Nature.com پر جانے کے لیے آپ کا شکریہ۔ آپ جو براؤزر ورژن استعمال کر رہے ہیں اس میں CSS کے لیے محدود سپورٹ ہے۔ بہترین تجربے کے لیے، ہم تجویز کرتے ہیں کہ آپ ایک اپ ڈیٹ شدہ براؤزر استعمال کریں (یا انٹرنیٹ ایکسپلورر میں کمپیٹیبلٹی موڈ آف کریں)۔ اس دوران، مسلسل سپورٹ کو یقینی بنانے کے لیے، ہم اس سائٹ کو اسٹائلز اور جاوا اسکرپٹ کے بغیر ڈسپلے کریں گے۔
ہیومن گٹ مورفوگنیسیس 3D اپیتھیلیل مائیکرو آرکیٹیکچر اور مقامی تنظیم کی کریپٹ-وِلس خصوصیات کو قائم کرتا ہے۔ اس منفرد ڈھانچے کی ضرورت ہے کہ گٹ ہومیوسٹاسس کو برقرار رکھنے کے لیے بیسل کریپٹ میں اسٹیم سیل کے طاق کو خارجی مائکروبیل اینٹیجنز اور ان کے میٹابولائٹس سے محفوظ رکھا جائے۔ آنتوں کی بلغم کی سطح پر رکاوٹ۔ اس لیے، وٹرو گٹ ماڈلز کی تعمیر کے لیے 3D اپکلا ڈھانچے کو دوبارہ بنانا بہت ضروری ہے۔ قابل ذکر بات یہ ہے کہ، نامیاتی مائمیٹک گٹ آن اے چپ آنتوں کے خود بخود 3D مورفوجینیسیس کو آمادہ کر سکتی ہے، جو کہ بایو فیتھلولوجیکل فنکشن فراہم کرتی ہے۔ مائیکرو فلائیڈک چپ کے ساتھ ساتھ ٹرانس ویل ایمبیڈڈ ہائبرڈ چپ پر گٹ میں آنتوں کے مورفوجنیسیس کو مضبوطی سے پیدا کرنے کے لیے تولیدی پروٹوکول۔ ہم ڈیوائس فیبریکیشن، Caco-2 کی کلچرنگ یا آنتوں کے آرگنائیڈ اپیتھیلیل سیلز کے طور پر کنوینٹک فلو 3 کے پلیٹ فارم کے طور پر مائیکرو فلوڈیڈیو سیٹنگ کے تفصیلی طریقے بیان کرتے ہیں۔ ہے، اور ایک سے زیادہ امیجنگ طریقوں کا استعمال کرتے ہوئے قائم کردہ 3D ایپیتھیلیا کی خصوصیت۔ یہ پروٹوکول 5 دن کے لیے باسولیٹرل فلوئڈ فلو کو کنٹرول کر کے فنکشنل گٹ مائیکرو آرکیٹیکچر کی تخلیق نو کو حاصل کرتا ہے۔ ہمارا ان وٹرو مورفوجینیسیس طریقہ جسمانی طور پر متعلقہ قینچ کے دباؤ اور مکینیکل موشن کو ملازمت دیتا ہے، جس سے ہمیں موجودہ انجن یا خلیے کی پیچیدہ تکنیک کی ضرورت نہیں ہوتی ہے۔ مجوزہ پروٹوکول کے بائیو میڈیکل ریسرچ کمیونٹی کے لیے وسیع مضمرات ہوسکتے ہیں، جو بائیو میڈیکل، کلینیکل اور فارماسیوٹیکل ایپلی کیشنز کے لیے وٹرو میں 3D آنتوں کے اپکلا تہوں کو دوبارہ تخلیق کرنے کا طریقہ فراہم کرتا ہے۔
تجربات سے پتہ چلتا ہے کہ گٹ آن اے چپ 1,2,3,4,5 یا بائلیئر مائیکرو فلائیڈک ڈیوائسز 6,7 میں کلچر شدہ آنتوں کے اپکلا Caco-2 خلیے بنیادی میکانزم کی واضح سمجھ کے بغیر وٹرو میں اچانک 3D مورفوجینیسیس سے گزر سکتے ہیں۔ s وٹرو میں 3D اپیٹیلیل مورفوگنیسیس کو دلانے کے لیے ضروری اور کافی ہے، جس کا مظاہرہ Caco-2 اور مریض سے حاصل کردہ آنتوں کے آرگنائڈز نے کیا ہے۔اپیتھیلیئل سیلز کی توثیق کی گئی۔ اس مطالعے میں، ہم نے خاص طور پر ایک طاقتور Wnt مخالف، Dickkopf-1 (DKK-1) کی سیل کی پیداوار اور ارتکاز کی تقسیم پر توجہ مرکوز کی، گٹ آن اے چپ اور تبدیل شدہ مائیکرو فلائیڈک ڈیوائسز جن میں ٹرانس ویل انسرٹس شامل ہیں، جن کو "ہائبرڈ چپس کے ایک اضافی ڈیمونٹ کے طور پر کہا جاتا ہے"۔ -1, Wnt repressor 1, secreted frizzled-related protein 1, or Soggy-1) on-chip گٹ میں morphogenesis کو روکتا ہے یا prestructured 3D epithelial تہہ میں خلل ڈالتا ہے، یہ بتاتا ہے کہ ثقافت کے دوران مخالفانہ تناؤ آنتوں کی مورفوجینیسیس کے لیے ذمہ دار ہے، وٹرو پراسٹ کے حصول کے لیے وٹروپراسٹک اپروچ۔ ایلیئل انٹرفیس فعال فلشنگ (مثال کے طور پر گٹ آن اے چپ یا ہائبرڈ آن اے چپ پلیٹ فارمز میں) یا ڈفیوژن کے ذریعے بیسولیٹرل کمپارٹمنٹ میں Wnt مخالفوں کی سطح کو ہٹانا یا کم سے کم برقرار رکھنا ہے۔ باسولیٹرل میڈیا (مثال کے طور پر، بڑے بیسولٹرل کنویں کے اندراج سے ٹرانس ویل داخل کرتا ہے)۔
اس پروٹوکول میں، ہم گٹ آن-اے-چپ مائیکرو ڈیوائسز اور ٹرانس ویل-انسرٹ ایبل ہائبرڈ چپس (مرحلہ 1-5) کو پولیڈیمیتھائلسلوکسین (PDMS) پر مبنی غیر محفوظ جھلیوں پر کلچر کرنے کے لیے ایک تفصیلی طریقہ فراہم کرتے ہیں۔ 6B, 7B, 8, 9) اور induced 3D morphogenesis in vitro (مرحلہ 10)۔ ہم نے سیلولر اور مالیکیولر خصوصیات کی بھی نشاندہی کی جو ٹشو سے متعلق مخصوص ہسٹوجنیسیس اور نسب پر منحصر سیلولر تفریق کی ایک سے زیادہ امیجنگ طریقوں کو لاگو کرتے ہوئے (مرحلہ 11-24) کا استعمال کرتے ہوئے انسانی خلیات کے طور پر۔ 2 یا آنتوں کے آرگنائڈز، تکنیکی تفصیلات کے ساتھ دو کلچر فارمیٹس میں جس میں غیر محفوظ جھلیوں کی سطح میں ترمیم، 2D monolayers کی تخلیق، اور آنتوں کی بایو کیمیکل اور بایو مکینیکل مائکرو ماحولیات کی تولید۔ 2D سے 3D مورفوجنیسس کو دلانے کے لیے، ہم دونوں کو ہٹانے کے لیے 2D morphogenesis کو ہٹاتے ہیں۔ ثقافت کے بیسولٹرل کمپارٹمنٹ میں درمیانے درجے تک۔ آخر میں، ہم ایک قابل تجدید 3D اپکلا پرت کی افادیت کی نمائندگی فراہم کرتے ہیں جو مورفوجن پر منحصر اپکلا نمو، طولانی میزبان-مائکروبائیوم کو کلچرز، پیتھوجین انفیکشن، سوزش کی چوٹ، باریک بیکٹیریل بیکٹیریل پرت کے نمونے کے لیے استعمال کی جا سکتی ہے۔ .اثرات
ہمارا پروٹوکول سائنس دانوں کی ایک وسیع رینج کے لیے کارآمد ہو سکتا ہے بنیادی (مثال کے طور پر، آنتوں کی میوکوسل بائیولوجی، اسٹیم سیل بیالوجی، اور ڈیولپمنٹ بائیولوجی) اور اپلائیڈ ریسرچ (مثلاً، پری کلینیکل ڈرگ ٹیسٹنگ، ڈیز ماڈلنگ، ٹشو انجینئرنگ، اور گیسٹرو اینٹرولوجی) کے وسیع اثرات۔ وٹرو میں آنتوں کے اپکلا، ہم تصور کرتے ہیں کہ ہماری تکنیکی حکمت عملی کو آنتوں کی نشوونما، تخلیق نو یا ہومیوسٹاسس کے دوران سیل سگنلنگ کی حرکیات کا مطالعہ کرنے والے سامعین تک پہنچایا جا سکتا ہے۔ اس کے علاوہ، ہمارا پروٹوکول مختلف متعدی ایجنٹوں جیسے کہ Norovirus 8، Severe-Rospiratory Corsavirus-2-Severe-Severe-Coronavirus کے تحت انفیکشن کی تفتیش کے لیے مفید ہے۔ ium difficile، Salmonella Typhimurium 9 یا Vibrio cholerae۔بیماری کی پیتھالوجی اور روگجنن کے سامعین بھی مفید ہیں۔ آن چپ گٹ مائکرو فزیالوجی سسٹم کا استعمال طول بلد شریک کلچر 10 اور اس کے نتیجے میں میزبان دفاع، مدافعتی ردعمل اور معدے (GI) میں پیتھوجین سے متعلقہ چوٹ کی مرمت کی اجازت دے سکتا ہے۔ s بیماری، السرٹیو کولائٹس، پاؤچائٹس، یا چڑچڑاپن والے آنتوں کے سنڈروم کو اس وقت تیار کیا جاسکتا ہے جب مریض کی 3D آنتوں کے اپکلا تہوں کا استعمال کرتے ہوئے 3D آنتوں کے اپکلا کی تہوں کو تیار کیا جاتا ہے، ان بیماریوں میں وائلس ایٹروفی، کریپٹ شارٹننگ، میوکوسل ڈیمیج، یا سٹرٹیبل بی آر سی کی خرابی شامل ہیں۔ oids12,13. بیماری کے ماحول کی اعلی پیچیدگی کو بہتر انداز میں ماڈل بنانے کے لیے، قارئین 3D آنتوں کے villus-crypt مائیکرو آرکیٹیکچرز پر مشتمل ماڈلز میں بیماری سے متعلقہ سیل اقسام، جیسے کہ مریض کے پیریفرل بلڈ مونو نیوکلیئر سیلز (PBMCs) کو شامل کرنے پر غور کر سکتے ہیں۔ٹشو مخصوص مدافعتی خلیات، 5.
