Дякуємо за відвідування Nature.com. Версія браузера, яку ви використовуєте, має обмежену підтримку CSS. Для найкращого досвіду рекомендуємо використовувати оновлений браузер (або вимкнути режим сумісності в Internet Explorer). Тим часом, щоб забезпечити постійну підтримку, ми відображатимемо сайт без стилів та JavaScript.
Існує потреба в надійній системі in vitro, яка може точно відтворювати фізіологічне середовище серця для тестування на наркотики. Обмежена доступність систем культивування тканини серця людини призвела до неточної інтерпретації ефектів серцевих препаратів. Тут ми розробили модель культивування тканини серця (КТСМ), яка електромеханічно стимулює зрізи серця та зазнає фізіологічного розтягування під час систолічної та діастолічної фаз серцевого циклу. Після 12 днів культивування цей підхід частково покращив життєздатність зрізів серця, але не повністю зберіг їх структурну цілісність. Тому після скринінгу малих молекул ми виявили, що додавання 100 нМ трийодтироніну (Т3) та 1 мкМ дексаметазону (Декс) до нашого середовища підтримувало мікроструктуру зрізів протягом 12 днів. У поєднанні з обробкою T3/Декс система КТСМ підтримувала транскрипційні профілі, життєздатність, метаболічну активність та структурну цілісність на тому ж рівні, що й свіжа тканина серця протягом 12 днів. Крім того, надмірне розтягування серцевої тканини в культурі індукує гіпертрофічну серцеву сигналізацію, що свідчить про здатність КТСМ імітувати гіпертрофічні стани, викликані розтягненням серця. На завершення, КТКМ може моделювати фізіологію та патофізіологію серця в культурі протягом тривалих періодів часу, що дозволяє проводити надійний скринінг ліків.
Перед клінічними дослідженнями необхідні надійні системи in vitro, які можуть точно відтворювати фізіологічне середовище людського серця. Такі системи повинні імітувати змінене механічне розтягнення, частоту серцевих скорочень та електрофізіологічні властивості. Моделі на тваринах зазвичай використовуються як платформа для скринінгу фізіології серця з обмеженою надійністю у відображенні впливу ліків на людське серце1,2. Зрештою, ідеальна експериментальна модель культури тканин серця (CTCM) – це модель, яка є високочутливою та специфічною для різних терапевтичних та фармакологічних втручань, точно відтворюючи фізіологію та патофізіологію людського серця3. Відсутність такої системи обмежує відкриття нових методів лікування серцевої недостатності4,5 та призвела до кардіотоксичності ліків як основної причини виходу з ринку6.
Протягом останнього десятиліття вісім некардіологічних препаратів було вилучено з клінічного застосування, оскільки вони викликають подовження інтервалу QT, що призводить до шлуночкових аритмій та раптової смерті7. Таким чином, існує зростаюча потреба в надійних доклінічних стратегіях скринінгу для оцінки серцево-судинної ефективності та токсичності. Нещодавнє використання кардіоміоцитів, отриманих з плюрипотентних стовбурових клітин людини (hiPS-CM), у скринінгу ліків та тестуванні на токсичність забезпечує часткове вирішення цієї проблеми. Однак, незріла природа hiPS-CM та відсутність багатоклітинної складності серцевої тканини є основними обмеженнями цього методу. Недавні дослідження показали, що це обмеження можна частково подолати, використовуючи ранні hiPS-CM для формування гідрогелів серцевої тканини невдовзі після початку спонтанних скорочень та поступово збільшуючи електричну стимуляцію з часом. Однак, цим мікротканинам hiPS-CM бракує зрілих електрофізіологічних та скоротливих властивостей дорослого міокарда. Крім того, серцева тканина людини має більш складну структуру, що складається з гетерогенної суміші різних типів клітин, включаючи ендотеліальні клітини, нейрони та стромальні фібробласти, з'єднані між собою специфічними наборами білків позаклітинного матриксу. Така гетерогенність популяцій некардіоміоцитарних клітин11,12,13 у серці дорослих ссавців є основною перешкодою для моделювання серцевої тканини з використанням окремих типів клітин. Ці основні обмеження підкреслюють важливість розробки методів культивування інтактної тканини міокарда за фізіологічних та патологічних умов.
Культивовані тонкі (300 мкм) зрізи людського серця виявилися перспективною моделлю інтактного людського міокарда. Цей метод забезпечує доступ до повної тривимірної багатоклітинної системи, подібної до тканини людського серця. Однак до 2019 року використання культивованих зрізів серця було обмежене коротким (24 години) терміном виживання культури. Це пов'язано з низкою факторів, включаючи відсутність фізико-механічного розтягування, поверхню розділу повітря-рідина та використання простих середовищ, які не задовольняють потреби серцевої тканини. У 2019 році кілька дослідницьких груп продемонстрували, що включення механічних факторів до систем культивування тканин серця може продовжити термін життя культури, покращити експресію серцевих функцій та імітувати серцеву патологію. Два елегантних дослідження 17 та 18 показують, що одноосьове механічне навантаження позитивно впливає на фенотип серця під час культивування. Однак у цих дослідженнях не використовувалося динамічне тривимірне фізико-механічне навантаження серцевого циклу, оскільки зрізи серця навантажувалися або ізометричними силами розтягування 17, або лінійним ауксотонічним навантаженням 18. Ці методи розтягування тканин призвели до пригнічення багатьох серцевих генів або надмірної експресії генів, пов'язаних з аномальними реакціями розтягування. Зокрема, Пітуліс та ін.19 розробили динамічну ванну для культивування зрізів серця для реконструкції серцевого циклу з використанням зворотного зв'язку за силовими датчиками та приводів натягу. Хоча ця система дозволяє проводити точніше моделювання серцевого циклу in vitro, складність та низька пропускна здатність методу обмежують застосування цієї системи. Наша лабораторія нещодавно розробила спрощену систему культивування з використанням електричної стимуляції та оптимізованого середовища для підтримки життєздатності зрізів тканини серця свині та людини до 6 днів20,21.
У цій статті ми описуємо модель культури серцевої тканини (КТКМ) з використанням зрізів серця свині, яка включає гуморальні сигнали для відтворення тривимірної фізіології серця та патофізіологічного розтягнення протягом серцевого циклу. Ця КТКМ може підвищити точність доклінічного прогнозування лікарських засобів до рівня, який ніколи раніше не був досягнутий, забезпечуючи економічно ефективну серцеву систему середньої пропускної здатності, яка імітує фізіологію/патофізіологію серця ссавців для доклінічного тестування лікарських засобів.
Гемодинамічні механічні сигнали відіграють вирішальну роль у підтримці функції кардіоміоцитів in vitro 22,23,24. У цій роботі ми розробили CTCM (рис. 1a), який може імітувати серцеве середовище дорослої людини, індукуючи як електричну, так і механічну стимуляцію на фізіологічних частотах (1,2 Гц, 72 удари на хвилину). Щоб уникнути надмірного розтягування тканин під час діастоли, для збільшення розміру тканини на 25% було використано 3D-друкарський пристрій (рис. 1b). Електрична стимуляція, індукована системою C-PACE, була запланована на 100 мс до систоли за допомогою системи збору даних для повного відтворення серцевого циклу. Система культивування тканин використовує програмований пневматичний привід (LB Engineering, Німеччина) для циклічного розширення гнучкої силіконової мембрани, що викликає розширення зрізів серця у верхній камері. Система була підключена до зовнішньої повітряної лінії через датчик тиску, що дозволяло точно регулювати тиск (± 1 мм рт. ст.) та час (± 1 мс) (рис. 1c).
a Прикріпіть зріз тканини до 7-міліметрового опорного кільця, показаного синім кольором, всередині культуральної камери пристрою. Культуральна камера відділена від повітряної камери тонкою гнучкою силіконовою мембраною. Помістіть прокладку між кожною камерою, щоб запобігти протіканню. Кришка пристрою містить графітові електроди, що забезпечують електричну стимуляцію. b Схематичне зображення великого тканинного пристрою, напрямного кільця та опорного кільця. Зрізи тканин (коричневі) розміщуються на великому пристрої, а напрямне кільце розміщується в пазу на зовнішньому краю пристрою. Використовуючи напрямну, обережно розмістіть опорне кільце, покрите тканинним акриловим клеєм, на зріз серцевої тканини. c Графік, що показує час електричної стимуляції як функцію тиску в повітряній камері, керованого програмованим пневматичним приводом (PPD). Для синхронізації електричної стимуляції за допомогою датчиків тиску використовувався пристрій збору даних. Коли тиск у культуральній камері досягає встановленого порогу, імпульсний сигнал надсилається на C-PACE-EM для запуску електричної стимуляції. d Зображення чотирьох CTCM, розміщених на полиці інкубатора. Чотири пристрої підключені до одного PPD через пневматичний контур, а датчики тиску вставлені в гемостатичний клапан для контролю тиску в пневматичному контурі. Кожен пристрій містить шість зрізів тканини.
Використовуючи один пневматичний привід, ми змогли керувати 4 пристроями CTCM, кожен з яких міг утримувати 6 зрізів тканини (рис. 1d). У CTCM тиск повітря в повітряній камері перетворюється на синхронний тиск у рідинній камері та індукує фізіологічне розширення зрізу серця (рис. 2a та додатковий фільм 1). Оцінка розтягнення тканини при тиску 80 мм рт. ст. показала розтягнення зрізів тканини на 25% (рис. 2b). Було показано, що цей відсоток розтягнення відповідає фізіологічній довжині саркомера 2,2–2,3 мкм для нормальної скоротливості зрізу серця17,19,25. Рух тканин оцінювали за допомогою спеціальних налаштувань камери (додатковий рисунок 1). Амплітуда та швидкість руху тканини (рис. 2c, d) відповідали розтягуванню під час серцевого циклу та часу під час систоли та діастоли (рис. 2b). Розтягнення та швидкість серцевої тканини під час скорочення та розслаблення залишалися постійними протягом 12 днів у культурі (рис. 2f). Щоб оцінити вплив електричної стимуляції на скоротливість під час культивування, ми розробили метод визначення активної деформації за допомогою алгоритму затінення (Додатковий рис. 2a,b) і змогли розрізнити деформації з електричною стимуляцією та без неї. Той самий зріз серця (рис. 2f). У рухомій області розрізу (R6-9) напруга під час електричної стимуляції була на 20% вищою, ніж за відсутності електричної стимуляції, що вказує на внесок електричної стимуляції в скоротливу функцію.
