Дякуємо за відвідування Nature.com. Ви використовуєте версію браузера з обмеженою підтримкою CSS. Для найкращого досвіду рекомендуємо використовувати оновлений браузер (або вимкнути режим сумісності в Internet Explorer). Крім того, для забезпечення постійної підтримки ми показуємо сайт без стилів та JavaScript.
Відображає карусель із трьох слайдів одночасно. Використовуйте кнопки «Попередній» та «Наступний», щоб переходити між трьома слайдами одночасно, або скористайтеся кнопками-повзунками в кінці, щоб переходити між трьома слайдами одночасно.
Пористі частинки кремнезему були отримані золь-гель методом з деякими модифікаціями для отримання частинок з широкими порами. Ці частинки були дериватизовані N-фенілмалеїмід-метилвінілізоціанатом (PMI) та стиролом за допомогою полімеризації зі зворотною передачею ланцюга-фрагментацією (RAFT) для отримання поліамідів, інтеркальованих N-фенілмалеїмідом. Стаціонарна фаза - стирол (PMP). Вузькопрохідні колонки з нержавіючої сталі (внутрішній діаметр 100 × 1,8 мм) були заповнені суспензійною насадкою. Хроматографічні характеристики колонки PMP були оцінені для розділення суміші синтетичних пептидів, що складається з п'яти пептидів (Gly-Tyr, Gly-Leu-Tyr, Gly-Gly-Tyr-Arg, Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg, Leu амінокислота енкефалін) та триптинового гідролізату сироваткового альбуміну людини (HAS). За оптимальних умов елюювання теоретична кількість пластин із сумішшю пептидів досягла 280 000 пластин/кв.м. Порівнюючи ефективність розділення розробленої колонки з комерційною колонкою Ascentis Express RP-Amide, було помічено, що ефективність розділення колонки PMP перевершувала комерційну колонку з точки зору ефективності розділення та роздільної здатності.
Біофармацевтична промисловість стала зростаючим світовим ринком зі значним збільшенням частки ринку за останні роки. Зі стрімким зростанням біофармацевтичної промисловості1,2,3 існує велика потреба в аналізі пептидів та білків. Окрім цільового пептиду, під час синтезу пептидів утворюються різні домішки, тому для отримання бажаної чистоти пептиду необхідне хроматографічне очищення. Аналіз та характеристика білків у рідинах, тканинах та клітинах організму є надзвичайно складним завданням через велику кількість потенційно виявлених видів, присутніх в одному зразку. Хоча мас-спектрометрія є ефективним інструментом для секвенування пептидів та білків, якщо такі зразки безпосередньо вводяться в мас-спектрометр, розділення буде незадовільним. Цю проблему можна вирішити, виконавши рідинну хроматографію (РХ) перед МС-аналізом, що зменшить кількість аналітів, що надходять у мас-спектрометр у заданий момент часу4,5,6. Крім того, аналіти можуть концентруватися у вузькій області під час розділення в рідкофазі, тим самим концентруючи ці аналіти та підвищуючи чутливість МС-детектування. Рідинна хроматографія (РХ) значно просунулася за останнє десятиліття та стала широко використовуваним методом протеомного аналізу7,8,9,10.
Обернено-фазова рідинна хроматографія (ОФРХ) широко використовується для очищення та розділення сумішей пептидів з використанням октадецил-модифікованого діоксиду кремнію (ОДС) як стаціонарної фази11,12,13. Однак, через їхню складну структуру та амфотерну природу14,15 стаціонарні фази ОФХ не можуть забезпечити задовільного розділення пептидів та білків. Тому аналіз пептидів та білків з полярними та неполярними фрагментами вимагає спеціально розроблених стаціонарних фаз для взаємодії та утримання цих аналітів16. Змішана хроматографія, яка пропонує мультимодальні взаємодії, може бути альтернативою ОФРХ для розділення пептидів, білків та інших складних сумішей. Було підготовлено кілька стаціонарних фаз змішаного типу, і колонки, заповнені цими стаціонарними фазами, використовувалися для розділення пептидів та білків17,18,19,20,21. Через наявність полярних та неполярних груп, стаціонарні фази змішаного режиму (WAX/ОФРХ, HILIC/ОФРХ, полярна інтеркаляція/ОФРХ) підходять для розділення пептидів та білків22,23,24,25,26,27,28. , полярні інтеркальовані стаціонарні фази з ковалентно зв'язаними полярними групами демонструють хороші можливості розділення та унікальну селективність для полярних та неполярних аналітів, оскільки розділення залежить від взаємодії між аналітом та стаціонарною фазою. Мультимодальні взаємодії 29,30,31,32. Нещодавно Zhang та ін. 30 отримали стаціонарні фази поліамінів з бегеніл-термінальними групами та успішно розділили вуглеводні, антидепресанти, флавоноїди, нуклеозиди, естрогени та деякі інші аналіти. Полярний вбудований стаціонарний матеріал має як полярні, так і неполярні групи, тому його можна використовувати для розділення пептидів та білків на гідрофобні та гідрофільні частини. Полярні вбудовані колонки (наприклад, колонки C18 з амідною вбудованою частиною) доступні під торговою назвою Ascentis Express RP-Amide columns, але ці колонки використовувалися лише для аналізу аміну 33.
У цьому дослідженні було підготовлено полярну вбудовану стаціонарну фазу (N-фенілмалеїмід, вбудований полістирол) та оцінено її для розділення пептидів та триптичного розщеплення HSA. Для приготування стаціонарної фази було використано наступну стратегію. Пористі частинки кремнезему були підготовлені згідно з процедурами, описаними в наших попередніх публікаціях, з деякими змінами в схемах приготування 31, 34, 35, 36, 37, 38, 39. Співвідношення сечовини, поліетиленгліколю (ПЕГ), ТМОС та водно-оцтової кислоти були скориговані для отримання частинок кремнезему з великими розмірами пор. По-друге, було синтезовано новий фенілмалеїмід-метилвінілізоціанатний ліганд, а його дериватизовані частинки кремнезему були використані для приготування полярних вбудованих стаціонарних фаз. Отриману стаціонарну фазу було упаковано в колонку з нержавіючої сталі (внутрішній діаметр 100 × 1,8 мм) згідно з оптимізованою схемою упаковки. Упаковка колонки здійснюється за допомогою механічної вібрації для забезпечення рівномірного шару всередині колонки. Наповнену колонку оцінювали на предмет розділення суміші пептидів, що складається з п'яти пептидів (Gly-Tyr, Gly-Leu-Tyr, Gly-Gly-Tyr-Arg, Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg, лейцин-енкефаліновий пептид) та триптичних гідролізатів сироваткового альбуміну людини (HSA). Було відзначено, що суміш пептидів та триптичний перетравлений HSA розділяються з хорошою роздільною здатністю та ефективністю. Ефективність розділення колонки PMP порівнювали з ефективністю колонки Ascentis Express RP-Amide. Було відзначено, що пептиди та білки мають хорошу роздільну здатність та високу ефективність розділення на колонці PMP, а ефективність розділення колонки PMP вища, ніж у колонки Ascentis Express RP-Amide.
ПЕГ (поліетиленгліколь), сечовина, оцтова кислота, триметоксиортосиликат (TMOS), триметилхлорсилан (TMCS), трипсин, людський сироватковий альбумін (HSA), хлорид амонію, сечовина, гексаметилметакрилоїлдисилазан (HMDS), метакрилоїлхлорид (MC), стирол, 4-гідрокси-TEMPO, бензоїлпероксид (BPO), ацетонітрил (ACN) для ВЕРХ, метанол, 2-пропанол та ацетон. Компанія Sigma-Aldrich (Сент-Луїс, Міссурі, США).
Суміш сечовини (8 г), поліетиленгліколю (8 г) та 8 мл 0,01 н. оцтової кислоти перемішували протягом 10 хвилин, після чого додали 24 мл TMOS при охолодженні льодом. Реакційну суміш нагрівали при 40°C протягом 6 годин, а потім при 120°C протягом 8 годин в автоклаві з нержавіючої сталі. Воду декантирували, а залишок сушили при 70°C протягом 12 годин. Висушені м'які блоки гладко подрібнювали та прожарювали в печі при 550°C протягом 12 годин. Було підготовлено та охарактеризовано три партії для перевірки відтворюваності розмірів частинок, розміру пор та площі поверхні.
Полярна група та стаціонарна фаза для полістирольних ланцюгів. Процедура отримання описана нижче.
N-фенілмалеїмід (200 мг) та метилвінілізоціанат (100 мг) розчинили в безводному толуолі, а потім до реакційної колби додали 0,1 мл 2,2'-азоізобутиронітрилу (AIBN) для отримання сополімеру фенілмалеїміду та метилвінілізоціанату (PMCP). Суміш нагрівали при 60°C протягом 3 годин, фільтрували та сушили в печі при 40°C протягом 3 годин.
Висушені частинки кремнезему (2 г) диспергували у сухому толуолі (100 мл), перемішували та обробляли ультразвуком протягом 10 хвилин у круглодонній колбі об'ємом 500 мл. PMCP (10 мг) розчинили в толуолі та додали краплями до реакційної колби через крапельну лійку. Суміш кип'ятили зі зворотним холодильником при 100°C протягом 8 годин, фільтрували, промивали ацетоном та сушили при 60°C протягом 3 годин. Потім частинки кремнезему, пов'язані з PMCP (100 г), розчинили в толуолі (200 мл) та додали 4-гідрокси-TEMPO (2 мл) у присутності 100 мкл дибутилдилаурату олова як каталізатора. Суміш перемішували при 50°C протягом 8 годин, фільтрували та сушили при 50°C протягом 3 годин.
Стирол (1 мл), бензоїлпероксид BPO (0,5 мл) та частинки кремнезему, приєднані до TEMPO-PMCP (1,5 г), диспергували в толуолі та продували азотом. Полімеризацію стиролу проводили при 100°C протягом 12 годин. Отриманий продукт промивали метанолом та сушили протягом ночі при 60°C. Загальна схема реакції показана на рис. 1.
Зразки дегазували при 393 K протягом 1 години до досягнення залишкового тиску менше 10–3 Торр. Кількість N2, адсорбованого при відносному тиску P/P0 = 0,99, використовували для визначення загального об'єму пор. Морфологію чистих та ліганд-зв'язаних частинок кремнезему досліджували за допомогою скануючого електронного мікроскопа (Hitachi High Technologies, Токіо, Японія). Сухі зразки (чистий кремнезем та ліганд-зв'язані частинки кремнезему) розміщували на алюмінієвих стрижнях за допомогою вуглецевої стрічки. Золото наносили на зразок за допомогою розпилювального пристрою Q150T, а шар Au товщиною 5 нм наносили на зразок. Це підвищує ефективність низьковольтного процесу та забезпечує дрібне холодне напилення. Елементний аналіз проводили за допомогою аналізатора елементного складу Thermo Electron (Waltham, MA, США) Flash EA1112. Для отримання розподілу розмірів частинок використовували аналізатор розмірів частинок Malvern (Worcestershire, UK) Mastersizer 2000. Непокриті частинки кремнезему та частинки кремнезему, зв'язані з лігандами (по 5 мг кожна) диспергували у 5 мл ізопропанолу, обробляли ультразвуком протягом 10 хвилин, перемішували протягом 5 хвилин та поміщали на оптичний стіл Mastersizer. Термогравіметричний аналіз проводили зі швидкістю 5 °C за хвилину в діапазоні температур від 30 до 800 °C.
Колонки з нержавіючої сталі з вузьким отвором, футерованим скловолокном, розмірами (внутрішній діаметр 100 × 1,8 мм), були заповнені методом суспензійного заповнення за тією ж процедурою, що й у посиланні 31. Колонку з нержавіючої сталі (з футеруванням скловолокном, внутрішній діаметр 100 × 1,8 мм) та вихідний отвір, що містить фритту 1 мкм, підключили до машини для суспензійного пакування (Alltech Deerfield, IL, США). Приготували суспензію стаціонарної фази, суспендувавши 150 мг стаціонарної фази в 1,2 мл метанолу та подавши її в резервуарну колону. Метанол використовували як розчинник для суспензії та контрольний розчинник. Заповнили колону, застосовуючи послідовний тиск 100 МП протягом 10 хвилин, 80 МП протягом 15 хвилин та 60 МП протягом 30 хвилин. У процесі заповнення використовували два вібратори газової хроматографії (Alltech, Deerfield, IL, США) для механічної вібрації, щоб забезпечити рівномірне заповнення колони. Закрийте суспензійний пакер та повільно скидайте тиск, щоб запобігти пошкодженню колони. Колону від'єднали від шламового сопла, а до входу приєднали інший фітинг і підключили до системи рідкого хроматографа для перевірки її роботи.
Спеціальний MLC був побудований з використанням насоса LC (10AD Shimadzu, Японія), пробовідбірника з інжекційною петлею 50 нл (Valco (США) C14 W.05), мембранного дегазатора (Shimadzu DGU-14A) та капілярного вікна UV-VIS. Детекторний пристрій (UV-2075) та емальована мікроколонка. Використовуйте дуже вузькі та короткі з'єднувальні трубки, щоб мінімізувати ефект додаткового розширення колонки. Після заповнення колонки встановіть капіляр (50 мкм внутрішній діаметр 365) на виході з відновлювального з'єднання 1/16 дюйма та встановіть капіляр (50 мкм) відновлювального з'єднання. Збір даних та обробка хроматограм виконуються за допомогою програмного забезпечення Multichro 2000. При 254 нм УФ-поглинання досліджуваних аналітів контролювали на рівні 0. Хроматографічні дані аналізували за допомогою OriginPro8 (Нортгемптон, Массачусетс).
Ліофілізований порошок людського сироваткового альбуміну, ≥ 96% (електрофорез в агарозному гелі), 3 мг, змішаний з трипсином (1,5 мг), 4,0 М сечовиною (1 мл) та 0,2 М бікарбонатом амонію (1 мл). Розчин перемішували протягом 10 хвилин та витримували на водяній бані при 37°C протягом 6 годин, потім гасили 1 мл 0,1% трифторвуглецевої кислоти (TFA). Розчин фільтрували та зберігали при температурі нижче 4°C.
Розділення суміші пептидів та трипсинового гідролізу HSA на колонці PMP оцінювали окремо. Перевірте трипсиновий гідроліз суміші пептидів та HSA, розділених колонкою PMP, та порівняйте результати з колонкою Ascentis Express RP-Amide. Кількість теоретичних тарілок розраховують за допомогою наступного рівняння:
Зображення SEM чистих частинок кремнезему та частинок кремнезему, пов'язаних з лігандом, показано на рисунку 2. Зображення SEM чистих частинок кремнезему (A, B) демонструють сферичну форму, в якій частинки витягнуті або мають неправильну симетрію порівняно з нашими попередніми дослідженнями. Поверхня частинок кремнезему, пов'язаних лігандом (C, D), гладша, ніж у чистих частинок кремнезему, що може бути пов'язано з тим, що ланцюги полістиролу покривають поверхню частинок кремнезему.
Фотографії сканувальних електронних мікроскопів чистих частинок кремнезему (A, B) та частинок кремнезему, зв'язаних з лігандами (C, D).
Розподіл розмірів частинок чистого кремнезему та частинок кремнезему, зв'язаних з лігандами, показано на рис. 2.3(A). Криві об'ємного розподілу розмірів частинок показали, що розмір частинок кремнезему збільшився після хімічної модифікації (рис. 3A). Дані розподілу розмірів частинок кремнезему з поточного та попереднього досліджень порівнюються в таблиці 1(A). Об'ємний розмір частинок d(0,5) PMP становив 3,36 мкм порівняно зі значенням ad(0,5) 3,05 мкм у нашому попередньому дослідженні (частинки кремнезему, пов'язані з полістиролом)34. Через зміну співвідношення PEG, сечовини, TMOS та оцтової кислоти в реакційній суміші розподіл розмірів частинок цієї партії був вужчим порівняно з нашим попереднім дослідженням. Розмір частинок фази PMP трохи більший, ніж у фази частинок кремнезему, пов'язаного з полістиролом, яку ми вивчали раніше. Це означає, що поверхнева функціоналізація частинок кремнезему стиролом призвела до утворення на поверхні кремнезему лише шару полістиролу (0,97 мкм), тоді як у фазі PMP товщина шару становила 1,38 мкм.
Розподіл розмірів частинок (A) та розподіл розмірів пор (B) чистих частинок кремнезему та частинок кремнезему, зв'язаних з лігандами.
Розмір пор, об'єм пор та площа поверхні частинок кремнезему, використаних у цьому дослідженні, наведено в таблиці 1 (B). Профілі PSD чистих частинок кремнезему та частинок кремнезему, зв'язаних з лігандами, показані на рис. 3 (B). Результати були порівнянні з нашим попереднім дослідженням34. Розміри пор чистих та зв'язаних з лігандами частинок кремнезему становили 310 Å та 241 Å відповідно, що вказує на те, що після хімічної модифікації розмір пор зменшився на 69 Å, як показано в таблиці 1 (B), а крива зсуву показана на рис. Питома площа поверхні частинок кремнезему в поточному дослідженні становить 116 м²/г, що можна порівняти з нашим попереднім дослідженням (124 м²/г). Як показано в таблиці 1 (B), площа поверхні (м²/г) частинок кремнезему після хімічної модифікації також зменшилася з 116 м²/г до 105 м²/г.
Результати елементного аналізу стаціонарної фази представлені в таблиці 2. Вміст вуглецю в поточній стаціонарній фазі становить 6,35%, що нижче, ніж у нашому попередньому дослідженні (частинки кремнезему, пов'язані з полістиролом, 7,93%35 та 10,21% відповідно)42. Вміст вуглецю в поточній стаціонарній фазі нижче, оскільки деякі полярні ліганди, такі як фенілмалеїмід метилвінілізоціанат (PCMP) та 4-гідрокси-TEMPO, використовувалися на додаток до стиролу при отриманні SP. Масовий відсоток азоту в поточній стаціонарній фазі становить 2,21% порівняно з 0,1735 та 0,85% у попередніх дослідженнях42. Це означає, що поточна стаціонарна фаза має високий масовий відсоток азоту через фенілмалеїмід. Аналогічно, продукти (4) та (5) мають вміст вуглецю 2,7% та 2,9% відповідно, тоді як кінцевий продукт (6) має вміст вуглецю 6,35%, як показано в Таблиці 2. Для перевірки втрати ваги на стаціонарній фазі PMP було використано термогравіметричний аналіз (ТГА), а крива ТГА показана на Рисунку 4. Крива ТГА показує втрату ваги 8,6%, що добре узгоджується з вмістом вуглецю (6,35%), оскільки ліганди містять не тільки C, але також N, O та H.
Ліганд фенілмалеїмід-метилвінілізоціанат був обраний для модифікації поверхні частинок кремнезему через його полярні фенілмалеїмідні та вінілізоціанатні групи. Вінілізоціанатні групи можуть додатково реагувати зі стиролом шляхом живої радикальної полімеризації. Друга причина полягає у введенні групи, яка має помірну взаємодію з аналітом і не має сильних електростатичних взаємодій між аналітом і стаціонарною фазою, оскільки фенілмалеїмідний фрагмент не має віртуального заряду при нормальному pH. Полярність стаціонарної фази можна контролювати оптимальною кількістю стиролу та часом реакції вільнорадикальної полімеризації. Заключний етап реакції (вільнорадикальна полімеризація) є критичним, оскільки він змінює полярність стаціонарної фази. Був проведений елементний аналіз для перевірки вмісту вуглецю в цих стаціонарних фазах. Було помічено, що збільшення кількості стиролу та часу реакції збільшує вміст вуглецю в стаціонарній фазі і навпаки. SP, приготовані з різною концентрацією стиролу, мають різне навантаження вуглецю. Аналогічно, ці стаціонарні фази були поміщені на колонки з нержавіючої сталі, і були перевірені їхні хроматографічні характеристики (селективність, роздільна здатність, значення N тощо). На основі цих експериментів було обрано оптимізований склад для приготування стаціонарної фази PMP, щоб забезпечити контрольовану полярність та хороше утримання аналіту.
Колонку PMP також оцінювали для аналізу п'яти сумішей пептидів (Gly-Tyr, Gly-Leu-Tyr, Gly-Gly-Tyr-Arg, Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg, лейцин-енкефалін) з використанням ємності рухомої фази 60/40 (об./об.) ACN/вода (0,1% TFA) зі швидкістю потоку 80 мкл/хв. За оптимальних умов елюції (200 000 пластин/м²) кількість теоретичних пластин (N) на колонку (100 × 1,8 мм) становить 20 000 ± 100. Значення N для трьох колонок PMP наведено в таблиці 3, а хроматограми – на рисунку 5A. Швидкий аналіз з високою швидкістю потоку (700 мкл/хв) на колонці PMP, п'ять пептидів елюйовано протягом однієї хвилини, відмінне значення N 13 500 ± 330 на колонку (діаметр 100 x 1,8 мм), що еквівалентно 135 000 пластин/м (рис. 5B). Три колонки однакового розміру (внутрішній діаметр 100 x 1,8 мм) були заповнені трьома різними партіями стаціонарної фази PMP для перевірки відтворюваності. Аналіти реєстрували для кожної колонки шляхом розділення тієї ж тестової суміші на кожній колонці з використанням оптимальних умов елюції, кількості теоретичних пластин N та часу утримування. Дані відтворюваності для колонок PMP наведено в таблиці 4. Відтворюваність колонки PMP добре корелювала з дуже низькими значеннями %RSD, як показано в таблиці 3.
Розділення пептидних сумішей на колонці PMP (B) та колонці Ascentis Express RP-Amide (A), рухома фаза 60/40 ACN/H2O (TFA 0,1%), розміри колонки PMP (100 x 1,8 мм внутрішній діаметр), аналіз. Порядок елюювання сполук: 1 (Gly-Tyr), 2 (Gly-Leu-Tyr), 3 (Gly-Gly-Tyr-Arg), 4 (Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg) та 5 (енкефалін лейцинової кислоти).
Колонку PMP (внутрішній діаметр 100 x 1,8 мм) оцінювали для розділення трипсинового гідролізату людського сироваткового альбуміну за допомогою ВЕРХ. Хроматограма на рисунку 6 показує, що зразки добре розділені з дуже хорошою роздільною здатністю. Розчини HSA аналізували з використанням швидкості потоку 100 мкл/хв, рухомої фази 70/30 ацетонітрил/вода та 0,1% TFA. Розщеплення HSA було розділено на 17 піків, як показано на хроматограмі (рис. 6), що відповідає 17 пептидам. Ефективність розділення окремих піків від гідролізату HSA була розрахована, а значення наведено в таблиці 5.
Триптичні гідролізати HSA розділяли на колонці PMP (внутрішній діаметр 100 x 1,8 мм), швидкість потоку (100 мкл/хв), рухома фаза 60/40 ацетонітрил/вода та 0,1% TFA.
де L – довжина колонки, η – в'язкість рухомої фази, ΔP – протитиск колонки, а u – лінійна швидкість рухомої фази. Проникність колонки PMP становила 2,5 × 10–14 м2, швидкість потоку – 25 мкл/хв, використовувалося суміш ACN/вода 60/40 об./об. Проникність колонки PMP (внутрішній діаметр 100 × 1,8 мм) була подібною до проникності нашого попереднього дослідження [34]. Проникність колонки, заповненої поверхнево пористими частинками, становить 1,7×10,6 мкм, 2,5×10-14 м2 для частинок розміром 5 мкм [43]. Отже, проникність фази PMP подібна до проникності частинок ядро-оболонка розміром 5 мкм.
де Wx – маса колони, заповненої хлороформом, Wy – маса колони, заповненої метанолом, а ρ – густина розчинника. Густина метанолу (ρ = 0,7866) та хлороформу (ρ = 1,484). Загальна пористість колони з частинками кремнезему-C18 (100 × 1,8 мм внутрішній діаметр)34 та нашої раніше дослідженої колони C18-сечовина31 становила 0,63 та 0,55 відповідно. Це означає, що присутність лігандів сечовини зменшує проникність стаціонарної фази. З іншого боку, загальна пористість колони PMP (внутрішній діаметр 100 × 1,8 мм) становить 0,60. Колони PMP менш проникні, ніж колони, заповнені частинками кремнезему, зв'язаними з C18, оскільки в стаціонарних фазах типу C18 ліганди C18 приєднані до частинок кремнезему лінійними ланцюгами, тоді як у стаціонарних фазах типу полістиролу навколо частинок утворюється відносно товстий полімер. шар А. У типовому експерименті пористість колони розраховується наступним чином:
На рис. 7A, B показано графіки Ван-Деемтера для колонки PMP (внутрішній діаметр 100 x 1,8 мм) та колонки Ascentis Express RP-Amide (внутрішній діаметр 100 x 1,8 мм) за однакових умов елюювання, 60/40 ACN/H2O та 0,1% TFA від 20 мкл/хв до 800 мкл/хв на обох колонках. Мінімальні значення HETP при оптимальній швидкості потоку (80 мкл/хв) становили 2,6 мкм та 3,9 мкм для колонки PMP та колонки Ascentis Express RP-Amide відповідно. Значення HETP показують, що ефективність розділення колонки PMP (100 x 1,8 мм внутрішній діаметр) значно вища, ніж у комерційно доступної колонки Ascentis Express RP-Amide (100 x 1,8 мм внутрішній діаметр). Графік ван Демтера на рис. 7(A) показує, що зменшення значення N не є суттєво більшим зі збільшенням потоку порівняно з нашим попереднім дослідженням. Вища ефективність розділення колони PMP (внутрішній діаметр 100 × 1,8 мм) порівняно з колоною Ascentis Express RP-Amide ґрунтується на покращеній формі та розмірі частинок, а також на складній процедурі наповнення колони, що використовується в поточній роботі34.
(A) Графік Ван-Деемтера (HETP проти лінійної швидкості рухомої фази), отриманий на колонці PMP (внутрішній діаметр 100 x 1,8 мм) у суміші ACN/H2O 60/40 з 0,1% TFA. (B) Графік Ван-Деемтера (HETP проти лінійної швидкості рухомої фази), отриманий на колонці Ascentis Express RP-Amide (внутрішній діаметр 100 x 1,8 мм) у суміші ACN/H2O 60/40 з 0,1% TFA.
Полярну стаціонарну фазу інтеркальованого полістиролу було підготовлено та оцінено для розділення суміші синтетичних пептидів та трипсинового гідролізату людського сироваткового альбуміну (HSA) у високоефективній рідинній хроматографії. Хроматографічні характеристики колонок PMP для пептидних сумішей є відмінними з точки зору ефективності розділення та роздільної здатності. Підвищена ефективність розділення колонок PMP зумовлена ​​кількома причинами, такими як розмір частинок кремнезему та розмір пор, контрольований синтез стаціонарних фаз та складні матеріали наповнення колонки. Окрім високої ефективності розділення, ще однією перевагою цієї стаціонарної фази є низький протитиск у колонці при високих швидкостях потоку. Колони PMP мають високу відтворюваність і можуть бути використані для аналізу сумішей пептидів та трипсинового розщеплення різних білків. Ми маємо намір використовувати цю колонку для розділення біоактивних сполук з натуральних продуктів, екстрактів лікарських рослин та грибів у рідинній хроматографії. У майбутньому колонки PMP також будуть оцінені для розділення білків та моноклональних антитіл.
Філд, Дж. К., Ейербі, М. Р., Лау, Дж., Тегерсен, Х. та Петерссон, П. Дослідження систем розділення пептидів методом обернено-фазової хроматографії, частина I: Розробка протоколу для характеристики колонки. Філд, Дж. К., Ейербі, М. Р., Лау, Дж., Тегерсен, Х. та Петерссон, П. Дослідження систем розділення пептидів методом обернено-фазової хроматографії, частина I: Розробка протоколу для характеристики колонки.Філд, Дж. К., Овербі, М. Р., Лау, Дж., Тогерсен, Х. та Петерссон, П. Дослідження систем розділення пептидів за допомогою обернено-фазової хроматографії, частина I: Розробка протоколу для характеристики колонки. Філд, Дж. К., Ейербі, М. Р., Лау, Дж., Тегерсен, Х. та Петерссон, П. Дослідження систем розділення пептидів за допомогою хроматографії оберненої фази, частина I: Розробка протоколу для характеристик колонки. Філд, Дж. К., Ейербі, М. Р., Лау, Дж., Тегерсен, Х. та Петерссон, П. Дослідження систем розділення пептидів за допомогою хроматографії оберненої фази, частина I: Розробка протоколу для характеристик колонки.Філд, Дж. К., Овербі, М. Р., Лау, Дж., Тогерсен, Х. та Петерссон, П. Дослідження систем розділення пептидів за допомогою обернено-фазової хроматографії, частина I: Розробка протоколу для характеристики колонки.J.色谱法。 1603，113-129。 https://doi.org/10.1016/j.chroma.2019.05.038(2019).
Гомес, Б. та ін. Методи створення покращених активних пептидів для лікування інфекційних захворювань. Біотехнологія. Досягнення 36(2), 415–429. https://doi.org/10.1016/j.biotechadv.2018.01.004 (2018).
Вліге, П., Лісовський, В., Мартінес, Й. та Хрестчатиський, М. Синтетичні терапевтичні пептиди: наука та ринок. Вліге, П., Лісовський, В., Мартінес, Й. та Хрестчатиський, М. Синтетичні терапевтичні пептиди: наука та ринок.Вліге П., Лісовскі В., Мартінес Дж. та Хрещатиський М. Синтетичні терапевтичні пептиди: наука та ринок.Вліге П., Лісовскі В., Мартінес Дж. та Хрещацький М. Синтетичні терапевтичні пептиди: наука та ринок. Розробка ліків. Today 15 (1–2), 40–56. https://doi.org/10.1016/j.drudis.2009.10.009 (2010).
Сє, Ф., Сміт, Р.Д. та Шень, Ю. Удосконалена протеомна рідинна хроматографія. Сє, Ф., Сміт, Р.Д. та Шень, Ю. Удосконалена протеомна рідинна хроматографія.Див. F., Smith RD та Shen Yu. Удосконалена протеомна рідинна хроматографія. Се, Ф., Сміт, Р. Д. та Шен, Ю. 高级蛋白质组液相色谱。 Xie, F., Smith, RD & Shen, Y. Удосконалений білковий склад 液相色谱。Див. F., Smith RD та Shen Yu. Удосконалена протеомна рідинна хроматографія.Журнал хроматографії. A 1261, 78–90 (2012).
Liu, W. та ін. Удосконалена рідинна хроматографія-мас-спектрометрія здатна поєднувати широку метаболому та протеоміку. anus. Chim. Acta 1069, 89–97 (2019).
Чеснут, С.М. та Солсбері, Дж.Дж. Роль ультрависокопродуктивної хроматографії (UHPLC) у фармацевтичній розробці. Чеснут, С.М. та Солсбері, Дж.Дж. Роль ультрависокопродуктивної хроматографії (UHPLC) у фармацевтичній розробці.Чеснут, С.М. та Солсбері, Дж.Дж. Роль ультрависокопродуктивної хроматографії (UHPLC) у фармацевтичній розробці.Чеснут, С.М. та Солсбері, Дж.Дж. Роль ультрависокопродуктивної хроматографії (UHPLC) у розробці ліків. J. Sept Science. 30(8), 1183–1190 (2007).
Ву, Н. та Клаузен, А.М. Фундаментальні та практичні аспекти рідинної хроматографії надвисокого тиску для швидкого розділення. Ву, Н. та Клаузен, А.М. Фундаментальні та практичні аспекти рідинної хроматографії надвисокого тиску для швидкого розділення.Ву, Н. та Клаузен, А.М. Фундаментальні та практичні аспекти рідинної хроматографії високого тиску для швидкого розділення. Wu, N. & Clausen, AM 用于快速分离的超高压液相色谱的基础和实践方面。 Ву, Н. та Клаузен, А.М. Основні та практичні аспекти рідинної хроматографії надвисокого тиску для швидкого розділення.Ву, Н. та Клаузен, А.М. Фундаментальні та практичні аспекти рідинної хроматографії високого тиску для швидкого розділення.Журнал вересневого природознавства. 30(8), 1167–1182. https://doi.org/10.1002/jssc.200700026 (2007).
Рен, С.А. та Челітчеф, П. Використання надпродуктивної рідинної хроматографії у фармацевтичній розробці. Рен, С.А. та Челітчеф, П. Використання надпродуктивної рідинної хроматографії у фармацевтичній розробці.Рен, С.А. та Челішефф, П. Використання надвисокоефективної рідинної хроматографії у фармацевтичній розробці. Wren, SA & Tchelitcheff, P. 超高效液相色谱在药物开发中的应用。 Рен, С.А. та Челітчеф, П.Рен, С.А. та Челішефф, П. Застосування надпродуктивної рідинної хроматографії в розробці ліків.Журнал хроматографії. 1119(1-2), 140-146. https://doi.org/10.1016/j.chroma.2006.02.052 (2006).
Гу, Х. та ін. Монолітний макропористий гідрогель, отриманий з емульсії «олія у воді» з високим вмістом внутрішньої фази для ефективного очищення ентеровірусу 71. Хімічний проект. Журнал 401, 126051 (2020).
Ши, Ю., Сян, Р., Хорват, К. та Вілкінс, Дж. А. Роль рідинної хроматографії в протеоміці. Ши, Ю., Сян, Р., Хорват, К. та Вілкінс, Дж. А. Роль рідинної хроматографії в протеоміці.Ши, Ю., Сян, Р., Хорват, К. та Вілкінс, Дж. А. Роль рідинної хроматографії в протеоміці. Shi, Y., Xiang, R., Horváth, C. & Wilkins, JA 液相色谱在蛋白质组学中的作用。 Ши, Ю., Сян, Р., Горват, К. і Вілкінс, JAШи, Ю., Сян, Р., Хорват, К. та Вілкінс, Дж. А. Роль рідинної хроматографії в протеоміці.Журнал хроматографії. A 1053 (1-2), 27-36 (2004).
Фекете, С., Вутей, Дж.-Л. & Гільярме, Д. Нові тенденції в розділенні терапевтичних пептидів та білків за допомогою обернено-фазової рідинної хроматографії: теорія та застосування. & Гільярме, Д. Нові тенденції в розділенні терапевтичних пептидів та білків за допомогою обернено-фазової рідинної хроматографії: теорія та застосування. & Guillarme, D. Нові тенденції в розділенні терапевтичних пептидів і білків за допомогою рідкої хроматографії з адресованою фазою: теорія і застосування. & Гільярме, Д. Нові тенденції в розділенні терапевтичних пептидів та білків за допомогою рідинної хроматографії з оберненою фазою: теорія та застосування. & Guillarme, D. 治疗性肽和蛋白质的反相液相色谱分离的新趋势：理论和应用。 & Гільярме, Д.та Гільярме, Д. Нові тенденції в розділенні терапевтичних пептидів та білків за допомогою рідинної хроматографії з оберненою фазою: теорія та застосування.Журнал фармацевтичних біомедичних наук. анус. 69, 9–27 (2012).
Гілар, М., Олівова, П., Дейлі, А.Є. та Геблер, Дж.К. Двовимірне розділення пептидів за допомогою системи RP-RP-HPLC з різним pH у першому та другому вимірах розділення. Гілар, М., Олівова, П., Дейлі, А.Є. та Геблер, Дж.К. Двовимірне розділення пептидів за допомогою системи RP-RP-HPLC з різним pH у першому та другому вимірах розділення.Гілар М., Олівова П., Далі А.Є. та Геблер Дж.К. Двовимірне розділення пептидів за допомогою системи RP-RP-HPLC з різним pH у першому та другому вимірах розділення.Гілар М., Олівова П., Далі А.Є. та Геблер Дж.К. Двовимірне розділення пептидів з використанням різних значень pH у першому та другому вимірах розділення за допомогою системи RP-RP-HPLC. J. Sept Science. 28 (14), 1694–1703 (2005).
Феллітті, С. та ін. Дослідження масопереносу та кінетичних характеристик високоефективних хроматографічних колонок, заповнених повністю пористими та поверхнево пористими частинками C18 розміром менше 2 мкм. J. Sept Science. 43 (9–10), 1737–1745 (2020).
Піовесана, С. та ін. Останні тенденції та аналітичні проблеми у виділенні, ідентифікації та валідації рослинних біоактивних пептидів. anus. Creature anal. Chemical. 410(15), 3425-3444. https://doi.org/10.1007/s00216-018-0852-x (2018).
Мюллер, Дж. Б. та ін. Протеомний ландшафт царства життя. Nature 582 (7813), 592–596. https://doi.org/10.1038/s41586-020-2402-x (2020).
Де Лука, К. та ін. Подальша обробка терапевтичних пептидів за допомогою препаративної рідинної хроматографії. Molecules (Базель, Швейцарія) 26(15), 4688 (2021).
Ян, Ю. та Генг, Х. Змішана хроматографія та її застосування до біополімерів. Ян, Ю. та Генг, Х. Змішана хроматографія та її застосування до біополімерів.Ян, Ю. та Генг, Х. Змішана хроматографія та її застосування до біополімерів. Yang, Y. & Geng, X. 混合模式色谱及其在生物聚合物中的应用。 Ян, Ю. та Генг, Х. Змішана хроматографія та її застосування в біополімерах.Ян, Ю. та Джин, Х. Змішана хроматографія та її застосування до біополімерів.Журнал хроматографії. A 1218(49), 8813–8825 (2011).