Nature.com پر جانے کا شکریہ۔آپ جس براؤزر کا ورژن استعمال کر رہے ہیں اسے محدود CSS سپورٹ حاصل ہے۔بہترین تجربے کے لیے، ہم تجویز کرتے ہیں کہ آپ ایک اپ ڈیٹ شدہ براؤزر استعمال کریں (یا انٹرنیٹ ایکسپلورر میں مطابقت موڈ کو غیر فعال کریں)۔اس دوران، مسلسل تعاون کو یقینی بنانے کے لیے، ہم سائٹ کو بغیر اسٹائل اور جاوا اسکرپٹ کے رینڈر کریں گے۔
مائکروبیل پرجیویوں کے ارتقاء میں قدرتی انتخاب کے درمیان ایک رد عمل شامل ہے، جس کی وجہ سے پرجیویوں میں بہتری آتی ہے، اور جینیاتی بہاؤ، جس کی وجہ سے پرجیویوں کے جین کھو جاتے ہیں اور نقصان دہ تغیرات جمع ہوتے ہیں۔یہاں، یہ سمجھنے کے لیے کہ یہ کاونٹریکشن کسی ایک میکرومولکول کے پیمانے پر کیسے ہوتا ہے، ہم Encephalitozoon cuniculi کے رائبوزوم کے cryo-EM ڈھانچے کی وضاحت کرتے ہیں، جو فطرت میں سب سے چھوٹے جینوموں میں سے ایک کے ساتھ یوکرائیوٹک جاندار ہے۔E. cuniculi ribosomes میں rRNA کی انتہائی کمی بے مثال ساختی تبدیلیوں کے ساتھ ہوتی ہے، جیسے کہ پہلے نامعلوم فیوزڈ rRNA لنکرز اور بلجز کے بغیر rRNA کا ارتقاء۔اس کے علاوہ، E. cuniculi ribosome rRNA کے ٹکڑوں اور پروٹینوں کے نقصان سے بچ گیا اور چھوٹے مالیکیولز کو انحطاط پذیر rRNA کے ٹکڑوں اور پروٹینوں کی ساختی نقل کے طور پر استعمال کرنے کی صلاحیت پیدا کر کے۔مجموعی طور پر، ہم یہ ظاہر کرتے ہیں کہ مالیکیولر ڈھانچے کو طویل عرصے سے کم، انحطاط، اور کمزور تغیرات کے تابع سمجھا جاتا ہے ان میں متعدد معاوضہ میکانزم ہوتے ہیں جو انتہائی سالماتی سنکچن کے باوجود انہیں متحرک رکھتے ہیں۔
چونکہ مائکروبیل پرجیویوں کے زیادہ تر گروہوں کے پاس اپنے میزبانوں کا استحصال کرنے کے لیے منفرد مالیکیولر ٹولز ہوتے ہیں، اس لیے ہمیں اکثر پرجیویوں کے مختلف گروپوں کے لیے مختلف علاج تیار کرنے ہوتے ہیں۔تاہم، نئے شواہد سے پتہ چلتا ہے کہ پرجیوی ارتقاء کے کچھ پہلو متضاد اور بڑی حد تک پیش قیاسی ہیں، جو مائکروبیل پرجیویوں3،4،5،6،7،8،9 میں وسیع علاج کی مداخلت کی ممکنہ بنیاد کی نشاندہی کرتے ہیں۔
پچھلے کام نے مائکروبیل پرجیویوں میں ایک عام ارتقائی رجحان کی نشاندہی کی ہے جسے جینوم میں کمی یا جینوم ڈیکی 10,11,12,13 کہا جاتا ہے۔موجودہ تحقیق سے پتہ چلتا ہے کہ جب مائکروجنزم اپنا آزادانہ طرز زندگی ترک کر دیتے ہیں اور انٹرا سیلولر پرجیویوں (یا اینڈو سیمبیونٹس) بن جاتے ہیں، تو ان کے جینومز لاکھوں سالوں میں سست لیکن حیرت انگیز میٹامورفوز سے گزرتے ہیں 9,11۔جینوم ڈے کے نام سے جانے والے ایک عمل میں، مائکروبیل پرجیوی نقصان دہ تغیرات جمع کرتے ہیں جو بہت سے پہلے اہم جینوں کو سیڈوجینز میں تبدیل کر دیتے ہیں، جس سے بتدریج جین کا نقصان ہوتا ہے اور 14,15 کا تغیراتی خاتمہ ہوتا ہے۔یہ گرنے سے سب سے پرانے انٹرا سیلولر جانداروں کے 95 فیصد تک جینز کو قریب سے متعلقہ آزاد جاندار پرجاتیوں کے مقابلے میں تباہ کیا جا سکتا ہے۔اس طرح، انٹرا سیلولر پرجیویوں کا ارتقاء دو مخالف قوتوں کے درمیان ٹگ آف وار ہے: ڈارون کا قدرتی انتخاب، پرجیویوں کی بہتری، اور جینوم کے خاتمے کا باعث بنتا ہے، پرجیویوں کو فراموشی میں پھینک دیتا ہے۔پرجیوی اس ٹگ آف وار سے ابھرنے اور اپنی سالماتی ساخت کی سرگرمی کو برقرار رکھنے میں کیسے کامیاب ہوا یہ ابھی تک واضح نہیں ہے۔
اگرچہ جینوم کشی کا طریقہ کار پوری طرح سے سمجھ میں نہیں آتا ہے، لیکن ایسا لگتا ہے کہ یہ اکثر جینیاتی بڑھنے کی وجہ سے ہوتا ہے۔چونکہ پرجیوی چھوٹی، غیر جنسی اور جینیاتی طور پر محدود آبادی میں رہتے ہیں، اس لیے وہ مؤثر طریقے سے نقصان دہ تغیرات کو ختم نہیں کر سکتے جو کبھی کبھی ڈی این اے کی نقل کے دوران رونما ہوتے ہیں۔یہ نقصان دہ تغیرات کے ناقابل واپسی جمع اور پرجیوی جینوم کی کمی کی طرف جاتا ہے۔نتیجے کے طور پر، پرجیوی نہ صرف ان جینز کو کھو دیتا ہے جو انٹرا سیلولر ماحول میں اس کی بقا کے لیے ضروری نہیں ہیں۔یہ پرجیوی آبادی کی چھٹپٹ نقصان دہ اتپریورتنوں کو مؤثر طریقے سے ختم کرنے میں ناکامی ہے جس کی وجہ سے یہ تغیرات پورے جینوم میں جمع ہوتے ہیں، بشمول ان کے اہم ترین جین۔
جینوم میں کمی کے بارے میں ہماری زیادہ تر موجودہ تفہیم مکمل طور پر جینوم کی ترتیب کے تقابل پر مبنی ہے، جس میں حقیقی مالیکیولز میں تبدیلیوں پر کم توجہ دی جاتی ہے جو ہاؤس کیپنگ کے کام انجام دیتے ہیں اور ممکنہ منشیات کے اہداف کے طور پر کام کرتے ہیں۔تقابلی مطالعات سے پتہ چلتا ہے کہ نقصان دہ انٹرا سیلولر مائکروبیل اتپریورتنوں کا بوجھ پروٹین اور نیوکلک ایسڈ کو غلط فولڈ اور جمع کرنے کا امکان ظاہر کرتا ہے ، جس سے وہ زیادہ چیپیرون پر انحصار کرتے ہیں اور 19,20,21,22,23 کو گرمی کے لیے انتہائی حساس بناتے ہیں۔مزید برآں، مختلف پرجیویوں - آزاد ارتقاء کو بعض اوقات 2.5 بلین سالوں سے الگ کیا جاتا ہے - کو اپنے پروٹین کی ترکیب5,6 اور ڈی این اے کی مرمت کے طریقہ کار میں کوالٹی کنٹرول سینٹرز کے اسی طرح کے نقصان کا سامنا کرنا پڑا۔تاہم، سیلولر میکرو مالیکیولس کی دیگر تمام خصوصیات پر انٹرا سیلولر طرز زندگی کے اثرات کے بارے میں بہت کم معلومات ہیں، بشمول نقصان دہ تغیرات کے بڑھتے ہوئے بوجھ کے لیے مالیکیولر موافقت۔