Типові криві вимірювань тиску в повітряній камері, тиску в рідинній камері та руху тканин підтверджують, що тиск у камері змінює тиск у рідинній камері, викликаючи відповідний рух зрізу тканини. b Типові криві відсотка розтягнення (синій) зрізів тканини, що відповідають відсотку розтягнення (помаранчевий). c Виміряний рух серцевого зрізу узгоджується з виміряною швидкістю руху. (d) Типові траєкторії циклічного руху (синя лінія) та швидкості (помаранчева пунктирна лінія) у зрізі серця. e Кількісна оцінка часу циклу (n = 19 зрізів на групу, від різних свиней), часу скорочення (n = 19 зрізів на групу), часу релаксації (n = 19 зрізів на групу, від різних свиней), руху тканин (n = 25 зрізів)/група від різних свиней, пікової систолічної швидкості (n = 24(D0), 25(D12) зрізів/група від різних свиней) та пікової швидкості релаксації (n = 24(D0), 25(D12) зрізів/група від різних свиней). Двосторонній t-критерій Стьюдента не показав суттєвої різниці в жодному параметрі. f Репрезентативні сліди аналізу деформації зрізів тканин з (червоним) та без (синім) електричної стимуляції, десять регіональних ділянок зрізів тканин з одного й того ж зрізу. Нижні панелі показують кількісну оцінку відсоткової різниці в деформації в зрізах тканин з та без електричної стимуляції в десяти ділянках з різних зрізів. (n = 8 зрізів/група від різних свиней, проведено двосторонній t-критерій Стьюдента; ****p < 0,0001, **p < 0,01, *p < 0,05). (n = 8 зрізів/група від різних свиней, проведено двосторонній t-критерій Стьюдента; ****p < 0,0001, **p < 0,01, *p < 0,05). (n = 8 срезів/групу від різних свиней, проводиться двосторонній t-критерій Стюдента; ****p<0,0001, **p<0,01, *p<0,05). (n = 8 зрізів/група від різних свиней, двосторонній t-критерій Стьюдента; ****p<0,0001, **p<0,01, *p<0,05). （n = 8 片/组，来自不同的猪，进行双尾学生t 检验；****p < 0,0001，**p < 0,01，*p < 0,05）. （n = 8 片/组，来自不同的猪，进行双尾学生t 检验；****p < 0,0001，**p < 0,01，*p < 0,05）. (n = 8 срезів/групу, від різних свиней, двосторонній критерій Стюдента; ****p <0,0001, **p <0,01, *p <0,05). (n = 8 зрізів/група, від різних свиней, двосторонній t-критерій Стьюдента; ****p<0,0001, **p<0,01, *p<0,05).Смуги похибки представляють середнє значення ± стандартне відхилення.
У нашій попередній системі статичної біоміметичної культивування зрізів серця [20, 21] ми підтримували життєздатність, функцію та структурну цілісність зрізів серця протягом 6 днів, застосовуючи електричну стимуляцію та оптимізуючи склад середовища. Однак через 10 днів ці показники різко знизилися. Ми будемо використовувати зрізи, культивовані в нашій попередній системі статичної біоміметичної культивування 20, 21 контрольних умовах (Ctrl), і ми будемо використовувати наше раніше оптимізоване середовище як умови MC та культивування за одночасної механічної та електричної стимуляції (CTCM). Спочатку ми визначили, що механічна стимуляція без електричної стимуляції була недостатньою для підтримки життєздатності тканини протягом 6 днів (Додатковий рис. 3a,b). Цікаво, що з впровадженням фізико-механічної та електричної стимуляції за допомогою STCM життєздатність 12-денних зрізів серця залишалася такою ж, як у свіжих зрізах серця в умовах MS, але не в умовах Ctrl, як показав MTT-аналіз (рис. 1). 3a). Це свідчить про те, що механічна стимуляція та моделювання серцевого циклу можуть підтримувати життєздатність зрізів тканини вдвічі довше, ніж повідомлялося в нашій попередній системі статичної культивування. Однак, оцінка структурної цілісності зрізів тканин шляхом імуномаркування серцевого тропоніну Т та коннексину 43 показала, що експресія коннексину 43 була значно вищою в тканинах серцевого міхура на 12-й день, ніж у контрольних групах того ж дня. Однак рівномірна експресія коннексину 43 та формування Z-подібних дисків не були повністю збережені (рис. 3b). Ми використовуємо платформу штучного інтелекту (ШІ) для кількісної оцінки структурної цілісності тканин26, конвеєр глибокого навчання на основі зображень, що базується на фарбуванні тропоніном-Т та коннексином43, для автоматичної кількісної оцінки структурної цілісності та флуоресценції зрізів серця з точки зору сили локалізації. Цей метод використовує згорткову нейронну мережу (CNN) та платформу глибокого навчання для надійної кількісної оцінки структурної цілісності серцевої тканини автоматизованим та неупередженим способом, як описано в посиланні26. Тканина серцевого міхура показала покращену структурну подібність до 0-го дня порівняно зі статичними контрольними зрізами. Крім того, трихромне фарбування Массона виявило значно нижчий відсоток фіброзу в умовах МС порівняно з контрольними умовами на 12-й день культивування (рис. 3c). Хоча CTCM підвищила життєздатність зрізів тканини серця на 12-й день до рівня, подібного до рівня свіжої тканини серця, вона суттєво не покращила структурну цілісність зрізів серця.
Гістограма показує кількісну оцінку життєздатності MTT свіжих зрізів серця (D0) або культури зрізів серця протягом 12 днів або у статичній культурі (D12 Ctrl), або в CTCM (D12 MC) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl), 12 (D12 MC) зрізів/група від різних свиней, проведено однофакторний дисперсійний аналіз (ANOVA); ####p < 0,0001 порівняно з D0 та **p < 0,01 порівняно з D12 Ctrl). Гістограма показує кількісну оцінку життєздатності MTT свіжих зрізів серця (D0) або культури зрізів серця протягом 12 днів або у статичній культурі (D12 Ctrl), або в CTCM (D12 MC) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl), 12 (D12 MC) зрізів/група від різних свиней, проведено однофакторний дисперсійний аналіз (ANOVA); ####p < 0,0001 порівняно з D0 та **p < 0,01 порівняно з D12 Ctrl).Гістограма показує кількісну оцінку життєздатності свіжих зрізів серця MTT (D0) або культивування зрізів серця протягом 12 днів у статичній культурі (D12 контроль) або CTCM (D12 MC) (n = 18 (D0), 15 (D12 контроль).) ), 12 (D12 MC) зрізів/група від різних свиней, проводиться однофакторний ANOVA-тест;####p < 0,0001 у порівнянні з D0 і **p < 0,01 у порівнянні з D12 Ctrl). ####p < 0,0001 порівняно з D0 та **p < 0,01 порівняно з D12 (контроль). a 条形图显示在静态培养(D12 Ctrl) 或CTCM (D12 MC) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl) 中新鲜心脏切片(D0)或心脏切片培养12 天的MTT 活力的量化)，来自不同猪的12 (D12 MC) 切片/组，进行单向ANOVA测试；与D0 相比，####p < 0,0001，与D12 Ctrl 相比，**p < 0,01)。 a 条形图显示在静态培养(D12 Ctrl) 或CTCM (D12 MC) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl) 中新鲜心脏切片(D0) ，来自不同猪的12 (D12 MC) 切片/组，进行单向 ANOVA 测试；与D0 相比，####p < 0,0001，与D12 Ctrl相比，**p。)гістограма, що показує кількісну оцінку життєздатності MTT у свіжих зрізах серця (D0) або зрізах серця, культивованих протягом 12 днів у статичній культурі (D12 контроль) або CTCM (D12 MC) (n = 18 (D0), 15 (D12 контроль)), 12 (D12 MC) зрізів/група від різних свиней, однофакторний ANOVA-тест;####p < 0,0001 у порівнянні з D0, **p < 0,01 у порівнянні з D12 Ctrl). ####p < 0,0001 порівняно з D0, **p < 0,01 порівняно з D12 (контроль).b Тропонін-T (зелений), конексин 43 (червоний) та DAPI (синій) у свіжовиділених зрізах серця (D0) або зрізах серця, культивованих у статичних умовах (Ctrl) або умовах CTCM (MC) протягом 12 днів) репрезентативних імунофлуоресцентних зображень (шкала порожнього зразка = 100 мкм). Кількісне визначення структурної цілісності тканини серця за допомогою штучного інтелекту (n = 7 (D0), 7 (D12 Ctrl), 5 (D12 MC) зрізів/групи від різних свиней, проведено однофакторний дисперсійний аналіз (ANOVA); ####p < 0,0001 порівняно з D0 та ****p < 0,0001 порівняно з D12 Ctrl). Кількісне визначення структурної цілісності тканини серця за допомогою штучного інтелекту (n = 7 (D0), 7 (D12 Ctrl), 5 (D12 MC) зрізів/групи кожного від різних свиней, проведено однофакторний дисперсійний аналіз (ANOVA); ####p < 0,0001 порівняно з D0 та ****p < 0,0001 порівняно з D12 Ctrl). Количественна оцінка структурної цілісності серцевої тканини штучного інтелекту (n = 7 (D0), 7 (D12 Ctrl), 5 (D12 MC) зрізів/груп від різних свиней, проводиться однофакторний тест ANOVA; ####p < 0,0001 у порівнянні з D0 і ****p < 0,0001 у порівнянні з D12 Ctrl). Кількісна оцінка структурної цілісності серцевої тканини за допомогою штучного інтелекту (n = 7 (D0), 7 (D12 Ctrl), 5 (D12 MC) зрізів/груп від різних свиней, проведено однофакторний дисперсійний аналіз (ANOVA); ####p < 0,0001 порівняно з D0 та ****p < 0,0001 порівняно з D12 Ctrl).人工智能量化心脏组织结构完整性（n = 7 (D0), 7 (D12 Ctrl), 5 (D12 MC) зрізів/група кожного з різних свиней, односторонній тест ANOVA;####p < 0,0001 与D0相比，****p < 0,0001 与D12 Ctrl 相比）。人工智能量化心脏组织结构完整性（n = 7 (D0), 7 (D12 Ctrl), 5 (D12 MC) зрізів/груп кожного з різних свиней, односторонній тест ANOVA;####p < 0,0001与D0相比，****p < 0,0001 与D12 Ctrl 相比）。 Іскусственний інтелект для кількісної оцінки структурної цілісності серцевої тканини (n = 7 (D0), 7 (D12 Ctrl), 5 (D12 MC) зрізів/групи кожної з різних свиней, односторонній тест ANOVA; ####p <0,0001 проти D0 Для порівняння ****p < 0,0001 у порівнянні з D12 Ctrl). Штучний інтелект для кількісної оцінки структурної цілісності серцевої тканини (n = 7 (D0), 7 (D12 Ctrl), 5 (D12 MC) зрізів/групи кожної з різних свиней, однофакторний дисперсійний аналіз; ####p<0,0001 проти .D0 Для порівняння ****p < 0,0001 порівняно з D12 Ctrl). c Репрезентативні зображення (ліворуч) та кількісна оцінка (праворуч) для зрізів серця, забарвлених трихромним барвником Массона (Scale gole = 500 мкм) (n = 10 зрізів/група, кожен від різних свиней, проведено однофакторний дисперсійний аналіз (ANOVA); ####p < 0,0001 порівняно з D0 та ***p < 0,001 порівняно з D12 Ctrl). c Репрезентативні зображення (ліворуч) та кількісна оцінка (праворуч) для зрізів серця, забарвлених трихромним барвником Массона (Scale gole = 500 мкм) (n = 10 зрізів/група кожного від різних свиней, проведено однофакторний дисперсійний аналіз (ANOVA); #### p < 0,0001 порівняно з D0 та ***p < 0,001 порівняно з D12 Ctrl). c Репрезентативні зображення (зрізи) і кількісна оцінка (справа) зрізів серця, прикрашених трихромним красителем Массона (масштаб без покриття = 500 мкм) (n = 10 зрізів/групу від різних свиней, виконується односторонній тест ANOVA; #### p < 0,0001 у порівнянні з D0 і ***p < 0,001 у порівнянні з D12 Ctrl). c Репрезентативні зображення (ліворуч) та кількісна оцінка (праворуч) зрізів серця, забарвлених трихромним барвником Массона (масштаб без покриття = 500 мкм) (n = 10 зрізів/група від різних свиней, проведено однофакторний дисперсійний аналіз (ANOVA); #### p < 0,0001 порівняно з D0 та ***p < 0,001 порівняно з D12 Ctrl). c 用Masson 三色染料染色的心脏切片的代表性图像（左）和量化（右）（裸尺度= 500 мкм）（n = 10 个切片/组，每组来自不同的猪；进行单向 ANOVA 测试；#### p < 0,0001 与D0 相比，***p < 0,001 与D12 Ctrl相比）。 C 用 masson 三 色 染料 的 心脏 切片 的 代表性 （左 左） 量化 （右） 裸尺度 裸尺度 裸尺度裸尺度 = 500 мкм） （n = 10 个 切片 组 每 组 来自 不同 猪 ， 进行 单向 单向 Anova 测试；#### p < 0,0001 与D0 相比，***p < 0,001 与D12 Ctrl 相比）。 c Репрезентативні зображення (зрізи) і кількісний аналіз (справа) зрізів серця, окрашених трихромним красителем Массона (чиста шкала = 500 мкм) (n = 10 зрізів/група, кожна від іншої свині, протестовано за допомогою однофакторного дисперсійного аналізу ;### #p < 0,0001 у порівнянні з D0, ***p < 0,001 у порівнянні з D12 Ctrl). c Репрезентативні зображення (ліворуч) та кількісна оцінка (праворуч) зрізів серця, забарвлених трихромним барвником Массона (холостий проба = 500 мкм) (n = 10 зрізів/група, кожен від різної свині, перевірено однофакторним дисперсійним аналізом;### # p < 0,0001 порівняно з D0, ***p < 0,001 порівняно з D12 Ctrl).Смуги похибки представляють середнє значення ± стандартне відхилення.
