Nature.com پر جانے کا شکریہ۔ آپ محدود سی ایس ایس سپورٹ کے ساتھ براؤزر کا ورژن استعمال کر رہے ہیں۔ بہترین تجربے کے لیے، ہم تجویز کرتے ہیں کہ آپ ایک اپ ڈیٹ شدہ براؤزر استعمال کریں (یا انٹرنیٹ ایکسپلورر میں مطابقت موڈ کو غیر فعال کریں)۔ اس کے علاوہ، جاری تعاون کو یقینی بنانے کے لیے، ہم سائٹ کو بغیر اسٹائل اور جاوا اسکرپٹ کے دکھاتے ہیں۔
ایک ساتھ تین سلائیڈوں کا ایک carousel دکھاتا ہے۔ ایک وقت میں تین سلائیڈوں سے گزرنے کے لیے پچھلے اور اگلے بٹنوں کا استعمال کریں، یا ایک وقت میں تین سلائیڈوں سے گزرنے کے لیے آخر میں سلائیڈر بٹن استعمال کریں۔
خود کو جمع کرنے والے نیورل آرگنیلز انسانی ترقی اور بیماری کی ماڈلنگ کے لیے وٹرو پلیٹ فارم کی نمائندگی کرتے ہیں۔ تاہم، organoids میں رابطے کی کمی ہے جو Vivo میں موجود ہے، جو کہ پختگی کو محدود کرتی ہے اور رویے کو کنٹرول کرنے والے دوسرے سرکٹس کے ساتھ انضمام کو روکتی ہے۔ یہاں ہم یہ ظاہر کرتے ہیں کہ نوزائیدہ عریاں چوہوں کے somatosensory cortex میں ٹرانسپلانٹ کیے گئے انسانی اسٹیم سیل سے ماخوذ کارٹیکل آرگنائڈز بالغ خلیوں کی اقسام تیار کرتے ہیں جو حسی اور محرک سے متعلق سرکٹس میں ضم ہوجاتے ہیں۔ ایم آر آئی نے کئی اسٹیم سیل لائنوں اور جانوروں میں پوسٹ ٹرانسپلانٹ آرگنائڈ کی نشوونما کا انکشاف کیا، جبکہ سنگل کور تجزیہ کارٹیکوجنیسیس کی ترقی اور سرگرمی پر منحصر ٹرانسکرپشن پروگرام کے ظہور کا انکشاف کرتا ہے۔ درحقیقت، ٹرانسپلانٹ شدہ کارٹیکل نیوران اپنے ان وٹرو ہم منصبوں کے مقابلے میں زیادہ پیچیدہ مورفولوجیکل، سینیپٹک اور اندرونی جھلی کی خصوصیات کی نمائش کرتے ہیں، جس سے ٹموتھیس سنڈروم کے مریضوں میں اعصابی نقائص کا پتہ لگانے کی اجازت ملتی ہے۔ جسمانی اور فنکشنل ٹریسنگ سے پتہ چلتا ہے کہ ٹرانسپلانٹڈ آرگنیلز تھیلاموکارٹیکل اور کورٹیکوکورٹیکل آدانوں کو حاصل کرتے ہیں، اور عصبی سرگرمیوں کی ویوو ریکارڈنگ میں بتایا گیا ہے کہ یہ ان پٹ انسانی خلیوں میں حسی ردعمل پیدا کر سکتے ہیں۔ آخر میں، کارٹیکل آرگنائڈز چوہے کے دماغ میں محوروں کو پھیلاتے ہیں، اور ان کی اوپٹوجنیٹک ایکٹیویشن انعام کے متلاشی رویے کا باعث بنتی ہے۔ اس طرح، ٹرانسپلانٹ شدہ انسانی کارٹیکس نیوران بالغ ہو جاتے ہیں اور میزبان کے سرکٹس میں حصہ لیتے ہیں جو رویے کو کنٹرول کرتے ہیں۔ ہم توقع کرتے ہیں کہ اس نقطہ نظر سے مریض سے ماخوذ خلیوں میں اسٹرینڈ لیول فینوٹائپس کا پتہ لگانے میں آسانی ہوگی جن کا پتہ دوسرے ذرائع سے نہیں لگایا جاسکتا۔
ترقی پذیر انسانی دماغ ایک قابل ذکر خود کو منظم کرنے والا عمل ہے جس میں خلیات پھیلتے ہیں، فرق کرتے ہیں، منتقل ہوتے ہیں اور فنکشنل نیورونل سرکٹس بنانے کے لیے جڑتے ہیں جو حسی تجربے کے ذریعے مزید بہتر ہوتے ہیں۔ انسانی دماغ کی نشوونما کو سمجھنے میں ایک اہم مسئلہ، خاص طور پر بیماری کے تناظر میں، دماغی بافتوں تک رسائی کی کمی ہے۔ خود کو منظم کرنے والے آرگنیلز، بشمول ہیومن کورٹیکس آرگنائڈز (hCO؛ جسے ہیومن کورٹیکس اسفیئر بھی کہا جاتا ہے)، 2,3,4,5,6 پیدا کر سکتے ہیں۔ تاہم، کئی حدود عصبی سرکٹس کی نشوونما اور کام کو سمجھنے کے لیے ان کے وسیع تر اطلاق کو محدود کرتی ہیں۔ خاص طور پر، یہ واضح نہیں ہے کہ آیا ایچ سی او کی پختگی Vivo میں موجود بعض مائیکرو ماحولیاتی اور حسی آدانوں کی عدم موجودگی سے محدود ہے۔ اس کے علاوہ، چونکہ ایچ سی اوز ایسے سرکٹس میں ضم نہیں ہوتے ہیں جو طرز عمل کے نتائج پیدا کر سکتے ہیں، اس لیے جینیاتی طور پر پیچیدہ اور رویے سے متعلق نیوروپسیچائٹرک عوارض کی ماڈلنگ میں ان کی افادیت فی الحال محدود ہے۔
ایک زندہ زندہ دماغ میں ایچ سی او کی پیوند کاری ان حدود کو دور کر سکتی ہے۔ پچھلے مطالعات سے پتہ چلتا ہے کہ چوہا پرانتستا میں ٹرانسپلانٹ کیے گئے انسانی نیوران چوہا خلیات 7,8,9,10,11,12 کے ساتھ زندہ رہنے، پروجیکٹ کرنے اور بات چیت کرنے کے قابل ہیں۔ تاہم، یہ تجربات عام طور پر بالغ جانوروں پر کیے جاتے ہیں، جو Synaptic اور axonal integration کو محدود کر سکتے ہیں۔ یہاں، ہم ایک ٹرانسپلانٹیشن پیراڈیم کی وضاحت کرتے ہیں جس میں ہم نے پلاسٹک کی نشوونما کے ابتدائی مرحلے میں hiPS خلیوں سے ماخوذ 3D hCO کو امیونوڈیفیسنٹ چوہوں کے پرائمری somatosensory cortex (S1) میں ٹرانسپلانٹ کیا۔ ٹرانسپلانٹڈ ایچ سی او (ٹی-ایچ سی او) نیوران کافی پختگی سے گزرتے ہیں، تھیلاموکارٹیکل اور کورٹیکل-کورٹیکل ان پٹس حاصل کرتے ہیں جو حسی ردعمل پیدا کرتے ہیں، اور انعام کے متلاشی رویے کو چلانے کے لیے چوہے کے دماغ میں محوری تخمینوں کو بڑھاتے ہیں۔ T-hCO کی توسیعی پختگی نے Timothy's Syndrome (TS) کے مریضوں میں اعصابی نقائص کا انکشاف کیا ہے، یہ ایک شدید جینیاتی عارضہ ہے جو وولٹیج سے حساس L-type CaV1.2 کیلشیم چینل (CACNA1C کے ذریعے انکوڈ شدہ) میں تغیرات کی وجہ سے ہوتا ہے۔
Vivo میں سرکٹس میں انسانی کارٹیکل نیوران کا مطالعہ کرنے کے لیے، ہم نے دقیانوسی طور پر 3D hCO کو ابتدائی بعد از پیدائش ایتھیمک چوہوں کے S1 میں ٹرانسپلانٹ کیا (تصویر 1a اور تصویر 1a-c کا توسیع شدہ ڈیٹا)۔ اس مقام پر، تھیلاموکارٹیکل اور کورٹیکوکورٹیکل محوری تخمینوں نے ابھی تک اپنی S1 انرویشن مکمل نہیں کی ہے (ریفری 13)۔ اس طرح، یہ نقطہ نظر t-hCO انضمام کو زیادہ سے زیادہ کرنے کے لیے ڈیزائن کیا گیا ہے جبکہ اینڈوجینس سرکٹس پر اثر کو کم سے کم کرتا ہے۔ زندہ جانوروں میں t-hCO کے محل وقوع کا تصور کرنے کے لیے، ہم نے پیوند کاری کے 2-3 ماہ بعد چوہوں کے T2 وزنی MRI دماغ کی تعمیر نو کی (تصویر 1b اور توسیعی ڈیٹا، تصویر 1d)۔ t-hCO کا آسانی سے مشاہدہ کیا گیا تھا اور t-hCO کے حجم کی پیمائش اسی طرح کی تھی جو مقررہ سلائسوں سے کی گئی تھی (توسیع شدہ ڈیٹا تصویر 1d,e؛ P > 0.05)۔ t-hCO کا آسانی سے مشاہدہ کیا گیا تھا اور t-hCO کے حجم کی پیمائش اسی طرح کی تھی جو مقررہ سلائسوں سے کی گئی تھی (توسیع شدہ ڈیٹا تصویر 1d,e؛ P > 0.05)۔ t-hCO легко наблюдались, а объемные измерения t-hCO были аналогичны рассчитанным для фиксированных срезов (расшированных срезов, e.d. P> 0,05)۔ t-hCO کا آسانی سے مشاہدہ کیا گیا، اور والیومیٹرک t-hCO پیمائشیں فکسڈ سیکشنز (توسیع شدہ ڈیٹا، تصویر 1d، e؛ P > 0.05) کے حساب سے ملتی جلتی تھیں۔很容易观察到t-hCO，并且t-hCO的体积测量值与从固定切片计算的测量值相似（扩展数据图1d、e；P > 0.05）۔很容易观察到t-hCO，并且t-hCO t-hCO легко наблюдался, а объемные измерения t-hCO были аналогичны рассчитанным для фиксированных срезов (расшированных срезов, e.d. P> 0,05)۔ t-hCO کا آسانی سے مشاہدہ کیا گیا، اور والیومیٹرک t-hCO پیمائشیں فکسڈ سیکشنز (توسیع شدہ ڈیٹا، تصویر 1d، e؛ P > 0.05) کے حساب سے ملتی جلتی تھیں۔ہم نے ٹرانسپلانٹیشن کے تقریباً 2 ماہ بعد ٹرانسپلانٹ شدہ جانوروں میں سے 81٪ میں t-hCO کا تعین کیا (n = 72 جانور؛ 10 hiPS سیل لائنوں سے hCO؛ ضمنی جدول 1 میں hiPS سیل لائنز)۔ ان میں سے 87% دماغی پرانتستا (تصویر 1c) میں واقع تھے۔ ایک ہی ٹرانسپلانٹ شدہ چوہے میں متعدد ٹائم پوائنٹس پر سیریل MRI اسکین کرنے سے، ہمیں 3 ماہ کے اندر t-hCO والیوم میں نو گنا اضافہ ہوا (تصویر 1d اور توسیع شدہ ڈیٹا، تصویر 1f)۔ ٹرانسپلانٹیشن کے بعد 12 مہینوں میں ٹرانسپلانٹ کیے گئے جانوروں میں زندہ رہنے کی شرح (74%) زیادہ تھی (توسیع شدہ ڈیٹا، تصویر 1 جی اور ضمنی جدول 2)، اور کوئی اوورٹ موٹر یا یاداشت کی خرابی، گلیوسس، یا الیکٹرو اینسفلاگرام (ای ای جی) نہیں پایا گیا۔ ڈیٹا تصویر 1 جی اور ضمنی جدول 2)۔ 1h–m اور 3e)۔
a، تجرباتی ڈیزائن کا اسکیمیٹک۔ hiPS خلیوں سے اخذ کردہ hCO تفریق کے 30-60 دنوں میں نوزائیدہ عریاں چوہوں کے S1 میں ٹرانسپلانٹ کیا گیا تھا۔ b، T2-ویٹڈ کورونل اور افقی ایم آر آئی تصاویر جو ٹرانسپلانٹیشن کے 2 ماہ بعد S1 میں t-hCO دکھا رہی ہیں۔ اسکیل بار، 2 ملی میٹر۔ c، ہر hiPS سیل لائن (n = 108، سلاخوں کے اندر کی تعداد t-hCO فی hIPS سیل لائن کی مقدار کو ظاہر کرتی ہے) اور cortical یا subcortical location (n = 88) کے لیے دکھائے گئے نقش کاری کی کامیابی کی شرح کی مقدار۔ d، کورونری شریان کی ایم آر آئی تصویر (بائیں؛ اسکیل بار، 3 ملی میٹر) اور متعلقہ 3D والیومیٹرک ری کنسٹرکشن (اسکیل بار، 3 ملی میٹر) جو 3 ماہ کے دوران t-hCO میں اضافہ دکھاتی ہے۔ ای، چوہا دماغی پرانتستا میں t-hCO پیٹرن کا جائزہ۔ اسکیل بار، 1 ملی میٹر۔ f، t-hCO کی نمائندہ امیونوسیٹو کیمیکل امیجز اوپر سے بائیں سے دائیں تک دکھائی گئی ہیں (تفرق کے دوران): PPP1R17 (4 ماہ پرانا)، NeuN (8 ماہ پرانا)، SOX9 اور GFAP (8 ماہ پرانا)، PDGFRα؛ (8 ماہ)، MAP2 (8 ماہ) اور IBA1 (8 ماہ)۔ اسکیل بار، 20 µm۔ HNA کا مشترکہ اظہار انسانی اصل کے خلیوں کی نشاندہی کرتا ہے۔ g، snRNA-seq: Seurat انضمام کے بعد تمام اعلیٰ معیار کے t-hCO نیوکلی کی یونیفائیڈ مینیفولڈ اور پروجیکشن (UMAP) ڈائمینشنلٹی ریڈکشن امیجنگ (n=3 t-hCO نمونے، n=2 hiPS سیل لائنز)۔ Astrocytes، astrocyte لائن کے خلیات؛ سائیکل پروگ، گردش کرنے والے پروجینٹرز؛ GluN DL، گہرے گلوٹومیٹرجک نیوران؛ GluN DL/SP، گہرے اور sublamellar glutamatergic نیوران؛ GluN UL، اوپری تہہ glutamatergic نیوران؛ oligodendrocytes، oligodendrocytes؛ OPC، oligodendrocyte progenitor خلیات؛ RELN، ریلین نیوران۔ h، HCO گلوٹامیٹرجک نیورونز کے مقابلے میں t-hCO گلوٹامیٹرجک نیورونز میں نمایاں طور پر اپ ریگولیٹڈ جینز کا جین اونٹولوجی (GO) اصطلاح افزودگی تجزیہ (ایڈجسٹڈ P <0.05، فولڈ چینج > 2، جس کا اظہار کم از کم 10% نیوکللی میں ہوتا ہے)۔ h، HCO گلوٹامیٹرجک نیورونز کے مقابلے میں t-hCO گلوٹامیٹرجک نیورونز میں نمایاں طور پر اپ ریگولیٹڈ جینز کا جین اونٹولوجی (GO) اصطلاح افزودگی تجزیہ (ایڈجسٹڈ P <0.05، فولڈ چینج > 2، جس کا اظہار کم از کم 10% نیوکللی میں ہوتا ہے)۔ h، Анализ обогащения терминов Gene Ontology (GO) по крайней мере в 10% ядер) в глутаматергических нейронах t-hCO по сравнению с глутаматергическими нейронами hCO. h، HCO گلوٹامیٹرجک نیورونز کے مقابلے میں t-hCO گلوٹامیٹرجک نیورونز میں اہم ایکٹیویشن (ایڈجسٹڈ P <0.05، فولڈ چینج>2، کم از کم 10% نیوکللی میں اظہار) والے جینز کے لیے جین آنٹولوجی (GO) اصطلاح افزودگی کا تجزیہ۔ h ，与hCO 谷氨酸能神经元相比，t-hCO 2، 在至少10% 的细胞核中表达）的基因本体论(GO) 术语富集分析۔ h ， 与 hco 谷氨酸 能 元 相比 ， t-hco 谷氨酸 能 神经 元 基因 显着 上调 （后 变 变 变 变 后变化> 2 ， 至少 10% 的 核中 表达） 基因 基因 基因 的 的 的 的 的 的 的 的 的 小少 的 核中 表达）术语富集分析. h، гены значительно активизировались (скорректированный P <0,05, кратность изменения> 2, экспрессируется по крайней %1меней) глутаматергических нейронах t-hCO по сравнению с глутаматергическими нейронами hCO Онтологический (GO) анализ тербоянах. h، افزودگی کی اصطلاح کے hCO گلوٹومیٹرجک نیوران اونٹولوجیکل (GO) تجزیہ کے مقابلے T-hCO گلوٹامیٹرجک نیورونز میں جینز کو نمایاں طور پر اپ ریگولیٹ کیا گیا تھا (ایڈجسٹڈ P <0.05، فولڈ چینج> 2، جس کا اظہار کم از کم 10 فیصد نیوکلی میں ہوا)۔نقطے والی لائن 0.05 کی aq قدر کی نشاندہی کرتی ہے۔ i، حوالہ 22 snRNA-seq بالغ موٹر کارٹیکس ڈیٹاسیٹ سے لیبل کی منتقلی کا استعمال کرتے ہوئے t-hCO میں GluN سیل اقسام کی UMAP امیجنگ۔ CT - corticothalamic خلیات، ET - extracerebral خلیات، IT - اندرونی telencephalic خلیات، NP - پروجیکشن کے قریب۔
اس کے بعد ہم نے cytoarchitecture اور t-hCO کی مجموعی سیلولر ساخت کا اندازہ کیا۔ چوہے کے اینڈوتھیلیل خلیوں کے اینٹی باڈی کے داغ نے t-hCO کے ساتھ ویسکولرائزیشن کا انکشاف کیا، جبکہ IBA1 کے داغ نے پورے گرافٹ میں چوہے کے مائکروگلیہ کی موجودگی کا انکشاف کیا (تصویر 1f اور توسیع شدہ ڈیٹا، تصویر 3c،d)۔ امیونوسٹیننگ نے انسانی نیوکلیئر اینٹیجن (HNA) مثبت خلیات کا انکشاف کیا جو PPP1R17 (cortical progenitors)، NeuN (neurons)، SOX9 اور GFAP (glial-derived خلیات) یا PDGFRα (oligodendrocyte progenitors) (شکل 1f) کا مشترکہ اظہار کرتے ہیں۔ سنگل سیل ریزولوشن پر t-hCO کی سیلولر کمپوزیشن کا مطالعہ کرنے کے لیے، ہم نے تقریباً 8 ماہ کے فرق کے بعد سنگل کور RNA سیکوینسنگ (snRNA-seq) انجام دیا۔ بلک فلٹریشن اور چوہے کے مرکزے کو ہٹانے سے 21,500 اعلیٰ معیار کے انسانی مونو نیوکلیئر نقشے ملے (تصویر 1 جی اور توسیع شدہ ڈیٹا، تصویر 4 اے، بی)۔ عام سیل قسم کے مارکروں کے اظہار کے نمونوں نے بڑے کارٹیکل سیل کلاسوں کے جھرمٹ کی نشاندہی کی، بشمول گہرے اور سطحی گلوٹامیٹرجک نیوران، گردش کرنے والے پروجینٹرز، اولیگوڈینڈروسائٹس، اور ایسٹروسائٹ نسب (تصویر 1 جی، توسیع شدہ ڈیٹا، تصویر 4 سی، اور ٹی سپلیمنٹ 3)۔ SATB2 اور CTIP2 کے لیے امیونوسٹیننگ نے ظاہر کیا کہ کارٹیکل ذیلی قسموں کی موجودگی کے باوجود، t-hCO نے واضح جسمانی استحکام نہیں دکھایا (توسیع شدہ ڈیٹا، تصویر 3a)۔ اسٹیج سے مماثل snRNA-seq hCO نے کچھ مستثنیات کے ساتھ وسیع پیمانے پر ملتے جلتے سیل کلاسز تیار کیے، بشمول oligodendrocytes کی غیر موجودگی اور GABAergic نیوران کی موجودگی، جو کہ لیٹرل پروجینیٹر سیلز کے لیے وٹرو حالات میں پہلے کی اطلاع کردہ سازگار کی عکاسی کر سکتی ہے 15 (توسیع شدہ ڈیٹا، تصویر 4 اور Tupple-i)۔ امتیازی جین کے اظہار کے تجزیے نے t-hCO اور hCO (ضمنی جدول 5) کے درمیان گلوٹامیٹرجک نیورونز میں نمایاں فرق کا انکشاف کیا، بشمول نیورونل میچوریشن سے وابستہ جینوں کے سیٹوں کو چالو کرنا جیسے Synaptic سگنلنگ، ڈینڈریٹک لوکلائزیشن، اور وولٹیج گیٹڈ چینل کی سرگرمی (Figure T-1h)۔ جدول 6)۔ اسی کے مطابق، کارٹیکل گلوٹامیٹرجک ٹی-ایچ سی او نیوران نے تیز نقلی پختگی کی نمائش کی۔
یہ واضح کرنے کے لیے کہ آیا t-hCO میں یہ نقلی تبدیلیاں وٹرو میں hCO اور vivo میں t-hCO کے درمیان مورفولوجیکل فرق سے متعلق تھیں، ہم نے 7-8 ماہ کی تفریق کے بعد ایکیوٹ حصوں میں اسٹیج سے مماثل بائیوسیٹن سے بھرے hCO اور hCO کو دوبارہ تشکیل دیا۔ hCO نیوران (تصویر 2a)۔ t-hCO نیوران نمایاں طور پر بڑے تھے، سوما قطر سے 1.5 گنا، ڈینڈرائٹس سے دوگنا، اور وٹرو hCO (تصویر 2b) کے مقابلے میں کل ڈینڈریٹک لمبائی میں مجموعی طور پر چھ گنا اضافہ تھا۔ اس کے علاوہ، ہم نے hCO نیوران (تصویر 2c) کے مقابلے t-hCO نیوران میں ڈینڈریٹک اسپائنز کی نمایاں طور پر زیادہ کثافت کا مشاہدہ کیا۔ اس سے پتہ چلتا ہے کہ t-hCO نیوران وسیع پیمانے پر ڈینڈریٹک لمبا اور برانچنگ سے گزرتے ہیں، جو سیل کے مسلسل پھیلاؤ کے ساتھ مل کر، ٹرانسپلانٹیشن کے بعد t-hCO کی شدید نشوونما میں حصہ ڈال سکتے ہیں (تصویر 1d اور توسیعی ڈیٹا تصویر 1f)۔ اس نے ہمیں الیکٹرو فزیولوجیکل خصوصیات کی چھان بین کرنے پر آمادہ کیا۔ جھلی کی گنجائش آٹھ گنا زیادہ تھی (توسیع شدہ ڈیٹا، تصویر 8d)، آرام کی حالت میں جھلی کی صلاحیت زیادہ ہائپر پولرائزڈ تھی (تقریباً 20 mV)، اور موجودہ انجیکشن نے hCO نیورونز کے مقابلے t-hCO نیوران میں زیادہ سے زیادہ جوش کی شرح پیدا کی۔ ان وٹرو (تصویر 2 ڈی)، ای)، جو t-hCO کی بڑی اور زیادہ پیچیدہ مورفولوجیکل خصوصیات کے مطابق ہے۔ اس کے علاوہ، T-hCO نیوران (تصویر 2f) میں اچانک حوصلہ افزا پوسٹ سینیپٹک کرنٹ ایونٹس (EPSC) کی فریکوئنسی نمایاں طور پر زیادہ تھی، جس سے پتہ چلتا ہے کہ t-hCO نیورونز میں دیکھے جانے والے ڈینڈریٹک ریڑھ کی ہڈی کی بڑھتی ہوئی کثافت فنکشنل اتیجیت سے وابستہ تھی۔ جنسی synapse. ہم نے وٹرو میں ایچ سی او نیوران کے ناپختہ کردار کی تصدیق لیبل لگے گلوٹامیٹرجک نیوران (توسیع شدہ ڈیٹا، تصویر 6a-c) کو ریکارڈ کرکے کی۔
a، 8 ماہ کی تفریق کے بعد بائیو سائیٹین سے بھرے hCO اور t-hCO نیوران کی 3D تعمیر نو۔ b، مورفولوجیکل خصوصیات کی مقدار (n = 8 hCO نیوران، n = 6 t-hCO نیوران؛ **P = 0.0084، *P = 0.0179 اور ***P <0.0001)۔ b، مورفولوجیکل خصوصیات کی مقدار (n = 8 hCO نیوران، n = 6 t-hCO نیوران؛ **P = 0.0084، *P = 0.0179 اور ***P <0.0001)۔ б, количественная оценка морфологических признаков (n = 8 нейронов hCO, n = 6 нейронов t-hCO; ** P = 0,0084, * P = 0,0179, * P = 0,0179, ***и <00179)۔ b، مورفولوجیکل خصوصیات کی مقدار کا تعین (n=8 hCO نیوران، n=6 t-hCO نیوران؛ **P=0.0084، *P=0.0179، اور ***P <0.0001)۔ b，形态学特征的量化（n = 8 个hCO 神经元，n = 6 个t-hCO 神经元；**P = 0.0084，*P = 0.0179 ，*P = 0.0179 和*0. b，形态学特征的量化（n = 8 个hCO 神经元，n = 6 个t-hCO 神经元；**P = 0.0084，*P = 0.0179 ，*P = 0.0179 和*0. б, количественная оценка морфологических признаков (n = 8 нейронов hCO, n = 6 нейронов t-hCO; ** P = 0,0084, * P = 0,0179, * P = 0,0179, ***и <00179)۔ b، مورفولوجیکل خصوصیات کی مقدار کا تعین (n=8 hCO نیوران، n=6 t-hCO نیوران؛ **P=0.0084، *P=0.0179، اور ***P <0.0001)۔c، 8 ماہ کے فرق کے بعد hCO اور t-hCO ڈینڈریٹک شاخوں کی 3D تعمیر نو۔ سرخ ستارے پوٹیٹیو ڈینڈریٹک ریڑھ کی ہڈی کی نشاندہی کرتے ہیں۔ ڈینڈرٹک ریڑھ کی کثافت کی مقدار (n = 8 hCO نیوران، n = 6 t-hCO نیوران؛ **P = 0.0092)۔ d، آرام کرنے والی جھلی کی صلاحیت کی مقدار (n = 25 hCO نیوران، n = 16 t-hCO نیوران؛ ***P <0.0001)۔ d، آرام کرنے والی جھلی کی صلاحیت کی مقدار (n = 25 hCO نیوران، n = 16 t-hCO نیوران؛ ***P <0.0001)۔ d, количественная оценка мембранного потенциала покоя (n = 25 нейронов hCO, n = 16 нейронов t-hCO; *** P <0,0001)۔ d، آرام کرنے والی جھلی کی ممکنہ مقدار (n = 25 hCO نیوران، n = 16 t-hCO نیوران؛ ***P <0.0001)۔ d，静息膜电位的量化（n = 25 hCO 神经元，n = 16 t-hCO 神经元；***P <0.0001）۔ d，静息膜电位的量化（n = 25 hCO 神经元，n = 16 t-hCO 神经元；***P <0.0001）۔ d, количественная оценка мембранного потенциала покоя (n = 25 нейронов hCO, n = 16 нейронов t-hCO; *** P <0,0001)۔ d، آرام کرنے والی جھلی کی ممکنہ مقدار (n = 25 hCO نیوران، n = 16 t-hCO نیوران؛ ***P <0.0001)۔ e، hCO اور t-hCO میں دہرائی جانے والی ایکشن ممکنہ فائرنگ، موجودہ انجیکشن میں اضافہ، اور زیادہ سے زیادہ فائرنگ کی شرح (n = 25 hCO نیوران، n = 16 t-hCO نیوران؛ ***P <0.0001) کی وجہ سے پیدا ہوتی ہے۔ e، hCO اور t-hCO میں دہرائی جانے والی ایکشن ممکنہ فائرنگ، موجودہ انجیکشن میں اضافہ، اور زیادہ سے زیادہ فائرنگ کی شرح (n = 25 hCO نیوران، n = 16 t-hCO نیوران؛ ***P <0.0001) کی وجہ سے پیدا ہوتی ہے۔ e، повторное возбуждение потенциала действия в hCO и t-hCO، вызванное увеличением тока، и количественная оценка максиала максиала действия возбуждения (n = 25 нейронов hCO, n = 16 нейронов t-hCO; *** P <0,0001)۔ e، hCO اور t-hCO میں ایکشن پوٹینشل ری-فائرنگ موجودہ اضافے اور زیادہ سے زیادہ فائرنگ کی شرح کی مقدار (n = 25 hCO نیوران، n = 16 t-hCO نیوران؛ *** P <0.0001) کی وجہ سے ہے۔ e，通过增加电流注入诱导的hCO 和t-hCO神经元，n = 16 个t-hCO 神经元；*P <0.0001）۔ E ， 通过 增加 电流 注入 的 的 hco 和 t-hco 重复 电位 放电 ， 以及 最 大 的 量 （ 电 5 ， n = 16 个 t-hco 神经 ； *** p <0.0001） . e، повторяющееся возбуждение потенциала действия hCO и t-hCO، вызванное увеличением подачи тока, и количественкайная количественкаиная скорости возбуждения (n = 25 нейронов hCO، n = 16 нейронов t-hCO؛ *** P <0,0001)۔ e، hCO اور t-hCO ایکشن پوٹینشلز کی بار بار فائرنگ موجودہ سپلائی میں اضافہ اور زیادہ سے زیادہ فائرنگ کی شرح (n = 25 hCO نیوران، n = 16 t-hCO نیوران؛ *** P <0.0001) کی وجہ سے پیدا ہوتی ہے۔ f، HCO اور t-hCO نیوران میں 8 ماہ کے فرق میں اچانک EPSCs (sEPSCs)، اور Synaptic واقعات کی تعدد کی مقدار (n = 25 hCO نیوران، n = 17 t-hCO نیوران؛ ***P <0.0001)۔ f، HCO اور t-hCO نیوران میں 8 ماہ کے فرق میں اچانک EPSCs (sEPSCs)، اور Synaptic واقعات کی تعدد کی مقدار (n = 25 hCO نیوران، n = 17 t-hCO نیوران؛ ***P <0.0001)۔ f، спонтанные EPSC (sEPSC) нейронов hCO, n = 17 нейронов t-hCO *** P <0,0001) ۔ f، HCO اور t-hCO نیوران میں Spontaneous EPSCs (sEPSCs) Synaptic ایونٹ کی شرحوں کی تفریق اور مقدار کے 8 ماہ میں (n=25 hCO نیوران، n=17 t-hCO نیوران؛ ***P <0.0001)۔ f，分化8 个月时hCO 和t-hCO 神经元中的自发性EPSCs (sEPSCs)，以及突触事件频率的量化（烞件频率的量化（n 17 t-hCO 神经元；**P <0.0001） . f，分化8 个月时hCO 和t-hCO 神经元中的自发性EPSCs (sEPSCs)，以及突触事件频率的量匼（n神率的量匼（n = 25 hCO 神率的量匼（n = 25hCO P <0.0001） ۔ f، спонтанные EPSC (sEPSC) нейронов hCO, n = 17 нейронов t-hCO *** P <0,0001)۔ f، HCO اور t-hCO نیوران میں Spontaneous EPSCs (sEPSCs) Synaptic ایونٹ کی شرحوں کی تفریق اور مقدار کے 8 ماہ میں (n = 25 hCO نیوران، n = 17 t-hCO نیوران؛ *** P <0.0001)۔bf کے لیے، لائن 1208-2 میں hCO اور t-hCO کو متوازی طور پر برقرار رکھنے والے اسی تفریق بیچ سے لیا گیا تھا۔ g، t-hCO گلوٹامیٹرجک نیورونز میں hCO گلوٹامیٹرجک نیورونز میں نمایاں طور پر اپ ریگولیٹڈ جینز کا جین سیٹ افزودگی کا تجزیہ (ایک طرفہ فشر کا عین مطابق ٹیسٹ) دیر سے رسپانس (LRG) سرگرمی پر منحصر جینز جن کی شناخت ان ویوو ماؤس اسٹڈی 16 سے کی گئی ہے اور انسانی مخصوص ایل آر جی ان وٹرو نیورونز17 سے۔ g، t-hCO گلوٹامیٹرجک نیورونز میں hCO گلوٹامیٹرجک نیورونز میں نمایاں طور پر اپ ریگولیٹڈ جینز کا جین سیٹ افزودگی کا تجزیہ (ایک طرفہ فشر کا عین مطابق ٹیسٹ) دیر سے رسپانس (LRG) سرگرمی پر منحصر جینز جن کی شناخت ان ویوو ماؤس اسٹڈی 16 سے کی گئی ہے اور انسانی مخصوص ایل آر جی ان وٹرو نیورونز17 سے۔ g، анализ обогащения набора генов (односторонний точный критерий Фишера) генов со значительной активацией изменения > 2, экспрессия по меньшей мере в 10% ядер) глутаматергических нейронах t-hCO по сравнению с глутаматергических по сравнению с глутамению hCO наборы генов как rannego (ERG)، так и позднего (LRG) генов, зависящих от активности, идентифицированных в исавишнах в исанов, позднего (LRG) и специфических для человека LRG из нейронов in vitro17۔ g، اہم ایکٹیویشن (ایڈجسٹڈ P <0.05، فولڈ چینج> 2، کم از کم 10 فیصد نیوکللی میں اظہار) کے ساتھ جین سیٹ کی افزودگی (ون ٹیلڈ فشر کا عین مطابق ٹیسٹ) کا تجزیہ t-hCO گلوٹامیٹرجک نیورونز کے مقابلے میں hCO glutamatergic نیورونز (Early set ERGL) اور ابتدائی سیٹ ای آر جی ایل کی سرگرمی (دونوں) ویوو چوہوں 16 میں جین کی شناخت اور وٹرو 17 میں نیوران سے انسانی مخصوص LRGs۔ g,t-hCO谷氨酸能神经元与hCO谷氨酸能神经元相比,t -hCO谷氨酸能神经元显着上调（调整后P<0.05，倍数变化>2，在至少10%的细胞核中表达）的基因集富集分析（单侧F isher精确检验）从体内小鼠研究中鉴定的早期反应(ERG)和晚期反应(LRG) 活性依赖性基因的基因组16 和体外神经元17 中的人类特异性性 g ， t-hco 谷氨酸 神经 元 与 hco 谷氨酸 神经 元 相比 ， t-hco 谷氨酸 神经 元 谨酸 神经倍数> 2، 至少 至少 10%的 细胞 核中 表达） 的 集富集 分析 （单侧 فشر 精确伉研究 中 的 早期 反应 反应 反应 和 晚期 反应 反应 (lrg) 活性 基因 基因焥廥 6 基因绥神经元 17 中 中 17 中 17 人类特异性LRG۔ g، глутаматергические нейроны t-hCO P<0,05, кратность изменения> 2, не менее 10% Анализ обогащения набора генов (односторонний точный тест Фишера) ранотегера позднего гены, зависящие от активности ответа (LRG)، идентифицированные в исследованиях на мышах in vivo16 и нейро, нейро. специфичные для человека. g، t-hCO گلوٹامیٹرجک نیوران کو hCO گلوٹامیٹرجک نیوران کے مقابلے میں نمایاں طور پر اپ گریڈ کیا گیا تھا (ایڈجسٹڈ P <0.05، فولڈ چینج>2، کم از کم 10٪ ارلی رسپانس (ERG) اور دیر سے رسپانس جین کی افزودگی کا تجزیہ (ایک دم فشر کے عین مطابق شناخت شدہ ٹیسٹس میں miRvo کی سرگرمی) اور وٹرو نیوران میں۔ 17 انسانی مخصوص ایل آر جی۔نقطے والی لائن 0.05 کی بونفیرونی کی درست کردہ P قدر کی نشاندہی کرتی ہے۔ h، GluN جین کا اظہار (ہر جین کا چھدم پیکج اور اسکیلنگ) کو T-hCO گلوٹامیٹرجک نیوران میں LRG جینوں کی snRNA-seq نقلوں میں نمایاں طور پر اپ گریڈ کیا گیا تھا۔ i، ٹی ایچ سی او (اوپر) اور ایچ سی او (نیچے) نیوران میں ایس سی جی 2 اظہار کو ظاہر کرنے والی امیونوسٹیننگ۔ سفید تیر SCG2+ سیلز کی طرف اشارہ کرتے ہیں۔ اسکیل بار، 25 µm۔ ڈیٹا کو اوسط ± معیاری انحراف کے طور پر ظاہر کیا جاتا ہے۔
سابق ویوو سلائسز میں مشاہدہ کردہ t-hCO کی بڑھتی ہوئی سرگرمی کی بنیاد پر، snRNA-seq نے وٹرو میں hCO کے مقابلے t-hCO میں جین ٹرانسکرپٹس کی سرگرمی پر منحصر اپ گریجولیشن کا انکشاف کیا۔ Glutamatergic t-hCO نیورونز نے دیر سے ردعمل کی سرگرمی کو منظم کرنے والے جینز کی اعلی سطح کا اظہار کیا (تصویر 2g,h)، جو ماؤس اور انسانی نیوران 16,17 میں پچھلے مطالعات میں پائے گئے تھے۔ مثال کے طور پر، BDNF18، SCG2، اور OSTN، ایک پرائمیٹ مخصوص سرگرمی کو ریگولیٹ کرنے والے جین نے hCO نیورونز (تصویر 2g-i) کے مقابلے t-hCO نیوران میں اظہار میں اضافہ دکھایا۔ اس طرح، t-hCO نیوران نے نقل، شکلی، اور فنکشنل تجزیوں کے ذریعے hCO نیوران کے مقابلے میں پختگی کی بہتر خصوصیات کی نمائش کی۔
انسانی دماغ کی نشوونما کے ساتھ t-hCO کی پختگی کی وابستگی کا مزید جائزہ لینے کے لیے، ہم نے جنین اور بالغ کارٹیکل سیل کی اقسام 19,20 اور بالغ 21,22 کے ٹرانسکرپٹومک موازنہ کے ساتھ ساتھ نشوونما کے دوران کارٹیکل جین اظہار23 پر وسیع ڈیٹا (توسیع شدہ ڈیٹا، تصویر 5) انجام دیا۔ )۔ پچھلے کام 24 کے ساتھ، 7-8 ماہ کی تفریق پر عالمی hCO اور t-hCO ٹرانسکرپٹوم میچوریشن کی حیثیت وسیع پیمانے پر vivo کی نشوونما کے وقت کے ساتھ مطابقت رکھتی ہے اور دیر سے جنین کی زندگی کے مترادف ہے (توسیع شدہ ڈیٹا تصویر 5a)۔ خاص طور پر، ہم نے عمر کے مماثل ایچ سی او کے مقابلے ٹی-ایچ سی او میں ٹرانسکرپٹوم کی پختگی میں اضافہ دیکھا، نیز سناپٹوجینیسیس، ایسٹروجنیسیس، اور مائیلینیشن (توسیع شدہ ڈیٹا، تصویر 5b-d) سے منسلک ٹرانسکرپٹوم ایکٹیویشن۔ سیلولر سطح پر، ہمیں t-hCO میں ایک پتلی کارٹیکس ذیلی قسم کے شواہد ملے، جس میں گلوٹامیٹرجک نیوران کے جھرمٹ بالغ L2/3، L5، اور L6 نیوران ذیلی قسموں (شکل 1i) کے ساتھ اوورلیپ ہوتے ہیں۔ اس کے برعکس، گلوٹامیٹرجک ٹی ایچ سی او نیوران اور فیٹل کورٹیکل نیوران کے درمیان کلسٹر اوورلیپ وسط حمل میں زیادہ محدود تھا (توسیع شدہ ڈیٹا، شکل 5e-j)۔ اس بات کا تعین کرنے کے لیے کہ آیا t-hCO نیوران انسانی بعد از پیدائش کے نیوکارٹیکل نیورونز سے ملتے جلتے ہیں، ہم نے انسانی بعد از پیدائش پرانتستا کے تیز حصوں میں انسانی L2/3 پرامڈل نیورونز کی الیکٹرو فزیولوجیکل ریکارڈنگ اور اناٹومیکل ری کنسٹرکشنز انجام دیے (توسیع شدہ ڈیٹا، تصویر 7a)۔ L2/3 پرامڈل نیوران کی الیکٹرو فزیوولوجیکل خصوصیات t-hCO پرامڈل نیوران کی طرح تھیں (توسیع شدہ ڈیٹا، تصویر 7e)۔ مورفولوجیکل طور پر، بعد از پیدائش انسانی نمونوں کے L2/3 نیوران hCO کے مقابلے t-hCO سے زیادہ ملتے جلتے تھے، حالانکہ L2/3 خلیات لمبے تھے، مجموعی طور پر زیادہ شاخوں پر مشتمل تھے، اور ریڑھ کی ہڈی کی کثافت زیادہ تھی (تصویر 3g اور توسیع شدہ ڈیٹا، تصویر 7b-)۔ جی)۔
