Дякуємо за відвідування Nature.com. Версія браузера, яку ви використовуєте, має обмежену підтримку CSS. Для найкращого досвіду рекомендуємо використовувати оновлений браузер (або вимкнути режим сумісності в Internet Explorer). Тим часом, щоб забезпечити постійну підтримку, ми відображатимемо сайт без стилів та JavaScript.
Пористі частинки кремнезему були отримані золь-гель методом з деякими модифікаціями для отримання макропористих частинок. Ці частинки були дериватизовані за допомогою полімеризації з оборотним додаванням та фрагментацією ланцюга (RAFT) з N-фенілмалеїмід-метилвінілізоціанатом (PMI) та стиролом для отримання стаціонарної фази інтеркаляції N-фенілмалеїміду полістиролу (PMP). Колонки з нержавіючої сталі з вузьким отвором (100 × 1,8 мм внутрішній діаметр) були заповнені суспензійним способом. Оцінено розділення на колонці PMP пептидної суміші, що складається з п'яти пептидів (Gly-Tyr, Gly-Leu-Tyr, Gly-Gly-Tyr-Arg, Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg, лейцин енкефалін), хроматографічні характеристики та перетравлення сироваткового альбуміну людини (HAS) трипсином. За оптимальних умов елюювання теоретична кількість пластинок пептидної суміші досягає 280 000 пластинок/м². Порівняння ефективності розділення розробленої колонки з комерційною колонкою Ascentis Express. На колонці RP-Amide було відзначено, що роздільна здатність колонки PMP перевершувала комерційну колонку з точки зору ефективності розділення та роздільної здатності.
В останні роки біофармацевтична промисловість стала зростаючим світовим ринком зі значним збільшенням частки ринку. Зі стрімким зростанням біофармацевтичної промисловості1,2,3, аналіз пептидів та білків є дуже бажаним. Окрім цільового пептиду, під час синтезу пептидів утворюється кілька домішок, що вимагає хроматографічного очищення для отримання пептидів бажаної чистоти. Аналіз та характеристика білків у рідинах, тканинах та клітинах організму є надзвичайно складним завданням через велику кількість потенційно виявлених видів в одному зразку. Хоча мас-спектрометрія є ефективним інструментом для секвенування пептидів та білків, якщо такі зразки вводяться в мас-спектрометр за один прохід, розділення не буде ідеальним. Цю проблему можна пом'якшити, застосувавши розділення рідинною хроматографією (РХ) перед аналізом МС, що зменшить кількість аналітів, що надходять у мас-спектрометр у певний момент часу4,5,6. Крім того, під час розділення в рідкофазній фазі аналіти можуть бути сфокусовані у вузьких областях, тим самим концентруючи ці аналіти та покращуючи чутливість виявлення за допомогою МС. Рідинна хроматографія (РХ) значно просунулася за останнє десятиліття та стала популярною методикою в протеомний аналіз7,8,9,10.
Обернено-фазова рідинна хроматографія (ОФРХ) широко використовується для очищення та розділення пептидних сумішей з використанням октадецил-модифікованого діоксиду кремнію (ОДС) як стаціонарної фази11,12,13. Однак стаціонарні фази ОФРХ не забезпечують задовільного розділення пептидів та білків через їхню складну структуру та амфіфільну природу14,15. Тому для аналізу пептидів та білків з полярними та неполярними фрагментами потрібні спеціально розроблені стаціонарні фази для взаємодії з цими аналітами та їх утримання16. Змішана хроматографія, яка забезпечує мультимодальні взаємодії, може бути альтернативою ОФРХ для розділення пептидів, білків та інших складних сумішей. Було підготовлено кілька змішаних стаціонарних фаз, і колонки, заповнені цими фазами, використовувалися для розділення пептидів та білків17,18,19,20,21. Змішані стаціонарні фази (WAX/ОФРХ, HILIC/ОФРХ, полярна інтеркаляція/ОФРХ) підходять для розділення пептидів та білків завдяки наявності як полярних, так і неполярних компонентів. групи22,23,24,25,26,27,28. Аналогічно, полярні інтеркалюючі стаціонарні фази з ковалентно зв'язаними полярними групами демонструють хорошу роздільну здатність та унікальну селективність для полярних та неполярних аналітів, оскільки розділення залежить від взаємодії між аналітом та стаціонарною фазою. Мультимодальні взаємодії 29, 30, 31, 32. Нещодавно Чжан та ін. 30 приготували додецильно-терміновану поліамінову стаціонарну фазу та успішно розділили вуглеводні, антидепресанти, флавоноїди, нуклеозиди, естрогени та кілька інших аналітів. Полярний інтеркалятор має як полярні, так і неполярні групи, тому його можна використовувати для розділення пептидів та білків, які мають як гідрофобні, так і гідрофільні фрагменти. Полярно-вбудовані колонки (наприклад, амідно-вбудовані колонки C18) комерційно доступні під торговою назвою Ascentis Express RP-Amide columns, але ці колонки використовуються лише для аналізу аміну 33.