Ми висунули гіпотезу, що додавання малих молекул до культурального середовища може покращити цілісність кардіоміоцитів та зменшити розвиток фіброзу під час культивування CTCM. Тому ми провели скринінг на малі молекули, використовуючи наші статичні контрольні культури20,21 через невелику кількість факторів, що впливають на результат. Для цього скринінгу були обрані дексаметазон (Dex), трийодтиронін (T3) та SB431542 (SB). Ці малі молекули раніше використовувалися в культурах hiPSC-CM для індукції дозрівання кардіоміоцитів шляхом збільшення довжини саркомерів, Т-трубочок та швидкості провідності. Крім того, відомо, що як Dex (глюкокортикоїд), так і SB пригнічують запалення29,30. Тому ми перевірили, чи покращить включення однієї або комбінації цих малих молекул структурну цілісність зрізів серця. Для початкового скринінгу дозу кожної сполуки було обрано на основі концентрацій, які зазвичай використовуються в моделях клітинних культур (1 мкМ Dex27, 100 нМ T327 та 2,5 мкМ SB31). Після 12 днів культивування комбінація T3 та Dex призвела до оптимальної структурної цілісності кардіоміоцитів та мінімального фіброзного ремоделювання (Додаткові рисунки 4 та 5). Крім того, використання подвійних або вдвічі більших концентрацій T3 та Dex мало шкідливий вплив порівняно з нормальними концентраціями (Додатковий рис. 6a,b).
Після початкового скринінгу ми провели порівняння 4 умов культивування (Рисунок 4a): Ctrl: зрізи серця, культивовані в нашому раніше описаному статичному культивуванні з використанням нашого оптимізованого середовища; 20.21 TD: T3 та Ctrl з додаванням дексу в середу; MC: зрізи серця, культивовані в CTCM з використанням нашого раніше оптимізованого середовища; та MT: CTCM з додаванням T3 та дексу до середовища. Після 12 днів культивування життєздатність тканин MS та MT залишалася такою ж, як у свіжих тканинах, оцінених за допомогою MTT-аналізу (Рис. 4b). Цікаво, що додавання T3 та дексу до трансвертинальних культур (TD) не призвело до значного покращення життєздатності порівняно з умовами Ctrl, що вказує на важливу роль механічної стимуляції у підтримці життєздатності зрізів серця.
Схема експериментального планування, що зображує чотири умови культивування, що використовуються для оцінки впливу механічної стимуляції та додавання T3/Dex на середовище протягом 12 днів. b Гістограма показує кількісну оцінку життєздатності через 12 днів після культивування за всіх 4 умов культивування (Ctrl, TD, MC та MT) порівняно зі свіжими зрізами серця (D0) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl, D12 TD та D12 MT), 12 (D12 MC) зрізів/група від різних свиней, проведено однофакторний дисперсійний аналіз (ANOVA); ####p < 0,0001, ###p < 0,001 порівняно з D0 та **p < 0,01 порівняно з D12 Ctrl). b Гістограма показує кількісну оцінку життєздатності через 12 днів після культивування за всіх 4 умов культивування (Ctrl, TD, MC та MT) порівняно зі свіжими зрізами серця (D0) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl, D12 TD та D12 MT), 12 (D12 MC) зрізів/група від різних свиней, проведено однофакторний дисперсійний аналіз (ANOVA); ####p < 0,0001, ###p < 0,001 порівняно з D0 та **p < 0,01 порівняно з D12 ctrl). b Гістограма показує достатню оцінку працездатності через 12 днів після культивування у всіх 4 умовах культивування (контроль, TD, MC і MT) у порівнянні зі свіжими зрізами серця (D0) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl, D12 TD і D12 MT), 12 (D12 MC) срезів/групу від різних свиней, проводиться односторонній тест ANOVA; ####p < 0,0001, ###p < 0,001 у порівнянні з D0 і **p < 0,01 у порівнянні з D12 Ctrl). b Гістограма показує кількісну оцінку життєздатності через 12 днів після культивування за всіх 4 умов культивування (контроль, TD, MC та MT) порівняно зі свіжими зрізами серця (D0) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl, D12 TD та D12 MT), 12 (D12 MC) зрізів/група від різних свиней, однофакторний дисперсійний аналіз (ANOVA); ####p < 0,0001, ###p < 0,001 проти D0 та **p < 0,01 порівняно з D12 Ctrl). b 条形图显示所有4 种培养条件（Ctrl、TD、MC 和MT）与新鲜心脏切片(D0) (n = 18 (D0)、15 (D12 Ctrl、D12 TD)和D12 MT), 来自不同猪的12 (D12 MC) 切片/组，进行单向 ANOVA 测试；####p < 0,0001，###p < 0,001 与D0相比，**p < 0,01 与D12控制）.b 4 12 (D12 MC) b Гістограма, що показує всі 4 умови культивування (контроль, TD, MC і MT) у порівнянні зі свіжими зрізами серця (D0) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl, D12 TD і D12 MT), від різних свиней 12 (D12 MC) срези/група, односторонній тест ANOVA; ####p <0,0001, ###p <0,001 у порівнянні з D0, **p <0,01 у порівнянні з контролем D12). b Гістограма, що показує всі 4 умови культивування (контроль, TD, MC та MT) порівняно зі свіжими зрізами серця (D0) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl, D12 TD та D12 MT), від різних свиней 12 (D12 MC) зрізів/група, однофакторний дисперсійний аналіз (ANOVA); ####p<0,0001, ###p<0,001 проти D0, **p<0,01 проти контролю D12). c Гістограма показує кількісну оцінку потоку глюкози через 12 днів після культивування за всіх 4 умов культивування (Ctrl, TD, MC та MT) порівняно зі свіжими зрізами серця (D0) (n = 6 зрізів/група від різних свиней, проведено однофакторний дисперсійний аналіз (ANOVA); ###p < 0,001 порівняно з D0 та ***p < 0,001 порівняно з D12 Ctrl). c Гістограма показує кількісну оцінку потоку глюкози через 12 днів після культивування за всіх 4 умов культивування (Ctrl, TD, MC та MT) порівняно зі свіжими зрізами серця (D0) (n = 6 зрізів/група від різних свиней, проведено однофакторний дисперсійний аналіз (ANOVA); ###p < 0,001 порівняно з D0 та ***p < 0,001 порівняно з D12 Ctrl). c Гістограма показує кількісну оцінку потоку глюкози через 12 днів після культивування у всіх 4 умовах культивування (контроль, TD, MC і MT) у порівнянні зі свіжими зрізами серця (D0) (n = 6 зрізів/групу від різних свиней, односторонній Виконується тест ANOVA; ###p < 0,001 у порівнянні з D0 і ***p < 0,001 у порівнянні з D12 Ctrl). Гістограма показує кількісну оцінку потоку глюкози через 12 днів після культивування за всіх 4 умов культивування (контроль, TD, MC та MT) порівняно зі свіжими зрізами серця (D0) (n = 6 зрізів/група від різних свиней, проведено однофакторний дисперсійний аналіз; ###p < 0,001 порівняно з D0 та ***p < 0,001 порівняно з D12 Ctrl). c 条形图显示所有4 种培养条件（Ctrl、TD、MC 和MT）与新鲜心脏切片(D0) 相比，培养后12天的葡萄糖通量定量（n = 6 片/组，来自不同猪，单向执行ANOVA 测试；###p < 0,001，与D0相比，***p < 0,001 与D12 Ctrl 相比）。 C 条形图 显示 所有 4 种 条件 （（ctrl 、 td 、 mc 和 mt） 新鲜 心脏 切片 切片 切片 相比 ，培养 后 后 12 天 的 通量 定量 （n = 6 片/组 ， 来自 猪 ， ， ， ， ， ， ， ， 猪猪单向执行ANOVA 测试；###p < 0,001，与D0 相比，***p < 0,001 与D12 Ctrl 相比）。 c Гістограма, що показує кількісну оцінку потоку глюкози через 12 днів після культивування для всіх 4 умов культивування (контроль, TD, MC і MT) у порівнянні зі свіжими зрізами серця (D0) (n = 6 зрізів/група, від різних свиней, односторонній Були проведені тести ANOVA; ###p < 0,001 у порівнянні з D0, ***p < 0,001 у порівнянні з D12 (контроль). c Гістограма, що показує кількісну оцінку потоку глюкози через 12 днів після культивування для всіх 4 умов культивування (контроль, TD, MC та MT) порівняно зі свіжими зрізами серця (D0) (n = 6 зрізів/група, від різних свиней, односторонній аналіз). Чи були проведені дисперсійні аналізи (ANOVA), ###p < 0,001 порівняно з D0, ***p < 0,001 порівняно з D12 (контроль).d Діаграми аналізу штамів свіжих (синій), тканин 12-го дня середньої ембріональної тканини (зелений) та 12-го дня середньої ембріональної тканини (червоний) у десяти точках регіональних зрізів тканини (n = 4 зрізи/група, однофакторний дисперсійний аналіз; суттєвої різниці між групами не було). e Діаграма «Вулкан», що показує диференційно експресовані гени у свіжих зрізах серця (D0) порівняно зі зрізами серця, культивованими за статичних умов (Ctrl) або за умов середньої ембріональної тканини (MT) протягом 10-12 днів. f Теплова карта генів саркомерів для зрізів серця, культивованих за кожних умов культивування. Смуги похибки представляють середнє значення ± стандартне відхилення.