a، کنٹرول کے ذریعہ تیار کردہ hCO کی پیوند کاری اور TS hiPS سیل لائنوں کو نوزائیدہ چوہوں میں۔ b، 8 ماہ کی تفریق کے بعد بائیو سائیٹین سے بھرے t-hCO نیوران کی 3D تعمیر نو۔ c، اوسط ڈینڈرٹک لمبائی کی مقدار کا تعین (n = 19 کنٹرول نیوران، n = 21 TS نیوران؛ **P = 0.0041)۔ d، 8 ماہ کی تفریق پر کنٹرول اور TS t-hCO سے 3D-تعمیر شدہ ڈینڈرٹک شاخیں، اور ڈینڈریٹک ریڑھ کی ہڈی کی کثافت کی مقدار (n = 16 کنٹرول نیوران، n = 21 TS نیوران، ***P <0.0001)۔ d، 8 ماہ کی تفریق پر کنٹرول اور TS t-hCO سے 3D-تعمیر شدہ ڈینڈرٹک شاخیں، اور ڈینڈریٹک ریڑھ کی ہڈی کی کثافت کی مقدار (n = 16 کنٹرول نیوران، n = 21 TS نیوران، ***P <0.0001)۔ d، 3D-RECONSTRUKCIIA дендритных ветвей из контроля и TS t-hCO через 8 месяцев дифференцировки и количественная оцединка шипов (n = 16 контрольных нейронов, n = 21 TS нейронов, *** P <0,0001) d، تفریق کے 8 ماہ میں کنٹرول اور t-hCO TS سے ڈینڈرٹک شاخوں کی 3D تعمیر نو اور ڈینڈریٹک ریڑھ کی ہڈی کی کثافت کی مقدار (n=16 کنٹرول نیوران، n=21 TS نیوران، ***P <0.0001)۔ d，分化8 个月时对照和TS t-hCO 的3D 重建树突分支，以及树突棘密度的量化（n=16 21 个TS 神经元，***P <0.0001）۔ d ， 分化 8 个 时 对照 和 ts t-hco 的 3d 重建 分支 分支 以及 树突棘 密度 量化 6 密度 个突棘元 ， n = 21 个 ts 神经 ， *** p <0.0001 ） . d، 3D-RECONSTRUKCIIA дендритных ветвей контроля и TS t-hCO через 8 месяцев дифференцировки и количественная оцентвей контроля шипов (n = 16 контрольных нейронов, n = 21 TS нейронов, *** P <0,0001) d، 8 ماہ کے تفریق اور ڈینڈریٹک ریڑھ کی ہڈی کی کثافت کی مقدار میں کنٹرول ڈینڈرٹک شاخوں اور TS t-hCO کی 3D تعمیر نو (n=16 کنٹرول نیوران، n=21 TS نیوران، ***P <0.0001)۔سرخ ستارے پوٹیٹیو ڈینڈریٹک ریڑھ کی ہڈی کی نشاندہی کرتے ہیں۔ e، 8 ماہ کی تفریق کے بعد کنٹرول میں بے ساختہ EPSCs اور TS t-hCO نیوران۔ f، مجموعی فریکوئنسی پلاٹ اور فریکوئنسی اور Synaptic واقعات کے طول و عرض کی مقدار (n=32 کنٹرول نیوران، n=26 TS نیوران؛ **P=0.0076 اور P=0.8102)۔ جی، ایچ سی او اور ٹی ایچ سی او میں ٹی ایس اور کنٹرول نیوران کا سکول تجزیہ۔ ڈیشڈ لائنیں موازنہ کے لیے انسانی L2/3 بعد از پیدائش پرامڈل نیورون دکھاتی ہیں (n = 24 کنٹرول t-hCO نیوران، n = 21 TS t-hCO نیوران، n = 8 کنٹرول hCO نیوران، اور n = 7 TS hCO نیوران)۔ ڈیٹا کو اوسط ± معیاری انحراف کے طور پر ظاہر کیا جاتا ہے۔
ٹی ایچ سی او کی انسانی کارٹیکس نیورونز کی شکل اور فنکشنل خصوصیات کو اعلیٰ سطح پر نقل کرنے کی صلاحیت نے ہمیں یہ دریافت کرنے پر آمادہ کیا کہ آیا t-hCO کو بیماری کے فینوٹائپس کا پتہ لگانے کے لیے استعمال کیا جا سکتا ہے۔ ہم نے TS پر توجہ مرکوز کی، ایک شدید نیورو ڈیولپمنٹل عارضہ جو جین انکوڈنگ CaV1.2 میں فائن آف فنکشن میوٹیشن کی وجہ سے ہوتا ہے، جو نیوران میں سرگرمی پر منحصر جین ٹرانسکرپشن کا آغاز کرتا ہے۔ ہم نے سب سے عام متبادل (p.G406R) اور تین کنٹرول (تصویر 3a) والے تین TS مریضوں سے hCO حاصل کیا۔ ٹرانسپلانٹیشن کے بعد، ہم نے پایا کہ ڈینڈرٹک مورفولوجی کو کنٹرولز کے مقابلے ٹی ایس نیورانز میں تبدیل کیا گیا تھا (تصویر 3b اور توسیع شدہ ڈیٹا، تصویر 8a،b)، پرائمری ڈینڈرائٹس کی تعداد میں دو گنا اضافہ اور ڈینڈریٹک لمبائی میں اوسط اور مجموعی طور پر مجموعی طور پر کمی کے ساتھ (تصویر 3c، Fig. 8) ڈیٹا۔ یہ ریڑھ کی ہڈی کی بڑھتی ہوئی کثافت اور کنٹرول نیوران کے مقابلے TS میں خود بخود EPSCs کی بڑھتی ہوئی تعدد سے منسلک تھا (تصویر 3d–f اور توسیع شدہ ڈیٹا، تصویر 8g)۔ مزید تجزیے سے کنٹرولز کے مقابلے t-hCO TS میں غیر معمولی ڈینڈریٹک برانچنگ کے نمونوں کا انکشاف ہوا، لیکن تفریق کے اسی مرحلے پر وٹرو TS hCO میں نہیں (تصویر 3 جی)۔ یہ TS میں سرگرمی پر منحصر ڈینڈریٹک سکڑنے کی ہماری پچھلی رپورٹوں سے مطابقت رکھتا ہے اور اس ٹرانسپلانٹ پلیٹ فارم کی Vivo میں بیماری کے فینوٹائپس کا پتہ لگانے کی صلاحیت کو اجاگر کرتا ہے۔
پھر ہم نے پوچھا کہ کس حد تک t-hCO خلیات چوہے S1 میں فعال طور پر مربوط ہیں۔ چوہوں میں S1 ipsilateral ventral basal اور posterior thalamic nuclei کے ساتھ ساتھ ipsilateral motor اور ثانوی somatosensory cortices، اور contralateral S1 (تصویر 4a) سے مضبوط Synaptic ان پٹ حاصل کرتا ہے۔ انرویشن پیٹرن کو بحال کرنے کے لیے، ہم نے ایچ سی او کو ریبیز وائرس-dG-GFP/AAV-G سے متاثر کیا اور 3 دن بعد HCO کو S1 چوہے میں ٹرانسپلانٹ کیا۔ ہم نے ٹرانسپلانٹیشن کے 7-14 دن بعد ipsilateral S1 اور وینٹرل بیسل گینگلیا کے نیورونز میں گھنے GFP اظہار کا مشاہدہ کیا (تصویر 4b، c)۔ اس کے علاوہ، تھیلامک مارکر نیٹرین جی 1 کے اینٹی باڈی کے داغ سے t-hCO (تصویر 4d، e) میں تھیلامک اختتام کی موجودگی کا انکشاف ہوا۔ اس بات کا اندازہ کرنے کے لیے کہ آیا یہ متعلقہ تخمینے t-hCO خلیوں میں Synaptic ردعمل کو نکال سکتے ہیں، ہم نے انسانی خلیوں سے تھیلاموکارٹیکل پرت کے تیز حصوں میں سیل کی پوری ریکارڈنگ کی۔ چوہا S1 کا برقی محرک، اندرونی کیپسول، سفید مادہ، t-hCO کے قریب ریشے یا AMPA ریسیپٹر مخالف NBQX کے سامنے آنے والے t-hCO نیوران میں شارٹ لیٹینسی EPSCs کی حوصلہ افزائی T-hCO میں opsin-اظہار کرنے والے تھیلامک اینڈز کی optogenetic ایکٹیویشن۔ (تصویر 4f، g اور توسیعی ڈیٹا، تصویر 9a–g)۔ یہ اعداد و شمار ظاہر کرتے ہیں کہ t-hCO جسمانی طور پر چوہے کے دماغ میں مربوط ہے اور چوہے کے میزبان ٹشو کے ذریعہ چالو کرنے کے قابل ہے۔
a، ریبیز سے باخبر رہنے کے تجربے کا اسکیمیٹک خاکہ۔ b، GFP اور T-hCO اور چوہا دماغی پرانتستا (اوپری پینل) کے درمیان انسانی مخصوص STEM121 اظہار۔ چوہا ipsilateral ventral basal nucleus (VB) (نیچے بائیں) اور ipsilateral S1 (نچلے دائیں) میں GFP اظہار بھی دکھایا گیا ہے۔ اسکیل بار، 50 µm۔ سرخ چوکور دماغ کے ان حصوں کی نمائندگی کرتے ہیں جہاں تصاویر لی گئی تھیں۔ c، GFP کا اظہار کرنے والے خلیوں کی مقدار کا تعین (n = 4 چوہے)۔ d, e — t-hCO میں نیٹرین G1+ تھیلامک ٹرمینلز۔ d ایک کورونل سیکشن دکھاتا ہے جس میں t-hCO اور VB نیوکلی ہوتا ہے۔ اسکیل بار، 2 ملی میٹر۔ e t-hCO (بائیں) اور VB (دائیں) نیوران میں نیٹرین G1 اور STEM121 اظہار دکھاتا ہے۔ اسکیل بار، 50 µm۔ نارنجی نقطے والی لکیر t-hCO بارڈر کی نشاندہی کرتی ہے۔ f, g, S1 چوہا (f) یا اندرونی کیپسول (g) میں برقی محرک کے بعد t-hCO نیوران کے موجودہ نشانات (جامنی) یا بغیر (سیاہ) NBQX (بائیں)۔ EPSC طول و عرض NBQX کے ساتھ اور اس کے بغیر (n = 6 S1 نیوران، *P = 0.0119؛ اور n = 6 اندرونی کیپسول نیوران، **P = 0.0022) (مرکز)۔ چوہا S1 (f) یا اندرونی کیپسول (g) (دائیں) کے برقی محرک کے جواب میں EPSC دکھاتے ہوئے t-hCO نیورونز کا فیصد۔ aCSF، مصنوعی دماغی اسپائنل سیال۔ h، 2P امیجنگ تجربے کا اسکیمیٹک خاکہ (بائیں)۔ T-hCO (درمیانی) میں GCaMP6s کا اظہار۔ اسکیل بار، 100 µm۔ GCaMP6s کا فلوروسینس ٹائم لیپس (دائیں)۔ i، بے ساختہ سرگرمی فلوروسینس کا Z-اسکور۔ j، مونچھوں کے محرک کی اسکیمیٹک مثال۔ k, z-scored 2P fluorescence trajectories in one trial, wisker deviation کے ساتھ وقت صفر (dashed line) مثال کے خلیوں میں۔ l، وقت صفر (ڈیشڈ لائن) (سرخ) یا تصادفی طور پر تیار کردہ ٹائم اسٹیمپ (گرے) پر سرگوشی کے انحراف کے ساتھ منسلک تمام خلیوں کے آبادی کے اوسط Z-اسکور کے جوابات۔ m آپٹیکل مارکنگ پر تجربے کا اسکیمیٹک خاکہ۔ n، بلیو لیزر محرک یا سرگوشی کے انحراف کے دوران مثال کے طور پر t-hCO سیل سے خام وولٹیج کے منحنی خطوط۔ سرخ تیر روشنی (اوپر) کی وجہ سے یا سرگوشی کے انحراف (نیچے) کی وجہ سے ہونے والی پہلی اسپائکس کی نشاندہی کرتے ہیں۔ گرے شیڈنگ سرگوشی کے انحراف کے ادوار کی نشاندہی کرتی ہے۔ o، چوٹی کی روشنی کی لہریں اور سرگوشی کے انحراف کے ردعمل۔ p، ایک ہی کوشش کے اسپائکس، مثال کے خلیوں میں سرگوشیوں کے انحراف کے ساتھ منسلک۔ 0 سرگوشی کی انحراف (ڈیشڈ لائن) کی نشاندہی کرتا ہے۔ q، تمام فوٹو حساس سیلز کے لیے آبادی کے اوسط Z-اسکور کی فائرنگ کی شرح، وقت صفر (ڈیشڈ لائن) (سرخ) یا تصادفی طور پر تیار کردہ ٹائم اسٹیمپ (گرے) پر سرگوشی کے انحراف کے ساتھ منسلک۔ r، نمایاں طور پر سرگوشی کے انحراف (n = 3 چوہوں) (بائیں) کے ذریعے ماڈیول کردہ فوٹو حساس اکائیوں کا تناسب۔ چوٹی زیڈ سکور لیٹنسی (n = 3 چوہے؛ n = 5 (ہلکا سبز)، n = 4 (گہرا سبز)، اور n = 4 (سیان) وِسکر ڈیفلیکشن ماڈیولیشن یونٹس فی چوہا) (دائیں)۔ ڈیٹا کو اوسط ± معیاری انحراف کے طور پر ظاہر کیا جاتا ہے۔