اس کام میں، انٹرا سیلولر مائکروجنزموں کے پروٹین اور نیوکلک ایسڈ کے ارتقا کو بہتر طور پر سمجھنے کے لیے، ہم نے انٹرا سیلولر پرجیوی Encephalitozoon cuniculi کے رائبوزوم کی ساخت کا تعین کیا۔E. cuniculi ایک فنگس نما جاندار ہے جو پرجیوی مائیکرو اسپوریڈیا کے ایک گروپ سے تعلق رکھتا ہے جس میں غیر معمولی طور پر چھوٹے یوکرائیوٹک جینوم ہوتے ہیں اور اس وجہ سے جینوم کے زوال کا مطالعہ کرنے کے لیے نمونہ حیاتیات کے طور پر استعمال ہوتے ہیں 25,26,27,28,29,30۔حال ہی میں، کرائیو-ای ایم رائبوزوم ڈھانچہ مائکرو اسپوریڈیا، پیرانوزیما لوکاسٹے، اور ویریموفا نیکاٹریکس 31,32 (~ 3.2 Mb جینوم) کے اعتدال سے کم جینوم کے لئے طے کیا گیا تھا۔یہ ڈھانچے تجویز کرتے ہیں کہ rRNA پروردن کے کچھ نقصان کی تلافی پڑوسی رائبوسومل پروٹین کے مابین نئے رابطوں کی نشوونما یا نئے msL131,32 رائبوسومل پروٹین کے حصول سے کی جاتی ہے۔انواع Encephalitozoon (جینوم ~2.5 ملین bp)، اپنے قریبی رشتہ دار Ordospora کے ساتھ، eukaryotes میں جینوم کی کمی کی حتمی ڈگری کا مظاہرہ کرتے ہیں - ان کے پاس 2000 سے کم پروٹین کوڈنگ جین ہوتے ہیں، اور یہ توقع کی جاتی ہے کہ ان کے رائبوزوم نہ صرف rRNA کے پھیلاؤ سے مبرا ہیں بیکٹیریل رائبوزوم) میں بھی چار رائبوسومل پروٹین ہوتے ہیں جس کی وجہ E. cuniculi genome 26,27,28 میں ہومولوگس کی کمی ہے۔لہذا، ہم نے یہ نتیجہ اخذ کیا کہ E. cuniculi ribosome جینوم کے خاتمے کے لیے سالماتی موافقت کے لیے پہلے کی نامعلوم حکمت عملیوں کو ظاہر کر سکتا ہے۔
ہمارا cryo-EM ڈھانچہ سب سے چھوٹے یوکرائیوٹک سائٹوپلاسمک رائبوزوم کی نمائندگی کرتا ہے جس کی خصوصیت کی جائے اور یہ بصیرت فراہم کرتا ہے کہ جینوم میں کمی کی حتمی ڈگری مالیکیولر مشینری کی ساخت، اسمبلی اور ارتقاء کو کس طرح متاثر کرتی ہے جو کہ سیل کے لیے لازمی ہے۔ہم نے پایا کہ E. cuniculi ribosome RNA فولڈنگ اور رائبوزوم اسمبلی کے بہت سے وسیع پیمانے پر محفوظ اصولوں کی خلاف ورزی کرتا ہے، اور اس نے ایک نیا، پہلے نامعلوم رائبوسومل پروٹین دریافت کیا۔بالکل غیر متوقع طور پر، ہم یہ ظاہر کرتے ہیں کہ مائیکرو اسپوریڈیا رائبوزوم نے چھوٹے مالیکیولز کو باندھنے کی صلاحیت تیار کی ہے، اور یہ قیاس کیا ہے کہ rRNA اور پروٹین میں کٹوتی ارتقائی اختراعات کو متحرک کرتی ہے جو بالآخر رائبوزوم کو مفید خصوصیات فراہم کر سکتی ہیں۔
انٹرا سیلولر جانداروں میں پروٹین اور نیوکلک ایسڈز کے ارتقاء کے بارے میں ہماری سمجھ کو بہتر بنانے کے لیے، ہم نے E. cuniculi spores کو متاثرہ ممالیہ کے خلیوں کی ثقافتوں سے الگ کرنے کا فیصلہ کیا تاکہ ان کے رائبوزوم کو صاف کیا جا سکے اور ان رائبوسومز کی ساخت کا تعین کیا جا سکے۔پرجیوی مائیکرو اسپوریڈیا کی ایک بڑی تعداد حاصل کرنا مشکل ہے کیونکہ مائیکرو اسپوریڈیا کو غذائیت والے میڈیم میں کلچر نہیں کیا جاسکتا۔اس کے بجائے، وہ صرف میزبان سیل کے اندر بڑھتے اور دوبارہ پیدا کرتے ہیں۔لہذا، رائبوزوم پیوریفیکیشن کے لیے E. cuniculi biomass حاصل کرنے کے لیے، ہم نے ممالیہ گردے کی سیل لائن RK13 کو E. cuniculi spores سے متاثر کیا اور E. cuniculi کو بڑھنے اور بڑھنے کی اجازت دینے کے لیے ان متاثرہ خلیوں کو کئی ہفتوں تک کلچر کیا۔تقریباً آدھے مربع میٹر کے ایک متاثرہ سیل مونولیئر کا استعمال کرتے ہوئے، ہم تقریباً 300 ملی گرام مائیکرو اسپوریڈیا بیضوں کو صاف کرنے اور رائبوسومز کو الگ تھلگ کرنے کے لیے استعمال کرنے میں کامیاب ہوئے۔اس کے بعد ہم نے شیشے کے موتیوں کے ساتھ صاف شدہ بیضوں میں خلل ڈالا اور لائسیٹس کے مرحلہ وار پولی تھیلین گلائکول فریکشن کا استعمال کرتے ہوئے خام رائبوسومز کو الگ تھلگ کیا۔اس سے ہمیں ساختی تجزیہ کے لیے تقریباً 300 µg خام E. cuniculi ribosomes حاصل کرنے کا موقع ملا۔
اس کے بعد ہم نے نتیجے میں رائبوزوم نمونوں کا استعمال کرتے ہوئے کریو-EM تصاویر اکٹھی کیں اور بڑے رائبوسومل سبونائٹ، چھوٹے سبونائٹ ہیڈ، اور چھوٹے سبونائٹ کے مساوی ماسک کا استعمال کرتے ہوئے ان تصاویر پر کارروائی کی۔اس عمل کے دوران، ہم نے تقریباً 108,000 رائبوسومل ذرات کی تصاویر اکٹھی کیں اور 2.7 Å (ضمنی اعداد و شمار 1-3) کی ریزولوشن کے ساتھ کمپیوٹڈ کرائیو-EM تصاویر حاصل کیں۔اس کے بعد ہم نے rRNA، ribosomal پروٹین، اور E. cuniculi ribosomes (تصویر 1a، b) سے وابستہ ہائبرنیشن فیکٹر Mdf1 کو ماڈل کرنے کے لیے cryoEM امیجز کا استعمال کیا۔
ہائبرنیشن فیکٹر Mdf1 (pdb id 7QEP) کے ساتھ کمپلیکس میں E. cuniculi ribosome کی ساخت۔b E. cuniculi ribosome سے وابستہ ہائبرنیشن فیکٹر Mdf1 کا نقشہ۔c ثانوی ڈھانچے کا نقشہ جس میں مائیکرو اسپوریڈین پرجاتیوں میں برآمد شدہ rRNA کا معروف رائبوسومل ڈھانچے سے موازنہ کیا جاتا ہے۔پینلز ایمپلیفائیڈ آر آر این اے فریگمنٹس (ES) اور رائبوزوم ایکٹو سائٹس کا مقام دکھاتے ہیں، بشمول ڈی کوڈنگ سائٹ (DC)، سارسینیسن لوپ (SRL)، اور پیپٹائڈل ٹرانسفراس سینٹر (PTC)۔d الیکٹران کی کثافت E. cuniculi ribosome کے peptidyl transferase مرکز سے مماثل ہے کہ یہ اتپریرک سائٹ E. cuniculi parasite اور H. sapiens سمیت اس کے میزبانوں میں ایک جیسی ساخت رکھتی ہے۔e, f ضابطہ کشائی مرکز (e) کی متعلقہ الیکٹران کثافت اور ضابطہ کشائی مرکز (f) کی اسکیمیٹک ساخت اس بات کی نشاندہی کرتی ہے کہ E. cuniculi میں A1491 کی بجائے U1491 باقیات ہیں (E. coli numbering) بہت سے دوسرے eukaryotes میں۔اس تبدیلی سے پتہ چلتا ہے کہ E. cuniculi اینٹی بائیوٹکس کے لیے حساس ہو سکتا ہے جو اس فعال سائٹ کو نشانہ بناتے ہیں۔
V. necatrix اور P. locustae ribosomes کے پہلے سے قائم ڈھانچے کے برعکس (دونوں ڈھانچے ایک ہی microsporidia family Nosematidae کی نمائندگی کرتے ہیں اور ایک دوسرے سے بہت ملتے جلتے ہیں)، 31,32 E. cuniculi ribosomes rRNA اور پروٹین کے ٹکڑے کرنے کے متعدد عمل سے گزرتے ہیں۔مزید ڈینیچریشن (ضمنی اعداد و شمار 4-6)۔rRNA میں، سب سے زیادہ حیران کن تبدیلیوں میں ایمپلیفائیڈ 25S rRNA فریگمنٹ ES12L کا مکمل نقصان اور h39، h41، اور H18 ہیلیکس کا جزوی انحطاط شامل ہے (تصویر 1c، ضمنی شکل 4)۔رائبوسومل پروٹینوں میں، سب سے زیادہ حیران کن تبدیلیوں میں eS30 پروٹین کا مکمل نقصان اور eL8، eL13، eL18، eL22، eL29، eL40، uS3، uS9، uS14، uS17، اور eS7 پروٹین (ضمنی اعداد و شمار 4، 5) شامل تھے۔