Метаболічна залежність від переходу від окислення жирних кислот до гліколізу є ознакою дедиференціації кардіоміоцитів. Незрілі кардіоміоцити переважно використовують глюкозу для виробництва АТФ і мають гіпопластичні мітохондрії з невеликою кількістю крист5,32. Аналіз утилізації глюкози показав, що в умовах MC та MT утилізація глюкози була подібною до такої в тканинах 0-го дня (Рисунок 4c). Однак зразки Ctrl показали значне збільшення утилізації глюкози порівняно зі свіжою тканиною. Це вказує на те, що комбінація CTCM та T3/Dex підвищує життєздатність тканин та зберігає метаболічний фенотип 12-денних культивованих зрізів серця. Крім того, аналіз штаму показав, що рівні штаму залишалися такими ж, як і у свіжій тканині серця протягом 12 днів в умовах MT та MS (Рис. 4d).
Щоб проаналізувати загальний вплив CTCM та T3/Dex на глобальний транскрипційний ландшафт тканини серцевих зрізів, ми виконали RNAseq на серцевих зрізах з усіх чотирьох різних умов культивування (Додаткові дані 1). Цікаво, що МТ-зрізи показали високу транскрипційну схожість зі свіжою тканиною серця, причому лише 16 диференційно експресувалися з 13 642 генів. Однак, як ми показали раніше, Ctrl-зрізи демонстрували 1229 диференційно експресованих генів після 10–12 днів культивування (рис. 4e). Ці дані були підтверджені за допомогою кПЛР у реальному часі (qRT-PCR) генів серця та фібробластів (Додаткові рис. 7a-c). Цікаво, що Ctrl-зрізи показали зниження регуляції серцевих та клітинних генів й активацію запальних генних програм. Ці дані свідчать про те, що дедиференціація, яка зазвичай відбувається після тривалого культивування, повністю послаблюється в умовах МТ (Додаткові рис. 8a,b). Ретельне вивчення генів саркомерів показало, що лише за умов MT зберігаються гени, що кодують саркомер (рис. 4f) та іонний канал (додатковий рис. 9), що захищає їх від пригнічення в умовах Ctrl, TD та MC. Ці дані демонструють, що при поєднанні механічної та гуморальної стимуляції (T3/Dex) транскриптом зрізу серця може залишатися подібним до свіжих зрізів серця після 12 днів культивування.
Ці транскрипційні дані підтверджуються тим фактом, що структурна цілісність кардіоміоцитів у зрізах серця найкраще зберігається в умовах MT протягом 12 днів, що показано інтактним та локалізованим конексином 43 (рис. 5a). Крім того, фіброз у зрізах серця в умовах MT був значно зменшеним порівняно з Ctrl та подібним до свіжих зрізів серця (рис. 5b). Ці дані демонструють, що поєднання механічної стимуляції та обробки T3/Dex ефективно зберігає структуру серця в зрізах серця в культурі.
a Репрезентативні імунофлуоресцентні зображення тропоніну-T (зелений), коннексину 43 (червоний) та DAPI (синій) у свіжовиділених зрізах серця (D0) або культивованих протягом 12 днів за всіх чотирьох умов культивування зрізів серця (масштабна шкала = 100 мкм). Кількісне визначення структурної цілісності тканини серця за допомогою штучного інтелекту (n = 7 (D0 та D12 Ctrl), 5 (D12 TD, D12 MC та D12 MT) зрізів/групи від різних свиней, проведено однофакторний дисперсійний аналіз (ANOVA); ####p < 0,0001 порівняно з D0 та *p < 0,05, або ****p < 0,0001 порівняно з D12 Ctrl). Кількісне визначення структурної цілісності тканини серця за допомогою штучного інтелекту (n = 7 (D0 та D12 Ctrl), 5 (D12 TD, D12 MC та D12 MT) зрізів/групи від різних свиней, проведено однофакторний дисперсійний аналіз (ANOVA); #### p < 0,0001 порівняно з D0 та *p < 0,05, або ****p < 0,0001 порівняно з D12 Ctrl). Количественна оцінка структурної цілісності тканини серця за допомогою штучного інтелекту (n = 7 (D0 і D12 Ctrl), 5 (D12 TD, D12 MC і D12 MT) зрізів/групи від різних свиней, проведений однофакторний тест ANOVA; #### p < 0,0001 у порівнянні з D0 і *p < 0,05 або ****p < 0,0001 у порівнянні з D12 Ctrl). Кількісна оцінка структурної цілісності тканини серця за допомогою штучного інтелекту (n = 7 (D0 та D12 Ctrl), 5 (D12 TD, D12 MC та D12 MT) зрізів/групи від різних свиней, проведено однофакторний дисперсійний аналіз (ANOVA); #### p < 0,0001 порівняно з D0 та *p < 0,05 або ****p < 0,0001 порівняно з D12 Ctrl).对不同猪的心脏组织结构完整性（n = 7（D0 和D12 Ctrl）、5（D12 TD、D12 MC 和D12 MT）切片/组）进行人工智能量化，进行单向ANOVA 测试；#### p < 0,0001 与D0 和*p < 0,05 相比，或****p < 0,0001 与D12 Ctrl 相比）。对 不同 猪 的 心脏 结构 完整性 （n = 7 （d0 和 d12 ctrl） （5 （d12 td 、 d12 mc 和 d12 mt） 组）人工 智能量 化 进行 单向 单向 单向 测试 ； ########## p < 0,0001 与D0 和*p < 0,05 相比，或****p < 0,0001 与D12 Ctrl 相比）。Кількісна оцінка структурної цілісності серцевої тканини за допомогою штучного інтелекту у різних свиней (n = 7 (D0 та D12 Ctrl), 5 (D12 TD, D12 MC та D12 MT) зрізів/група) за допомогою однофакторного ANOVA-тесту;#### p < 0,0001 у порівнянні з D0 і *p < 0,05 або ****p < 0,0001 у порівнянні з D12 Ctrl). #### p < 0,0001 порівняно з D0 та *p < 0,05 або ****p < 0,0001 порівняно з D12 (контроль). b Репрезентативні зображення та кількісна оцінка зрізів серця, забарвлених трихромним барвником Массона (масштабна шкала = 500 мкм) (n = 10 (D0, D12 Ctrl, D12 TD та D12 MC), 9 (D12 MT) зрізів/група від різних свиней, проведено однофакторний дисперсійний аналіз (ANOVA); ####p < 0,0001 порівняно з D0 та ***p < 0,001, або ****p < 0,0001 порівняно з D12 Ctrl). b Репрезентативні зображення та кількісна оцінка зрізів серця, забарвлених трихромним барвником Массона (масштабна шкала = 500 мкм) (n = 10 (D0, D12 Ctrl, D12 TD та D12 MC), 9 (D12 MT) зрізів/група від різних свиней, проведено однофакторний дисперсійний аналіз (ANOVA); ####p < 0,0001 порівняно з D0 та ***p < 0,001, або ****p < 0,0001 порівняно з D12 Ctrl). b Репрезентативні зображення та кількісна оцінка зрізів серця, прикрашених трихромним красителем Массона (масштабна лінія = 500 мкм) (n = 10 (D0, D12 Ctrl, D12 TD і D12 MC), 9 (D12 MT) зрізів/групи від різних свиней, виконується односторонній тест ANOVA; ####p < 0,0001 у порівнянні з D0 і ***p < 0,001 або ****p < 0,0001 у порівнянні з D12 Ctrl). b Репрезентативні зображення та кількісна оцінка зрізів серця, забарвлених трихромним барвником Массона (масштабна шкала = 500 мкм) (n = 10 (D0, D12 Ctrl, D12 TD та D12 MC), 9 (D12 MT) зрізів/група від різних свиней, проведені однофакторним дисперсійним аналізом; ####p < 0,0001 проти D0 та ***p < 0,001 або ****p < 0,0001 проти D12 Ctrl). b 用Masson 三色染料染色的心脏切片的代表性图像和量化（比例尺= 500 мкм）（n = 10（D0、D12 Ctrl、D12 TD 和D12 MC），来自不同猪的9 个（D12 MT）切片/组，进行单因素方差分析；####p < 0,0001与D0 相比，***p < 0,001，或****p < 0,0001 与D12 Ctrl 相比）。 b 用 masson 三 色 染料 的 心脏 切片 的 代表性 和 量化 （比例 尺 尺 尺 = 500 мкм） （n = 10 （d0 、 d12 ctrl 、 d12 td 和 d12 mc） 来自 不同 的 9 个 d12 mt 切片 切片 切片 切片 切片 切片 切片 切片切片 切片 切片 切片 切片 切片 切片 切片 切片 切片/组，进行单因素方差分析；####p < 0,0001与D0 相比，***p < 0,001，或****p < 0,0001 与D12 Ctrl 相比）。 b Репрезентативні зображення та кількісна оцінка зрізів серця, прикрашених трихромом Массона (масштабна лінія = 500 мкм) (n = 10 (D0, D12 Ctrl, D12 TD і D12 MC), 9 (D12 MT) зрізів від різних свиней / групи, один спосіб ANOVA; ####p < 0,0001 у порівнянні з D0, ***p < 0,001 або ****p < 0,0001 у порівнянні з D12 Ctrl). b Репрезентативні зображення та кількісна оцінка зрізів серця, забарвлених трихромом Массона (масштабна шкала = 500 мкм) (n = 10 (D0, D12 Ctrl, D12 TD та D12 MC), 9 (D12 MT) зрізів від різних свиней/групи, один метод ANOVA; ####p < 0,0001 порівняно з D0, ***p < 0,001 або ****p < 0,0001 порівняно з D12 Ctrl).Смуги похибки представляють середнє значення ± стандартне відхилення.