پھر ہم نے پوچھا کہ کیا ٹی ایچ سی او کو ویوو میں حسی محرکات کے ذریعے چالو کیا جا سکتا ہے۔ ہم نے جینیاتی طور پر انکوڈ شدہ کیلشیم انڈیکیٹرز GCaMP6 کو S1 چوہوں میں ظاہر کرتے ہوئے hCO کو ٹرانسپلانٹ کیا۔ 150 دنوں کے بعد، ہم نے فائبر فوٹوومیٹری یا دو فوٹون کیلشیم امیجنگ (تصویر 4h اور توسیع شدہ ڈیٹا، تصویر 10a) کی۔ ہم نے پایا کہ t-hCO خلیوں نے مطابقت پذیر تال کی سرگرمی کی نمائش کی (شکل 4i، توسیع شدہ ڈیٹا، شکل 10b اور ضمنی ویڈیو 1)۔ چوٹی کی ٹی-ایچ سی او سرگرمی کو نمایاں کرنے کے لیے، ہم نے بے ہوشی والے ٹرانسپلانٹ چوہوں میں ایکسٹرا سیلولر الیکٹرو فزیوولوجیکل ریکارڈنگ کی (توسیع شدہ ڈیٹا، تصویر 10c-f)۔ ہم نے MRI امیجز سے سٹیریوٹیکسک کوآرڈینیٹ بنائے ہیں۔ اس طرح، یہ ریکارڈ شدہ اکائیاں انسانی نیوران کی نمائندگی کرتی ہیں، حالانکہ اکیلے الیکٹرو فزیالوجی اصل کی کسی نوع کا تعین کرنے کی اجازت نہیں دیتی ہے۔ ہم نے سرگرمی کی مطابقت پذیری کا مشاہدہ کیا (توسیع شدہ ڈیٹا، تصویر 10d)۔ برسٹ تقریباً 460 ایم ایس تک جاری رہے اور تقریباً 2 سیکنڈ کے خاموشی کے وقفوں سے الگ ہوئے (توسیع شدہ ڈیٹا، تصویر 10 ڈی، ای)۔ انفرادی یونٹس نے فی برسٹ پر اوسطاً تین راؤنڈ فائر کیے، جو کہ فی برسٹ رجسٹرڈ یونٹس کا تقریباً 73% ہے۔ انفرادی اکائیوں کی سرگرمیاں انتہائی باہم مربوط تھیں، اور یہ ارتباط ان اکائیوں سے زیادہ تھے جن کی شناخت انہی حالات میں ریکارڈ شدہ غیر ویکسین شدہ جانوروں میں کی گئی تھی (توسیع شدہ ڈیٹا، تصویر 10f)۔ شناخت شدہ انسانی ماخوذ نیوران کے اسپائک ردعمل کو مزید نمایاں کرنے کے لیے، ہم نے ایچ سی او کے ساتھ ٹرانسپلانٹ کیے گئے اینستھیٹائزڈ چوہوں پر لائٹ ٹیگنگ کے تجربات کیے جس میں روشنی کے لیے حساس کیشن چینل روڈوپسین 2 (hChR2) کا اظہار کیا گیا، جس کے ذریعے t-hCO نیورون شارٹ لیٹنسی ریکگنیشن (10 سے کم بلیو 4 ایم ایس میں)۔ t-hCO نیورونز نے کیلشیم امیجنگ میں مشاہدہ کرنے والی تعدد پر خود بخود سرگرمی کے پھٹنے کی نمائش کی، نیز روشنی کے نشانات کی عدم موجودگی میں t-hCO میں الیکٹرو فزیولوجیکل ریکارڈنگ کی گئی (توسیع شدہ ڈیٹا، تصویر 10c-g)۔ وٹرو میں ریکارڈ شدہ ایچ سی او کے متعلقہ مراحل میں کوئی بے ساختہ سرگرمی نہیں دیکھی گئی۔ اس بات کا اندازہ لگانے کے لیے کہ آیا t-hCO کو حسی محرکات کے ذریعے چالو کیا جا سکتا ہے، ہم نے مختصراً چوہوں کے سروں کو t-hCO (تصویر 4j،m اور توسیعی ڈیٹا، تصویر 10h،k) سے ہٹا دیا۔ پچھلے مطالعات کے مطابق 8,10، t-hCO خلیوں کے ایک ذیلی سیٹ نے سرگوشی کے انحراف کے جواب میں بڑھتی ہوئی سرگرمی ظاہر کی، جس کا مشاہدہ اس وقت نہیں کیا گیا جب ڈیٹا کا بے ترتیب ٹائم اسٹامپ کے ساتھ موازنہ کیا گیا (تصویر 4k–q اور توسیع شدہ ڈیٹا، تصویر 10h–q)۔ درحقیقت، تقریباً 54% آپٹو لیبل والی واحد اکائیوں نے سرگوشی کے محرک کے بعد جوش و خروش کی شرح میں نمایاں طور پر اضافہ دکھایا، جو کہ تقریباً 650 ایم ایس (تصویر 4r) پر پہنچ گیا۔ ایک ساتھ لے کر، یہ اعداد و شمار بتاتے ہیں کہ t-hCO مناسب فنکشنل ان پٹس حاصل کرتا ہے اور اسے ماحولیاتی محرکات سے چالو کیا جا سکتا ہے۔
پھر ہم نے تفتیش کی کہ آیا t-hCO رویے کو کنٹرول کرنے کے لیے چوہوں میں سرکٹس کو چالو کر سکتا ہے۔ ہم نے پہلے تفتیش کی کہ آیا t-hCO نیوران کے محور چوہے کے آس پاس کے ٹشوز میں پروجیکٹ کرتے ہیں۔ ہم نے ایچ سی او کو ایک لینٹیو وائرس انکوڈنگ hChR2 سے EYFP (hChR2-EYFP) سے متاثر کیا۔ 110 دنوں کے بعد، ہم نے ipsilateral cortical خطوں میں EYFP اظہار کا مشاہدہ کیا، بشمول سمعی، موٹر، ​​اور somatosensory cortices کے ساتھ ساتھ ذیلی کارٹیکل علاقوں میں، بشمول سٹرائٹم، ہپپوکیمپس، اور تھیلامس (تصویر 5a)۔ اس بات کا اندازہ لگانے کے لیے کہ آیا یہ اثر انگیز تخمینہ چوہوں کے خلیوں میں Synaptic ردعمل پیدا کر سکتا ہے، ہم نے دماغ کے تیز حصوں میں چوہے کے دماغی پرانتستا کے خلیوں کو ریکارڈ کرکے hChR2-EYFP کا اظہار کرنے والے t-hCO خلیوں کو آپٹیکل طور پر چالو کیا۔ چوہوں کے پرامڈل کارٹیکس نیورونز میں نیلی روشنی کی حوصلہ افزائی مختصر تاخیر والے EPSCs کے ساتھ t-hCO محوروں کی ایکٹیویشن، جنہیں NBQX (Figs. 5b–g) نے روک دیا تھا۔ اس کے علاوہ، ان ردعملوں کو ٹیٹروڈوٹوکسین (TTX) کے ذریعے روکا جا سکتا ہے اور 4-aminopyridine (4-AP) کے ذریعے بحال کیا جا سکتا ہے، یہ تجویز کرتا ہے کہ یہ مونو سیناپٹک کنکشن (تصویر 5e) کی وجہ سے ہوئے ہیں۔
a، ایکسن ٹریکنگ کا اسکیمیٹک خاکہ (بائیں)۔ t-hCO EYFP اظہار (دائیں)۔ اسکیل بار، 100 µm۔ A1، آڈیٹری کورٹیکس، ACC، anterior cingulate cortex، d. سٹرائٹم، ڈورسل سٹرائٹم، ایچ پی سی، ہپپوکیمپس؛ ڈایافرام، لیٹرل سیپٹم، ایم پی ایف سی، میڈل پریفرنٹل کورٹیکس، پیری، پیریفارم کورٹیکس، وی سٹرائٹم، وینٹرل سٹرائٹم، وی پی ایم، تھیلامس کا وینٹروپوسٹومیڈیل نیوکلئس، وی ٹی اے، وینٹرل ٹیگینٹل ریجن۔ سرخ چوکور دماغ کے ان حصوں کی نمائندگی کرتے ہیں جہاں تصاویر لی گئی تھیں۔ b، محرک تجربے کا اسکیمیٹک خاکہ۔ c, d, انسانی (c) EYFP+ t-hCO یا چوہا (d) EYFP- خلیات میں نیلی روشنی سے متاثر فوٹوکورنٹ (اوپر) اور وولٹیج (نیچے) کے ردعمل کی مثالیں۔ ای، ایف، ٹی ٹی ایکس اور 4-اے آر (سبز)، ٹی ٹی ایکس (گرے) یا اے سی ایس ایف (سیاہ) (ای) کے ساتھ (بنفشی) یا بغیر (سیاہ) کے ساتھ نیلی روشنی کے محرک کے بعد چوہوں کے نیوران کے موجودہ نشانات (سیاہ) NBQX (e)۔ g، چوہوں کے خلیات میں نیلی روشنی کی وجہ سے ردعمل کی تاخیر (n = 16 خلیات)؛ افقی سلاخیں اوسط تاخیر (7.13 ms) (بائیں) کی نشاندہی کرتی ہیں۔ NBQX (n = 7 سیل؛ ***P <0.0001) (درمیانی) کے ساتھ یا اس کے بغیر ریکارڈ کردہ روشنی سے پیدا ہونے والے EPSCs کا طول و عرض۔ NBQX (n = 7 سیل؛ ***P <0.0001) (درمیانی) کے ساتھ یا اس کے بغیر ریکارڈ کردہ روشنی سے پیدا ہونے والے EPSCs کا طول و عرض۔ ای پی ایس سی کے حوالے سے منتخب کریں، зарегистрированных с или без NBQX (n = 7 клеток; ***P <0,0001) (в центре). NBQX (n = 7 سیل؛ ***P <0.0001) (مرکز) کے ساتھ یا اس کے بغیر ریکارڈ کردہ روشنی سے حوصلہ افزائی شدہ EPSCs کا طول و عرض۔使用或不使用NBQX 记录的光诱发EPSC 的振幅（n = 7 个细胞；***P <0.0001）（中）۔使用或不使用NBQX 记录的光诱发EPSC 的振幅（n = 7 个细胞；***P <0.0001）（中）۔ ای پی ایس سی کے حوالے سے منتخب کریں، зарегистрированных с или без NBQX (n = 7 клеток; ***P <0,0001) (в центре). NBQX (n = 7 سیل؛ ***P <0.0001) (مرکز) کے ساتھ یا اس کے بغیر ریکارڈ کردہ روشنی سے حوصلہ افزائی شدہ EPSCs کا طول و عرض۔EPSC دکھاتے ہوئے چوہے کے خلیوں کا فیصد جو نیلی روشنی (دائیں) کا جواب دیتے ہیں۔ h، طرز عمل کے کام کا اسکیمیٹک خاکہ۔ d0، دن 0. i. تربیت کے پہلے دن (بائیں) یا دن 15 (دائیں) پر مثالی جانوروں کی کارکردگی۔ دن 1 (بائیں) یا 15 دن (دائیں مرکز) پر کی جانے والی چاٹوں کی اوسط تعداد (n = 150 بلیو لائٹ ٹرائلز، n = 150 ریڈ لائٹ ٹرائلز؛ ***P <0.0001)۔ دن 1 (بائیں) یا 15 دن (دائیں مرکز) پر کی جانے والی چاٹوں کی اوسط تعداد (n = 150 بلیو لائٹ ٹرائلز، n = 150 ریڈ لائٹ ٹرائلز؛ ***P <0.0001)۔ Среднее количество облизываний, выполненных в день 1 (слева) или день (в центре справа) (n = 150 испытаний с, с = 150 испытаний) испытаний с красным светом; ***P <0,0001)۔ دن 1 (بائیں) یا 15 دن (وسط میں دائیں) پر کئے گئے چاٹوں کی اوسط تعداد (n = 150 بلیو لائٹ ٹرائلز، n = 150 ریڈ لائٹ ٹرائلز؛ ***P <0.0001)۔第1 天（左）或第15 天（右中）执行的平均舔次数（n = 150 次蓝光试验，n = 150次红光试验；**P <0.0001）۔第1 天（左）或第15 天（右中）执行的平均舔次数（n = 150 次蓝光试验，n = 150次红光试验；*P <0.001 Среднее количество облизываний, выполненных в день 1 (слева) или день (в центре справа) (n = 150 испытаний с, с = 150 испытаний) испытаний с красным светом; ***P <0,0001)۔ دن 1 (بائیں) یا 15 دن (وسط میں دائیں) پر کئے گئے چاٹوں کی اوسط تعداد (n = 150 بلیو لائٹ ٹرائلز، n = 150 ریڈ لائٹ ٹرائلز؛ ***P <0.0001)۔سرخ اور نیلی روشنی کے ٹرائلز کے لیے دن 1 (درمیان بائیں) یا دن 15 (دائیں) پر مجموعی چاٹیں۔ NS، اہم نہیں ہے۔ j,k، t-hCO کے ساتھ ٹرانسپلانٹ کیے گئے تمام جانوروں کے طرز عمل کی خصوصیات hChR2-EYFP (j) یا کنٹرول فلوروفور (k) کو دن 1 یا 15 پر (hChR2-EYFP: n = 9 چوہے، ** P = 0.0049؛ کنٹرول: n = 9، 9، 7)۔ l، ترجیحی سکور کا ارتقاء (n = 9 hChR2، n = 9 کنٹرول؛ **P <0.001، ***P <0.0001)۔ l، ترجیحی سکور کا ارتقاء (n = 9 hChR2، n = 9 کنٹرول؛ **P <0.001، ***P <0.0001)۔ l, Эволюция показателя предпочтения (n = 9 hChR2, n = 9 контрольных; **P <0,001, ***P <0,0001)۔ l، ترجیحی سکور کا ارتقاء (n = 9 hChR2، n = 9 کنٹرول؛ **P <0.001، ***P <0.0001)۔ l，偏好评分的演变（n = 9 hChR2，n = 9 对照；**P <0.001，***P <0.0001）۔ l，偏好评分的演变（n = 9 hChR2，n = 9 对照；**P <0.001，***P <0.0001）۔ l، Эволюция показателей предпочтения (n = 9 hChR2, n = 9 контролей; **P <0,001, ***P <0,0001)۔ l، ترجیحی اسکورز کا ارتقاء (n = 9 hChR2، n = 9 کنٹرول؛ **P <0.001، ***P <0.0001)۔m، S1 میں t-hCO کے آپٹوجینیٹک ایکٹیویشن کے جواب میں FOS اظہار۔ FOS اظہار کی تصاویر (بائیں)، اور مقدار (n = 3 فی گروپ؛ *P <0.05، **P <0.01 اور ***P <0.001) (دائیں) دکھائی گئی ہیں۔ FOS اظہار کی تصاویر (بائیں)، اور مقدار (n = 3 فی گروپ؛ *P <0.05، **P <0.01 اور ***P <0.001) (دائیں) دکھائی گئی ہیں۔ Показаны изображения экспрессии FOS (слева) и количественного определения (n = 3 на группу; * P <0,05, ** P <0,01 и *** P <0,001)۔ FOS اظہار (بائیں) اور مقدار (n = 3 فی گروپ؛ *P <0.05، **P <0.01، اور ***P <0.001) کی تصاویر (دائیں) دکھائی گئی ہیں۔显示了FOS 表达（左）和量化（每组n = 3；*P <0.05、**P <0.01 和***P <0.001）（叾叾ﾼP显示了FOS 表达（左）和量化（每组n = 3；*P <0.05、**P <0.01 和***P <0.001）（叾叾ﾼP Показаны изображения экспрессии FOS (слева) и количественного определения (n = 3 на группу; * P <0,05, ** P <0,01 и *** P <0,001)۔ FOS اظہار (بائیں) اور مقدار (n = 3 فی گروپ؛ *P <0.05، **P <0.01، اور ***P <0.001) کی تصاویر (دائیں) دکھائی گئی ہیں۔اسکیل بار، 100 µm۔ ڈیٹا کو بی ایل اے، بیسولیٹرل ٹانسل، ایم ڈی ٹی، ڈورسمیڈیل تھیلامک نیوکلئس، پی اے جی، پیریا کیوڈکٹل گرے کی اوسط ± معیاری غلطی کے طور پر ظاہر کیا جاتا ہے۔
