Nature.com پر جانے کا شکریہ۔آپ محدود سی ایس ایس سپورٹ کے ساتھ براؤزر کا ورژن استعمال کر رہے ہیں۔بہترین تجربے کے لیے، ہم تجویز کرتے ہیں کہ آپ ایک اپ ڈیٹ شدہ براؤزر استعمال کریں (یا انٹرنیٹ ایکسپلورر میں مطابقت موڈ کو غیر فعال کریں)۔اس کے علاوہ، جاری تعاون کو یقینی بنانے کے لیے، ہم سائٹ کو بغیر اسٹائل اور جاوا اسکرپٹ کے دکھاتے ہیں۔
ایک ساتھ تین سلائیڈوں کا ایک carousel دکھاتا ہے۔ایک وقت میں تین سلائیڈوں سے گزرنے کے لیے پچھلے اور اگلے بٹنوں کا استعمال کریں، یا ایک وقت میں تین سلائیڈوں سے گزرنے کے لیے آخر میں سلائیڈر بٹن استعمال کریں۔
خون دماغی رکاوٹ اور خون دماغی رکاوٹ بایوتھراپیٹک ایجنٹوں کو مرکزی اعصابی نظام میں اپنے اہداف تک پہنچنے سے روکتی ہے، اس طرح اعصابی بیماریوں کے مؤثر علاج میں رکاوٹ بنتی ہے۔Vivo میں دماغ کے نئے ٹرانسپورٹرز کو دریافت کرنے کے لیے، ہم نے ایک T7 فیج پیپٹائڈ لائبریری متعارف کرائی اور چوہوں کے کینولیٹڈ شعور والے بڑے پول ماڈل کا استعمال کرتے ہوئے خون اور سیریبراسپائنل فلوئڈ (CSF) کو سلسلہ وار جمع کیا۔انتخاب کے چار راؤنڈ کے بعد CSF میں مخصوص فیز کلون کو انتہائی افزودہ کیا گیا تھا۔انفرادی امیدوار پیپٹائڈس کی جانچ سے CSF میں 1000 گنا سے زیادہ افزودگی کا انکشاف ہوا۔دماغ میں پیپٹائڈ کی ثالثی کی ترسیل کی بایو ایکٹیویٹی کی تصدیق شدہ ناول ٹرانزٹ پیپٹائڈ سے منسلک BACE1 پیپٹائڈ انحیبیٹر کا استعمال کرتے ہوئے دماغی اسپائنل سیال میں amyloid-β کی سطح میں 40٪ کمی سے ہوئی۔یہ نتائج بتاتے ہیں کہ ویوو فیج کے انتخاب کے طریقوں کے ذریعے شناخت شدہ پیپٹائڈز علاج کے اثر کے ساتھ دماغ میں میکرو مالیکیولز کی نظامی ترسیل کے لیے مفید گاڑیاں ہو سکتی ہیں۔
مرکزی اعصابی نظام (سی این ایس) کی ٹارگٹڈ تھراپی ریسرچ نے بڑی حد تک اصلاح شدہ ادویات اور ایجنٹوں کی نشاندہی پر توجہ مرکوز کی ہے جو سی این ایس کو نشانہ بنانے والی خصوصیات کو ظاہر کرتے ہیں، ان میکانزم کو دریافت کرنے پر کم کوشش کے ساتھ جو دماغ تک منشیات کی فعال ترسیل کو چلاتے ہیں۔یہ اب تبدیل ہونا شروع ہو رہا ہے کیونکہ منشیات کی ترسیل، خاص طور پر بڑے مالیکیول، جدید نیورو سائنس منشیات کی نشوونما کا ایک لازمی حصہ ہیں۔مرکزی اعصابی نظام کا ماحول دماغی رکاوٹ کے نظام کے ذریعہ اچھی طرح سے محفوظ ہے، جس میں خون کے دماغ کی رکاوٹ (BBB) ​​اور خون کے دماغ کی رکاوٹ (BCBB) 1 شامل ہے، جس سے دماغ تک منشیات پہنچانا مشکل ہو جاتا ہے۔ایک اندازے کے مطابق تقریباً تمام بڑی مالیکیول ادویات اور 98% سے زیادہ چھوٹی مالیکیول ادویات دماغ سے ختم ہو جاتی ہیں۔یہی وجہ ہے کہ دماغی نقل و حمل کے نئے نظاموں کی نشاندہی کرنا بہت ضروری ہے جو CNS 4,5 کو علاج معالجے کی موثر اور مخصوص ترسیل فراہم کرتے ہیں۔تاہم، BBB اور BCSFB منشیات کی ترسیل کے لیے ایک بہترین موقع بھی پیش کرتے ہیں کیونکہ وہ دماغ کے تمام ڈھانچے میں داخل ہوتے ہیں اور اس کے وسیع عروقی کے ذریعے داخل ہوتے ہیں۔اس طرح، دماغ تک پہنچانے کے غیر ناگوار طریقے استعمال کرنے کی موجودہ کوششیں بڑی حد تک اینڈوجینس BBB6 ریسیپٹر کا استعمال کرتے ہوئے ریسیپٹر میڈیٹیڈ ٹرانسپورٹ (PMT) کے طریقہ کار پر مبنی ہیں۔ٹرانسفرن ریسیپٹر پاتھ وے 7,8 کا استعمال کرتے ہوئے حالیہ اہم پیشرفت کے باوجود، بہتر خصوصیات کے ساتھ نئے ڈیلیوری سسٹم کی مزید ترقی کی ضرورت ہے۔اس مقصد کے لیے، ہمارا مقصد پیپٹائڈز کی شناخت کرنا تھا جو CSF ٹرانسپورٹ میں ثالثی کرنے کے قابل ہیں، کیونکہ وہ اصولی طور پر میکرو مالیکیولز کو CNS تک پہنچانے یا رسیپٹر کے نئے راستے کھولنے کے لیے استعمال کیے جا سکتے ہیں۔خاص طور پر، دماغی نظام کے مخصوص رسیپٹرز اور ٹرانسپورٹرز (BBB اور BSCFB) بائیو تھراپیٹک ادویات کی فعال اور مخصوص ترسیل کے لیے ممکنہ اہداف کے طور پر کام کر سکتے ہیں۔Cerebrospinal fluid (CSF) choroid plexus (CS) کی ایک خفیہ پیداوار ہے اور subarachnoid space اور ventricular space4 کے ذریعے دماغ کے بیچوالا سیال کے ساتھ براہ راست رابطے میں ہے۔حال ہی میں یہ دکھایا گیا ہے کہ subarachnoid cerebrospinal سیال دماغ کے انٹرسٹیٹیئم میں ضرورت سے زیادہ پھیلتا ہے۔ہم امید کرتے ہیں کہ اس subarachnoid inflow tract کا استعمال کرتے ہوئے یا براہ راست BBB کے ذریعے پیرنچیمل اسپیس تک رسائی حاصل کریں۔اس کو حاصل کرنے کے لیے، ہم نے vivo فیج سلیکشن کی ایک مضبوط حکمت عملی کو نافذ کیا جو مثالی طور پر ان دو الگ الگ راستوں میں سے کسی ایک کے ذریعے منتقل ہونے والے پیپٹائڈس کی شناخت کرتا ہے۔
اب ہم سب سے زیادہ لائبریری تنوع کے ساتھ ابتدائی انتخاب کے راؤنڈ کی نگرانی کے لیے CSF نمونے لینے کے ساتھ ہائی تھرو پٹ سیکوینسنگ (HTS) کے ساتھ Vivo phage ڈسپلے اسکریننگ کے طریقہ کار کی ترتیب بیان کرتے ہیں۔خون کی آلودگی سے بچنے کے لیے مستقل طور پر لگائے گئے بڑے سیسٹرنا (سی ایم) کینول کے ساتھ ہوش والے چوہوں پر اسکریننگ کی گئی۔اہم بات یہ ہے کہ یہ نقطہ نظر دماغی اہداف اور پیپٹائڈس دونوں کا انتخاب کرتا ہے جس میں دماغی رکاوٹ کے پار نقل و حمل کی سرگرمی ہوتی ہے۔ہم نے T7 فیجز کو ان کے چھوٹے سائز (~ 60 nm) 10 کی وجہ سے استعمال کیا اور تجویز کیا کہ وہ vesicles کی نقل و حمل کے لیے موزوں ہیں جو endothelial اور/یا epithelial-medulla بیریئر کے ٹرانس سیلولر کراسنگ کی اجازت دیتے ہیں۔پیننگ کے چار چکروں کے بعد، فیز کی آبادی کو الگ تھلگ کر دیا گیا جو Vivo CSF ​​کی افزودگی اور دماغی مائیکرو ویسل ایسوسی ایشن میں مضبوط دکھائی دیتے ہیں۔اہم بات یہ ہے کہ ہم یہ ظاہر کرکے اپنے نتائج کی تصدیق کرنے میں کامیاب ہوئے کہ ترجیحی اور کیمیائی طور پر ترکیب شدہ بہترین امیدوار پیپٹائڈس پروٹین کارگو کو دماغی اسپائنل سیال میں لے جانے کے قابل ہیں۔سب سے پہلے، CNS کے فارماکوڈینامک اثرات BACE1 پیپٹائڈ کے ایک روکنے والے کے ساتھ ایک معروف ٹرانزٹ پیپٹائڈ کو ملا کر قائم کیے گئے تھے۔یہ ظاہر کرنے کے علاوہ کہ Vivo فنکشنل اسکریننگ کی حکمت عملی ناول دماغ کی نقل و حمل پیپٹائڈس کو موثر پروٹین کارگو کیریئرز کے طور پر شناخت کر سکتی ہے، ہم توقع کرتے ہیں کہ اسی طرح کے فنکشنل سلیکشن اپروچز بھی ناول دماغی نقل و حمل کے راستوں کی شناخت میں اہم بن جائیں گے۔
تختی بنانے والے یونٹس (PFU) کی بنیاد پر، فیز پیکیجنگ کے مرحلے کے بعد، تقریباً 109 کے تنوع کے ساتھ بے ترتیب 12-mer لکیری T7 فیج پیپٹائڈس کی ایک لائبریری کو ڈیزائن اور تخلیق کیا گیا تھا (ملاحظہ کریں مواد اور طریقے)۔یہ نوٹ کرنا ضروری ہے کہ ویوو پیننگ سے پہلے ہم نے اس لائبریری کا بغور تجزیہ کیا تھا۔ترمیم شدہ پرائمر کا استعمال کرتے ہوئے فیج لائبریری کے نمونوں کی پی سی آر ایمپلیفیکیشن نے تیار کردہ ایمپلیون جو براہ راست HTS پر لاگو ہوتے تھے (ضمنی شکل 1a)۔a) HTS11 کی ترتیب کی غلطیوں کی وجہ سے، b) پرائمر (NNK) 1-12 کے معیار پر اثر، اور c) اسٹینڈ بائی لائبریری میں وائلڈ ٹائپ (wt) فیج (سکلیٹن انسرٹس) کی موجودگی کی وجہ سے، صرف تصدیق شدہ plugup sequenceb کی معلومات کو نکالنے کے لیے ایک ترتیب فلٹرنگ کا طریقہ کار نافذ کیا گیا تھا۔یہ فلٹر اقدامات تمام HTS ترتیب دینے والی لائبریریوں پر لاگو ہوتے ہیں۔معیاری لائبریری کے لیے، کل 233,868 ریڈز حاصل کیے گئے، جن میں سے 39% نے فلٹر کے معیار کو پاس کیا اور لائبریری کے تجزیہ اور بعد کے راؤنڈز کے لیے انتخاب کے لیے استعمال کیے گئے (ضمنی شکل 1c–e)۔ریڈز بنیادی طور پر لمبائی میں 3 بیس جوڑوں کے ملٹیز تھے جن کی چوٹی 36 نیوکلیوٹائڈس (ضمنی شکل 1c) تھی، جو لائبریری ڈیزائن (NNK) 1-12 کی تصدیق کرتی تھی۔خاص طور پر، لائبریری کے تقریباً 11% اراکین میں 12 جہتی جنگلی قسم (wt) بیک بون PAGISRELVDKL داخل تھا، اور تقریباً نصف ترتیب (49%) اندراج یا حذف پر مشتمل تھی۔