоці. Крім того, при макроскопічному огляді спостерігалося збільшення лінійності рухливості пучків сперматозоїдів порівняно з ізольованими сперматозоїдами. Це свідчить про те, що аглютинація сперматозоїдів може відбуватися до проникнення SST, і що виробництво сперматозоїдів не обмежується невеликою ділянкою через стрес, як передбачалося раніше (Tingari та Lake12). Під час формування пучка сперматозоїди плавають синхронно, доки не утворюють з'єднання, потім їхні хвости обвивають один одного, і головка сперматозоїда залишається вільною, але хвіст і дистальна частина сперматозоїда злипаються за допомогою липкої речовини. Тому вільна головка зв'язки відповідає за рух, тягнучи за собою решту зв'язки. Скануюча електронна мікроскопія пучків сперматозоїдів показала прикріплені головки сперматозоїдів, покриті великою кількістю липкого матеріалу, що свідчить про те, що головки сперматозоїдів були прикріплені в пучках спокою, що могло статися після досягнення місця зберігання (SST).
Коли мазок сперми забарвлюють акридиновим помаранчевим, під флуоресцентним мікроскопом можна побачити позаклітинний адгезивний матеріал навколо сперматозоїдів. Ця речовина дозволяє пучкам сперматозоїдів прилипати та чіплятися за будь-які навколишні поверхні або частинки, щоб вони не дрейфували разом з навколишнім потоком. Таким чином, наші спостереження показують роль адгезії сперматозоїдів у формі рухомих пучків. Їхня здатність плавати проти течії та прилипати до сусідніх поверхонь дозволяє сперматозоїдам довше залишатися в SST.
Ротшильд25 використовував гемоцитометричну камеру для вивчення розподілу плаваючої сперми великої рогатої худоби в краплі суспензії, роблячи мікрофотографії за допомогою камери з вертикальною та горизонтальною оптичними вісями мікроскопа. Результати показали, що сперматозоїди притягувалися до поверхні камери. Автори припускають, що між спермою та поверхнею можуть існувати гідродинамічні взаємодії. Беручи це до уваги, разом зі здатністю сперми курчат Шаркаші утворювати липкі пучки, це може збільшити ймовірність того, що сперма прилипне до стінки SST та зберігатиметься протягом тривалого часу.
Бчетті та Афцеліу26 повідомили, що глікокалікс сперматозоїдів необхідний для розпізнавання та аглютинації гамет. Форман10 спостерігав, що гідроліз α-глікозидних зв'язків у глікопротеїн-гліколіпідних покриттях шляхом обробки сперми птахів нейрамінідазою призвів до зниження фертильності без впливу на рухливість сперматозоїдів. Автори припускають, що вплив нейрамінідази на глікокалікс погіршує секвестрацію сперматозоїдів на матково-вагінальному з'єднанні, тим самим знижуючи фертильність. Їхні спостереження не можуть ігнорувати можливість того, що обробка нейрамінідазою може зменшити розпізнавання сперматозоїдів та ооцитів. Форман та Енгель10 виявили, що фертильність знижувалася, коли курей інтравагінально запліднювали спермою, обробленою нейрамінідазою. Однак ЕКЗ зі спермою, обробленою нейрамінідазою, не вплинуло на фертильність порівняно з контрольною групою курей. Автори дійшли висновку, що зміни в глікопротеїн-гліколіпідному покритті навколо мембрани сперматозоїда знижують здатність сперматозоїдів до запліднення, погіршуючи секвестрацію сперматозоїдів у матково-вагінальному з'єднанні, що, у свою чергу, збільшує втрату сперматозоїдів через швидкість матково-вагінального з'єднання, але не впливає на розпізнавання сперматозоїдів та яйцеклітин.