Зрештою, здатність КТКМ імітувати гіпертрофію серця оцінювали шляхом збільшення розтягнення серцевої тканини. У КТКМ піковий тиск у повітряній камері збільшився з 80 мм рт. ст. до 80 мм рт. ст. (нормальне розтягнення) аж до 140 мм рт. ст. (рис. 6a). Це відповідає збільшенню розтягнення на 32% (рис. 6b), яке раніше було показано як відповідний відсоток розтягнення, необхідний для досягнення зрізами серця довжини саркомера, подібної до тієї, що спостерігається при гіпертрофії. Розтягнення та швидкість серцевої тканини під час скорочення та розслаблення залишалися постійними протягом шести днів культивування (рис. 6c). Серцеву тканину з умов МТ піддавали нормальному розтягуванню (МТ (нормальне)) або надмірному розтягуванню (МТ (перерозтягнення)) протягом шести днів. Вже після чотирьох днів культивування рівень гіпертрофічного біомаркера NT-ProBNP був значно підвищений у середовищі в умовах МТ (перерозтягнення) порівняно з умовами МТ (нормальне) (рис. 7a). Крім того, після шести днів культивування розмір клітин у МТ (ОС) (рис. 7b) значно збільшився порівняно зі зрізами серця МТ (нормальний стан). Крім того, ядерна транслокація NFATC4 була значно збільшена в перерозтягнутих тканинах (рис. 7c). Ці результати показують прогресуючий розвиток патологічного ремоделювання після гіпердистензиї та підтверджують концепцію, що пристрій CTCM може бути використаний як платформа для вивчення сигналізації серцевої гіпертрофії, індукованої розтягненням.
Типові криві вимірювань тиску в повітряній камері, тиску в рідинній камері та руху тканини підтверджують, що тиск у камері змінює тиск у рідинній камері, викликаючи відповідний рух зрізу тканини. b Типові криві відсотка розтягування та швидкості розтягування для нормально розтягнутих (помаранчевий) та перерозтягнутих (синій) зрізів тканини. c Гістограма, що показує час циклу (n = 19 зрізів на групу, від різних свиней), час скорочення (n = 18-19 зрізів на групу, від різних свиней), час релаксації (n = 19 зрізів на групу, від різних свиней)), амплітуду руху тканини (n = 14 зрізів/група, від різних свиней), пікову систолічну швидкість (n = 14 зрізів/група, від різних свиней) та пікову швидкість релаксації (n = 14 (D0), 15 (D6) зрізів/груп) від різних свиней), двосторонній t-критерій Стьюдента не показав суттєвої різниці в жодному параметрі, що вказує на те, що ці параметри залишалися постійними протягом 6 днів культивування з перенапругою. Смуги похибки представляють середнє значення ± стандартне відхилення.
Кількісне визначення концентрації NT-ProBNP у культуральному середовищі зі зрізів серця, культивованих за умов нормального розтягування (Norm) або надмірного розтягування (OS) MT (n = 4 (D2 MTNorm), 3 (D2 MTOS, D4 MTNorm та D4 MTOS) зрізи/група від різних свиней, проведено двофакторний дисперсійний аналіз (ANOVA); **p < 0,01 порівняно з нормальним розтягуванням). Кількісне визначення концентрації NT-ProBNP у культуральному середовищі зі зрізів серця, культивованих за умов нормального розтягування (Norm) або надмірного розтягування (OS) MT (n ​​= 4 (D2 MTNorm), 3 (D2 MTOS, D4 MTNorm та D4 MTOS) зрізи/група від різних свиней, проведено двофакторний дисперсійний аналіз (ANOVA); **p < 0,01 порівняно з нормальним розтягуванням).Кількісна гістограма концентрації NT-ProBNP у культуральному середовищі зі зрізів серця, культивованих за умов нормального розтягування (норма) або надмірного розтягування (OS) МТ (n = 4 (D2 МТнорм), 3 (D2 МТНОРМ, D4 МТНОРМ та D4 МТНОРМ) зрізи/група від різних свиней, проведено двофакторний дисперсійний аналіз;**p < 0,01 у порівнянні з нормальним розтяжінням). **p < 0,01 порівняно з нормальним розтягуванням). a 在MT 正常拉伸(Norm) 或过度拉伸(OS) 条件下培养的心脏切片培养基中NT-ProBNP浓度的条形图量化（n = 4 (D2 MTNorm)、3（D2 MTOS、D4 MTNorm 和D4 MTOS）来自不同猪的切片/组，进行双向方差分析；**与正常拉伸相比，p < 0,01). a Кількісне визначення концентрації NT-ProBNP у зрізах серця, культивованих за умов нормального розтягування МТ (Norm) або перерозтягнення (OS) (n = 4 (D2 MTNorm), 3 (D2 MTOS, D4 MTNorm和D4 MTOS) з різних猪的切片/组，可以双向方方发发动 **порівняно зі звичайним розтягуванням, p < 0,01).гістограма. Кількісне визначення концентрацій NT-ProBNP у зрізах серця, культивованих за умов нормального розтягнення МТ (норма) або надмірного розтягнення (ОС) (n = 4 (D2 МТнорм), 3 (D2 МТНОРМ, D4 МТНОРМ) та D4 МТОС) зрізи/група від різних свиней, двофакторний дисперсійний аналіз;**p < 0,01 у порівнянні з нормальним розтяжінням). **p < 0,01 порівняно з нормальним розтягуванням). b Репрезентативні зображення зрізів серця, забарвлених тропоніном-Т та WGA (ліворуч), та кількісне визначення розміру клітин (праворуч) (n = 330 (D6 MTOS), 369 (D6 MTNorm) клітин/група з 10 різних зрізів від різних свиней, проведено двосторонній t-критерій Стьюдента; ****p < 0,0001 порівняно з нормальним розтягненням). b Репрезентативні зображення зрізів серця, забарвлених тропоніном-Т та WGA (ліворуч), та кількісне визначення розміру клітин (праворуч) (n = 330 (D6 MTOS), 369 (D6 MTNorm) клітин/група з 10 різних зрізів від різних свиней, проведено двосторонній t-критерій Стьюдента; ****p < 0,0001 порівняно з нормальним розтягненням). b Репрезентативні зображення зрізів серця, окрашених тропоніном-Т і АЗП (слева) і кількісного визначення розміру клітин (справа) (n = 330 (D6 MTOS), 369 (D6 MTNorm) клітин/групи з 10 різних зрізів від різних свиней, два- проводиться хвостовий t-критерій Стюдента; ****p < 0,0001 порівняно з порівнянням з нормальним розтяжінням). b Репрезентативні зображення зрізів серця, забарвлених тропоніном-Т та AZP (ліворуч), та кількісне визначення розміру клітин (праворуч) (n = 330 (D6 MTOS), 369 (D6 MTNorm) клітин/група з 10 різних зрізів від різних свиней, було проведено двосторонній t-критерій Стьюдента; ****p < 0,0001 порівняно з нормальним штамом). b 用肌钙蛋白-T 和WGA（左）和细胞大小量化（右）染色的心脏切片的代表性图像（n = 330（D6 MTOS），来自不同猪的10 个不同切片的369（D6 MTNorm）细胞/组，两进行有尾学生t 检验；与正常拉伸相比；****p < 0,0001）。 b Репрезентативні зображення зрізів серця, забарвлених кальцареїном-T та WGA (ліворуч), та розмір клітин (праворуч) (n = 330 (D6 MTOS), 369 з 10 різних зрізів (D6 MTNorm)) Клітини/组, t-тест 两方法有尾学生, порівняно з нормальним розтягуванням, ****p < 0,0001). b Репрезентативні зображення зрізів серця, окрашених тропоніном-Т і АЗП (слева) і кількісна оцінка розміру клітин (справа) (n = 330 (D6 MTOS), 369 (D6 MTNorm) з 10 різних зрізів від різних свиней Клетки/групи, двосторонні критерії Стюдента; ****p < 0,0001 порівняно з нормальним розтяжінням). b Репрезентативні зображення зрізів серця, забарвлених тропоніном-Т та AZP (ліворуч), та кількісне визначення розміру клітин (праворуч) (n = 330 (D6 MTOS), 369 (D6 MTNorm) з 10 різних зрізів від різних свиней) Клітини/група, двосторонній критерій Стьюдента t; ****p < 0,0001 порівняно з нормальним штамом). c Репрезентативні зображення зрізів серця MTOS на 0-й та 6-й день, імуномічених для тропоніну-Т та NFATC4, та кількісне визначення транслокації NFATC4 до ядер CM (n = 4 (D0), 3 (D6 MTOS) зрізи/група від різних свиней, проведено двосторонній t-критерій Стьюдента; *p < 0,05). c Репрезентативні зображення зрізів серця MTOS на 0-й та 6-й день, імуномічених для тропоніну-T та NFATC4, та кількісне визначення транслокації NFATC4 до ядер кондиціонованих клітин (n = 4 (D0), 3 (D6 MTOS) зрізи/група від різних свиней, проведено двосторонній t-критерій Стьюдента; *p < 0,05). c Репрезентативні зображення для зрізів серця 0 і 6 днів MTOS, імуномечених для тропоніну-Т і NFATC4, і кількісна оцінка транслокації NFATC4 в ядра кавернозних клітин (n = 4 (D0), 3 (D6 MTOS) зрізів/групи від різних свиней, виконується за двостороннім t-критерієм Стюдента; *p < 0,05). c Репрезентативні зображення зрізів серця на 0 та 6 днях MTOS, імуномічених для тропоніну-T та NFATC4, та кількісне визначення транслокації NFATC4 у ядрі кавернозних клітин (n = 4 (D0), 3 (D6 MTOS) зрізи/група від різних свиней), виконане за двостороннім t-критерієм Стьюдента; *p < 0,05). c 用于肌钙蛋白-T 和NFATC4 免疫标记的第0 天和第6 天MTOS心脏切片的代表性图像，以及来自不同猪的NFATC4 易位至CM 细胞核的量化（n = 4 (D0)、3 (D6 MTOS)切片/组, 进行双尾学生t 检验；*p < 0,05)。 c Репрезентативні зображення кальцаніну-Т та NFATC4 імунологічного маркування 第0天和第6天MTOS зрізів серця та NFATC4 з різних NFATC4 易位至клітинного ядра的кількості化 (n = 4 (D0), 3 (D6 MTOS) 切礼/组,时间双尾学生et 电影；*p < 0,05). c Репрезентативні зображення зрізів серця MTOS на 0 і 6 днів для імуномаркування тропоніном-Т і NFATC4 і кількісна оцінка транслокації NFATC4 в ядра CM від різних свиней (n = 4 (D0), 3 (D6 MTOS) зріз/група, два хвостатий t-критерій Стюдента; *p < 0,05). c Репрезентативні зображення зрізів серця MTOS на 0-й та 6-й день для імуномаркування тропоніном-T та NFATC4 та кількісного визначення транслокації NFATC4 у ядрі CM у різних свиней (n = 4 (D0), 3 (D6 MTOS) зрізи/група, двосторонній t-критерій Стьюдента; *p < 0,05).Смуги похибок представляють середнє значення ± стандартне відхилення.