لائبریری لائبریری کے ایچ ٹی ایس نے لائبریری میں پیپٹائڈس کے اعلی تنوع کی تصدیق کی: 81% سے زیادہ پیپٹائڈ کی ترتیب صرف ایک بار پائی گئی اور صرف 1.5% ≥4 کاپیوں میں واقع ہوئی (ضمیمہ تصویر 2a)۔ذخیرے میں تمام 12 پوزیشنوں پر امینو ایسڈز (aa) کی فریکوئنسیز ان تعدد کے ساتھ اچھی طرح سے منسلک ہیں جو انحطاط پذیر NKK ریپرٹوائر (ضمیمہ تصویر 2b) سے پیدا ہونے والے کوڈنز کی تعداد کے لیے متوقع ہیں۔ان داخلوں کے ذریعہ انکوڈ شدہ AA باقیات کی مشاہدہ شدہ تعدد حسابی فریکوئنسی (r = 0.893) (ضمیمہ تصویر 2c) کے ساتھ اچھی طرح سے منسلک ہے۔انجیکشن کے لیے فیج لائبریریوں کی تیاری میں اینڈوٹوکسین کو بڑھانے اور ہٹانے کے اقدامات شامل ہیں۔اس سے پہلے 12,13 فیز لائبریریوں کے تنوع کو ممکنہ طور پر کم کرنے کے لیے دکھایا گیا ہے۔لہذا، ہم نے ایک پلیٹ ایمپلیفائیڈ فیج لائبریری کو ترتیب دیا جس میں اینڈوٹوکسین کو ہٹایا گیا تھا اور AA کی فریکوئنسی کا اندازہ لگانے کے لیے اس کا اصل لائبریری سے موازنہ کیا۔اصل پول اور ایمپلیفائیڈ اور پیوریفائیڈ پول (ضمنی شکل 2d) کے درمیان ایک مضبوط ارتباط (r = 0.995) دیکھا گیا، جو اس بات کی نشاندہی کرتا ہے کہ T7 فیج کا استعمال کرتے ہوئے پلیٹوں پر بڑھے ہوئے کلون کے درمیان مقابلہ بڑا تعصب کا سبب نہیں بنا۔یہ موازنہ ہر لائبریری میں ٹریپپٹائڈ شکلوں کی فریکوئنسی پر مبنی ہے، کیونکہ لائبریریوں کے تنوع (~109) کو HTS کے ساتھ بھی مکمل طور پر پکڑا نہیں جا سکتا۔ہر پوزیشن پر aa کے تعدد کے تجزیے نے درج کردہ ذخیرے کی آخری تین پوزیشنوں میں ایک چھوٹی پوزیشن پر منحصر تعصب کا انکشاف کیا (ضمنی شکل 2e)۔آخر میں، ہم نے یہ نتیجہ اخذ کیا کہ لائبریری کا معیار اور تنوع قابل قبول تھا اور انتخاب کے کئی راؤنڈز کے درمیان فیز لائبریریوں کو بڑھانے اور تیاری کی وجہ سے تنوع میں صرف معمولی تبدیلیاں دیکھی گئیں۔
سیریل سیریبرو اسپائنل فلوئڈ سیمپلنگ سرجیکل طور پر ہوش میں چوہوں کے سی ایم میں کینول لگا کر انجام دی جا سکتی ہے تاکہ BBB اور/یا BCSFB (تصویر 1a-b) کے ذریعے نس کے ذریعے لگائے جانے والے T7 فیز (iv) کی شناخت میں آسانی ہو۔ہم نے ان ویوو سلیکشن کے پہلے تین راؤنڈز میں دو آزاد سلیکشن آرمز (آرمز A اور B) استعمال کیے (تصویر 1c)۔ہم نے سلیکشن کے پہلے تین راؤنڈز میں متعارف کرائے گئے فیج کی کل مقدار کو کم کرکے سلیکشن کی سختی میں بتدریج اضافہ کیا۔پیننگ کے چوتھے دور کے لیے، ہم نے شاخوں A اور B کے نمونے اکٹھے کیے اور تین اضافی آزاد انتخاب کیے ہیں۔اس ماڈل میں T7 فیج کے ذرات کی vivo خصوصیات کا مطالعہ کرنے کے لیے، جنگلی قسم کا فیج (PAGISRELVDKL ماسٹر انسرٹ) چوہوں میں دم کی رگ کے ذریعے لگایا گیا تھا۔مختلف ٹائم پوائنٹس پر دماغی اسپائنل فلوئڈ اور خون سے فیجز کی بازیابی سے پتہ چلتا ہے کہ نسبتاً چھوٹے T7 icosahedral فیجز میں خون کے ڈبے سے ابتدائی کلیئرنس کا مرحلہ تیز ہوتا ہے (ضمیمہ تصویر 3)۔زیر انتظام ٹائٹرز اور چوہوں کے خون کے حجم کی بنیاد پر، ہم نے حساب لگایا کہ تقریباً 1% wt۔زیر انتظام خوراک سے فیج کا پتہ خون میں داخل ہونے کے 10 منٹ بعد ہوا تھا۔اس ابتدائی تیزی سے کمی کے بعد، ایک سست بنیادی کلیئرنس 27.7 منٹ کی نصف زندگی کے ساتھ ماپا گیا۔اہم بات یہ ہے کہ CSF کمپارٹمنٹ سے صرف بہت کم فیزز کو بازیافت کیا گیا تھا، جو CSF کمپارٹمنٹ میں جنگلی قسم کے فیز کی منتقلی کے لیے کم پس منظر کی نشاندہی کرتا ہے (ضمنی شکل 3)۔اوسطاً، خون میں T7 فیز کے صرف 1 x 10-3% ٹائٹرز اور ابتدائی طور پر انفیوزڈ فیزز کا 4 x 10-8% نمونے لینے کی پوری مدت (0-250 منٹ) کے دوران دماغی اسپائنل فلوئڈ میں پائے گئے۔خاص طور پر، دماغی اسپائنل سیال میں جنگلی قسم کے فیز کی نصف زندگی (25.7 منٹ) خون میں مشاہدہ کی طرح تھی۔یہ اعداد و شمار ظاہر کرتے ہیں کہ سی ایم کینولڈ چوہوں میں خون سے CSF ٹوکری کو الگ کرنے میں رکاوٹ برقرار ہے، جس سے فیز لائبریریوں کے ویوو سلیکشن میں ایسے کلون کی شناخت کی جا سکتی ہے جو خون سے آسانی سے CSF کمپارٹمنٹ میں منتقل ہو جاتے ہیں۔
(a) ایک بڑے تالاب سے سیریبروسپائنل فلوئڈ (CSF) کے دوبارہ نمونے لینے کا طریقہ ترتیب دینا۔(b) مرکزی اعصابی نظام (CNS) رکاوٹ کے سیلولر مقام اور خون کے دماغی رکاوٹ (BBB) ​​اور خون کے دماغ کی رکاوٹ کو عبور کرنے والے پیپٹائڈس کی شناخت کے لیے استعمال ہونے والی انتخابی حکمت عملی کو ظاہر کرنے والا خاکہ۔(c) ویوو فیج ڈسپلے اسکریننگ فلو چارٹ میں۔انتخاب کے ہر دور میں، فیز (تیر کے اندر جانوروں کی شناخت کرنے والے) کو نس کے ذریعے انجکشن لگایا گیا تھا۔انتخاب کے چوتھے دور تک دو آزاد متبادل شاخیں (A, B) الگ رکھی جاتی ہیں۔سلیکشن راؤنڈ 3 اور 4 کے لیے، CSF سے نکالے گئے ہر فیز کلون کو دستی طور پر ترتیب دیا گیا تھا۔(d) T7 پیپٹائڈ لائبریری (2 x 1012 فیز/جانور) کے نس میں انجیکشن کے بعد دو کینولڈ چوہوں میں انتخاب کے پہلے دور کے دوران خون (سرخ حلقوں) اور دماغی اسپائنل فلوئڈ (سبز مثلث) سے الگ تھلگ فیج کے حرکیات۔نیلے چوکور خون میں فیز کی اوسط ابتدائی حراستی کی نشاندہی کرتے ہیں، جس کا حساب انجیکشن فیز کی مقدار سے کیا جاتا ہے، خون کے کل حجم کو مدنظر رکھتے ہوئے۔سیاہ چوکور خون کے فیز کے ارتکاز سے نکالی گئی y لائن کے چوراہے کے نقطہ کی نشاندہی کرتے ہیں۔(e،f) پیپٹائڈ میں پائے جانے والے تمام ممکنہ اوورلیپنگ ٹریپپٹائڈ شکلوں کی متعلقہ تعدد اور تقسیم کو پیش کریں۔1000 ریڈنگز میں پائے جانے والے نقشوں کی تعداد دکھائی گئی ہے۔نمایاں طور پر (p <0.001) افزودہ شکلوں کو سرخ نقطوں سے نشان زد کیا گیا ہے۔(e) انجکشن شدہ لائبریری کے ٹریپپٹائڈ موٹف کی نسبتہ فریکوئنسی کا جانوروں #1.1 اور #1.2 سے خون سے ماخوذ فیز کے ساتھ موازنہ کرنے والا سکیٹر پلاٹ۔(f) خون اور دماغی اسپائنل سیال میں الگ تھلگ جانوروں کے فیج ٹریپپٹائڈ شکلوں # 1.1 اور # 1.2 کی نسبتہ تعدد کا موازنہ کرنے والا ارتباطی سکیٹر پلاٹ۔(g, h) دونوں جانوروں میں ویوو سلیکشن کے ایک راؤنڈ کے بعد خون (g) بمقابلہ انجکشن شدہ لائبریریوں اور CSF (h) بمقابلہ خون میں افزودہ فیز کی ترتیب ID کی نمائندگی۔ایک حرفی کوڈ کا سائز بتاتا ہے کہ وہ امینو ایسڈ اس پوزیشن پر کتنی بار ہوتا ہے۔سبز = قطبی، جامنی = غیر جانبدار، نیلا = بنیادی، سرخ = تیزابی اور سیاہ = ہائیڈروفوبک امینو ایسڈ۔شکل 1a، b ایڈورڈ یوریچ نے ڈیزائن اور تیار کیا تھا۔
ہم نے ایک فیج پیپٹائڈ لائبریری کو دو سی ایم انسٹرومنٹ چوہوں (کلیڈس اے اور بی) میں انجیکشن لگایا اور دماغی اسپائنل سیال اور خون سے الگ تھلگ فیج (شکل 1d)۔لائبریری کی ابتدائی تیز رفتار کلیئرنس جنگلی قسم کے فیج کے مقابلے میں کم واضح تھی۔دونوں جانوروں میں انجیکشن لائبریری کی اوسط نصف زندگی خون میں 24.8 منٹ تھی، جنگلی قسم کے فیج کی طرح، اور CSF میں 38.5 منٹ۔ہر جانور کے خون اور دماغی اسپائنل فلوڈ فیز کے نمونوں کو ایچ ٹی ایس کا نشانہ بنایا گیا تھا اور تمام شناخت شدہ پیپٹائڈس کا مختصر ٹریپٹائڈ شکل کی موجودگی کے لئے تجزیہ کیا گیا تھا۔Tripeptide motifs کا انتخاب کیا گیا کیونکہ وہ ساخت کی تشکیل اور پیپٹائڈ-پروٹین کے تعامل کے لیے کم سے کم بنیاد فراہم کرتے ہیں 14,15۔ہمیں انجکشن شدہ فیج لائبریری اور دونوں جانوروں کے خون سے نکالے گئے کلون (تصویر 1e) کے درمیان شکلوں کی تقسیم میں ایک اچھا تعلق ملا۔اعداد و شمار سے پتہ چلتا ہے کہ لائبریری کی ساخت صرف خون کے ڈبے میں معمولی طور پر افزودہ ہے۔Weblogo16 سافٹ ویئر کی موافقت کا استعمال کرتے ہوئے ہر پوزیشن پر امینو ایسڈ کی تعدد اور اتفاق رائے کی ترتیب کا مزید تجزیہ کیا گیا۔دلچسپ بات یہ ہے کہ ہمیں خون میں گلائسین کی باقیات (تصویر 1 جی) میں مضبوط افزودگی ملی۔جب خون کا موازنہ CSF سے منتخب کردہ کلون کے ساتھ کیا گیا تو، مضبوط انتخاب اور کچھ شکلوں کو غیر منتخب کیا گیا (تصویر 1f)، اور بعض امینو ایسڈ ترجیحی طور پر 12 رکنی (تصویر 1h) میں پہلے سے طے شدہ پوزیشنوں پر موجود تھے۔