آخر میں، ہم نے پوچھا کہ کیا t-hCO چوہے کے رویے کو ماڈیول کر سکتا ہے۔ اس کو جانچنے کے لیے، ہم نے hChR2-EYFP-اظہار کرنے والے hCO کو S1 میں ٹرانسپلانٹ کیا، اور 90 دن بعد، ہم نے روشنی کی ترسیل کے لیے آپٹیکل فائبرز کو t-hCO میں لگایا۔ اس کے بعد ہم نے ایک ترمیم شدہ آپریٹ کنڈیشنگ پیراڈائم (تصویر 5h) کے ساتھ چوہوں کو تربیت دی۔ ہم نے جانوروں کو طرز عمل کے ٹیسٹ چیمبر میں رکھا اور تصادفی طور پر 5 سیکنڈ نیلے (473 nm) اور سرخ (635 nm) لیزر محرکات کا اطلاق کیا۔ جانوروں کو پانی کا انعام ملتا ہے اگر وہ نیلی روشنی کے محرک کے دوران چاٹتے ہیں لیکن سرخ روشنی کے محرک کے دوران چاٹتے نہیں ہیں۔ تربیت کے پہلے دن، جانوروں نے چاٹنے میں کوئی فرق نہیں دکھایا جب نیلی یا سرخ روشنی سے حوصلہ افزائی کی گئی۔ تاہم، 15 ویں دن، hChR2-EYFP کا اظہار کرنے والے hCO کے ساتھ ٹرانسپلانٹ کیے گئے جانوروں نے سرخ روشنی کے محرک کے مقابلے میں نیلی روشنی سے حوصلہ افزائی کرنے پر زیادہ فعال چاٹ دکھایا۔ چاٹنے کے رویے میں یہ تبدیلیاں کنٹرول جانوروں میں نہیں دیکھی گئیں جن میں ایچ سی او کے ساتھ ٹرانسپلانٹ کیا گیا جس میں کنٹرول فلوروفور کا اظہار کیا گیا (سیکھنے کی کامیابی کی شرح: hChR2 89%، EYFP 0%، شکل 5i-1 اور ضمنی ویڈیو 2)۔ یہ اعداد و شمار بتاتے ہیں کہ t-hCO خلیے انعام کے متلاشی رویے کو متحرک کرنے کے لیے چوہے کے نیوران کو چالو کر سکتے ہیں۔ یہ جاننے کے لیے کہ کون سے چوہے کے t-hCO عصبی سرکٹس ان رویے کی تبدیلیوں میں شامل ہو سکتے ہیں، ہم نے 90 منٹ بعد تربیت یافتہ جانوروں اور کٹے ہوئے ٹشوز میں t-hCO کو آپٹوجینیٹک طور پر چالو کیا۔ امیونو ہسٹو کیمسٹری نے متحرک رویے میں ملوث دماغ کے متعدد خطوں میں سرگرمی پر منحصر FOS پروٹین کے اظہار کا انکشاف کیا، بشمول میڈل پریفرنٹل کارٹیکس، میڈل تھیلامس، اور پیریا کیوڈکٹل گرے مادہ، جس کا اظہار یا تو غیر محرک کنٹرول جانوروں میں یا جانوروں میں ہوتا ہے۔ چاول 5m)۔ ایک ساتھ مل کر، یہ اعداد و شمار بتاتے ہیں کہ t-hCO رویے کو چلانے کے لیے چوہے کی نیورونل سرگرمی کو ماڈیول کر سکتا ہے۔
نیورل آرگنائڈز وٹرو میں انسانی نشوونما اور بیماری کا مطالعہ کرنے کے لیے ایک امید افزا نظام کی نمائندگی کرتے ہیں، لیکن وہ vivo میں موجود سرکٹس کے درمیان رابطوں کی کمی کی وجہ سے محدود ہیں۔ ہم نے ایک نیا پلیٹ فارم تیار کیا ہے جس میں ویوو میں انسانی خلیوں کی نشوونما اور کام کا مطالعہ کرنے کے لیے ہم نے ایچ سی او کو امیونوکمپرومائزڈ ابتدائی بعد از پیدائش چوہوں کے S1 میں ٹرانسپلانٹ کیا۔ ہم نے دکھایا ہے کہ t-hCO بالغ خلیوں کی اقسام کو تیار کرتا ہے جس کا مشاہدہ وٹرو 28 میں نہیں ہوتا ہے اور یہ کہ t-hCO جسمانی اور فعال طور پر چوہا دماغ میں مربوط ہے۔ چوہا اعصابی سرکٹس میں t-hCO کے انضمام نے ہمیں انسانی سیلولر سرگرمی اور جانوروں کے رویے کا مطالعہ کرنے کے درمیان ایک ربط قائم کرنے کی اجازت دی، جس سے یہ ظاہر ہوتا ہے کہ t-hCO نیوران رویے کے ردعمل کو چلانے کے لیے چوہے کی نیورونل سرگرمی کو ماڈیول کر سکتے ہیں۔
ہم جس پلیٹ فارم کی وضاحت کرتے ہیں اس کے انسانی خلیوں کو چوہا دماغوں میں ٹرانسپلانٹ کرنے کے بارے میں پچھلی تحقیق کے مقابلے میں بہت سے فوائد ہیں۔ سب سے پہلے، ہم نے ایچ سی او کو ابتدائی بعد از پیدائش چوہوں کے ترقی پذیر پرانتستا میں ٹرانسپلانٹ کیا، جو جسمانی اور فعال انضمام کی سہولت فراہم کر سکتا ہے۔ دوسرا، t-hCO MRI مانیٹرنگ نے ہمیں زندہ جانوروں میں گرافٹ پوزیشن اور نمو کا مطالعہ کرنے کی اجازت دی، جس سے ہمیں طویل مدتی کثیر جانوروں کے مطالعے کرنے اور کئی hiPS سیل لائنوں کی وشوسنییتا قائم کرنے کی اجازت ملی۔ آخر میں، ہم نے الگ تھلگ سنگل سیل سسپینشنز کے بجائے برقرار آرگنائڈز کی پیوند کاری کی، جو انسانی خلیات کے لیے کم تباہ کن ہیں اور چوہے کے دماغ میں انسانی پرانتستا کے نیوران کے انضمام اور تخلیق کو فروغ دے سکتے ہیں۔
ہم تسلیم کرتے ہیں کہ اس پلیٹ فارم میں پیشرفت کے باوجود، وقتی، مقامی اور کراس اسپیشیز رکاوٹیں ترقی کے ابتدائی مرحلے میں ٹرانسپلانٹیشن کے بعد بھی اعلیٰ مخلصی کے ساتھ انسانی عصبی سرکٹس کی تشکیل کو روکتی ہیں۔ مثال کے طور پر، یہ واضح نہیں ہے کہ آیا t-hCO میں دیکھی جانے والی بے ساختہ سرگرمی ایک ترقیاتی فینوٹائپ کی نمائندگی کرتی ہے جو کارٹیکل نشوونما کے دوران مشاہدہ کی گئی ردھمک سرگرمی سے ملتی جلتی ہے، یا آیا یہ t-hCO میں موجود دبانے والے خلیوں کی اقسام کی عدم موجودگی کی وجہ سے ہے۔ اسی طرح، یہ واضح نہیں ہے کہ t-hCO میں لیمینیشن کی عدم موجودگی چین کے رابطے کو کس حد تک متاثر کرتی ہے۔ مستقبل کا کام سیل کی دوسری اقسام جیسے ہیومن مائیکروگلیہ، ہیومن اینڈوتھیلیل سیلز، اور GABAergic انٹرنیورونز کے مختلف تناسب کو ضم کرنے پر توجہ مرکوز کرے گا جیسا کہ وٹرو میں اسمبلی 6 کا استعمال کرتے ہوئے دکھایا گیا ہے، نیز یہ سمجھنا ہوگا کہ تبدیل شدہ t-hCO میں اعصابی انضمام اور پروسیسنگ کیسے ہو سکتی ہے۔ مریضوں سے حاصل کردہ خلیوں میں ٹرانسکرپشن، synaptic اور طرز عمل کی سطح۔
مجموعی طور پر، یہ ان ویوو پلیٹ فارم ایک طاقتور وسائل کی نمائندگی کرتا ہے جو وٹرو انسانی دماغ کی نشوونما اور بیماریوں کی تحقیق میں تکمیل کر سکتا ہے۔ ہم توقع کرتے ہیں کہ یہ پلیٹ فارم ہمیں مریض سے ماخوذ خلیوں میں ناول اسٹرینڈ لیول فینوٹائپس کو دریافت کرنے اور نئی علاج کی حکمت عملیوں کی جانچ کرنے کی اجازت دے گا۔
جیسا کہ پہلے بیان کیا گیا ہے ہم نے HiPS خلیوں سے hCO2.5 تیار کیا۔ فیڈر لیئرز پر کلچرڈ hiPS سیلز سے hCO کی پیداوار شروع کرنے کے لیے، hiPS سیلز کی برقرار کالونیوں کو ڈسپیس (0.35 mg/mL) کا استعمال کرتے ہوئے کلچر ڈشز سے ہٹا دیا گیا اور hiPS سیل کلچر میڈیم کے ساتھ ڈشز پر مشتمل انتہائی کم منسلک پلاسٹک کلچرز میں منتقل کر دیا گیا۔ (کارننگ) دو SMAD inhibitors dorsomorphine (5 μM; P5499, Sigma-Aldrich) اور SB-431542 (10 μM; 1614, Tocris) اور ROCK inhibitor Y-27632 (10 μM, S10mcheck4) کے ساتھ ضمیمہ۔ پہلے 5 دنوں کے دوران، hiPS سیل میڈیم روزانہ تبدیل کیا جاتا تھا اور ڈورسومورفین اور SB-431542 کو شامل کیا جاتا تھا۔ معطلی کے چھٹے دن، نیورل اسفیرائڈز کو نیورل میڈیم میں منتقل کیا گیا جس میں نیورو باسل-اے (10888، لائف ٹیکنالوجیز)، وٹامن اے کے بغیر B-27 ضمیمہ (12587، لائف ٹیکنالوجیز)، گلوٹا میکس (1:100، لائف ٹیکنالوجیز)، پینسلن، ٹیکنالوجیز (10888، لائف ٹیکنالوجیز) ایپیڈرمل گروتھ فیکٹر (EGF; 20 ng ml−1; R&D Systems) اور fibroblast گروتھ فیکٹر 2 (FGF2; 20 ng ml−1; R&D Systems) کے ساتھ 24 ویں دن تک۔ 25 ویں دن سے 42 ویں دن تک، میڈیم کو برین-ڈیریو کے ساتھ ضمیمہ کیا گیا تھا۔ ml−1, Peprotech) اور neurotrophin 3 (NT3; 20 ng ml−1; Peprotech) ہر دوسرے دن درمیانی تبدیلیوں کے ساتھ۔ معطلی کے چھٹے دن، نیورل اسفیرائڈز کو نیورل میڈیم میں منتقل کیا گیا جس میں نیورو باسل-اے (10888، لائف ٹیکنالوجیز)، وٹامن اے کے بغیر B-27 ضمیمہ (12587، لائف ٹیکنالوجیز)، گلوٹا میکس (1:100، لائف ٹیکنالوجیز)، پینسلن، ٹیکنالوجیز (10888، لائف ٹیکنالوجیز) ایپیڈرمل گروتھ فیکٹر (EGF; 20 ng ml−1; R&D Systems) اور fibroblast گروتھ فیکٹر 2 (FGF2; 20 ng ml−1; R&D Systems) کے ساتھ 24 ویں دن تک۔ 25 ویں دن سے 42 ویں دن تک، میڈیم کو برین-ڈیریو کے ساتھ ضمیمہ کیا گیا تھا۔ ml−1, Peprotech) اور neurotrophin 3 (NT3; 20 ng ml−1; Peprotech) ہر دوسرے دن درمیانی تبدیلیوں کے ساتھ۔معطلی کے چھٹے دن، نیورل اسفیرائڈز کو نیورل میڈیم میں منتقل کیا گیا جس میں نیورو باسل-اے (10888، لائف ٹیکنالوجیز)، وٹامن اے کے بغیر B-27 سپلیمنٹ (12587، لائف ٹیکنالوجیز)، گلوٹا میکس (1:100، لائف ٹیکنالوجیز)، پینسلن شامل تھے۔и стрептомицин (1:100, Life Technologies) и дополнены эпидермальным фактором роста (EGF; 20 ng/ml; R&D Systems) и фактором роста; ng/ml; R&D سسٹمز) 24-го дня اور سٹریپٹومائسن (1:100، لائف ٹیکنالوجیز) اور ایپیڈرمل گروتھ فیکٹر (EGF؛ 20 ng/ml؛ R&D Systems) اور fibroblast گروتھ فیکٹر 2 (FGF2؛ 20 ng/ml؛ R&D سسٹمز) کے ساتھ 24 دن تک ضمیمہ۔25 سے 42 دنوں تک، دماغ سے ماخوذ نیوروٹروفک عنصر (BDNF؛ 20 ng ml-1، Peprotech) اور neurotrophin 3 (NT3؛ 20 ng ml-1، Peprotech) میڈیم میں شامل کیے گئے، ہر دوسرے دن میڈیم بدلتے رہے۔在悬浮的第6 天，将神经球体转移到含有neurobasal-A（10888，Life Technologies）、不含维生素A B2-7补充剂（12587，Life Technologies）、GlutaMax（1:100，Life Technologies）、青霉素的神经培养基中和链0）Life10 ٹکنالوجی سسٹمز）直至第24 天۔在 悬浮 的 第 6 天 将 神经 球体 转移 含有 含有 neurobasal-a （10888 , Life Technologies 12587 لائف ٹیکنالوجیز ٹیکنالوجیز سسٹمز) 直至第24天۔ 6-й день суспензии нейросферы были переведены на добавку, содержащую нейробазал-А (10888, Life Technologies), добавку витамина А (12587, Life Technologies), GlutaMax (1:100, Life Technologies), пенициллин- нейтрализованный стрептомицин (1:100, Life Technologies) фактора роста (EGF; 20 ng ml-1; R&D Systems) и фактора роста фибробластов 2 (FGF2; 20 ng ml-1) 1; چھٹے دن، نیورو اسپیئر معطلی کو نیورو باسل-اے (10888، لائف ٹیکنالوجیز)، وٹامن اے کے بغیر B-27 سپلیمنٹ (12587، لائف ٹیکنالوجیز)، گلوٹا میکس (1:100، لائف ٹیکنالوجیز)، پینسلائزڈ لائف ٹکنالوجیز (1:100، لائف ٹکنالوجی) پر مشتمل سپلیمنٹ میں تبدیل کیا گیا۔ ٹیکنالوجیز) ایپیڈرمل گروتھ فیکٹر (EGF؛ 20 ng ml-1؛ R&D Systems) اور فبروبلاسٹ گروتھ فیکٹر 2 (FGF2؛ 20 ng ml-1) کے ساتھ ضمیمہ؛ R&D سسٹمز) 24-го дня. R&D سسٹمز) دن 24 تک۔25 سے 42 دن تک، دماغ سے ماخوذ نیوروٹروفک فیکٹر (BDNF؛ 20 ng ml-1، Peprotech) اور نیوروٹروفک فیکٹر 3 (NT3؛ 20 ng ml-1، Peprotech) کو ہر دوسرے دن کلچر میڈیم میں شامل کیا گیا۔ ایک بار درمیانی تبدیلی۔دن 43 سے شروع کرتے ہوئے، ایچ سی او کو ہر 4-6 دنوں میں درمیانی تبدیلی کے ساتھ غیر ضمنی نیوروباسال-اے میڈیم (NM؛ 1088022، تھرمو فشر) میں برقرار رکھا گیا۔ فیڈر لیس حالات میں کلچر شدہ hiPS سیلز سے hCO حاصل کرنے کے لیے، hiPS سیلز کو Accutase (AT-104، Innovate Cell Technologies) کے ساتھ 7 منٹ کے لیے 37 ° C پر انکیوبیٹ کیا گیا، سنگل سیلز میں الگ کر دیا گیا، اور AggreWell 800 پلیٹوں پر چڑھایا گیا (34815، STEMCELL) پر سنگل سیلز کے 3700 ٹیکنو لاگ ان فی کنواں ضروری 8 میڈیم میں ROCK inhibitor Y-27632 (10 μM؛ S1049، Selleckchem) کے ساتھ ضمیمہ۔ 24 گھنٹوں کے بعد، کنوؤں میں موجود میڈیا کو ضروری 6 میڈیا (A1516401، لائف ٹیکنالوجیز) پر مشتمل میڈیا میں پائپ کیا گیا جس میں ڈورسمورفین (2.5 μM؛ P5499، سگما-الڈرچ) اور SB-431542 (10 μ4M؛ 10 μM) شامل ہیں۔ ، ٹوکریڈا)۔ دن 2 سے 6 تک، ضروری 6 میڈیم کو روزانہ ڈورسومورفین اور سپلیمنٹ SB-431542 سے تبدیل کیا گیا۔ چھٹے دن سے، نیورو اسپیئر معطلی کو نیورو باسل میڈیم میں منتقل کر دیا گیا اور جیسا کہ اوپر بیان کیا گیا ہے برقرار رکھا گیا۔
جانوروں کے تمام طریقہ کار اسٹینفورڈ یونیورسٹی لیبارٹری اینیمل کیئر ایڈمنسٹریٹو کمیٹی (اے پی ایل اے سی) کے ذریعہ منظور شدہ جانوروں کی دیکھ بھال کے رہنما خطوط کے مطابق انجام دیئے گئے تھے۔ حاملہ euthymic RNU (rnu/+) چوہوں کو خریدا گیا تھا (چارلس ریور لیبارٹریز) یا رکھا گیا تھا۔ جانوروں کو 12 گھنٹے کے ہلکے تاریک سائیکل پر خوراک اور پانی کے ساتھ رکھا گیا تھا۔ تین سے سات دن کی عمر کے عریاں (FOXN1–/-) چوہے کے پپلوں کی شناخت ناپختہ سرگوشیوں کی نشوونما سے کی گئی تھی جو کاٹنے سے پہلے تھی۔ کتے (مرد اور مادہ) کو 2-3% isoflurane کے ساتھ بے ہوشی کی گئی اور ایک سٹیریوٹیکسک فریم پر رکھا گیا۔ ڈورا میٹر کی سالمیت کو برقرار رکھتے ہوئے S1 کے اوپر تقریبا 2-3 ملی میٹر قطر کے ساتھ کھوپڑی کی ٹریپینیشن کی گئی تھی۔ پھر ڈورا کو چھیدنے کے لیے کرینیوٹومی کے بالکل باہر 30-G سوئی (تقریباً 0.3 ملی میٹر) استعمال کریں۔ پھر ایک پتلی 3×3 سینٹی میٹر پیرا فلم پر HCO لگائیں اور اضافی میڈیم کو ہٹا دیں۔ 23 G، 45° سوئی سے منسلک ہیملٹن سرنج کا استعمال کرتے ہوئے، آہستہ سے hCO کو سوئی کے سب سے دور دراز سرے پر کھینچیں۔ پھر سرنج کو سٹیریوٹیکسک ڈیوائس سے منسلک سرنج پمپ پر انسٹال کریں۔ پھر سوئی کی نوک کو پہلے سے بنائے گئے 0.3 ملی میٹر چوڑے پنکچر ہول پر ڈورا (z = 0 ملی میٹر) میں رکھیں اور سرنج کو 1–2 ملی میٹر (z = تقریباً -1.5 ملی میٹر) تنگ کریں جب تک کہ سوئی ڈیورا میٹر اے کے درمیان نہ ہو۔ ایک گھنی مہر بن جائے۔ پھر سرنج کو کارٹیکل سطح کے مرکز میں z = -0.5 ملی میٹر پر اٹھائیں اور 1-2 µl فی منٹ کی شرح سے hCO انجیکشن لگائیں۔ ایچ سی او انجیکشن کی تکمیل کے بعد، سوئی کو 0.2-0.5 ملی میٹر فی منٹ کی شرح سے پیچھے ہٹایا جاتا ہے، جلد کو سیون کیا جاتا ہے، اور مکمل صحت یابی تک کتے کو فوری طور پر گرم ہیٹنگ پیڈ پر رکھا جاتا ہے۔ کچھ جانوروں کو دو طرفہ طور پر ٹرانسپلانٹ کیا گیا تھا۔
تمام جانوروں کے طریقہ کار اسٹینفورڈ یونیورسٹی APLAC سے منظور شدہ جانوروں کی دیکھ بھال کے رہنما خطوط کے مطابق انجام دیئے گئے تھے۔ چوہوں (پیوند کاری کے 60 دن سے زیادہ) کو 5% isoflurane اینستھیزیا کے ساتھ حوصلہ افزائی کی گئی اور امیجنگ کے دوران 1-3% isoflurane کے ساتھ بے ہوشی کی گئی۔ تصور کے لیے، بین الاقوامی الیکٹرک کمپنی (IECO) گریڈینٹ ڈرائیو کے ساتھ ایک 7 Tesla فعال طور پر شیلڈ افقی بورہول سکینر Bruker (Bruker Corp.)، 120 mm (600 mT/m، 1000 T/m/s AVANCE کا استعمال کرتے ہوئے اندرونی قطر کے ساتھ ایک شیلڈ گریڈینٹ انسرٹ) استعمال کیا گیا۔ III، آٹھ چینل ملٹی کوائل RF اور ملٹی کور صلاحیتیں، اور اس کے ساتھ پیراویژن 6.0.1 پلیٹ فارم۔ ریکارڈنگ ایک فعال طور پر ڈیکپلڈ والیومیٹرک RF کوائل کا استعمال کرتے ہوئے کی گئی جس کا اندرونی قطر 86 ملی میٹر ہے اور صرف وصول کرنے کے لیے چار چینل کی کریو کولڈ RF کوائل ہے۔ Axial 2D Turbo-RARE (دوہرانے کا وقت = 2500 ms، echo time = 33 ms، 2 اوسط) 16 سلائس کیپچرز کے ساتھ، سلائس کی موٹائی 0.6–0.8 mm، جس میں 256 × 256 نمونے ہیں۔ سگنلز 2 سینٹی میٹر (Rapid MR International, LLC) کے اندرونی قطر کے ساتھ کواڈریچر ٹرانسیور والیومیٹرک RF کوائل کا استعمال کرتے ہوئے موصول ہوئے تھے۔ آخر میں، 3D رینڈرنگ اور حجم کے تجزیہ کے لیے بلٹ ان Imaris (BitPlane) سطح کے تخمینے کے افعال استعمال کریں۔ ایک کامیاب ٹرانسپلانٹ کی تعریف اس کے طور پر کی گئی تھی جس میں ٹرانسپلانٹ شدہ نصف کرہ میں مسلسل T2-وزن والے MRI سگنل کے علاقے بنتے تھے۔ گرافٹ مسترد ہونے کی تعریف ایک ایسے گرافٹ کے طور پر کی گئی تھی جو ٹرانسپلانٹڈ نصف کرہ میں مسلسل T2-وزن والے MRI سگنل کے علاقے پیدا نہیں کرتی تھی۔ سبکورٹیکل ٹی ایچ سی او کو بعد کے تجزیے سے خارج کردیا گیا تھا۔
دو فوٹون کیلشیم امیجنگ کے لیے hCO میں GCaMP6s کو مستحکم طور پر ظاہر کرنے کے لیے، hiPS سیلز pLV[Exp]-EF1a::GcaMP6s-WPRE-Puro سے متاثر ہوئے تھے جس کے بعد اینٹی بائیوٹکس کا انتخاب کیا گیا تھا۔ مختصراً، خلیات کو EDTA سے الگ کر دیا گیا اور پولی برین (5 μg/ml) اور 15 μl وائرس کی موجودگی میں تقریباً 300,000 خلیات کی کثافت پر ضروری 8 میڈیم کے 1 ملی لیٹر میں معطل کر دیا گیا۔ اس کے بعد خلیوں کو 60 منٹ تک معطلی میں لگایا گیا اور 50،000 خلیات فی کنویں کی کثافت پر بیج دیا گیا۔ سنگم کے بعد، خلیات کا علاج 5-10 μg ml-1 puromycin کے ساتھ 5-10 دنوں تک یا مستحکم کالونیوں کے ظاہر ہونے تک کیا گیا۔ شدید ایچ سی او انفیکشن جیسا کہ پہلے بیان کیا گیا تھا کچھ ترمیم کے ساتھ انجام دیا گیا تھا۔ مختصراً، دن 30-45 ایچ سی او کو 1.5 ملی لیٹر ایپینڈورف مائیکرو سینٹری فیوج ٹیوبوں میں منتقل کریں جس میں 100 μl اعصابی میڈیم ہو۔ پھر میڈیم کا تقریباً 90 µl ہٹا دیا جاتا ہے، 3-6 µl ہائی ٹائٹر لینٹیو وائرس (0.5 x 108 سے 1.2 x 109 تک) ٹیوب میں شامل کیا جاتا ہے، اور hCO کو 30 منٹ کے لیے انکیوبیٹر میں منتقل کیا جاتا ہے۔ پھر ہر ٹیوب میں 90–100 µl میڈیم شامل کریں اور رات بھر ٹیوبوں کو انکیوبیٹر میں واپس کردیں۔ اگلے دن، کم منسلک پلیٹوں میں ایچ سی او کو تازہ اعصابی میڈیم میں منتقل کریں۔ 7 دن کے بعد، ایچ سی او کو 24 کنویں شیشے کے نیچے والی پلیٹوں میں منتقل کر دیا گیا تاکہ انفیکشن کے معیار کا اندازہ لگایا جا سکے۔ pLV[Exp]-SYN1::EYFP-WPRE اور pLV[Exp]-SYN1::hChR2-EYFP-WPRE VectorBuilder کے ذریعے تیار کیے گئے تھے۔ لینٹیو وائرس زیادہ تر تجربات میں استعمال ہوتا ہے کیونکہ یہ میزبان جینوم میں ضم ہوتا ہے، جس سے متاثرہ سیل لائنوں میں رپورٹر جین کے اظہار کی اجازت ملتی ہے۔ ریبیز فالو اپ کے لیے، دن 30-45 ایچ سی او ریبیز-ΔG-eGFP اور AAV-DJ-EF1a-CVS-G-WPRE-pGHpA (پلاسمڈ #67528، Addgene) سے متاثر ہوا تھا، 3 دن کے لیے اچھی طرح دھویا گیا، اور 17 دنوں میں sv1-7 میں ٹرانسپلانٹ کیا گیا۔