У цьому дослідженні було підготовлено та оцінено полярно вбудовану стаціонарну фазу (полістирол, вбудований у N-фенілмалеїмід) для розділення пептидів та трипсинових перетравлень HSA. Стаціонарну фазу було підготовлено з використанням наступної стратегії. Пористі частинки кремнезему було підготовлено згідно з процедурою, наведеною в нашій попередній публікації, з деякими модифікаціями протоколу приготування. Співвідношення сечовини, поліетиленгліколю (PEG), TMOS, води та оцтової кислоти було скориговано для отримання частинок кремнезему з великим розміром пор. По-друге, було синтезовано новий ліганд, фенілмалеїмід-метилвінілізоціанат, та використано для дериватизації частинок кремнезему з метою отримання полярно вбудованої стаціонарної фази. Отриману стаціонарну фазу було заповнено в колонку з нержавіючої сталі (100 × 1,8 мм внутрішній діаметр) з використанням оптимізованої схеми упакування. Упаковка колонки здійснюється за допомогою механічної вібрації, щоб забезпечити формування однорідного шару в колонці. Оцінити розділення пептидних сумішей, що складаються з п'яти пептидів, на упакованій колонці; (Gly-Tyr, Gly-Leu-Tyr, Gly-Gly-Tyr-Arg, Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg, лейцин енкефалін) та трипсиновий гідролізат людського сироваткового альбуміну (HAS). Було виявлено, що суміш пептидів та трипсиновий гідролізат HSA розділяються з хорошою роздільною здатністю та ефективністю. Характеристики розділення колонки PMP порівнювали з характеристиками колонки Ascentis Express RP-Amide. Було виявлено, що як пептиди, так і білки добре розділяються та ефективно працюють на колонці PMP, яка була ефективнішою, ніж колонка Ascentis Express RP-Amide.
ПЕГ (поліетиленгліколь), сечовина, оцтова кислота, триметоксиортосиликат (TMOS), триметилхлорсилан (TMCS), трипсин, людський сироватковий альбумін (HSA), хлорид амонію, сечовина, гексан метилдисилазан (HMDS), метакрилоїлхлорид (MC), стирол, 4-гідрокси-TEMPO, бензоїлпероксид (BPO), ацетонітрил (ACN) класу ВЕРХ, метанол, 2-пропанол та ацетон, придбані у Sigma-Aldrich (Сент-Луїс, Міссурі, США).
Суміш сечовини (8 г), поліетиленгліколю (8 г) та 8 мл 0,01 N оцтової кислоти перемішували протягом 10 хвилин, а потім до неї додали 24 мл TMOS у крижаному режимі. Реакційну суміш нагрівали при 40°C протягом 6 годин, а потім при 120°C протягом 8 годин в автоклаві з нержавіючої сталі. Воду злили, а залишковий матеріал сушили при 70°C протягом 12 годин. Висушену м'яку масу гладко подрібнювали в печі та прожарювали при 550°C протягом 12 годин. Були підготовлені та охарактеризовані три партії для дослідження відтворюваності розміру частинок, розміру пор та площі поверхні.
Шляхом модифікації поверхні частинок кремнезему попередньо синтезованим лігандом фенілмалеїмід-метилвінілізоціанатом (PCMP) з подальшою радіальною полімеризацією зі стиролом було отримано сполуку, що містить полярні групи. Стаціонарна фаза для агрегатів та полістирольних ланцюгів. Процес отримання описано нижче.
