Дякуємо, що відвідали Nature.com.Версія браузера, яку ви використовуєте, має обмежену підтримку CSS.Для найкращої роботи радимо використовувати оновлений браузер (або вимкнути режим сумісності в Internet Explorer).Тим часом, щоб забезпечити постійну підтримку, ми відтворюємо сайт без стилів і JavaScript.
Існує потреба у надійній системі in vitro, яка може точно відтворити фізіологічне середовище серця для тестування на наркотики.Обмежена доступність систем культури тканин серця людини призвела до неточних інтерпретацій ефектів серцевих препаратів.Тут ми розробили модель культури серцевої тканини (CTCM), яка електромеханічно стимулює шматочки серця і зазнає фізіологічного розтягування під час систолічних та діастолічних фаз серцевого циклу.Після 12 днів культури цей підхід частково покращив життєздатність серця, але не повністю зберіг їх структурну цілісність.Тому після скринінгу невеликої молекули ми виявили, що додавання 100 нм трийодотироніну (Т3) та 1 мкМ дексаметазон (DEX) до нашого середовища підтримував мікроструктуру секцій протягом 12 днів.У поєднанні з лікуванням T3/DEX система CTCM підтримувала транскрипційні профілі, життєздатність, метаболічну активність та структурну цілісність на тому ж рівні, що і тканина свіжої серця протягом 12 днів.Крім того, надмірне розтягнення серцевої тканини в культурі викликає гіпертрофічну серцеву сигналізацію, що свідчить про здатність КТКМ імітувати гіпертрофічні умови, спричинені розтягуванням серця.На закінчення, CTCM може моделювати фізіологію та патофізіологію серця в культурі протягом тривалих періодів часу, що дозволяє надійним скринінгу наркотиків.
До клінічних досліджень потрібні надійні системи in vitro, які можуть точно відтворити фізіологічне середовище людського серця.Такі системи повинні імітувати змінену механічну розтяжку, частоту серцевих скорочень та електрофізіологічні властивості.Моделі тварин зазвичай використовуються як скринінг -платформа для серцевої фізіології з обмеженою надійністю у відображенні наслідків наркотиків у людському серці1,2.Зрештою, ідеальна експериментальна модель культури серцевої тканини (CTCM) - це модель, яка є дуже чутливою та специфічною для різних терапевтичних та фармакологічних втручань, точно відтворюючи фізіологію та патофізіологію людського серця3.Відсутність такої системи обмежує виявлення нових методів лікування серцевої недостатності4,5 і призвела до кардіотоксичності наркотиків як основної причини виходу на ринок6.
Протягом останнього десятиліття вісім некарді судинних препаратів були вилучені з клінічного використання, оскільки вони викликають продовження інтервалу QT, що призводить до аритмії шлуночків та раптової смерті7.Таким чином, зростає потреба у надійних стратегіях доклінічного скринінгу для оцінки серцево -судинної ефективності та токсичності.Нещодавнє використання індукованих людиною плюрипотентними стовбуровими клітинами кардіоміоцитів (стегна-СМ) при скринінгу наркотиків та тестування токсичності забезпечує часткове рішення цієї проблеми.Однак незрілий характер стегна-СМ та відсутність багатоклітинної складності серцевої тканини є основними обмеженнями цього методу.Останні дослідження показали, що це обмеження можна частково подолати, використовуючи ранні стегна-CM для утворення гідрогелів серцевої тканини незабаром після початку спонтанних скорочень та поступово збільшуючи електричну стимуляцію з часом.Однак у цих мікротісах HIPS-CM не вистачає зрілих електрофізіологічних та скорочувальних властивостей міокарда дорослих.Крім того, серцева тканина людини має більш складну структуру, що складається з гетерогенної суміші різних типів клітин, включаючи ендотеліальні клітини, нейрони та стромальні фібробласти, взаємопов'язані конкретними наборами білків позаклітинного матриксу.Ця неоднорідність популяцій некардіоміоцитів11,12,13 у серці дорослих ссавців є головним бар'єром для моделювання серцевої тканини з використанням окремих типів клітин.Ці основні обмеження підкреслюють важливість розвитку методів культивування неушкодженої тканини міокарда у фізіологічних та патологічних умовах.
Культивовані тонкі (300 мкм) секції людського серця виявилися перспективною моделлю неушкодженого людського міокарда.Цей метод забезпечує доступ до повної 3D -багатоклітинної системи, подібної до тканини серця людини.Однак до 2019 року використання культивованих секцій серця було обмежене коротким (24 год) виживанням культури.Це пов’язано з низкою факторів, включаючи відсутність фізичної механічної розтяжки, інтерфейс повітря-рідини та використання простих середовищ, які не підтримують потреби серцевої тканини.У 2019 році кілька дослідницьких груп продемонстрували, що включення механічних факторів у системи культури серцевої тканини може розширити життя культури, покращити експресію серця та імітувати серцеву патологію.Два елегантні дослідження 17 та 18 показують, що одноосне механічне навантаження позитивно впливає на серцевий фенотип під час культури.Однак ці дослідження не використовували динамічне тривимірне фізико-механічне навантаження серцевого циклу, оскільки секції серця були завантажені або ізометричними силами 17, або лінійним ауксонічним завантаженням 18.Ці методи розтягування тканин призводили до придушення багатьох генів серця або надмірної експресії генів, пов'язаних з аномальними реакціями розтягування.Зокрема, Pitoulis et al.19 Розробила динамічна ванна з шматочками для зрізів для реконструкції серцевого циклу, використовуючи зворотний зв'язок перетворювача сили та натяжні накопичувачі.Незважаючи на те, що ця система дозволяє більш точне моделювання серцевого циклу in vitro, складність та низька пропускна здатність методу обмежують застосування цієї системи.Наша лабораторія нещодавно розробила спрощену систему культури з використанням електричної стимуляції та оптимізованого середовища для підтримки життєздатності ділянок тканини серця свиней та людини до 6 днів20,21.
У поточному рукописі ми описуємо модель культури серцевої тканини (CTCM) з використанням ділянок свинячого серця, що включає гуморальні сигнали для рекапітуляції тривимірної фізіології серця та патофізіологічного здуття під час серця.Цей CTCM може підвищити точність передклінічного прогнозування лікарських засобів до рівня, який ніколи раніше не досягнуто, забезпечуючи економічну, середньо-пропускну серцеву систему, яка імітує фізіологію/патофізіологію серця ссавців для доклінічного тестування на наркотики.
Гемодинамічні механічні сигнали відіграють вирішальну роль у підтримці функції кардіоміоцитів in vitro 22,23,24.У нинішньому рукописі ми розробили CTCM (мал. 1А), який може імітувати серцеве середовище для дорослих, індукуючи як електричну, так і механічну стимуляцію на фізіологічних частотах (1,2 Гц, 72 удари в хвилину).Щоб уникнути надмірної розтяжки тканин під час діастоли, для збільшення розміру тканин 3D -друкарні використовували на 25% (рис. 1В).Електричний темп, індукований системою C-Pace, приурочувався до запуску 100 мс до систоли за допомогою системи збору даних для повного відтворення серця.Система культури тканин використовує програмований пневматичний привід (LB Engineering, Німеччина) для циклічного розширення гнучкої силіконової мембрани, щоб викликати розширення шматочків серця у верхній камері.Система була підключена до зовнішньої повітряної лінії через перетворювач тиску, що дозволило точно регулювати тиск (± 1 мм рт.ст.) та час (± 1 мс) (рис. 1С).
Прикріплення тканинної ділянки до 7 -мм опорного кільця, показане синім кольором, всередині камери культури пристрою.Камера культури відокремлена від повітряної камери тонкою гнучкою силіконовою мембраною.Помістіть прокладку між кожною камерою, щоб запобігти витоком.Кришка пристрою містить графітові електроди, які забезпечують електричну стимуляцію.B Схематичне подання великого тканинного пристрою, направляючого кільця та кільця для опор.Зрізи тканин (коричневий) розміщуються на негабаритному пристрої з направляючим кільцем, розміщеним у канавці на зовнішньому краю пристрою.Використовуючи напрям, обережно розміщуйте опорне кільце, покрите тканинним акриловим клеєм над ділянкою серцевої тканини.C Графік, що показує час електричної стимуляції як функцію тиску повітряної камери, керованого програмованим пневматичним приводом (PPD).Пристрій збору даних був використаний для синхронізації електричної стимуляції за допомогою датчиків тиску.Коли тиск у камері культури досягає встановленого порогу, імпульсний сигнал надсилається до C-PACE-EM, щоб викликати електричну стимуляцію.D Зображення чотирьох CTCM, розміщених на інкубаторській полиці.Чотири пристрої підключені до одного PPD через пневматичний ланцюг, а датчики тиску вставляються в гемостатичний клапан для моніторингу тиску в пневматичному ланцюзі.Кожен пристрій містить шість ділянок тканин.
Використовуючи один пневматичний привід, нам вдалося контролювати 4 пристрої CTCM, кожен з яких міг утримувати 6 ділянок тканин (рис. 1D).У CTCM тиск повітря в повітряній камері перетворюється на синхронний тиск у рідинній камері і індукує фізіологічне розширення шматочка серця (мал. 2А та додатковий фільм 1).Оцінка розтягування тканин при 80 мм рт.ст.Мистецтво.показали розтягнення ділянок тканин на 25% (рис. 2В).Показано, що ця процентна розтяжка відповідає довжині фізіологічного саркомера 2,2–2,3 мкм для нормальної скорочення серцевої секції17,19,25.Рух тканин оцінювали за допомогою спеціальних налаштувань камери (додаткова рисунок 1).Амплітуда та швидкість руху тканин (рис. 2С, г) відповідали розтягуванню під час серцевого циклу та часу під час систоли та діастоли (рис. 2В).Розтягнення та швидкість серцевої тканини під час скорочення та релаксації залишалися постійними протягом 12 днів у культурі (рис. 2F).Для оцінки впливу електричної стимуляції на скоротливість під час культури ми розробили метод визначення активної деформації за допомогою алгоритму затінення (додаткова фіг. 2А, б) і змогли розрізняти деформації з електричною стимуляцією та без нього.Той самий розділ серця (рис. 2f).У рухомої області розрізу (R6-9) напруга під час електричної стимуляції була на 20% вище, ніж за відсутності електричної стимуляції, що вказує на внесок електричної стимуляції у скоротливу функцію.
Репрезентативні сліди тиску повітряної камери, тиску рідинної камери та вимірювання руху тканин підтверджують, що тиск камери змінює тиск камери рідини, викликаючи відповідний рух тканинного шматочка.B Представницькі сліди відсоткової розтяжки (синій) тканинних ділянок, що відповідають відсоткову розтяжку (помаранчевий).C Виміряний рух серцевого зрізу узгоджується з вимірюваною швидкістю руху.(d) Репрезентативні траєкторії циклічного руху (синя лінія) та швидкість (помаранчева пунктирна лінія) у зрізі серця.e Кількісне визначення часу циклу (n = 19 зрізів на групу, від різних свиней), час скорочення (n = 19 зрізів на групу), час релаксації (n = 19 зрізів на групу, від різних свиней), руху тканин (n = 25).шматочки)/група з різних свиней), пікова систолічна швидкість (n = 24 (d0), 25 (d12) шматочки/група з різних свиней) та швидкість релаксації піку (n = 24 (d0), 25 (d12) шматочки/група з різних свиней).T-тест з двома хвостами не показав суттєвої різниці в жодному параметрі.F Репрезентативні сліди деформаційного аналізу тканинних ділянок з (червоним) та без (синього) електричної стимуляції, десять регіональних ділянок тканинних ділянок з одного розділу.Нижні панелі показують кількісну оцінку відсоткової різниці деформацій у тканинних ділянках з електричною стимуляцією та без нього в десяти областях з різних секцій. (n = 8 шматочків/група з різних свиней, виконується з двома хвостом T-тесту; **** p <0,0001, ** p <0,01,*p <0,05). (n = 8 шматочків/група з різних свиней, виконується з двома хвостом T-тесту; **** p <0,0001, ** p <0,01,*p <0,05). (n = 8 СРЕзо/Группп От Разныхс, Проовідитса двесторони; (n = 8 розділів/група з різних свиней, двосхилий t-тест Стьюдента; **** p <0,0001, ** p <0,01,*p <0,05). （N = 8 片/组 ， 来自 不同 的 猪 ， 进行 双尾 学生 t 检验 ； **** p <0,0001 ， ** p <0,01 ，*p <0,05）。 （N = 8 片/组 ， 来自 不同 的 猪 ， 进行 双尾 学生 t 检验 ； **** p <0,0001 ， ** p <0,01 ，*p <0,05）。 (n = 8 с. (n = 8 розділів/група, з різних свиней, t-тест у двосторонній студент; **** p <0,0001, ** p <0,01,*p <0,05).Стрибки помилок представляють середнє ± стандартне відхилення.
У нашій попередній статичній системі культури біоміметичного серця [20, 21] ми підтримували життєздатність, функцію та структурну цілісність шматочків серця протягом 6 днів, застосовуючи електричну стимуляцію та оптимізуючи композицію середовища.Однак через 10 днів ці цифри різко впали.Ми будемо посилатися на розділи, культивовані в нашій попередній статичній системі біоміметичної культури 20, 21 умови управління (CTRL), і ми будемо використовувати наше раніше оптимізоване середовище як умови та культура MC при одночасному механічному та електричному стимуляції (CTCM).покликаний.По -перше, ми визначили, що механічна стимуляція без електричної стимуляції була недостатньою для підтримки життєздатності тканин протягом 6 днів (додаткова фіг. 3а, б).Цікаво, що при впровадженні фізіомеханічної та електричної стимуляції за допомогою STCM життєздатність 12-денних секцій серця залишалася такою ж, як і в секціях свіжого серця в умовах МС, але не в умовах CTRL, як показано аналізом MTT (рис. 1).3a).Це говорить про те, що механічна стимуляція та моделювання серцевого циклу можуть підтримувати ділянки тканин життєздатними вдвічі довшими, як повідомляється в нашій попередній системі статичної культури.Однак оцінка структурної цілісності тканинних ділянок шляхом імунолаляції серцевого тропоніну Т та коннексину 43 показала, що експресія коннексину 43 була значно вищою у тканинах МС на 12 день, ніж у контролі в один і той же день.Однак рівномірна експресія коннексину 43 та утворення Z-диска не були повністю підтримані (рис. 3В).Ми використовуємо рамку штучного інтелекту (AI) для кількісної оцінки тканинної структурної цілісності26, трубопроводу глибокого навчання на основі зображення, заснованого на фарбуванні Troponin-T та коннексину43, щоб автоматично кількісно оцінити структурну цілісність та флуоресценцію серцевих зрізів з точки зору сили локалізації.Цей метод використовує згорнуту нейронну мережу (CNN) та глибоко навчальну рамку, щоб надійно кількісно оцінити структурну цілісність серцевої тканини автоматизовано та неупереджено, як описано в посиланнях.26. Тканина MC показала покращену структурну схожість до 0 дня порівняно зі статичними контрольними секціями.Крім того, трихромне фарбування Массона виявило значно нижчий відсоток фіброзу в умовах МС порівняно з умовами контролю на 12 -й день культури (рис. 3С).У той час як CTCM збільшував життєздатність ділянок тканин серця на 12 день до рівня, подібного до тканини свіжого серця, це не суттєво покращило структурну цілісність серця.
Графік з гістограми показує кількісну оцінку життєздатності MTT свіжих зрізів серця (D0) або культури серця на 12 днів або в статичній культурі (D12 CTRL), або в CTCM (D12 MC) (N = 18 (D0), 15 (D12 CTRL), 12 (D12 MC) Ships/Group з різних свиней, порівняно з дюмами PRAH PROM PROM PROM Порівняно; D12 CTRL). Графік з гістограми показує кількісну оцінку життєздатності MTT свіжих зрізів серця (D0) або культури серця на 12 днів або в статичній культурі (D12 CTRL), або в CTCM (D12 MC) (N = 18 (D0), 15 (D12 CTRL), 12 (D12 MC) Ships/Group з різних свиней, порівняно з дюмами PRAH PROM PROM PROM Порівняно; D12 CTRL).Гістограма показує кількісне визначення життєздатності секцій MTT Fresh Heart (D0) або культури серця протягом 12 днів у статичній культурі (D12 Control), або CTCM (D12 MC) (N = 18 (D0), 15 (D12 Control).)), 12 (D12 MC) секції/група з різних свиней, виконується тестовий тест ANOVA;#### p <0,0001 Пос. #### p <0,0001 порівняно з D0 та ** P <0,01 порівняно з D12 CTRL). Гістограма, що показує кількісну оцінку життєздатності MTT у секціях свіжого серця (D0) або секціях серця, культивованих протягом 12 днів у статичній культурі (D12 Control) або CTCM (D12 MC) (n = 18 (D0), 15 (контроль D12)), 12 (D12 MC) секцій/група з різних свиней, тесту на один шлях ANOVA;#### p <0,0001 по -Срухневіюс D0, ** p <0,01 по -Срухневії D12 Ctrl). #### p <0,0001 порівняно з D0, ** p <0,01 порівняно з D12 CTRL).B Troponin-T (зелений), коннексин 43 (червоний) та DAPI (синій) у свіжозойлених ділянках серця (D0) або сердечних секціях, культивованих у статичних умовах (CTRL) або CTCM умовах (MC) протягом 12 днів) репрезентативних імунофлуоресцентних зображень (порожній масштаб = 100 мкм). Кількісне визначення штучного інтелекту структурної цілісності тканин серця (n = 7 (d0), 7 (d12 ctrl), 5 (d12 mc) шматочки/група з різних свиней, проводиться одностороннім тестом ANOVA; #### p <0,0001 порівняно з D0 та **** p <0,0001 порівняно з D12 CTRL). Кількісне визначення штучного інтелекту структурної цілісності тканин серця (n = 7 (d0), 7 (d12 ctrl), 5 (d12 mc) шматочки/група, кожна з різних свиней, проводиться одностороннім тестом ANOVA; #### p <0,0001 порівняно з D0 та **** p <0,0001 порівняно з D12 CTRL). КОЛІЙСТВЕННАЯ ОРЕКУНКАСЬКОГО СТРУХТУРНО НАЛОСТНОСТИНСЬКОГО СТЕРНОй ТКАНІТНОСТІЯ Групп в р. Кількісне визначення структурної цілісності серцевої тканини за допомогою штучного інтелекту (n = 7 (d0), 7 (D12 CTRL), 5 (D12 MC) секції/групи з різних свиней, проведений односторонній тест ANOVA; #### p <0,0001 проти D0 та **** p <0,0001 порівняно з D12 CTRL).人工 智能量化.人工 智能量化 心脏. Yskusstvennый intentelelenkt gdlta oolyrчentevennoй onki strukturnoй целостнос Стердной, 5 Группу -КажДой, raзnых Сине,, донностороннин, anova; #### p <0 0001 проти d0 цин Штучний інтелект для кількісної оцінки структурної цілісності серцевої тканини (n = 7 (D0), 7 (D12 CTRL), 5 (D12 MC) секції/група кожної з різних свиней, односторонній тест ANOVA; #### p <0,0001 проти .d0 для порівняння **** p <0,0001 порівняно з d12 ctrl). C Представницькі зображення (ліворуч) та кількісне визначення (праворуч) для шматочків серця, забарвлених плямами трихрому Массона (масштаб гола = 500 мкм) (n = 10 шматочків/група, кожна з різних свиней, проводиться одностороннім тестом ANOVA; #### p <0,0001 порівняно з D0 та *** P <0,001 порівняно з D12 CTRL). C Представницькі зображення (ліворуч) та кількісне визначення (праворуч) для шматочків серця, забарвлених плямами Трихрому Массона (масштаб гола = 500 мкм) (n = 10 шматочків/група, кожна з різних свиней, проводиться одностороннім тестом ANOVA; #### p <0,0001 порівняно з D0 та *** P <0,001 порівняно з D12 CTRL). Crепрезеньятівеные і є вбраїні (Слева) і Коліштевнная Оренка (Спран) Ona (maSшtayb bcuз npokrыtij = 500 мкм) (n = 10 Срезо/Групппу Ота Разных Сцине, В'Полняна Нию с D0 і *** p <0,001 Пос. C Репрезентативні зображення (зліва) та кількісне визначення (праворуч) секцій серця, забарвлених трихромом Массона (без покриття = 500 мкм) (n = 10 секцій/група з різних свиней, односторонній тест ANOVA, виконаний; #### p <0 .0001 порівняно з D0 та *** p <0,001 порівняно з D12 CTRL). Crепрезеньянсько (Слева) іобраньяя (Слева) і Койштевнный Аналайз (Спран) Нах (чистяя шkala = 500 мкм) (n = 10 с. ANALYза; ### #P <00001 ПОС СРАВНІНІВС СТ, *** P <0,001 Пос. C Представницькі зображення (ліворуч) та кількісне визначення (праворуч) секцій серця, забарвлені плямою Трихрому Массона (порожня = 500 мкм) (n = 10 секцій/група, кожна з різних свиней, перевіреної одностороннім аналізом дисперсії; #### P <0,0001 порівняно з D0, *** p <0,001 порівняно з D12 CTRL).Стрибки помилок представляють середнє ± стандартне відхилення.
Ми висунули гіпотезу, що, додаючи невеликі молекули до культурального середовища, цілісність кардіоміоцитів може бути покращена та розвиток фіброзу зменшився під час культури КТКМ.Тому ми перевіряли на наявність малих молекул, використовуючи наші статичні культури контролю20,21 через невелику кількість заплутаних факторів.Для цього екрана були обрані дексаметазон (DEX), трийодтиронін (T3) та SB431542 (SB).Ці невеликі молекули раніше використовувались у культурах HIPSC-CM для індукції дозрівання кардіоміоцитів за рахунок збільшення довжини саркомера, Тубулів та швидкості провідності.Крім того, як відомо, як DEX (глюкокортикоїд), так і СБ пригнічують запалення29,30.Тому ми перевірили, чи включення однієї чи комбінації цих малих молекул покращить структурну цілісність секцій серця.Для початкового скринінгу дозу кожної сполуки вибирали на основі концентрацій, які зазвичай використовуються в моделях клітинної культури (1 мкМ DEX27, 100 нм T327 та 2,5 мкМ SB31).Після 12 днів культури комбінація Т3 та DEX призвела до оптимальної структурної цілісності кардіоміоцитів та мінімальної волокнистої ремоделювання (додаткові фігури 4 та 5).Крім того, використання подвійних або подвійних цих концентрацій T3 та DEX спричинило шкідливі ефекти порівняно з нормальними концентраціями (додаткова фіг. 6а, б).
Після початкового скринінгу ми провели порівняння 4-х умов культури (мал. 4А): CTRL: Серцеві секції, культивовані в нашій описаній раніше статичній культурі, використовуючи наше оптимізоване середовище;20.21 TD: T3 та CTRL S додали DEX у середу;MC: Серцеві секції, культивовані в CTCM, використовуючи наше раніше оптимізоване середовище;і MT: CTCM з T3 та DEX, що додаються до середовища.Після 12 днів вирощування життєздатність тканин МС та МТ залишалася такою ж, як у свіжих тканинах, оцінених за допомогою аналізу MTT (рис. 4В).Цікаво, що додавання T3 та DEX до культур Transwell (TD) не призвело до значного поліпшення життєздатності порівняно з умовами CTRL, що свідчить про важливу роль механічної стимуляції у підтримці життєздатності секцій серця.
Експериментальна схема проектування із зображенням чотирьох умов культури, що використовуються для оцінки впливу механічної стимуляції та добавки T3/DEX на середовище протягом 12 днів. B-графік B-гастролі показує кількісну оцінку життєздатності 12 днів після культури у всіх 4 умовах культури (CTRL, TD, MC та MT) порівняно зі свіжими шматочками серця (D0) (N = 18 (D0), 15 (D12 CTRL, D12 TD та D12 MT), 12 (D12 MC) і групою/групою від різних свиней, односторонніх тестів, що виконуються; ** p <0,01 порівняно з D12 Ctrl). B-графік B-гастролі показує кількісну оцінку життєздатності 12 днів після культури у всіх 4 умовах культури (CTRL, TD, MC та MT) порівняно зі свіжими шматочками серця (D0) (N = 18 (D0), 15 (D12 CTRL, D12 TD та D12 MT), 12 (D12 MC) і групою/групою від різних свиней, односторонніх тестів, що виконуються; ** p <0,01 порівняно з D12 Ctrl). B -giStorygmama tpokaзыvert coliчiestvennuю ценку -жизнспозобностист чрез 12 днень -писевіовіовіонивіїновіонивіонивіонивіонивиновіояновіояноя rovarta (controrolet, td, mc y mt) по -всовенитью ссеміми с. с.м. Ви, що р. B Графік B-гісточки показує кількісне визначення життєздатності на 12 днів після культури у всіх 4 умовах культури (контроль, TD, MC та MT) порівняно з свіжими секціями серця (D0) (N = 18 (D0), 15 (D12 CTRL, D12 TD та D12 MT), 12 (D12 MC) секціями/групою з різних свиней, однодорожних тестів ANOVA; *p <0,01 за порівняно з D12 Ctrl). B 条形图 显示 所有 4 种 培养 条件 （ctrl 、 td 、 mc 和 mt） 与 新鲜 心脏 切片 切片 (d0) (n = 18 (d0) 、 15 (d12 ctrl 、 d12 td 和 d12 mt) ， 来自 不同 的 的 的 的 的 的 的 单向 的 单向 单向 单向 单向 单向 单向 单向 单向 单向 单向 单向 单向 单向 单向 单向 单向 单向 的 单向 的 ； 单向 的 的 ； ； ； ； 的 ； 的 的 的 ； ； 的 的 ； ； 的 的 12 ### p <0,001 与 d0 相比 ， ** p <0,01 与 D12 控制）。B 4 12 (D12 MC) B -giStorygmam. 0), 15 (D12 CTRL, D12 TD і D12 MT), Ot R.Nыхnых СВІНЕй 12 (D12 MC) СРЕ/ГРУППА, ОДНОСТОРОННІЙСЬКИЙ АНОВА; ** p <0,01 по -Срануні! B Гістограма B, що показує всі 4 умови культури (контроль, TD, MC та MT) порівняно з свіжими секціями (D0) (N = 18 (D0), 15 (D12 CTRL, D12 TD та D12 MT), з різних свиней 12 (D12 MC), група, односторонній тест ANOVA; C-графік C показує кількісне визначення потоку глюкози на 12 днів після культури у всіх 4 умовах культури (CTRL, TD, MC та MT) порівняно зі свіжими шматочками серця (D0) (n = 6 зрізів/групи з різних свиней, проводиться односторонній тест ANOVA; ### p <0,001, порівняно з D0 та *** P <0,001 порівняно з D12 CTRL). C-графік C показує кількісне визначення потоку глюкози на 12 днів після культури у всіх 4 умовах культури (CTRL, TD, MC та MT) порівняно зі свіжими шматочками серця (D0) (n = 6 зрізів/групи з різних свиней, проводиться односторонній тест ANOVA; ### p <0,001, порівняно з D0 та *** P <0,001 порівняно з D12 CTRL). C Гистогарммма, а -вкАзыВте Колайштевенуюе, а -Потока, Глкозые 12 12 до № Анея (controroles, td, mc y mt) по -Сранневи Со Сехімі Сремомі/С. листоптья C Гістограма C показує кількісне визначення потоку глюкози 12 днів після культури при всіх 4 умовах культури (Control, TD, MC та MT) порівняно з секціями свіжого серця (D0) (n = 6 розділів/група з різних свиней, проведеного одностороннім тестом ANOVA; ### p <0,001 порівняно з D0 та *** P <0,001 порівняно з D12 CTRL). C 条形图 显示 所有 4 种 培养 条件 （ctrl 、 td 、 mc 和 mt） 与 新鲜 心脏 切片 切片 (d0) 相比 ， 后 后 12 天 葡萄糖 通量 定量 定量 （n = 6 片/组 ， 来自 猪 猪 ， 单向 执行 执行 执行 测试 测试 测试 00 00 00 00 00 00 00 00 00 00 00 00 00 00 00 00 00 00 00 00 2 Ctrl 相比）。 C серстогммм, каказыаая Колиштевенуюоюе, а -Потока, Глкозые 12 Овнія (controroles, td, mc y mt) по -всовению ссежиміїс Сремомі/сердца (d0) (n = 6 Срезо/Грюпппппппппппппппппппппппппппппппппппп li provenenыtыtы anova; ### p <0,001 п. C Гістограма, що демонструє кількісне визначення потоку глюкози на 12 днів після культури для всіх 4 умов культури (контроль, TD, MC та MT) порівняно зі свіжими секціями серця (D0) (n = 6 секцій/група, з різних свиней, були проведені односторонні тести ANOVA, ### p <0,001 порівняно з D, *** P <0,001 порівняно з D12 (контроль).Ділянки аналізу штаму свіжих (синіх), 12-ти мс (зелений) та 12 млн. Т (червона) тканини на десяти точках регіональних тканин (n = 4 зрізів/групи, односторонній тест на ANOVA; між групами не було суттєвої різниці).Елкан Елкан, що демонструють диференційно експресовані гени в секціях свіжого серця (D0) порівняно з секціями серця, культивованими в статичних умовах (CTRL) або в умовах МТ (МТ) протягом 10-12 днів.F Теплова карта генів саркомера для розділів серця, культивованих у кожному з культурних умов.Стрибки помилок представляють середнє ± стандартне відхилення.
Метаболічна залежність від перемикання від окислення жирної кислоти до гліколізу є ознакою кардіоміоцитарної дедференціації.Незрілі кардіоміоцити в першу чергу використовують глюкозу для вироблення АТФ і мають гіпопластичні мітохондрії з невеликим Cristae5,32.Аналіз використання глюкози показав, що в умовах МС та МТ використання глюкози було подібним до того, що в тканинах 0 день (мал. 4С).Однак зразки CTRL показали значне збільшення використання глюкози порівняно зі свіжою тканиною.Це вказує на те, що комбінація CTCM та T3/DEX підвищує життєздатність тканин та зберігає метаболічний фенотип 12-денних культивованих секцій серця.Крім того, аналіз штаму показав, що рівень штаму залишається таким же, як у тканинах свіжого серця протягом 12 днів в умовах МТ та МС (рис. 4D).
Щоб проаналізувати загальний вплив CTCM та T3/DEX на глобальний транскрипційний ландшафт тканини серця з шматочками, ми виконали RNASEQ на серцеві шматочки з усіх чотирьох різних умов культури (додаткові дані 1).Цікаво, що МТ -секції показали високу транскрипційну схожість із тканиною свіжого серця, лише 16 диференційно експресуються з 13 642 генів.Однак, як ми показали раніше, зрізами CTRL показали 1229 генів диференційно експресованих через 10–12 днів у культурі (рис. 4е).Ці дані були підтверджені QRT-PCR генів серця та фібробластів (додаткова фіг. 7A-С).Цікаво, що розділи CTRL показали зниження регуляції генів серцевого та клітинного циклу та активації програм запальних генів.Ці дані говорять про те, що дедференціація, яка зазвичай виникає після тривалого культивування, повністю ослаблена в умовах МТ (додаткова рис. 8а, б).Ретельне вивчення генів саркомера показало, що лише в умовах МТ є гени, що кодують саркомер (рис. 4F) та іонний канал (додатковий рис. 9) збереглися, захищаючи їх від придушення в умовах CTRL, TD та MC.Ці дані демонструють, що при поєднанні механічної та гуморальної стимуляції (T3/DEX) транскриптом серця зрізів може залишатися схожим із свіжими шматочками серця після 12 днів у культурі.
Ці транскрипційні результати підтверджуються тим, що структурна цілісність кардіоміоцитів у секціях серця найкраще зберігається в умовах МТ протягом 12 днів, як показано інтактним та локалізованим коннексином 43 (рис. 5А).Крім того, фіброз у зріжках серця в умовах МТ значно зменшено порівняно з CTRL та аналогічно із свіжими ділянками серця (рис. 5В).Ці дані демонструють, що поєднання механічної стимуляції та лікування Т3/DEX ефективно зберігає серцеву структуру в розділах серця в культурі.
Репрезентативні імунофлуоресцентні зображення тропоніну-Т (зеленого), коннексину 43 (червоний) та DAPI (синій) у свіжозойованих секціях серця (D0) або культивовані протягом 12 днів у всіх чотирьох умовах культури серця (масштабний бар = 100 мкм).). Кількісне визначення штучного інтелекту структурної цілісності тканин серця (n = 7 (D0 і D12 CTRL), 5 (D12 TD, D12 MC та D12 MT) зрізами/групою з різних свиней проводиться односторонній тест ANOVA; Кількісне визначення штучного інтелекту структурної цілісності тканин серця (n = 7 (D0 і D12 CTRL), 5 (D12 TD, D12 MC та D12 MT) зрізами/групою з різних свиней проводиться односторонній тест ANOVA; Коліштевнная Овенка, Стрюктернойеш -сетноусті Ткани Сурдца Сомьщ -Ісскасц. Mc y d12 mt) srезо/Грюпп, а р. СРВНІНИю С D12 CTRL). Кількісне визначення структурної цілісності тканини серця за допомогою штучного інтелекту (n = 7 (D0 та D12 CTRL), 5 (D12 TD, D12 MC та D12 MT) секцій/група з різних свиней, односторонній тест ANOVA, виконаний;对 不同 猪 的 心脏 组织 结构 完整性 （n = 7 （d0 和 d12 ctrl） 、 5 （d12 td 、 d12 mc 和 d12 mt） 切片/组） 进行 智能量 化 ， 进行 单向 单向 单向 测试 相比 ； ； ； 或 或 或 或 或 或 或 或 ， ， 与 与 与 与 与 与 与 与 与 与 与 与 与 与 与 与 与 与 与 与 与 与 和 和 和 和 与 与 与 与 与 与 与 和 和 p <0,05与 D12 Ctrl 相比）。" <0,0001 与 D12 Ctrl 相比）。Кількісне визначення структурної цілісності серцевої тканини з використанням штучного інтелекту у різних свиней (n = 7 (D0 та D12 CTRL), 5 (D12 TD, D12 MC та D12 MT) секціями/групою) з одностороннім тестом ANOVA;#### p <0,0001 по -Сранневіюс D0 і*p <0,05 ілі **** p <00001 по -ссраннеїнсько d12 ctrl). #### p <0,0001 порівняно з D0 та*p <0,05 або **** p <0,0001 порівняно з D12 CTRL). B B Репрезентативні репрезентативні шматочки Массону Трихром (шкали шкали = 500 мкм) (N = 10 (D0, D12 CTRL, D12 TD та D12 MC), 9 (D12 MT) шматочками/групою від різних свиней, односторонній тест ANOVA,#0,00, порівняно з D0 та*, порівняно з D0 та*, порівняно з D0 та*, порівняно з D0 і*, PROM* PROM* PROM* PROM* PROCTR1, PRECTR1, порівняно з D0 та ***, PRT 0,001, і 0,00, порівняно D0 та ***, PROM* PROM* PROM* PCORM* PROCTR1, PRECT D01* P.0000, PROM* PCORM* PCORM* PCOMON. 12 Ctrl). B B Репрезентативні репрезентативні шматочки Массону Трихром (шкали шкали = 500 мкм) (N = 10 (D0, D12 CTRL, D12 TD та D12 MC), 9 (D12 MT) шматочками/групою від різних свиней, односторонній тест ANOVA,#0,00, порівняно з D0 та*, порівняно з D0 та*, порівняно з D0 та*, порівняно з D0 і*, PROM* PROM* PROM* PROM* PROCTR1, PRECTR1, порівняно з D0 та ***, PRT 0,001, і 0,00, порівняно D0 та ***, PROM* PROM* PROM* PCORM* PROCTR1, PRECT D01* P.0000, PROM* PCORM* PCORM* PCOMON. 12 Ctrl). b Репрезентативні зображення та кількісне визначення секцій серця, забарвлених трихромною плямою Массона (шкалою шкали = 500 мкм) (n = 10 (D0, D12 CTRL, D12 TD та D12 MC), 9 (D12 MT)/групою від різних свиней, виконаних в одну сторону ANOVA; л). Brепрезентіявные іображеяя іко, а -киневцтевная, Окрапхенннннень -ренхеннхеннхеннхенхеннхеннхеннхеннхеннхнхеннхнхенн, M) (N = 10 (D0, D12 Ctrl, D12 TD і D12 MC), 9 (D12 MT) СРЕЙВО ОТ РАРА НАКСВІЙ / ГРУПППППА, ОНДІНА СПОСОБА АНОВА; yli **** p <00001 по -с -совению с D12 ctrl). B Репрезентативні зображення та кількісне визначення секцій серця, забарвлених трихромом Массона (шкали шкали = 500 мкм) (N = 10 (D0, D12 CTRL, D12 TD та D12 MC), 9 (D12 MT) з різних свиней/група, один метод ANOVA;Стрибки помилок представляють середнє ± стандартне відхилення.
Нарешті, здатність КТКМ імітувати гіпертрофію серця оцінювали за рахунок збільшення розтягування серцевої тканини.У CTCM тиск пікової повітряної камери збільшився з 80 мм рт.ст. до 80 мм рт.ст.Мистецтво.(звичайна розтяжка) до 140 мм рт.ст. ст.(Рис. 6а).Це відповідає збільшенню на 32% розтяжки (рис. 6В), що раніше було показано як відповідний відсотковий розтяг, необхідний для секцій серця для досягнення довжини саркомера, подібної до тієї, що спостерігається в гіпертрофії.Розтягнення та швидкість серцевої тканини під час скорочення та релаксації залишалися постійними протягом шести днів культури (рис. 6в).Серцева тканина від умов МТ піддавалася нормальній розтяжці (MT (нормально)) або умовами перенапруження (MT (ОС)) протягом шести днів.Вже після чотирьох днів у культурі гіпертрофічний біомаркер NT-Probnp був значно підвищений у середовищі в умовах MT (OS) порівняно з умовами МТ (нормальних) (рис. 7А).Крім того, після шести днів культивування розмір клітин у МТ (ОС) (рис. 7В) значно збільшився порівняно з ділянками серця МТ (нормально).Крім того, ядерна транслокація NFATC4 значно збільшувалася в перенапружених тканинах (рис. 7в).Ці результати показують прогресивну розробку патологічного реконструкції після гіпердистензії та підтримують концепцію того, що пристрій CTCM може бути використаний як платформа для вивчення індукованої розтяжкою серцевої гіпертрофії.
Репрезентативні сліди тиску повітряної камери, тиску рідинної камери та вимірювання руху тканин підтверджують, що тиск камери змінює тиск камери рідини, викликаючи відповідний рух тканинного шматочка.b Представницька процентна розтяжка та криві швидкості розтяжки для нормально розтягнутих (помаранчевих) та перенапружених (синіх) тканинних ділянок.C-графік C, що показує час циклу (n = 19 шматочків на групу, від різних свиней), час скорочення (n = 18-19 шматочків на групу, від різних свиней), час релаксації (n = 19 шматочків на групу/від різних свиней)), амплітуда руху тканин (n = 14 шматочків, від різних свиней), вершини Systolic lecticity (n = 14 шлюмів/група, з різних свиней) та peak relication restaumy restainty rentainty rentainty rentianty rentiam rentainty (r; 6)) Розділи/групи) з різних свиней), двосхилий t-тест Стьюдента не показав суттєвої різниці в жодному параметрі, що вказує на те, що ці параметри залишаються постійними протягом 6 днів культури з перенапруженням.Стрибки помилок представляють середнє ± стандартне відхилення.
Кількісне визначення гастрольної графіки концентрації NT-ProbNP в культуральних носіях із шматочків серця, культивованих при нормальній розтяжці MT (норми) або перенапруження (OS) (n = 4 (D2 MTNORM), 3 (D2 MTOS, D4 MTNORM та D4 MTOS) шматочками/групою від різних свиней, проводиться двостороння ANOVA; Кількісне визначення гастрольної графіки концентрації NT-ProbNP в культуральних носіях із шматочків серця, культивованих при нормальній розтяжці MT (норми) або перенапруження (OS) (n = 4 (D2 MTNORM), 3 (D2 MTOS, D4 MTNORM та D4 MTOS) шматочками/групою від різних свиней, проводиться двостороння ANOVA;Кількісна гістограма концентрації NT-ProbNP в культуральному середовищі з шматочків серця, культивованих в умовах нормальної розтяжки МТ (норми) або перенапруження (OS) (n = 4 (D2 MTNORM), 3 (D2 MTOS, D4 MTNORM та D4) .MTOS) зрізами /групою з різних свиней, виконують двофакторний аналіз дисперсії;** p <0,01 ПОС ** p <0,01 порівняно з нормальним розтягуванням). A 在 mt 正常 拉伸 (норма) 或 过度 拉伸 (os) 条件 下 培养 心脏 切片 培养 培养 基 中 nt-probnp 浓度 条形 图量化 （n = 4 (d2 mtnorm) 、 3 （d2 mtos 、 d4 mtnorm 和 和 不同 猪 猪 猪 猪 猪 的 的 猪 猪 的 的 的 的 猪 猪 的 猪 猪 猪 的 猪正常 拉伸相比 ， p <0,01）。 Кількісне визначення концентрації NT-Probnp в зріжках серця, культивованих при нормальній розтяжці MT (норми) або перенапруження (OS) (n = 4 (d2 mtnorm), 3 (d2 mtos, d4 mtnorm 和 d4 mTOS) від різних 猪 的 切片/组 ， 可以 可以 双向 发动 发动 发动 发动 发动 发动 发动 发动 发动 发动 发动 发动 发动 发动 发动 发动 发动 发动 发动 发动 发动 发动 发动 发动 发动 发动 发动 发动 发动 发动Кількісне визначення гістограмів NT-ProbNP-концентрацій у зрізах серця, культивованих в умовах нормального розтягування МТ (норми) або перенапруження (ОС) (n = 4 (d2 mtnorm), 3 (d2 mTOS, d4 mtnorm) та d4 mTOS) зрізами/групою з різних свиней, двосторонній аналіз дисперсії;** p <0,01 ПОС ** p <0,01 порівняно з нормальним розтягуванням). B Репрезентативні зображення для шматочків серця, забарвлених тропоніном-T та WGA (ліворуч) та кількісним визначенням розміру клітин (праворуч) (n = 330 (D6 MTOS), 369 (D6 MTNORM) клітин/група з 10 різних шматочків різних свиней, виконують двосхилий T-тест; **** p <0,0001 порівняно з нормальною розтяжкою). B Репрезентативні зображення для шматочків серця, забарвлених тропоніном-T та WGA (ліворуч) та кількісним визначенням розміру клітин (праворуч) (n = 330 (D6 MTOS), 369 (D6 MTNORM) клітин/група з 10 різних шматочків з різних свиней, виконують двосторонній T-тест; **** p <0,0001 порівняно з нормальною розтяжкою). brепрезеньятьвеные іображея, ссеви, серума, око, т. Еток (Справа) (n = 330 (d6 mTOS), 369 (d6 mtnorm) Клеток/Грюпп, 10 р. thюdenta; **** p <00001 По Сранунію С Снормальным Растеяжем). B Представлені репрезентативні зображення серця, забарвлених тропоніном-T та AZP (ліворуч) та кількісним визначенням розміру клітин (праворуч) (N = 330 (D6 MTOS), 369 (D6 MTNORM) клітин/група з 10 різних секцій з різних свиней, двосторонній t-тест студента; **** p <0,0001 порівняно з нормальним напруженням). b Репрезентативні зображення серцевих шматочків, забарвлених Calcarein-T та WGA (ліворуч) та розміром клітин (праворуч) (n = 330 (D6 MTOS), 369 з 10 різних шматочків (d6 mtnorm)) клітин/组 ， 两 有尾 学生 t тест ； порівняно з нормальним розтягуванням ， **** p <0,0001). Brепрезеньятья іображея, ссе, с.ерд'а, Окрашеннныхм, Тропоним-Т. СПРАА) (n = 330 (D6 MTOS), 369 (d6 mtnorm) і 10 р. по -повнінию с Снормальным Растеяженім). b Репрезентативні зображення серцевих секцій, забарвлених тропоніном-T та AZP (зліва) та кількісним визначенням розміру клітин (праворуч) (n = 330 (d6 mTOS), 369 (d6 mtnorm) з 10 різних секцій з різних свиней) клітин/групи, двосхилий критерій ТО;**** p <0,0001 порівняно з нормальним штамом). C Представницькі зображення на день 0 і день 6 МТОС серцевих шматочків, імунольоровані для тропонін-Т і NFATC4 та кількісна оцінка транслокації NFATC4 до ядра CM (n = 4 (D0), 3 (D6 MTOS) шматочків/групи з різних свиней, виконується двосторонній студент T-Test; *P <0,05). C Представницькі зображення на день 0 і день 6 МТОС серцевих шматочків, імунольоровані для тропонін-Т і NFATC4 та кількісна оцінка транслокації NFATC4 до ядра CM (n = 4 (D0), 3 (D6 MTOS) шматочків/групи з різних свиней, виконується двосторонній студент T-Test; *P <0,05). Crепрезеньятіїнхеные іображеяли листи 6 днів MTOS, ymmunoreченыхм, r. trаанслокаїії nfAtc4 v jodra-cavernoзnыхnых kletok (n = 4 (d0), 3 (d6 mtos) crезо/грпппют-raзnых knony, tronyc. ryй stnthюdenta; *p <0,05). C Репрезентативні зображення для розрізів серця за 0 та 6 днів МТО, імунольоровані для тропонін-Т і NFATC4, а також кількісна оцінка транслокації NFATC4 в ядрі кавернозних клітин (n = 4 (D0), 3 (D6 MTOS) шматочками/групою з різних свиней) виконували два-тестові студентські т-тет;*p <0,05). C 用 于 肌钙 蛋白 -T 和 NFATC4 免疫 标记 的 第 0 天 和 第 6 天 MTOS 心脏 切片 代表性 图像 ， 以及 来自 猪 的 的 nfatc4 易位 至 cm 细胞 核 量化 （n = 4 (d0) 、 3 (d6 mtos) 切片。 C Представницькі зображення кальканіну-T та NFATC4 імунолаламного маркування 第 0 天 和 第 6 天 MTOS-шматочків серця, а NFATC4 від різних NFATC4 易位 至 CM ядра клітин 的 Кількість 化 (n = 4 (d0), 3 (d6 мТок) 切礼/组, 时间 学生 学生 学生 电影 电影 电影 crепрезеньятьвеные іображеяс СрезоВ-Сердца mTOS 0 і 6 Денья Для a tratslorokaцiy nfatc4 v idra cm ot raзnых csquyrей (n = 4 (d0), 3 (d6 mtos) ssreз/gru, o-х х C Репрезентативні зображення зрізів серця MTOS на 0 та 6 для імунолаляції тропонін-T та NFATC4 та кількісної оцінки транслокації NFATC4 в ядрі CM від різних свиней (n = 4 (D0), 3 (d6 mtos) шматочків/групи, двоступленого T -criterion Student; *P <0,05).Стрибки помилок представляють середнє ± стандартне відхилення.
Поступальні серцево -судинні дослідження вимагають клітинних моделей, які точно відтворюють серцеве середовище.У цьому дослідженні було розроблено та охарактеризовано пристрій CTCM, який може стимулювати надтонкі секції серця.Система CTCM включає фізіологічно синхронізовану електромеханічну стимуляцію та збагачення рідини T3 та DEX.Коли розрізи серця свиней були піддані цим факторам, їх життєздатність, структурна цілісність, метаболічна активність та експресія транскрипції залишалися такими ж, як у тканинах свіжого серця після 12 днів культури.Крім того, надмірне розтягнення серцевої тканини може спричинити гіпертрофію серця, спричиненої гіперекстензією.В цілому ці результати підтримують вирішальну роль умов фізіологічної культури у підтримці нормального серцевого фенотипу та забезпечують платформу для скринінгу наркотиків.
Багато факторів сприяють створенню оптимального середовища для функціонування та виживання кардіоміоцитів.Найбільш очевидні з цих факторів пов'язані з (1) міжклітинними взаємодіями, (2) електромеханічною стимуляцією, (3) гуморальними факторами та (4) метаболічними субстратами.Фізіологічні взаємодії клітин до клітин потребують складних тривимірних мереж декількох типів клітин, що підтримуються позаклітинною матрицею.Такі складні клітинні взаємодії важко реконструювати in vitro за допомогою спільної культури окремих типів клітин, але їх можна легко досягти за допомогою органотипічної природи серця.
Механічна розтягнення та електрична стимуляція кардіоміоцитів є критичними для підтримки серцевого фенотипу33,34,35.Незважаючи на те, що механічна стимуляція широко використовується для кондиціонування та дозрівання HIPSC-CM, нещодавно кілька елегантних досліджень спробували механічну стимуляцію зрізів серця в культурі, використовуючи одноосне навантаження.Ці дослідження показують, що 2D одноосьове механічне навантаження позитивно впливає на фенотип серця під час культури.У цих дослідженнях секції серця були завантажені ізометричними силами розтягування17, лінійним ауксонічним завантаженням18, або серцевий цикл відтворювали за допомогою зворотного зв'язку силового перетворювача та накопичувачів натягу.Однак ці методи використовують розтягнення одноосної тканини без оптимізації навколишнього середовища, що призводить до придушення багатьох серцевих генів або надмірної експресії генів, пов'язаних з аномальними реакціями розтягування.Описаний тут CTCM забезпечує 3D електромеханічний стимул, який імітує природний серцевий цикл з точки зору часу циклу та фізіологічного розтягування (25% розтягування, 40% систол, 60% діастоли та 72 ударів в хвилину).Незважаючи на те, що ця тривимірна механічна стимуляція не є достатньою для підтримки цілісності тканин, для адекватного підтримки життєздатності, функції та цілісності необхідне комбінація гуморальної та механічної стимуляції за допомогою T3/DEX.
Гуморальні фактори відіграють важливу роль у модуляції фенотипу серця для дорослих.Це було виділено в дослідженнях HIPS-CM, в яких T3 та DEX були додані до культуральних середовищ для прискорення дозрівання клітин.Т3 може впливати на транспортування амінокислот, цукрів та кальцію через клітинні мембрани36.Крім того, T3 сприяє експресії MHC-α та зниженням регуляції MHC-β, сприяючи утворенню швидких міофібрил у зрілих кардіоміоцитах порівняно з повільними міофібрилами у плоді КМ.Дефіцит Т3 у гіпотиреоїдних пацієнтів призводить до втрати міофібрилярних смуг та зниженій швидкості розвитку тону37.DEX діє на глюкокортикоїдні рецептори і показано, що він збільшує скоротливість міокарда в ізольованих перфузованих серцях;38 Вважається, що це поліпшення пов'язане з впливом на введення кальцію, керованого депозитами (SOCE) 39,40.Крім того, DEX зв'язується зі своїми рецепторами, викликаючи широку внутрішньоклітинну реакцію, яка пригнічує імунну функцію та запалення30.
Наші результати свідчать про те, що фізична механічна стимуляція (МС) покращила загальну ефективність культури порівняно з CTRL, але не змогла підтримувати життєздатність, структурну цілісність та експресію серця протягом 12 днів у культурі.Порівняно з CTRL, додавання T3 та DEX до культур CTCM (MT) покращило життєздатність та підтримувало подібні профілі транскрипції, структурну цілісність та метаболічну активність із тканиною свіжого серця протягом 12 днів.Крім того, контролюючи ступінь розтягування тканин, була створена модель серця, спричиненої гіперкресивною, за допомогою STCM, що ілюструє універсальність системи STCM.Слід зазначити, що хоча серцеве ремоделювання та фіброз зазвичай передбачають неушкоджені органи, циркулюючі клітини яких можуть забезпечити відповідні цитокіни, а також фагоцитоз та інші фактори ремоделювання, ділянки серця все ще можуть імітувати фіброзний процес у відповідь на стрес і травму.в міофібробласти.Раніше це було оцінено в цій моделі серця.Слід зазначити, що параметри CTCM можуть бути модульовані шляхом зміни тиску/електричної амплітуди та частоти для імітації багатьох умов, таких як тахікардія, брадикардія та механічна підтримка кровообігу (механічне вивантажене серце).Це робить систему середньою пропускною здатністю для тестування на наркотики.Здатність CTCM моделювати індуковану перенапруженням серцевої гіпертрофії прокладає шлях для тестування цієї системи для персоналізованої терапії.На закінчення, це дослідження демонструє, що механічна розтягнення та гуморальна стимуляція є критичними для підтримки культури розділів серцевої тканини.
Хоча представлені тут дані говорять про те, що CTCM є дуже перспективною платформою для моделювання неушкодженого міокарда, цей метод культури має деякі обмеження.Основне обмеження культури КТКМ полягає в тому, що воно нав'язує постійні динамічні механічні напруження на шматочки, що виключає здатність активно контролювати скорочення серцевих зрізів протягом кожного циклу.Крім того, завдяки невеликому розміру серцевих ділянок (7 мм) здатність оцінювати систолічну функцію поза культурними системами за допомогою традиційних датчиків сили обмежена.У поточному рукописі ми частково подоламо це обмеження, оцінюючи оптичну напругу як показник скорочувальної функції.Однак це обмеження вимагатиме подальшої роботи і може бути вирішено в майбутньому, вводячи методи оптичного моніторингу функції шматочків серця в культурі, таких як оптичне відображення з використанням кальцієвих та чутливих до напруги барвників.Ще одне обмеження CTCM полягає в тому, що робоча модель не маніпулює фізіологічним стресом (попереднє завантаження та після завантаження).У CTCM тиск індукували в протилежних напрямках для відтворення 25% фізіологічного розтягування в діастолі (повному розтягуванні) та систолу (довжина скорочення під час електричної стимуляції) у дуже великих тканинах.Це обмеження слід усунути в майбутніх конструкціях CTCM за рахунок належного тиску на серцеву тканину з обох сторін та застосовуючи точні відносини об'ємного тиску, що виникають у камерах серця.
Ремоделювання, спричинене перенапруженням, повідомлене в цьому рукописі, обмежується імітуючи гіпертрофічні сигнали гіпертерчування.Таким чином, ця модель може допомогти у дослідженні гіпертрофічної сигналізації, спричиненої розтягуванням, без необхідності гуморальних або нейронних факторів (яких у цій системі не існує).Потрібні подальші дослідження для підвищення множинності CTCM, наприклад, спільної культури з імунними клітинами, циркулюючими гуморальними факторами плазми та іннервацією при спільній культурі з клітинами нейронів покращить можливості моделювання захворювання з CTCM.
У цьому дослідженні було використано тринадцять свиней.Усі процедури тварин проводилися відповідно до інституційних рекомендацій та були затверджені Комітетом з догляду та використання тварин університета Луїсвілля.Аортальну арку затиснули, а серце перфузували 1 л стерильної кардіоплегії (110 мм NaCl, 1,2 мм CACL2, 16 мм KCl, 16 мм MgCl2, 10 мм Nahco3, 5 U/Ml гепарин, pH до 7,4); Серця зберігалися в крижаному кардіоплегічному розчині до перевозування до лабораторії на льоду, яка зазвичай становить <10 хв. Серця зберігалися в крижаному кардіоплегічному розчині до перевозування до лабораторії на льоду, яка зазвичай становить <10 хв. С. Серця зберігали в крижаному кардіоплегічному розчині до транспортування до лабораторії на льоду, яка зазвичай займає <10 хв.将 心脏 保存 在 冰冷 的 心脏 停搏液 中 ， 直到 运送 到 实验室 ， 通常 <10 分钟。 分钟 分钟 分钟将 心脏 保存 在 冰冷 的 心脏 停搏液 中 ， 直到 运送 到 实验室 ， 通常 <10 分钟。 分钟 分钟 分钟 Дедержитсе сердца Вдяной -Кардопегири До Тренспорировки В Льбакорріорикун, Обкунона <10. Тримайте серця на льоду кардіоплегії до транспортування до лабораторії на льоду, як правило, <10 хв.
Пристрій CTCM був розроблений у програмному забезпеченні SolidWorks Computer-Adived Design (CAD).Культурні камери, роздільники та повітряні камери виготовлені з прозорого акрилового пластику ЧПУ.Резервне кільце діаметром 7 мм виготовляється з поліетилену високої щільності (HDPE) в центрі і має канавку ущільнювача для розміщення силіконового ущільнювача, що використовується для ущільнення носія внизу.Тонка мембрана кремнезему відокремлює камеру культури від пластини поділу.Силіконова мембрана - лазерний вирізаний з силіконового листа товщиною 0,02 ″ і має твердість 35А.Нижні та верхні силіконові прокладки - лазерні вирізання з силіконового листа товщиною 1/16 ″ і мають твердість 50А.316L гвинти з нержавіючої сталі та гайки крила використовуються для кріплення блоку та створення герметичного ущільнення.
Виділена друкована плата (PCB) розроблена для інтеграції з системою C-PACE-EM.Розетки швейцарської машини на друкованій платі підключені до графітових електродів за допомогою мідних проводів сріблястими та бронзовими 0-60 гвинтами, що викручуються в електроди.Друкована плата розміщується в кришці 3D -принтера.
Пристрій CTCM контролюється програмованим пневматичним приводом (PPD), який створює контрольований тиск кровообігу, аналогічний серцевому циклу.Зі збільшенням тиску всередині повітряної камери гнучка силіконова мембрана розширюється вгору, змушуючи середовище під ділянкою тканини.Площа тканини потім буде розтягнута цим вигнанням рідини, імітуючи фізіологічне розширення серця під час діастоли.На піку релаксації електричну стимуляцію застосовували за допомогою графітових електродів, що знижувало тиск у повітряній камері і спричинило скорочення тканинних ділянок.Всередині труби є гемостатичний клапан з датчиком тиску для виявлення тиску в системі повітря.Тиск, який відчуває датчик тиску, застосовується до колектора даних, підключеного до ноутбука.Це дозволяє постійному моніторингу тиску всередині газової камери.Коли було досягнуто максимального тиску камери (стандартна 80 мм рт.ст., 140 мм рт.ст. ОС), пристрій збору даних було замовлено для надсилання сигналу в систему C-PACE-EM для створення двофазного сигналу напруги протягом 2 мс, встановленого на 4 В.
Були отримані ділянки серця, а умови культури в 6 свердловинах проводили так: Перенесіть зібрані серця з трансферного судна на лоток, що містить холодну (4 ° С.) Кардіоплегію.Лівий шлуночок виділяли стерильним лезом і розрізали шматочками 1-2 см3.Ці тканинні блоки прикріплювали до тканинної омпи з тканинним клеєм і поміщали у вібраційну міктомову тканинну ванну, що містить розчин Тірода, і безперервно кисневий (3 г/л 2,3-бутанедіоне моноксим (BDM), 140 мм NaCl (8,18 г), 6 мм ккл (0,4447 г), 10 мм PES (2,38 г), 1 мм MGCL2 (1 мл 1 м розчин), 1,8 мм CACL2 (1,8 мл 1 м розчин), до 1 л Ddh2O).Вібраційний міктом встановлювали для розрізання шматочків товщиною 300 мкм на частоті 80 Гц, горизонтальної амплітуди вібрації 2 мм та швидкості заздалегідь 0,03 мм/с.Тканинну ванну оточили льодом, щоб розчин прохолодно, а температуру підтримували при 4 ° С.Перенесіть зрізи тканин з мікротомової ванни на інкубаційну ванну, що містить безперервно кисневий розчин тирода на льоду, поки не буде отримано достатньо секцій для однієї культурної пластини.Для трансвелл-культур тканинні зрізи були прикріплені до стерильних підтримки поліуретану шириною 6 мм і розміщували 6 мл оптимізованого середовища (199 середовища, 1x його добавка, 10% FBS, 5 нг/мл VEGF, 10 нг/мл FGF-алкаліну та 2х антибіотик-антифунгал).Електричну стимуляцію (10 В, частота 1,2 Гц) застосовували до ділянок тканин через C-Pace.Для умов ТД додавали свіжі Т3 та DEX при 100 нм та 1 мкм при кожній зміні середовища.Середовище насичується киснем перед заміною 3 рази на день.Зрізи тканин культивували в інкубаторі при 37 ° С і 5% СО2.
Для культур CTCM ділянки тканин розміщували на 3D-принтері на замовлення в чашці Петрі, що містить модифіковане рішення Тірода.Пристрій призначений для збільшення розміру шматочка серця на 25% площі опорного кільця.Це робиться так, щоб секції серця не розтягувались після перенесення з розчину Тірода в середовище та під час діастоли.Використовуючи гістоакрильний клей, секції товщиною 300 мкм фіксували на опорному кільці діаметром 7 мм.Після прикріплення ділянок тканин до опорного кільця відріжте надлишки тканинних ділянок і покладіть прикріплені ділянки тканин назад у ванну розчину Тірода на льоду (4 ° С), поки для одного пристрою не буде підготовлено достатньо ділянок.Загальний час обробки для всіх пристроїв не повинен перевищувати 2 години.Після того, як до їх кілець було приєднано 6 тканинних секцій, пристрій CTCM був зібраний.Камера культури CTCM попередньо заповнена з 21 мл попередньо оксигенованим середовищем.Перенесіть ділянки тканин до камери культури і обережно видаліть будь -які бульбашки повітря за допомогою піпетки.Потім тканинна секція керується в отвір і обережно притискається на місце.Нарешті, покладіть кришку електрода на пристрій і передайте пристрій в інкубатор.Потім підключіть CTCM до повітряної трубки та систему C-Pace-EM.Пневматичний привід відкривається, а повітряний клапан відкриває CTCM.Система C-Pace-EM була налаштована для доставки 4 В при 1,2 Гц під час двофазного кроку протягом 2 мс.Середовище змінювали двічі на день, а електроди змінювали раз на день, щоб уникнути накопичення графіту на електродах.Якщо необхідно, ділянки тканин можуть бути вилучені зі своїх культурних колодязів, щоб вигнати будь -які бульбашки повітря, які, можливо, впали під ними.Для умов лікування МТ T3/DEX додавали свіже з кожною зміною середовища з 100 нм Т3 та 1 мкМ DEX.Пристрої CTCM культивували в інкубаторі при 37 ° С і 5% CO2.
Для отримання розтягнутих траєкторій шматочків серця була розроблена спеціальна система камер.Камера дзеркала (Canon Rebel T7I, Canon, Tokyo, Japan) використовувалася з макро-об'єктивом Navitar Zoom 7000 18-108 мм (Navitar, San Francisco, Каліфорнія).Візуалізація проводили при кімнатній температурі після заміни середовища свіжим середовищем.Камера розміщується під кутом 51 °, а відео записується на 30 кадрів в секунду.По-перше, програмне забезпечення з відкритим кодом (Musclemotion43) було використано з Image-J для кількісної оцінки руху шматочків серця.Маска була створена за допомогою MATLAB (Mathworks, Natick, MA, США) для визначення цікавих регіонів для побиття шматочків серця, щоб уникнути шуму.Сегментовані маски вручну застосовуються до всіх зображень у послідовності кадру, а потім передаються до плагіну musclemotion.Рух м'язів використовує середню інтенсивність пікселів у кожному кадрі для кількісного визначального руху відносно еталонного кадру.Дані записували, фільтували та використовували для кількісного визначення часу циклу та оцінки розтягування тканин під час серця.Записане відео було після обробки за допомогою цифрового фільтра нульового фази першого порядку.Для кількісної оцінки розтяжки тканин (пік до піку) проводили аналіз піку до піку, щоб розрізняти піки та корита в записаному сигналі.Крім того, роз'єднання проводиться за допомогою полінома 6 -го порядку для усунення дрейфу сигналу.Програмний код був розроблений у MATLAB для визначення глобального руху тканин, часу циклу, часу релаксації та часу скорочення (додатковий код програми 44).
Для аналізу деформацій, використовуючи ті самі відео, створені для механічної оцінки розтягування, ми спочатку простежили два зображення, що представляють піки руху (найвищі (верхні) та найнижчі (нижні) точки руху) відповідно до програмного забезпечення Musclemotion.Потім ми сегментуємо тканинні області і застосували форму алгоритму затінення до сегментованої тканини (додаткова фіг. 2А).Потім сегментовану тканину поділяли на десять підводних місць, і напругу на кожній поверхні обчислювали за допомогою наступного рівняння: штам = (sup-swdow)/swdown, де SUP і sway-це відстані форми від верхньої та нижньої тіней тканини відповідно (додаткова фіг. 2В).
Серцеві секції фіксували в 4% параформальдегіду протягом 48 годин.Фіксовані тканини зневоднювали в 10% та 20% сахарозі протягом 1 години, потім у 30% сахарози протягом ночі.Потім секції були вбудовані в оптимальну температуру різання (з'єднання OCT) і поступово заморожували у ізопентано/сухій крижаній ванті.Зберігайте вбудовування OCT при температурі -80 ° C до розділення.Слайди готували як зрізи з товщиною 8 мкм.
Щоб видалити OCT з ділянок серця, нагрійте слайди на нагрівальному блоці при 95 ° С протягом 5 хв.Додайте 1 мл PBS до кожного слайда і інкубуйте протягом 30 хвилин при кімнатній температурі, а потім пронизуйте секції, встановивши 0,1% Triton-X в PBS протягом 15 хвилин при кімнатній температурі.Щоб запобігти зв'язуванню неспецифічних антитіл до зразка, додайте 1 мл 3% розчину BSA до слайдів і інкубуйте протягом 1 години при кімнатній температурі.Потім BSA видаляли і слайди промивали PBS.Позначте кожен зразок олівцем.Первинні антитіла (розведені 1: 200 в 1% BSA) (коннексин 43 (ABCAM; #AB11370), NFATC4 (ABCAM; #AB99431) та Troponin-T (Thermo Scientific; ; #A16079), проти кролика Alexa Fluor 594 (Thermo Scientific; #T6391) протягом додаткових 90 хвилин промивався 3 рази PBS для розрізнення цільового фарбування з фону, ми використовували лише вторинне антитіло як контроль. Нарешті, додавання ядерних плям Dapi та герметизаційні фальшини) та 20 -ти лабораторіях) та лабораторії vector) та фальсифікації vicortapator) та вкладених у лабораторіях) та клавіші) та ключових лабораторіях) та ключових лабораторіях) та клавіші) та клавіші) та ключових лабораторіях) та клавіатура ification.
Fluor 555 WGA-ALEXA (Thermo Scientific; #W32464) при 5 мкг/мл в PBS використовували для фарбування WGA та наносили на фіксовані ділянки протягом 30 хвилин при кімнатній температурі.Потім слайди промивали PBS, а до кожного слайда додавали чорний судан і інкубували протягом 30 хвилин.Потім слайди промивали PBS і додавали вкладене середовище Vectashield.Слайди візуалізували на мікроскопі ключування при збільшенні 40x.
OCT видаляли з зразків, як описано вище.Після видалення OCT занурюйте слайди в розчин Буйна протягом ночі.Потім слайди промивали дистильованою водою протягом 1 години, а потім поміщали в розчин фуксин -алое з бібрихом протягом 10 хвилин.Потім слайди промивали дистильованою водою і поміщали в розчин 5% фосфомолібдену/5% фосфотунгугстову кислоту протягом 10 хвилин.Без промивання передайте слайди безпосередньо в аніліновий синій розчин протягом 15 хвилин.Потім гірки промивали дистильованою водою і поміщали в 1% розчину оцтової кислоти протягом 2 хвилин.Слайди сушили в 200 Н етанолу і переносили в ксилол.Пофарбовані слайди візуалізували за допомогою мікроскопа ключових з 10 -кратною метою.Відсоток площі фіброзу кількісно визначали за допомогою програмного забезпечення для аналізатора ключових.
Аналіз життєздатності клітин Cyquant ™ MTT (Invitrogen, Carlsbad, CA), номер каталогу V13154, згідно з протоколом виробника з деякими модифікаціями.Зокрема, хірургічний удар з діаметром 6 мм був використаний для забезпечення рівномірного розміру тканини під час аналізу MTT.Тканини індивідуально покладали в лунки 12-лункової пластини, що містить підкладку MTT відповідно до протоколу виробника.Зрізи інкубують при 37 ° С протягом 3 годин, а жива тканина метаболізує субстрат MTT, утворюючи фіолетову складу формазану.Замініть розчин MTT на 1 мл ДМСО та інкубуйте при 37 ° С протягом 15 хвилин для вилучення фіолетового формазану з ділянок серця.Зразки розбавляли 1:10 в DMSO в 96-лункових чітких днах та фіолетова інтенсивність кольору, виміряні при 570 нм за допомогою зчитувача пластини цитації (Biotek).Показання нормалізувались до ваги кожного шматочка серця.
Медіа зрізання серця замінювали носієм, що містять 1 мкці/мл [5-3H]-глюкози (Biochemicals Moravek, Brea, CA, США) для аналізу використання глюкози, як описано раніше.Через 4 години інкубації додайте 100 мкл середовища до відкритої трубки мікроцентрифуги, що містить 100 мкл 0,2 Н HCl.Потім трубку поміщали в сцинтиляційну трубку, що містить 500 мкл DH2O для випаровування [3H] 2O протягом 72 годин при 37 ° С.Потім вийміть трубку мікроцентрифуги з сцинтиляційної трубки і додайте 10 мл сцинтиляційної рідини.Кількість сцинтиляції проводили за допомогою аналізатора рідинного сцинтиляції трикутника 2900TR (Packard Bioscience Company, Meriden, CT, США).Потім використання глюкози розраховували з урахуванням специфічної активності [5-3H]-глюкози, неповної рівноваги та фону, розведення [5-3H]-не маркованої глюкози та ефективності лічильника сцинтиляції.Дані нормалізуються на масу секцій серця.
Після гомогенізації тканин у TRIZOL РНК виділяли з секцій серця за допомогою мікрокомплекту Qiagen mirneasy #210874 відповідно до протоколу виробника.Підготовка бібліотеки RNASEC, секвенування та аналіз даних проводили наступним чином:
1 мкг РНК на зразок використовували як вихідний матеріал для приготування бібліотеки РНК.Бібліотеки секвенування були створені за допомогою набору для підготовки бібліотеки Ultratm RNA Nebnext для Illumina (NEB, США), дотримуючись рекомендацій виробника, а до послідовностей атрибутів додавали коди індексу для кожного зразка.Коротко, мРНК очищали від загальної РНК за допомогою магнітних намистин, прикріплених з олігонуклеотидами Poly-T.Фрагментація проводиться за допомогою двовалентних катіонів при високій температурі в буфері реакційного синтезу першої нитки (5x).Перша нитка кДНК синтезована за допомогою випадкових праймерів гексамера та зворотної транскриптази M-MuLV (RNase H-).Потім кДНК другої ланцюга синтезується за допомогою ДНК -полімерази I та RNase H. Решта навичок перетворюються на тупих кінців шляхом екзонуклеази/полімеразної активності.Після аденілювання 3 'кінця фрагмента ДНК, до нього прикріплюється адаптер Nebnext з конструкцією петлі шпильки, щоб підготувати його до гібридизації.Для вибору фрагментів кДНК бажаної довжини 150-200 bp.Фрагменти бібліотеки очищали за допомогою системи Ampure XP (Beckman Coulter, Beverly, США).Потім 3 мкл ферменту користувача (NEB, США) з обраними розмірами кДНК, що переводили з адаптером протягом 15 хвилин при 37 ° С, а потім протягом 5 хвилин при 95 ° С до ПЛР.Потім ПЛР проводили за допомогою ДНК-полімерази з високою точністю фузії, універсальних праймерів ПЛР та індексу (x) праймерів.Нарешті, продукти ПЛР були очищені (Ampure XP System) та якість бібліотеки, оцінені в системі Agilent Bioanalyzer 2100.Потім бібліотеку кДНК секвенували за допомогою секвенера Novaseq.Файли зображень RAW від Illumina були перетворені на RAW зчитування за допомогою базових дзвінків Casava.Сирої дані зберігаються у файлах формату FASTQ (FQ), які містять послідовності зчитування та відповідні базові якості.Виберіть HISAT2, щоб відповідати фільтруваному послідовності зчитування до еталонного геному SSCROFA11.1.Загалом, HISAT2 підтримує геноми будь -якого розміру, включаючи геноми, що перевищують 4 мільярди баз, і значення за замовчуванням встановлюються для більшості параметрів.Зчитування сплайсингу з даних RNA SEQ може бути ефективно вирівняне за допомогою HISAT2, найшвидшої наявної в даний час системи, з такою ж точністю, ніж будь -який інший метод.
Достаток транскриптів безпосередньо відображає рівень експресії генів.Рівні експресії генів оцінюються за рахунок великої кількості стенограм (кількість послідовності), пов'язаних з геномом або екзонами.Кількість зчитувань пропорційна рівнем експресії генів, довжині генів та глибині послідовності.FPKM (фрагменти на тисячу базових пар транскрипції секвенсували на мільйон пар базових пар), а р-значення диференціальної експресії визначали за допомогою пакету Deseq2.Потім ми обчислили помилкову швидкість виявлення (FDR) для кожного значення P, використовуючи метод Benjamini-Hochberg9 на основі вбудованої R-функції "P.Adjust".
РНК, виділену з секцій серця, перетворювали на кДНК в концентрації 200 нг/мкл, використовуючи суміш Master Superscript IV Vilo від Thermo (Thermo, кат. № 11756050).Кількісну RT-PCR проводили за допомогою прикладеної біосистеми Endura Plate Microamp 384-луна прозора реакційна пластина (Thermo, Cat. № 4483319) та оптичний клей з мікромами (Thermo, кат. № 4311971).Реакційна суміш складалася з 5 мкл швидкої вдосконаленої головної суміші Taqman (Thermo, CAT # 4444557), 0,5 мкл праймера Taqman та 3,5 мкл H2O змішаною на лунку.Проводили стандартні цикли QPCR, а значення КТ вимірювали за допомогою прикладних біосистем Quantstudio 5 ПЛР-інструменту в режимі реального часу (модуль 384 лунки; продукт № A28135).Праймери Taqman були придбані у Thermo (GAPDH (SS03375629_U1), PARP12 (SS06908795_M1), PKDCC (SS06903874_M1), CYGB (SS06900188_M1), RGL1 (SS0688890_M1) MH), GATA4 (SS03383805_U1), GJA1 (SS03374839_U1), COL1A2 (SS03375009_U1), COL3A1 (SS04333794_M1), Acta2 (SS04245588_M1) .
Випуск медіа NT-Probnp оцінювали за допомогою комплекту NT-Probnp (свиня) (кат.Коротко, 250 мкл кожного зразка та стандарту додавали у двох примірниках до кожної лунки.Відразу після додавання зразка додайте 50 мкл реагенту на аналіз A до кожної лунки.Акуратно струсіть тарілку і ущільнюйте герметиком.Потім таблетки інкубували при 37 ° С протягом 1 години.Потім аспіруйте розчин і промийте свердловини 4 рази 350 мкл розчину промивання 1х, інкубуючи розчин промивання протягом 1-2 хвилин щоразу.Потім додайте 100 мкл реагенту аналізу B на лунку і ущільнюйте герметик пластини.Таблетка обережно струшували і інкубували при 37 ° С протягом 30 хвилин.Аспіруйте розчин і промийте свердловини 5 разів 350 мкл розчину промивання 1х.Додайте до кожної лунки 90 мкл розчину підкладки і заклейте пластину.Інкубуйте тарілку при 37 ° С протягом 10-20 хвилин.Додайте 50 мкл зупинки розчину до кожної лунки.Пластину негайно вимірювали за допомогою зчитувача пластини цитації (Biotek), встановленим на 450 нм.
Аналіз потужності проводили для вибору розмірів групи, які забезпечать> 80% потужності для виявлення 10% абсолютної зміни параметра з 5% швидкості помилок типу I. Аналіз потужності проводили для вибору розмірів групи, які забезпечать> 80% потужності для виявлення 10% абсолютної зміни параметра з 5% швидкості помилок типу I. Analiз mощnosti bzl ыpolenenencenta ыborar.rзmerév gruppp, cotorые ObeSpчat> 80% мNOSTIS -юnаnynyяnyяnyяnyяnynyяnyяnynyяnynyяnynyяnynyяnynyяnynyяnynyяnynyяnynyяnynyяnynyяnynyяnynyяnynyяnynyяnynyяnyяnyяnyяnynyяnynyяnynyяnynytyяnynyяnynyяnynyяnynyяnynyяnynyяnynyяnynyяnynyяnynyяnynyяnyny. НІЯ Аналіз потужності був проведений для вибору розмірів груп, які забезпечили б> 80% потужності для виявлення 10% абсолютної зміни параметрів із 5% рівня помилок типу I.进行 功效 分析 以 选择 提供 提供> 80 ％ 以 检测 参数 参数 中 10 ％ 绝对 变化 和 5 ％ i 型 的 组 大小。。。。进行 功效 分析 以 选择 提供 提供> 80 ％ 以 检测 参数 参数 中 10 ％ 绝对 变化 和 5 ％ i 型 的 组 大小。。。。 Чул Проведен Аналайзм -Ностер -Для В'БОРАРА РАРАРА ГРУПППППА, КОТОРАРый ОБЕСПЕЙЛІВ> 80% Нитья Парамтерова і 5% чАСТОЙТЬКО ОРАБОК ТИПА І. Аналіз потужності був проведений для вибору розміру групи, який би забезпечив> 80% потужності для виявлення 10% абсолютної зміни параметрів та 5% швидкості помилок типу I.Розрізи тканин були випадковим чином відібрані перед експериментом.Усі аналізи були умовою сліпими, а зразки були розшифровані лише після аналізу всіх даних.Програмне забезпечення GraphPad Prism (Сан -Дієго, Каліфорнія) було використано для проведення всіх статистичних аналізів. Для всієї статистики значення p вважалися значущими у значеннях <0,05. Для всієї статистики значення p вважалися значущими у значеннях <0,05. ДЛЯ ВСЕй СТАТИСТИКИ П-з НАХІНІЯ СИТАЛІСЯ зNAчIMMYP-ПРІ зNAчENYUх <0,05. Для всієї статистики значення p вважалися значущими у значеннях <0,05.对于 所有 统计 数据 ， p 值 在值 <0,05 时 认为 是 显着 的。对于 所有 统计 数据 ， p 值 在值 <0,05 时 认为 是 显着 的。 ДЛЯ ВСЕй СТАТИСТИКИ П-з НАХІНІЯ СИТАЛІСЯ зNAчIMMYP-ПРІ зNAчENYUх <0,05. Для всієї статистики значення p вважалися значущими у значеннях <0,05.Двохволистий t-тест студента проводили за даними лише з 2 порівняннями.Односторонній або двосторонній ANOVA використовувався для визначення значущості між декількома групами.Під час виконання пост -спеціальних тестів виправлення Тукі було застосовано для врахування декількох порівнянь.Дані RNASEC мають спеціальні статистичні міркування при обчисленні FDR та P.Adjust, як описано в розділі Методи.
Для отримання додаткової інформації про дизайн дослідження див. Звіт про дослідження Nature Abstract, пов’язаний із цією статтею.