چونکہ 3D اپکلا مائیکرو اسٹرکچر کو سیکشننگ کے عمل کے بغیر فکس اور تصور کیا جا سکتا ہے، اس لیے مقامی ٹرانسکرپٹومکس اور ہائی ریزولوشن یا سپر ریزولوشن امیجنگ پر کام کرنے والے ناظرین اپکلا طاقوں پر جینز اور پروٹینوں کی spatiotemporal حرکیات کی ہماری میپنگ میں دلچسپی لے سکتے ہیں۔ٹیکنالوجی میں دلچسپی ہے۔ مائکروبیل یا مدافعتی محرکات کا ردعمل۔ مزید برآں، طولانی میزبان-مائکروبائیوم کراسسٹالک 10، 14 جو کہ گٹ ہومیوسٹاسس کو مربوط کرتے ہیں، 3D آنتوں کے میوکوسل تہہ میں مختلف مائکروبیل پرجاتیوں، مائکروبیل کمیونٹیز، خاص طور پر مائیکروبیل کمیونٹیز میں مشترکہ ثقافت کے ذریعے قائم کیا جا سکتا ہے۔پلیٹ فارم میں۔ یہ نقطہ نظر ان سامعین کے لیے خاص طور پر پرکشش ہے جو میوکوسل امیونولوجی، گیسٹرو اینٹرولوجی، ہیومن مائکرو بایوم، کلچرومکس اور کلینیکل مائکرو بایولوجی کا مطالعہ کر رہے ہیں جو لیبارٹری میں پہلے سے غیر کلچرڈ گٹ مائیکرو بائیوٹا کاشت کرنا چاہتے ہیں۔ tes جو بیسولٹرل کمپارٹمنٹس کو مسلسل بھرتے ہیں، پروٹوکول کو ان لوگوں تک بھی پھیلایا جا سکتا ہے جو دواسازی، بایومیڈیکل یا ہائی تھرو پٹ اسکریننگ یا فوڈ انڈسٹری کے لیے توثیق کرنے والے پلیٹ فارم تیار کر رہے ہیں۔ اصول کے ثبوت کے طور پر، ہم نے حال ہی میں ایک ملٹی پلیکس ہائی تھرو پٹ سسٹم کی فزیبلٹی کا مظاہرہ کیا ہے۔ -a-چپ پروڈکٹس کو تجارتی بنا دیا گیا ہے 16,17,18۔ اس لیے ہمارے ان وٹرو مورفوجینیسیس کے طریقہ کار کی توثیق کو تیز کیا جا سکتا ہے اور ممکنہ طور پر بہت سی تحقیقی لیبارٹریز، صنعت یا حکومت اور ریگولیٹری ایجنسیوں کے ذریعے ان وٹرو گٹ مورفوجینیسیس کی سیلولر ری پروگرامنگ کو سمجھنے کے لیے اپنایا جا سکتا ہے تاکہ بائیو ٹیپ یا بائیو ٹیسٹ کے لیے بائیو میٹرک ٹیسٹ کی سطح پر ان وٹرو گٹ مورفوجینیسیس کو سمجھا جا سکے۔ 3D گٹ سروگیٹس کا استعمال کرتے ہوئے یا گٹ مورفوجینیسیس کے عمل کی تولیدی صلاحیت کا جائزہ لینے کے لیے کسٹم یا کمرشل آرگن آن اے چپ ماڈلز کا استعمال۔
آنتوں کے اپکلا مورفوگنیسیس کا مطالعہ کرنے کے لئے انسانی متعلقہ تجرباتی ماڈل کی ایک محدود تعداد کا استعمال کیا گیا ہے ، اس کی بنیادی وجہ وٹرو میں تھری ڈی مورفوگنیسیس کو دلانے کے لئے قابل عمل پروٹوکول کی کمی ہے۔ حقیقت میں ، اہمیت کے حامل ، اور اس میں اہمیت کا حامل ہے ، اور اس کی وجہ یہ ہے کہ مشمولات ، اور اس کی وجہ سے یہ معلوم ہوتا ہے۔ ، انسانی ترقیاتی عمل کا قطعی طور پر تعین نہ کریں۔ یہ ماڈل ایک کثیر الجہتی انداز میں جانچنے کی ان کی قابلیت میں بھی بہت محدود ہیں۔ لہذا ، ویوو جانوروں کے ماڈلز میں وٹرو آؤٹ پرفارمنس میں 3D ٹشو ڈھانچے کو دوبارہ تخلیق کرنے کے لئے ہمارے پروٹوکول کے ساتھ ساتھ دیگر روایتی جامد سیل کلچر ماڈل کو بھی استعمال کیا جاتا ہے۔ مختلف mucosal یا مدافعتی محرکات کے جواب میں محور .3 ڈی اپکلا پرتیں ایک جگہ فراہم کرسکتی ہیں کہ کس طرح مائکروبیل خلیات میزبان عوامل کے جواب میں مقامی طاق اور ماحولیاتی ارتقاء کی تشکیل کے لئے مقابلہ کرتے ہیں (جیسے ، اندرونی بمقابلہ بیرونی بلغم کی پرتوں ، آئی جی اے اور اینٹی مائکروبیل پیپٹائڈس کا سراو) اعصابی طور پر مائکروبیل میٹابولائٹس (جیسے ، شارٹ چین فیٹی ایسڈ) تیار کرتے ہیں جو بیسل کریپٹ میں سیلولر تنظیم اور اسٹیم سیل طاق کی تشکیل کرتے ہیں۔ یہ خصوصیات صرف اس وقت ظاہر کی جاسکتی ہیں جب وٹرو میں تھری ڈی اپکلا پرتیں قائم ہوں۔
3D آنتوں کے اپکلا ڈھانچے بنانے کے ہمارے طریقہ کار کے علاوہ، وٹرو کے کئی طریقے ہیں۔ آنتوں کے آرگنائیڈ کلچر ایک جدید ترین ٹشو انجینئرنگ تکنیک ہے جس کی بنیاد مخصوص مورفوجن حالات23,24,25 کے تحت آنتوں کے اسٹیم سیلز کی کاشت پر مبنی ہے۔ چیلنج ہے کیونکہ آنتوں کا لیمن آرگنائڈ کے اندر بند ہوتا ہے اور اس وجہ سے، لومینل اجزاء جیسے مائکروبیل سیلز یا خارجی اینٹیجنز کا تعارف محدود ہے۔مائیکرو انجیکٹر،26,27 کا استعمال کرتے ہوئے آرگنائیڈ لیمنس تک رسائی کو بہتر بنایا جا سکتا ہے لیکن یہ طریقہ ناگوار اور محنت طلب ہے اور اسے انجام دینے کے لیے خصوصی علم کی ضرورت ہوتی ہے۔ مزید برآں، جامد حالات میں ہائیڈروجیل اسکافولڈز میں برقرار روایتی آرگنائیڈ کلچرز ویوو بائیو مکینکس میں درست طریقے سے فعال نہیں ہوتے۔