У індиків Бакст і Баучан 11 виявили невеликі везикули та фрагменти мембрани в просвіті SST і спостерігали, що деякі з цих гранул злилися з мембраною сперматозоїда. Автори припускають, що ці взаємозв'язки можуть сприяти тривалому зберіганню сперматозоїдів у SST. Однак дослідники не вказали джерело цих частинок, чи секретуються вони епітеліальними клітинами CCT, чи виробляються та секретуються чоловічою репродуктивною системою, чи виробляються самою спермою. Також ці частинки відповідають за аглютинацію. Грютцнер та ін.27 повідомили, що епітеліальні клітини придатка яєчка виробляють та секретують специфічний білок, необхідний для формування однопорових сім'яних шляхів. Автори також повідомляють, що дисперсія цих пучків залежить від взаємодії білків придатка яєчка. Ніксон та ін.28 виявили, що придатки секретують білок, кислий багатий на цистеїн остеонектин; SPARC бере участь у формуванні пучків сперми у короткодзьобих єхидн та качкодзьобів. Розсіювання цих променів пов'язане з втратою цього білка.
У цьому дослідженні ультраструктурний аналіз за допомогою електронної мікроскопії показав, що сперматозоїди прилипли до великої кількості щільного матеріалу. Вважається, що ці речовини відповідають за аглютинацію, яка конденсується між та навколо прилиплих головок, але в нижчих концентраціях у хвостовій області. Ми припускаємо, що ця аглютинуюча речовина виділяється з чоловічої репродуктивної системи (придатка яєчка або сім'явивідної протоки) разом зі спермою, оскільки ми часто спостерігаємо відділення сперми від лімфи та сім'явивідної плазми під час еякуляції. Повідомлялося, що коли сперматозоїди птахів проходять через придаток яєчка та сім'явивідну протоку, вони зазнають змін, пов'язаних з дозріванням, які підтверджують їхню здатність зв'язувати білки та набувати глікопротеїни, пов'язані з лемою плазми. Персистенція цих білків на резидентних мембранах сперматозоїдів у SST свідчить про те, що ці білки можуть впливати на набуття стабільності мембрани сперматозоїдів 30 та визначати їхню фертильність 31. Ахаммад та ін.32 повідомили, що сперматозоїди, отримані з різних частин чоловічої репродуктивної системи (від яєчок до дистального відділу сім'явивідної протоки), демонстрували поступове збільшення життєздатності в рідких умовах зберігання, незалежно від температури зберігання, а життєздатність у курей також зростає в фаллопієвих трубах після штучного запліднення.
Пучки сперми курей шаркаші мають інші характеристики та функції, ніж інші види, такі як єхидни, качкодзьоби, лісові миші, оленячі щури та морські свинки. У курей шаркаші утворення пучків сперматозоїдів знижувало їхню швидкість плавання порівняно з окремими сперматозоїдами. Однак ці пучки збільшували відсоток реологічно позитивних сперматозоїдів та підвищували здатність сперматозоїдів стабілізуватися в динамічному середовищі. Таким чином, наші результати підтверджують попереднє припущення про те, що аглютинація сперматозоїдів у SST пов'язана з тривалим зберіганням сперми. Ми також висуваємо гіпотезу, що схильність сперматозоїдів до утворення пучків може контролювати швидкість втрати сперматозоїдів у SST, що може змінити результат конкуренції сперматозоїдів. Згідно з цим припущенням, сперматозоїди з низькою аглютинаційною здатністю першими вивільняють SST, тоді як сперматозоїди з високою аглютинаційною здатністю продукують більшу частину потомства. Утворення пучків сперматозоїдів з однією порою є корисним і впливає на співвідношення батьків і дітей, але використовує інший механізм. У єхидн та качкодзьобів сперматозоїди розташовані паралельно один одному, щоб збільшити швидкість руху променя. Пучки єхидн рухаються приблизно втричі швидше, ніж окремі сперматозоїди. Вважається, що утворення таких пучків сперми у єхидн є еволюційною адаптацією для підтримки домінування, оскільки самки нерозбірливі та зазвичай спаровуються з кількома самцями. Тому сперматозоїди з різних еякулятів запекло конкурують за запліднення яйцеклітини.