Трансляційні серцево-судинні дослідження вимагають клітинних моделей, які точно відтворюють серцеве середовище. У цьому дослідженні було розроблено та охарактеризовано пристрій CTCM, який може стимулювати надтонкі зрізи серця. Система CTCM включає фізіологічно синхронізовану електромеханічну стимуляцію та збагачення рідиною T3 та Dex. Коли зрізи серця свині піддавалися впливу цих факторів, їхня життєздатність, структурна цілісність, метаболічна активність та транскрипційна експресія залишалися такими ж, як у свіжій тканині серця після 12 днів культивування. Крім того, надмірне розтягнення серцевої тканини може спричинити гіпертрофію серця, спричинену гіперекстензиєю. Загалом, ці результати підтверджують критичну роль фізіологічних умов культивування у підтримці нормального серцевого фенотипу та забезпечують платформу для скринінгу ліків.
Багато факторів сприяють створенню оптимального середовища для функціонування та виживання кардіоміоцитів. Найбільш очевидні з цих факторів пов'язані з (1) міжклітинними взаємодіями, (2) електромеханічною стимуляцією, (3) гуморальними факторами та (4) метаболічними субстратами. Фізіологічні міжклітинні взаємодії вимагають складних тривимірних мереж кількох типів клітин, підтримуваних позаклітинним матриксом. Такі складні клітинні взаємодії важко реконструювати in vitro шляхом спільного культивування окремих типів клітин, але їх можна легко досягти, використовуючи органотипову природу зрізів серця.
Механічне розтягування та електрична стимуляція кардіоміоцитів мають вирішальне значення для підтримки серцевого фенотипу33,34,35. Хоча механічна стимуляція широко використовується для кондиціонування та дозрівання hiPSC-CM, нещодавно було проведено кілька елегантних досліджень, у яких було зроблено спробу механічної стимуляції зрізів серця в культурі з використанням одноосьового навантаження. Ці дослідження показують, що 2D одноосьове механічне навантаження позитивно впливає на фенотип серця під час культивування. У цих дослідженнях зрізи серця або навантажували ізометричними силами розтягування17, лінійним ауксотонічним навантаженням18, або серцевий цикл відтворювали за допомогою зворотного зв'язку від силових датчиків та приводів натягу. Однак ці методи використовують одноосьове розтягування тканин без оптимізації навколишнього середовища, що призводить до пригнічення багатьох серцевих генів або надмірної експресії генів, пов'язаних з аномальними реакціями розтягування. Описаний тут CTCM забезпечує 3D електромеханічний стимул, який імітує природний серцевий цикл з точки зору часу циклу та фізіологічного розтягування (25% розтягнення, 40% систоли, 60% діастоли та 72 удари на хвилину). Хоча цієї тривимірної механічної стимуляції самої по собі недостатньо для підтримки цілісності тканин, для адекватної підтримки життєздатності, функції та цілісності тканин необхідне поєднання гуморальної та механічної стимуляції за допомогою T3/Dex.
Гуморальні фактори відіграють важливу роль у модуляції фенотипу серця дорослого. Це було підкреслено в дослідженнях HiPS-CM, в яких T3 та Dex додавали до культурального середовища для прискорення дозрівання клітин. T3 може впливати на транспорт амінокислот, цукрів та кальцію через клітинні мембрани36. Крім того, T3 сприяє експресії MHC-α та зниженню регуляції MHC-β, що сприяє утворенню швидких міофібрил у зрілих кардіоміоцитах порівняно з повільними міофібрилами у фетальному CM. Дефіцит T3 у пацієнтів з гіпотиреозом призводить до втрати міофібрилярних тяжів та зниження швидкості розвитку тонусу37. Dex діє на глюкокортикоїдні рецептори та, як було показано, підвищує скоротливість міокарда в ізольованих перфузованих серцях;38 вважається, що це покращення пов'язане з впливом на надходження, кероване відкладенням кальцію (SOCE)39,40. Крім того, Dex зв'язується зі своїми рецепторами, викликаючи широку внутрішньоклітинну відповідь, яка пригнічує імунну функцію та запалення30.
Наші результати показують, що фізико-механічна стимуляція (МС) покращила загальну продуктивність культури порівняно з Ctrl, але не змогла зберегти життєздатність, структурну цілісність та експресію серцевих рецепторів протягом 12 днів культивування. Порівняно з Ctrl, додавання T3 та Dex до культур CTCM (MT) покращило життєздатність та підтримувало подібні профілі транскрипції, структурну цілісність та метаболічну активність зі свіжою тканиною серця протягом 12 днів. Крім того, контролюючи ступінь розтягнення тканини, за допомогою STCM була створена модель гіпертрофії серця, індукованої гіперекстензиєю, що ілюструє універсальність системи STCM. Слід зазначити, що хоча ремоделювання серця та фіброз зазвичай залучають інтактні органи, циркулюючі клітини яких можуть забезпечити відповідні цитокіни, а також фагоцитоз та інші фактори ремоделювання, ділянки серця все ще можуть імітувати фіброзний процес у відповідь на стрес та травму. Це було раніше оцінено на цій моделі зрізу серця. Слід зазначити, що параметри CTCM можна модулювати, змінюючи тиск/електричну амплітуду та частоту, щоб імітувати багато станів, таких як тахікардія, брадикардія та механічна підтримка кровообігу (механічно ненавантажене серце). Це робить систему середньої пропускної здатності для тестування на наркотики. Здатність CTCM моделювати гіпертрофію серця, викликану перенапруженням, відкриває шлях для тестування цієї системи для персоналізованої терапії. На завершення, це дослідження демонструє, що механічне розтягнення та гуморальна стимуляція є критично важливими для підтримки культури зрізів серцевої тканини.
Хоча представлені тут дані свідчать про те, що КТКМ є дуже перспективною платформою для моделювання інтактного міокарда, цей метод культивування має деякі обмеження. Основним обмеженням культивування КТКМ є те, що воно створює постійні динамічні механічні навантаження на зрізи, що виключає можливість активного моніторингу скорочень серцевих зрізів протягом кожного циклу. Крім того, через малий розмір серцевих зрізів (7 мм) можливість оцінки систолічної функції поза системами культивування з використанням традиційних датчиків сили обмежена. У цій роботі ми частково долаємо це обмеження, оцінюючи оптичну напругу як показник скоротливої ​​функції. Однак це обмеження вимагатиме подальшої роботи і може бути усунене в майбутньому шляхом впровадження методів оптичного моніторингу функції серцевих зрізів у культурі, таких як оптичне картування з використанням кальцію та напругочутливих барвників. Ще одним обмеженням КТКМ є те, що робоча модель не маніпулює фізіологічним навантаженням (попереднє та післянавантаження). У КТКМ тиск індукувався в протилежних напрямках для відтворення 25% фізіологічного розтягнення в діастолі (повне розтягнення) та систолі (тривалість скорочення під час електричної стимуляції) у дуже великих тканинах. Це обмеження слід усунути в майбутніх конструкціях КТКМ шляхом адекватного тиску на серцеву тканину з обох сторін та застосування точних співвідношень тиск-об'єм, які спостерігаються в камерах серця.
Ремоделювання, індуковане надмірним розтягненням, про яке повідомляється в цьому рукописі, обмежується імітацією сигналів гіпертрофічного гіперрозтягнення. Таким чином, ця модель може допомогти у вивченні сигналізації гіпертрофічного типу, індукованої розтягуванням, без необхідності гуморальних або нейронних факторів (які відсутні в цій системі). Необхідні подальші дослідження для збільшення множинності КТКМ, наприклад, спільне культивування з імунними клітинами, циркулюючими гуморальними факторами плазми та іннервація при спільному культивуванні з нейрональними клітинами покращать можливості моделювання захворювань за допомогою КТКМ.
У цьому дослідженні було використано тринадцять свиней. Усі процедури на тваринах проводилися відповідно до інституційних рекомендацій та були схвалені Комітетом з догляду за тваринами та їх використання Університету Луїсвілла. Дугу аорти пережимали, а серце перфузували 1 л стерильної кардіоплегії (110 мМ NaCl, 1,2 мМ CaCl2, 16 мМ KCl, 16 мМ MgCl2, 10 мМ NaHCO3, 5 Од/мл гепарину, pH до 7,4); Серця зберігали в крижаному кардіоплегічному розчині до транспортування до лабораторії на льоду, що зазвичай становить <10 хв. Серця зберігали в крижаному кардіоплегічному розчині до транспортування до лабораторії на льоду, що зазвичай становить <10 хв. серця зберігали в ледяному кардіоплегічному розчині до транспортування в лабораторію на льду, що зазвичай займає <10 хв. Серця зберігали в крижаному кардіоплегічному розчині до транспортування до лабораторії на льоду, що зазвичай займає <10 хвилин.将心脏保存在冰冷的心脏停搏液中，直到冰上运送到实验室，通常<10分钟。将心脏保存在冰冷的心脏停搏液中，直到冰上运送到实验室，通常<10分钟。 Тримайте серце в ледяній кардіоплегії до транспортування в лабораторію на льду, зазвичай <10 хв. Тримайте серця на крижаній кардіоплегії до транспортування до лабораторії на льоду, зазвичай <10 хв.
Пристрій CTCM було розроблено в програмному забезпеченні для автоматизованого проектування (CAD) SolidWorks. Культуральні камери, роздільники та повітряні камери виготовлені з прозорого акрилового пластику, обробленого на верстаті з ЧПК. Опорне кільце діаметром 7 мм виготовлене з поліетилену високої щільності (HDPE) у центрі та має паз для ущільнювального кільця для розміщення силіконового ущільнювального кільця, що використовується для герметизації середовища знизу. Тонка кремнеземна мембрана відділяє культуральну камеру від розділювальної пластини. Силіконова мембрана вирізана лазером з силіконового листа товщиною 0,02 дюйма та має твердість 35 А. Нижня та верхня силіконові прокладки вирізані лазером з силіконового листа товщиною 1/16 дюйма та мають твердість 50 А. Для кріплення блоку та створення герметичного ущільнення використовуються гвинти та баранчикові гайки з нержавіючої сталі 316L.
Спеціальна друкована плата (PCB) призначена для інтеграції з системою C-PACE-EM. Роз'єми швейцарського машинного роз'єму на друкованій платі з'єднані з графітовими електродами за допомогою посріблених мідних дротів та бронзових гвинтів 0-60, вкручених в електроди. Друкована плата розміщена в кришці 3D-принтера.