N-фенілмалеїмід (200 мг) та метилвінілізоціанат (100 мг) розчинили в сухому толуолі, та до реакційної колби додали 0,1 мл 2,2'-азоізобутиронітрилу (AIBN) для отримання сополімеру фенілмалеїміду-метилвінілізоціанату (PMCP). Суміш нагрівали при 60°C протягом 3 годин, фільтрували та сушили в печі при 40°C протягом 3 годин.
Висушені частинки кремнезему (2 г) диспергували у сухому толуолі (100 мл), перемішували та обробляли ультразвуком у круглодонній колбі об'ємом 500 мл протягом 10 хвилин. PMCP (10 мг) розчиняли у толуолі та додавали краплями до реакційної колби через крапельну лійку. Суміш кип'ятили зі зворотним холодильником при 100°C протягом 8 годин, фільтрували, промивали ацетоном та сушили при 60°C протягом 3 годин. Потім частинки кремнезему, пов'язані з PMCP (100 г), розчиняли у толуолі (200 мл) та додавали 4-гідрокси-TEMPO (2 мл) у присутності 100 мкл дибутилдилаурату олова як каталізатора. Суміш перемішували при 50°C протягом 8 годин, фільтрували та сушили при 50°C протягом 3 годин.
Стирол (1 мл), бензоїлпероксид BPO (0,5 мл) та частинки кремнезему, приєднані до TEMPO-PMCP (1,5 г), диспергували в толуолі та продували азотом. Полімеризацію стиролу проводили при 100°C протягом 12 годин. Отриманий продукт промивали метанолом та сушили при 60°C протягом ночі. Загальна схема реакції показана на рисунку 1.
Зразки дегазували при 393 K протягом 1 години для отримання залишкового тиску менше 10-3 Торр. Кількість N2, адсорбованого при відносному тиску P/P0 = 0,99, використовували для визначення загального об'єму пор. Морфологію оголених та ліганд-зв'язаних частинок кремнезему досліджували за допомогою скануючої електронної мікроскопії (Hitachi High Technologies, Токіо, Японія). Висушені зразки (голий кремнезем та ліганд-зв'язані частинки кремнезему) розміщували на алюмінієвій колонці за допомогою клейкої вуглецевої стрічки. Золото наносили на зразки за допомогою розпилювального апарата Q150T, а шар Au товщиною 5 нм наносили на зразки. Це підвищує ефективність процесу при низьких напругах та забезпечує дрібнозернисте холодне напилення. Для елементного аналізу використовували елементний аналізатор Thermo Electron (Waltham, MA, США) Flash EA1112. Для отримання розподілу розмірів частинок використовували аналізатор розмірів частинок Malvern (Worcestershire, UK) Mastersizer 2000. Неголі частинки кремнезему та ліганд-зв'язані частинки кремнезему (5 мг) (кожен) диспергували у 5 мл ізопропанолу, обробляли ультразвуком протягом 10 хвилин, перемішували на вортексі протягом 5 хвилин та поміщали на оптичний стенд Mastersizer. Термогравіметричний аналіз проводили зі швидкістю 5 °C за хвилину в діапазоні температур від 30 до 800 °C.
Вузькопрохідні колони з нержавіючої сталі з футерованою склопластиком розмірами (100 × 1,8 мм внутрішній діаметр) були заповнені методом шламового заповнення, застосовуючи ту саму процедуру, що й у роботі [посилання]. 31. Колонку з нержавіючої сталі (з емальованим склом, 100 × 1,8 мм внутрішній діаметр) з вихідним фітингом, що містить фриту 1 мкм, підключили до пакера суспензії (Alltech Deerfield, IL, США). Приготували суспензію стаціонарної фази, суспендувавши 150 мг стаціонарної фази в 1,2 мл метанолу та надіславши її в колону для зберігання. Метанол використовували як розчинник суспензії, а також як розчинник-пропелер. Послідовно заповнювали колону, застосовуючи тиск 100 МПа протягом 10 хвилин, 80 МПа протягом 15 хвилин та 60 МПа протягом 30 хвилин. Під час заповнення застосовували механічну вібрацію за допомогою двох шейкерів для колонок ГХ (Alltech, Deerfield, IL, США) для забезпечення рівномірного заповнення колони. Закрийте пакер суспензії та повільно скидайте тиск, щоб запобігти пошкодженню всередині колони. Від'єднайте колону від блоку заповнення суспензії та підключіть інший фітинг до входу та до системи рідкого хроматографа, щоб перевірити її роботу.