خاص طور پر، انفرادی جانور دماغی اسپائنل سیال میں نمایاں طور پر مختلف تھے، جبکہ دونوں جانوروں میں خون میں گلائسین کی افزودگی دیکھی گئی تھی (ضمیمہ تصویر 4a–j)۔جانوروں # 1.1 اور # 1.2 کے دماغی اسپائنل سیال میں ترتیب کے اعداد و شمار کی سخت فلٹرنگ کے بعد، کل 964 اور 420 منفرد 12-میر پیپٹائڈس حاصل کیے گئے تھے (ضمیمہ تصویر 1d–e)۔الگ تھلگ فیج کلون کو بڑھاوا دیا گیا اور ویوو سلیکشن کے دوسرے دور کا نشانہ بنایا گیا۔انتخاب کے دوسرے دور سے نکالے گئے فیز کو ہر جانور میں ایچ ٹی ایس کا نشانہ بنایا گیا اور تمام شناخت شدہ پیپٹائڈس کو ٹریپپٹائڈ شکلوں کی موجودگی کا تجزیہ کرنے کے لیے ایک شکل کی شناخت کے پروگرام میں ان پٹ کے طور پر استعمال کیا گیا (تصویر 2a، b، ef)۔CSF سے برآمد ہونے والے فیز کے پہلے چکر کے مقابلے میں، ہم نے شاخوں A اور B (تصویر 2) میں CSF میں بہت سے نقشوں کے مزید انتخاب اور غیر منتخب ہونے کا مشاہدہ کیا۔ایک نیٹ ورک کی شناخت الگورتھم کا اطلاق اس بات کا تعین کرنے کے لیے کیا گیا تھا کہ آیا وہ مستقل ترتیب کے مختلف نمونوں کی نمائندگی کرتے ہیں۔متبادل کلیڈ A (تصویر 2c، d) اور کلیڈ B (تصویر 2g، h) میں CSF کے ذریعے برآمد کردہ 12 جہتی ترتیبوں کے درمیان واضح مماثلت دیکھی گئی۔ہر برانچ میں جمع کیے گئے تجزیے سے 12-میر پیپٹائڈس (ضمنی شکل 5c،d) کے لیے مختلف انتخابی پروفائلز کا انکشاف ہوا اور انتخاب کے پہلے دور کے مقابلے انتخاب کے دوسرے دور کے بعد پولڈ کلون کے لیے وقت کے ساتھ ساتھ CSF/بلڈ ٹائٹر تناسب میں اضافہ ہوا (ضمیمہ تصویر 5e)۔)۔
ان ویوو فنکشنل فیج ڈسپلے سلیکشن کے لگاتار دو راؤنڈز کے ذریعے دماغی اسپائنل فلوئڈ میں شکلوں اور پیپٹائڈس کی افزودگی۔
ہر جانور (جانور #1.1 اور #1.2) کے پہلے راؤنڈ سے برآمد ہونے والے تمام دماغی اسپائنل فلوئڈ فیزز کو پول کیا گیا، ایمپلیفائیڈ کیا گیا، ایچ ٹی سیکوینس کیا گیا اور ایک ساتھ دوبارہ لگایا گیا (2 x 1010 فیز/جانور) 2 SM کینولڈ چوہے (#1.1 → #)۔2.1 اور 2.2، 1.2 → 2.3 اور 2.4)۔(a,b,e,f) پہلے اور دوسرے سلیکشن راؤنڈ میں تمام CSF سے ماخوذ فیجز کے ٹریپپٹائڈ شکلوں کی نسبتہ تعدد کا موازنہ کرنے والے ارتباطی سکیٹر پلاٹس۔رشتہ دار فریکوئنسی اور شکلوں کی تقسیم جو دونوں سمتوں میں پیپٹائڈس میں پائے جانے والے تمام ممکنہ اوورلیپنگ ٹریپٹائڈس کی نمائندگی کرتی ہے۔1000 ریڈنگز میں پائے جانے والے نقشوں کی تعداد دکھائی گئی ہے۔موٹیفز جو نمایاں طور پر (p <0.001) مقابلے کی لائبریریوں میں سے کسی ایک میں منتخب یا خارج کیے گئے تھے سرخ نقطوں کے ساتھ نمایاں کیے گئے ہیں۔(c, d, g, h) تمام CSF سے بھرپور 12 امینو ایسڈ لمبے تسلسل کی تسلسل علامت (لوگو) کی نمائندگی جو Vivo کے انتخاب میں راؤنڈ 2 اور 1 پر مبنی ہے۔ایک حرفی کوڈ کا سائز بتاتا ہے کہ وہ امینو ایسڈ اس پوزیشن پر کتنی بار ہوتا ہے۔لوگو کی نمائندگی کرنے کے لیے، دو سلیکشن راؤنڈز کے درمیان انفرادی جانوروں سے نکالے گئے CSF سیکوینسز کی فریکوئنسی کا موازنہ کیا جاتا ہے اور دوسرے راؤنڈ میں افزودہ ترتیب دکھائے جاتے ہیں: (c) #1.1–#2.1 (d) #1.1–#2.2 (g) #1.2–#2.3 اور (h) #1.2–#2.(c، d) جانوروں میں دی گئی پوزیشن پر سب سے زیادہ افزودہ امینو ایسڈز نمبر۔2.1 اور نمبر2.2 یا (جی، ایچ) جانوروں میں نمبر۔2.3 اور نمبر2.4 رنگ میں دکھائے گئے ہیں۔سبز = قطبی، جامنی = غیر جانبدار، نیلا = بنیادی، سرخ = تیزابی اور سیاہ = ہائیڈروفوبک امینو ایسڈ۔
انتخاب کے تیسرے دور کے بعد، ہم نے دو جانوروں سے الگ تھلگ 332 CSF-دوبارہ تشکیل شدہ فیز کلون سے 124 منفرد پیپٹائڈ تسلسل (#3.1 اور #3.2) کی نشاندہی کی (ضمیمہ تصویر 6a)۔ترتیب LGSVS (18.7%) کا سب سے زیادہ رشتہ دار تناسب تھا، اس کے بعد جنگلی قسم کے داخلے PAGISRELVDKL (8.2%)، MRWFFSHASQGR (3%)، DVAKVS (3%)، TWLFSLG (2.2%)، اور SARGSWREIVSLS (2.2%)۔آخری چوتھے راؤنڈ میں، ہم نے تین الگ الگ جانوروں (تصویر 1c) سے آزادانہ طور پر منتخب کردہ دو شاخوں کو جمع کیا۔CSF سے برآمد ہونے والے 925 ترتیب والے فیز کلون میں سے، چوتھے راؤنڈ میں ہمیں 64 منفرد پیپٹائڈ سیکوینسز ملے (ضمنی شکل 6b)، جن میں جنگلی قسم کے فیز کا رشتہ دار تناسب 0.8% تک گر گیا۔چوتھے راؤنڈ میں سب سے زیادہ عام CSF کلون LYVLHSRGLWGFKLAAALE (18%)، LGSVS (17%)، GFVRFRLSNTR (14%)، KVAWRVFSLFWK (7%)، SVHGV (5%)، GRPQKINGARVC (3.6%)، %2SSDRL (3.6%) اور %2SSDRL) تھے۔%))۔NNK لائبریری ڈیزائن کے لیے ڈیجنریٹ کوڈنز کا استعمال کرتے وقت لائبریری پرائمر میں منتخب پیپٹائڈس کی لمبائی کی حد نیوکلیوٹائڈ داخل کرنے/حذف کرنے یا قبل از وقت اسٹاپ کوڈنز کی وجہ سے ہوتی ہے۔قبل از وقت سٹاپ کوڈنز چھوٹے پیپٹائڈز پیدا کرتے ہیں اور ان کا انتخاب کیا جاتا ہے کیونکہ ان میں سازگار AA شکل ہوتی ہے۔لمبے پیپٹائڈس کا نتیجہ مصنوعی لائبریریوں کے پرائمر میں اندراج/حذف کرنے سے ہوسکتا ہے۔یہ ڈیزائن کردہ اسٹاپ کوڈن کو فریم کے باہر رکھتا ہے اور اسے اس وقت تک پڑھتا ہے جب تک کہ نیا اسٹاپ کوڈن نیچے کی طرف ظاہر نہ ہو۔عام طور پر، ہم نے ان پٹ ڈیٹا کا نمونہ آؤٹ پٹ ڈیٹا کے ساتھ موازنہ کرکے چاروں انتخابی راؤنڈز کے لیے افزودگی کے عوامل کا حساب لگایا۔اسکریننگ کے پہلے دور کے لیے، ہم نے غیر مخصوص پس منظر کے حوالے کے طور پر جنگلی قسم کے فیج ٹائٹرز کا استعمال کیا۔دلچسپ بات یہ ہے کہ پہلے CSF سائیکل میں منفی فیز کا انتخاب بہت مضبوط تھا، لیکن خون میں نہیں تھا (تصویر 3a)، جس کی وجہ پیپٹائڈ لائبریری کے زیادہ تر ممبران کے CSF کمپارٹمنٹ میں غیر فعال پھیلاؤ کے کم امکان کی وجہ سے ہو سکتا ہے یا رشتہ دار فیجز زیادہ مؤثر طریقے سے خون کے دھارے سے بیکٹریو کے مقابلے میں برقرار یا ہٹائے جاتے ہیں۔تاہم، پیننگ کے دوسرے دور میں، دونوں کلیڈز میں CSF میں فیزز کا مضبوط انتخاب دیکھا گیا، جس سے معلوم ہوتا ہے کہ پچھلا راؤنڈ پیپٹائڈز کو ظاہر کرنے والے فیزز میں افزودہ تھا جو CSF کے استعمال کو فروغ دیتے ہیں (تصویر 3a)۔ایک بار پھر، خون کی اہم افزودگی کے بغیر۔تیسرے اور چوتھے راؤنڈ میں بھی، فیج کلون کو CSF میں نمایاں طور پر افزودہ کیا گیا۔انتخاب کے آخری دو راؤنڈز کے درمیان ہر منفرد پیپٹائڈ ترتیب کی نسبتہ تعدد کا موازنہ کرتے ہوئے، ہم نے پایا کہ انتخاب کے چوتھے دور میں ترتیب اور بھی زیادہ افزودہ تھی (تصویر 3b)۔دونوں پیپٹائڈ واقفیت کا استعمال کرتے ہوئے تمام 64 منفرد پیپٹائڈ تسلسل سے کل 931 ٹریپپٹائڈ شکلیں نکالی گئیں۔چوتھے راؤنڈ میں سب سے زیادہ افزودہ شکلوں کو انجیکشن شدہ لائبریری (کٹ آف: 10% افزودگی) (ضمیمہ تصویر 6c) کے مقابلے تمام راؤنڈ میں ان کی افزودگی پروفائلز کے لیے زیادہ باریک بینی سے جانچا گیا۔انتخاب کے عمومی نمونوں سے پتہ چلتا ہے کہ زیادہ تر مطالعہ شدہ محرکات دونوں انتخابی شاخوں کے تمام پچھلے دوروں میں افزودہ تھے۔تاہم، کچھ شکلیں (مثلاً SGL، VSG، LGS GSV) بنیادی طور پر متبادل کلیڈ A سے تھیں، جبکہ دیگر (جیسے FGW، RTN، WGF، NTR) کو متبادل کلیڈ B میں افزودہ کیا گیا تھا۔
CSF سے افزودہ فیز ڈسپلے شدہ پیپٹائڈس اور بایوٹینیلیٹڈ لیڈر پیپٹائڈس کی CSF ٹرانسپورٹ کی توثیق جو اسٹریپٹاویڈن پے لوڈز سے جڑی ہوئی ہے۔
(a) انجیکشن (ان پٹ = I) فیج (PFU) ٹائٹرز اور طے شدہ CSF فیج ٹائٹرز (آؤٹ پٹ = O) کی بنیاد پر چاروں راؤنڈز (R1-R4) میں افزودگی کا تناسب۔پچھلے تین راؤنڈز (R2-R4) کے افزودگی کے عوامل کا حساب وزن کے اعداد و شمار کے ساتھ پچھلے راؤنڈ اور پہلے راؤنڈ (R1) کے مقابلے میں کیا گیا۔کھلی سلاخیں دماغی اسپائنل سیال ہیں، سایہ دار سلاخیں پلازما ہیں۔(***p <0.001، طالب علم کے ٹی ٹیسٹ پر مبنی)۔(b) سب سے زیادہ پائے جانے والے فیز پیپٹائڈس کی فہرست، انتخاب کے راؤنڈ 4 کے بعد CSF میں جمع کیے گئے تمام فیجز کے ان کے رشتہ دار تناسب کے مطابق درجہ بندی کی گئی ہے۔چھ سب سے عام فیز کلون کو رنگ، نمبر اور انتخاب کے راؤنڈ 3 اور 4 (انسیٹس) کے درمیان ان کی افزودگی کے عوامل میں نمایاں کیا گیا ہے۔(c،d) راؤنڈ 4 سے چھ انتہائی افزودہ فیز کلون، خالی فیج اور پیرنٹل فیج پیپٹائڈ لائبریریوں کا CSF نمونے لینے والے ماڈل میں انفرادی طور پر تجزیہ کیا گیا۔CSF اور خون کے نمونے اشارہ کردہ وقت کے مقامات پر جمع کیے گئے تھے۔(c) مساوی مقدار میں 6 امیدوار فیز کلون (2 x 1010 فیز/جانور)، خالی فیز (#1779) (2 x 1010 فیج/جانور) اور سٹاک فیج پیپٹائڈ لائبریریز (2 x 1012 فیجز/جانور) انجیکشن لگا کر کم از کم 3 CM کے ذریعے جانوروں کی دم کو الگ الگ کر سکتے ہیں۔وقت کے ساتھ ہر انجکشن شدہ فیج کلون اور فیج پیپٹائڈ لائبریری کی CSF فارماکوکینیٹکس کو دکھایا گیا ہے۔(d) نمونے لینے کے وقت کے دوران تمام بازیافت شدہ فیز/mL کے لیے اوسط CSF/خون کا تناسب دکھاتا ہے۔(e) چار مصنوعی لیڈر پیپٹائڈس اور ایک سکیمبلڈ کنٹرول کو بایوٹین سے اسٹریپٹاویڈن کے ساتھ ان کے N-ٹرمینس (ٹیٹرمر ڈسپلے) کے ذریعے منسلک کیا گیا تھا جس کے بعد انجکشن (ٹیل ویین iv، 10 ملی گرام اسٹریپٹاویڈن/کلوگرام)۔کم از کم تین انٹیوبیٹڈ چوہے (N = 3)۔)۔CSF کے نمونے اشارہ کردہ وقت کے مقامات پر جمع کیے گئے تھے اور سٹریپٹاویڈن کی تعداد کو CSF اینٹی سٹریپٹاویڈن ELISA (nd = پتہ نہیں چلا) کے ذریعے ماپا گیا تھا۔(*p <0.05، **p <0.01، ***p <0.001، ANOVA ٹیسٹ کی بنیاد پر)۔(f) سب سے زیادہ افزودہ فیج پیپٹائڈ کلون #2002 (جامنی) کے امینو ایسڈ کی ترتیب کا انتخاب کے چوتھے دور سے دوسرے منتخب فیز پیپٹائڈ کلون کے ساتھ موازنہ۔ایک جیسے اور اسی طرح کے امینو ایسڈ کے ٹکڑے کلر کوڈڈ ہیں۔
چوتھے دور (تصویر 3b) میں تمام افزودہ مراحل میں سے، CSF نمونے لینے کے ماڈل میں مزید انفرادی تجزیہ کے لیے چھ امیدوار کلون منتخب کیے گئے۔چھ امیدوار فیج، خالی فیج (کوئی داخل نہیں) اور پروپیج پیپٹائڈ لائبریریوں کی مساوی مقدار کو تین کینولڈ سی ایم جانوروں میں لگایا گیا تھا، اور فارماکوکینیٹکس کا تعین CSF (تصویر 3c) اور خون (ضمنی شکل 7) اسسیس میں کیا گیا تھا۔ٹیسٹ کیے گئے تمام فیز کلون نے CSF کمپارٹمنٹ کو خالی کنٹرول فیز (#1779) سے 10-1000 گنا زیادہ سطح پر نشانہ بنایا۔مثال کے طور پر، کلون #2020 اور #2077 میں کنٹرول فیج سے تقریباً 1000 گنا زیادہ CSF ٹائٹرز تھے۔ہر منتخب پیپٹائڈ کا فارماکوکینیٹک پروفائل مختلف ہوتا ہے، لیکن ان سب میں CSF ہومنگ کی اعلیٰ صلاحیت ہوتی ہے۔ہم نے کلون #1903 اور #2011 میں وقت کے ساتھ ساتھ مسلسل کمی دیکھی، جب کہ کلون #2077، #2002 اور #2009 کے لیے پہلے 10 منٹ کے دوران اضافہ ایکٹو ٹرانسپورٹ کی نشاندہی کر سکتا ہے لیکن اس کی تصدیق کی ضرورت ہے۔کلون #2020، #2002، اور #2077 اعلی سطح پر مستحکم ہوئے، جب کہ ابتدائی اضافے کے بعد کلون #2009 کا CSF ارتکاز آہستہ آہستہ کم ہوا۔اس کے بعد ہم نے ہر CSF امیدوار کی نسبتہ تعدد کا اس کے خون کے ارتکاز (تصویر 3d) سے موازنہ کیا۔نمونے لینے کے ہر وقت ہر CSF امیدوار کے اس کے خون کے ٹائٹر کے ساتھ اوسط ٹائٹر کا باہمی تعلق ظاہر کرتا ہے کہ چھ امیدواروں میں سے تین خون CSF میں نمایاں طور پر افزودہ تھے۔دلچسپ بات یہ ہے کہ کلون #2077 نے خون میں زیادہ استحکام دکھایا (ضمنی شکل 7)۔اس بات کی تصدیق کرنے کے لیے کہ پیپٹائڈز خود فیز پارٹیکلز کے علاوہ دیگر کارگو کو CSF کمپارٹمنٹ میں لے جانے کے قابل ہیں، ہم نے N-terminus پر بایوٹین کے ساتھ اخذ کردہ چار لیڈر پیپٹائڈس کی ترکیب کی جہاں پیپٹائڈز فیج پارٹیکل سے منسلک ہوتے ہیں۔بایوٹینیلیٹڈ پیپٹائڈس (نمبر 2002، 2009، 2020 اور 2077) کو اسٹریپٹاویڈن (SA) کے ساتھ ملایا گیا تاکہ کسی حد تک فیز جیومیٹری کی نقل کرنے والی ملٹیمیرک شکلیں حاصل کی جاسکیں۔اس فارمیٹ نے ہمیں کارگو ٹرانسپورٹنگ پروٹین پیپٹائڈس کے طور پر خون اور دماغی اسپائنل سیال میں SA کی نمائش کی پیمائش کرنے کی بھی اجازت دی۔اہم بات یہ ہے کہ جب مصنوعی پیپٹائڈس کو اس SA- conjugated فارمیٹ (تصویر 3e) میں دیا جاتا تھا تو اکثر فیج ڈیٹا کو دوبارہ تیار کیا جا سکتا تھا۔سکیمبلڈ پیپٹائڈس کی ابتدائی نمائش کم تھی اور 48 گھنٹوں کے اندر ناقابل شناخت سطح کے ساتھ تیز تر CSF کلیئرنس تھی۔CSF جگہ میں ان پیپٹائڈ فیج کلون کی ترسیل کے راستوں کے بارے میں بصیرت حاصل کرنے کے لیے، ہم نے امیونو ہسٹو کیمسٹری (IHC) کا استعمال کرتے ہوئے انفرادی فیز پیپٹائڈ ہٹ کے لوکلائزیشن کا تجزیہ کیا تاکہ ویوو میں انٹراوینس انجیکشن کے 1 گھنٹے بعد فیز ذرات کا براہ راست پتہ لگایا جا سکے۔خاص طور پر، کلون #2002، #2077، اور #2009 کا پتہ دماغ کی کیپلیریوں میں مضبوط داغوں سے لگایا جا سکتا ہے، جبکہ کنٹرول فیج (#1779) اور کلون #2020 کا پتہ نہیں چل سکا (ضمنی شکل 8)۔اس سے پتہ چلتا ہے کہ یہ پیپٹائڈس BBB کو عبور کرکے دماغ پر اثر ڈالنے میں حصہ ڈالتے ہیں۔اس مفروضے کو جانچنے کے لیے مزید تفصیلی تجزیے کی ضرورت ہے، کیونکہ BSCFB کا راستہ بھی شامل ہو سکتا ہے۔جب سب سے زیادہ افزودہ کلون (#2002) کے امینو ایسڈ کی ترتیب کا دوسرے منتخب پیپٹائڈس کے ساتھ موازنہ کیا جائے تو، یہ نوٹ کیا گیا کہ ان میں سے کچھ میں ایک جیسے امینو ایسڈ ایکسٹینشن ہوتے ہیں، جو اسی طرح کے نقل و حمل کے طریقہ کار کی نشاندہی کر سکتے ہیں (تصویر 3f)۔
اس کے منفرد پلازما پروفائل اور وقت کے ساتھ ساتھ CSF میں نمایاں اضافے کی وجہ سے، فیج ڈسپلے کلون #2077 کو 48 گھنٹے کی طویل مدت میں مزید دریافت کیا گیا اور مسلسل SA کی سطح (تصویر 4a) کے ساتھ مل کر مشاہدہ کردہ CSF میں تیزی سے اضافے کو دوبارہ پیدا کرنے میں کامیاب رہا۔دیگر شناخت شدہ فیج کلون کے بارے میں، #2077 نے دماغ کی کیپلیریوں کے لیے سخت داغ دیا اور کیپلیری مارکر لیکٹین کے ساتھ اہم اجتماعیت کو ظاہر کیا جب اعلی ریزولیوشن پر دیکھا جائے اور ممکنہ طور پر پیرنچیمل اسپیس میں کچھ داغ دھبے (شکل 4b)۔یہ جانچنے کے لیے کہ آیا سی این ایس میں پیپٹائڈ ثالثی فارماسولوجیکل اثرات حاصل کیے جاسکتے ہیں، ہم نے ایک تجربہ کیا جس میں i) #2077 ٹرانزٹ پیپٹائڈ اور ii) BACE1 inhibitor peptide کو SA کے ساتھ دو مختلف تناسب میں ملایا گیا تھا۔ایک مجموعہ کے لیے ہم نے صرف BACE1 پیپٹائڈ انحیبیٹر استعمال کیا اور دوسرے کے لیے ہم نے BACE1 پیپٹائڈ انحیبیٹر کا #2077 پیپٹائڈ کا 1:3 تناسب استعمال کیا۔دونوں نمونے نس کے ذریعے دیے گئے تھے اور وقت کے ساتھ ساتھ بیٹا امیلائیڈ پیپٹائڈ 40 (Abeta40) کے خون اور دماغی اسپائنل سیال کی سطح کی پیمائش کی گئی۔Abeta40 کی پیمائش CSF میں کی گئی تھی کیونکہ یہ دماغی parenchyma میں BACE1 کی روک تھام کی عکاسی کرتا ہے۔جیسا کہ توقع کی گئی تھی، دونوں کمپلیکسز نے Abeta40 (تصویر 4c، d) کے خون کی سطح کو نمایاں طور پر کم کیا۔تاہم، پیپٹائڈ نمبر کے مرکب پر مشتمل صرف نمونے2077 اور BACE1 پیپٹائڈ کو SA سے جوڑ کر روکنے والے دماغی اسپائنل سیال (تصویر 4c) میں Abeta40 میں نمایاں کمی کا باعث بنے۔اعداد و شمار سے پتہ چلتا ہے کہ پیپٹائڈ نمبر2077 60 kDa SA پروٹین کو CNS میں منتقل کرنے کے قابل ہے اور BACE1 پیپٹائڈ کے SA-conjugated inhibitors کے ساتھ فارماسولوجیکل اثرات بھی پیدا کرتا ہے۔
(a) T7 فیز کا کلونل انجیکشن (2 × 10 فیجز/جانور) کم از کم تین CM انٹیوبیٹڈ چوہوں میں CSF پیپٹائڈ #2077 (RLSSVDSDLSGC) اور غیر انجکشن شدہ کنٹرول فیج (#1779) کے طویل مدتی فارماکوکینیٹک پروفائلز دکھاتا ہے۔(b) فیج انجیکشن والے چوہوں (2 × 10 10 فیجز/جانور) میں نمائندہ کارٹیکل مائکروویسلز کی کنفوکل مائکروسکوپک امیج پیپٹائڈ #2077 اور وریدوں (لیکٹین) کے انسداد کو ظاہر کرتی ہے۔یہ فیز کلون 3 چوہوں کو دیے گئے تھے اور پرفیوژن سے پہلے 1 گھنٹے تک گردش کرنے کی اجازت دی گئی تھی۔دماغوں کو T7 فیج کیپسڈ کے خلاف پولی کلونل ایف آئی ٹی سی کے لیبل والے اینٹی باڈیز سے سیکشن اور داغ دیا گیا تھا۔پرفیوژن اور اس کے بعد طے کرنے سے دس منٹ پہلے، DyLight594 لیبل والے لیکٹین کو نس کے ذریعے دیا گیا تھا۔فلوروسینٹ امیجز مائیکرو ویسلز کے لومینل سائیڈ کے لیکٹین سٹیننگ (سرخ) اور کیپلیریوں اور پیریواسکولر دماغی بافتوں کے لیمن میں فیجز (سبز) دکھاتی ہیں۔اسکیل بار 10 µm کے مساوی ہے۔(c، d) بایوٹینیلیٹڈ BACE1 انحیبیٹری پیپٹائڈ اکیلے یا بایوٹینیلیٹڈ ٹرانزٹ پیپٹائڈ #2077 کے ساتھ مل کر اسٹریپٹاویڈن کے ساتھ جوڑا گیا تھا جس کے بعد کم از کم تین کینولڈ سی ایم چوہوں (10 ملی گرام اسٹریپٹاویڈن/کلوگرام) کو انٹراوینس انجیکشن لگایا گیا تھا۔Aβ40 میں BACE1 پیپٹائڈ انحیبیٹر کی ثالثی کی کمی کو Aβ1-40 ELISA کے ذریعہ خون (سرخ) اور دماغی اسپائنل فلوئڈ (نارنجی) کے ذریعہ اشارہ کردہ ٹائم پوائنٹس پر ماپا گیا۔بہتر وضاحت کے لیے، گراف پر 100% کے پیمانے پر ایک نقطے والی لکیر کھینچی گئی ہے۔(c) خون میں Aβ40 میں فی صد کمی (سرخ مثلث) اور دماغی اسپائنل فلوئڈ (نارنجی مثلث) چوہوں میں 3:1 کے تناسب میں ٹرانزٹ پیپٹائڈ #2077 اور BACE1 انحیبیٹری پیپٹائڈ کے ساتھ اسٹریپٹاویڈن کے ساتھ علاج کیا جاتا ہے۔(d) خون میں فیصد کی کمی Aβ40 (سرخ حلقے) اور چوہوں کے دماغی اسپائنل فلوئڈ (اورینج حلقوں) میں صرف BACE1 انحیبیٹری پیپٹائڈ کے ساتھ اسٹریپٹاویڈن کے ساتھ علاج کیا جاتا ہے۔کنٹرول میں Aβ ارتکاز 420 pg/ml (معیاری انحراف = 101 pg/ml) تھا۔
بائیو میڈیکل ریسرچ17 کے کئی شعبوں میں فیز ڈسپلے کو کامیابی کے ساتھ لاگو کیا گیا ہے۔یہ طریقہ Vivo vascular diversity study18,19 کے ساتھ ساتھ دماغی وریدوں 20,21,22,23,24,25,26 کو نشانہ بنانے والے مطالعات میں استعمال کیا گیا ہے۔اس مطالعے میں، ہم نے اس انتخاب کے طریقہ کار کے اطلاق کو نہ صرف دماغی وریدوں کو نشانہ بنانے والے پیپٹائڈس کی براہ راست شناخت تک بڑھایا، بلکہ خون دماغی رکاوٹ کو عبور کرنے کے لیے فعال نقل و حمل کی خصوصیات والے امیدواروں کی دریافت تک بھی۔اب ہم سی ایم انٹیوبیٹڈ چوہوں میں ان ویوو سلیکشن کے طریقہ کار کی ترقی کی وضاحت کرتے ہیں اور CSF ہومنگ خصوصیات کے ساتھ پیپٹائڈس کی شناخت کرنے کی صلاحیت کو ظاہر کرتے ہیں۔12-mer بے ترتیب پیپٹائڈس کی لائبریری کو ظاہر کرنے والے T7 فیز کا استعمال کرتے ہوئے، ہم یہ ظاہر کرنے کے قابل تھے کہ T7 فیج کافی چھوٹا ہے (تقریباً 60 nm قطر) 10 کو خون کے دماغی رکاوٹ کے مطابق ڈھال لیا جائے، اس طرح براہ راست خون کے دماغ کی رکاوٹ یا plexus choroid کو عبور کیا جائے۔ہم نے مشاہدہ کیا کہ کینولڈ سی ایم چوہوں سے CSF کی کٹائی Vivo فنکشنل اسکریننگ کے طریقہ کار میں ایک اچھی طرح سے کنٹرول تھی، اور یہ کہ نکالا ہوا فیز نہ صرف ویسکولیچر کا پابند ہے بلکہ خون کے دماغ کی رکاوٹ کو عبور کرنے والے کے طور پر بھی کام کرتا ہے۔مزید برآں، بیک وقت خون جمع کرکے اور CSF اور خون سے حاصل ہونے والے فیجز پر HTS کا اطلاق کرکے، ہم نے تصدیق کی کہ CSF کا ہمارا انتخاب خون کی افزودگی یا انتخاب کے دوروں کے درمیان توسیع کے لیے فٹنس سے متاثر نہیں ہوا تھا۔تاہم، خون کا ٹوکری انتخاب کے طریقہ کار کا حصہ ہے، کیونکہ CSF کے کمپارٹمنٹ تک پہنچنے کے قابل ہونے والے مراحل کو خون کے دھارے میں کافی دیر تک زندہ رہنا چاہیے اور گردش کرنا چاہیے تاکہ دماغ میں خود کو تقویت پہنچ سکے۔خام HTS ڈیٹا سے قابل اعتماد ترتیب کی معلومات نکالنے کے لیے، ہم نے تجزیہ کے ورک فلو میں پلیٹ فارم کے لیے مخصوص ترتیب کی غلطیوں کے مطابق فلٹرز نافذ کیے ہیں۔اسکریننگ کے طریقہ کار میں حرکیاتی پیرامیٹرز کو شامل کرکے، ہم نے خون میں جنگلی قسم کے T7 فیز (t½ ~ 28 منٹ) کے تیز فارماکوکینیٹکس کی تصدیق کی 24، 27، 28 اور دماغی اسپائنل سیال (t½ ~ 26 منٹ) فی منٹ میں ان کی نصف زندگی کا بھی تعین کیا۔خون اور CSF میں ملتے جلتے فارماکوکینیٹک پروفائلز کے باوجود، CSF میں فیز کے خون کے ارتکاز کا صرف 0.001% پتہ لگایا جا سکتا ہے، جو خون دماغی رکاوٹ کے پار جنگلی قسم کے T7 فیز کے پس منظر میں کم نقل و حرکت کی نشاندہی کرتا ہے۔یہ کام vivo پیننگ کی حکمت عملیوں میں استعمال کرتے وقت انتخاب کے پہلے دور کی اہمیت کو اجاگر کرتا ہے، خاص طور پر فیج سسٹمز کے لیے جو گردش سے تیزی سے صاف ہو جاتے ہیں، کیونکہ چند کلون CNS کمپارٹمنٹ تک پہنچنے کے قابل ہوتے ہیں۔اس طرح، پہلے دور میں، لائبریری کے تنوع میں کمی بہت زیادہ تھی، کیونکہ اس انتہائی سخت CSF ماڈل میں صرف ایک محدود تعداد میں کلون جمع کیے گئے تھے۔اس میں vivo پیننگ کی حکمت عملی میں کئی انتخابی اقدامات شامل تھے جیسے CSF کے کمپارٹمنٹ میں فعال جمع ہونا، خون کے ڈبے میں کلون کی بقا، اور پہلے 10 منٹ کے اندر T7 فیج کلون کو خون سے تیزی سے ہٹانا (تصویر 1d اور ضمنی شکل 4M)۔)۔اس طرح، پہلے راؤنڈ کے بعد، CSF میں مختلف فیز کلون کی نشاندہی کی گئی، حالانکہ ایک ہی ابتدائی پول انفرادی جانوروں کے لیے استعمال کیا گیا تھا۔اس سے پتہ چلتا ہے کہ بڑی تعداد میں لائبریری ممبران والی سورس لائبریریوں کے لیے انتخاب کے متعدد سخت اقدامات کے نتیجے میں تنوع میں نمایاں کمی واقع ہوتی ہے۔لہذا، بے ترتیب واقعات ابتدائی انتخاب کے عمل کا ایک لازمی حصہ بن جائیں گے، جو نتیجہ پر بہت زیادہ اثر انداز ہوں گے۔امکان ہے کہ اصل لائبریری کے بہت سے کلون میں CSF کی افزودگی کا رجحان بہت ملتا جلتا تھا۔تاہم، ایک ہی تجرباتی حالات میں بھی، ابتدائی پول میں ہر مخصوص کلون کی چھوٹی تعداد کی وجہ سے انتخاب کے نتائج مختلف ہو سکتے ہیں۔
CSF میں افزودہ شکلیں خون میں موجود عناصر سے مختلف ہوتی ہیں۔دلچسپ بات یہ ہے کہ ہم نے انفرادی جانوروں کے خون میں گلیسین سے بھرپور پیپٹائڈس کی طرف پہلی تبدیلی نوٹ کی۔(تصویر 1 جی، سپلیمنٹری انجیر 4e، 4 ایف)۔گلائسین پیپٹائڈس پر مشتمل فیز زیادہ مستحکم اور گردش سے باہر نکالے جانے کا امکان کم ہو سکتا ہے۔تاہم، دماغی اسپائنل سیال کے نمونوں میں یہ گلائسین سے بھرپور پیپٹائڈس کا پتہ نہیں چل سکا، جس سے پتہ چلتا ہے کہ کیوریٹ شدہ لائبریریاں انتخاب کے دو مختلف مراحل سے گزری ہیں: ایک خون میں اور دوسرا دماغی اسپائنل سیال میں جمع ہونے کی اجازت ہے۔انتخاب کے چوتھے دور کے نتیجے میں CSF سے افزودہ کلون کا بڑے پیمانے پر تجربہ کیا گیا ہے۔تقریباً تمام انفرادی طور پر جانچے گئے کلون خالی کنٹرول فیز کے مقابلے میں CSF میں افزودہ ہونے کی تصدیق کی گئی۔ایک پیپٹائڈ ہٹ (#2077) کا مزید تفصیل سے جائزہ لیا گیا۔اس نے دیگر ہٹ (شکل 3d اور ضمنی شکل 7) کے مقابلے میں طویل پلازما نصف زندگی ظاہر کی، اور دلچسپ بات یہ ہے کہ اس پیپٹائڈ میں سی ٹرمینس میں سیسٹین کی باقیات موجود تھیں۔حال ہی میں یہ دکھایا گیا ہے کہ پیپٹائڈس میں سیسٹین کا اضافہ البومن 29 سے منسلک ہو کر ان کی دواسازی کی خصوصیات کو بہتر بنا سکتا ہے۔یہ فی الحال پیپٹائڈ #2077 کے لیے نامعلوم ہے اور مزید مطالعہ کی ضرورت ہے۔کچھ پیپٹائڈس نے CSF افزودگی میں توازن پر انحصار ظاہر کیا (ڈیٹا نہیں دکھایا گیا)، جس کا تعلق T7 کیپسڈ کی ظاہر کردہ سطح جیومیٹری سے ہوسکتا ہے۔ہم نے جو T7 سسٹم استعمال کیا اس میں فی فیج پارٹیکل ہر پیپٹائڈ کی 5-15 کاپیاں دکھائی گئیں۔IHC چوہوں کے دماغی پرانتستا میں نس کے ذریعے لگائے گئے امیدوار لیڈ فیز کلون پر انجام دیا گیا تھا (ضمیمہ تصویر 8)۔اعداد و شمار سے پتہ چلتا ہے کہ کم از کم تین کلون (نمبر 2002، نمبر 2009 اور نمبر 2077) نے بی بی بی کے ساتھ بات چیت کی۔یہ طے کرنا باقی ہے کہ آیا اس BBB تعامل کا نتیجہ CSF کے جمع ہونے یا ان کلون کی براہ راست BCSFB میں منتقل ہونے میں ہوتا ہے۔اہم بات یہ ہے کہ ہم یہ ظاہر کرتے ہیں کہ منتخب پیپٹائڈس اپنی CSF نقل و حمل کی صلاحیت کو برقرار رکھتے ہیں جب ترکیب کی جاتی ہے اور پروٹین کارگو سے منسلک ہوتی ہے۔این ٹرمینل بایوٹینیلیٹڈ پیپٹائڈس کا SA پر پابند ہونا بنیادی طور پر خون اور دماغی اسپائنل فلوئڈ (تصویر 3e) میں ان کے متعلقہ فیز کلون کے ساتھ حاصل کردہ نتائج کو دہراتا ہے۔آخر میں، ہم یہ ظاہر کرتے ہیں کہ لیڈ پیپٹائڈ #2077 BACE1 کے بایوٹینیلیٹڈ پیپٹائڈ روکنے والے کے دماغی عمل کو فروغ دینے کے قابل ہے، جو CSF میں Abeta40 کی سطح کو نمایاں طور پر کم کرکے CNS میں واضح فارماکوڈائنامک اثرات کا باعث بنتا ہے (تصویر 4)۔ہم تمام ہٹ کی پیپٹائڈ سیکوینس ہومولوجی سرچ کرکے ڈیٹا بیس میں کسی بھی ہومولوگس کی شناخت کرنے سے قاصر تھے۔یہ نوٹ کرنا ضروری ہے کہ T7 لائبریری کا سائز تقریباً 109 ہے، جب کہ 12-mers کے لیے نظریاتی لائبریری کا سائز 4 x 1015 ہے۔ اس لیے، ہم نے 12-mer peptide لائبریری کے تنوع کی جگہ کا صرف ایک چھوٹا سا حصہ منتخب کیا ہے، جس کا مطلب یہ ہو سکتا ہے کہ زیادہ سے زیادہ موزوں جگہوں کی نشاندہی کی جا سکتی ہے۔فرضی طور پر، ہمیں ان پیپٹائڈس کی کوئی قدرتی ہم جنس نہ ملنے کی ایک وجہ ارتقاء کے دوران دماغ میں مخصوص پیپٹائڈ شکلوں کے بے قابو داخلے کو روکنے کے لیے غیر منتخب ہونا ہو سکتی ہے۔
ایک ساتھ مل کر، ہمارے نتائج مستقبل کے کام کے لیے ایک بنیاد فراہم کرتے ہیں تاکہ Vivo میں دماغی رکاوٹ کے نقل و حمل کے نظام کی مزید تفصیل سے شناخت اور ان کی خصوصیت کی جا سکے۔اس طریقہ کار کا بنیادی سیٹ اپ ایک فنکشنل سلیکشن حکمت عملی پر مبنی ہے جو نہ صرف دماغی عروقی بائنڈنگ خصوصیات کے ساتھ کلون کی شناخت کرتا ہے بلکہ اس میں ایک اہم مرحلہ بھی شامل ہے جس میں کامیاب کلون CNS کمپارٹمنٹ میں Vivo میں حیاتیاتی رکاوٹوں کو عبور کرنے کے لیے اندرونی سرگرمی رکھتے ہیں۔ان پیپٹائڈس کی نقل و حمل کے طریقہ کار اور دماغی علاقے کے لیے مخصوص مائیکرو واسکولیچر سے منسلک ہونے کے لیے ان کی ترجیح کو واضح کرنا ہے۔اس سے بی بی بی اور ریسیپٹرز کی نقل و حمل کے لیے نئے راستے تلاش کیے جا سکتے ہیں۔ہم توقع کرتے ہیں کہ شناخت شدہ پیپٹائڈس براہ راست سیریرووسکولر ریسیپٹرز یا BBB یا BCSFB کے ذریعے منتقل ہونے والے گردش کرنے والے لیگنڈس سے منسلک ہوسکتے ہیں۔اس کام میں دریافت ہونے والے CSF ٹرانسپورٹ کی سرگرمی کے ساتھ پیپٹائڈ ویکٹرز کی مزید تفتیش کی جائے گی۔ہم فی الحال BBB اور/یا BCSFB کو عبور کرنے کی صلاحیت کے لئے ان پیپٹائڈس کی دماغی خصوصیات کی تحقیقات کر رہے ہیں۔یہ نئے پیپٹائڈز نئے ریسیپٹرز یا راستوں کی ممکنہ دریافت اور دماغ تک میکرو مالیکیولز جیسے حیاتیات کی ترسیل کے لیے نئے انتہائی موثر پلیٹ فارمز کی ترقی کے لیے انتہائی قیمتی ٹولز ہوں گے۔
پہلے بیان کردہ طریقہ میں ترمیم کا استعمال کرتے ہوئے بڑے سیسٹرنا (سی ایم) کو کینولیٹ کریں۔اینستھیٹائزڈ وسٹار چوہوں (200-350 گرام) کو ایک سٹیریوٹیکسک اپریٹس پر نصب کیا گیا تھا اور کھوپڑی کو بے نقاب کرنے کے لئے منڈوا اور غیر محفوظ طریقے سے تیار شدہ کھوپڑی کے اوپر ایک درمیانی چیرا بنایا گیا تھا۔اوپری سیش کے علاقے میں دو سوراخ ڈرل کریں اور سوراخوں میں فکسنگ سکرو باندھ دیں۔سی ایم میں سٹینلیس سٹیل کینولا کی سٹیریوٹیکٹک رہنمائی کے لیے لیٹرل occipital crest میں ایک اضافی سوراخ کیا گیا تھا۔کینول کے ارد گرد دانتوں کا سیمنٹ لگائیں اور پیچ سے محفوظ کریں۔فوٹو کیورنگ اور سیمنٹ سخت ہونے کے بعد، جلد کے زخم کو 4/0 سپرمڈ سیون سے بند کر دیا گیا تھا۔کینول کی مناسب جگہ کی تصدیق دماغی اسپائنل فلوئڈ (CSF) کے بے ساختہ رساو سے ہوتی ہے۔سٹیریوٹیکسک اپریٹس سے چوہے کو ہٹائیں، مناسب علاج کے بعد کی دیکھ بھال اور درد کا انتظام حاصل کریں، اور اسے کم از کم ایک ہفتے تک صحت یاب ہونے دیں جب تک کہ دماغی اسپائنل سیال میں خون کے آثار نظر نہ آئیں۔ویسٹار چوہے (Crl:WI/Han) دریائے چارلس (فرانس) سے حاصل کیے گئے تھے۔تمام چوہوں کو مخصوص روگزن سے پاک حالات میں رکھا گیا تھا۔تمام جانوروں کے تجربات کو سوئٹزرلینڈ کے شہر باسل کے ویٹرنری آفس سے منظور کیا گیا تھا، اور جانوروں کے لائسنس نمبر 2474 کے مطابق انجام دیا گیا تھا (دماغی اسپائنل فلوئڈ اور چوہے کے دماغ میں علاج کے امیدواروں کی سطح کی پیمائش کے ذریعے فعال دماغی نقل و حمل کا اندازہ)۔
ہاتھ میں سی ایم کینولا کے ساتھ چوہے کو آہستہ سے ہوش میں رکھیں۔داتورا کو کینولا سے ہٹائیں اور 10 µl بے ساختہ بہتے ہوئے دماغی اسپائنل سیال کو جمع کریں۔چونکہ کینولا کی پیٹنسی بالآخر سمجھوتہ کی گئی تھی، اس مطالعے میں صرف واضح دماغی اسپائنل سیال کے نمونے شامل کیے گئے تھے جن میں خون کی آلودگی یا رنگت کا کوئی ثبوت نہیں تھا۔متوازی طور پر، تقریباً 10-20 μl خون کو دم کی نوک پر چھوٹے چیرا سے ہیپرین (سگما-الڈرچ) والی ٹیوبوں میں لیا گیا۔CSF اور خون T7 فیج کے انٹراوینس انجیکشن کے بعد مختلف ٹائم پوائنٹس پر جمع کیا گیا۔ہر CSF نمونے کو جمع کرنے سے پہلے تقریبا 5–10 μl سیال کو ضائع کر دیا گیا تھا، جو کیتھیٹر کے مردہ حجم کے مساوی ہے۔
لائبریریاں T7Select 10-3b ویکٹر کا استعمال کرتے ہوئے تیار کی گئیں جیسا کہ T7Select سسٹم مینوئل میں بیان کیا گیا ہے (Novagen, Rosenberg et al., Innovations 6, 1-6, 1996)۔مختصراً، ایک بے ترتیب 12-میر ڈی این اے داخل کو درج ذیل شکل میں ترکیب کیا گیا تھا۔
NNK کوڈن داخل کرنے میں ڈبل اسٹاپ کوڈنز اور امینو ایسڈ اوور ایکسپریشن سے بچنے کے لیے استعمال کیا گیا تھا۔N ہر نیوکلیوٹائڈ کا دستی طور پر ملا ہوا مساوی تناسب ہے، اور K ایڈنائن اور سائٹوسین نیوکلیوٹائڈس کا دستی طور پر ملا ہوا مساوی تناسب ہے۔سنگل پھنسے ہوئے علاقوں کو 37 ڈگری سینٹی گریڈ پر 3 گھنٹے کے لیے dNTP (Novagen) اور Klenow enzyme (New England Biolabs) کے ساتھ مزید انکیوبیشن کے ذریعے ڈبل پھنسے ہوئے DNA میں تبدیل کیا گیا۔رد عمل کے بعد، EtOH بارش کے ذریعہ ڈبل پھنسے ہوئے ڈی این اے کو برآمد کیا گیا۔نتیجے میں ڈی این اے کو پابندی والے خامروں EcoRI اور HindIII (دونوں روچے سے) کے ساتھ ہضم کیا گیا۔کلیویڈ اور پیوریفائیڈ (QIAquick، Qiagen) insert (T4 ligase، New England Biolabs) کو پھر 10B کیپسڈ جین کے امینو ایسڈ 348 کے بعد پری کلیویڈ T7 ویکٹر میں فریم میں باندھ دیا گیا۔وٹرو پیکیجنگ سے پہلے 18 گھنٹے کے لئے ligation کے رد عمل کو 16 ° C پر انکیوبیٹ کیا گیا تھا۔وٹرو میں فیز پیکیجنگ T7Select 10-3b کلوننگ کٹ (Novagen) کے ساتھ فراہم کردہ ہدایات کے مطابق کی گئی تھی اور Escherichia coli (BLT5615، Novagen) کا استعمال کرتے ہوئے پیکیجنگ سلوشن کو ایک بار lysis کے لیے بڑھا دیا گیا تھا۔لائسیٹس کو گلیسرول کے اسٹاک حل کے طور پر -80 ° C پر سینٹرفیوجڈ، ٹائٹریٹڈ اور منجمد کیا گیا تھا۔
پروپرائیٹری 454/Roche-amplicon فیوژن پرائمر کا استعمال کرتے ہوئے شوربے یا پلیٹ میں پھیلا ہوا فیز متغیر علاقوں کا براہ راست PCR ایمپلیفیکیشن۔فارورڈ فیوژن پرائمر میں متغیر خطے (NNK) 12 (ٹیمپلیٹ کے ساتھ مخصوص)، GS FLX ٹائٹینیم اڈاپٹر A، اور فور بیس لائبریری کلیدی ترتیب (TCAG) (ضمنی شکل 1a):
ریورس فیوژن پرائمر میں کیپچر بیڈز سے منسلک بایوٹین اور ایملشن پی سی آر کے دوران کلونل ایمپلیفیکیشن کے لیے ضروری GS FLX ٹائٹینیم اڈاپٹر B بھی ہوتا ہے:
اس کے بعد 454 GS-FLX ٹائٹینیم پروٹوکول کے مطابق amplicons کو 454/Roche pyrosequencing کا نشانہ بنایا گیا۔دستی سینجر کی ترتیب کے لیے (Applied Biosystems Hitachi 3730 xl DNA Analyzer)، T7 فیج DNA کو PCR کے ذریعے بڑھایا گیا اور درج ذیل پرائمر جوڑوں کے ساتھ ترتیب دیا گیا:
روشے فاسٹ سٹارٹ ڈی این اے پولیمریز کٹ (مینوفیکچرر کی ہدایات کے مطابق) کا استعمال کرتے ہوئے انفرادی تختیوں کے داخلوں کو پی سی آر ایمپلیفیکیشن کا نشانہ بنایا گیا۔گرم آغاز (95 ° C پر 10 منٹ) اور 35 بوسٹ سائیکل (95 ° C پر 50 s، 50 ° C پر 1 منٹ، اور 72 ° C پر 1 منٹ) انجام دیں۔
لائبریریوں سے فیج، جنگلی قسم کے فیج، CSF اور خون سے بچائے گئے فیج، یا انفرادی کلون کو Escherichia coli BL5615 میں TB شوربے (Sigma Aldrich) میں یا 500 cm2 ڈشز (Thermo Scientific) میں 37 ° C پر 4 گھنٹے کے لیے بڑھا دیا گیا تھا۔پلیٹوں سے پلیٹوں کو Tris-EDTA بفر (Fluka Analytical) سے کلی کر کے یا جراثیم سے پاک پائپیٹ ٹپس کے ساتھ تختیوں کو جمع کر کے فیج نکالا گیا تھا۔فیج کو پولی تھیلین گلائکول (پی ای جی 8000) ورن (پرومیگا) کے ایک دور کے ساتھ کلچر سپرنٹنٹ یا نکالنے والے بفر سے الگ تھلگ کیا گیا تھا اور ٹریس-ای ڈی ٹی اے بفر میں دوبارہ معطل کیا گیا تھا۔
انٹرا وینس (IV) انجیکشن (500 μl/جانور) سے پہلے اینڈوٹوکسین ہٹانے والے موتیوں (ملٹینی بائیوٹیک) کا استعمال کرتے ہوئے ایمپلیفائیڈ فیج کو اینڈوٹوکسین ہٹانے کے 2-3 راؤنڈ کا نشانہ بنایا گیا۔پہلے راؤنڈ میں، 2×1012 فیجز متعارف کرائے گئے تھے۔دوسرے میں، 2×1010 فیز؛تیسرے اور چوتھے سلیکشن راؤنڈ میں، فی جانور 2×109 فیز۔CSF میں فیز کا مواد اور خون کے نمونے جو اشارہ شدہ وقت کے مقامات پر جمع کیے گئے تھے ان کا تعین کارخانہ دار کی ہدایات (T7 سلیکٹ سسٹم مینوئل) کے مطابق تختی کی گنتی کے ذریعے کیا گیا تھا۔فیز کا انتخاب پچھلے سلیکشن راؤنڈ سے سی ایس ایف سے نکالے گئے فیز کو دوبارہ صاف کرنے والی لائبریریوں کے انٹراوینس انجیکشن کے ذریعہ انجام دیا گیا تھا ، اور اس کے بعد کی کٹائی 10 منٹ ، 30 منٹ ، 60 منٹ ، 90 منٹ ، 120 منٹ ، 120 منٹ ، 180 منٹ ، اور 240 منٹ بالترتیب CSF اور خون کے نمونے پر کی گئی تھی۔ان ویوو پیننگ کے کل چار راؤنڈز کیے گئے جس میں دو منتخب برانچوں کو الگ الگ ذخیرہ کیا گیا اور انتخاب کے پہلے تین راؤنڈز کے دوران تجزیہ کیا گیا۔سلیکشن کے پہلے دو راؤنڈز سے CSF سے نکالے گئے تمام فیز انسرٹس کو 454/Roche pyrosequencing کا نشانہ بنایا گیا تھا، جبکہ سلیکشن کے آخری دو راؤنڈز سے CSF سے نکالے گئے تمام کلون دستی طور پر ترتیب دیئے گئے تھے۔انتخاب کے پہلے دور کے تمام خون کے مراحل کو بھی 454/Roche pyrosequencing کا نشانہ بنایا گیا۔فیز کلون کے انجیکشن کے لیے، منتخب فیجز کو E. coli (BL5615) میں 500 cm2 پلیٹوں پر 37°C پر 4 گھنٹے تک بڑھا دیا گیا۔ٹی بی میڈیم میں انفرادی طور پر منتخب اور دستی طور پر ترتیب دیئے گئے کلون کی تشہیر کی گئی۔فیز نکالنے کے بعد، اینڈوٹوکسین کو صاف کرنے اور ہٹانے کے بعد (جیسا کہ اوپر بیان کیا گیا ہے)، 300 μl میں 2×1010 فیز/جانوروں کو ایک دم کی رگ میں نس کے ذریعے انجکشن لگایا گیا تھا۔
ترتیب ڈیٹا کی پری پروسیسنگ اور کوالٹیٹو فلٹرنگ۔Raw 454/Roche ڈیٹا کو وینڈر سافٹ ویئر کا استعمال کرتے ہوئے بائنری معیاری اسٹریم میپ فارمیٹ (sff) سے Pearson ہیومن ریڈ ایبل فارمیٹ (fasta) میں تبدیل کیا گیا۔نیوکلیوٹائڈ ترتیب کی مزید پروسیسنگ ملکیتی سی پروگراموں اور اسکرپٹس (غیر جاری کردہ سافٹ ویئر پیکج) کا استعمال کرتے ہوئے کی گئی جیسا کہ ذیل میں بیان کیا گیا ہے۔بنیادی ڈیٹا کے تجزیے میں سخت ملٹی اسٹیج فلٹرنگ کے طریقہ کار شامل ہیں۔To filter out reads that did not contain a valid 12mer insert DNA sequence, the reads were sequentially aligned to start label (GTGATGTCGGGGATCCGAATTCT), stop label (TAAGCTTGCGGCCGCACTCGAGTA) and background insert (CCCTGCAGGGATATCCCGGGAGCTCGTCGAC) using the global Needleman-Wunsch test.الائنمنٹ فی سیدھ 31 تک 2 متضادات کی اجازت دیتا ہے۔لہذا، بغیر شروع اور سٹاپ ٹیگز کے پڑھنے اور بیک گراؤنڈ انسرٹس پر مشتمل ریڈز، یعنی الائنمنٹس جو مماثلت کی اجازت شدہ تعداد سے زیادہ ہیں، کو لائبریری سے ہٹا دیا گیا ہے۔جہاں تک بقیہ ریڈز کا تعلق ہے، N-mer DNA تسلسل شروع کے نشان سے پھیلا ہوا ہے اور سٹاپ مارک سے پہلے ختم ہونے سے پہلے پڑھنے کی اصل ترتیب سے نکالا گیا تھا اور مزید کارروائی کی گئی تھی (اس کے بعد اسے "داخل کریں" کہا جاتا ہے)۔داخل کے ترجمہ کے بعد، پرائمر کے 5′ سرے پر پہلے اسٹاپ کوڈن کے بعد کا حصہ داخل سے ہٹا دیا جاتا ہے۔اس کے علاوہ، پرائمر کے 3′ سرے پر نامکمل کوڈنز کا باعث بننے والے نیوکلیوٹائڈز کو بھی ہٹا دیا گیا۔صرف پس منظر کی ترتیب پر مشتمل داخلوں کو خارج کرنے کے لیے، امینو ایسڈ پیٹرن "PAG" سے شروع ہونے والے ترجمہ شدہ داخلوں کو بھی ہٹا دیا گیا تھا۔لائبریری سے 3 امینو ایسڈ سے کم ترجمے کے بعد کی لمبائی والے پیپٹائڈس کو ہٹا دیا گیا تھا۔آخر میں، داخل کرنے کے پول میں فالتو پن کو ہٹا دیں اور ہر منفرد داخل کی فریکوئنسی کا تعین کریں۔اس تجزیے کے نتائج میں نیوکلیوٹائڈ کی ترتیب (داخلے) اور ان کی (پڑھنے والی) تعدد (ضمنی اعداد و شمار 1c اور 2) کی فہرست شامل تھی۔
ترتیب کی مماثلت کے لحاظ سے گروپ N-mer DNA داخل کرتا ہے: 454/Roche-مخصوص ترتیب کی خرابیوں کو ختم کرنے کے لیے (جیسے کہ homopolymer ایکسٹینشن کو ترتیب دینے میں دشواری) اور کم اہم فالتو پن کو دور کرنے کے لیے، پہلے فلٹر کیے گئے N-mer DNA سیکوینس انسرٹس (انسرٹس) کو مماثلت کے مطابق ترتیب دیا گیا ہے۔ایک تکراری الگورتھم کا استعمال کرتے ہوئے اندراجات (2 تک غیر مماثل بنیادوں کی اجازت ہے) جس کی وضاحت اس طرح کی گئی ہے: داخلوں کو پہلے ان کی فریکوئنسی (اعلی سے کم سے کم) کے لحاظ سے ترتیب دیا جاتا ہے، اور اگر وہ ایک جیسے ہیں، تو ان کی ثانوی ترتیب کے لحاظ سے لمبائی (سب سے طویل سے مختصر))۔اس طرح، سب سے زیادہ بار بار اور طویل ترین اندراجات پہلے "گروپ" کی وضاحت کرتے ہیں۔گروپ فریکوئنسی کلیدی فریکوئنسی پر سیٹ ہے۔اس کے بعد، ترتیب شدہ فہرست میں باقی رہنے والے ہر اندراج کو جوڑے کی طرف سے Needleman-Wunsch الائنمنٹ کے ذریعے گروپ میں شامل کرنے کی کوشش کی گئی۔اگر کسی سیدھ میں مماثلت، اندراج، یا حذف کرنے کی تعداد 2 کی حد سے زیادہ نہیں ہے، تو گروپ میں ایک اندراج شامل کیا جاتا ہے، اور مجموعی طور پر گروپ فریکوئنسی میں اضافہ کیا جاتا ہے کہ اندراج کو کتنی بار شامل کیا گیا تھا۔کسی گروپ میں شامل کردہ داخلوں کو بطور استعمال شدہ نشان زد کیا جاتا ہے اور مزید کارروائی سے خارج کر دیا جاتا ہے۔اگر پہلے سے موجود گروپ میں داخل کی ترتیب کو شامل نہیں کیا جا سکتا ہے تو، داخل کرنے کی ترتیب کو مناسب داخل کرنے کی فریکوئنسی کے ساتھ ایک نیا گروپ بنانے کے لیے استعمال کیا جاتا ہے اور بطور استعمال نشان زد کیا جاتا ہے۔تکرار اس وقت ختم ہوتی ہے جب ہر اندراج کی ترتیب کو یا تو ایک نیا گروپ بنانے کے لیے استعمال کیا جاتا ہے یا پہلے سے موجود گروپ میں شامل کیا جا سکتا ہے۔سب کے بعد، نیوکلیوٹائڈز پر مشتمل گروپ شدہ داخلوں کو بالآخر پیپٹائڈ کی ترتیب (پیپٹائڈ لائبریریوں) میں ترجمہ کیا جاتا ہے۔اس تجزیے کا نتیجہ اندراجات کا ایک مجموعہ اور ان سے متعلقہ تعدد ہے جو لگاتار پڑھنے کی تعداد بناتا ہے (ضمیمہ تصویر 2)۔
موٹیف جنریشن: منفرد پیپٹائڈس کی فہرست کی بنیاد پر، ایک لائبریری بنائی گئی تھی جس میں تمام ممکنہ امینو ایسڈ پیٹرن (AA) شامل تھے جیسا کہ ذیل میں دکھایا گیا ہے۔لمبائی 3 کا ہر ممکنہ نمونہ پیپٹائڈ سے نکالا گیا تھا اور اس کا الٹا پیٹرن ایک عام شکل لائبریری کے ساتھ شامل کیا گیا تھا جس میں تمام پیٹرن (ٹرائپپٹائڈس) شامل تھے۔انتہائی دہرائے جانے والے محرکات کی لائبریریوں کو ترتیب دیا گیا اور فالتو پن کو ہٹا دیا گیا۔پھر، موٹف لائبریری میں ہر ٹریپپٹائڈ کے لیے، ہم نے کمپیوٹیشنل ٹولز کا استعمال کرتے ہوئے لائبریری میں اس کی موجودگی کی جانچ کی۔اس صورت میں، پائے جانے والے موٹف ٹریپپٹائڈ پر مشتمل پیپٹائڈ کی فریکوئنسی کو موٹف لائبریری میں موٹف کے لیے شامل کیا جاتا ہے اور تفویض کیا جاتا ہے ("موٹیفز کی تعداد")۔موٹیف جنریشن کا نتیجہ ایک دو جہتی سرنی ہے جس میں ٹریپپٹائڈس (موٹیفز) کے تمام واقعات اور ان کی متعلقہ اقدار شامل ہیں، جو کہ ترتیب وار پڑھنے کی تعداد ہے جس کے نتیجے میں متعلقہ شکل پیدا ہوتی ہے جب ریڈز کو فلٹر، گروپ اور ترجمہ کیا جاتا ہے۔میٹرکس جیسا کہ اوپر تفصیل سے بیان کیا گیا ہے۔
نقشوں کی تعداد اور متعلقہ بکھرے ہوئے حصوں کو معمول بنانا: ہر نمونے کے لئے نقشوں کی تعداد کو استعمال کرتے ہوئے معمول بنایا گیا تھا۔
جہاں ni موضوع i پر مشتمل پڑھنے کی تعداد ہے۔اس طرح، vi نمونے میں motif i پر مشتمل پڑھنے (یا پیپٹائڈس) کی فیصد تعدد کی نمائندگی کرتا ہے۔فشر کے عین مطابق ٹیسٹ کا استعمال کرتے ہوئے شکلوں کی غیر معمولی تعداد کے لئے P- اقدار کا حساب لگایا گیا تھا۔محرکات کی تعداد کے correlograms کے بارے میں، Spearman کے ارتباط کا حساب R کے ساتھ محرکات کی معمول کی تعداد کا استعمال کرتے ہوئے کیا گیا۔
پیپٹائڈ لائبریری میں ہر پوزیشن پر امینو ایسڈ کے مواد کو دیکھنے کے لیے، ویب لوگوگرام 32، 33 (http://weblogo.threeplusone.com) بنائے گئے تھے۔سب سے پہلے، 12-میر پیپٹائڈ کی ہر پوزیشن پر امینو ایسڈ کا مواد 20×12 میٹرکس میں محفوظ ہوتا ہے۔پھر، 1000 پیپٹائڈس کا ایک سیٹ جس میں ہر پوزیشن پر ایک ہی رشتہ دار امینو ایسڈ مواد ہوتا ہے فاسٹا سیکوینس فارمیٹ میں تیار کیا جاتا ہے اور ویب لوگو 3 کو ان پٹ کے طور پر فراہم کیا جاتا ہے، جو ہر پوزیشن پر رشتہ دار امینو ایسڈ مواد کی گرافیکل نمائندگی پیدا کرتا ہے۔دی گئی پیپٹائڈ لائبریری کے لیے۔کثیر جہتی ڈیٹاسیٹس کو دیکھنے کے لیے، حرارت کے نقشے R میں اندرونی طور پر تیار کردہ ٹول کا استعمال کرتے ہوئے بنائے گئے تھے (biosHeatmap، ابھی تک جاری ہونے والا R پیکیج)۔گرمی کے نقشوں میں پیش کردہ ڈینڈروگرامس کا حساب وارڈ کے درجہ بندی کے کلسٹرنگ کے طریقہ کار سے یوکلیڈین فاصلہ میٹرک کے ساتھ کیا گیا تھا۔موٹف اسکورنگ ڈیٹا کے شماریاتی تجزیہ کے لیے، فشر کے عین مطابق ٹیسٹ کا استعمال کرتے ہوئے غیر معمولی اسکورنگ کے لیے P اقدار کا حساب لگایا گیا۔دیگر ڈیٹاسیٹس کے لیے P- ویلیوز کا حساب R میں طالب علم کے ٹی ٹیسٹ یا ANOVA کا استعمال کرتے ہوئے کیا گیا۔
داخل کیے بغیر منتخب فیز کلون اور فیز کو دم کی رگ (2×1010 فیز/جانور 300 μl PBS میں) کے ذریعے نس کے ذریعے انجکشن لگایا گیا تھا۔پرفیوژن اور بعد میں طے کرنے سے دس منٹ پہلے، انہی جانوروں کو 100 μl DyLight594 لیبل والے لیکٹین (ویکٹر لیبارٹریز انکارپوریٹڈ، DL-1177) کے ساتھ نس کے ذریعے انجکشن لگایا گیا تھا۔فیج انجیکشن کے 60 منٹ بعد، چوہوں کو دل کے ذریعے 50 ملی لیٹر پی بی ایس کے ساتھ پرفیوز کیا گیا اور اس کے بعد 50 ملی لیٹر 4٪ پی ایف اے/پی بی ایس۔دماغ کے نمونے اضافی طور پر راتوں رات 4% PFA/PBS میں طے کیے گئے اور 30% سوکروز میں رات بھر 4°C پر بھگو دیے گئے۔نمونے او سی ٹی مکسچر میں فلیش منجمد ہیں۔منجمد نمونوں کا امیونو ہسٹو کیمیکل تجزیہ کمرے کے درجہ حرارت پر 1% BSA کے ساتھ بلاک شدہ 30 µm cryosections پر کیا گیا تھا اور T7 فیج (Novus NB 600-376A) کے خلاف پولی کلونل FITC- لیبل والی اینٹی باڈیز کے ساتھ 4 °C پر انکیوبیٹ کیا گیا تھا۔رات بھر انکیوبیٹ کریں۔آخر میں، حصوں کو پی بی ایس کے ساتھ 3 بار دھویا گیا اور کنفوکل لیزر مائکروسکوپ (لائیکا ٹی سی ایس ایس پی 5) سے جانچا گیا۔
98% کی کم از کم پاکیزگی کے ساتھ تمام پیپٹائڈس کو GenScript USA کے ذریعہ ترکیب کیا گیا تھا، بایوٹینیلیٹڈ اور لائو فلائزڈ۔بایوٹین این ٹرمینس پر ایک اضافی ٹرپل گلائسین اسپیسر کے ذریعے پابند ہے۔ماس اسپیکٹومیٹری کا استعمال کرتے ہوئے تمام پیپٹائڈس کو چیک کریں۔
Streptavidin (Sigma S0677) کو بایوٹینیلیٹڈ پیپٹائڈ، بایوٹینیلیٹڈ BACE1 انحیبیٹری پیپٹائڈ، یا بایوٹینیلیٹڈ BACE1 انحیبیٹری پیپٹائڈ اور BACE1 inhibitory peptide کے 5 گنا ایکومولر اضافی کے ساتھ ملایا گیا تھا۔انجیکشن سے پہلے کمرے کے درجہ حرارت پر 1 گھنٹہ۔دماغی گہا کے ساتھ چوہوں کی دم کی رگوں میں سے ایک میں 10 ملی گرام/کلوگرام کی خوراک پر اسٹریپٹاویڈن کنججٹیڈ پیپٹائڈس کو نس کے ذریعے داخل کیا گیا تھا۔
اسٹریپٹاویڈن پیپٹائڈ کمپلیکس کی حراستی کا اندازہ ELISA نے کیا۔Nunc Maxisorp microtiter پلیٹس (Sigma) کو راتوں رات 4°C پر 1.5 μg/ml ماؤس اینٹی اسٹریپٹاویڈن اینٹی باڈی (تھرمو، MA1-20011) کے ساتھ لیپت کیا گیا۔بلاک کرنے کے بعد (بلاکنگ بفر: 140 nM NaCL, 5 mM EDTA, 0.05% NP40, 0.25% جلیٹن, 1% BSA) کمرے کے درجہ حرارت پر 2 گھنٹے تک، پلیٹ کو 0.05% Tween-20/PBS (واش بفر) کے ساتھ دھوئیں اور 3s کے لیے buffer سیمپل کے ساتھ buffer کے ساتھ اچھی طرح سے بلاک کیا گیا تھا۔ لسما 1:10,000، CSF 1:115)۔اس کے بعد پلیٹ کو راتوں رات 4°C پر پتہ لگانے والے اینٹی باڈی (1 μg/ml، anti-streptavidin-HRP، Novus NB120-7239) کے ساتھ سینک دیا گیا۔دھونے کے تین مراحل کے بعد، 20 منٹ تک TMB سبسٹریٹ سلوشن (Roche) میں انکیوبیشن کے ذریعے اسٹریپٹاویڈن کا پتہ چلا۔1M H2SO4 کے ساتھ رنگ کی نشوونما کو روکنے کے بعد، 450 nm پر جاذبیت کی پیمائش کریں۔
streptavidin-peptide-BACE1 inhibitor کمپلیکس کے فنکشن کا اندازہ Aβ(1-40) ELISA نے مینوفیکچرر کے پروٹوکول (واکو، 294-64701) کے مطابق کیا تھا۔مختصراً، CSF کے نمونوں کو معیاری diluent (1:23) میں پتلا کیا گیا اور BNT77 کیپچر اینٹی باڈی کے ساتھ لیپت 96 کنویں پلیٹوں میں 4°C پر راتوں رات انکیوبیٹ کیا گیا۔دھونے کے پانچ مراحل کے بعد، HRP-conjugated BA27 اینٹی باڈی کو شامل کیا گیا اور 4° C. پر 2 گھنٹے تک انکیوبیٹ کیا گیا، اس کے بعد دھونے کے پانچ مراحل۔Aβ(1–40) کا پتہ TMB محلول میں کمرے کے درجہ حرارت پر 30 منٹ تک انکیوبیشن کے ذریعے ہوا۔اسٹاپ سلوشن کے ساتھ رنگ کی نشوونما کو روکنے کے بعد، 450 این ایم پر جاذبیت کی پیمائش کریں۔Aβ(1–40) ELISA سے پہلے پلازما کے نمونے ٹھوس مرحلے کے نکالنے کا نشانہ بنائے گئے تھے۔پلازما کو 96 کنویں پلیٹوں میں 0.2٪ DEA (سگما) میں شامل کیا گیا اور کمرے کے درجہ حرارت پر 30 منٹ تک انکیوبیٹ کیا گیا۔SPE پلیٹوں (Oasis, 186000679) کو پانی اور 100% میتھانول سے یکے بعد دیگرے دھونے کے بعد، SPE پلیٹوں میں پلازما کے نمونے شامل کیے گئے اور تمام مائع نکال دیا گیا۔نمونے دھوئے گئے (پہلے 5% میتھانول کے ساتھ پھر 30% میتھانول) اور 2% NH4OH/90% میتھانول کے ساتھ ایلوٹ کیے گئے۔مسلسل N2 کرنٹ پر 99 منٹ کے لیے ایلیویٹ کو 55 ° C پر خشک کرنے کے بعد، نمونے معیاری diluents میں کم کیے گئے اور Aβ(1–40) کی پیمائش کی گئی جیسا کہ اوپر بیان کیا گیا ہے۔
اس مضمون کا حوالہ کیسے دیا جائے: Urich, E. et al.Vivo میں شناخت شدہ ٹرانزٹ پیپٹائڈس کا استعمال کرتے ہوئے دماغ تک کارگو کی ترسیل۔سائنس.5، 14104;doi:10.1038/srep14104 (2015)۔
Likhota J., Skjorringe T., Thomsen LB اور Moos T. ٹارگٹڈ تھراپی کا استعمال کرتے ہوئے دماغ میں میکرو مالیکولر ادویات کی ترسیل۔جرنل آف نیورو کیمسٹری 113, 1–13, 10.1111/j.1471-4159.2009.06544.x (2010)۔
Brasnjevic, I., Steinbusch, HW, Schmitz, C., اور Martinez-Martinez, P. خون دماغی رکاوٹ کے پار پیپٹائڈ اور پروٹین ادویات کی فراہمی۔Prog Neurobiol 87, 212–251, 10.1016/j.pneurobio.2008.12.002 (2009)۔
پرڈریج، ڈبلیو ایم خون دماغی رکاوٹ: دماغی منشیات کی نشوونما میں رکاوٹ۔NeuroRx 2, 3–14, 10.1602/neurorx.2.1.3 (2005)۔
Johanson, KE, Duncan, JA, Stopa, EG, and Byrd, A. بہتر منشیات کی ترسیل اور کورائیڈ پلیکسس-CSF پاتھ وے کے ذریعے دماغ کو نشانہ بنانے کے امکانات۔فارماسیوٹیکل ریسرچ 22, 1011–1037, 10.1007/s11095-005-6039-0 (2005)۔
پرڈریج، دماغ کی ترسیل کے لیے مالیکیولر ٹروجن ہارسز کے ساتھ بائیو فارماسیوٹیکلز کی ڈبلیو ایم ماڈرنائزیشن۔Bioconjug Chem 19, 1327–1338, 10.1021/bc800148t (2008)۔
پرڈریج، ڈبلیو ایم ریسیپٹر ثالثی پیپٹائڈ کو خون دماغی رکاوٹ کے پار منتقل کرتا ہے۔Endocr Rev. 7, 314–330 (1986)۔
Niewoehner، J. et al.monovalent مالیکیولر شٹل کا استعمال کرتے ہوئے دماغی دخول اور علاج کے اینٹی باڈیز کی افادیت میں اضافہ کریں۔نیوران 81, 49–60, 10.1016/j.neuron.2013.10.061 (2014)۔
Bien-Lee, N. et al.ٹرانسفرین ریسیپٹر (TfR) ٹرانسپورٹ TfR اینٹی باڈیز کے وابستگی کی مختلف حالتوں کے دماغ کے استعمال کا تعین کرتی ہے۔J Exp Med 211, 233–244, 10.1084/jem.20131660 (2014)۔