Пристрій CTCM керується програмованим пневматичним приводом (PPD), який створює контрольований тиск кровообігу, подібний до серцевого циклу. Зі збільшенням тиску всередині повітряної камери гнучка силіконова мембрана розширюється вгору, змушуючи середовище потрапляти під ділянку тканини. Ділянка тканини потім розтягується внаслідок цього виштовхування рідини, імітуючи фізіологічне розширення серця під час діастоли. На піку розслаблення через графітові електроди застосовувалася електрична стимуляція, що знижувало тиск у повітряній камері та викликало скорочення ділянок тканин. Всередині труби знаходиться гемостатичний клапан з датчиком тиску для виявлення тиску в повітряній системі. Тиск, що вимірюється датчиком тиску, подається на колектор даних, підключений до ноутбука. Це дозволяє постійно контролювати тиск всередині газової камери. Коли досягався максимальний тиск у камері (стандарт 80 мм рт. ст., 140 мм рт. ст. OS), пристрій збору даних отримував команду надіслати сигнал до системи C-PACE-EM для генерації двофазного сигналу напруги протягом 2 мс, встановленого на 4 В.
Були отримані зрізи серця та умови культивування в 6 лунках були виконані наступним чином: зібрані серця з посудини для перенесення перенесли в лоток, що містив холодну (4°C) кардіоплегію. Лівий шлуночок виділяли стерильним лезом та нарізали на шматки об'ємом 1-2 см3. Ці тканинні блоки прикріплювали до тканинних опор за допомогою тканинного клею та поміщали у вібраційну тканинну ванну мікротома, що містила розчин Тироде, та безперервно оксигенували (3 г/л 2,3-бутандіонмонооксиму (BDM), 140 мМ NaCl (8,18 г)), 6 мМ KCl (0,447 г), 10 мМ D-глюкози (1,86 г), 10 мМ HEPES (2,38 г), 1 мМ MgCl2 (1 мл 1 М розчину), 1,8 мМ CaCl2 (1,8 мл 1 М розчину), до 1 л ddH2O). Вібраційний мікротом був налаштований на нарізання зрізів товщиною 300 мкм з частотою 80 Гц, амплітудою горизонтальної коливання 2 мм та швидкістю просування 0,03 мм/с. Ванна з тканинами була оточена льодом, щоб розчин залишався прохолодним, а температура підтримувалася на рівні 4°C. Переносьте зрізи тканин з ванни з мікротома в інкубаційну ванну, що містить безперервно насичений киснем розчин Тироде на льоду, доки не буде отримано достатньо зрізів для одного культурального планшета. Для транслункових культур зрізи тканин прикріплювали до стерильних поліуретанових підставок шириною 6 мм та поміщали в 6 мл оптимізованого середовища (середовище 199, 1x добавка ITS, 10% FBS, 5 нг/мл VEGF, 10 нг/мл FGF-лужний та 2X антибіотик-протигрибковий засіб). Електрична стимуляція (10 В, частота 1,2 Гц) застосовувалася до зрізів тканин через C-Pace. Для умов TD свіжий T3 та Dex додавали в концентрації 100 нМ та 1 мкМ при кожній зміні середовища. Середовище насичують киснем перед заміною 3 рази на день. Зрізи тканин культивували в інкубаторі при 37°C та 5% CO2.
Для культур CTCM зрізи тканин розміщували на спеціально виготовленому 3D-принтері в чашці Петрі, що містила модифікований розчин Тироде. Пристрій розроблений для збільшення розміру зрізу серця на 25% від площі опорного кільця. Це робиться для того, щоб зрізи серця не розтягувалися після перенесення з розчину Тироде в середовище та під час діастоли. Використовуючи гістоакриловий клей, зрізи товщиною 300 мкм фіксували на опорному кільці діаметром 7 мм. Після прикріплення зрізів тканин до опорного кільця, відрізали зайві зрізи тканини та поміщали прикріплені зрізи тканини назад у ванну з розчином Тироде на льоду (4°C), доки не буде підготовлено достатньо зрізів для одного пристрою. Загальний час обробки для всіх пристроїв не повинен перевищувати 2 годин. Після прикріплення 6 зрізів тканин до їхніх опорних кілець, пристрій CTCM було зібрано. Культуральна камера CTCM попередньо заповнена 21 мл попередньо оксигенованого середовища. Перенесіть зрізи тканин у культуральну камеру та обережно видаліть будь-які бульбашки повітря піпеткою. Потім зріз тканини вводять у отвір і обережно притискають до місця. Нарешті, помістіть ковпачок електрода на пристрій та перенесіть його до інкубатора. Потім підключіть CTCM до повітряної трубки та системи C-PACE-EM. Пневматичний привід відкривається, а повітряний клапан відкриває CTCM. Система C-PACE-EM була налаштована на подачу 4 В з частотою 1,2 Гц під час двофазної стимуляції протягом 2 мс. Середовище змінювали двічі на день, а електроди - один раз на день, щоб уникнути накопичення графіту на електродах. За необхідності зрізи тканин можна виймати з лунок для культивування, щоб видалити будь-які бульбашки повітря, які могли потрапити під них. Для умов обробки MT, T3/Dex додавали свіжим при кожній зміні середовища зі 100 нМ T3 та 1 мкМ Dex. Пристрої CTCM культивували в інкубаторі при температурі 37°C та 5% CO2.
Для отримання розтягнутих траєкторій зрізів серця було розроблено спеціальну систему камер. Використовувалася дзеркальна камера (Canon Rebel T7i, Canon, Токіо, Японія) з макрооб'єктивом Navitar Zoom 7000 18-108 мм (Navitar, Сан-Франциско, Каліфорнія). Візуалізацію проводили за кімнатної температури після заміни середовища на свіже. Камера розташована під кутом 51°, а відео записується зі швидкістю 30 кадрів на секунду. Спочатку для кількісної оцінки руху зрізів серця використовувалося програмне забезпечення з відкритим кодом (MUSCLEMOTION43) з Image-J. Маску було створено за допомогою MATLAB (MathWorks, Natick, MA, США) для визначення областей інтересу для зрізів серця, що скорочуються, щоб уникнути шуму. Сегментовані вручну маски застосовуються до всіх зображень у послідовності кадрів, а потім передаються до плагіна MUSCLEMOTION. Muscle Motion використовує середню інтенсивність пікселів у кожному кадрі для кількісної оцінки його руху відносно опорного кадру. Дані були записані, відфільтровані та використані для кількісної оцінки часу циклу та оцінки розтягнення тканини протягом серцевого циклу. Записане відео було пост-оброблено за допомогою цифрового фільтра нульової фази першого порядку. Для кількісної оцінки розтягнення тканини (від піку до піку) було проведено відпіковий аналіз, щоб розрізнити піки та западини в записаному сигналі. Крім того, для усунення дрейфу сигналу було проведено детрендування за допомогою полінома 6-го порядку. Програмний код було розроблено в MATLAB для визначення глобального руху тканини, часу циклу, часу релаксації та часу скорочення (Додатковий програмний код 44).
Для аналізу деформації, використовуючи ті ж відео, що й для оцінки механічного розтягування, ми спочатку простежили два зображення, що представляють піки руху (найвищу (верхню) та найнижчу (нижню) точки руху) відповідно до програмного забезпечення MUSCLEMOTION. Потім ми сегментували області тканини та застосували до сегментованої тканини певний алгоритм затінення (Додатковий рис. 2a). Сегментовану тканину потім розділили на десять підповерхонь, і напруження на кожній поверхні розрахували за допомогою наступного рівняння: Деформація = (Sup-Sdown)/Sdown, де Sup та Sdown – це відстані форми від верхньої та нижньої тіней тканини відповідно (Додатковий рис. 2b).
Зрізи серця фіксували у 4% параформальдегіді протягом 48 годин. Фіксовані тканини зневоднювали у 10% та 20% сахарозі протягом 1 години, потім у 30% сахарозі протягом ночі. Потім зрізи заливали в компаунд для оптимальної температури різання (OCT-композицію) та поступово заморожували у бані з ізопентаном/сухим льодом. Зберігайте блоки для заливання OCT при температурі -80 °C до розділення. Слайди готували у вигляді зрізів товщиною 8 мкм.
Щоб видалити ОКТ зі зрізів серця, нагрівайте слайди на нагрівальному блоці при 95 °C протягом 5 хвилин. Додайте 1 мл PBS до кожного слайда та інкубуйте протягом 30 хвилин за кімнатної температури, потім просочіть зрізи, встановивши 0,1% Triton-X у PBS на 15 хвилин за кімнатної температури. Щоб запобігти зв'язуванню неспецифічних антитіл зі зразком, додайте 1 мл 3% розчину BSA до слайдів та інкубуйте протягом 1 години за кімнатної температури. Потім BSA видаляли, а слайди промивали PBS. Позначте кожен зразок олівцем. Первинні антитіла (розведені 1:200 в 1% BSA) (коннексин 43 (Abcam; #AB11370), NFATC4 (Abcam; #AB99431) та тропонін-T (Thermo Scientific; #MA5-12960) додавали протягом 90 хвилин, потім вторинні антитіла (розведені 1:200 в 1% BSA) проти мишачого Alexa Fluor 488 (Thermo Scientific; #A16079), проти кролячого Alexa Fluor 594 (Thermo Scientific; #T6391) протягом додаткових 90 хвилин. Промивали 3 рази PBS. Щоб відрізнити цільове забарвлення від фонового, ми використовували лише вторинне антитіло як контроль. Нарешті, додавали ядерний барвник DAPI, а слайди поміщали у плівку vectashield (Vector Laboratories) та запечатували лаком для нігтів. -x збільшення) та мікроскоп Keyence з 40-кратним збільшенням.
Для фарбування WGA використовували WGA-Alexa Fluor 555 (Thermo Scientific; #W32464) у концентрації 5 мкг/мл у PBS та наносили на фіксовані зрізи на 30 хвилин за кімнатної температури. Потім слайди промивали PBS, до кожного слайда додавали суданський чорний та інкубували протягом 30 хвилин. Потім слайди промивали PBS та додавали середовище для заливання vectashield. Слайди візуалізували на мікроскопі Keyence при 40-кратному збільшенні.
ОКТ видаляли зі зразків, як описано вище. Після видалення ОКТ, занурювали слайди у розчин Буена на ніч. Потім слайди промивали дистильованою водою протягом 1 години, а потім поміщали в розчин алое-кислого фуксину Бібріча на 10 хвилин. Потім слайди промивали дистильованою водою та поміщали в розчин 5% фосфорномолібдену/5% фосфорновольфрамової кислоти на 10 хвилин. Не промиваючи, переносили слайди безпосередньо в розчин анілінового синього на 15 хвилин. Потім слайди промивали дистильованою водою та поміщали в 1% розчин оцтової кислоти на 2 хвилини. Слайди сушили у 200 N етанолі та переносили в ксилол. Забарвлені слайди візуалізували за допомогою мікроскопа Keyence з об'єктивом 10x. Відсоток площі фіброзу визначали кількісно за допомогою програмного забезпечення Keyence Analyzer.