Аглютиновані сперматозоїди курей шаркасі легко візуалізувати за допомогою фазово-контрастної мікроскопії, що вважається перевагою, оскільки дозволяє легко вивчати поведінку сперматозоїдів in vitro. Механізм, за допомогою якого утворення пучків сперми сприяє розмноженню у курей шаркасі, також відрізняється від того, що спостерігається у деяких плацентарних ссавців, що представляють кооперативну поведінку сперматозоїдів, таких як лісові миші, де деякі сперматозоїди досягають яйцеклітин, допомагаючи іншим спорідненим особинам досягати та пошкоджувати їхні яйця. проявити себе. альтруїстична поведінка. Самозапліднення 34. Інший приклад кооперативної поведінки сперматозоїдів був виявлений у оленячих мишей, де сперматозоїди змогли ідентифікувати та об'єднуватися з найбільш генетично спорідненими сперматозоїдами та формувати кооперативні групи, щоб збільшити свою швидкість порівняно з неспорідненими сперматозоїдами35.
Результати, отримані в цьому дослідженні, не суперечать теорії Фомана про тривале зберігання сперматозоїдів у сперматозоїдах (SWS). Дослідники повідомляють, що сперматозоїди продовжують рухатися в потоці епітеліальних клітин, що вистилають SST, протягом тривалого періоду часу, і через певний проміжок часу запаси енергії сперматозоїдів виснажуються, що призводить до зниження швидкості, що дозволяє виштовхувати речовини з малою молекулярною масою разом з потоком рідини з просвіту SST. У цьому дослідженні ми спостерігали, що половина окремих сперматозоїдів демонструвала здатність плавати проти течії рідини, а їх адгезія в пучку збільшила їхню здатність демонструвати позитивну реологію. Крім того, наші дані узгоджуються з даними Мацудзакі та ін.1, які повідомили, що підвищена секреція лактату в SST може пригнічувати рухливість резидентних сперматозоїдів. Однак наші результати описують формування рухливих зв'язок сперматозоїдів та їх реологічну поведінку за наявності динамічного середовища в мікроканалі, намагаючись з'ясувати їхню поведінку в SST. Майбутні дослідження можуть бути зосереджені на визначенні хімічного складу та походження аглютинуючого агента, що, безсумнівно, допоможе дослідникам розробити нові способи зберігання рідкої сперми та збільшення тривалості фертильності.
П'ятнадцять 30-тижневих самців шаркасі без шиї (гомозиготні домінантні; NaNa) були відібрані як донори сперми для дослідження. Птахів вирощували на дослідницькій птахофермі факультету сільського господарства Університету Ашит, губернаторство Ашит, Єгипет. Птахів розміщували в індивідуальних клітках (30 x 40 x 40 см), піддавали світловій програмі (16 годин світла та 8 годин темряви) та годували раціоном, що містив 160 г сирого протеїну, 2800 ккал метаболічної енергії, 35 г кальцію кожен, 5 грамів доступного фосфору на кілограм раціону.
Згідно з даними 36, ​​37, сперму у чоловіків збирали за допомогою масажу живота. Загалом протягом 3 днів у 15 чоловіків було зібрано 45 зразків сперми. Сперму (n = 15/день) негайно розводили 1:1 (об'єм:об'єм) розчинником для сперми птиці Belsville, який містить дифосфат калію (1,27 г), глутамат натрію моногідрат (0,867 г), фруктозу (0,5 г), безводний ацетат натрію (0,43 г), трис(гідроксиметил)амінометан (0,195 г), моногідрат цитрату калію (0,064 г), монофосфат калію (0,065 г), хлорид магнію (0,034 г) та H2O (100 мл), pH = 7,5, осмолярність 333 мОсм/кг38. Розведені зразки сперми спочатку досліджували під світловим мікроскопом, щоб переконатися в її якості (вологості), а потім зберігали у водяній бані при температурі 37°C до використання протягом півгодини після збору.
