کچھ LC ٹربل شوٹنگ کے موضوعات کبھی پرانے نہیں ہوتے ہیں، کیونکہ LC پریکٹس میں مسائل ہوتے ہیں، حتیٰ کہ وقت کے ساتھ ساتھ آلات کی ٹیکنالوجی میں بہتری آتی ہے۔ ایسے بہت سے طریقے ہیں جن سے LC سسٹم میں مسائل پیدا ہو سکتے ہیں اور خراب چوٹی کی شکل میں ختم ہو سکتے ہیں۔ جب چوٹی کی شکل سے متعلق مسائل پیدا ہوتے ہیں، تو ان نتائج کی ممکنہ وجوہات کی ایک مختصر فہرست ہمارے ٹربل شوٹنگ کے تجربے کو آسان بنانے میں مدد کرتی ہے۔
یہ "ایل سی ٹربل شوٹنگ" کالم لکھنا اور ہر ماہ عنوانات کے بارے میں سوچنا مزہ آیا، کیونکہ کچھ موضوعات کبھی بھی انداز سے باہر نہیں ہوتے۔ جب کہ کرومیٹوگرافی کی تحقیق کے میدان میں کچھ عنوانات یا خیالات متروک ہو جاتے ہیں کیونکہ وہ نئے اور بہتر خیالات کے ذریعے تبدیل ہو جاتے ہیں، ٹربل شوٹنگ کے شعبے میں، جب سے یہ پہلا ٹربل شوٹنگ مضمون شائع ہوا ہے (ایل سی ٹربل شوٹنگ کے مضمون میں اب بھی کچھ مضامین موجود ہیں)۔ 1983 میں (1)۔ پچھلے کچھ سالوں میں، میں نے مائع کرومیٹوگرافی (LC) کو متاثر کرنے والے عصری رجحانات پر کئی LC ٹربل شوٹنگ سیکشنز پر توجہ مرکوز کی ہے (مثال کے طور پر، برقرار رکھنے پر دباؤ کے اثر کے بارے میں ہماری سمجھ کا نسبتاً موازنہ [2] نئی پیش رفت) LC کی ہماری تشریح اس مہینے میں ایل سی کے مسائل کے حل اور جدید طریقوں کے ساتھ کیسے نتائج حاصل کرتی ہے۔ میری سیریز (3) کو جاری رکھنا، جو دسمبر 2021 میں شروع ہوا، جس نے LC کی خرابیوں کا سراغ لگانے کے کچھ "زندگی اور موت" کے موضوعات پر توجہ مرکوز کی — ایسے عناصر جو کسی بھی ٹربل شوٹر کے لیے بہترین ہوتے ہیں، اس سے کوئی فرق نہیں پڑتا ہے کہ ہم جس نظام کا استعمال کر رہے ہیں، اس کی عمر کیوں نہ ہو۔ ، میں نے چوٹی کی شکل یا چوٹی کی خصوصیات سے متعلق مسائل پر توجہ مرکوز کرنے کا انتخاب کیا ہے۔ حیرت انگیز طور پر، دیوار چارٹ میں چوٹی کی خراب شکل کی 44 مختلف ممکنہ وجوہات کی فہرست دی گئی ہے! ہم ان تمام مسائل پر ایک مضمون میں تفصیل سے غور نہیں کر سکتے، اس لیے اس موضوع پر پہلی قسط میں، میں ان میں سے کچھ پر توجہ مرکوز کروں گا جنہیں میں اکثر دیکھتا ہوں۔
میں اپنے آپ کو "کچھ بھی ممکن ہے" کے ساتھ مسائل کا حل کرنے والے سوالات کا تیزی سے جواب دیتا ہوا محسوس کرتا ہوں۔ یہ جواب ان مشاہدات پر غور کرنے پر آسان معلوم ہو سکتا ہے جن کی تشریح کرنا مشکل ہے، لیکن مجھے یہ اکثر مناسب لگتا ہے۔ خراب چوٹی کی شکل کی بہت سی ممکنہ وجوہات کے ساتھ، مسئلہ کیا ہو سکتا ہے اس پر غور کرتے وقت کھلا ذہن رکھنا ضروری ہے، اور ممکنہ وجوہات کو ترجیح دینے کے قابل ہونا، ان مسائل کو حل کرنے کے لیے ہماری کوششیں بہت اہم ہیں۔ sible
کسی بھی ٹربل شوٹنگ کی مشق میں ایک اہم قدم — لیکن ایک جسے میرے خیال میں کم درجہ دیا گیا ہے — یہ تسلیم کرنا ہے کہ ایک مسئلہ ہے جسے حل کرنے کی ضرورت ہے۔ اکثر یہ تسلیم کرنے کا مطلب ہے کہ اس آلے کے ساتھ جو ہوتا ہے وہ ہماری توقعات سے مختلف ہوتا ہے، جو نظریہ، تجرباتی علم، اور تجربے سے تشکیل پاتا ہے (5)۔ "چوٹی کی شکل" کا حوالہ دیا گیا ہے، یہاں صرف peakmetric کی شکل کا حوالہ نہیں دیا گیا ہے۔ oth, fluffy, leading edge, tailing, etc.) بلکہ چوڑائی تک بھی۔ اصل چوٹی کی شکل کے لیے ہماری توقعات سادہ ہیں۔ تھیوری (6) نصابی کتاب کی اس توقع کی اچھی طرح تائید کرتی ہے کہ زیادہ تر معاملات میں، کرومیٹوگرافک چوٹیوں کو ہم آہنگ ہونا چاہیے اور گاؤسائی تقسیم کی شکل کے مطابق ہونا چاہیے، جیسا کہ ہم پیچیدگی کے معاملے میں زیادہ سے زیادہ ظاہر کیے گئے ہیں۔ ہم مستقبل کے مضمون میں اس موضوع پر بات کریں گے۔ شکل 1 میں دیگر چوٹی کی شکلیں کچھ دوسرے امکانات کو ظاہر کرتی ہیں جن کا مشاہدہ کیا جا سکتا ہے- دوسرے لفظوں میں، کچھ طریقے جن سے چیزیں غلط ہو سکتی ہیں۔
بعض اوقات کرومیٹوگرام میں چوٹیوں کا بالکل بھی مشاہدہ نہیں کیا جاتا ہے جہاں ان کے ختم ہونے کی توقع کی جاتی ہے۔ اوپر والا دیواری چارٹ اس بات کی نشاندہی کرتا ہے کہ چوٹی کی عدم موجودگی (یہ فرض کرتے ہوئے کہ نمونے میں اصل میں ٹارگٹ اینالائٹ موجود ہے جو اسے شور کے اوپر دیکھنے کے لیے ڈیٹیکٹر کے ردعمل کو کافی بناتا ہے) عام طور پر کسی آلے کے مسئلے سے متعلق ہوتا ہے یا (موبائل کے تمام حالات میں غلط مشاہدہ)۔چوٹیاں، عام طور پر بہت "کمزور")۔
جیسا کہ اوپر ذکر کیا گیا ہے، اس سوال پر توجہ دینے اور اسے ٹھیک کرنے کی کوشش کرنے سے پہلے چوٹی کی چوٹی کو کس حد تک برداشت کیا جانا چاہیے ایک پیچیدہ موضوع ہے جس پر میں آئندہ مضمون میں بات کروں گا۔ میرا تجربہ یہ ہے کہ چوٹی کی چوٹی کو وسیع کرنے میں اکثر چوٹی کی شکل میں نمایاں تبدیلی آتی ہے، اور چوٹی کی چوٹی چوٹی سے پہلے یا تقسیم سے زیادہ عام ہوتی ہے۔ وجوہات:
ان مسائل میں سے ہر ایک پر ٹربل شوٹنگ ایل سی کے پچھلے شماروں میں تفصیل سے بات کی گئی ہے، اور ان موضوعات میں دلچسپی رکھنے والے قارئین ان مسائل کی بنیادی وجوہات اور ممکنہ حل کے بارے میں معلومات کے لیے ان پچھلے مضامین کا حوالہ دے سکتے ہیں۔مزید تفصیلات.
چوٹی ٹیلنگ، چوٹی فرنٹنگ، اور تقسیم سبھی کیمیائی یا جسمانی مظاہر کی وجہ سے ہوسکتے ہیں، اور ان مسائل کے ممکنہ حل کی فہرست وسیع پیمانے پر مختلف ہوتی ہے، اس بات پر منحصر ہے کہ آیا ہم کسی کیمیائی یا جسمانی مسئلے سے نمٹ رہے ہیں۔ اکثر، کرومیٹوگرام میں مختلف چوٹیوں کا موازنہ کرکے، آپ اس بارے میں اہم اشارے تلاش کر سکتے ہیں کہ سب سے زیادہ ممکنہ طور پر سب سے زیادہ مماثلت کی وجہ سے پیکروگرام کی شکل ہے۔ جسمانی نہیں۔
چوٹی ٹیلنگ کی کیمیائی وجوہات یہاں پر مختصراً بحث کرنے کے لیے بہت پیچیدہ ہیں۔ دلچسپی رکھنے والے قارئین کو مزید گہرائی سے بحث کے لیے "LC ٹربل شوٹنگ" کے حالیہ شمارے کا حوالہ دیا گیا ہے (10)۔ تاہم، کوشش کرنے کے لیے ایک آسان چیز یہ ہے کہ انجکشن والے تجزیہ کار کے حجم کو کم کیا جائے اور یہ دیکھیں کہ چوٹی کی شکل بہتر ہوتی ہے یا نہیں۔ چھوٹے تجزیہ کاروں کو نکالنا، یا کرومیٹوگرافک حالات کو تبدیل کرنا ضروری ہے تاکہ بڑے پیمانے پر انجیکشن لگانے کے باوجود بھی اچھی چوٹی کی شکلیں حاصل کی جاسکیں۔
چوٹی ٹیلنگ کی بہت سی ممکنہ جسمانی وجوہات بھی ہیں۔ امکانات کی تفصیلی بحث میں دلچسپی رکھنے والے قارئین کو "LC ٹربل شوٹنگ" (11) کے ایک اور حالیہ شمارے کی طرف رجوع کیا جاتا ہے۔ چوٹی ٹیلنگ کی ایک عام فزیکل وجہ انجیکٹر اور ڈیٹیکٹر (12) کے درمیان ایک نقطہ پر ناقص کنکشن ہے۔ ایک نیا انجیکشن والو والا سسٹم جو ہم نے پہلے استعمال نہیں کیا تھا، اور ایک فیرول کے ساتھ ایک چھوٹے والیوم انجیکشن لوپ کو انسٹال کیا جسے ایک سٹینلیس سٹیل کیپلیری میں ڈھالا گیا تھا۔ کچھ ابتدائی خرابیوں کا سراغ لگانے کے تجربات کے بعد، ہم نے محسوس کیا کہ انجیکشن والو سٹیٹر میں پورٹ کی گہرائی اس سے کہیں زیادہ گہری تھی جس کے نتیجے میں ہم نے بڑی آسانی سے ڈیڈ والیوم کو حل کرنے کے لیے استعمال کیا تھا۔ ایک اور ٹیوب کے ساتھ انجیکشن لوپ، ہم بندرگاہ کے نچلے حصے میں مردہ حجم کو ختم کرنے کے لیے فیرول کو مناسب پوزیشن میں ایڈجسٹ کر سکتے ہیں۔
چوٹی کے محاذ جیسے شکل 1e میں دکھائے گئے ہیں جسمانی یا کیمیائی مسائل کی وجہ سے بھی ہو سکتے ہیں۔ معروف کنارے کی ایک عام فزیکل وجہ یہ ہے کہ کالم کا پارٹیکل بیڈ اچھی طرح سے بھرا ہوا نہیں ہے، یا یہ کہ ذرات وقت کے ساتھ ساتھ دوبارہ منظم ہو گئے ہیں۔ جیسا کہ اس جسمانی رجحان کی وجہ سے چوٹی کی چوٹی کی وجہ سے، اس کو ٹھیک کرنے کا بہترین طریقہ یہ ہے کہ کیمیکل کی شکل کو تبدیل کر کے چوٹی کو ٹھیک کیا جائے۔ اصل اکثر اس سے پیدا ہوتی ہے جسے ہم "نان لکیری" برقرار رکھنے کے حالات کہتے ہیں۔ مثالی (لکیری) حالات کے تحت، اسٹیشنری مرحلے (لہذا، برقرار رکھنے کا عنصر) کے ذریعہ برقرار رکھنے والے تجزیہ کی مقدار کا کالم میں تجزیہ کار کے ارتکاز سے خطی طور پر تعلق ہوتا ہے۔ یہ رشتہ اس وقت ٹوٹ جاتا ہے جب برقرار رکھنے کا رویہ غیر خطی ہوتا ہے، اور چوٹیاں نہ صرف لمبی ہوتی ہیں بلکہ چوڑی بھی ہوتی ہیں کیونکہ زیادہ بڑے پیمانے پر انجکشن ہوتا ہے۔ اس کے علاوہ، غیر لکیری شکلیں کرومیٹوگرافک چوٹیوں کی شکل کا تعین کرتی ہیں، جس کے نتیجے میں آگے یا پیچھے والے کنارے ہوتے ہیں۔ analyte mass.اگر چوٹی کی شکل بہتر ہوتی ہے، تو طریقہ کار میں ترمیم کی جانی چاہیے تاکہ انجکشن کے معیار سے زیادہ نہ ہو جو کہ معروف کنارے کا سبب بنتا ہے، یا اس رویے کو کم سے کم کرنے کے لیے کرومیٹوگرافک حالات کو تبدیل کیا جانا چاہیے۔
بعض اوقات ہم مشاہدہ کرتے ہیں کہ کیا "تقسیم" چوٹی دکھائی دیتی ہے، جیسا کہ شکل 1f میں دکھایا گیا ہے۔ اس مسئلے کو حل کرنے کا پہلا مرحلہ یہ طے کرنا ہے کہ آیا چوٹی کی شکل جزوی کو-ایلیوشن کی وجہ سے ہے (یعنی، دو الگ الگ لیکن قریب سے ایلوٹ کرنے والے مرکبات کی موجودگی)۔ اگر حقیقت میں دو مختلف تجزیہ کار ایک دوسرے کے قریب ہو رہے ہیں، تو یہ ان کی مثال کے طور پر، پی پی، ریزولیوشن اور ریزولیوشن میں اضافہ کا معاملہ ہے۔ "تقسیم" چوٹیاں جسمانی کارکردگی سے متعلق نہیں ہیں، کالم سے ہی کوئی تعلق نہیں ہے۔ اکثر، اس فیصلے کا سب سے اہم اشارہ یہ ہوتا ہے کہ کرومیٹوگرام کی تمام چوٹیاں تقسیم کی شکلوں کی نمائش کرتی ہیں، یا صرف ایک یا دو۔اگر تمام چوٹیوں کو تقسیم کر دیا جاتا ہے، تو یہ ممکنہ طور پر ایک جسمانی مسئلہ ہے، زیادہ تر ممکنہ طور پر کالم ہی سے متعلق ہے۔
خود کالم کی جسمانی خصوصیات سے متعلق سپلٹ چوٹیاں عام طور پر جزوی طور پر بلاک شدہ ان لیٹ یا آؤٹ لیٹ فرٹس، یا کالم میں ذرات کی تنظیم نو کی وجہ سے ہوتی ہیں، جس سے کالم چینل کی تشکیل کے بعض علاقوں میں موبائل فیز کو موبائل فیز سے زیادہ تیزی سے بہنے دیتا ہے۔تاہم، میرے تجربے میں، یہ عام طور پر طویل المدتی حل کے بجائے مختصر مدت کا ہوتا ہے۔ جدید کالموں کے ساتھ یہ اکثر مہلک ہوتا ہے اگر کالم کے اندر ذرات دوبارہ اکٹھے ہوجائیں۔ اس مقام پر، کالم کو تبدیل کرنا اور جاری رکھنا بہتر ہے۔
تصویر 1 جی میں چوٹی، میری اپنی لیب میں بھی ایک حالیہ مثال سے، عام طور پر اشارہ کرتا ہے کہ سگنل اتنا زیادہ ہے کہ یہ رسپانس رینج کے اونچے سرے پر پہنچ گیا ہے۔ آپٹیکل جاذب کا پتہ لگانے والے (اس معاملے میں UV-vis) کے لیے، جب تجزیہ کرنے والے کا ارتکاز بہت زیادہ ہوتا ہے، تو تجزیہ کار زیادہ تر جذب کرتا ہے، ان میں سے زیادہ تر روشنی کے بہاؤ کا پتہ لگانے والے الیکٹرک سیل سے گزرنے والی روشنی کو بہت کم چھوڑ دیتا ہے۔ فوٹو ڈیٹیکٹر کا ال سگنل شور کے مختلف ذرائع سے بہت زیادہ متاثر ہوتا ہے، جیسے آوارہ روشنی اور "تاریک کرنٹ"، جس سے سگنل بہت "مبہم" ہوتا ہے اور تجزیہ کرنے والے ارتکاز سے آزاد ہوتا ہے۔جب ایسا ہوتا ہے تو، تجزیہ کار کے انجیکشن والیوم کو کم کر کے - انجیکشن والیوم کو کم کر کے، نمونے کو کم کر کے، یا دونوں سے مسئلہ کو آسانی سے حل کیا جا سکتا ہے۔
کرومیٹوگرافی اسکول میں، ہم نمونے میں تجزیہ کار ارتکاز کے اشارے کے طور پر ڈیٹیکٹر سگنل (یعنی کرومیٹوگرام میں y-axis) کا استعمال کرتے ہیں۔ لہٰذا صفر سے نیچے سگنل کے ساتھ کرومیٹوگرام دیکھنا عجیب لگتا ہے، جیسا کہ سادہ تشریح یہ ہے کہ یہ اس بات کی نشاندہی کرتا ہے کہ اکثر منفی تجزیہ نگاری کا مشاہدہ کیا جاتا ہے، جب میرا مشاہدہ ہوتا ہے کہ اکثر منفی تجزیہ کار کا تجربہ نہیں ہوتا ہے۔ آپٹیکل جاذب کا پتہ لگانے والے (مثال کے طور پر، UV-vis)۔
اس صورت میں، ایک منفی چوٹی کا سیدھا مطلب یہ ہے کہ کالم سے نکلنے والے مالیکیولز چوٹی سے پہلے اور بعد میں موبائل فیز سے کم روشنی جذب کرتے ہیں۔ یہ ہوسکتا ہے، مثال کے طور پر، نسبتاً کم ڈٹیکشن ویو لینتھ (<230 nm) اور موبائل فیز ایڈیٹوز جو ان طول موج پر زیادہ تر روشنی جذب کرتے ہیں استعمال کرتے وقت۔ ایسیٹیٹ یا فارمیٹ۔ کوئی بھی انشانکن وکر کو تیار کرنے اور درست مقداری معلومات حاصل کرنے کے لیے درحقیقت منفی چوٹیوں کا استعمال کر سکتا ہے، اس لیے ان سے بچنے کی کوئی بنیادی وجہ نہیں ہے (اس طریقہ کو بعض اوقات "بالواسطہ UV کا پتہ لگانے" کہا جاتا ہے) (13) تاہم، اگر ہم واقعی منفی چوٹیوں سے مکمل طور پر بچنا چاہتے ہیں، تو اس صورت میں لہر کا پتہ لگانے کے لیے بہترین حل استعمال کیا جا سکتا ہے۔ اینالائٹ موبائل فیز سے زیادہ جذب کرتا ہے، یا موبائل فیز کی کمپوزیشن کو تبدیل کرتا ہے تاکہ وہ تجزیہ کاروں سے کم روشنی جذب کریں۔
منفی چوٹیاں ریفریکٹیو انڈیکس (RI) کا پتہ لگانے کا استعمال کرتے وقت بھی ظاہر ہو سکتی ہیں جب نمونے میں تجزیہ کار کے علاوہ دیگر اجزاء کا ریفریکٹیو انڈیکس، جیسے سالوینٹ میٹرکس، موبائل فیز کے ریفریکٹیو انڈیکس سے مختلف ہوتا ہے۔ یہ UV-vis ڈیٹیکشن کے ساتھ بھی ہوتا ہے، لیکن یہ اثر کم ہوتا ہے۔ سیمپل میٹرکس کا موبائل فیز کے مقابلے۔
LC ٹربل شوٹنگ کے بنیادی موضوع پر حصہ تین میں، میں نے ان حالات پر تبادلہ خیال کیا جن میں مشاہدہ شدہ چوٹی کی شکل متوقع یا عام چوٹی کی شکل سے مختلف ہوتی ہے۔ اس طرح کے مسائل کا مؤثر حل متوقع چوٹی کی شکلوں کے علم سے شروع ہوتا ہے (نظریہ یا موجودہ طریقوں کے ساتھ پہلے کے تجربے کی بنیاد پر)، لہذا ان توقعات سے انحراف واضح ہے۔ قسط میں، میں ان وجوہات میں سے کچھ پر تفصیل سے بات کرتا ہوں جو میں اکثر دیکھتا ہوں۔ ان تفصیلات کو جاننا ٹربل شوٹنگ شروع کرنے کے لیے ایک اچھی جگہ فراہم کرتا ہے، لیکن تمام امکانات کو حاصل نہیں کرتا۔ اسباب اور حل کی مزید گہرائی سے فہرست میں دلچسپی رکھنے والے قارئین LCGC "LC ٹربل شوٹنگ گائیڈ" وال چارٹ کا حوالہ دے سکتے ہیں۔
(4) LCGC "LC ٹربل شوٹنگ گائیڈ" وال چارٹ۔https://www.chromatographyonline.com/view/troubleshooting-wallchart (2021)۔
(6) اے فیلنگر، کرومیٹوگرافی میں ڈیٹا تجزیہ اور سگنل پروسیسنگ (ایلسیویئر، نیویارک، نیو یارک، 1998)، پی پی 43-96۔
(8) وہاب ایم ایف، داس گپتا پی کے، کڈجو اے ایف اور آرمسٹرانگ ڈی ڈبلیو، اینال.چم.جرنل.ریو.907، 31–44 (2016)۔https://doi.org/10.1016/j.aca.2015.11.043۔