Було побудовано рідкий хроматографічний насос (10AD Shimadzu, Японія), інжектор (Valco (США) C14 W.05) з інжекторною петлею 50 нл, мембранний дегазатор (Shimadzu DGU-14A), капілярне вікно УФ-ВІС, спеціальний детектор µРХ (UV-2075) та мікроколонки зі скляним покриттям. Використовувалися дуже вузькі та короткі з'єднувальні трубки для мінімізації ефекту додаткового розширення смуги колонки. Після упаковки капіляри (50 мкм внутрішній діаметр 365 мкм) та капіляри відновлювального з'єднання (50 мкм) були встановлені на виході 1/16 дюйма відновлювального з'єднання. Збір даних та хроматографічну обробку проводили за допомогою програмного забезпечення Multichro 2000. Моніторинг при 254 нм. Аналіти перевіряли на УФ-поглинання. Хроматографічні дані аналізували за допомогою OriginPro8 (Нортгемптон, Массачусетс).
Альбумін із сироватки людини, ліофілізований порошок, ≥ 96% (електрофорез в агарозному гелі) 3 мг, змішаний з трипсином (1,5 мг), 4,0 М сечовиною (1 мл) та 0,2 М бікарбонатом амонію (1 мл). Розчин перемішували протягом 10 хвилин та витримували на водяній бані при 37°C протягом 6 годин, потім гасили 1 мл 0,1% трифторвуглецевої кислоти (TFA). Розчин фільтрували та зберігали при температурі нижче 4°C.
Розділення пептидних сумішей та трипсинових перетравлень HSA оцінювали окремо на колонках PMP. Перевіряли розділення пептидної суміші та трипсинових перетравлень HSA на колонці PMP та порівнювали результати з колонкою Ascentis Express RP-Amide. Теоретичне число пластин розраховували наступним чином:
Зображення SEM частинок кремнезему без покриття та частинок кремнезему, зв'язаних лігандами, показані на рис. 2. Зображення SEM частинок кремнезему без покриття (A, B) показують, що, на відміну від наших попередніх досліджень, ці частинки є сферичними, тобто витягнутими або мають неправильну симетрію. Поверхня частинок кремнезему з зв'язаними лігандами (C, D) є гладшою, ніж поверхня частинок кремнезему без покриття, що може бути пов'язано з покриттям полістирольних ланцюгів на поверхні частинок кремнезему.
Зображення скануючого електронного мікроскопа оголених частинок кремнезему (A, B) та частинок кремнезему, зв'язаних лігандами (C, D).
Розподіл розмірів частинок чистого кремнезему та частинок кремнезему, зв'язаних лігандами, показано на рисунку 3(A). Криві розподілу розмірів частинок на основі об'єму показали, що розмір частинок кремнезему збільшився після хімічної модифікації (рис. 3A). Дані розподілу розмірів частинок кремнезему з поточного дослідження та попереднього дослідження порівнюються в таблиці 1(A). Розмір частинок PMP на основі об'єму, d(0,5), становить 3,36 мкм, порівняно з нашим попереднім дослідженням зі значенням ad(0,5) 3,05 мкм (частинки кремнезему, зв'язані з полістиролом)34. Ця партія мала вужчий розподіл розмірів частинок порівняно з нашим попереднім дослідженням через різне співвідношення PEG, сечовини, TMOS та оцтової кислоти в реакційній суміші. Розмір частинок фази PMP трохи більший, ніж у фази частинок кремнезему, зв'язаної з полістиролом, яку ми вивчали раніше. Це означає, що поверхнева функціоналізація частинок кремнезему стиролом призвела лише до утворення шару полістиролу (0,97 мкм) на поверхні кремнезему, тоді як у фазі PMP товщина шару була... 1,38 мкм.