متعدد تحقیقی گروپوں کے ذریعہ استعمال کردہ دیگر نقطہ نظر جیل کی سطح پر الگ تھلگ انسانی آنتوں کے خلیوں کی ثقافت کے ذریعے گٹ کے اپکلا ڈھانچے کی نقل کرنے کے لئے پہلے سے تشکیل شدہ 3D ہائیڈروجل اسکافولڈز کا استعمال کرتے ہیں۔ جسمانی لحاظ سے متعلقہ مورفوجن گریڈیئنٹس کے ساتھ وٹرو، اسکافولڈ میں اسٹروومل سیلز کو شامل کرکے ایک اعلی اسپیکٹ ریشو اپیتھیلیل ڈھانچہ اور اسٹروما اپیتھیلیل کراسسٹالک کا قیام۔ تاہم، پہلے سے تشکیل شدہ سہاروں کی نوعیت خود ساختہ مورفوجنیٹک عمل کی نمائش کو روک سکتی ہے۔ اس بات پر دباؤ ہے کہ آنتوں کے خلیوں کو مورفوجینیسیس سے گزرنا اور جسمانی فعل حاصل کرنے کی ضرورت ہے۔ ایک اور حالیہ تحقیق میں مائکرو فلائیڈک پلیٹ فارم میں ہائیڈروجیل اسکافولڈز کا استعمال کیا گیا ہے اور لیزر اینچنگ تکنیک کا استعمال کرتے ہوئے پیٹرن والے آنتوں کے اپکلا ڈھانچے ہیں۔ ics ماڈیول۔تاہم، یہ ماڈل نہ تو خود بخود مورفوجینیٹک عمل کو ظاہر کرتا ہے اور نہ ہی اس میں گٹ میکانوبیولوجیکل حرکتیں شامل ہیں۔ اسی گروپ کی 3D پرنٹنگ تکنیک خود بخود مورفوجینیٹک عمل کے ساتھ چھوٹے گٹ ٹیوبیں بنانے کے قابل تھی۔ مزید برآں، ماڈل کی آپریبلٹی محدود ہوسکتی ہے، خاص طور پر بائیو پرنٹنگ کے عمل کے مکمل ہونے کے بعد، تجرباتی حالات یا خلیے سے خلیے کے تعاملات کو پریشان کرنے کے بعد۔ اس کے بجائے، ہمارا مجوزہ پروٹوکول اچانک گٹ مورفوجینیسیس، جسمانی لحاظ سے متعلقہ قینچ کا تناؤ، بائیو مکینکس فراہم کرتا ہے جو گٹ کی نقل و حرکت کی نقل کرتا ہے۔ ماڈیولریٹی کے ماحول۔ اس لیے، ہمارا ان وٹرو تھری ڈی مورفوجینیسیس پروٹوکول موجودہ طریقوں کے چیلنجوں پر قابو پانے کے لیے ایک تکمیلی نقطہ نظر فراہم کر سکتا ہے۔
ہمارا پروٹوکول مکمل طور پر تھری ڈی اپیتھیلیل مورفوجنیسیس پر مرکوز ہے، جس میں کلچر میں صرف اپکلا خلیات ہیں اور اس کے ارد گرد کے خلیات کی کوئی دوسری قسم نہیں ہے جیسے کہ mesenchymal خلیات، endothelial خلیات، اور مدافعتی خلیات۔ جیسا کہ پہلے بیان کیا گیا ہے، ہمارے پروٹوکول کا بنیادی حصہ epithelial morphogenesis in the secreted by remotoral morphogenesis induction ہے. درمیانہ۔جبکہ ہمارے گٹ آن اے چپ اور ہائبرڈ آن اے چپ کی مضبوط ماڈیولریٹی ہمیں غیر منقطع 3D اپیتھیلیل پرت کو دوبارہ بنانے کی اجازت دیتی ہے، اضافی حیاتیاتی پیچیدگیاں جیسے اپیتھیلیل-میسینچیمل تعاملات 33,34، ایکسٹرا سیلولر میٹرکس (ECM) میں جمع ہونے والی خصوصیتیں، جو کہ ہمارے ماڈلز، کرپٹو 3D میں جمع ہوتی ہیں۔ بیسل کریپٹس میں طاقوں پر مزید غور کیا جانا باقی ہے۔ mesenchyme میں سٹرومل خلیات (مثال کے طور پر، fibroblasts) ECM پروٹین کی پیداوار اور vivo35,37,38 میں آنتوں کی مورفوجینیسیس کے ریگولیشن میں کلیدی کردار ادا کرتے ہیں۔ ہمارے ماڈل میں mesenchymal خلیات کے اضافے نے morphogenetic پرت، کیپٹیلی لیئر اور کیپسول کے عمل کو بڑھایا۔ ) آنتوں کے مائیکرو ماحولیات میں مالیکیولر ٹرانسپورٹ39 اور امیون سیل کی بھرتی کو ریگولیٹ کرنے میں اہم کردار ادا کرتا ہے۔ مزید برآں، ویسکولیچر اجزاء جو ٹشو ماڈلز کے درمیان منسلک ہو سکتے ہیں ایک شرط ہے جب ٹشو ماڈلز کو کثیر اعضاء کے تعاملات کو ظاہر کرنے کے لیے ڈیزائن کیا جاتا ہے۔ اس لیے سیلز کو اضافی خصوصیات کے ساتھ شامل کرنے کی ضرورت ہے۔ ریزولیوشن۔مریض سے ماخوذ مدافعتی خلیے بھی آنتوں کی بیماری کی نقل کرنے کے تناظر میں پیدائشی مدافعتی ردعمل، اینٹیجن پریزنٹیشن، پیدائشی موافقت مدافعتی کراسسٹالک، اور بافتوں سے متعلق مخصوص قوت مدافعت کو ظاہر کرنے کے لیے ضروری ہیں۔
ہائبرڈ چپس کا استعمال گٹ آن اے چپ کے مقابلے میں زیادہ سیدھا ہے کیونکہ ڈیوائس کا سیٹ اپ آسان ہے اور ٹرانس ویل انسرٹس کا استعمال گٹ اپیتھیلیم کی توسیع پذیر کلچر کی اجازت دیتا ہے۔ تاہم، پولیسٹر جھلیوں کے ساتھ تجارتی طور پر دستیاب ٹرانس ویل انسرٹس لچکدار نہیں ہوتے ہیں اور ٹرانس ویل انسرٹس کی نقل نہیں کر سکتے ہیں، ٹرانس ویل انسرٹ کی نقل و حرکت کی زیادہ جگہ پر۔ d چپ apical سائیڈ پر بغیر کسی قینچ کے دباؤ کے ساکن رہی۔ واضح طور پر، apical کمپارٹمنٹ میں جامد خصوصیات شاذ و نادر ہی ہائبرڈ چپس میں طویل مدتی بیکٹیریل کو کلچر کو فعال کرتی ہیں۔ جب کہ ہم ٹرانس ویل انسرٹس میں 3D مورفوجینیسیس کو مضبوطی سے آمادہ کر سکتے ہیں جب کہ ہائبرڈ فلو کے شارٹ فلو کا استعمال کرتے ہوئے ٹرانس ویل انسرٹس میں تھری ڈی مورفوجینیسیس کا استعمال کر سکتے ہیں۔ آئی ڈی کا بہاؤ ممکنہ ایپلی کیشنز کے لیے ہائبرڈ چپ پلیٹ فارم کی فزیبلٹی کو محدود کر سکتا ہے۔
گٹ آن اے چپ اور ہائبرڈ آن اے چپ کلچرز میں انسانی کریپٹ وِلس ایکسس کی مکمل پیمانے پر تعمیر نو مکمل طور پر قائم نہیں ہوسکی ہے۔ چونکہ مورفوجینیسیس اپکلا مونولیئر سے شروع ہوتا ہے، 3D مائیکرو آرکیٹیکچرز ضروری نہیں کہ ہم کرپٹو سیلولوجیکل آبادی میں مورفولوجیکل مماثلت فراہم کریں۔ مائیکرو انجینیئرڈ 3D اپیتھیلیم میں بیسل کریپٹ ڈومین، کرپٹ اور وائلس علاقوں کی واضح طور پر حد بندی نہیں کی گئی تھی۔ اگرچہ چپ کے اوپری چینلز مائیکرو انجینیئرڈ اپیتھیلیم کی اونچائی میں اضافے کا باعث بنتے ہیں، زیادہ سے زیادہ اونچائی اب بھی ~300–400 تک محدود ہے۔ es بالترتیب ~135 µm اور ~ 400 µm ہے، اور چھوٹی آنت والی ولی کی اونچائی ~ 600 µm41 ہے۔
امیجنگ کے نقطہ نظر سے، 3D مائیکرو آرکیٹیکچرز کی صورتحال میں سپر ریزولوشن امیجنگ چپ پر گٹ تک محدود ہو سکتی ہے، کیونکہ مقصدی لینس سے اپیتھیلیل پرت تک کام کا مطلوبہ فاصلہ چند ملی میٹر کے حکم پر ہے۔ اس مسئلے پر قابو پانے کے لیے، ایک دور مقصد کی ضرورت ہو سکتی ہے۔ PDMS.مزید برآں، چونکہ چپ پر گٹ کی تہہ بہ تہہ مائیکرو فیبریکیشن میں ہر تہہ کے درمیان مستقل چپکنا شامل ہوتا ہے، اس لیے اپکلا پرت کی سطح کی ساخت کا جائزہ لینے کے لیے اوپری تہہ کو کھولنا یا ہٹانا انتہائی مشکل ہوتا ہے۔ مثال کے طور پر، اسکیننگ الیکٹران مائیکروسکوپ (SEM) کا استعمال کرکے۔
ہائیڈروفوبک چھوٹے مالیکیولز سے متعلق مائیکرو فلائیڈک پر مبنی مطالعات میں PDMS کی ہائیڈرو فوبیسٹی ایک محدود عنصر رہی ہے، کیونکہ PDMS غیر مخصوص طور پر ایسے ہائیڈروفوبک مالیکیولز کو جذب کر سکتا ہے۔ PDMS کے متبادل کو دوسرے پولیمرک مواد کے ساتھ سمجھا جا سکتا ہے۔ متبادل کے طور پر، PDMS کے ساتھ ملحقہ مادّی یا سطحی ترمیم ene glycol) 43 ) کو ہائیڈروفوبک مالیکیولز کے جذب کو کم کرنے کے لیے سمجھا جا سکتا ہے۔
آخر میں، ہمارے طریقہ کار کو ہائی تھرو پٹ اسکریننگ یا "ایک سائز کے تمام فٹ" صارف دوست تجرباتی پلیٹ فارم فراہم کرنے کے حوالے سے اچھی خاصیت نہیں دی گئی ہے۔ موجودہ پروٹوکول کے لیے ایک سرنج پمپ فی مائکرو ڈیوائس کی ضرورت ہے، جو CO2 انکیوبیٹر میں جگہ لیتا ہے اور بڑے پیمانے پر تجربات کو روکتا ہے۔ ، یا 384 اچھی طرح سے غیر محفوظ انسرٹس جو بیسولیٹرل میڈیا کو مسلسل بھرنے اور ہٹانے کی اجازت دیتے ہیں)۔
وٹرو میں انسانی آنتوں کے اپکلا کے 3D مورفوجینیسیس کو دلانے کے لیے، ہم نے ایک مائیکرو فلائیڈک چپ آنتوں کے آلے کا استعمال کیا جس میں دو متوازی مائکرو چینلز اور درمیان میں ایک لچکدار غیر محفوظ جھلی موجود تھی تاکہ ایک لیمن کیپلیری انٹرفیس بنایا جا سکے۔ ٹرانس ویل انسرٹس پر اگنے والی پولرائزڈ اپیتھیلیل پرتیں۔ دونوں پلیٹ فارمز میں، مختلف انسانی آنتوں کے اپکلا خلیوں کی مورفوجینیسیس کو بہاؤ کی دشاتمک ہیرا پھیری کا استعمال کرتے ہوئے ظاہر کیا جا سکتا ہے تاکہ باسولٹرل کمپارٹمنٹ سے مورفوجن مخالفوں کو ہٹایا جا سکے۔ پورا تجرباتی طریقہ کار (شکل 1) پانچ مائیکرو ویلڈ پرزوں پر مشتمل ہوتا ہے۔ چپ (مرحلہ 1-5؛ باکس 1)، (ii) آنتوں کے اپکلا خلیات (Caco-2 خلیات) یا انسانی آنتوں کے آرگنائڈز کی تیاری؛باکسز 2-5)، (iii) آنتوں کے چپس یا ہائبرڈ چپس پر آنتوں کے اپکلا خلیوں کی ثقافت (مرحلہ 6-9)، (iv) وٹرو میں 3D مورفوجینیسیس کی شمولیت (مرحلہ 10) اور (v) 3D اپکلا کی خصوصیت کے لیے (v) 3D اپیتھیلیل کنٹرول (مزید مناسب گروپس 1-2) ذیل میں مناسب مائیکرو اسٹرکچر) اپکلا مورفوگنیسیس کا مقامی، وقتی، مشروط، یا طریقہ کار کنٹرولز سے موازنہ کرکے ان وٹرو مورفوجنیسیس کی تاثیر کو درست کرنے کے لیے ڈیزائن کیا گیا تھا۔
ہم نے دو مختلف کلچر پلیٹ فارمز کا استعمال کیا: گٹ آن اے چپ سیدھے چینلز کے ساتھ یا نان لائنر کنولوٹیڈ چینلز، یا ایک مائیکرو فلائیڈک ڈیوائس میں ٹرانس ویل (TW) انسرٹس پر مشتمل ہائبرڈ چپس، جیسا کہ باکس 1 میں بیان کیا گیا ہے، اور مرحلہ 1-5۔"ڈیوائس فیبریکیشن" ایک ہی اسٹین پی ایچ پی بنانے کے اہم مراحل کو ظاہر کرتا ہے۔ lial Cells" اس پروٹوکول میں استعمال ہونے والے خلیے کے ماخذ (Caco-2 یا انسانی آنتوں کے آرگنائڈز) اور ثقافت کے طریقہ کار کی وضاحت کرتا ہے۔"In vitro morphogenesis" ان مجموعی مراحل کو ظاہر کرتا ہے جس میں Caco-2 یا organoid سے ماخوذ اپیتھیلیل خلیات آنتوں کی چپ پر یا Transhybriisd inserts of Transhybriis3 کے ذریعے کلچر ہوتے ہیں۔ ایک خصوصیت والے اپیتھیلیل ڈھانچے کی تشکیل۔ پروگرام کا مرحلہ نمبر یا باکس نمبر ہر تیر کے نیچے ظاہر ہوتا ہے۔ ایپلی کیشن مثالیں فراہم کرتی ہے کہ آنتوں کے اپکلا پرتوں کو کس طرح استعمال کیا جا سکتا ہے، مثال کے طور پر، سیل کی تفریق کی خصوصیت، گٹ فزیالوجی اسٹڈیز، ہوسٹ مائکرو بایوم ایکو سسٹم کا قیام، اور بیماری کے ماڈلنگ میں "Flue-Modeling"۔ ایکٹین اور MUC2 کا اظہار گٹ چپ پر پیدا ہونے والی 3D Caco-2 اپیتھیلیل پرت میں ہوا ہے۔ MUC2 سگنلنگ گوبلٹ سیلز اور بلغم کی سطحوں سے چھپنے والے بلغم میں موجود ہے۔ گٹ فزیالوجی میں فلوروسینٹ امیجز سے ظاہر ہوتا ہے کہ بلغم کو داغ لگنے سے پیدا ہوتا ہے جس میں سیالک ایسڈ اور این ایس سی ایل سی ایسڈ کا استعمال ہوتا ہے۔ in. "میزبان-مائکروب کو-کلچرز" میں دو اوور لیپنگ امیجز ایک چپ پر گٹ میں نمائندہ میزبان مائکروبیوم کو کلچر دکھاتی ہیں۔ بائیں پینل مائیکرو انجینیئرڈ 3D Caco-2 کے ساتھ E. کولی کی شریک ثقافت کو ظاہر کرتا ہے۔ 3D Caco-2 اپکلا خلیات، جس کے بعد F-actin (سرخ) اور نیوکلیائی (نیلے) کے ساتھ امیونو فلوروسینس سٹیننگ۔ بیماری کی ماڈلنگ بیکٹیریل اینٹیجنز کے ساتھ جسمانی چیلنج کے تحت گٹ کی سوزش کے چپس میں صحت مند بمقابلہ لیکی گٹ کی وضاحت کرتی ہے (مثال کے طور پر، لیپوپولیساکرائڈ سیلز (پی ایم سی، ایل پی ایم سی)، اور ایل پی ایس سی سی، اورسبز)۔Caco-2 سیلز کو 3D اپکلا پرت قائم کرنے کے لیے کلچر کیا گیا تھا۔ اسکیل بار، 50 µm۔ نیچے کی قطار میں تصاویر: "خلیات کی تفریق" حوالہ سے اجازت کے ساتھ موافقت۔آکسفورڈ یونیورسٹی پریس؛Ref.5 سے اجازت کے ساتھ دوبارہ پیش کیا گیا۔NAS;"میزبان مائیکروب کو کلچر" ریفری 3 کی اجازت سے ڈھال لیا گیا۔NAS;"ڈیزیز ماڈلنگ" حوالہ سے اجازت کے ساتھ موافقت۔5۔این اے ایس
گٹ آن چپ اور ہائبرڈ چپس دونوں PDMS نقلوں کا استعمال کرتے ہوئے من گھڑت تھے جنہیں نرم لتھوگرافی 1,44 کے ذریعے سلکان کے سانچوں سے ڈھایا گیا تھا اور SU-8 کے ساتھ پیٹرن کیا گیا تھا۔ ہر چپ میں مائکرو چینلز کے ڈیزائن کا تعین ہائیڈروڈائینامکس جیسے شیئر اسٹریس اور ہائیڈروڈینا 1،44 کے ذریعے کیا جاتا ہے۔ ڈیٹا تصویر 1a)، جو دو متوازی متوازی سیدھے مائیکرو چینلز پر مشتمل تھا، ایک پیچیدہ گٹ آن-اے-چپ (توسیع شدہ ڈیٹا تصویر 1b) میں تیار ہوا ہے جس میں مڑے ہوئے مائیکرو چینلز کا ایک جوڑا شامل ہے جس میں سیال کے رہائش کے وقت میں اضافہ، غیر لکیری بہاؤ کے نمونوں اور ملٹی فیکس سیلز (F2-W) کی شکل میں اضافہ ہوتا ہے۔ زیادہ پیچیدہ گٹ بائیو مکینکس کو دوبارہ بنانے کی ضرورت ہے، پیچیدہ گٹ آن اے چپس کا انتخاب کیا جا سکتا ہے۔ ہم نے یہ ثابت کیا ہے کہ گٹ چپس بھی مضبوطی سے 3D مورفوجینیسیس کو ایک ہی ٹائم فریم میں مضبوطی سے اکساتی ہے جس میں اصل گٹ چپ کے مقابلے اپیتھیلیل نمو کی ایک ہی ڈگری ہوتی ہے، قطع نظر اس سے قطع نظر کہ کلچرڈ اور 3 ڈی سیل پر کمپلیکس سیل، 3 ڈی مورفوجینیسیس کے ساتھ۔ چپ گٹ کے ڈیزائن قابل تبادلہ ہوتے ہیں۔ SU-8 پیٹرن کے ساتھ سلیکون مولڈز پر ٹھیک ہونے والی PDMS نقلیں ڈیمولڈنگ کے بعد منفی خصوصیات فراہم کرتی ہیں (تصویر 1)۔2a) چپ پر گٹ بنانے کے لیے، تیار شدہ اوپری PDMS تہہ کو ترتیب وار ایک غیر محفوظ PDMS فلم کے ساتھ جوڑا گیا اور پھر ایک کورونا ٹریٹر (تصویر 2b–f) کا استعمال کرتے ہوئے ناقابل واپسی بانڈنگ کے ذریعے نچلی PDMS تہہ کے ساتھ منسلک کیا گیا۔ آئیڈیک ڈیوائسز جو ٹرانس ویل انسرٹس کو ایڈجسٹ کرسکتی ہیں (تصویر 2h اور توسیعی ڈیٹا تصویر 2)۔ بانڈنگ کا عمل PDMS ریپلیکا اور شیشے کی سطحوں کو آکسیجن پلازما یا کورونا ٹریٹمنٹ سے ٹریٹ کرکے انجام دیا جاتا ہے۔ مائیکرو فیبریکیٹڈ ڈیوائس کو جراثیم سے پاک کرنے کے بعد، سلیکون ٹیوب کے سیٹ اپ 3 کو پرفارم کرنے کے لیے تیار کیا گیا تھا۔ ہیلیم (شکل 2 جی)۔
a، SU-8 پیٹرن والے سلیکون مولڈز سے PDMS حصوں کی تیاری کی اسکیمیٹک مثال۔ غیر علاج شدہ PDMS محلول کو سلیکون مولڈ (بائیں) پر ڈالا گیا، 60 ° C (درمیانی) پر ٹھیک کیا گیا اور (دائیں) توڑ دیا گیا۔ مسمار شدہ PDMS کو ٹکڑوں میں کاٹ دیا گیا اور PDMS کو مزید استعمال کرنے کے لیے فوٹو گرافی کی پرت کو صاف کیا گیا۔ PDMS غیر محفوظ جھلی کو بنانے کے لیے استعمال ہونے والے سلیکون مولڈ کا، اوپری اور نچلے PDMS اجزاء کی تصویروں کی ایک سیریز اور آن چپ آنت کے آلے کو جمع کیا جاتا ہے۔ یعنی اوپری، جھلی، اور نچلے PDMS اجزاء کی سیدھ کی منصوبہ بندی۔ ہر پرت کو غیر تبدیل شدہ یا غیر متزلزل علاج کے ذریعے بنایا جاتا ہے۔ سپر امپوزڈ مائیکرو چینلز اور ویکیوم چیمبرز کے ساتھ ut-on-a-chip ڈیوائس، مائیکرو فلائیڈک سیل کلچر کے لیے گٹ آن-اے-چپ کا سیٹ اپ۔ سلیکون ٹیوب اور سرنج کے ساتھ اسمبل کردہ چپ پر من گھڑت گٹ کو کور سلپ پر رکھا گیا تھا۔ اس ڈیوائس کو ڈسپریپ 1 کے لیے لیپ 5 پر رکھا گیا تھا۔ سلیکون ٹیوب کو بند کرنے کے لیے استعمال کیا جاتا ہے، ہائبرڈ چپ فیبریکیشن کے بصری اسنیپ شاٹس اور ہائبرڈ چپس کا استعمال کرتے ہوئے تھری ڈی مورفوجینیسیس۔ ٹرانس ویل انسرٹس کو کلچر کے لیے آزادانہ طور پر تیار کیا گیا تھا آنتوں کے اپکلا خلیوں کے 2D monolayers کو ہائبرڈ چپ میں داخل کیا گیا تھا۔ ٹرانس ویل انسرٹ پر قائم سیل پرت کے نیچے مائیکرو چینلز کے ذریعے۔ اسکیل بار، 1 cm.h حوالہ سے اجازت کے ساتھ دوبارہ پرنٹ کیا گیا۔4۔ایلسیویئر۔
اس پروٹوکول میں، Caco-2 سیل لائن اور آنتوں کے آرگنائڈز کو اپکلا ذرائع (تصویر 3a) کے طور پر استعمال کیا گیا تھا۔ دونوں قسم کے خلیوں کو آزادانہ طور پر کلچر کیا گیا تھا (باکس 2 اور باکس 5) اور آن چپ گٹ یا ٹرانس ویل انسرٹس کے ای سی ایم کوٹڈ مائیکرو چینلز کو سیڈ کرنے کے لیے استعمال کیا جاتا ہے۔ (حصہ 10 اور 50 کے درمیان) ٹی فلاسکس میں ٹرپسنائزیشن فلوئڈ (باکس 2) کے ذریعے منقطع سیل سسپنشن تیار کرنے کے لیے کاٹا جاتا ہے۔ آنتوں کے بایپسی یا جراحی سے متعلق انسانی آنتوں کے آرگنائڈز کو میٹریجل اسکافولڈ ڈومز میں کلچر کیا گیا تھا تاکہ 24-مائیکرو سٹرکچرل سپورٹ مائیکرو سٹرکٹینم (مائیکرو سٹرکچر) پر مشتمل ہو۔ جیسا کہ Wnt، R-spondin، اور Noggin) اور باکس 3 میں بیان کیے گئے نمو کے عوامل کو ہر دوسرے دن اس وقت تک پورا کیا جاتا تھا جب تک کہ organoids بڑھ کر ~500 µm قطر تک نہ پہنچ جائیں۔ مکمل طور پر بڑھے ہوئے آرگنائڈز کی کٹائی کی جاتی ہے اور گٹ پر بیج ڈالنے کے لیے ایک خلیے میں منقطع ہو جاتے ہیں یا Transwell بیماری کی اطلاع کے مطابق ہمیں مختلف بیماریوں کی اطلاع دی جا سکتی ہے۔ قسم 12,13 (مثلاً السرٹیو کولائٹس، کروہن کی بیماری، کولوریکٹل کینسر، یا نارمل ڈونر)، زخم کی جگہ (مثلاً، زخم بمقابلہ غیر زخم والے علاقے) اور معدے کا مقام (مثلاً، گرہنی، جیجنم، آئیلیم، سیکم، بڑی آنت، یا ملاشی)۔ عام طور پر چھوٹے آنتوں کے آرگنائڈز کے مقابلے میں مورفوجینز کی زیادہ تعداد کی ضرورت ہوتی ہے۔
a، گٹ چپ میں گٹ مورفوجینیسیس کو شامل کرنے کے لیے ورک فلو۔ Caco-2 انسانی آنتوں کے اپکلا اور آنتوں کے آرگنائڈز کو اس پروٹوکول میں 3D مورفوجینیسیس کا مظاہرہ کرنے کے لیے استعمال کیا گیا ہے۔ الگ تھلگ اپیتھیلیل سیلز کو تیار شدہ گٹ-آن-اے-چیپ سیٹڈ سیلز (اٹیچڈ سیلز) میں سیڈ کیا گیا تھا (سیڈیڈ ڈیوائس)۔ ) دن 0 (D0) کو PDMS غیر محفوظ جھلی میں، apical (AP) کا بہاؤ شروع کیا جاتا ہے اور پہلے 2 دنوں تک برقرار رکھا جاتا ہے (flow, AP, D0-D2)۔ بیسولیٹرل (BL) بہاؤ بھی سائیکلک اسٹریچنگ حرکات کے ساتھ شروع کیا جاتا ہے (اسٹریچ، فلو، اے پی اور بی ایل ڈی 3 مکمل ہونے پر)۔ مائیکرو فلائیڈک کلچر کے 5 دنوں کے بعد بے ساختہ سرخ رنگ (مورفوجینیسیس، D5)۔ فیز کنٹراسٹ امیجز ہر تجرباتی قدم یا ٹائم پوائنٹ پر Caco-2 سیلز کی نمائندہ شکلیات کو ظاہر کرتی ہیں (بار گراف، 100 µm)۔ چار اسکیمیٹک ڈایاگرامس ظاہر کرتے ہیں کہ دائیں طرف سے آرمورفوجین کے متعلقہ cascades کی نمائندگی کرتے ہیں۔ fluid flow.b، SEM امیج جو قائم کردہ 3D Caco-2 اپیتھلیم (بائیں) کی سطحی ٹوپولوجی دکھا رہی ہے۔ میگنیفائیڈ ایریا (سفید ڈیشڈ باکس) کو نمایاں کرنے والا انسیٹ 3D Caco-2 پرت (دائیں) پر دوبارہ تخلیق شدہ مائیکروولی کو دکھاتا ہے۔ c، قائم Caco-2 کا افقی سامنے کا منظر، لگاتار claud-2 لابیلڈ (بائیں) -ایکٹین (سبز) اور نیوکلی (نیلا) آنتوں کے چپس پر اپکلا خلیوں کا امیونو فلوروسینس کنفوکل ویژولائزیشن۔ درمیانی اسکیمیٹک کی طرف اشارہ کرنے والے تیر ہر ایک کنفوکل ویو کے لیے فوکل ہوائی جہاز کے مقام کی نشاندہی کرتے ہیں۔ 13. انسیٹ (اوپر دائیں) فراہم کردہ امیج کی اعلی میگنیفیکیشن کو ظاہر کرتا ہے۔ یعنی، 7.f دن لی گئی سلائس پر گٹ میں آرگنائڈ 3D اپیتھلیم کا DIC فوٹومیکروگراف، اسٹیم سیلز کے لیے مارکر دکھاتے ہوئے اوورلیڈ امیونو فلوروسینس امیجز (LGR5;میجنٹا)، گوبلٹ سیلز (MUC2؛ سبز)، F-actin (گرے) اور نیوکلیائی (سیان) گٹ چپس پر 3 دن کے لیے اگائے گئے، بالترتیب (بائیں) اور 13 دن (درمیانی) آرگنائڈز اپکلا پرت پر۔ توسیعی ڈیٹا فگر 3 بھی دیکھیں، جو ایل جی 2 ایم یو کی علامت کے بغیر علامتی علامت ظاہر کرتا ہے۔ کلچر کے 13 ویں دن CellMask ڈائی (دائیں) کے ساتھ پلازما جھلی پر داغ لگا کر چپ پر گٹ میں 3D آرگنائڈ اپیٹیلیم کا ایتھلیئل مائکرو اسٹرکچر (دائیں)۔ اسکیل بار 50 μm ہے جب تک کہ دوسری صورت میں بیان نہ کیا گیا ہو۔آکسفورڈ یونیورسٹی پریس؛c حوالہ سے اجازت کے ساتھ موافقت۔2۔آکسفورڈ یونیورسٹی پریس؛e اور f حوالہ کے ذریعہ اجازت کے ساتھ موافقت پذیر۔ 12 کریٹیو کامنز لائسنس CC BY 4.0 کے تحت۔
ایک چپ پر گٹ میں، کامیاب ECM کوٹنگ کے لیے PDMS غیر محفوظ جھلی کی ہائیڈروفوبک سطح میں ترمیم کرنا ضروری ہے۔ اس پروٹوکول میں، ہم PDMS جھلیوں کی ہائیڈروفوبکٹی کو تبدیل کرنے کے لیے دو مختلف طریقے لاگو کرتے ہیں۔ Caco-2 خلیات کو کلچر کرنے کے لیے، PDMS کی سطح کو چالو کرنے کے لیے اکیلے UV/Hydrophobic علاج کے ذریعے سطح کی ایکٹیویشن کو کم کرنا تھا۔ ECM کوٹ کریں اور Caco-2 خلیات کو PDMS جھلی سے جوڑیں۔ تاہم، organoid epithelium کے مائیکرو فلائیڈک کلچر کو کیمیکل پر مبنی سطح کی فنکشنلائزیشن کی ضرورت ہوتی ہے تاکہ ECM پروٹینوں کو ترتیب وار پولیتھیلینیمین (PEI) اور گلوٹرالڈہائڈ کو PDMS پر لگا کر مؤثر طریقے سے جمع کیا جا سکے۔ سطح اور پھر الگ تھلگ آرگنائڈ اپیتھیلیم میں متعارف کرایا جاتا ہے۔ خلیات کے منسلک ہونے کے بعد، مائکرو فلائیڈک سیل کلچر صرف میڈیم کو اوپری مائیکرو چینل میں پرفیوز کرنے سے شروع ہوتا ہے جب تک کہ خلیے ایک مکمل مونولیئر نہیں بن جاتے، جبکہ نچلا مائکرو چینل جامد حالات کو برقرار رکھتا ہے۔ PDMS سطح
ٹرانس ویل ثقافتوں کو سیل سیڈنگ سے پہلے ECM کوٹنگ کی بھی ضرورت ہوتی ہے۔تاہم، ٹرانس ویل کلچرز کو غیر محفوظ داخلوں کی سطح کو چالو کرنے کے لیے پیچیدہ پری ٹریٹمنٹ اقدامات کی ضرورت نہیں ہوتی ہے۔ ٹرانس ویل انسرٹس پر بڑھتے ہوئے Caco-2 سیلز کے لیے، غیر محفوظ انسرٹس پر ECM کوٹنگ منقطع Caco-2 سیلز (<1 گھنٹہ) کے اٹیچمنٹ کو تیز کرتی ہے اور سخت جنکشن بیریئر فارمیشن (<1-2 کلچر پر ٹرانس ویلز یا سیویلڈ انسرٹس پر ہوتا ہے)۔ ای سی ایم لیپت داخل، جھلی کی سطح (<3 h) سے منسلک اور اس وقت تک برقرار رکھا جاتا ہے جب تک کہ آرگنائڈز رکاوٹ کی سالمیت کے ساتھ مکمل monolayer نہ بن جائیں۔ ٹرانس ویل کلچرز کو ہائبرڈ چپس کے استعمال کے بغیر 24 کنویں پلیٹوں میں انجام دیا جاتا ہے۔
ان وٹرو تھری ڈی مورفوجینیسیس کو ایک قائم شدہ اپیتھیلیل پرت کے باسولیٹرل پہلو پر سیال کے بہاؤ کو لاگو کرکے شروع کیا جا سکتا ہے۔ ایک چپ پر گٹ میں، اپیتھیلیل مورفوجنیسیس اس وقت شروع ہوا جب میڈیم کو اوپری اور نچلے مائکرو چینلز (تصویر 3a،) میں پرفیوز کیا گیا تھا۔ ڈائریکشنل سیکریٹڈ مورفوجن انحیبیٹرز کو مسلسل ہٹانے کے لیے کمپارٹمنٹ۔ غیر محفوظ جھلیوں پر جکڑے ہوئے خلیات کو کافی غذائی اجزاء اور سیرم فراہم کرنے اور لومینل شیئر اسٹریس پیدا کرنے کے لیے، ہم عام طور پر ایک چپ پر گٹ میں دوہری بہاؤ لگاتے ہیں۔ ہائبرڈ چپس میں، ٹرانس ویل انسرٹ ہوتے ہیں، جس میں موچیوتھائی شامل ہوتے ہیں۔ میڈیم کو مائیکرو چینل کے ذریعے غیر محفوظ ٹرانس ویل انسرٹ کے باسولیٹرل سائیڈ کے نیچے لگایا گیا تھا۔ دونوں کلچر پلیٹ فارمز میں باسولیٹرل بہاؤ شروع ہونے کے 3-5 دن بعد آنتوں کی مورفوجینیسس واقع ہوئی۔
مائکرو انجینئرڈ تھری ڈی اپکلا پرتوں کی اخلاقی خصوصیات کا تجزیہ مختلف امیجنگ طریقوں کو لاگو کرکے کیا جاسکتا ہے ، جس میں مرحلے کے برعکس مائکروسکوپی ، تفریق مداخلت کے برعکس (ڈی آئی سی) مائکروسکوپی ، ایس ای ایم ، یا امیونو فلوروسینس کنفوکل مائکروسکوپی (اعداد و شمار 3 اور 4) میں امیونو فلوروسلنس کنفوکل مائکروسکوپی (اعداد و شمار 3 اور 4) میں آسانی سے کام کیا جاسکتا ہے۔ آپٹیکل شفافیت PDMS اور پالئیےسٹر فلموں کی ، گٹ آن-ایک-چپ اور ہائبرڈ چپ پلیٹ فارم دونوں آلہ کے سیکشننگ یا بے ترکیبی کی ضرورت کے بغیر سیٹو امیجنگ میں حقیقی وقت فراہم کرسکتے ہیں۔ ایٹون ایکس -100 اور 2 ٪ (ڈبلیو ٹی/جلد)) بوائین سیرم البومین (بی ایس اے) ، ترتیب میں ، سیل کی قسم ، مختلف فکسٹیو ، پیرمیبیلائزرز ، اور بلاک کرنے والے ایجنٹوں کو استعمال کیا جاسکتا ہے۔ 4 ′ ، 6-ڈیمیڈینو -2-فینیلین) انڈول ، ڈی اے پی آئی) یا ایف ایکٹین (جیسے ، فلوروسینٹی لیبل لگا ہوا فیلائڈین)۔ فلوروسینس پر مبنی براہ راست امیجنگ بھی بلغم کی پیداوار کا پتہ لگانے کے لئے صورتحال میں انجام دی جاسکتی ہے (انجیر۔1، "خلیہ کی تفریق" اور "گٹ فزیالوجی")، مائکروبیل خلیوں کی بے ترتیب نوآبادیات (تصویر 1، "میزبان مائکروب کو کلچر")، مدافعتی خلیوں کی بھرتی (تصویر 1، 'ڈیزیز ماڈلنگ') یا 3D کی شکلیں، 3D اپیتھیلیل اور موڈیفائیف 3. اوپری پرت کو نچلی مائیکرو چینل پرت سے الگ کرنے کے لیے چپ پر گٹ، جیسا کہ تصویر 2 میں دکھایا گیا ہے، جیسا کہ تصویر 2 میں دکھایا گیا ہے، 3D اپیٹیلیل مورفولوجی کے ساتھ ساتھ اپیکل برش بارڈر پر موجود مائکروویلی کو SEM (تصویر 3b) کے ذریعے تصور کیا جا سکتا ہے۔ ، گٹ چپس یا ہائبرڈ چپس میں اگنے والے اپیٹیلیل خلیوں کی 3D تہوں کو ٹرپسنائزیشن کے ذریعہ کاٹا جاتا ہے اور پھر سالماتی یا جینیاتی تجزیہ کے لئے استعمال کیا جاتا ہے۔
a، ایک ہائبرڈ چپ میں آنتوں کی مورفوجینیسیس کی شمولیت کے لیے ورک فلو۔ اس پروٹوکول میں Caco-2 اور آنتوں کے آرگنائڈز کا استعمال ایک ہائبرڈ چپ پلیٹ فارم میں 3D مورفوجینیسیس کو ظاہر کرنے کے لیے کیا جاتا ہے۔ منقطع اپکلا خلیات کو تیار شدہ ٹرانس ویل میں سیڈ کیا گیا تھا اور ذیل میں ٹرانس ویل انسرٹ سیلز کو منسلک کیا گیا تھا۔ ٹرانس ویل انسرٹس میں پالئیےسٹر میمبرینز، تمام سیلز کو جامد حالات (TW کلچر) کے تحت کلچر کیا گیا تھا۔ 7 دنوں کے بعد، ایک ٹرانس ویل انسرٹ کو ایک ہائبرڈ چپ میں ضم کر دیا گیا جس میں اپیتھیلیل سیلز کا 2D monolayer شامل تھا تاکہ بیسولیٹرل فلو (فلو، BL) متعارف کرایا جا سکے، جس سے بالآخر مائیکرو لیئرز تھری ڈی کی ایک تہہ بن گئی۔ ہر تجرباتی مرحلے یا ٹائم پوائنٹ پر نارمل ڈونر (C103 لائن) سے اخذ کردہ انسانی اعضاء کے اپکلا خلیات کی مورفولوجیکل خصوصیات دکھاتے ہیں۔ اوپری تہوں میں اسکیمیٹکس ہر قدم کے لیے تجرباتی ترتیب کو واضح کرتے ہیں۔ مختلف Z پوزیشنوں پر (اوپری، درمیانی، اور نیچے؛صحیح اسکیمیٹک اور متعلقہ ڈاٹڈ لائنیں دیکھیں)۔واضح مورفولوجیکل خصوصیات دکھائیں۔ ایف ایکٹین (سیان)، نیوکلئس (گرے) سی، آرگنائیڈ سے ماخوذ اپیتھیلیل سیلز کے فلوروسینس کنفوکل مائیکرو گرافس (3D اینگلڈ ویو) جامد ٹرانس ویل میں کلچرڈ (TW؛ سفید ڈیشڈ باکس کے اندر اندر) بمقابلہ ہائبرڈ کمپیوسرنگ فلیورسٹنگ 3D، 3D، 2020 بالترتیب۔ 2D عمودی کراس کٹ ویوز کا ایک جوڑا (اوپر دائیں کونے میں نصب؛ "XZ") 2D اور 3D خصوصیات بھی دکھاتا ہے۔ اسکیل بار، 100 µm.c حوالہ سے اجازت کے ساتھ دوبارہ پرنٹ کیا گیا۔ایلسیویئر۔
روایتی جامد ثقافت کے حالات کے تحت ایک ہی خلیات (Caco-2 یا آنتوں کے آرگنائڈ اپکلا خلیات) کو دو جہتی monolayers میں کلچر کرکے کنٹرول تیار کیے جاسکتے ہیں۔ خاص طور پر، غذائی اجزاء کی کمی مائکرو چینلز کی محدود حجم کی گنجائش کی وجہ سے ہوسکتی ہے (یعنی ~4 µL)۔ basolateral بہاؤ کی درخواست کے بعد بھی موازنہ کیا جا سکتا ہے.
نرم لتھوگرافی کا عمل صاف ستھرا کمرے میں انجام دیا جانا چاہیے۔ چپ (اوپری اور نچلی تہوں اور جھلیوں) اور ہائبرڈ چپس پر ہر ایک پرت کے لیے، الگ الگ سلیکون ویفرز پر مختلف فوٹو ماسک استعمال کیے گئے اور گھڑے گئے کیونکہ مائیکرو چینلز کی اونچائیاں مختلف تھیں۔ اوپری اور نچلے مائیکرو چینلز کی ہدف کی اونچائییں g5µ0p0µ0p0µ0p0µ0p0µ0p0µ0p0µ0p0µ0pµ0pµ0pµ0µ0pµ0µ0pµchinels. m، بالترتیب۔ ہائبرڈ چپ کے چینل ہدف کی اونچائی 200 µm ہے۔
ایسٹون والی ڈش میں 3 انچ کا سلکان ویفر رکھیں۔ پلیٹ کو 30 سیکنڈ کے لیے ہلکے سے گھمائیں، پھر ویفر کو ہوا میں خشک کریں۔ IPA والی پلیٹ میں ویفر کو منتقل کریں، پھر پلیٹ کو 30 سیکنڈ تک صاف کرنے کے لیے گھمائیں۔
ایک پیرانہ محلول (ہائیڈروجن پیرو آکسائیڈ اور مرتکز سلفیورک ایسڈ کا مرکب، 1:3 (جلد/ والیوم)) اختیاری طور پر سلکان ویفر کی سطح سے نامیاتی باقیات کو زیادہ سے زیادہ ہٹانے کے لیے استعمال کیا جا سکتا ہے۔
پیرانہ محلول انتہائی سنکنرن ہے اور گرمی پیدا کرتا ہے۔ اضافی حفاظتی احتیاطیں ضروری ہیں۔ فضلے کو ٹھکانے لگانے کے لیے، محلول کو ٹھنڈا ہونے دیں اور صاف، خشک کچرے کے کنٹینر میں منتقل کریں۔ ثانوی کنٹینرز کا استعمال کریں اور فضلے کے کنٹینرز کو مناسب طریقے سے لیبل کریں۔ مزید تفصیلی طریقہ کار کے لیے براہ کرم سہولت کی حفاظتی ہدایات پر عمل کریں۔
ویفرز کو 10 منٹ کے لیے 200 ° C کی گرم پلیٹ میں رکھ کر پانی کی کمی کریں۔ پانی کی کمی کے بعد، ویفر کو ٹھنڈا ہونے کے لیے پانچ بار ہوا میں ہلایا گیا۔
صاف کیے گئے سلیکون ویفر کے بیچ میں ~10 گرام فوٹو ریزسٹ SU-8 2100 ڈالیں۔ فوٹو ریزسٹ کو ویفر پر یکساں طور پر پھیلانے کے لیے چمٹی کا استعمال کریں۔ کبھی کبھار ویفر کو 65 ° C گرم پلیٹ پر رکھیں تاکہ فوٹو ریزسٹ کو کم چپچپا اور پھیلانا آسان ہو۔
SU-8 کو سپن کوٹنگ چلا کر ویفر پر یکساں طور پر تقسیم کیا گیا۔ 5-10 s کے لیے SU-8 کی آنے والی گردش کو 100 rpm/s کی سرعت پر 500 rpm پر پھیلانے کے لیے پروگرام کریں۔ 200 µm موٹائی پیٹرننگ کے لیے مین اسپن سیٹ کریں چپ پر گٹ کی اوپری تہہ کے لیے 500 µm اونچائی؛ ذیل میں "اہم مراحل" دیکھیں) 1,200 rpm پر 300 rpm/s 30 سیکنڈ کے ایکسلریشن پر سیٹ کیا گیا ہے۔
سلکان ویفر پر SU-8 پیٹرن کی ہدف کی موٹائی کے مطابق مرکزی اسپن کی رفتار کو ایڈجسٹ کیا جا سکتا ہے۔
چپ پر گٹ کی اوپری پرت کے لیے 500 µm اونچائی کے SU-8 پیٹرن بنانے کے لیے، اس باکس کی اسپن کوٹنگ اور نرم بیک اسٹیپس (مرحلہ 7 اور 8) کو ترتیب وار دہرایا گیا (مرحلہ 9 دیکھیں) تاکہ 250 µm کی دو پرتیں تیار کی جا سکیں، جس میں SUV2 کی موٹی پرت اور UV1 کی اس پرت کو جوڑا جا سکتا ہے۔ 500 µm اونچی پرت بنانا۔
SU-8 کوٹڈ ویفرز کو نرم طریقے سے گرم پلیٹ پر 65 ° C پر 5 منٹ کے لیے رکھ کر نرم کریں، پھر سیٹنگ کو 95 ° C پر تبدیل کریں اور مزید 40 منٹ کے لیے انکیوبیٹ کریں۔
اوپری مائیکرو چینل میں SU-8 پیٹرن کی 500 μm اونچائی حاصل کرنے کے لیے، دو 250 μm موٹی SU-8 پرتیں بنانے کے لیے اقدامات 7 اور 8 کو دہرائیں۔
یووی ماسک الائنر کا استعمال کرتے ہوئے، ویفر کی نمائش کے وقت کا حساب لگانے کے لیے مینوفیکچرر کی ہدایات کے مطابق لیمپ ٹیسٹ کریں۔
نمائش کے وقت کا تعین کرنے کے بعد، فوٹو ماسک کو UV ماسک الائنر کے ماسک ہولڈر پر رکھیں اور فوٹو ماسک کو SU-8 کوٹڈ ویفر پر رکھیں۔
فوٹو ماسک کی پرنٹ شدہ سطح کو براہ راست سلیکون ویفر کے SU-8 کوٹڈ سائیڈ پر رکھیں تاکہ UV کے پھیلاؤ کو کم سے کم کیا جاسکے۔
پہلے سے طے شدہ نمائش کے وقت کے لیے SU-8 لیپت ویفر اور فوٹو ماسک کو عمودی طور پر 260 mJ/cm2 UV لائٹ پر ظاہر کریں (اس باکس کا مرحلہ 10 دیکھیں)۔
UV کی نمائش کے بعد، SU-8 کوٹڈ سلکان ویفرز کو 65°C پر 5 منٹ اور 95°C پر 15 منٹ کے لیے ہر ہاٹ پلیٹ پر 200 μm کی اونچائی کے ساتھ پیٹرن بنانے کے لیے بیک کیا گیا تھا۔ بیک بیک کے بعد کا وقت 95 °C سے 30 منٹ تک بڑھائیں
ڈویلپر کو شیشے کی ڈش میں ڈالا جاتا ہے، اور بیکڈ ویفر کو ڈش میں رکھا جاتا ہے۔ شیشے کی پلیٹ کے سائز کے لحاظ سے SU-8 ڈویلپر کا حجم مختلف ہو سکتا ہے۔ غیر ظاہر شدہ SU-8 کو مکمل طور پر ہٹانے کے لیے کافی SU-8 ڈویلپر کا استعمال یقینی بنائیں۔ مثال کے طور پر، 150 ملی میٹر قطر کی گلاس ڈش کا استعمال کرتے وقت، ایک 150 ملی میٹر ڈیولپر گلاس ~L00 ڈیولپمنٹ کی صلاحیت کے ساتھ SU-8 کا استعمال کریں۔ کبھی کبھار ہلکی گردش کے ساتھ 25 منٹ تک سڑنا۔
تیار شدہ مولڈ کو ~ 10 ملی لیٹر تازہ ڈویلپر کے ساتھ کللا کریں جس کے بعد آئی پی اے کو پائپیٹ کا استعمال کرتے ہوئے محلول کا چھڑکاؤ کریں۔
ویفر کو پلازما کلینر میں رکھیں اور 1.5 منٹ کے لیے آکسیجن پلازما (ماحول کی گیس، ہدف کا دباؤ 1 × 10−5 Torr، پاور 125 W) کے سامنے رکھیں۔
ویفر کو ویکیوم ڈیسیکیٹر میں رکھیں جس کے اندر شیشے کی سلائیڈ ہو۔ ویفرز اور سلائیڈز کو ساتھ ساتھ رکھا جا سکتا ہے۔ اگر ویکیوم ڈیسیکیٹر کو پلیٹ کے ذریعے کئی تہوں میں تقسیم کیا گیا ہے تو سلائیڈوں کو نچلے چیمبر میں اور ویفرز کو اوپری چیمبر میں رکھیں۔ fluorooctyl) silane محلول کو شیشے کی سلائیڈ پر ڈالیں اور سیلانائزیشن کے لیے ویکیوم لگائیں۔
منجمد Caco-2 خلیوں کی ایک شیشی کو 37°C کے پانی کے غسل میں پگھلا دیں، پھر پگھلے ہوئے خلیوں کو T75 فلاسک میں منتقل کریں جس میں 37°C پہلے سے تیار شدہ Caco-2 میڈیم کے 15 ملی لیٹر پر مشتمل ہو۔
Caco-2 سیلز کو ~90% سنگم پر منتقل کرنے کے لیے، پہلے گرم Caco-2 میڈیم، PBS، اور 0.25% trypsin/1 mM EDTA 37°C پانی کے غسل میں ڈالیں۔
ویکیوم اسپائریشن کے ذریعے میڈیم کو ایسپریٹ کریں۔ خلیات کو 5 ملی لیٹر گرم پی بی ایس سے دو بار دھوئیں اور ویکیوم اسپائریشن کو دہرائیں اور تازہ پی بی ایس شامل کریں۔