Аналіз життєздатності клітин CyQUANT™ MTT (Invitrogen, Карлсбад, Каліфорнія), каталожний номер V13154, згідно з протоколом виробника з деякими модифікаціями. Зокрема, для забезпечення однорідного розміру тканини під час аналізу MTT використовували хірургічний пробив діаметром 6 мм. Тканини окремо розсівали в лунки 12-лункового планшета, що містив субстрат MTT, згідно з протоколом виробника. Зрізи інкубували при 37°C протягом 3 годин, і жива тканина метаболізувала субстрат MTT з утворенням пурпурової формазану. Замініть розчин MTT на 1 мл DMSO та інкубуйте при 37°C протягом 15 хвилин, щоб екстрагувати пурпуровий формазан зі зрізів серця. Зразки розводили 1:10 у DMSO у 96-лункових планшетах з прозорим дном, а інтенсивність пурпурового кольору вимірювали при 570 нм за допомогою планшетного рідера Cytation (BioTek). Показники нормалізували до ваги кожного зрізу серця.
Середовище для зрізів серця замінили середовищем, що містить 1 мкКі/мл [5-3H]-глюкози (Moravek Biochemicals, Бреа, Каліфорнія, США) для аналізу утилізації глюкози, як описано раніше. Після 4 годин інкубації додали 100 мкл середовища до відкритої мікроцентрифужної пробірки, що містить 100 мкл 0,2 N HCl. Потім пробірку помістили в сцинтиляційну пробірку, що містить 500 мкл dH2O, для випаровування [3H]2O протягом 72 годин при 37°C. Потім вийняли мікроцентрифужну пробірку зі сцинтиляційної пробірки та додали 10 мл сцинтиляційної рідини. Підрахунок сцинтиляцій проводили за допомогою рідинного сцинтиляційного аналізатора Tri-Carb 2900TR (Packard Bioscience Company, Меріден, Коннектикут, США). Потім було розраховано використання глюкози з урахуванням питомої активності [5-3H]-глюкози, неповної рівноваги та фону, розведення [5-3H]-неміченою глюкозою та ефективності сцинтиляційного лічильника. Дані нормалізовано відносно маси зрізів серця.
Після гомогенізації тканин у Trizol, РНК виділяли з зрізів серця за допомогою набору Qiagen miRNeasy Micro Kit №210874 згідно з протоколом виробника. Підготовку бібліотеки RNAsec, секвенування та аналіз даних проводили наступним чином:
1 мкг РНК на зразок використовували як вихідний матеріал для підготовки бібліотеки РНК. Бібліотеки секвенування були створені за допомогою набору для підготовки бібліотеки РНК NEBNext UltraTM для Illumina (NEB, США) відповідно до рекомендацій виробника, а індексні коди були додані до атрибутних послідовностей для кожного зразка. Коротко кажучи, мРНК очищали із загальної РНК за допомогою магнітних кульок, приєднаних до полі-Т олігонуклеотидів. Фрагментацію проводили за допомогою двовалентних катіонів при високій температурі в буфері для реакції синтезу першого ланцюга NEBNext (5X). кДНК першого ланцюга синтезували за допомогою випадкових гексамерних праймерів та зворотної транскриптази M-MuLV (РНКаза H-). Потім кДНК другого ланцюга синтезували за допомогою ДНК-полімерази I та РНКази H. Залишки виступаючих кінців перетворюються на тупі кінці під дією екзонуклеазної/полімеразної активності. Після аденілювання 3′-кінця фрагмента ДНК до нього приєднують адаптер NEBNext зі структурою шпилькової петлі для підготовки до гібридизації. Для відбору фрагментів кДНК бажаної довжини 150-200 п.н. Фрагменти бібліотеки очищали за допомогою системи AMPure XP (Beckman Coulter, Беверлі, США). Потім 3 мкл ферменту USER (NEB, США) з кДНК, відібраною за розміром, лігованою за допомогою адаптера, використовували протягом 15 хвилин при 37°C, а потім протягом 5 хвилин при 95°C перед ПЛР. ПЛР проводили з використанням ДНК-полімерази Phusion High-Fidelity, універсальних праймерів для ПЛР та праймерів Index (X). Нарешті, продукти ПЛР очищали (система AMPure XP), а якість бібліотеки оцінювали на системі Agilent Bioanalyzer 2100. Бібліотеку кДНК секвенували за допомогою секвенатора Novaseq. Файли необроблених зображень від Illumina конвертували в необроблені дані за допомогою CASAVA Base Calling. Необроблені дані зберігаються у файлах формату FASTQ(fq), які містять послідовності зчитування та відповідні якості основ. Виберіть HISAT2, щоб зіставити відфільтровані дані секвенування з референсним геномом Sscrofa11.1. Загалом, HISAT2 підтримує геноми будь-якого розміру, включаючи геноми розміром понад 4 мільярди основ, і для більшості параметрів встановлені значення за замовчуванням. Сплайсингові зчитування з даних РНК-секвенування можна ефективно вирівняти за допомогою HISAT2, найшвидшої доступної наразі системи, з такою ж або кращою точністю, ніж будь-який інший метод.
Кількість транскриптів безпосередньо відображає рівень експресії генів. Рівні експресії генів оцінюються за кількістю транскриптів (кількістю секвенувань), пов'язаних з геномом або екзонами. Кількість зчитувань пропорційна рівням експресії генів, довжині гена та глибині секвенування. FPKM (кількість фрагментів на тисячу пар основ транскрипту, секвенованих на мільйон пар основ) були розраховані, а P-значення диференціальної експресії визначені за допомогою пакета DESeq2. Потім ми розрахували коефіцієнт хибних відкриттів (FDR) для кожного значення P за допомогою методу Бенджаміні-Хохберга9 на основі вбудованої R-функції «p.adjust».
РНК, виділену зі зрізів серця, перетворювали на кДНК у концентрації 200 нг/мкл за допомогою суміші SuperScript IV Vilo Master Mix від Thermo (Thermo, кат. № 11756050). Кількісну RT-ПЛР проводили за допомогою прозорого реакційного планшета Applied Biosystems Endura Plate Microamp на 384 лунки (Thermo, кат. № 4483319) та оптичного адгезиву Microamp (Thermo, кат. № 4311971). Реакційна суміш складалася з 5 мкл суміші Taqman Fast Advanced Master Mix (Thermo, кат. № 4444557), 0,5 мкл Taqman Primer та 3,5 мкл H2O, змішаних на лунку. Були проведені стандартні цикли кПЛР, а значення CT вимірювали за допомогою приладу для ПЛР у реальному часі Applied Biosystems Quantstudio 5 (384-лунковий модуль; номер продукту A28135). Праймери Taqman були придбані у Thermo (GAPDH (Ss03375629_u1), PARP12 (Ss06908795_m1), PKDCC (Ss06903874_m1), CYGB (Ss06900188_m1), RGL1 (Ss06868890_m1), ACTN1 (Ss01009508_mH), GATA4 (Ss03383805_u1), GJA1 (Ss03374839_u1), COL1A2 (Ss03375009_u1), COL3A1 (Ss04323794_m1), ACTA2 (Ss04245588_m1). Значення CT усіх зразків були нормалізовані відносно гена господарського призначення GAPDH.
Вивільнення NT-ProBNP з середовища оцінювали за допомогою набору NT-ProBNP (pig) (кат. № MBS2086979, MyBioSource) згідно з протоколом виробника. Коротко кажучи, по 250 мкл кожного зразка та стандарту додавали у двох примірниках до кожної лунки. Відразу після додавання зразка додайте 50 мкл реагенту для аналізу A до кожної лунки. Обережно струсіть планшет та запечатайте герметиком. Потім планшети інкубували при 37°C протягом 1 години. Потім аспіруйте розчин та промийте лунки 4 рази по 350 мкл розчину для промивання 1X, інкубуючи розчин для промивання протягом 1-2 хвилин щоразу. Потім додайте 100 мкл реагенту для аналізу B на лунку та запечатайте герметиком планшета. Планшет обережно струшували та інкубували при 37°C протягом 30 хвилин. Аспіруйте розчин та промийте лунки 5 разів по 350 мкл розчину для промивання 1X. Додайте 90 мкл розчину субстрату в кожну лунку та герметично закрийте планшет. Інкубуйте планшет при 37°C протягом 10-20 хвилин. Додайте 50 мкл стоп-розчину в кожну лунку. Планшет негайно виміряли за допомогою планшетного рідера Cytation (BioTek), встановленого на 450 нм.
Було проведено аналіз потужності для вибору розмірів груп, які забезпечать потужність >80% для виявлення 10% абсолютної зміни параметра з 5% коефіцієнтом помилок I типу. Було проведено аналіз потужності для вибору розмірів груп, які забезпечать потужність >80% для виявлення 10% абсолютної зміни параметра з 5% коефіцієнтом помилок I типу. Аналіз потужностей був виконаний для вибору розмірів груп, які забезпечують >80% потужностей для виявлення змін 10% абсолютного параметра з 5% частотою помилок типу I. Було проведено аналіз потужності для вибору розмірів груп, які забезпечили б потужність >80% для виявлення 10% абсолютної зміни параметрів з 5% коефіцієнтом помилок I типу.进行功效分析以选择将提供> 80％功效以检测参数中10％绝对变化和5％I型错误率的组大小。进行功效分析以选择将提供> 80％功效以检测参数中10％绝对变化和5％I型错误率的组大小。 Був проведений аналіз потужності для вибору розміру групи, яка забезпечила > 80% потужності для виявлення змін 10% абсолютного параметра та 5% частоти помилок типу I. Було проведено аналіз потужності для вибору розміру групи, який забезпечив би потужність >80% для виявлення 10% абсолютної зміни параметрів та 5% частоти помилок I типу.Зрізи тканин були випадковим чином відібрані перед експериментом. Усі аналізи були умовно-сліпими, а зразки були декодовані лише після аналізу всіх даних. Для проведення всіх статистичних аналізів використовувалося програмне забезпечення GraphPad Prism (Сан-Дієго, Каліфорнія). Для всіх статистичних даних p-значення вважалися значущими при значеннях <0,05. Для всіх статистичних даних p-значення вважалися значущими при значеннях <0,05. Для всієї статистики p-значення вважалися значимими при значеннях <0,05. Для всіх статистичних даних p-значення вважалися значущими при значеннях <0,05.对于所有统计数据，p 值在值<0,05 时被认为是显着的。对于所有统计数据，p 值在值<0,05 时被认为是显着的。 Для всієї статистики p-значення вважалися значимими при значеннях <0,05. Для всіх статистичних даних p-значення вважалися значущими при значеннях <0,05.Двосторонній t-критерій Стьюдента було проведено на даних лише з 2 порівняннями. Для визначення значущості між кількома групами використовувався однофакторний або двофакторний дисперсійний аналіз (ANOVA). Під час проведення post hoc тестів застосовувалася корекція Тьюкі для врахування множинних порівнянь. Дані RNAsec мають особливі статистичні міркування при розрахунку FDR та p.adjust, як описано в розділі «Методи».
Для отримання додаткової інформації про дизайн дослідження див. анотацію до звіту про дослідження природи, посилання на яку наведено в цій статті.