Розподіл розмірів частинок (A) та розподіл розмірів пор (B) частинок кремнезему без домішок та частинок кремнезему, зв'язаних з лігандами.
Розмір пор, об'єм пор та площа поверхні частинок кремнезему поточного дослідження наведено в таблиці 1(B). Профілі PSD (питома площа поверхні) частинок кремнезему без покриття та частинок кремнезему, зв'язаних лігандами, показані на рисунку 3(B). Результати можна порівняти з нашим попереднім дослідженням. Розміри пор частинок кремнезему без покриття та зв'язаних лігандами становлять 310 та 241 відповідно, що вказує на зменшення розміру пор на 69 після хімічної модифікації, як показано в таблиці 1(B), а зміна кривої показана на рис. 3(B). Аналогічно, об'єм пор частинок кремнезему зменшився з 0,67 до 0,58 см3/г після хімічної модифікації. Питома площа поверхні досліджуваних частинок кремнезему становить 116 м2/г, що можна порівняти з нашим попереднім дослідженням (124 м2/г). Як показано в таблиці 1(B), площа поверхні (м2/г) частинок кремнезему також зменшилася з 116 м2/г до 105 м2/г після хімічної модифікації. модифікація.
Результати елементного аналізу стаціонарної фази наведено в таблиці 2. Вміст вуглецю в поточній стаціонарній фазі становить 6,35%, що нижче, ніж вміст вуглецю в нашому попередньому дослідженні (частинки кремнезему, пов'язані з полістиролом, 7,93%35 та 10,21% відповідно)42. Вміст вуглецю в поточній стаціонарній фазі низький, оскільки при приготуванні поточного SP, крім стиролу, використовувалися деякі полярні ліганди, такі як фенілмалеїмід-метилвінілізоціанат (PCMP) та 4-гідрокси-TEMPO. Масовий відсоток азоту в поточній стаціонарній фазі становить 2,21%, порівняно з 0,1735 та 0,85% за вагою азоту в попередніх дослідженнях відповідно. Це означає, що масовий відсоток азоту в поточній стаціонарній фазі вищий через фенілмалеїмід. Аналогічно, вміст вуглецю в продуктах (4) та (5) становив 2,7% та 2,9% відповідно, тоді як вміст вуглецю в кінцевому продукті (6) був 6,35%, як показано в Таблиці 2. Втрату ваги перевіряли за допомогою стаціонарної фази PMP, а крива TGA показана на Рисунку 4. Крива TGA показує втрату ваги 8,6%, що добре узгоджується з вмістом вуглецю (6,35%), оскільки ліганди містять не тільки C, але й N, O та H.
Фенілмалеїмід-метилвінілізоціанатний ліганд був обраний для модифікації поверхні частинок кремнезему, оскільки він має полярні фенілмалеїмідні групи та вінілізоціанатні групи. Вінілізоціанатні групи можуть додатково реагувати зі стиролом шляхом живої радикальної полімеризації. Друга причина полягає у введенні групи, яка має помірну взаємодію з аналітом і не має сильної електростатичної взаємодії між аналітом і стаціонарною фазою, оскільки фенілмалеїмідний фрагмент не має віртуального заряду при нормальному pH. Полярність стаціонарної фази можна контролювати оптимальною кількістю стиролу та часом реакції вільнорадикальної полімеризації. Останній етап реакції (вільнорадикальна полімеризація) є критичним і може змінити полярність стаціонарної фази. Був проведений елементний аналіз для перевірки вуглецевого навантаження цих стаціонарних фаз. Було помічено, що збільшення кількості стиролу та часу реакції збільшує вуглецеве навантаження стаціонарної фази і навпаки. SP, приготовані з різною концентрацією стиролу, мають різне вуглецеве навантаження. Знову ж таки, завантажте ці стаціонарні фази в колонки з нержавіючої сталі та перевірте їх хроматографічну ефективність (селективність, роздільну здатність, значення N, тощо). На основі цих експериментів було обрано оптимізовану рецептуру для приготування стаціонарної фази PMP, щоб забезпечити контрольовану полярність та хороше утримання аналіту.
