Дякуємо за відвідування Nature.com. Версія веб-переглядача, яку ви використовуєте, має обмежену підтримку CSS. Для найкращого досвіду ми рекомендуємо вам використовувати оновлений браузер (або вимкнути режим сумісності в Internet Explorer). Тим часом, щоб забезпечити постійну підтримку, ми відображатимемо сайт без стилів і JavaScript.
Частинки пористого кремнезему були отримані золь-гелевим методом з деякими модифікаціями для отримання макропористих частинок. Ці частинки були дериватизовані полімеризацією з оборотним додаванням фрагментаційного перенесення ланцюга (RAFT) з N-фенілмалеімід-метилвінілізоціанатом (PMI) і стиролом для отримання N-фенілмалеімідної інтеркаляції полістиролу (PMP) нерухомої фази. Вузькоканальна колона з нержавіючої сталі s (100 × 1,8 мм внутр.) були упаковані за допомогою суспензії. Оцінювано хроматографічну продуктивність PMP-розділення суміші пептидів, що складається з п’яти пептидів (Gly-Tyr, Gly-Leu-Tyr, Gly-Gly-Tyr-Arg, Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg, лейцин-енкефалін)) і розщеплення трипсином сироваткового альбуміну людини (HAS). За оптимальних умов елюції теоретична кількість чашок пептидної суміші досягає 280 000 пластин/м². Порівнюючи ефективність розділення розробленої колонки з комерційною колонкою Ascentis Express RP-Amide, було виявлено, що ефективність розділення колонки PMP була кращою, ніж комерційна колонка з точки зору ефективності розділення та роздільної здатності.
Останніми роками біофармацевтична промисловість стала зростаючим світовим ринком зі значним збільшенням частки ринку. З вибуховим зростанням біофармацевтичної промисловості1,2,3 аналіз пептидів і білків є дуже бажаним. Окрім цільового пептиду, під час синтезу пептидів утворюється декілька домішок, що вимагає хроматографічного очищення для отримання пептидів бажаної чистоти. Аналіз і характеристика білків у рідинах організму, тканин і клітин є надзвичайно складним завданням через велику кількість потенційно виявлених видів в одному зразку. Хоча мас-спектрометрія є ефективним інструментом для секвенування пептидів і білків, якщо такі зразки вводити в мас-спектрометр за один прохід, розділення не буде ідеальним. Цю проблему можна пом’якшити шляхом впровадження розділення за допомогою рідинної хроматографії (РХ) перед МС-аналізом, що зменшить кількість аналітів, що надходять у мас-спектрометр. у певний час4,5,6. Крім того, під час розділення рідкої фази аналіти можуть бути зосереджені у вузьких областях, таким чином концентруючи ці аналіти та покращуючи чутливість виявлення MS. Рідинна хроматографія (РХ) значно просунулася вперед за останнє десятиліття та стала популярною технікою в протеомному аналізі7,8,9,10.
Обернено-фазова рідинна хроматографія (RP-LC) широко використовується для очищення та розділення пептидних сумішей з використанням октадецил-модифікованого діоксиду кремнію (ODS) як нерухомої фази11,12,13. Однак стаціонарні фази RP не забезпечують задовільного розділення пептидів і білків через їх складну структуру та амфіфільну природу 14,15. Тому спеціально розроблені стаціонарні фази потрібні для аналізу пептидів і білків із полярними та неполярними фрагментами, щоб взаємодіяти з цими аналітами та зберігати їх16. Змішана хроматографія, яка забезпечує мультимодальні взаємодії, може бути альтернативою RP-LC для поділу пептидів, білків та інших складних сумішей. Було підготовлено кілька змішаних стаціонарних фаз, і колонки, заповнені цими фазами, використовувалися для поділу пептидів і білків17 ,18,19,20,21. Стаціонарні фази змішаного режиму (WAX/RPLC, HILIC/RPLC, полярна інтеркаляція/RPLC) підходять для поділу пептидів і білків завдяки наявності як полярних, так і неполярних груп22,23,24,25,26,27,28. Подібним чином, полярні інтеркалюючі стаціонарні фази з ковалентно зв’язаними полярними групами демонструють хорошу роздільну здатність унікальна селективність для полярних і неполярних аналітів, оскільки розділення залежить від взаємодії між аналітом і нерухомою фазою.Мультимодальні взаємодії 29, 30, 31, 32. Нещодавно Zhang et al.30 підготував стаціонарну фазу поліаміну з кінцевими додецилами та успішно відокремив вуглеводні, антидепресанти, флавоноїди, нуклеозиди, естрогени та кілька інших аналітів. Полярний інтеркалятор має як полярні, так і неполярні групи, тому його можна використовувати для розділення пептидів і білків, які мають як гідрофобні, так і гідрофільні частини. Полярні вбудовані колонки (наприклад, вбудований амід C18 колонки) комерційно доступні під торговою назвою Ascentis Express RP-Amide columns, але ці колонки використовуються лише для аналізу аміну 33.
У поточному дослідженні була підготовлена ​​та оцінена полярна стаціонарна фаза (полістирол з N-фенілмалеімідом) для розділення пептидів і трипсинових переварів HSA. Стаціонарна фаза була підготовлена ​​за наступною стратегією. Частинки пористого кремнезему були підготовлені згідно з процедурою, наведеною в нашій попередній публікації, з деякими змінами в протоколі підготовки. Співвідношення сечовини, поліетиленгліколю (PEG), TMOS , вода оцтова кислота була відрегульована для отримання частинок діоксиду кремнію з великим розміром пор. По-друге, новий ліганд, фенілмалеімід-метил вінілізоціанат, був синтезований і використаний для дериватізації частинок діоксиду кремнію для отримання полярної вбудованої стаціонарної фази. Отриману стаціонарну фазу було упаковано в колонку з нержавіючої сталі (100 × 1,8 мм внутр.) за допомогою оптимізованої схеми пакування. з механічною вібрацією, щоб забезпечити утворення однорідного шару всередині колонки. Оцініть розділення наповненої колонки пептидних сумішей, що складаються з п’яти пептидів;(Gly-Tyr, Gly-Leu-Tyr, Gly-Gly-Tyr-Arg, Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg, Leucine Enkephalin) і трипсиновий гідроліз сироваткового альбуміну людини (HAS). Спостерігалося розділення пептидної суміші та трипсинового гідролізу HSA з хорошою роздільною здатністю та ефективністю. Продуктивність розділення колонки PMP порівнювалася з продуктивністю колонки Ascentis Express RP-Amide. спостерігалося, що пептиди та білки добре розділені та ефективні на колонці PMP, яка була ефективнішою, ніж колонка Ascentis Express RP-Amide.
PEG (поліетиленгліколь), сечовина, оцтова кислота, триметоксіортосилікат (TMOS), триметилхлорсилан (TMCS), трипсин, сироватковий альбумін людини (HSA), хлорид амонію, сечовина, гексан-метилдисилазан (HMDS), метакрилоїлхлорид (MC), стирол, 4-гідрокси-TEMPO, пероксид бензоїлу (B). PO), ацетонітрил класу ВЕРХ (ACN), метанол, 2-пропанол і ацетон, придбані у Sigma-Aldrich (Сент-Луїс, Миссурі, США).
Суміш сечовини (8 г), поліетиленгліколю (8 г) і 8 мл 0,01 н. оцтової кислоти перемішували протягом 10 хвилин, а потім до неї додавали 24 мл TMOS в умовах охолодження льоду. Реакційну суміш нагрівали при 40 °C протягом 6 годин, а потім при 120 °C протягом 8 годин в автоклаві з нержавіючої сталі. Воду зливали і залишковий матеріал був сушили при 70°C протягом 12 годин. Висушену м’яку масу гладко подрібнювали в печі та прожарювали при 550°C протягом 12 годин. Три партії готували та характеризували для перевірки відтворюваності розміру частинок, розміру пор і площі поверхні.
Шляхом модифікації поверхні частинок кремнезему попередньо синтезованим лігандом фенілмалеімід-метилвінілізоціанату (PCMP) з наступною радіальною полімеризацією стиролом було отримано сполуку, що містить полярну групу.Стаціонарна фаза для заповнювачів і полістирольних ланцюгів. Процес приготування описаний нижче.
N-фенілмалеімід (200 мг) і метилвінілізоціанат (100 мг) розчиняли в сухому толуолі, і 0,1 мл 2,2'-азоізобутиронітрилу (AIBN) додавали в реакційну колбу для отримання сополімеру фенілмалеімід-метилвінілізоціанат (PMCP). Суміш нагрівали при 60°C протягом 3 ч., фільтрують і сушать у сушильній шафі при 40°С протягом 3 год.
Висушені частинки діоксиду кремнію (2 г) диспергували в сухому толуолі (100 мл), перемішували та обробляли ультразвуком у круглодонній колбі на 500 мл протягом 10 хв. PMCP (10 мг) розчиняли в толуолі та додавали по краплях до реакційної колби через краплинну воронку. Суміш кип’ятили зі зворотним холодильником при 100°C протягом 8 годин, фільтрували та промивали ацетоном і сушили при 60°C протягом 3 годин. Потім частинки кремнезему, пов’язані з PMCP (100 г), розчиняли в толуолі (200 мл) і додавали 4-гідрокси-TEMPO (2 мл) у присутності 100 мкл дибутилолова дилаурату як каталізатора. Суміш перемішували при 50°C протягом 8 годин, фільтрували та сушили при 50°C протягом 3 годин. години.
Стирол (1 мл), пероксид бензоїлу BPO (0,5 мл) і приєднані до TEMPO-PMCP частинки діоксиду кремнію (1,5 г) диспергували в толуолі та продували азотом. Полімеризацію стиролу проводили при 100°C протягом 12 годин. Отриманий продукт промивали метанолом і сушили при 60°C протягом ночі. Загальна схема реакції показана на малюнку 1.
Зразки дегазували при 393 K протягом 1 години для отримання залишкового тиску менше ніж 10-3 Torr. Кількість N2, адсорбованого при відносному тиску P/P0 = 0,99, використовували для визначення загального об’єму пор. Морфологію голих і зв’язаних лігандом частинок кремнезему досліджували за допомогою скануючої електронної мікроскопії (Hitachi High Technologies, Токіо, Японія). Висушені зразки ( чистий діоксид кремнію та частинки діоксиду кремнію, пов’язані з лігандом) поміщали на алюмінієву колонку за допомогою клейкої вугільної стрічки. Золото наносили на зразки за допомогою пристрою для напилення Q150T, а на зразки наносили шар Au товщиною 5 нм. Це покращує ефективність процесу за допомогою низьких напруг і забезпечує дрібне зернисте холодне розпилення. Був використаний елементний аналізатор Thermo Electron (Waltham, MA, США) Flash EA1112. використовувався для елементного аналізу. Аналізатор розміру частинок Malvern (Вустершир, Великобританія) Mastersizer 2000 використовувався для отримання розподілу частинок за розміром. Голі частинки кремнезему та частинки кремнезему, зв’язані лігандом (5 мг кожна) були дисперговані в 5 мл ізопропанолу, оброблені ультразвуком протягом 10 хвилин, перемішувалися протягом 5 хвилин і поміщені на оптичний стіл Mastersizer. Thermo гравіметричний аналіз проводився зі швидкістю 5 °C на хвилину в діапазоні температур від 30 до 800 °C.
Вузькопрохідні колони з нержавіючої сталі, облицьовані склом, розмірами (100 × 1,8 мм внутр.) були упаковані за допомогою методу суспензії, застосовуючи ту саму процедуру, що використовується в Ref.31.Колонку з нержавіючої сталі (обшиту склом, внутрішній діаметр 100 × 1,8 мм) з випускним фітингом, що містить фритту 1 мкм, було з’єднано з пакером суспензії (Alltech Deerfield, IL, США). Приготуйте суспензію нерухомої фази, суспендуючи 150 мг нерухомої фази в 1,2 мл метанолу, і відправте її в колону для зберігання. Метанол також використовувався як розчинник суспензії. Послідовно заповнюйте колонку, застосовуючи тиск 100 МП протягом 10 хвилин, 80 МП протягом 15 хвилин і 60 МП протягом 30 хвилин. Під час пакування застосовувалася механічна вібрація за допомогою двох струшувачів колонки GC (Alltech, Deerfield, IL, США), щоб забезпечити рівномірне заповнення колонки. Закрийте пакер для суспензії та повільно скидайте тиск, щоб запобігти пошкодженню колонки. Від’єднайте колонку від блоку пакування суспензії та під’єднайте іншу арматуру до входу та системи LC, щоб перевірити її роботу.
РХ-насос (10AD Shimadzu, Японія), інжектор (Valco (США) C14 W.05) з ін’єкційною петлею об’ємом 50 нл, мембранний дегазатор (Shimadzu DGU-14A), капілярне вікно UV-VIS. Спеціальний детектор пристрою µLC (UV-2075) і мікроколонки зі склом. Використовуйте дуже вузькі та короткі з’єднувальні трубки, щоб мінімізувати ефект. розширення смуги додаткової колонки. Після упаковки капіляри (50 мкм id 365 і редукційні з’єднувальні капіляри (50 мкм) були встановлені на виході 1/16 дюйма відновного з’єднання. Збір даних і хроматографічну обробку проводили за допомогою програмного забезпечення Multichro 2000. Моніторинг при 254 нм Аналіти перевіряли на УФ-поглинання. Хроматографічні дані аналізували OriginPro8 (Нортгемптон, Массачусетс).
Альбумін із сироватки крові людини, ліофілізований порошок, ≥ 96% (електрофорез у агарозному гелі) 3 мг, змішаний з трипсином (1,5 мг), 4,0 М сечовиною (1 мл) і 0,2 М бікарбонатом амонію (1 мл). Розчин перемішували протягом 10 хвилин і витримували на водяній бані при 37 °C протягом 6 годин, потім гасили 1 мл 0,1% TFA. Відфільтрувати розчин і зберігати при температурі нижче 4 °C.
Розділення суміші пептидів і розщеплення трипсину HSA оцінювали окремо на колонках PMP. Перевірте розділення суміші пептидів і розщеплення трипсину HSA колонкою PMP і порівняйте результати з колонкою Ascentis Express RP-Amide. Теоретичну кількість пластин розраховують таким чином:
SEM-зображення чистих частинок діоксиду кремнію та частинок діоксиду кремнію, зв’язаних лігандом, показані на фіг.2 .Sem Зображення голих частинок кремнезему (A, B) показують, що, на відміну від наших попередніх досліджень, ці частинки є сферичними, в яких частинки витягнуті або мають нерегулярну симетрію. Поверхня частинок кремнезему, пов'язаних з лігандом (C, D), більш гладкою, ніж у голих частинок кремнезему, що може бути обумовленим коліном полістирону на поверхні частинки SILICLE.
Зображення за допомогою скануючого електронного мікроскопа голих частинок кремнезему (A, B) і частинок кремнезему, зв’язаних лігандом (C, D).
Розподіл розмірів часток голих частинок кремнезему та частинок кремнезему, зв’язаних лігандами, показано на рисунку 3(A). Криві розподілу частинок за розміром на основі об’єму показали, що розмір частинок кремнезему збільшився після хімічної модифікації (рис. 3A). Дані розподілу частинок кремнезему за розміром із поточного дослідження та попереднього дослідження порівнюються в таблиці 1(A). Об’ємний розмір частинок, d(0,5), P MP становить 3,36 мкм у порівнянні з нашим попереднім дослідженням зі значенням ad(0,5) 3,05 мкм (частинки кремнезему, пов’язані з полістиролом)34. Ця партія мала більш вузький розподіл частинок за розміром порівняно з нашим попереднім дослідженням через різне співвідношення PEG, сечовини, TMOS та оцтової кислоти в реакційній суміші. Розмір частинок фази PMP трохи більший, ніж у зв’язаного з полістиролом кремнезему. фазу частинок, яку ми вивчали раніше. Це означає, що поверхнева функціональність частинок кремнезему стиролом призвела лише до утворення шару полістиролу (0,97 мкм) на поверхні кремнезему, тоді як у фазі PMP товщина шару становила 1,38 мкм.
Розподіл частинок за розміром (A) і розподіл розміру пор (B) голих частинок кремнезему та зв’язаних лігандом частинок кремнезему.
Розмір пор, об’єм пор і площа поверхні частинок діоксиду кремнію в поточному дослідженні наведені в таблиці 1(B). Профілі PSD голих частинок діоксиду кремнію та частинок діоксиду кремнію, зв’язаних лігандами, показані на малюнку 3(B). Результати можна порівняти з нашим попереднім дослідженням. Розміри пор голих і зв’язаних лігандом частинок діоксиду кремнію становлять 310 і 241 відповідно, що вказує на те, що розмір пор зменшується на 69 після хімічної модифікації, як показано в таблиці 1(B), а зміна кривої показана на рис. 3(B). Подібним чином об’єм пор частинок кремнезему зменшився з 0,67 до 0,58 см3/г після хімічної модифікації. Питома площа поверхні досліджуваних на даний момент частинок кремнезему становить 116 м2/г, що можна порівняти з нашим попереднім дослідженням (124 м2/г). Як показано в таблиці 1(B), площа поверхні (м2/г) частинок кремнезему також зменшилася з 116 м2/г до 105 м2/г після хімічної модифікації.
Результати елементного аналізу нерухомої фази наведено в таблиці 2. Вміст вуглецю в поточній нерухомій фазі становить 6,35%, що нижче, ніж вміст вуглецю в нашому попередньому дослідженні (частинки кремнезему, пов’язані з полістиролом, 7,93%35 і 10,21%, відповідно) 42. Вміст вуглецю в поточній нерухомій фазі є низьким, оскільки при отриманні поточного SP, крім стиролу, деякі полярні ліганди, такі як Було використано фенілмалеімід-метилвінілізоціанат (PCMP) і 4-гідрокси-TEMPO. Масовий відсоток азоту в поточній стаціонарній фазі становить 2,21%, порівняно з 0,1735 і 0,85% за вагою азоту в попередніх дослідженнях відповідно. Це означає, що масовий % азоту вищий у поточній стаціонарній фазі через фенілмалеімід. Подібним чином вміст вуглецю в продуктах ( 4) і (5) становили 2,7% і 2,9% відповідно, тоді як вміст вуглецю в кінцевому продукті (6) становив 6,35%, як показано в таблиці 2. Втрату ваги перевіряли за допомогою стаціонарної фази PMP, а криву TGA показано на малюнку 4. Крива TGA показує втрату ваги 8,6%, що добре узгоджується з вмістом вуглецю (6,35%), оскільки ліганди містять не тільки C, але також N, O і H.
Ліганд фенілмалеімід-метилвінілізоціанат був обраний для модифікації поверхні частинок кремнезему, оскільки він містить полярні фенілмалеімідні групи та вінілізоціанатні групи. Вінілізоціанатні групи можуть далі реагувати зі стиролом шляхом живої радикальної полімеризації. Друга причина полягає в тому, щоб вставити групу, яка має помірну взаємодію з аналітом і не має сильної електростатичної взаємодії між аналітом і нерухомою фазою, оскільки p Залишок генілмалеіміду не має віртуального заряду при нормальному рН. Полярність нерухомої фази можна контролювати оптимальною кількістю стиролу та часом реакції вільнорадикальної полімеризації. Останній етап реакції (вільнорадикальна полімеризація) є критичним і може змінити полярність нерухомої фази. Для перевірки вмісту вуглецю в цих нерухомих фазах було проведено елементний аналіз. Було помічено, що збільшення кількості стиролу та часу реакції збільшує вміст вуглецю нерухомої фази і навпаки. SP, приготовлені з різними концентраціями стиролу, мають різний вміст вуглецю. Знову ж таки, завантажте ці нерухомі фази в колонки з нержавіючої сталі та перевірте їхні хроматографічні характеристики (селективність, роздільна здатність, значення N тощо). На основі цих експериментів було вибрано оптимізовану композицію для приготування нерухомої фази PMP для забезпечення контрольованої полярності та хорошого утримання аналіту.
П’ять пептидних сумішей (Gly-Tyr, Gly-Leu-Tyr, Gly-Gly-Tyr-Arg, Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg, лейцин-енкефалін) також оцінювали за допомогою PMP колонки з використанням рухомої фази;60/40 (об’єм/об’єм) ацетонітрил/вода (0,1% ТФУ) зі швидкістю потоку 80 мкл/хв. За оптимальних умов елюювання теоретична кількість пластин (N) на колонку (100 × 1,8 мм внутр. діаметр) становить 20 000 ± 100 (200 000 пластин/м²). У таблиці 3 наведено значення N для трьох колонок PMP і кольоровості. тограми показані на малюнку 5A. Швидкий аналіз на колонці PMP при високій швидкості потоку (700 мкл/хв), п’ять пептидів було елюйовано протягом однієї хвилини, значення N були дуже хорошими, 13 500 ± 330 на колонку (100 × 1,8 мм внутр.), відповідає 135 000 планшетів/м (рис. 5B). Три колонки однакового розміру (100 × 1,8 мм id) були заповнені трьома різними партіями нерухомої фази PMP для перевірки відтворюваності. Концентрація аналіту для кожної колонки була зареєстрована з використанням оптимальних умов елюювання та кількості теоретичних планшетів N і часу утримування для розділення тієї самої тестової суміші на кожній колонці. Дані відтворюваності для колонок PMP наведено в таблиці 4. Відтворюваність колонки PMP добре корелює з дуже низькими значеннями %RSD, як показано в таблиці 3 .
Розділення суміші пептидів на колонці PMP (B) і колонці Ascentis Express RP-Amide (A);рухома фаза 60/40 ACN/H2O (TFA 0,1%), розміри колонки PMP (100 × 1,8 мм id);аналітичний Порядок елюції сполук: 1 (Gly-Tyr), 2 (Gly-Leu-Tyr), 3 (Gly-Gly-Tyr-Arg), 4 (Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg) і 5 (лейцинова кислота енкефалін)).
Колонку PMP (внутрішній діаметр 100 × 1,8 мм) оцінювали для розділення триптичних розщеплень сироваткового альбуміну людини за допомогою високоефективної рідинної хроматографії. Хроматограма на рисунку 6 показує, що зразок добре розділений і роздільна здатність дуже добра. Розщеплення HSA аналізували з використанням швидкості потоку 100 мкл/хв, рухомої фази 70/30 ацетонітрил/вода та 0,1% TFA. Як показано. на хроматограмі (рис. 6) розщеплення HSA було розділено на 17 піків, що відповідають 17 пептидам. Розраховано ефективність поділу кожного піку в розщепленому HSA, а значення наведено в таблиці 5.
Триптичний розщеплення HSA (100 × 1,8 мм внутрішнього діаметра) відокремлювали на PMP колонці;швидкість потоку (100 мкл/хв), рухома фаза 60/40 ацетонітрил/вода з 0,1% TFA.
де L — довжина колонки, η — в’язкість рухомої фази, ΔP — протитиск колонки, u — лінійна швидкість рухомої фази. Проникність колонки PMP становила 2,5 × 10-14 м2, швидкість потоку становила 25 мкл/хв, використовували 60/40 об’єм ACN/вода. Проникність колонки PMP (внутрішній діаметр 100 × 1,8 мм) ) була подібна до проникності нашого попереднього дослідження Ref.34. Проникність колонки, наповненої поверхнево пористими частинками, становить: 1,7 × 10-15 для частинок 1,3 мкм, 3,1 × 10-15 для частинок 1,7 мкм, 5,2 × 10-15 і 2,5 × 10-14 м2 для частинок 2,6 мкм Для 5 мкм частинки 43. Таким чином, проникність фази PMP подібна до проникності 5 мкм частинок ядро-оболонка.
де Wx — вага колонки, заповненої хлороформом, Wy — вага колонки, заповненої метанолом, а ρ — щільність розчинника. Щільності метанолу (ρ = 0,7866) і хлороформу (ρ = 1,484). Загальна пористість колонок SILICA PARTICLES-C18 (100 × 1,8 мм id) 34 і C18-U реа колонки 31, які ми раніше вивчали, становили 0,63 і 0,55 відповідно. Це означає, що присутність лігандів сечовини зменшує проникність нерухомої фази. З іншого боку, загальна пористість колонки PMP (100 × 1,8 мм внутр. діаметр) становить 0,60. Проникність колонок PMP нижча, ніж у колонок, наповнених частинками кремнезему, пов’язаними з C18, оскільки в C18-типі У стаціонарних фазах ліганди C18 приєднані до частинок кремнезему у вигляді лінійних ланцюгів, тоді як у стаціонарних фазах типу полістиролу навколо нього утворюється відносно товстий полімерний шар. У типовому експерименті пористість колонки розраховується як:
На малюнках 7A, B показано PMP-колонку (100 × 1,8 мм внутрішнього діаметра) та колонку Ascentis Express RP-Amide (100 × 1,8 мм внутрішнього діаметру) з використанням однакових умов елюції (тобто 60/40 ACN/H2O та 0,1% TFA).) ділянки ван Деемтера.Вибрані пептидні суміші (Gly-Tyr, Gly-Leu-Tyr, Gly-Gly-Tyr-Arg, Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg, Leucine Enkephalin) були приготовані в 20 мкл / Мінімальна швидкість потоку для обох колонок становить 800 мкл/хв. Мінімальні значення HETP при оптимальній швидкості потоку (80 мкл/хв) для PMP колонки та колонка Ascentis Express RP-Amide становила 2,6 мкм і 3,9 мкм відповідно. Значення HETP вказують на те, що ефективність розділення колонки PMP (100 × 1,8 мм внутр. діаметр) набагато краща, ніж комерційно доступна колонка Ascentis Express RP-Amide (100 × 1,8 мм внутр. діаметр). Графік Ван Деемтера на рис. 7(A) показує, що зменшення значення N з збільшення потоку не є суттєвим порівняно з нашим попереднім дослідженням. Вища ефективність розділення колонки PMP (100 × 1,8 мм внутр.) порівняно з колонкою Ascentis Express RP-Amide базується на вдосконаленні форми, розміру частинок і складних процедурах упаковки колонки, які використовуються в поточній роботі34.
(A) графік Ван Деемтера (HETP від ​​лінійної швидкості рухомої фази), отриманий за допомогою колонки PMP (100 × 1,8 мм внутрішнього діаметра) у 60/40 ACN/H2O з 0,1% TFA. (B) Графік Ван Деемтера (HETP проти лінійної швидкості рухомої фази), отриманий за допомогою колонки Ascentis Express RP-Amide (100 × 1,8 мм внутрішнього діаметра) у 60/4 0 ACN/H2O з 0,1% TFA.
Було підготовлено та оцінено стаціонарну фазу полістиролу з вбудованим полярним способом для поділу синтетичних пептидних сумішей і трипсину, розщепленого сироватковим альбуміном людини (HAS) у високоефективній рідинній хроматографії. Хроматографічні характеристики PMP-колонок для пептидних сумішей є чудовими щодо ефективності розділення та роздільної здатності. Покращена продуктивність поділу PMP-колонок пояснюється низкою причин, таких як розмір часток і розмір пор si частинок lica, контрольованого синтезу стаціонарної фази та складної упаковки колонки. На додаток до високої ефективності розділення, низький протитиск колонки при високих витратах є ще однією перевагою цієї стаціонарної фази. PMP колонки демонструють хорошу відтворюваність і можуть бути використані для аналізу пептидних сумішей і трипсину перетравлення різних білків. Ми маємо намір використовувати цю колонку для розділення природних продуктів, біоактивних сполук з лікарських рослин і екстрактів грибів у рідкому хромі. тографія. У майбутньому колонки PMP також будуть оцінюватися на розділення білків і моноклональних антитіл.
Філд, Дж.К., Ейербі, М.Р., Лау, Дж., Тегерсен, Х. і Петерссон, П. Дослідження систем розділення пептидів за допомогою хроматографії з оберненою фазою. Частина I: Розробка протоколу визначення характеристик колонки.J.Хроматографія.1603, 113–129.https://doi.org/10.1016/j.chroma.2019.05.038 (2019).
Gomez, B. et al. Покращені активні пептиди, призначені для лікування інфекційних захворювань. Biotechnology.Advanced.36(2), 415-429.https://doi.org/10.1016/j.biotechadv.2018.01.004 (2018).
Vlieghe, P., Lisowski, V., Martinez, J. & Khrestchatisky, M. Синтетичні терапевтичні пептиди: наука та ринок. відкриття ліків.15 (1-2) сьогодні, 40-56.https://doi.org/10.1016/j.drudis.2009.10.009 (2010).
Xie, F., Smith, RD & Shen, Y. Advanced Proteomic Liquid Chromatography.J.Хроматографія.A 1261, 78–90 (2012).
Liu, W. et al. Удосконалена рідинна хроматографія-мас-спектрометрія дозволяє включати метаболоміку та протеоміку широкого призначення. anus.Chim.Acta 1069, 89–97 (2019).
Chesnut, SM & Salisbury, JJ Роль UHPLC у розробці ліків.J.Sep. Sci.30(8), 1183-1190 (2007).
Wu, N. & Clausen, AM Фундаментальні та практичні аспекти рідинної хроматографії надвисокого тиску для швидкого розділення.J.Sep. Sci.30(8), 1167-1182.https://doi.org/10.1002/jssc.200700026 (2007).
Wren, SA & Tchelitcheff, P. Застосування рідинної хроматографії надвисокої ефективності в розробці ліків.J.Хроматографія.1119(1-2), 140-146.https://doi.org/10.1016/j.chroma.2006.02.052 (2006).
Gu, H. et al. Монолітні макропористі гідрогелі, виготовлені з емульсій типу «олія у воді» з високою внутрішньою фазою для ефективного очищення ентеровірусів. Chemical.Britain.J.401, 126051 (2020).
Shi, Y., Xiang, R., Horváth, C. & Wilkins, JA Роль рідинної хроматографії в протеоміці.J.Хроматографія.A 1053(1-2), 27-36 (2004).
Fekete, S., Veuthey, J.-L. & Guillarme, D. Нові тенденції в розділенні рідинною хроматографією з оберненою фазою терапевтичних пептидів і білків: теорія та застосування.J.Pharmacy.Biomedical Science.anus.69, 9-27 (2012).
Gilar, M., Olivova, P., Daly, AE & Gebler, JC. Двомірне розділення пептидів за допомогою системи RP-RP-HPLC з використанням різних значень pH у першому та другому вимірах розділення.J.Sep. Sci. 28 (14), 1694-1703 (2005).
Feletti, S. et al. Було досліджено характеристики масообміну та кінетичні характеристики високоефективних хроматографічних колонок, наповнених повністю та поверхнево пористими частинками C18 менше 2 мкм. J.Sep. Sci. 43 (9-10), 1737-1745 (2020).
Piovesana, S. et al. Останні тенденції та аналітичні проблеми в ізоляції, ідентифікації та перевірці біоактивних пептидів рослин. anus.biological anus.Chemical.410(15), 3425–3444.https://doi.org/10.1007/s00216-018-0852-x (2018).
Мюллер, Дж. Б. та інші. Протеомний ландшафт царства життя. Природа 582 (7813), 592-596. https://doi.org/10.1038/s41586-020-2402-x (2020).
DeLuca, C. et al. Подальша обробка терапевтичних пептидів препаративною рідинною хроматографією. Молекула (Базель, Швейцарія) 26(15), 4688(2021).
Yang, Y. & Geng, X. Змішана хроматографія та її застосування до біополімерів.J.Хроматографія.A 1218(49), 8813–8825 (2011).
Zhao, G., Dong, X.-Y. & Sun, Y. Ліганди для змішаної білкової хроматографії: принцип, характеристика та дизайн.J.Біотехнологія.144(1), 3-11 (2009).