اس طرح، Encephalotozoon/Ordospora پرجاتیوں کے جینوموں کی انتہائی کمی ان کے رائبوزوم کی ساخت میں جھلکتی ہے: E. cuniculi ribosomes ساختی خصوصیات کے تحت یوکریوٹک سائٹوپلاسمک رائبوزوم میں پروٹین کے مواد کی سب سے زیادہ ڈرامائی کمی کا تجربہ کرتے ہیں، اور ان کے پاس وہ بھی نہیں ہوتے ہیں جو صرف تینوں فروڈیز اور آر آر این اے میں ہوتے ہیں، جو پروٹین کے وسیع پیمانے پر ہوتے ہیں۔ زندگی کے ڈومینز.E. cuniculi ribosome کی ساخت ان تبدیلیوں کے لیے پہلا مالیکیولر ماڈل فراہم کرتی ہے اور ارتقائی واقعات کو ظاہر کرتی ہے جن کو تقابلی جینومکس اور انٹرا سیلولر بائیو مالیکولر ڈھانچے کے مطالعہ (ضمنی شکل 7) دونوں نے نظر انداز کیا ہے۔ذیل میں، ہم ان واقعات میں سے ہر ایک کو ان کے ممکنہ ارتقائی ماخذ اور رائبوزوم فنکشن پر ان کے ممکنہ اثرات کے ساتھ بیان کرتے ہیں۔
پھر ہم نے پایا کہ بڑی آر آر این اے کٹوتی کے علاوہ، ای کیونیکولی رائبوسومز میں اپنی ایک فعال جگہ پر آر آر این اے کی مختلف حالتیں ہیں۔اگرچہ E. cuniculi ribosome کے peptidyl transferase center کی ساخت دیگر eukaryotic ribosomes جیسی ہے (تصویر 1d)، نیوکلیوٹائڈ 1491 (E. کولی نمبرنگ، تصویر 1e، f) میں ترتیب کے تغیر کی وجہ سے ضابطہ کشائی کا مرکز مختلف ہے۔یہ مشاہدہ اہم ہے کیونکہ یوکرائیوٹک رائبوزوم کی ضابطہ کشائی کرنے والی سائٹ میں عام طور پر بیکٹیریل قسم کی باقیات A1408 اور G1491 کے مقابلے میں G1408 اور A1491 کی باقیات ہوتی ہیں۔یہ تغیر بیکٹیریل اور یوکرائیوٹک رائبوزوم کی مختلف حساسیت پر مشتمل ہے جو رائبوسومل اینٹی بائیوٹکس اور دیگر چھوٹے مالیکیولز کے امینوگلیکوسائیڈ فیملی کے لیے ہے جو ڈی کوڈنگ سائٹ کو نشانہ بناتے ہیں۔E. cuniculi ribosome کی ضابطہ کشائی کرنے والی جگہ پر، باقیات A1491 کو U1491 سے بدل دیا گیا، ممکنہ طور پر اس فعال سائٹ کو نشانہ بنانے والے چھوٹے مالیکیولز کے لیے ایک منفرد بائنڈنگ انٹرفیس بنا۔یہی A14901 مختلف قسم کے دیگر مائیکرو اسپوریڈیا جیسے P. locustae اور V. necatrix میں بھی موجود ہے، جو تجویز کرتا ہے کہ یہ مائکرو اسپوریڈیا پرجاتیوں (تصویر 1f) میں وسیع ہے۔
چونکہ ہمارے E. cuniculi ribosome کے نمونے میٹابولک طور پر غیر فعال spores سے الگ تھلگ تھے، اس لیے ہم نے E. cuniculi کے cryo-EM نقشے کو تناؤ یا بھوک کی حالت میں پہلے بیان کردہ رائبوزوم بائنڈنگ کے لیے جانچا۔ہائبرنیشن عوامل 31,32,36,37, 38۔ ہم نے ہائیبرنیشن رائبوزوم کی پہلے سے قائم کردہ ساخت کو E. cuniculi ribosome کے cryo-EM نقشے کے ساتھ ملایا۔ڈاکنگ کے لیے، S. cerevisiae ribosomes کو ہائبرنیشن فیکٹر Stm138 کے ساتھ کمپلیکس میں، Lso232 فیکٹر کے ساتھ کمپلیکس میں Locust ribosomes اور Mdf1 اور Mdf231 فیکٹر کے ساتھ کمپلیکس میں V. necatrix رائبوزوم استعمال کیا گیا تھا۔ایک ہی وقت میں، ہمیں cryo-EM کثافت باقی عنصر Mdf1 کے مطابق ملی۔Mdf1 V. necatrix ribosome کے پابند ہونے کی طرح، Mdf1 E. cuniculi ribosome سے بھی منسلک ہوتا ہے، جہاں یہ رائبوزوم کی E سائٹ کو بلاک کرتا ہے، ممکنہ طور پر جب پرجیوی بیضہ جسم کے غیر فعال ہونے پر میٹابولک طور پر غیر فعال ہو جاتے ہیں تو رائبوزوم کو دستیاب کرنے میں مدد کرتا ہے۔)۔
Mdf1 رائبوزوم کی E سائٹ کو روکتا ہے، جو ایسا لگتا ہے کہ جب پرجیوی بیضہ میٹابولک طور پر غیر فعال ہو جاتا ہے تو رائبوزوم کو غیر فعال کرنے میں مدد کرتا ہے۔E. cuniculi ribosome کی ساخت میں، ہم نے پایا کہ Mdf1 L1 رائبوزوم اسٹیم کے ساتھ پہلے سے نامعلوم رابطہ بناتا ہے، رائبوزوم کا وہ حصہ جو پروٹین کی ترکیب کے دوران رائبوزوم سے deacylated tRNA کے اخراج میں سہولت فراہم کرتا ہے۔یہ رابطے تجویز کرتے ہیں کہ Mdf1 اسی طریقہ کار کا استعمال کرتے ہوئے رائبوزوم سے الگ ہوجاتا ہے جیسا کہ deacetylated tRNA، اس بات کی ممکنہ وضاحت فراہم کرتا ہے کہ کس طرح رائبوزوم Mdf1 کو پروٹین کی ترکیب کو دوبارہ فعال کرنے کے لیے ہٹاتا ہے۔
تاہم، ہماری ساخت نے Mdf1 اور L1 رائبوزوم ٹانگ (رائبوزوم کا وہ حصہ جو پروٹین کی ترکیب کے دوران رائبوزوم سے deacylated tRNA کو خارج کرنے میں مدد کرتا ہے) کے درمیان ایک نامعلوم رابطے کا انکشاف کیا۔خاص طور پر، Mdf1 وہی رابطوں کا استعمال کرتا ہے جو deacylated tRNA مالیکیول (تصویر 2) کے کہنی والے حصے کے طور پر کرتا ہے۔اس سے پہلے نامعلوم مالیکیولر ماڈلنگ سے پتہ چلتا ہے کہ Mdf1 اسی طریقہ کار کا استعمال کرتے ہوئے رائبوزوم سے الگ ہوجاتا ہے جیسا کہ deacetylated tRNA، جو یہ بتاتا ہے کہ کس طرح رائبوزوم پروٹین کی ترکیب کو دوبارہ فعال کرنے کے لیے اس ہائبرنیشن عنصر کو ہٹاتا ہے۔
rRNA ماڈل کی تعمیر کرتے وقت، ہم نے پایا کہ E. cuniculi ribosome میں غیر معمولی طور پر rRNA کے ٹکڑے ہیں، جنہیں ہم نے فیوزڈ rRNA (تصویر 3) کہا ہے۔رائبوسومز میں جو زندگی کے تین ڈومینز پر محیط ہوتے ہیں، rRNA ان ڈھانچے میں فولڈ ہو جاتے ہیں جن میں زیادہ تر rRNA اڈے یا تو بیس جوڑے اور ایک دوسرے کے ساتھ فولڈ ہوتے ہیں یا رائبوسومل پروٹین 38,39,40 کے ساتھ تعامل کرتے ہیں۔تاہم، E. cuniculi ribosomes میں، rRNAs اپنے کچھ ہیلیکس کو کھولے ہوئے rRNA خطوں میں تبدیل کرکے فولڈنگ کے اس اصول کی خلاف ورزی کرتے نظر آتے ہیں۔
S. cerevisiae، V. necatrix، اور E. cuniculi میں H18 25S rRNA ہیلکس کی ساخت۔عام طور پر، تین لائف ڈومینز پر محیط رائبوزوم میں، یہ لنکر ایک RNA ہیلکس میں جوڑتا ہے جس میں 24 سے 34 باقیات ہوتے ہیں۔Microsporidia میں، اس کے برعکس، یہ rRNA لنکر بتدریج دو سنگل پھنسے ہوئے یوریڈین سے بھرپور لنکرز تک کم ہو جاتا ہے جس میں صرف 12 باقیات ہوتے ہیں۔ان میں سے زیادہ تر باقیات سالوینٹس کے سامنے آتی ہیں۔اعداد و شمار سے پتہ چلتا ہے کہ پرجیوی مائکرو اسپوریڈیا rRNA فولڈنگ کے عمومی اصولوں کی خلاف ورزی کرتا دکھائی دیتا ہے، جہاں rRNA اڈے عام طور پر دوسرے اڈوں کے ساتھ جوڑے جاتے ہیں یا rRNA-پروٹین کے تعامل میں شامل ہوتے ہیں۔مائیکرو اسپوریڈیا میں، کچھ rRNA کے ٹکڑے ایک ناموافق تہہ اختیار کرتے ہیں، جس میں سابقہ ​​rRNA ہیلکس تقریباً ایک سیدھی لکیر میں لمبا ایک واحد پھنسے ہوئے ٹکڑا بن جاتا ہے۔ان غیر معمولی علاقوں کی موجودگی مائکرو اسپوریڈیا آر آر این اے کو کم سے کم تعداد میں آر این اے بیسز کا استعمال کرتے ہوئے دور دراز کے آر آر این اے کے ٹکڑوں کو باندھنے کی اجازت دیتی ہے۔
اس ارتقائی تبدیلی کی سب سے نمایاں مثال H18 25S rRNA ہیلکس (تصویر 3) میں دیکھی جا سکتی ہے۔ای کولی سے انسانوں تک کی انواع میں، اس rRNA ہیلکس کی بنیادیں 24-32 نیوکلیوٹائڈز پر مشتمل ہوتی ہیں، جو قدرے بے قاعدہ ہیلکس بناتی ہیں۔V. necatrix اور P. locustae سے پہلے سے شناخت شدہ رائبوسومل ڈھانچے میں، 31,32 H18 ہیلکس کی بنیادیں جزوی طور پر غیر منقطع ہیں، لیکن نیوکلیوٹائڈ بیس جوڑا محفوظ ہے۔تاہم، E. cuniculi میں یہ rRNA ٹکڑا مختصر ترین لنکر 228UUUGU232 اور 301UUUUUUUU307 بن جاتا ہے۔عام rRNA کے ٹکڑوں کے برعکس، یہ uridine سے بھرپور لنکرز رائبوسومل پروٹین کے ساتھ کوائل یا وسیع رابطہ نہیں کرتے۔اس کے بجائے، وہ سالوینٹس کے کھلے اور مکمل طور پر کھلے ہوئے ڈھانچے کو اپناتے ہیں جس میں rRNA اسٹرینڈ کو تقریباً سیدھے بڑھایا جاتا ہے۔یہ پھیلی ہوئی شکل بتاتی ہے کہ کس طرح E. cuniculi H16 اور H18 rRNA ہیلیکس کے درمیان 33 Å خلا کو پُر کرنے کے لیے صرف 12 RNA اڈوں کا استعمال کرتا ہے، جبکہ دوسری نسلوں کو اس خلا کو پُر کرنے کے لیے کم از کم دو گنا زیادہ rRNA بیسز کی ضرورت ہوتی ہے۔
اس طرح، ہم یہ ظاہر کر سکتے ہیں کہ، توانائی کے لحاظ سے ناموافق فولڈنگ کے ذریعے، پرجیوی مائیکرو اسپوریڈیا نے ان rRNA حصوں کو بھی معاہدہ کرنے کی حکمت عملی تیار کی ہے جو زندگی کے تین شعبوں میں پرجاتیوں میں وسیع پیمانے پر محفوظ رہتے ہیں۔بظاہر، rRNA ہیلیکس کو مختصر پولی-U لنکرز میں تبدیل کرنے والے اتپریورتنوں کو جمع کرنے سے، E. cuniculi غیر معمولی rRNA ٹکڑوں کو تشکیل دے سکتا ہے جس میں کم سے کم نیوکلیوٹائڈز ہوتے ہیں تاکہ دور دراز کے rRNA کے ٹکڑوں کو بند کیا جا سکے۔اس سے یہ بتانے میں مدد ملتی ہے کہ کس طرح مائیکرو اسپوریڈیا نے اپنی ساختی اور فعال سالمیت کو کھونے کے بغیر اپنی بنیادی سالماتی ساخت میں ڈرامائی کمی حاصل کی۔
E. cuniculi rRNA کی ایک اور غیر معمولی خصوصیت rRNA کا بغیر گاڑھا ہونا ہے (تصویر 4)۔بلج بیس جوڑوں کے بغیر نیوکلیوٹائڈز ہیں جو RNA ہیلکس میں چھپنے کے بجائے باہر مڑ جاتے ہیں۔زیادہ تر rRNA پروٹریشن سالماتی چپکنے والے کے طور پر کام کرتے ہیں، ملحقہ رائبوسومل پروٹین یا دیگر rRNA ٹکڑوں کو باندھنے میں مدد کرتے ہیں۔کچھ بلجز قلابے کے طور پر کام کرتے ہیں، جس سے rRNA ہیلکس کو بہتر طریقے سے موڑنے اور پروٹین کی پیداواری ترکیب کے لیے فولڈ کرنے کی اجازت ملتی ہے 41۔
ایک rRNA پروٹروژن (S. cerevisiae numbering) E. cuniculi ribosome ڈھانچے سے غائب ہے، لیکن زیادہ تر دیگر eukaryotes b E. coli، S. cerevisiae، H. sapiens، اور E. cuniculi اندرونی رائبوزوم میں موجود ہے۔پرجیویوں میں بہت سے قدیم، انتہائی محفوظ آر آر این اے بلجز کی کمی ہے۔یہ گاڑھا ہونا رائبوزوم کی ساخت کو مستحکم کرتا ہے۔لہذا، مائیکرو اسپوریڈیا میں ان کی عدم موجودگی مائیکرو اسپوریڈیا پرجیویوں میں آر آر این اے فولڈنگ کے کم استحکام کی نشاندہی کرتی ہے۔پی تنوں کے ساتھ موازنہ (بیکٹیریا میں L7/L12 تنوں) سے پتہ چلتا ہے کہ rRNA bumps کا نقصان بعض اوقات کھوئے ہوئے bumps کے آگے نئے bumps کی ظاہری شکل کے ساتھ موافق ہوتا ہے۔23S/28S rRNA میں H42 ہیلکس میں ایک قدیم بلج ہے (Saccharomyces cerevisiae میں U1206) زندگی کے تین شعبوں میں اس کے تحفظ کی وجہ سے اس کی عمر کم از کم 3.5 بلین سال ہے۔مائیکرو اسپوریڈیا میں یہ بلج ختم ہوجاتا ہے۔تاہم، کھوئے ہوئے بلج کے ساتھ ایک نیا بلج نمودار ہوا (E. cuniculi میں A1306)۔
حیرت انگیز طور پر، ہم نے پایا کہ E. cuniculi ribosomes میں دیگر انواع میں پائے جانے والے زیادہ تر rRNA بلجز کی کمی ہے، بشمول دیگر eukaryotes میں محفوظ 30 سے ​​زیادہ بلجز (تصویر 4a)۔یہ نقصان رائبوسومل ذیلی یونٹس اور ملحقہ rRNA ہیلیکس کے درمیان بہت سے رابطوں کو ختم کر دیتا ہے، بعض اوقات رائبوزوم کے اندر بڑے کھوکھلے خلا پیدا کر دیتا ہے، جس سے E. cuniculi ribosome زیادہ روایتی رائبوسومز (تصویر 4b) کے مقابلے میں زیادہ غیر محفوظ ہو جاتا ہے۔خاص طور پر، ہم نے پایا کہ ان میں سے زیادہ تر بلجز پہلے سے شناخت شدہ V. necatrix اور P. locustae ribosome ڈھانچے میں بھی کھو گئے تھے، جنہیں پچھلے ساختی تجزیہ 31,32 سے نظر انداز کر دیا گیا تھا۔
بعض اوقات rRNA بلج کا نقصان کھوئے ہوئے بلج کے آگے نئے بلجز کی نشوونما کے ساتھ ہوتا ہے۔مثال کے طور پر، ribosomal P-stem میں U1208 بلج (Saccharomyces cerevisiae میں) ہوتا ہے جو E. coli سے انسانوں تک زندہ رہتا ہے اور اس لیے اس کی عمر 3.5 بلین سال بتائی جاتی ہے۔پروٹین کی ترکیب کے دوران، یہ بلج P سٹیم کو کھلی اور بند شکلوں کے درمیان منتقل کرنے میں مدد کرتا ہے تاکہ رائبوزوم ترجمہ کے عوامل کو بھرتی کر سکے اور انہیں فعال جگہ پر پہنچا سکے۔E. cuniculi ribosomes میں، یہ گاڑھا ہونا غائب ہے؛تاہم، ایک نیا گاڑھا ہونا (G883) جو صرف تین بیس جوڑوں میں واقع ہے، پی اسٹیم (تصویر 4c) کی بہترین لچک کی بحالی میں معاون ثابت ہوسکتا ہے۔
بلجز کے بغیر rRNA پر ہمارے اعداد و شمار بتاتے ہیں کہ rRNA مائنسائزیشن صرف رائبوزوم کی سطح پر rRNA عناصر کے نقصان تک محدود نہیں ہے، بلکہ اس میں رائبوزوم نیوکلئس بھی شامل ہو سکتا ہے، جس سے ایک پرجیوی مخصوص مالیکیولر خرابی پیدا ہوتی ہے جسے آزاد زندہ خلیوں میں بیان نہیں کیا گیا ہے۔زندہ پرجاتیوں کا مشاہدہ کیا جاتا ہے.
کیننیکل رائبوسومل پروٹین اور آر آر این اے کی ماڈلنگ کے بعد، ہم نے پایا کہ روایتی رائبوسومل اجزاء کریو-ای ایم امیج کے تین حصوں کی وضاحت نہیں کر سکتے۔ان میں سے دو ٹکڑے سائز میں چھوٹے مالیکیول ہیں (تصویر 5، ضمنی شکل 8)۔پہلا طبقہ رائبوسومل پروٹین uL15 اور eL18 کے درمیان سینڈویچ کیا جاتا ہے ایک ایسی پوزیشن میں جو عام طور پر eL18 کے C-ٹرمینس کے زیر قبضہ ہوتا ہے، جسے E. cuniculi میں چھوٹا کیا جاتا ہے۔اگرچہ ہم اس مالیکیول کی شناخت کا تعین نہیں کر سکتے، لیکن اس کثافت والے جزیرے کی جسامت اور شکل کو سپرمائیڈائن مالیکیولز کی موجودگی سے اچھی طرح سے سمجھا جاتا ہے۔رائبوزوم کے ساتھ اس کا پابند uL15 پروٹین (Asp51 اور Arg56) میں مائکرو اسپوریڈیا کے مخصوص تغیرات سے مستحکم ہوتا ہے، جو اس چھوٹے مالیکیول کے لیے رائبوزوم کی وابستگی کو بڑھاتے نظر آتے ہیں، کیونکہ وہ uL15 کو چھوٹے مالیکیول کو رائبوسومل ڈھانچے میں لپیٹنے کی اجازت دیتے ہیں۔ضمنی شکل 2)۔8، اضافی ڈیٹا 1، 2)۔
Cryo-EM امیجنگ جو E. cuniculi ribosome کے پابند رائبوز کے باہر نیوکلیوٹائڈس کی موجودگی کو ظاہر کرتی ہے۔E. cuniculi ribosome میں، یہ نیوکلیوٹائیڈ وہی جگہ رکھتا ہے جو 25S rRNA A3186 نیوکلیوٹائڈ (Saccharomyces cerevisiae numbering) زیادہ تر دیگر یوکرائیوٹک رائبوزوم میں رکھتا ہے۔b E. cuniculi کے رائبوسومل ڈھانچے میں، یہ نیوکلیوٹائڈ رائبوسومل پروٹین uL9 اور eL20 کے درمیان واقع ہے، اس طرح دو پروٹینوں کے درمیان رابطے کو مستحکم کرتا ہے۔مائکرو اسپوریڈیا پرجاتیوں کے درمیان سی ڈی ای ایل 20 ترتیب کے تحفظ کا تجزیہ۔مائکرو اسپوریڈیا پرجاتیوں (c) کے فائیلوجنیٹک درخت اور eL20 پروٹین (d) کی ایک سے زیادہ ترتیب کی سیدھ سے پتہ چلتا ہے کہ نیوکلیوٹائڈ بائنڈنگ باقیات F170 اور K172 زیادہ تر عام مائکرو اسپوریڈیا میں محفوظ ہیں، S. lophii کے استثناء کے ساتھ، ابتدائی برانچنگ exsporidia کے ساتھ جو Microsporidia کی ابتدائی شاخوں میں شامل ہیں۔e یہ اعداد و شمار ظاہر کرتا ہے کہ نیوکلیوٹائڈ بائنڈنگ باقیات F170 اور K172 انتہائی کم مائکرو اسپوریڈیا جینوم کے صرف eL20 میں موجود ہیں، لیکن دیگر یوکرائٹس میں نہیں۔مجموعی طور پر، یہ اعداد و شمار بتاتے ہیں کہ مائیکرو اسپوریڈین رائبوزوم نے ایک نیوکلیوٹائڈ بائنڈنگ سائٹ تیار کی ہے جو AMP مالیکیولز کو باندھتی ہے اور انہیں رائبوسومل ڈھانچے میں پروٹین-پروٹین کے تعامل کو مستحکم کرنے کے لیے استعمال کرتی ہے۔مائیکرو اسپوریڈیا میں اس بائنڈنگ سائٹ کا اعلیٰ تحفظ اور دیگر یوکرائٹس میں اس کی عدم موجودگی بتاتی ہے کہ یہ سائٹ مائیکراسپوریڈیا کے لیے بقا کا انتخابی فائدہ فراہم کرسکتی ہے۔اس طرح، مائیکرو اسپوریڈیا رائبوزوم میں نیوکلیوٹائڈ بائنڈنگ جیب انحطاط پذیر خصوصیت یا rRNA انحطاط کی آخری شکل دکھائی نہیں دیتی ہے جیسا کہ پہلے بیان کیا گیا ہے، بلکہ ایک مفید ارتقائی اختراع ہے جو مائیکرو اسپوریڈیا رائبوزوم کو چھوٹے مالیکیولز کو براہ راست باندھنے کی اجازت دیتی ہے، انہیں مالیکیولر بلڈنگ بلاک کے طور پر استعمال کرتی ہے۔رائبوزوم کے لئے عمارت کے بلاکس.یہ دریافت مائیکرو اسپوریڈیا رائبوزوم کو واحد رائبوزوم بناتی ہے جو ایک واحد نیوکلیوٹائڈ کو اپنے ساختی عمارت کے بلاک کے طور پر استعمال کرنے کے لیے جانا جاتا ہے۔f نیوکلیوٹائڈ بائنڈنگ سے اخذ کردہ فرضی ارتقائی راستہ۔
دوسری کم سالماتی وزن کی کثافت رائبوسومل پروٹین uL9 اور eL30 (تصویر 5a) کے درمیان انٹرفیس پر واقع ہے۔اس انٹرفیس کو پہلے Saccharomyces cerevisiae ribosome کی ساخت میں rRNA A3186 (ES39L rRNA ایکسٹینشن کا حصہ) 38 کے 25S نیوکلیوٹائڈ کے لیے بائنڈنگ سائٹ کے طور پر بیان کیا گیا تھا۔یہ دکھایا گیا تھا کہ انحطاط پذیر P. locustae ES39L رائبوسومز میں، یہ انٹرفیس ایک نامعلوم واحد نیوکلیوٹائڈ 31 کو جوڑتا ہے، اور یہ فرض کیا جاتا ہے کہ یہ نیوکلیوٹائڈ rRNA کی ایک کم حتمی شکل ہے، جس میں rRNA کی لمبائی ~130-230 بیسز ہے۔ES39L ایک واحد نیوکلیوٹائڈ 32.43 تک کم ہو گیا ہے۔ہماری cryo-EM تصاویر اس خیال کی تائید کرتی ہیں کہ کثافت کی وضاحت نیوکلیوٹائڈز کے ذریعے کی جا سکتی ہے۔تاہم، ہمارے ڈھانچے کی اعلیٰ ریزولیوشن سے پتہ چلتا ہے کہ یہ نیوکلیوٹائڈ ایک ماورائی مالیکیول ہے، ممکنہ طور پر AMP (تصویر 5a، b)۔
پھر ہم نے پوچھا کہ کیا نیوکلیوٹائڈ بائنڈنگ سائٹ E. cuniculi ribosome میں نمودار ہوئی یا یہ پہلے موجود تھی۔چونکہ نیوکلیوٹائڈ بائنڈنگ بنیادی طور پر eL30 رائبوسومل پروٹین میں Phe170 اور Lys172 اوشیشوں کے ذریعہ ثالثی کی جاتی ہے ، لہذا ہم نے 4396 نمائندہ یوکرائٹس میں ان اوشیشوں کے تحفظ کا اندازہ کیا۔جیسا کہ مذکورہ بالا UL15 کے معاملے میں ، ہم نے پایا ہے کہ PHE170 اور LYS172 کی باقیات صرف عام مائکروسپوریڈیا میں انتہائی محفوظ ہیں ، لیکن دوسرے یوکرائٹس میں غیر حاضر ہیں ، بشمول ایٹیکل مائکروسپوریڈیا مائٹوسپوریڈیم اور امفیمبلیس ، جس میں ES39L RRNA ٹکڑے کو 46 ، 45 ، 45 ، 45 ، 45 ، 45 ، 45 ، 46 ، 46 ، 46 ، 46 ، 46 ،-e)۔
ایک ساتھ مل کر، یہ اعداد و شمار اس خیال کی تائید کرتے ہیں کہ E. cuniculi اور ممکنہ طور پر دیگر کینونیکل مائکرو اسپوریڈیا نے rRNA اور پروٹین کی سطح میں کمی کی تلافی کے لیے رائبوزوم ڈھانچے میں بڑی تعداد میں چھوٹے میٹابولائٹس کو موثر طریقے سے پکڑنے کی صلاحیت کو تیار کیا ہے۔ایسا کرتے ہوئے، انہوں نے رائبوزوم کے باہر نیوکلیوٹائڈز کو باندھنے کی ایک انوکھی صلاحیت تیار کی ہے، جس سے یہ ظاہر ہوتا ہے کہ پرجیوی مالیکیولر ڈھانچے وافر چھوٹے میٹابولائٹس کو پکڑ کر اور ان کو انحطاط شدہ RNA اور پروٹین کے ٹکڑوں کی ساختی نقل کے طور پر استعمال کرتے ہوئے معاوضہ دیتے ہیں۔.
ہمارے cryo-EM نقشے کا تیسرا غیر نقلی حصہ، جو بڑے رائبوسومل سبونائٹ میں پایا جاتا ہے۔ہمارے نقشے کی نسبتا high اعلی ریزولیوشن (2.6 Å) بتاتی ہے کہ یہ کثافت بڑے سائیڈ چین کی باقیات کے منفرد امتزاج کے ساتھ پروٹین سے تعلق رکھتی ہے، جس نے ہمیں اس کثافت کو پہلے سے نامعلوم رائبوسومل پروٹین کے طور پر شناخت کرنے کی اجازت دی جسے ہم نے msL2 (Microsporidia- مخصوص پروٹین L2) کا نام دیا تھا (طریقے، اعداد و شمار 6)۔ہماری ہومولوجی کی تلاش سے پتہ چلتا ہے کہ msL2 جینس Encephaliter اور Orosporidium کے Microsporidia کلیڈ میں محفوظ ہے، لیکن دیگر انواع بشمول دیگر Microsporidia میں موجود نہیں ہے۔رائبوسومل ڈھانچے میں، msL2 توسیع شدہ ES31L rRNA کے نقصان سے پیدا ہونے والے خلا پر قبضہ کرتا ہے۔اس صفر میں، msL2 rRNA فولڈنگ کو مستحکم کرنے میں مدد کرتا ہے اور ES31L کے نقصان کی تلافی کر سکتا ہے (شکل 6)۔
E. cuniculi ribosomes میں پائے جانے والے Microsporidia-specific ribosomal پروٹین msL2 کا ایک الیکٹران کثافت اور ماڈل۔b زیادہ تر یوکرائیوٹک رائبوزوم، بشمول Saccharomyces cerevisiae کے 80S رائبوزوم میں، ES19L rRNA ایمپلیفیکیشن زیادہ تر مائیکرو اسپوریڈین پرجاتیوں میں کھو جاتا ہے۔V. necatrix microsporidia ribosome کی پہلے سے قائم کردہ ساخت بتاتی ہے کہ ان پرجیویوں میں ES19L کے نقصان کی تلافی نئے msL1 رائبوسومل پروٹین کے ارتقاء سے ہوتی ہے۔اس مطالعے میں، ہم نے پایا کہ E. cuniculi ribosome نے ES19L کے نقصان کے لیے ایک واضح معاوضے کے طور پر ایک اضافی رائبوسومل RNA نقلی پروٹین بھی تیار کیا۔تاہم، msL2 (فی الحال فرضی ECU06_1135 پروٹین کے طور پر بیان کیا گیا ہے) اور msL1 کی ساختی اور ارتقائی ماخذ مختلف ہیں۔c ارتقائی طور پر غیر متعلقہ msL1 اور msL2 رائبوسومل پروٹین کی نسل کی یہ دریافت بتاتی ہے کہ اگر رائبوسومز اپنے rRNA میں نقصان دہ تغیرات جمع کرتے ہیں، تو وہ قریب سے متعلقہ پرجاتیوں کے ایک چھوٹے سے ذیلی سیٹ میں بھی ساختی تنوع کی بے مثال سطح حاصل کر سکتے ہیں۔اس دریافت سے مائٹوکونڈریل رائبوزوم کی ابتدا اور ارتقاء کو واضح کرنے میں مدد مل سکتی ہے، جو کہ اس کی انتہائی کم آر آر این اے اور پرجاتیوں میں پروٹین کی ساخت میں غیر معمولی تغیر کے لیے جانا جاتا ہے۔
اس کے بعد ہم نے msL2 پروٹین کا موازنہ پہلے بیان کردہ msL1 پروٹین سے کیا، جو V. necatrix ribosome میں پایا جانے والا واحد مائکرو اسپوریڈیا مخصوص رائبوسومل پروٹین ہے۔ہم یہ جانچنا چاہتے تھے کہ آیا msL1 اور msL2 ارتقائی لحاظ سے متعلق ہیں۔ہمارے تجزیے سے پتہ چلتا ہے کہ msL1 اور msL2 رائبوسومل ڈھانچے میں ایک ہی گہا پر قابض ہیں، لیکن ان کے بنیادی اور ترتیری ڈھانچے مختلف ہیں، جو ان کی خود مختار ارتقائی اصل کی نشاندہی کرتے ہیں (تصویر 6)۔اس طرح، ایم ایس ایل 2 کی ہماری دریافت اس بات کا ثبوت فراہم کرتی ہے کہ کمپیکٹ یوکریاٹک پرجاتیوں کے گروپ آر آر این اے کے ٹکڑوں کے نقصان کی تلافی کے لیے ساختی طور پر الگ رائبوسومل پروٹین کو آزادانہ طور پر تیار کر سکتے ہیں۔یہ دریافت اس میں قابل ذکر ہے کہ زیادہ تر سائٹوپلاسمک یوکرائیوٹک رائبوزوم میں ایک غیر متزلزل پروٹین ہوتا ہے، جس میں 81 رائبوسومل پروٹین کا ایک ہی خاندان بھی شامل ہے۔توسیع شدہ rRNA حصوں کے نقصان کے جواب میں مائکرو اسپوریڈیا کے مختلف کلیڈز میں msL1 اور msL2 کی ظاہری شکل بتاتی ہے کہ پرجیوی کے مالیکیولر فن تعمیر میں انحطاط کی وجہ سے پرجیویوں کو معاوضہ اتپریورتنوں کی تلاش ہوتی ہے، جو بالآخر مختلف پرجیوی آبادیوں میں ان کے حصول کا باعث بن سکتی ہے۔ڈھانچے
آخر کار، جب ہمارا ماڈل مکمل ہوا، تو ہم نے E. cuniculi ribosome کی ساخت کا موازنہ جینوم کی ترتیب سے کی گئی پیش گوئی سے کیا۔کئی رائبوسومل پروٹینز، بشمول eL14، eL38، eL41، اور eS30، پہلے یہ خیال کیا جاتا تھا کہ وہ E. cuniculi genome سے غائب ہیں کیونکہ E. cuniculi genome سے ان کے ہومولوگس کی ظاہری غیر موجودگی کی وجہ سے۔بہت سے رائبوسومل پروٹین کے نقصان کی پیش گوئی زیادہ تر دیگر انتہائی کم انٹرا سیلولر پرجیویوں اور اینڈو سیمبیونٹس میں بھی کی جاتی ہے۔مثال کے طور پر، اگرچہ زیادہ تر آزاد رہنے والے بیکٹیریا میں 54 رائبوسومل پروٹینوں کا ایک ہی خاندان ہوتا ہے، لیکن ان میں سے صرف 11 پروٹین خاندانوں میں میزبان محدود بیکٹیریا کے ہر تجزیہ شدہ جینوم میں قابل شناخت ہومولوگ ہوتے ہیں۔اس تصور کی تائید میں، V. necatrix اور P. locustae microsporidia میں تجرباتی طور پر رائبوسومل پروٹین کا نقصان دیکھا گیا ہے، جن میں eL38 اور eL4131,32 پروٹین کی کمی ہے۔
تاہم، ہمارے ڈھانچے سے پتہ چلتا ہے کہ صرف eL38، eL41، اور eS30 دراصل E. cuniculi ribosome میں کھو گئے ہیں۔eL14 پروٹین کو محفوظ کیا گیا اور ہماری ساخت نے ظاہر کیا کہ یہ پروٹین ہومولوجی کی تلاش میں کیوں نہیں مل سکا (تصویر 7)۔E. cuniculi ribosomes میں، eL14 بائنڈنگ سائٹ کا زیادہ تر حصہ rRNA- amplified ES39L کے انحطاط کی وجہ سے کھو جاتا ہے۔ES39L کی غیر موجودگی میں، eL14 نے اپنا زیادہ تر ثانوی ڈھانچہ کھو دیا، اور E. cuniculi اور S. cerevisiae میں eL14 کی ترتیب کا صرف 18% ایک جیسا تھا۔یہ ناقص ترتیب کا تحفظ قابل ذکر ہے کیونکہ یہاں تک کہ Saccharomyces cerevisiae اور Homo sapiens — وہ جاندار جو 1.5 بلین سال کے وقفے سے تیار ہوئے — eL14 میں 51 فیصد سے زیادہ اسی باقیات کا اشتراک کرتے ہیں۔تحفظ کا یہ غیر معمولی نقصان اس بات کی وضاحت کرتا ہے کہ کیوں E. cuniculi eL14 کو فی الحال پوٹیٹیو M970_061160 پروٹین کے طور پر تشریح کیا جاتا ہے نہ کہ eL1427 رائبوسومل پروٹین کے طور پر۔
اور Microsporidia ribosome نے ES39L rRNA ایکسٹینشن کو کھو دیا، جس نے جزوی طور پر eL14 رائبوسومل پروٹین بائنڈنگ سائٹ کو ختم کر دیا۔ES39L کی غیر موجودگی میں، eL14 مائیکرو اسپور پروٹین ثانوی ساخت کے نقصان سے گزرتا ہے، جس میں سابقہ ​​rRNA- بائنڈنگ α-helix کم سے کم لمبائی والے لوپ میں انحطاط پذیر ہوتا ہے۔b ایک سے زیادہ ترتیب کی سیدھ سے پتہ چلتا ہے کہ eL14 پروٹین یوکرائیوٹک پرجاتیوں میں انتہائی محفوظ ہے (خمیر اور انسانی ہومولوگس کے درمیان 57٪ ترتیب کی شناخت)، لیکن مائکرو اسپوریڈیا میں خراب طور پر محفوظ اور مختلف ہے (جس میں 24٪ سے زیادہ باقیات eL14 homologues سے مماثل نہیں ہیں)۔S. cerevisiae یا H. sapiens سے)۔یہ ناقص ترتیب کا تحفظ اور ثانوی ساخت کی تغیر یہ بتاتا ہے کہ ای ایل 14 ہومولوگ E. cuniculi میں کیوں نہیں پایا گیا اور کیوں خیال کیا جاتا ہے کہ یہ پروٹین E. cuniculi میں کھو گیا ہے۔اس کے برعکس، E. cuniculi eL14 کو اس سے قبل M970_061160 پروٹین کے طور پر بیان کیا گیا تھا۔اس مشاہدے سے پتہ چلتا ہے کہ مائیکرو اسپوریڈیا جینوم کے تنوع کا فی الحال بہت زیادہ تخمینہ لگایا گیا ہے: کچھ جین جو اس وقت مائیکرو اسپوریڈیا میں کھو گئے ہیں درحقیقت محفوظ ہیں، اگرچہ انتہائی مختلف شکلوں میں؛اس کے بجائے، کچھ کے بارے میں سوچا جاتا ہے کہ وہ کیڑے سے متعلق مخصوص پروٹینز (مثلاً فرضی پروٹین M970_061160) کے لیے مائیکرو اسپوریڈیا جینز کے لیے کوڈ کرتے ہیں جو دوسرے یوکرائٹس میں پائے جانے والے بہت متنوع پروٹینوں کے لیے ہوتے ہیں۔
اس تلاش سے پتہ چلتا ہے کہ آر آر این اے ڈینیچریشن ملحقہ رائبوسومل پروٹینوں میں ترتیب کے تحفظ کے ڈرامائی نقصان کا باعث بن سکتی ہے، جس سے ان پروٹینوں کو ہومولوجی کی تلاش کے لیے ناقابل شناخت قرار دیا جا سکتا ہے۔اس طرح، ہم چھوٹے جینوم کے جانداروں میں مالیکیولر انحطاط کی اصل ڈگری کا زیادہ اندازہ لگا سکتے ہیں، کیونکہ کچھ پروٹین جن کے بارے میں سوچا جاتا ہے کہ وہ بہت زیادہ تبدیل شدہ شکلوں میں ہوتے ہوئے بھی حقیقت میں برقرار رہتے ہیں۔
پرجیوی جینوم کی انتہائی کمی کے حالات میں اپنی سالماتی مشینوں کے کام کو کیسے برقرار رکھ سکتے ہیں؟ہمارا مطالعہ اس سوال کا جواب E. cuniculi کے پیچیدہ مالیکیولر ڈھانچے (ribosome) کو بیان کرتے ہوئے دیتا ہے، ایک ایسا جاندار جس میں سب سے چھوٹے یوکرائیوٹک جینوم ہیں۔
یہ تقریباً دو دہائیوں سے مشہور ہے کہ مائکروبیل پرجیویوں میں پروٹین اور آر این اے مالیکیول اکثر آزاد جاندار پرجاتیوں میں ان کے ہم جنس مالیکیولز سے مختلف ہوتے ہیں کیونکہ ان میں کوالٹی کنٹرول سینٹرز کی کمی ہوتی ہے، آزاد زندہ جرثوموں میں ان کے سائز کا 50 فیصد تک کم ہو جاتا ہے۔بہت سے کمزور تغیرات جو فولڈنگ اور کام کو متاثر کرتے ہیں۔مثال کے طور پر، چھوٹے جینوم والے جانداروں کے رائبوسومز، بشمول بہت سے انٹرا سیلولر پرجیویوں اور اینڈو سیمبیونٹس میں، توقع کی جاتی ہے کہ آزاد جاندار انواع 27، 29، 30، 49 کے مقابلے میں کئی رائبوسومل پروٹین اور ایک تہائی تک rRNA نیوکلیوٹائڈز کی کمی ہوگی۔ جینومکس
ہمارا مطالعہ ظاہر کرتا ہے کہ میکرو مالیکیولز کی ساخت ارتقاء کے بہت سے پہلوؤں کو ظاہر کر سکتی ہے جنہیں انٹرا سیلولر پرجیویوں اور دوسرے میزبان محدود جانداروں کے روایتی تقابلی جینومک مطالعات سے نکالنا مشکل ہے (ضمیمہ تصویر 7)۔مثال کے طور پر، eL14 پروٹین کی مثال سے پتہ چلتا ہے کہ ہم پرجیوی پرجاتیوں میں مالیکیولر اپریٹس کے انحطاط کی اصل ڈگری کا اندازہ لگا سکتے ہیں۔اب خیال کیا جاتا ہے کہ Encephalitic پرجیویوں میں سینکڑوں مائیکرو اسپوریڈیا مخصوص جین ہوتے ہیں۔تاہم، ہمارے نتائج سے پتہ چلتا ہے کہ ان میں سے کچھ بظاہر مخصوص جین دراصل جینوں کی بالکل مختلف قسمیں ہیں جو دوسرے یوکرائٹس میں عام ہیں۔مزید یہ کہ ایم ایس ایل 2 پروٹین کی مثال سے پتہ چلتا ہے کہ ہم کس طرح نئے رائبوسومل پروٹین کو نظر انداز کرتے ہیں اور پرجیوی مالیکیولر مشینوں کے مواد کو کم سمجھتے ہیں۔چھوٹے مالیکیولز کی مثال سے پتہ چلتا ہے کہ ہم پرجیوی مالیکیولر ڈھانچے میں ان سب سے ذہین اختراعات کو کس طرح نظر انداز کر سکتے ہیں جو انہیں نئی ​​حیاتیاتی سرگرمی دے سکتی ہیں۔
ایک ساتھ مل کر، یہ نتائج میزبان محدود حیاتیات کے مالیکیولر ڈھانچے اور آزاد جانداروں میں ان کے ہم منصبوں کے درمیان فرق کے بارے میں ہماری سمجھ کو بہتر بناتے ہیں۔ہم یہ ظاہر کرتے ہیں کہ مالیکیولر مشینیں، جن کے بارے میں طویل عرصے سے سوچا جاتا ہے کہ اسے کم کیا جاتا ہے، انحطاط پذیر ہوتا ہے، اور مختلف کمزور تغیرات کا شکار ہوتا ہے، اس کے بجائے منظم طریقے سے غیر معمولی ساختی خصوصیات کو نظر انداز کیا جاتا ہے۔
دوسری طرف، غیر بھاری rRNA کے ٹکڑے اور فیوز شدہ ٹکڑے جو ہمیں E. cuniculi کے رائبوسومز میں ملے ہیں یہ بتاتے ہیں کہ جینوم کی کمی بنیادی مالیکیولر مشینری کے ان حصوں کو بھی بدل سکتی ہے جو زندگی کے تین ڈومینز میں محفوظ ہیں - تقریباً 3.5 بلین سال کے بعد۔پرجاتیوں کا آزاد ارتقاء۔
E. cuniculi ribosomes میں بلج فری اور فیوزڈ rRNA کے ٹکڑے endosymbiotic بیکٹیریا میں RNA مالیکیولز کے پچھلے مطالعات کی روشنی میں خاص دلچسپی رکھتے ہیں۔مثال کے طور پر، aphid endosymbiont Buchnera aphidicola میں، rRNA اور tRNA مالیکیولز A+T کمپوزیشن تعصب کی وجہ سے درجہ حرارت کے لیے حساس ڈھانچے اور غیر کینونیکل بیس جوڑوں کے 20,50 کے اعلی تناسب کے لیے دکھایا گیا ہے۔آر این اے میں ان تبدیلیوں کے ساتھ ساتھ پروٹین کے مالیکیولز میں ہونے والی تبدیلیوں کو اب شراکت داروں پر اینڈو سیمبیونٹس کی حد سے زیادہ انحصار اور حرارت 21، 23 کو منتقل کرنے میں اینڈوسیمبیونٹس کی نااہلی کے لیے ذمہ دار سمجھا جاتا ہے۔اگرچہ پرجیوی مائیکرو اسپوریڈیا آر آر این اے میں ساختی طور پر الگ تبدیلیاں ہیں، ان تبدیلیوں کی نوعیت بتاتی ہے کہ تھرمل استحکام میں کمی اور چیپیرون پروٹین پر زیادہ انحصار کم جینوم والے جانداروں میں آر این اے مالیکیولز کی عام خصوصیات ہو سکتی ہیں۔
دوسری طرف، ہمارے ڈھانچے سے پتہ چلتا ہے کہ پرجیوی مائیکرو اسپوریڈیا نے وسیع پیمانے پر محفوظ آر آر این اے اور پروٹین کے ٹکڑوں کے خلاف مزاحمت کرنے کی ایک انوکھی صلاحیت تیار کی ہے، جس سے پرچر اور آسانی سے دستیاب چھوٹے میٹابولائٹس کو انحطاط پذیر rRNA اور پروٹین کے ٹکڑوں کی ساختی نقالی کے طور پر استعمال کرنے کی صلاحیت پیدا ہوئی ہے۔سالماتی ساخت کا انحطاط۔.اس رائے کی تائید اس حقیقت سے ہوتی ہے کہ چھوٹے مالیکیولز جو rRNA میں پروٹین کے ٹکڑوں کے نقصان کی تلافی کرتے ہیں اور E. cuniculi کے ribosomes uL15 اور eL30 پروٹینوں میں مائکرو اسپوریڈیا مخصوص باقیات سے منسلک ہوتے ہیں۔اس سے پتہ چلتا ہے کہ چھوٹے مالیکیولز کو رائبوسومز کے ساتھ جوڑنا مثبت انتخاب کا نتیجہ ہو سکتا ہے، جس میں رائبوسومل پروٹینز میں مائکرو اسپوریڈیا سے متعلق مخصوص تغیرات کو چھوٹے مالیکیولز کے لیے رائبوسومز کی وابستگی بڑھانے کی صلاحیت کے لیے منتخب کیا گیا ہے، جو زیادہ موثر رائبوسومل جانداروں کا باعث بن سکتے ہیں۔یہ دریافت مائکروبیل پرجیویوں کے مالیکیولر ڈھانچے میں ایک زبردست اختراع کو ظاہر کرتی ہے اور ہمیں اس بات کی بہتر تفہیم فراہم کرتی ہے کہ کس طرح پرجیوی مالیکیولر ڈھانچے تخفیف ارتقاء کے باوجود اپنے کام کو برقرار رکھتے ہیں۔
فی الحال، ان چھوٹے مالیکیولز کی شناخت غیر واضح ہے۔یہ واضح نہیں ہے کہ رائبوسومل ڈھانچے میں ان چھوٹے مالیکیولز کی ظاہری شکل مائکرو اسپوریڈیا پرجاتیوں کے درمیان کیوں مختلف ہے۔خاص طور پر، یہ واضح نہیں ہے کہ نیوکلیوٹائڈ بائنڈنگ E. cuniculi اور P. locustae کے رائبوسومز میں کیوں دیکھی جاتی ہے، اور V. necatrix کے رائبوسومز میں نہیں، EL20 اور K172 پروٹینوں میں F170 کی باقیات کی موجودگی کے باوجود V. necatrix کےیہ حذف باقیات 43 uL6 (نیوکلیوٹائڈ بائنڈنگ جیب سے متصل) کی وجہ سے ہوسکتا ہے، جو V. necatrix میں ٹائروسین ہے اور E. cuniculi اور P. locustae میں تھرونائن نہیں ہے۔Tyr43 کی بڑی خوشبو دار سائیڈ چین سٹیرک اوورلیپ کی وجہ سے نیوکلیوٹائڈ بائنڈنگ میں مداخلت کر سکتی ہے۔متبادل طور پر، بظاہر نیوکلیوٹائڈ ڈیلیٹ کرائیو-EM امیجنگ کے کم ریزولوشن کی وجہ سے ہو سکتا ہے، جو V. necatrix ribosomal ٹکڑوں کی ماڈلنگ میں رکاوٹ ہے۔
دوسری طرف، ہمارے کام سے پتہ چلتا ہے کہ جینوم کے خاتمے کا عمل ایک اختراعی قوت ہو سکتا ہے۔خاص طور پر، E. cuniculi ribosome کی ساخت بتاتی ہے کہ microsporidia ribosome میں rRNA اور پروٹین کے ٹکڑوں کا نقصان ارتقائی دباؤ پیدا کرتا ہے جو رائبوزوم کی ساخت میں تبدیلیوں کو فروغ دیتا ہے۔یہ مختلف حالتیں رائبوزوم کی فعال جگہ سے بہت دور واقع ہوتی ہیں اور زیادہ سے زیادہ رائبوزوم اسمبلی کو برقرار رکھنے (یا بحال کرنے) میں مدد کرتی نظر آتی ہیں جو بصورت دیگر کم آر آر این اے سے خلل پڑ جائے گی۔اس سے پتہ چلتا ہے کہ مائکرو اسپوریڈیا رائبوزوم کی ایک بڑی اختراع بفر جین کے بہاؤ کی ضرورت میں تیار ہوئی ہے۔
شاید اس کی بہترین مثال نیوکلیوٹائڈ بائنڈنگ سے ہوتی ہے، جو اب تک دوسرے جانداروں میں کبھی نہیں دیکھی گئی۔حقیقت یہ ہے کہ نیوکلیوٹائڈ بائنڈنگ باقیات عام مائکرو اسپوریڈیا میں موجود ہیں، لیکن دیگر یوکرائٹس میں نہیں، یہ بتاتا ہے کہ نیوکلیوٹائڈ بائنڈنگ سائٹس صرف ایسے آثار نہیں ہیں جو غائب ہونے کا انتظار کر رہے ہیں، یا rRNA کی حتمی سائٹ انفرادی نیوکلیوٹائڈس کی شکل میں بحال ہونے کی ہے۔اس کے بجائے، یہ سائٹ ایک مفید خصوصیت کی طرح لگتا ہے جو مثبت انتخاب کے کئی دوروں میں تیار ہو سکتی ہے۔نیوکلیوٹائڈ بائنڈنگ سائٹس قدرتی انتخاب کی ضمنی پیداوار ہوسکتی ہیں: ایک بار جب ES39L تنزلی ہو جاتا ہے، مائکرو اسپوریڈیا کو ES39L کی عدم موجودگی میں زیادہ سے زیادہ رائبوزوم بائیوجنسیس کو بحال کرنے کے لیے معاوضہ لینے پر مجبور کیا جاتا ہے۔چونکہ یہ نیوکلیوٹائڈ ES39L میں A3186 نیوکلیوٹائڈ کے سالماتی رابطوں کی نقل کر سکتا ہے، اس لیے نیوکلیوٹائڈ مالیکیول رائبوزوم کا ایک بلڈنگ بلاک بن جاتا ہے، جس کی بائنڈنگ eL30 ترتیب کے تغیر سے مزید بہتر ہوتی ہے۔
انٹرا سیلولر پرجیویوں کے مالیکیولر ارتقاء کے حوالے سے، ہمارا مطالعہ ظاہر کرتا ہے کہ ڈارون کے قدرتی انتخاب کی قوتیں اور جینوم کے زوال کے جینیاتی بڑھے متوازی طور پر کام نہیں کرتے بلکہ دوغلے پن سے کام کرتے ہیں۔سب سے پہلے، جینیاتی بہاؤ بائیو مالیکیولز کی اہم خصوصیات کو ختم کرتا ہے، جس سے معاوضے کی سخت ضرورت ہوتی ہے۔صرف اس صورت میں جب پرجیوی ڈارون کے قدرتی انتخاب کے ذریعے اس ضرورت کو پورا کرتے ہیں تو ان کے میکرو مالیکیولز کو اپنی انتہائی متاثر کن اور اختراعی خصلتوں کو تیار کرنے کا موقع ملے گا۔اہم بات یہ ہے کہ E. cuniculi ribosome میں نیوکلیوٹائڈ بائنڈنگ سائٹس کا ارتقاء بتاتا ہے کہ مالیکیولر ارتقاء کا یہ نقصان سے حاصل کرنے والا نمونہ نہ صرف نقصان دہ اتپریورتنوں کو ختم کرتا ہے، بلکہ بعض اوقات پرجیوی میکرو مالیکیولز پر مکمل طور پر نئے فنکشن فراہم کرتا ہے۔
یہ خیال سیول رائٹ کے متحرک توازن کے نظریے سے مطابقت رکھتا ہے، جو کہتا ہے کہ قدرتی انتخاب کا سخت نظام حیاتیات کی اختراع کرنے کی صلاحیت کو محدود کرتا ہے 51,52,53۔تاہم، اگر جینیاتی بہاؤ قدرتی انتخاب میں خلل ڈالتا ہے، تو یہ بہاؤ ایسی تبدیلیاں پیدا کر سکتے ہیں جو اپنے آپ میں موافق نہیں (یا نقصان دہ بھی) نہیں ہیں بلکہ مزید تبدیلیوں کا باعث بنتی ہیں جو اعلی فٹنس یا نئی حیاتیاتی سرگرمی فراہم کرتی ہیں۔ہمارا فریم ورک اس خیال کی تائید کرتا ہے کہ یہ واضح کر کے کہ ایک ہی قسم کا تغیر جو بایو مالیکیول کے فولڈ اور فنکشن کو کم کرتا ہے اس کی بہتری کا بنیادی محرک معلوم ہوتا ہے۔جیتنے والے ارتقائی ماڈل کے مطابق، ہمارا مطالعہ ظاہر کرتا ہے کہ جینوم کا زوال، روایتی طور پر ایک انحطاطی عمل کے طور پر دیکھا جاتا ہے، جدت کا ایک بڑا محرک بھی ہے، بعض اوقات اور شاید اکثر میکرو مالیکیولز کو نئی پرجیوی سرگرمیاں حاصل کرنے کی اجازت دیتا ہے۔ان کا استعمال کر سکتے ہیں.