П'ять пептидних сумішей (Gly-Tyr, Gly-Leu-Tyr, Gly-Gly-Tyr-Arg, Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg, лейцин енкефалін) також оцінювали за допомогою колонки PMP з використанням рухомої фази; 60/40 (об./об.) ацетонітрил/вода (0,1% TFA) при швидкості потоку 80 мкл/хв. За оптимальних умов елюювання теоретична кількість пластин (N) на колонку (100 × 1,8 мм внутрішній діаметр) становить 20 000 ± 100 (200 000 пластин/м²). У таблиці 3 наведено значення N для трьох колонок PMP, а хроматограми показано на рисунку 5A. Швидкий аналіз на колонці PMP при високій швидкості потоку (700 мкл/хв) показав п'ять пептидів, які елюювалися протягом однієї хвилини, значення N були дуже хорошими, 13 500 ± 330 на колонку (100 × 1,8 мм внутрішній діаметр), що відповідає 135 000 пластин/м² (рисунок 5B). Три колонки однакового розміру (100 × 1,8 мм внутрішній діаметр) були заповнені трьома різними партіями стаціонарної фази PMP для перевірки відтворюваності. Концентрацію аналіту для кожної колонки реєстрували з використанням оптимальних умов елюції та кількості теоретичних тарілок N і часу утримування для розділення тієї ж тестової суміші на кожній колонці. Дані відтворюваності для колонок PMP наведено в таблиці 4. Відтворюваність колонки PMP добре корелює з дуже низькими значеннями %RSD, як показано в таблиці 3.
Розділення пептидної суміші на колонці PMP (B) та колонці Ascentis Express RP-Amide (A); рухома фаза 60/40 ACN/H2O (TFA 0,1%), розміри колонки PMP (100 × 1,8 мм внутрішній діаметр); аналітичний. Порядок елюювання сполук: 1 (Gly-Tyr), 2 (Gly-Leu-Tyr), 3 (Gly-Gly-Tyr-Arg), 4 (Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg) та 5 (лейцин)кислий енкефалін).
Колонку PMP (100 × 1,8 мм внутрішній діаметр) оцінювали для розділення трипсинових гідролізів людського сироваткового альбуміну за допомогою високоефективної рідинної хроматографії. Хроматограма на рисунку 6 показує, що зразок добре розділений, а роздільна здатність дуже хороша. Гідролізи HSA аналізували з використанням швидкості потоку 100 мкл/хв, рухомої фази 70/30 ацетонітрил/вода та 0,1% TFA. Як показано на хроматограмі (рисунок 6), гідроліз HSA був розділений на 17 піків, що відповідають 17 пептидам. Ефективність розділення кожного піку в гідролізі HSA була розрахована, а значення наведені в таблиці 5.
Трипсиновий гідролізат HSA (100 × 1,8 мм внутрішній діаметр) розділяли на колонці PMP; швидкість потоку (100 мкл/хв), рухома фаза 60/40 ацетонітрил/вода з 0,1% TFA.
де L – довжина колонки, η – в'язкість рухомої фази, ΔP – протитиск колонки, а u – лінійна швидкість рухомої фази. Проникність колонки PMP становила 2,5 × 10⁻¹⁴ м², швидкість потоку – 25 мкл/хв, і використовувалася суміш ACN/води 60/40 об./об. Проникність колонки PMP (100 × 1,8 мм внутрішній діаметр) була подібною до проникності нашого попереднього дослідження [посилання 34]. Проникність колонки, заповненої поверхнево пористими частинками, становить: 1,7 × 10⁻¹⁴ для частинок розміром 1,3 мкм, 3,1 × 10⁻¹⁴ для частинок розміром 1,7 мкм, 5,2 × 10⁻¹⁴ та 2,5 × 10⁻¹⁴ м² для частинок розміром 2,6 мкм. Для частинок розміром 5 мкм [43]. Отже, проникність фази PMP подібна до проникності частинок типу ядро-оболонка розміром 5 мкм.