Кінематику та реологію сперматозоїдів описано за допомогою системи мікрофлюїдних пристроїв. Зразки сперми додатково розводили до співвідношення 1:40 у розчиннику для сперми птахів Beltsville, завантажували в мікрофлюїдний пристрій (див. нижче), а кінетичні параметри визначали за допомогою системи комп'ютерного аналізу сперми (CASA), розробленої раніше для характеристики мікрофлюїдних даних. Плагін можна завантажити за адресою: http://www.assiutmicrofluidics.com/research/casa39. Були виміряні швидкість кривої (VCL, мкм/с), лінійна швидкість (VSL, мкм/с) та середня швидкість траєкторії (VAP, мкм/с). Відео сперматозоїдів знімали за допомогою інвертованого фазово-контрастного мікроскопа Optika XDS-3 (з об'єктивом 40x), підключеного до камери Tucson ISH1000, зі швидкістю 30 кадрів/с протягом 3 секунд. Використовуйте програмне забезпечення CASA для вивчення щонайменше трьох областей та 500 траєкторій сперматозоїдів на зразок. Записане відео було оброблено за допомогою саморобного CASA. Визначення рухливості в плагіні CASA базується на швидкості плавання сперматозоїдів порівняно зі швидкістю потоку та не включає інші параметри, такі як рух з боку в бік, оскільки це було визнано більш надійним при потоці рідини. Реологічний рух описується як рух сперматозоїдів проти напрямку потоку рідини. Кількість сперматозоїдів з реологічними властивостями поділяли на кількість рухомих сперматозоїдів; сперматозоїди, що перебували у стані спокою, та сперматозоїди, що конвективно рухалися, виключали з підрахунку.
Усі використані хімічні речовини були отримані від Elgomhoria Pharmaceuticals (Каїр, Єгипет), якщо не зазначено інше. Пристрій було виготовлено, як описано El-sherry et al.40 з деякими модифікаціями. Матеріали, використані для виготовлення мікроканалів, включали скляні пластини (Howard Glass, Вустер, Массачусетс), негативний резист SU-8-25 (MicroChem, Ньютон, Каліфорнія), діацетоновий спирт (Sigma Aldrich, Steinheim, Німеччина) та поліацетон.-184, Dow Corning, Мідленд, Мічиган). Мікроканали виготовляються за допомогою м'якої літографії. Спочатку прозору захисну маску для обличчя з бажаним дизайном мікроканалу друкували на принтері високої роздільної здатності (Prismatic, Каїр, Єгипет та Pacific Arts and Design, Маркем, Онтаріо). Майстер-класи виготовляли з використанням скляних пластин як підкладок. Пластини очищали в ацетоні, ізопропанолі та деіонізованій воді, а потім покривали шаром SU8-25 товщиною 20 мкм методом центрифугування (3000 об/хв, 1 хв). Шари SU-8 потім обережно висушили (65°C, 2 хв та 95°C, 10 хв) та піддали впливу УФ-випромінювання протягом 50 с. Після експонування проводили випікання при 65°C та 95°C протягом 1 хв та 4 хв для зшивання експонованих шарів SU-8, а потім проявили в діацетоновому спирті протягом 6,5 хв. Вафлі випікали до твердого стану (200°C протягом 15 хв) для подальшого затвердіння шару SU-8.
ПДМС готували шляхом змішування мономеру та затверджувача у ваговому співвідношенні 10:1, потім дегазували у вакуумному ексикаторі та виливали на основну раму SU-8. ПДМС затвердівали в печі (120°C, 30 хв), потім канали вирізали, відокремлювали від макету та перфорували, щоб можна було прикріпити трубки на вході та виході мікроканалу. Нарешті, мікроканали ПДМС були постійно прикріплені до предметних стекол мікроскопа за допомогою портативного коронного процесора (Electro-Technic Products, Чикаго, Іллінойс), як описано в іншому місці. Мікроканал, використаний у цьому дослідженні, має розмір 200 мкм × 20 мкм (Ш × В) та довжину 3,6 см.
Потік рідини, викликаний гідростатичним тиском всередині мікроканалу, досягається шляхом підтримки рівня рідини у вхідному резервуарі вище різниці висот Δh39 у вихідному резервуарі (рис. 1).
де f – коефіцієнт тертя, що визначається як f = C/Re для ламінарного потоку в прямокутному каналі, де C – константа, що залежить від співвідношення сторін каналу, L – довжина мікроканалу, Vav – середня швидкість всередині мікроканалу, Dh – гідравлічний діаметр каналу, g – прискорення вільного падіння. Використовуючи це рівняння, середню швидкість каналу можна розрахувати за допомогою наступного рівняння: