Дякуємо, що відвідали Nature.com.Версія браузера, яку ви використовуєте, має обмежену підтримку CSS.Для найкращої роботи радимо використовувати оновлений браузер (або вимкнути режим сумісності в Internet Explorer).Тим часом, щоб забезпечити постійну підтримку, ми відтворюємо сайт без стилів і JavaScript.
Angustifolius lupine (Nll, Lupinus angustifolius L.) - це бобова рослина, що використовується для виробництва їжі та поліпшення ґрунту.Глобальне розширення NLL як врожаю залучило багато патогенних грибів, включаючи антракнозу люпину, що спричиняє руйнівну хворобу антракнози.Два алелі, LANR1 та Anman, які надають підвищену резистентність, використовувались у розведенні NLL, але основні молекулярні механізми залишаються невідомими.У цьому дослідженні маркери LANR1 та Anman використовувались для екранізації європейських зразків NLL.Тестування вакцини в контрольованому середовищі підтвердило ефективність обох стійких донорів.Диференціальне профілювання експресії генів проводили на репрезентативних стійких та сприйнятливих лініях.Резистентність до антракнози була пов'язана з надмірною експресією термінів онтології генів "GO: 0006952 Відповідь на захист", "GO: 0055114 Redox Process" та "GO: 0015979 фотосинтез".Крім того, лінія LANR1 (83A: 476) показала значне перепрограмування транскрипту швидко після щеплення, а інші лінії показали затримку цієї відповіді приблизно на 42 години.Захисні реакції пов'язані з генами TIR-NBS, CC-NBS-LRR та NBS-LRR, 10 білками, що беруть участь у патогенезі, білках перенесення ліпідів, ендоглюкан-1,3-β-глюкозидази, білків клітин, багатих гліцином, та генами від реактивного шляху кисню.Ранні відповіді на 83А: 476, включаючи ретельне придушення генів, пов'язаних з фотосинтезом, збігалися з успішним захистом під час фази вегетативного росту грибкової біології, що дозволяє припустити, що ефектор викликає імунітет.Реакція Mandeloop сповільнюється, як і загальне горизонтальне перетягування.
Вузький лупін (NLL, Lupinus angustifolius L.)-це висока білкова крупа, що виникає в західному середземноморському регіоні1,2.В даний час він вирощується як продовольчий урожай для тварин і людей.Він також вважається зеленим гною в системах ротації врожаю через фіксацію азоту за допомогою симбіотичних бактерій, що фіксують азот, та загального поліпшення структури ґрунту.NLL пройшов швидкий процес одомашнення в минулому столітті і досі перебуває під високим тиском розмноження 3,4,5,6,7,8,9,10,11,12.Завдяки широкому вирощуванню NLL, спадщина патогенних грибів розвинула нові сільськогосподарські ніші та спричинила нові захворювання, що руйнують врожай. Найбільш примітним для фермерів та селекціонерів люпін був поява антракнози, викликана патогенним грибком, Colletotrichum lupini (Bondar) Nirenberg, Feiler & Hagedorn13. Найбільш примітним для фермерів та селекціонерів люпін був поява антракнози, викликана патогенним грибком, Colletotrichum lupini (Bondar) Nirenberg, Feiler & Hagedorn13. Nаібалее Прімечателььн -М.д. UPINI (BONDAR) NIRENBERG, FEILER & HAGEDORN13. Найбільш помітним для люпінових фермерів та селекціонерів стала поява антракнози, спричинена патогенним грибком Colletotrichum lupini (Bondar) Nirenberg, Feiler & Hagedorn13.对于 羽扇豆 农民 和 饲养者 来说.对于 羽扇豆 农民 和 饲养者 来说. Намауле -Плярзительнях -Для люта лют. Ichum Lupini (Бондар) Ніренберг, Фейлер і Хагедорн13. Найбільш вражаючим люпіновим фермерам та селекціонерам є поява антракнози, викликана патогенним грибком Colletotrichum lupini (Bondar) Nirenberg, Feiler & Hagedorn13.Найдавніші повідомлення про захворювання надходили з Бразилії та США, з типовими симптомами, що виникають відповідно у 1912 та 1929 роках.Однак приблизно через 30 років збудник був позначений як Colletotrichum Gloeosporioides (Penz.) Penz. & Sacc., Teleomorph Glomerella cingulata (Stoneman) Spauld. & Sacc., Teleomorph Glomerella cingulata (Stoneman) Spauld. & SACC., ТЕЛЕОМОРФ ГЛОМЕРЕЛЕЛЕЛЬ СІНГУЛАТА (СТОНЕМАН) Спаулд. & Sacc., Телеоморф Glomerella cingulata (Stoneman) Spauld. & Sacc. & Sacc. & Sacc., Glomerella cingulata (Stoneman) Spauld целеляправленной Морфлоги. & Sacc., Glomerella cingulata (Stoneman) Spauld у цільовій морфології. & Х. Шренк ,. & Х. Шренк ,.та Х. Шренк. & H. 施伦克 ，。 & H. 施伦克 ，。та Х. Шленк ,.Попереднє фенотипування захворювання, зроблене в середині 20 століття, показало певну резистентність у приєднаннях NLL та жовтого люпіну (L. luteus L.), але всі тестовані присутності білого люпину (L. albus L.) були дуже сприйнятливими15,16.Дослідження показали, що розвиток антракнози пов'язаний із збільшенням опадів (вологість повітря) та температурою (в діапазоні 12-28 ° C), що призводить до порушення резистентності при більш високій температурі17, 18. Насправді час, необхідний для конідії, і захворювання, було в чотири рази коротший при високій умовах19.Таким чином, постійне глобальне потепління призвело до поширення антракнози.Однак хвороба спостерігалася у Франції (1982) та Україні (1983) як передвісник загрози, що насувається, але, очевидно, ігнорувалась люпіновою промисловістю на час 20,21.Через кілька років це руйнівне захворювання поширилося по всьому світу, а також вплинуло на великі країни, що виробляють люпин, такі як Австралія, Польща та Німеччина22,23,24.Після спалаху антракнози в середині 1990-х років обширний скринінг призвів до ідентифікації декількох резистентних донорів у зразках NLL19.Стійкість NLL до антракнози контролюється двома окремими домінуючими алелями, що містяться в різних джерелах зародкової плазми: LANR1 у сорті Танджил та Вонга та Анмана в сорті.Mandalay 25, 26. Ці алелі доповнюють молекулярні маркери, які підтримують вибір стійкої зародкової плазми в програмах розведення 25,26,27,28,29,30.Однак, через невелику кількість RIL та велику генетичну відстань між маркерами та відповідними алелями, щодо їх основних генів не можна зробити достовірних висновків.З іншого боку, використання зворотної генетики в люпінах складно через їх дуже низький потенціал регенерації, що робить генетичну маніпуляцію громіздкою37.
Розвиток одомашненої зародки, що несе бажаний алель у гомозиготній державі, таких як 83А: 476 (LANR1) та Mandelup (Anman), відкрив двері для вивчення резистентності до антракнози в умовах присутності протилежних комбінацій алелів у дикому населенні.Можливості молекулярних механізмів.Порівняйте відповіді на захист, породжені специфічними генотипами.У цьому дослідженні було оцінено ранню транскриптову реакцію NLL на вакцинацію C. lupini.По -перше, європейська панель NLL -зародка, що містить 215 ліній, була обстежена за допомогою молекулярних маркерів, які позначають алелі LANR1 та Anman.Потім фенотипування антракнози проводили на 50 лініях NLL, раніше відібраних для молекулярних маркерів, в контрольованих умовах.На основі цих експериментів було обрано чотири лінії, що відрізняються за резистентністю до антракнози, а для диференціальної експресії гена оборони, а алельного складу LANR1/ANMAN були обрані для диференціальної експресії гена оборони, використовуючи два додаткові підходи: високопропускну послідовність РНК та кількісне визначення ПКР у режимі реального часу.
Скринінг набору NLL-зародної плазми (n = 215) з маркерами LANR1 (Anseq3 та Anseq4) та Anman (Anseq4) та Anman (Anmanm1) показали, що лише одна лінія (95726, поблизу Саламанки-Б) підсилює "опір" алель для всіх маркерів, а "наявність 58-річного".Тринадцять ліній створили два «стійкі» алелі маркера LANR1, а 8 ліній виробляли «стійкі» алелі LANR1.Маркер.Алель "опору" маркера Anman (додаткова таблиця S1).Дві лінії були гетерозиготними для маркера Anseq3 і одна гетерозиготна для маркера Anmanm1.42 лінії (19,5%) носили протилежні фази алелів ANSEQ3 та ANSEQ4, що вказує на високу частоту рекомбінації між цими двома локусами.Фенотипи антракнози в контрольованих умовах (додаткова таблиця S2) виявила мінливість резистентності випробуваних генотипів, що відображалося у тяжкості антракнози.Відмінності середніх балів коливалися від 1,8 (помірно стійкі) до 6,9 (сприйнятливі) та різниці ваги рослин коливався від 0,62 (сприйнятливого) до 4,45 г (стійкий). Існувала значна кореляція між значеннями, що спостерігаються у двох реплікаціях експерименту (0,51 для балів тяжкості захворювання, р = 0,00017 та 0,61 для маси рослин, р <0,0001), а також між цими двома параметрами ( - 0,59 та - 0,77, р <0,0001). Існувала значна кореляція між значеннями, що спостерігаються у двох реплікаціях експерименту (0,51 для балів тяжкості захворювання, р = 0,00017 та 0,61 для маси рослин, р <0,0001), а також між цими двома параметрами ( - 0,59 та - 0,77, р <0,0001). В'АВЕЛЕНА ДОСТОВЕРНАЯ КОРРЕЛЯХІЙСЯ МЕЙКОДУ зNачкемомі, Наблхедемміми Вуух н -втірносях ньянт. leезni, p = 000017 y 0,61 ция -maSSыr.rastenyuy, p <0,0001), a takже meжdu эtymi dutemu stramе -r. Було виявлено значну кореляцію між значеннями, що спостерігаються у двох повторах експерименту (0,51 для балів тяжкості захворювання, p = 0,00017 та 0,61 для маси рослин, р <0,0001), а також між цими двома параметрами ( - 0,59 та -0,77, р <0,0001) 0,0001).在 两 次 重复 实验 中 观察 到 的 值 之间 存在 显着 相关性 （疾病 严重 程度 评 分为 分为 分为 0,51 ， p = 0,00017 ， 植物 为 为 为 0,61 ， p <0,0001） 这 两 个 参数 之间 （- 0,59 和- 0,77 ， P <0,0001)。- 0,59 和- 0,77 ， P <0,0001)。- 0,59 和- 0,77 ， P <0,0001)。- 0,59 和- 0,77 ， P <0,0001)。- 0,79- 0,77 ， P <0,0001)。- 0,79- 0,77 ， P <0,0001)。。-在 两 次 重复 实验 中 观察 的 值 之间 存在 相关性. 1)。 Наблхдаласьолатялатялатяя -дителная, що є, дюхенімі, nablюdaemymi v dvхt.. , 00017 y maSSA.raStentyta 0,61, p <00001), ymежdу эtymi двумя Парамена (-0,59 і -0 0001) 0,77, p <0 0001. Існувала значна кореляція між значеннями, що спостерігаються у двох примірниках (оцінка тяжкості захворювання 0,51, р = 0,00017 та маса рослин 0,61, р <0,0001) та між цими двома параметрами (-0,59 та -0 .0001) 0,77, p <0,0001. ).Типові симптоми, що спостерігаються в сприйнятливих рослинах, включають в себе крадіжку та скручування стебла, що нагадують структуру "лук -пастуха", а потім овальні ураження з помаранчевими/рожевими спорозійами (додаткові рис. 1).Австралійські приєднання, що несуть LANR1 (83A: 476 та Tanjil) та Anman (Mandelup) гени є помірно стійкими, 0,0331 та 0,0036).Деякі лінії, які також мають "стійкі" LANR1 та/або алелі Анмана, виявляють симптоми захворювання.
Цікаво, що кілька ліній NLL, у яких не вистачає будь-якого «стійкого» алеля маркера, виявив високий рівень резистентності до антракнози (порівнянні або вище, ніж для генотипів LANR1 або Anman), наприклад боргін (P значення <0,0001 для обох параметрів), Bojar (значення P <0,0001 для оцінки та 0,001 для ваги рослини), а також на вагові. Цікаво, що кілька ліній NLL, у яких не вистачає будь-якого «стійкого» алеля маркера, виявив високий рівень резистентності до антракнози (порівнянні або вище, ніж для генотипів LANR1 або Anman), наприклад боргін (P значення <0,0001 для обох параметрів), Bojar (значення P <0,0001 для оцінки та 0,001 для ваги рослини), а також на вагові. Цікаво, що кілька ліній NLL, у яких не вистачає "стійкого" маркера, показали високий рівень стійкості до антракнози (порівнянні з або вище, ніж для генотипів LANR1 або Anman), наприклад боргін (P значення <0,0001 для обох параметрів), Bojar (значення P <0,0001 для оцінки та 0,001 для ваги рослини) та вагови. Цікаво, що деякі системи NLL, які не мають жодних «антигенних» маркерів, виявляють високу горизонтальну стійкість (еквівалентні генам LANR1 або Anman), такими як свердловина (обидва параметри p <0,0001), Bojar (P значення <0,0001, вага рослини 0,001) та штам B-549/79b (P значення <0,0001, не значуща). Нентерисно, вністорує Линіци Нл, Лише-Каки-Пибо Маркерных Аллелеко «ретешойосько», Ти -К. Антакноуу (Сраниме, іли, ви, начень, - це гентипу Ланр1 іли), Тахіе Борегін (зNAче -тися тисячі). ченіе p <0,0001, maSSSAr-rastentia 0,001) та апуляя B-549/79b (Oцenka p-зnачене <00001, maSSSA nезnatеліелі). Цікаво, що деякі лінії NLL, у яких не вистачає будь-яких маркерних алелів «резистентності», показали високий рівень резистентності до антракнози (порівнянні з або вище, ніж LANR1 або Anman Genotypes), наприклад, боргін (P для обох параметрів <0,0001), Bojar (P-value <0,0001, вага рослини 0,001) та ВАСУ B-549/79B (P-ВАЛАЛЬНА ВАЛАЛЬНА 0,001).Це явище говорить про можливість нового генетичного джерела резистентності, пояснюючи спостережувану відсутність кореляції між генотипами маркера та фенотипами хвороби (значення Р від ~ 0,42 до ~ 0,98).Таким чином, тест Колмогоров-Смірнов показав, що дані про резистентність до антракнози були приблизно нормально розподілені для балів (P-значення 0,25 та 0,11) та рослинної маси (Р-значення 0,47 та 0,55), що дозволяє припустити, що я гіпотезую, що більше алеля, ніж LANR1 та Anman.
Виходячи з результатів скринінгу резистентності до антракнози, для аналізу транскриптомів було обрано 4 лінії: 83a: 476, боргін, манделап та популяція 22660. Ці лінії були перепробувані для резистентності до сибірської виразки в експериментах з щепленням шляхом секвенування РНК, за умови, що вони були такими ж, як і в попередньому тесті.Значення балів були такими: Борегін (1,71 ± 1,39), 83A: 476 (2,09 ± 1,38), Mandelup (3,82 ± 1,42) та населення 22660 (6,11 ± 1,29).
Протокол Illumina Novaseq 6000 досяг в середньому 40,5 мд.Оцінки вирівнювання в референтній послідовності коливалися від 75,5% до 88,6%.Середня кореляція даних про кількість зчитування між експериментальними варіантами між біологічними реплік становила від 0,812 до 0,997 (середнє 0,959). З проаналізованих 35 170 генів 2917 не виявив експресії, а інші 4785 генів експресувались на незначному рівні (середнє значення <5). З проаналізованих 35 170 генів 2917 не виявив експресії, а інші 4785 генів експресувались на незначному рівні (середнє значення <5). Iз 35 170 Проаналироовенных Гедов 2917 НЕ ПОРОВАЛЯЛЬНІЙ ЧАСПРЕСИСІВ 4785 ГЕЛАН НАННІВНІВНІВНІВНІВНІВНІВНІВНІВНІВНІВНІВНІВНІВНІВНІВАНСІЙНІВАНСІЙНІХО НЕ (Базоое, <5). З аналізованих 35 170 генів 2917 не показали експресії, а решта 4785 генів експресувались на незначному рівні (середнє значення <5).在 分析 的 35,170 个 基因 中 ， 2917 个 没有 表达 ， 其他 4785 个 基因 表达 可以 忽略不计 （基本 平均值 <5）。。。。。。。35 170 35 170 Проаналироовенныхм 2917 НЕ НЕСПРЕСИСРОВАЛІСЯ, АСТАЛЬНЕТ 4785 р. Ендее внасе <5). З аналізованих 35 170 генів 2917 не експресувались, а решта 4785 генів мали незначну експресію (середнє значення основи <5).Таким чином, кількість виражених генів (середнє значення ≥ 5) під час експерименту становила 27 468 (78,1%) (додаткова таблиця S4).
З першого моменту часу всі лінії NLL відповіли на щеплення C. lupini (штам Col-08) шляхом перепрограмування транскриптом (табл. 1), однак значні відмінності спостерігалися між лініями.Таким чином, лінія резистентності 83a: 476 (перенесення гена LANR1) показала значне перепрограмування транскрипту в перший момент часу (6 HPI) із збільшенням кількості ізольованих та вниз поколінь в 31-69 разів порівняно з іншими часовими моментами в цей час.Крім того, цей пік був короткочасним, оскільки експресія лише декількох генів залишалася значно зміненою у другий момент (12 HPI).Цікаво, що боргін, який також показав високий рівень резистентності в тесті на трансплантат, не зазнав такого масивного перепрограмування транскрипції під час експерименту.Однак кількість диференційно експресованих генів (DEG) була однаковою для свердловини та 83А: 476 при 12 HPI.І Mandelup, і населення 22660 показали вершини DEG в останній момент часу (48 л/с), що вказує на відносну затримку оборонних відповідей.
Оскільки 83А: 476 пройшов масивне перепрограмування транскрипту у відповідь на C. lupini при 6 HPI порівняно з усіма іншими лініями, ~ 91% DEG, що спостерігаються в цей момент часу, були специфічними для лінії (рис. 1).Однак у ранніх реакціях між досліджуваними лініями було певне перекриття, як 68,5%, 50,9%та 52,6%град в галузі свердловини, Манделап та населення 22660 відповідно, перекриваючись з тими, що були виявлені у 83A: 476 у певні моменти часу.Однак ці DEG становили лише невелику частку (0,97–1,70%) усіх DEG, які зараз виявлені за допомогою 83A: 476.Крім того, 11 градусів від усіх ліній були узгодженими в цей час (додаткові таблиці S4-S6), включаючи загальні компоненти реакцій захисту рослин: білок перенесення ліпідів (Tanjilg_32225), ендоглюкан-1,3-β-глюкозид ферменту (Tanjilg_23384), два білки, що не мають стресу. (Також було відносно високе перекриття у відповідях транскрипту між 83A: 476 та боргіном при 24 ГПІ (загалом 16-38% градусів) та між Манделупом та популяцією 22660 при 48 HPI (загалом 14-20% градусів).
Діаграма Венна, що показує кількість диференційно експресованих генів (DEG) у лініях з вузькословованим люпіном (NLL), прищепленими котетотрихумом lupini (штам Col-08, отриманий з люпінових полів у Вірженісі, Польща, 1999).Проаналізовані лінії NLL були: 83a: 476 (стійкі, несучи алель LANR1), боргін (стійкий, генетичний фон невідомі), Mandelup (помірно стійкий, несучи алель Anman) та популяцію 22660 (дуже сприйнятливий).Скорочення HPI стоїть годинами після вакцинації.Нульові значення були видалені для спрощення графіка.
Набір надмірно виражених генів при 6 HPI аналізували на наявність канонічних доменів генів R (додаткова таблиця S7).Це дослідження виявило індукцію транскриптомів класичних генів резистентності захворювань з доменами NBS-LRR лише при 83а: 476.Усі ці гени мають канонічні домени, розташовані в збережених послідовностях.На додаток до генів домену NBS-LRR, було активовано кілька кіназ RLL на 6 HPI, а саме в бурегіні (Tanjilg_19877), два в Mandelup (Tanjilg_07141 та Tanjilg_19877) та в популяції 22660 (Tanjilg_09014 та Tanjilg_10361) та 43.
Гени зі значно зміненою експресією у відповідь на щеплення з C. lupini (штам Col-08) піддавались аналізу генної онтології (GO) (додаткова таблиця S8). Найчастіше завищеним представленим терміном біологічного процесу був "GO: 0006952 захисна реакція", яка з'явилася у 6 з 16 (час × лінійка) комбінацій з великою значущою (р. <0,001) (рис. 2). Найчастіше завищеним представленим терміном біологічного процесу був "GO: 0006952 захисна реакція", яка з'явилася у 6 з 16 (час × лінійка) комбінацій з великою значущою (р. <0,001) (рис. 2). Nаіболее чАасто чRезMErnOpprе -дитявленнымм Термонім, Байлогісешкоггугешеса Бкул «йти: 0006952 р. yз 16 (vrемя × lїнія) combynaцiйs vыsokoй зnaчimostnyю (зnаченіе p <0,001) (р. 2). Найчастіше завищеним представленим терміном біологічного процесу був "Go: 0006952 захисна реакція", яка з'явилася в 6 з 16 (час × лінійка) комбінацій з великою значущою (р. <0,001) (рис. 2).最 常 被 过度 代表 的 生物 过程 术语 是 是 ”” go: 0006952 防御 反应 ”， 它 出现 在 在 个 （时间 × 线） 组合 的 的 6 个 中 ， 高 显着性 （p 值 <0,001） （图）。。。。。。。。。。。。。。。 Найбільш репрезентативним терміном біологічного процесу є "GO: 0006952 Відповідь на захист", яка з’являється у 6 з 16 (时间 × 线) комбінацій, що мають велике значення (р -значення <0,001) (图 2). Нахабелее, аро -ретехерно Предшленденным Т. Т. yй (vrемя × vlynia) Сокой зnачоустя (зnаченіе p <0,001) (riS. 2). Найчастіше завищеним представленим терміном біологічного процесу був "Go: 0006952 захисна реакція", яка з'явилася у 6 з 16 комбінацій (час × лінія) з великою значущістю (р. <0,001) (рис. 2).Цей термін був надмірно представлений у два часові моменти у 83A: 476 та боргін (6 та 24 HPI), а в один момент часу в Мандіепі та популяції 22660 (12 та 6 HPI відповідно).Це очікуваний результат, що підкреслює протигрибкову реакцію стійких ліній.Крім того, 83А: 476 відповів на C. lupini, швидко індукуючи гени, пов'язані з окислювальним вибухом, представленим терміном "GO: 0055114 окислювально -відновлювального процесу", що вказує на конкретну оборонну відповідь, тоді як Борегін розкрив конкретні відповіді на захист, пов'язані з терміном "Go".: 0006950 Відповідь на стрес ”.Населення 22660 активізували реагування на горизонтальну резистентність, пов’язану з вторинними метаболітами, підкреслюючи надмірну кількість термінів "Іди: 0016104 Процес біосинтезу тритерпену" та "GO: 0006722 Процес метаболізму тритерпену" (обидва терміни належать до того ж набору генів), враховуючи результати проходження строків, що інплотують, додавання, що не є реагуванням на населення, індикатора Рання реакція 83а: 476 (6 HPI) та затримка реакції Mandelup та населення 22660 включають термін: 0015979 «фотосинтез» та інші біологічні процеси.
Терміни онтології гена біопроцесу, відібрані в анотації диференційно експресованих генів під час реакцій транскрипту вузькословиваного люпину (NLL), прищепленого люпіном сибірської виразки (штам COL-08, отриманого з люпінових полів у Вірцженіце, Польща, у 1999 р.) Значно перебільшені.Проаналізовані лінії NLL були: 83a: 476 (стійкі, носіння гомозиготного алеля LANR1), боргін (стійкий, невідомий генетичний фон), Mandelup (помірно стійкий, несучи гомозиготний алель Anman) та популяцію 22660 (сприйнятливі).
Оскільки це дослідження мало на меті виявити гени, що сприяють резистентності до антракнози, гени, присвоєні термінам, йдуть: "go: 0006952 оборонні відповіді" та "GO: 0055114 окислювально-відновлювальні процеси" були проаналізовані з відсічками, оскільки базові засоби ≥ 30 принаймні з однією лінією.× точка часу, поєднуючи статистично значущі значення log2 (зміна складки).Кількість генів, що відповідають цим критеріям, становила 65 для GO: 0006952 та 524 для GO: 0055114.
83a: 476 виявив два вершини градусів, анотовані з терміном: 0006952, першими в 6 генах на дюйм (64 генів, регулювання вгору і вниз) та другий при 24 генах на дюйм (15 генів, лише регулювання вгору).Борегін також показав, що GO: 0006952 досягав максимуму в той же момент часу, але з меншим DEG (11 і 8) та пільговою активацією.Mandeloop показав два піки GO: 0006952 при 12 та 48 HPI, обидва несуть 12 генів (перші з активаційними генами, а другий лише з супресивними генами), тоді як популяція 22660 при 6 HPI (13 генів) мала більшу перевагу підвищення піку.регулювання.Слід зазначити, що 96,4% GO: 0006952 град на ці піки мав однаковий тип відповіді (вгору або вниз), що свідчить про значне перекриття оборонних реакцій, незважаючи на відмінності в кількості залучених генів.Найбільша група послідовностей, пов’язаних із терміном GO: 0006952 кодує білок 22, пов'язаний з голодуванням (SAM22-подібний), який належить до білка, пов'язаного з патогенезом класу 10 (PR-10) білкового кладу та основного білка латексу.Аналогічний (MLP-подібний) білок) білок (рис. 3).Дві групи відрізнялися за характером вираження та напрямком відповіді.Гени, що кодують SAM22-подібні білки, показали послідовну та значну індукцію в ранні моменти часу (6 або 12 HPI) і, як правило, не відповідали в кінці експерименту (48 HPI), тоді як білки, подібні до MLP, показали координацію при 6 hpi.HPI.83a: 476 та Mandelup при 48 к.с./дюйма, майже всі інші точки даних були невідповідними.Крім того, відмінності в профілях експресії генів, подібних до SAM22, супроводжували спостережувану мінливість резистентності до антракнози, оскільки більш стійкі лінії мали більше моментів часу, що значно індукують ці гени, ніж більш сприйнятливі гени.Ще один ген LLR18A/B PR-10 показав дуже схожу картину експресії з геном білка, подібного до SAM22.
Основні компоненти терміна біологічного процесу "GO: 0006952 Відповідь на захист" та схеми експресії кандидатів генів LANR1 та Anman Alleles.Шкала LOG2 являє собою значення log2 (зміна складки) між прищепленою (Colletotrichum lupini, деформація Col-08, отримана з люпінових полів, Wizhenica, Польща, 1999) та контрольних (інкольованих).Були проаналізовані такі вузькофелі -люпінові лінії: 83a: 476 (стійкий, носіння гомозиготного алеля LANR1), боргін (стійкий, генетичний фон невідомий), мандель (помірно стійкий, несучи гомозиготний алель Anman) та популяцію 22660 (сприйнятлива).
Крім того, оцінювали профілі експресії генів кандидатів RNA-Seq LANR1 (Tanjilg_05042) та Anman (Tanjilg_12861) (рис. 3).Ген Tanjilg_05042 показав значну реакцію (активацію) при 83А: 476 лише в перший момент часу (6 HPI), тоді як Tanjilg_12861 був значущим у Mandeloop лише в два часові моменти: 6 HPI (регулювання вниз) та 24 HPI (6 HPI).З.).регульований)).
Найбільш надмірно вираженими генами в терміні GO: 0055114 «окислювально -відновлювальний процес» - це гени, що кодують білки цитохрому P450 та пероксидаза (рис. 4).Для зразків, виділених з 83A: 476 при 6 HPI, максимальні або мінімальні значення LOG2 (зміна складки) (для 86,6% генів), як правило, спостерігалися між інокульованими та контрольними рослинами, підкреслюючи високу реакцію цього генотипу на інокулюючу стать.83a: 476 показав найважливіший GO: 0055114 град при 6 HPI (503 генів), а решта ліній при 48 HPI (боргін, 31 гени; Mandelup, 85 генів; популяція 22660, 78 генів).У більшості генів GO: 0055114 Сімейство спостерігали два типи відповідей на вакцинацію (активацію та гальмування).Цікаво, що до 97,6% DEG, визначених для терміну GO: 0055114 у Манделепе при 48 к.с. Ці спостереження свідчать про те, що, незважаючи на значно меншу шкалу (тобто кількість мутованих окислювальних генів, 85 проти 503), схема затримки відповіді на транскрипту MANDELOOSУ свердловинах та популяції 22660 ця конвергенція нижча на рівні 51,6% та 75,6% відповідно.
Були виявлені закономірності експресії основних компонентів терміна біологічного процесу "GO: 0055114 окислювально -відновлювального процесу".Шкала LOG2 являє собою значення log2 (зміна складки) між прищепленою (Colletotrichum lupini, деформація Col-08, отримана з люпінових полів, Wizhenica, Польща, 1999) та контрольних (інкольованих).Були проаналізовані такі вузькофелі -люпінові лінії: 83a: 476 (стійкий, носіння гомозиготного алеля LANR1), боргін (стійкий, генетичний фон невідомий), мандель (помірно стійкий, несучи гомозиготний алель Anman) та популяцію 22660 (сприйнятлива).
83a: 476 Транскриптомічні відповіді на щеплення з C. lupini (штам Col-08) також включали скоординоване замовчування генів, віднесених до терміна GO: 0015979 «фотосинтез» та інших супутніх біологічних процесів (рис. 5).Це GO: 0015979 град в місті містили 105 генів, які були значно пригнічені при 6 HPI при 83а: 476.У цьому підмножині 37 генів також були регульовані в Mandelup при 48 HPI та 35 в той же момент часу в популяції 22660, включаючи 19 градусів, загальних для обох генотипів.Жоден DEG, пов'язаний з терміном, GO: 0015979 не було активовано в будь -якій комбінації (час X).
Були виявлені закономірності вираження основних компонентів терміна біологічного процесу «Іди: 0015979 фотосинтез».Шкала LOG2 являє собою значення log2 (зміна складки) між прищепленою (Colletotrichum lupini, деформація Col-08, отримана з люпінових полів, Wizhenica, Польща, 1999) та контрольних (інкольованих).Були проаналізовані такі вузькофелі -люпінові лінії: 83a: 476 (стійкий, носіння гомозиготного алеля LANR1), боргін (стійкий, генетичний фон невідомий), мандель (помірно стійкий, несучи гомозиготний алель Anman) та популяцію 22660 (сприйнятлива).
Виходячи з результатів диференціального аналізу експресії та, імовірно, залучаються до оборонних реакцій проти патогенних грибів, цей набір із семи генів був обраний для кількісної оцінки профілів експресії за допомогою ПЛР у реальному часі (додаткова таблиця S9).
Генний ген білка Tanjilg_10657 був значно індукований у всіх досліджуваних лініях та часових точках порівняно з контрольними (мімічними) рослинами (додаткові таблиці S10, S11).Крім того, профіль експресії Tanjilg_10657 показав зростаючу тенденцію протягом експерименту для всіх ліній.Населення 22660 показала найвищу чутливість Tanjilg_10657 до щеплення з 114-кратною активацією та найвищим відносним рівнем експресії (4,4 ± 0,4) при 24 HPI (рис. 6А).PR10 LLR18A GENE GENE TANJILG_27015 також показав активацію в усіх лініях та часових точках, зі статистичною значимістю в більшості точок даних (рис. 6В).Подібно до Tanjilg_10657, найвищий відносний рівень експресії Tanjilg_27015 спостерігався у прищепленої популяції 2266 при 24 HPI (19,5 ± 2,4).Ген кислоти ендохітінази Tanjilg_04706 був значно регульований у всіх лініях і в усіх моментах часу, за винятком сортів 6 HPI (рис. 6С).Він був сильно індукований в перший момент часу (6 HPI) при 83а: 476 (на 10,5 разів) і помірно збільшувався в інших лініях (на 6,6-7,5 разів).Під час експерименту експресія Tanjilg_04706 залишалася на аналогічних рівнях у 83A: 476 та боргіну, тоді як у Mandelup та популяції 22660 він значно збільшився, досягаючи відносно високих значень (5,9 ± 1,5 та 6,2 ± 1,5 відповідно).Ендоглюкан-1,3-β-глюкозидаза гена Tanjilg_23384 показав високу активацію в перші два часові точки (6 та 12 HPI) у всіх лініях, крім популяції 22660 (рис. 6D).Найвищі відносні рівні експресії Tanjilg_23384 спостерігалися у другий час (12 HPI) у Mandelup (2,7 ± 0,3) та 83A: 476 (1,5 ± 0,1).При 24 HPI експресія Tanjilg_23384 була відносно низькою у всіх досліджуваних лініях (від 0,04 ± 0,009 до 0,44 ± 0,12).
Профілі експресії вибраних генів (Ag), виявлені кількісною ПЛР.Числа 6, 12 та 24 представляють години після вакцинації.Для нормалізації використовували гени LandexH7 та Lantub6, а Lantub6 використовували для калібрування міжсеріалів.Стрибки помилок представляють стандартне відхилення на основі трьох біологічних реплік, кожен з яких є середнім показником трьох технічних реплік. Статистична значення відмінностей у рівнях експресії між прищепленим (Colletotrichum lupini, штамом COL-08, отриманим у 1999 році з поля Люпін у Вірзеніці, Польща) та контрольних (макетних) рослин позначені вище точок даних (*p значення <0,05, ** p значення ≤ 0,01, *** p значення ≤ 0,001). Статистична значення відмінностей у рівнях експресії між прищепленим (Colletotrichum lupini, штамом COL-08, отриманим у 1999 році з поля Люпін у Вірзеніці, Польща) та контрольних (макетних) рослин позначені вище точок даних (*p значення <0,05, ** p значення ≤ 0,01, *** p значення ≤ 0,001). Статіостишоскя зnачіосте Разлици Вруряхкпрешиїм МежДу Ннокуровенннхми (colletotrichum lupini, ш ш ш Я, а -вени, польья) і Ковенронехіми (Льноно, Рьокулірованн) Расемоми 5, ** зNаченіе p ≤ 0,01, *** зNаченіе p ≤ 0,001). Статистично значущі відмінності в рівнях експресії між прищепленим (Colletotrichum lupini, штамом Col-08, отриманим у 1999 році з поля люпіну у Вірженісі, Польща) та контрольних (інкокульованих шамом), що зазначаються вище точок даних (*p значення <0,05, ** p-value ≤ 0,01, *** p-value ≤ 0,001).接种 （colletotrichum lupini ， col-08 株 ， 1999 年 波兰 波兰 波兰 波兰 模拟 模拟）） 植物 之间 水平 差异 统计学 显着性 模拟） 数据点 上方 之间 表达 水平 差异 统计学 显着性 标记 数据点 数据点 上方 （**p 值 <0,05, ** p 值 ≤ 0,01接种 （colletotrichum lupini ， color-08 株 ， 1999 年 波兰 波兰 波兰 波兰 植物 之间 水平 差异 差异 统计学 显着性 对照 （接种 植物 之间 水平 差异 的 显着性 显着性 标记 上方 上方*p 值 <0,05, ** p ≤ 0,01, *** p ≤ 0,001)。 Статистично значущі відмінності в рівнях експресії між прищепленим (Colletotrichum lupini, штамом COL-08, отриманим із полів Люпін у Верценісі, Польща, у 1999 р.) Та контрольних (неокульованих) рослин відзначаються вище точок даних (*p значення <0,05, ** p-value ≤ 0,01, *** p-value ≤ 0,001).Проаналізовані лінії NLL були: 83a: 476 (стійкі, несучи гомозиготний алель LANR1), Mandelup (помірно стійкий, що переносить гомозиготний алель Анмана), свердловини (стійкий, невідомий генетичний фон) та популяцію 22660 (сприйнятливий).
Ген-кандидат ген Tanjilg_05042 у локусі LANR1 показав помітно різну схему експресії з профілів, отриманих з досліджень RNA-Seq (рис. 6е).Значна активація цього гена спостерігалася у Mandelup та популяції 22660 (до 39,7 та 11,7 разів відповідно), що призводить до відносно високих рівнів експресії (до 1,4 ± 0,14 та 7,2 ± 1,3 відповідно).83a: 476 також виявив деяку регуляцію гена Tanjilg_05042 (до 3,8 рази), однак, досягнутий відносні рівні експресії (0,044 ± 0,002) були більш ніж у 30 разів нижчими, ніж у Манделіпа та популяції 22660.Проаналізовано за допомогою QPCR показав значні відмінності в рівнях експресії між генотипами у макетних (контрольних) варіантах, досягаючим 58-кратних різниці між популяціями 22660 та 83A: 476, а також між популяцією 22660 та 22660. Двохратна різниця була досягнута між бордогіном та мандаліною.
Ген кандидата в локусі Anman, Tanjilg_12861, був активований у відповідь на вакцинацію у 83а: 476 та Mandelup, був нейтральним у популяції 22660 і був знижений у свердловини (рис. 6F).Відносна експресія гена Tanjilg_12861 була найвищою у інокульованому 83A: 476 (0,14 ± 0,01).Ген білка теплового шоку 17,4 KDA класу Tanjilg_05080 HSP17.4 показав менші рівні відносної експресії у всіх досліджуваних штамах та часових точках (рис. 6G).Найвищі значення спостерігали при 24 HPI у популяції 2260 (0,14 ± 0,02, що в восьми разів збільшило відповідь на вакцинацію).
Порівняння профілів експресії генів (рис. 7) виявило високу кореляцію між tanjilg_10657 та чотирма іншими генами: tanjilg_27015 (r = 0,89), tanjilg_05080 (r = 0,85), tanjilg_05042 (r = 0,80) та tanjilg_04706 (r = 0,79).Такі результати можуть вказувати на спільну регуляцію цих генів під час оборонних реакцій.Гени Tanjilg_12861 та Tanjilg_23384 показали різні профілі експресії з нижчими значеннями коефіцієнта кореляції Пірсона (від 0,08 до 0,43 та -0,19 до 0,28 відповідно) порівняно з іншими генами.
Кореляції між профілями експресії генів були виявлені за допомогою кількісної ПЛР.Були проаналізовані такі вузькі лінійні лінії люпіну: 83a: 476 (стійкий, носіння гомозиготного алеля LANR1), Манделеп (помірно стійкий, несучи гомозиготний алель Anman), свердловину (стійкий, генетичний фон невідомий) та популяцію 22660 (сприйнятливий).Три часові моменти були розраховані (через 6, 12 та 24 години після щеплення), включаючи прищеплення (Colletotrichum lupini, штам Col-08, отримані з люпінових полів у Вірженіце, Польща, у 1999 р.) Та контрольних (інкокульованих шахрайськими) рослинами.Шкала показує значення коефіцієнта кореляції Пірсона.
На основі даних, отриманих за 6 кінськими силами на дюйм, WGCNA проводили на 9981 градусах, ідентифікованих шляхом порівняння прищеплених та контрольних заводів, щоб зосередити увагу на ранніх відповідях захисту (додаткова таблиця S12).Двадцять два модулі генів (кластери) були виявлені з корельованими (позитивними або негативними) профілями експресії між генотипами та експериментальними варіантами. В середньому рівні експресії генів спускалися в порядку 83a: 476> Mandelup> Борегін> Населення 22660 (в обох варіантах, однак, ця тенденція була сильнішою в контрольних установах). В середньому рівні експресії генів спускалися в порядку 83a: 476> Mandelup> Борегін> Населення 22660 (в обох варіантах, однак, ця тенденція була сильнішою в контрольних установах). Внод, уоровини, Сжавалісьє Вряддке 83а: 476> Мандельп> Борегін> Населення 22660 (Вумоїш, Соляне у Контрольных Растеній). В середньому рівні експресії генів знижувались у порядку 83a: 476> Mandelup> Борегін> Популяція 22660 (в обох варіантах, однак, ця тенденція була сильнішою в контрольних установах).平均 而 言 ， 基因 表达 水平 按 83a: 476> mandelup> боргін> населення 22660 的 顺序 下降 然而 ， 在 两 种 变体 中 ， 这 趋势 在 植物 中 中 强）。。。 在 植物 更 强）。。。。。。。平均 而 言 ，. С. Не в Кнонтрольных Растеневі). В середньому рівні експресії генів знижувались у серії 83a: 476> Mandelup> Борегін> Популяція 22660 (однак, в обох варіантах ця тенденція була сильнішою в контрольних установах).Вакцинація призвела до регуляції експресії генів, особливо в модулях 18, 19, 14, 6 та 1 (у порядку низхідного порядку), негативного регуляції (наприклад, модулями 9 та 20) або з нейтральними ефектами (наприклад, модулями 11, 22, 8 та 13).Аналіз збагачення терміну (додаткова таблиця S13) виявив "GO: 0006952 захисні відповіді" для прищепленого модуля (18) з максимальною активацією, включаючи гени, проаналізовані QPCR (Tanjilg_04706, Tanjilg_23384, Tanjilg_10657 та Tanjilg_27015). .Концентратор модуля 18 (рис. 8) був ідентифікований як ген Tanjilg_26536, що кодує білок LLR18B, схожий на PR-10, і концентратор модуля 9 був ідентифікований як ген Tanjilg_28955, що кодує білок PSBQ PSBQ II.Ген резистентності до антракнози кандидата LANR1, Tanjilg_05042, був знайдений у модулі 22 (рис. 9) і пов'язаний з термінами "GO: 0044260 Клітинний макромолекулярний метаболічний процес" та "go: 0006355 Транскрипційна регуляція, шаблонування ДНК", що перевозить Tanjilg_0121212 HUB.Ген кодує фактор транскрипції теплового стресу A-4A (HSFA4A).
Зважений мережевий аналіз спільної експресії генів модулів з надмірно представленими термінами біологічного процесу "Іди: 0006952 відповіді на захист".Лігацію було спрощено, щоб виділити чотири гени, проаналізовані QPCR (Tanjilg_04706, Tanjilg_23384, Tanjilg_10657 та Tanjilg_27015).
Зважений мережевий аналіз спільної експресії гена модуля з надмірно представленим терміном біологічного процесу «Іди: 0006355: регулювання транскрипції, шаблон ДНК» та перенесення кандидата гена резистентності до антракнози LANR1 TANJILG_05042.Лігацію спрощували для ізоляції гена Tanjilg_05042 та центрального гена Tanjilg_01212.
Скринінг резистентності до антракнози, зібраний в Австралії, показав, що більшість сортів раннього випуску були сприйнятливими;Калія, Коромуп та Манделап були описані як помірно стійкі, тоді як Вонга, Танжил та 83а: 476 були описані як високостійкі26,27,31.мав однаковий алель опору, позначений LANR1, а Coromup і Mandelup мали інший алель, призначений Anman10, 26, 39, а Калі передавала інший алель., Lanr2.Скринінг на резистентність антракнози в Німеччині призвів до ідентифікації стійкої лінії BO7212 з алелем -кандидатом, крім LANR1, призначеним Lanrbo36.
Наше дослідження виявило дуже низьку частоту (близько 6%) алеля LANR1 у випробуваній зародері.Це спостереження узгоджується з результатами скринінгу східноєвропейської зародкової плазми за допомогою маркерів ANSEQ3 та ANSEQ4, які показали, що алель LANR1 присутній лише у двох білоруських лініях.Це говорить про те, що алель LANR1 ще не широко використовується місцевими програмами розведення, на відміну від Австралії, де це один із ключових алелів для розведення, що сприяє маркерам.Це може бути пов’язано з нижчим рівнем стійкості, що надається алелем LANR1 в європейських польових умовах порівняно з австралійським звітом.Крім того, дослідження антракнози у районах високих опадів Австралії показали, що реакції на резистентність, опосередковані алелем LANR1, можуть бути не ефективними у погодних умовах, що сприяють зростанню та швидкому розвитку патогену19,42.Насправді, у цьому дослідженні деякі симптоми антракнози спостерігалися також у генотипах, що несуть алель LANR1, що дозволяє припустити, що резистентність може зникнути в оптимальних умовах для розвитку C. lupini.Крім того, помилкові позитивні інтерпретації наявності маркерів ANSEQ3 та ANSEQ4, які знаходяться приблизно на 1 см від локусу LANR1, можливі 28,30,43.
Наше дослідження показало, що 83А: 476, що перевозив алель LANR1, відповів на прищеплену C. lupini з масштабним перепрограмуванням транскрипту в перший проаналізований момент часу (6 HPI), тоді як у Mandelup, що перевозили алель anman, стенограми спостерігалися значно пізніше.(від 24 до 48 к.с.).Ці тимчасові зміни в оборонних реакціях пов'язані з відмінностями в симптомах захворювання, підкреслюючи важливість раннього розпізнавання патогенів для успішної реакції на резистентність.Щоб заражати рослинну тканину, спори сибірської виразки повинні пройти кілька етапів розвитку на поверхні господаря, включаючи проростання, поділ клітин та формування схвалення.Придаток - це інфекційна структура, яка кріпиться до поверхні господаря і полегшує проникнення в тканини господаря.Таким чином, спори C. gloeosporioides в екстракті гороху показали перший поділ ядра через 75-90 хвилин інкубації, утворення зародкової трубки через 90-120 хвилин та придушення через 4 години 45.Mango C. Gloeosporioides показали понад 40% проростання конідіалу через 3 години інкубації та близько 20% утворення апресів через 4 години.Ген CAP20, пов'язаний з вірулентністю, C. gloeosporioides демонстрував транскрипційну активність у конідіях, що утворюють епіфіт, після 3,5 год інкубації у поверхневому воску авокадо з високими концентраціями білка CAP20 через 4 год 46 хв.Аналогічно, активність генів біосинтезу меланіну в C. trifolii була індукована під час 2-годинної інкубації з подальшим утворенням схеми через 1 годину.Дослідження листяних тканин показали, що полуниця, прищеплена C. acutatum, перше придушує при 8 hpi, тоді як помідори, прищеплені C. coccodes, перше пригнічують при 4 hpi48,49.значною мірою узгоджується з часовою шкалою Colletotrichum spp.Інфекційний процес.Швидкі відповіді на захист до 83A: 476 пропонує залучення стійкості до рослин та генів імунітету (ETI) у цій лінії, тоді як затримка відповідей Манделап підтримує мікро-асоційовану молекулярну схему імунітету (MTI) 50. Ранні відповіді на 83A: 476 та мантела.Часткове перекриття між генами, регульованими вгору або вниз у затримці реакції, також підтримує цю концепцію, оскільки ETI часто вважається прискореною та посиленою реакцією MTI, яка завершується запрограмованою загибеллю клітин на місці інфекції, відомої як анафілактичний шок 51,52.
Більшість генів, пов’язаних із надмірно представленим терміном, онтологія генів GO: 0006952 "захисна реакція"-це 11 гомологів білка, спричиненого стресом, 22 білка (подібно до SAM22) та семи основних латексних білків (MLP).-То, як білки 31, 34, 43 та 423 показали подібність послідовності.Сам22-подібні гени показали значну активацію, яка тривала довше, демонструючи підвищений рівень резистентності до антракнози (83a: 476 та боргін).Однак гени, що нагадують MLP, були знижені лише в лініях, що несуть алель опору кандидата (83a: 476/lanr1 при 6 hpi та mandelup/anman при 24 hpi).Слід зазначити, що всі ідентифіковані гомологи, подібні до SAM22, походять з генного кластера, що охоплює приблизно 105 кб, тоді як гени, подібні до MLP, походять з окремих областей геному.Координована активація таких генів, подібних до SAM22, також була виявлена ​​в нашому попередньому дослідженні резистентності NLL до прищеплення діортетоксики, що дозволяє припустити, що вони беруть участь у горизонтальних компонентах оборонної реакції.Цей висновок також підтверджується повідомленнями про позитивну реакцію генів, подібних до SAM22, на травму або лікування саліциловою кислотою, індукторами грибів або перекисом водню.
Показано, що гени, подібні до MLP, реагують на різні абіотичні та біотичні стреси, включаючи бактеріальні, вірусні та патогенні грибкові інфекції у багатьох видів рослин55.Вказівки реакції на певні взаємодії між рослинами та патогенами варіювались від сильно збільшення (тобто під час зараження бавовни з вертицилієм Далій) до значного зменшення (тобто після зараження яблуні з Alternaria spp.) 56,57.Значна зниження регуляції MLP-подібного гена 423 спостерігається під час захисту авокадо до інфекції F. niger та під час зараження яблучного дерева Botryospheria berengeriana f.cn.Piricola та Alternaria alternata - це патотипи Apple58,59.Крім того, Apple Calli надмірно експресує MLP-подібний ген 423, мала нижчу експресію генів, пов'язаних з резистентністю, і був більш сприйнятливим до грибкової інфекції59.Після Fusarium oxysporum F, ген 423, що нагадує MLP, також був пригнічений у стійкій загальній зародку квасолі.cn.Інфекція квасолі 60.
Іншими членами сімейства PR-10, ідентифікованих у нашому дослідженні RNA-SEQ, були гени LLR18A та LLR18B у відповідь на регуляцію, а також регульований (1 ген) або знижений (3 гени) гена для білка перенесення ліпідів DIR1..Крім того, WGCNA підкреслює ген LLR18B як центр у цьому модулі, який дуже сприйнятливий до вакцинації та несе кілька генів захисної реакції.Гени LLR18A та LLR18B індуковані в жовті листя люпіну у відповідь на патогенні бактерії, а також у стеблах NLL після D. Токсична щеплення, в той час як гомолог рису цих генів, rsospr10, швидко індукується грибковою інфекцією, передбачуваною, передбачуваною гениною проводом 53,61, 62. необхідні для початку системного набутого опору (SAR).З розвитком захисних реакцій білок DIR1 транспортується з фокусу інфекції через флоему, щоб індукувати SAR у віддалених органах.Цікаво, що ген TANJILG_02313 DIR1 був значно індукований в перший момент часу в рядках 84A: 476 та популяції 22660, але резистентність до антракнози успішно розвинулася лише в рядку 84a: 476.Це може вказувати на деяку субфункціоналізацію гена DIR1 в NLL, оскільки решта трьох гомологів реагували на щеплення лише в лінії 83A: 476 при 6 HPI, і ця відповідь була спрямована вниз.
У нашому дослідженні найпоширенішими компонентами, що відповідають біологічним процесом, що називається "GO: 0055114 окислювально-відновлювального процесу", були цитохром білка P450, пероксидаза, лінолевої кислоти 9S-/13S-ліпоксигенази та 1-аміноциклопропан-1-карбонової кислоти.Крім того, наша WGCNA визначає гомолог HSFA4A як концентратор, що перевозить модулі, такі як кандидат гена резистентності LANR1 Tanjilg_05042.HSFA4A є компонентом окислювально-залежної регуляції ядерної транскрипції у рослин.
Білки P450 P450-це оксидоредуктази, які каталізують реакції гідроксилювання NADPH та/або O2 в первинному та вторинному метаболізм, включаючи метаболізм ксенобіотиків, а також гормонів, жирних кислот, стеролів, компоненти клітин, в індустрії, в індукції Plitemome Plantibley, в умовах біосинтезу Pritective 69. Зниження від -10,6 LOG2 (зміна складки) до 5,7 через велику кількість змінених гомологів (37) та відмінності у моделях відповідей між специфічними генами, що відображає перегляд вгору..Використання лише даних RNA-SEQ для з'ясування передбачуваної біологічної функції генів NLL у такій великій надсімействі білка було б дуже спекулятивним.Однак варто зазначити, що деякі гени цитохрому p450 пов'язані з підвищеною стійкістю до патогенних грибів або бактерій, включаючи внесок у алергічні реакції 69,70,71.
Пероксидази класу III - це багатофункціональні рослинні ферменти, що беруть участь у широкому діапазоні метаболічних процесів під час росту та розвитку рослин, а також у відповідь на навколишнє середовище, такі як солоність, посуха, висока інтенсивність світла та атака патогенів72.Пероксидази беруть участь у взаємодії декількох видів рослин з антрацисом, включаючи Stylosanthes humilis та C. gloeosporioides, Lens Culinaris та C. truncatum, Phaseolus vulgaris та C. lindemuthianum, Cucumis sativus та C. lagenarium73,74,75,76.Відповідь дуже швидка, іноді навіть при 4 HPI, перш ніж грибок проникає в тканину рослини73.Ген пероксидази також реагував на прищеплення D. toxica nll.На додаток до їх типових функцій для регулювання окислювального вибуху або усунення окислювального стресу, пероксидази можуть перешкоджати росту патогенів, створюючи фізичні бар'єри на основі арматури клітинної стінки під час лігніфікації, субодиниці або зшивання конкретних сполук.Цю функцію можна віднести в силіконі з геном tanjilg_03329, що кодує передбачувану пероксидазу, що утворює лігнін, який був значно регульований у нашому дослідженні в 83A: 476 стійкій лінії на 6 hpi, але не в інших штамах та часових моментах, які не реагували.
9S-/13S-Ліпоксигеназа лінолевої кислоти-це перший етап окислювального шляху ліпідного біосинтезу78.Продукти цього шляху мають декілька функцій у захисті рослин, включаючи зміцнення клітинних стінок за рахунок утворення калози та пектинового відкладення, а також регулювання окисного стресу через вироблення реактивних видів кисню 79,80,81,82,83.У цьому дослідженні експресія лінолевої кислоти 9S-/13S-ліпоксигенази була змінена у всіх штамах, але у сприйнятливої ​​популяції 22660 рр. Рудівка переважала в різні моменти часу, тоді як у штамів, що переносять стійкий LANR1 та алель anman, він наголошує на диверсифікації оксилюпінського шару в захисних антаніях між цими генотиками.
Гомолог 1-аміноциклопропан-1-карбоксилат оксидаза (АКО) значно регулювався (9 генів) або знизив (2 гени) при інокульованому люпіні.За двома винятками, всі ці відповіді відбулися при 6 к.с.в 83а: 476.Ферментативна реакція, опосередкована білками АКО, є етапом, що обмежує швидкість у виробництві етилену, і тому є високорегульованим84.Етилен - це рослинний гормон, який відіграє різноманітні ролі в регулюванні розвитку рослин та реакції на абіотичні та біотичні стресові умови.Індукція транскрипції ACO та активація сигнального шляху етилену беруть участь у підвищенні резистентності рису до гемібіотрофного гриба Oryzae Oryzae, регулюючи вироблення реактивних видів кисню та фітокелексинів.Дуже схожий процес інфекції листя, виявлений між М. Орізе та К. Лупіні88,89, на тлі значної регуляції гомологів АКО в лінії 83A: 476, повідомленого в цьому дослідженні, зміщує можливість надання стійкості до NLL -антракнози -етилену сигналізації центрального кроку в молекулярних шляхах.
У цьому дослідженні масштабне придушення багатьох генів, пов'язаних з фотосинтезом, спостерігалось у 6 HPI у 83A: 476 та при 48 HPI в Манделіпі та популяції 22660.Ступінь та прогресування цих змін пропорційні рівню.У цьому експерименті спостерігали резистентність антракнози.Нещодавно про сильні та ранні репресії стенограм, пов'язаних з фотосинтезом, повідомлялося в декількох моделях взаємодії рослин-патогенів, включаючи патогенні бактерії та гриби.Поспіх (від 2 HPI в деяких взаємодіях) та глобальне придушення генів, пов'язаних з фотосинтезом у відповідь на інфекцію, можуть викликати імунітет рослин на основі розгортання реактивних видів кисню та їх взаємодії з шляхом саліцилової кислоти для опосередкування алергічних реакцій 90,94.
На закінчення, механізми захисту, запропоновані для найбільш стійкого родового роду (83a: 476), включають швидке розпізнавання патогенів за геном R (імовірно, TIR-NBS-LRR Tanjilg_05042) та алергічною реакцією, опосередкованою саліциловою кислотою та етиленом, з подальшим встановленням тривалої діапазону SAR.Дія підтримується білком DIR-1.Слід зазначити, що біотрофний період для інфекції C. lupini дуже короткий (приблизно 2 дні), а потім некротичний ріст95.Перехід між цими стадіями може бути пов'язаний з некрозом та експресією білків, що індукують етилен, які діють як запускається для реакцій гіперчутливості у рослин господаря.Тому часове вікно для успішного захоплення C. lupini на біотрофічній стадії дуже вузьке.Перепрограмування генів, пов'язаних з окислювально -відновлювальним та фотосинтезом, що спостерігається у 83а: 476 при 6 HPI, відповідає прогресуванню грибкових гіф та віщує розвиток успішної захисної реакції на біотрофічній стадії.Транскриптомічні відповіді Mandelup та популяції 22660 можуть бути занадто затриманими, щоб захопити гриб перед переходом на некротичний ріст
ETI, керований канонічним геном R, здається, є загальним механізмом стійкості до квасолі до антракнози.Таким чином, у моделі бобова Medicago Truncatula резистентність до антракнози надається геном RCT1, членом класу гена рослини TIR-NBS-LRR97 R.Цей ген також надає резистентність антракнози широкого спектру дії в люцерни при переносах на сприйнятливі рослини.У загальній квасолі (P. vulgaris) на сьогодні було виявлено більше двох десятків генів резистентності антракнози.Деякі з цих генів знаходяться в регіонах, у яких не вистачає будь-яких канонічних генів R, однак багато інших розташовані на краях хромосом, що несуть кластер генів NBS-LRR, включаючи TIR-NBS-LRRS99.Дослідження SSR, що знаходиться в геномі, також підтвердило асоціацію гена NBS-LRR з резистентністю до антракнози у загальній квасолі.Канонічний ген R був виявлений також у геномній області, що несе основні локус резистентності до антракнози в білому люпіні 101.
Наша робота показує, що реакція негайної резистентності, активована на ранній стадії рослинної інфекції (бажано, не пізніше 12 HPI), ефективно захищає вузькорічний люпін від антракнози, спричиненого патогенним грибком колелотріхуму.Використовуючи секвенування високої пропускної здатності, ми продемонстрували диференціальні профілі експресії генів резистентності до антракнози у рослинах NLL, опосередкованих генами резистентності LANR1 та Anman.Успішна оборона передбачає ретельно розробку генів для білків, що беруть участь у окислювально -відновлювальному, фотосинтезі та патогенезі протягом декількох годин після першого контакту рослини з збудником.Подібні захисні реакції, але затримка часу, набагато менш ефективні у захисті рослин від захворювань.Резистентність до сибірської виразки, опосередкована геном LANR1, нагадує типову швидку реакцію гена R (імунітет, спричинений ефекторами), тоді як ген Anman, швидше за все, забезпечує горизонтальну реакцію (імунітет, спрацьований за допомогою молекулярної картини, пов'язаної з мікробами), забезпечуючи помірний рівень стійкості.
Лінії 215 NLL, що використовуються для екранізації маркерів антракнози, складалися з 74 сортів, 60 ліній, отриманих шляхом переходу або розведення, 5 мутантів та 76 диких або оригінальних зародків.Лінії надходили з 17 країн, головним чином з Польщі (58), Іспанії (47), Німеччини (27), Австралії (26), Росії (19), Білорусі (7), Італії (5) та інших ліній.з 10 країн.Набір також включає референтні стійкі лінії: 83a: 476, Танджіл, Вонга, що несе алель LANR1, і Mandelup, що несе алель Анмана.Лінії були отримані з європейської бази даних генетичних ресурсів люпіну, що підтримується Poznań Plant Serving Ltd., Wiatrowo, Польща (додаткова таблиця S1).
Рослини вирощували в контрольованих умовах (фотоперіод 16 годин, температура 25 ° С протягом дня та 18 ° С вночі).Були проаналізовані два біологічні репліки.ДНК виділяли з три тижневого листя, використовуючи міні -комплект Dneasy рослин (Qiagen, Hilden, Німеччина) згідно з протоколом.Якість та концентрацію ізольованої ДНК оцінювали за допомогою спектрофотометричних методів (Nanodrop 2000; Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, США).Маркер Anmanm1, що позначає ген резистентності антракнози Anman (отриманий від CV. Mandelup) та маркерами Anseq3 та Anseq4, що фланкують ген Lanr1 (похідні від CV. Tanjil) були проаналізовані 11,26,28.Гомозиготи для стійкого алеля були оцінені як "1 ″, сприйнятливі - як" 0 ″ та гетерозиготи - як 0,5.
На основі результатів скринінгу для маркерів Anmanm1, Anseq3 та Anseq4 та наявності насіння для остаточних експериментів з подальшим спостереженням було обрано 50 ліній NLL для фенотипування стійкості до антракнози.Аналіз проводили у двох примірниках у теплиці, керованому комп’ютером, з 14 -годинним фотоперіодом з температурним діапазоном 22 ° C протягом дня та 19 ° С вночі.Насіння подряпано (відрізання насіннєвого покриття на протилежній стороні ембріона гострим лезом) перед посівом, щоб запобігти спокою насіння через те, що насіннєве покриття було занадто жорстким і для забезпечення рівномірного проростання.Рослини вирощували в горщиках (11 × 11 × 21 см) зі стерильним ґрунтом (TS-1 Rec 085 Sedmer Basic, Klasmann-Deilmann Polska, Warsaw, Польща).Інокуляцію проводили за допомогою штаму Colletotrichum lupini Col-08, вирощеним у 1999 році зі стебла вузькословиваних люпінових рослин, вирощених у полі у Верженіці, Велика Польща (52 ° 27 ′ 42 ″ N 17 ° 04 ′ 05 ″ е).Отримати територію.Ізоляти культивували в середовищі SNA при 20 ° С. під чорним світлом протягом 21 дня для індукції споруляції.Через чотири тижні після посіву, коли рослини досягли стадії 4-6 листя, щеплення проводили шляхом обприскування призупиненні конідій у концентрації 0,5 х 106 конідій на мл.Після щеплення рослини зберігали в темряві протягом 24 годин при вологості близько 98% та температурою 25 ° С для полегшення проростання конідій та процесу зараження.Потім рослини вирощували під 14-годинний фотоперіод за 22 ° С/19 ° С вночі та 70% вологості.Оцінка захворювання була зроблена через 22 дні після щеплення і становила від 0 (імунітет) до 9 (дуже сприйнятливий) залежно від наявності або відсутності некротичних уражень на стеблах та листях.Крім того, після оцінки вимірювали вагу рослин.Взаємозв'язки між генотипами маркера та фенотипами захворювання розраховувались як кореляції двох послідовностей (відсутність гетерозиготних маркерів у наборі ліній для аналізу фенотипу резистентності антракнози).