де Wx – вага колони, заповненої хлороформом, Wy – вага колони, заповненої метанолом, а ρ – густина розчинника. Густини метанолу (ρ = 0,7866) та хлороформу (ρ = 1,484). Загальна пористість колон SILICA PARTICLES-C18 (100 × 1,8 мм внутрішній діаметр) 34 та колон C18-Urea 31, які ми раніше досліджували, становила 0,63 та 0,55 відповідно. Це означає, що присутність лігандів сечовини зменшує проникність стаціонарної фази. З іншого боку, загальна пористість колони PMP (100 × 1,8 мм внутрішній діаметр) становить 0,60. Проникність колон PMP нижча, ніж у колон, заповнених частинками кремнезему, зв'язаними C18, оскільки в стаціонарних фазах типу C18 ліганди C18 приєднані до частинок кремнезему у вигляді лінійних ланцюгів, тоді як у стаціонарних фазах типу полістиролу навколо нього утворюється відносно товстий полімерний шар. У У типовому експерименті пористість колони розраховується як:
На рисунках 7A,B показано колонку PMP (100 × 1,8 мм внутрішній діаметр) та колонку Ascentis Express RP-Amide (100 × 1,8 мм внутрішній діаметр) з використанням однакових умов елюції (тобто 60/40 ACN/H2O та 0,1% TFA). ) графіка Ван-Деемтера. Вибрані пептидні суміші (Gly-Tyr, Gly-Leu-Tyr, Gly-Gly-Tyr-Arg, Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg, лейцин енкефалін) були приготовані в об'ємі 20 мкл/хв. Мінімальна швидкість потоку для обох колонок становила 800 мкл/хв. Мінімальні значення HETP при оптимальній швидкості потоку (80 мкл/хв) для колонки PMP та колонки Ascentis Express RP-Amide становили 2,6 мкм та 3,9 мкм відповідно. Значення HETP вказують на те, що ефективність розділення колонки PMP (100 × 1,8 мм внутрішній діаметр) набагато краща, ніж у комерційно доступної колонки Ascentis Express RP-Amide (100 × 1,8 мм внутрішній діаметр). Графік Ван-Деемтера на рис. 7(A) показує, що зменшення значення N зі збільшенням потоку не є значним порівняно з нашим попереднім дослідженням. Вища ефективність розділення колонки PMP (100 × 1,8 мм ід) порівняно з колонкою Ascentis Express RP-Amide базується на покращеннях форми, розміру частинок та складних процедур пакування колонки, що використовуються в поточній роботі34.
(A) Графік Ван-Демертера (HETP проти лінійної швидкості рухомої фази), отриманий за допомогою колонки PMP (100 × 1,8 мм внутрішній діаметр) у суміші ACN/H2O 60/40 з 0,1% TFA. (B) Графік Ван-Демертера (HETP проти лінійної швидкості рухомої фази), отриманий за допомогою колонки Ascentis Express RP-Amide (100 × 1,8 мм внутрішній діаметр) у суміші ACN/H2O 60/40 з 0,1% TFA.
Було підготовлено та оцінено стаціонарну фазу з полярним полістиролом для розділення синтетичних пептидних сумішей та трипсинових перетравлень людського сироваткового альбуміну (HAS) у високоефективній рідинній хроматографії. Хроматографічна продуктивність колонок PMP для пептидних сумішей є відмінною з точки зору ефективності розділення та роздільної здатності. Покращена продуктивність колонок PMP зумовлена ​​низкою причин, таких як розмір частинок та розмір пор частинок кремнезему, контрольований синтез стаціонарної фази та складне ущільнення колонки. Окрім високої ефективності розділення, низький протитиск у колонці при високих швидкостях потоку є ще однією перевагою цієї стаціонарної фази. Колонки PMP демонструють хорошу відтворюваність і можуть бути використані для аналізу пептидних сумішей та трипсиново-перетравлюваних різних білків. Ми маємо намір використовувати цю колонку для розділення натуральних продуктів, біоактивних сполук з лікарських рослин та грибкових екстрактів у рідинній хроматографії. У майбутньому колонки PMP також будуть оцінені для розділення білків та моноклональних антитіл.
Філд, Дж. К., Ейербі, М. Р., Лау, Дж., Тегерсен, Х. та Петерссон, П. Дослідження систем розділення пептидів за допомогою обернено-фазової хроматографії. Частина I: Розробка протоколу характеристики колонки. J. Chromatography. 1603, 113–129. https://doi.org/10.1016/j.chroma.2019.05.038 (2019).
Гомес, Б. та ін. Покращені активні пептиди, призначені для лікування інфекційних захворювань. Biotechnology.Advanced.36(2), 415-429. https://doi.org/10.1016/j.biotechadv.2018.01.004 (2018).
Вліге, П., Лісовський, В., Мартінес, Дж. та Хрестчатиський, М. Синтетичні терапевтичні пептиди: наука та ринок. Відкриття ліків. 15 (1-2) сьогодні, 40-56. https://doi.org/10.1016/j.drudis.2009.10.009 (2010).
Сє, Ф., Сміт, Р.Д. та Шень, Ю. Удосконалена протеомна рідинна хроматографія. J. Chromatography. A 1261, 78–90 (2012).
Liu, W. et al. Удосконалена рідинна хроматографія-мас-спектрометрія дозволяє включати широко спрямовані метаболомічні та протеомічні методи. anus. Chim. Acta 1069, 89–97 (2019).
Чеснут, С.М. та Солсбері, Дж.Дж. Роль ультрависокопродуктивної хроматографії (UHPLC) у розробці ліків. Журнал наукових досліджень, 30(8), 1183-1190 (2007).
Ву, Н. та Клаузен, А.М. Фундаментальні та практичні аспекти рідинної хроматографії надвисокого тиску для швидкого розділення. J. Sep. Sci. 30(8), 1167-1182. https://doi.org/10.1002/jssc.200700026 (2007).
Рен, С.А. та Челітчефф, П. Застосування надвисокоефективної рідинної хроматографії у розробці ліків. J. Chromatography. 1119(1-2), 140-146. https://doi.org/10.1016/j.chroma.2006.02.052 (2006).
Gu, H. et al. Монолітні макропористі гідрогелі, отримані з емульсій з високим вмістом внутрішньої фази типу «олія у воді» для ефективного очищення ентеровірусів. Chemical.Britain.J. 401, 126051 (2020).
Ши, Ю., Сян, Р., Хорват, К. та Вілкінс, Дж. А. Роль рідинної хроматографії в протеоміці. J. ​​Chromatography. A 1053(1-2), 27-36 (2004).
Фекете, С., Войтей, Дж.-Л. та Гільярме, Д. Новітні тенденції в розділенні терапевтичних пептидів та білків за допомогою рідинної хроматографії з оберненою фазою: теорія та застосування. J. Pharmacy. Biomedical Science.anus.69, 9-27 (2012).
Гілар, М., Олівова, П., Дейлі, А.Є. та Геблер, Дж.К. Двовимірне розділення пептидів за допомогою системи RP-RP-HPLC з використанням різних значень pH у першому та другому вимірах розділення. J. Sep. Sci.28(14), 1694-1703 (2005).
Фелетті, С. та ін. Досліджено характеристики масопереносу та кінетичні характеристики високоефективних хроматографічних колонок, заповнених повністю та поверхнево пористими частинками C18 розміром менше 2 мкм. J. Sep. Sci.43 (9-10), 1737-1745 (2020).
Піовесана, С. та ін. Останні тенденції та аналітичні проблеми у виділенні, ідентифікації та валідації рослинних біоактивних пептидів. anus.biological anus.Chemical.410(15), 3425–3444.https://doi.org/10.1007/s00216-018-0852-x (2018).
Мюллер, Дж. Б. та ін. Протеомний ландшафт царства життя. Nature 582(7813), 592-596. https://doi.org/10.1038/s41586-020-2402-x (2020).
ДеЛука, К. та ін. Дальня обробка терапевтичних пептидів за допомогою препаративної рідинної хроматографії. Molecule (Базель, Швейцарія) 26(15), 4688(2021).
Ян, Ю. та Генг, Х. Змішана хроматографія та її застосування до біополімерів. J. Chromatography. A 1218(49), 8813–8825 (2011).
Zhao, G., Dong, X.-Y. та Sun, Y. Ліганди для змішаної хроматографії білків: принцип, характеристика та розробка. J. Biotechnology. 144(1), 3-11 (2009).