امیونوسیٹو کیمسٹری کے لیے، جانوروں کو بے ہوشی کی گئی اور پی بی ایس کے ساتھ ٹرانس کارڈی طور پر پرفیوز کیا گیا جس کے بعد 4% پیرافارمیلڈہائڈ (پی بی ایس میں پی ایف اے؛ الیکٹران مائیکروسکوپی سائنسز)۔ دماغ کو 4% PFA میں 2 گھنٹے کے لیے یا راتوں رات 4°C پر طے کیا گیا، PBS میں 30% سوکروز میں 48-72 گھنٹے کے لیے cryopreserved کیا گیا، اور 1:1، 30% سوکروز میں سرایت کیا گیا: OCT (Tissue-Tek OCT کمپاؤنڈ 4583، Sakura Finetek) اور cocron µc3m کا استعمال کرتے ہوئے بنایا گیا تھا۔ (لائیکا)۔ موٹے حصوں کی امیونو ہسٹو کیمسٹری کے لیے، جانوروں کو پی بی ایس کے ساتھ پرفیوز کیا گیا تھا، اور دماغ کو 300–400 µm پر وائبراٹوم (Leica) کا استعمال کرتے ہوئے کورونلی سے الگ کیا گیا تھا اور حصوں کو 30 منٹ کے لیے 4% PFA کے ساتھ طے کیا گیا تھا۔ پھر کرائی سیکشن یا موٹے حصوں کو پی بی ایس سے دھویا گیا، کمرے کے درجہ حرارت پر 1 گھنٹہ کے لیے بلاک کیا گیا (10% نارمل ڈونکی سیرم (NDS) اور 0.3% Triton X-100 PBS میں پتلا ہوا) اور 4°C پر بلاکنگ سلوشن کے ساتھ بلاک کر دیا گیا۔ - انکیوبیشن کرائی سیکشنز کو راتوں رات انکیوبیٹ کیا جاتا تھا اور موٹے حصوں کو 5 دن تک انکیوبیٹ کیا جاتا تھا۔ استعمال ہونے والی بنیادی اینٹی باڈیز یہ تھیں: اینٹی نیو این (ماؤس، 1:500؛ ab104224، abcam) اینٹی CTIP2 (چوہا، 1:300؛ ab18465، abcam)، اینٹی GFAP (خرگوش، 1:1,000؛ Z0334، Dako)، اینٹی GFP (GT10،70؛ 1000؛ چکن) جین ٹیکس)، اینٹی ایچ این اے (ماؤس، 1:200؛ ab191181، abcam)، اینٹی NeuN (خرگوش، 1:500؛ ABN78، ملی پور)، اینٹی PDGFRA (خرگوش، 1:200؛ sc-338، سانتا کروز)، اینٹی پی پی پی 1 آر 17، ایچ اے بی اے 19؛ 2008؛ 2000 اینٹی باڈیز)، اینٹی RECA-1 (ماؤس، 1:50؛ ab9774، abcam)، اینٹی SCG2 (خرگوش، 1:100؛ 20357-1-AP، Proteintech)، اینٹی SOX9 (بکری، 1:500؛ AF3075، R&D سسٹمز)، نیٹرین G1A، R10Af؛ R100D سسٹمز)، اینٹی STEM121 (ماؤس، 1:200؛ Y40410، Takara Bio)، اینٹی SATB2 (ماؤس، 1:50؛ ab51502، abcam)، اینٹی GAD65/67 (خرگوش، 1:400؛ ABN904، ملی پور) اور anti-IBAat، ab60:150 ()۔ استعمال ہونے والی بنیادی اینٹی باڈیز یہ تھیں: اینٹی نیو این (ماؤس، 1:500؛ ab104224، abcam) اینٹی CTIP2 (چوہا، 1:300؛ ab18465، abcam)، اینٹی GFAP (خرگوش، 1:1,000؛ Z0334، ڈاکو)، اینٹی-GFP (GT10،70؛ 1000؛ چکن) جین ٹیکس)، اینٹی ایچ این اے (ماؤس، 1:200؛ ab191181، abcam)، اینٹی NeuN (خرگوش، 1:500؛ ABN78، ملی پور)، اینٹی PDGFRA (خرگوش، 1:200؛ sc-338، سانتا کروز)، اینٹی پی پی پی 1 آر 17، ایچ اے بی اے 19؛ 2008؛ 2000 اینٹی باڈیز)، اینٹی RECA-1 (ماؤس، 1:50؛ ab9774، abcam)، اینٹی SCG2 (خرگوش، 1:100؛ 20357-1-AP، پروٹینٹیک)، اینٹی SOX9 (بکری، 1:500؛ AF3075، R&D Systems)، Netrin G1&1aF (R&D) سسٹمز)، اینٹی STEM121 (ماؤس، 1:200؛ Y40410، Takara Bio)، اینٹی SATB2 (ماؤس، 1:50؛ ab51502، abcam)، اینٹی GAD65/67 (خرگوش، 1:400؛ ABN904، ملی پور) اور اینٹی، اے بی اے اے بی اے اے بی اے 150 (:070) مخالف۔ Использовались следующие первичные antитела: ANTI-NeuN (мышиные, 1:500; ab104224, abcam), ANTI-CTIP2 (крысиные, abcam) , 1360; abcam اینٹی-جی ایف اے پی (کرولیچی، 1:1000؛ Z0334، ڈاکو)، اینٹی--جی ایف پی (کوریزا، 1:1000؛ جی ٹی ایکس 13970، جین ٹیکس)، انٹی-ایچ این اے (مِش، 1:200؛ ab19-19) (کرولک، 1:500؛ ABN78، ملی پور)، اینٹی پی ڈی جی ایف آر اے (کرولک، 1:200؛ sc-338، سانٹا-کروز)، اینٹی-پی پی پی 1 آر 17 (کرولک، 1:200؛ ایچ پی اے047، 1:200؛ اینٹیلاس، 1:200؛ اینٹی پی ڈی جی ایف آر اے)، (mышь, 1:50; ab9774, abcam)، ANTI-SCG2 (crolic , 1:100; 20357-1-AP، Proteintech)، ANTI-SOX9 (koziй, 1:500; AF3075, R&D Systems), G1N; AF1166, R&D Systems), ANTI-STEM121 (мышиный , 1:200; Y40410, Takara Bio), ANTI-SATB2 (мышь, 1:50; ab51502, abcam), ANTI-GAD65,49/07; ملی پور) اور اینٹی-آئی بی اے 1 (کوزا, 1 :100; аб5076, абкам)۔ استعمال ہونے والی بنیادی اینٹی باڈیز یہ تھیں: اینٹی نیو این (ماؤس، 1:500؛ ab104224، abcam)، اینٹی CTIP2 (چوہا، 1:300؛ ab18465، abcam)، اینٹی GFAP (خرگوش، 1:1000؛ Z0334، ڈاکو)، اینٹی GFP (چکن: 0334، ڈاکو)، اینٹی جی ایف پی (چکن: 0334؛ 1007؛ 1007؛ جین ٹیکس)، اینٹی ایچ این اے (ماؤس، 1:200؛ ab191181، abcam)، اینٹی نیو این (خرگوش، 1:500؛ ABN78، ملی پور)، اینٹی پی ڈی جی ایف آر اے (خرگوش، 1:200؛ sc-338، سانتا کروز)، اینٹی پی پی پی 1 آر بی، ایچ 19، 18 پی اے 17، 4 پی اے 200، 19 اینٹی باڈیز)، اینٹی RECA-1 (ماؤس، 1:50؛ ab9774، abcam)، اینٹی SCG2 (خرگوش، 1:100؛ 20357-1-AP، پروٹینٹیک)، اینٹی SOX9 (بکری، 1:500؛ AF3075، R&D Systems)، netrin G1&6aF (R&D) سسٹمز)، اینٹی STEM121 (ماؤس، 1:200؛ Y40410، Takara Bio)، اینٹی SATB2 (ماؤس، 1:50؛ ab51502، abcam)، اینٹی GAD65/67 (خرگوش، 1:400؛ ABN904، ملی پور) اور anti-IBA:0150؛ 6015 کا مخالف)۔使用的一抗是：抗NeuN（小鼠，1:500；ab104224，abcam）抗CTIP2（大鼠，1:3 00；ab18465，abcam），抗GFAP（兔，1:1,000；Z0334，Dako），抗-GF P（鸡，1:1,000；GTX13970，GeneTex），抗HNA（小鼠，1:200；ab1911 81، abcam），抗NeuN（兔，1:500；ABN78,ملی پور）,抗PDGFRA（兔1:200；sc-338，سانتا کروز），抗PPP1R17（兔，1:200；HPA047819，اٹلس抗体），抗RECA-1（小鼠，1:50；ab9774，abcam），抗SCG2（兔）، 1:100；20357-1-AP，Proteintech），抗SOX9（山羊，1:500；AF3075，R&D Systems），Netrin G1a（山羊，1:100；AF1166，R&D سسٹمز)، 抗STEM121（小鼠، 1:200؛使用的一抗是：抗NeuN（小鼠，1:500；ab104224，abcam）抗CTIP2（大鼠，1 :300；ab18465，abcam），抗GFAP（兔，1:1,000；Z0334，ڈاکو），抗-GFP（鸡，1:1,000；GTX13970，GeneTex）,抗HNA（小鼠，1:200；ab 191181، abcam），抗NeuN（兔，1:500；ABN78,Millipur％弔,抗1: سنتا کروز 100；20357-1-AP，Proteintech），抗SOX9（山羊，1:500；AF3075，R&D Systems），Netrin G1a（山羊，1:100；AF1166）, R&D頄0;Y40410، Takara Bio)، اینٹی SATB2 (ماؤس، 1:50؛ ab51502، abcam)، اینٹی GAD65/67 (خرگوش، 1:400؛ ABN904، ملی پور) اور اینٹی IBA1 (بکری، 1:100؛ ab5076، abcam)۔بنیادی اینٹی باڈیز استعمال کی گئیں: اینٹی نیو این (ماؤس، 1:500؛ ab104224، abcam)، اینٹی CTIP2 (چوہا، 1:300؛ ab18465، abcam)، اینٹی GFAP (خرگوش، 1:1000؛ Z0334، ڈاکو)۔ , اینٹی GFP (چکن، 1:1000؛ GTX13970، GeneTex)، اینٹی HNA (ماؤس، 1:200؛ ab191181، abcam)، اینٹی نیو این (خرگوش، 1:500؛ ABN78، ملی پور)، اینٹی PDGFRA (C-38؛ rabbit؛ 130؛ rabbit) اینٹی پی پی پی 1 آر 17 (خرگوش، 1:200؛ HPA047819، اٹلس اینٹی باڈی)، اینٹی RECA-1 (ماؤس، 1:50؛ ab9774، abcam)، اینٹی SCG2 (خرگوش)، 1:100؛20357-1-AP، Proteintech)، ANTI-SOX9 (koza, 1:500; AF3075, R&D Systems), netrin G1a (koza, 1:100; AF1166, R&D Systems), ANTI-STEM121, Y101,400; Takara Bio)، ANTI-SATB2 (мышь, 1:50; ab51502, abcam), ANTI-GAD65/67 (crolic, 1:400; ABN904, Millipore) и анти-IBA1 (koza, 1:100, бакама6)۔ 20357-1-AP، پروٹینٹیک)، اینٹی SOX9 (بکری، 1:500؛ AF3075، R&D سسٹمز)، نیٹرین G1a (بکری، 1:100؛ AF1166، R&D سسٹمز)، اینٹی STEM121 (ماؤس، 1:200؛ بائیو ایس بی اے ٹی 200، بائیو اے ٹی 40)، مخالف 1:50؛ ab51502، abcam)، اینٹی GAD65/67 (خرگوش، 1:400؛ ABN904، ملی پور)، اور اینٹی IBA1 (بکری، 1:100؛ ab5076، ابکم)۔اس کے بعد حصوں کو پی بی ایس سے دھویا گیا اور ثانوی اینٹی باڈی کے ساتھ کمرے کے درجہ حرارت (منجمد حصوں) پر 1 گھنٹہ یا راتوں رات 4 ° C (موٹے حصے) پر لگایا گیا۔ الیکسا فلور سیکنڈری اینٹی باڈی (لائف ٹیکنالوجیز) کو 1:1000 کو مسدود کرنے کے حل میں استعمال کیا گیا۔ پی بی ایس کے ساتھ دھونے کے بعد، نیوکلی کو ہوچسٹ 33258 (لائف ٹیکنالوجیز) کے ساتھ تصور کیا گیا۔ آخر میں، سلائیڈز کو ایک مائیکروسکوپ پر رکھا گیا جس میں ایکواماؤنٹ (پولی سائنسز) کا استعمال کرتے ہوئے کور سلپس (فشر سائنٹیفک) کا استعمال کیا گیا اور تصویر پر کینس فلوروسینٹ مائکروسکوپ (BZ-X تجزیہ کار) یا Leica TCS SP8 کنفوکل مائکروسکوپ (Las-X) پر تجزیہ کیا گیا۔ امیج جے پروگرام (فجی) کا استعمال کرتے ہوئے تصاویر پر کارروائی کی گئی۔ ٹی-ایچ سی او اور چوہا پرانتستا میں انسانی نیوران کے تناسب کو درست کرنے کے لیے، 387.5 μm چوڑی مستطیل تصاویر t-hCO کے مرکز میں، چوہے کی پرانتستا کے کنارے یا اس کے قریب لی گئی تھیں۔ گرافٹ مارجن کا تعین ٹشو کی شفافیت، HNA+ نیوکلی، اور/یا ٹشو آٹو فلوروسینس کی موجودگی میں تبدیلیوں کا اندازہ لگا کر کیا گیا تھا۔ ہر تصویر میں، NeuN+ اور HNA+ خلیوں کی کل تعداد کو اسی علاقے میں NeuN+ خلیوں کی کل تعداد سے تقسیم کیا گیا تھا۔ اس بات کو یقینی بنانے کے لیے کہ تصویری جہاز میں صرف نیوکلی والے خلیے ہی شمار کیے جائیں، صرف وہ خلیے جو Hoechst+ بھی ہیں حساب میں شامل ہیں۔ شماریاتی غلطی کو کم کرنے کے لیے کم از کم 1 ملی میٹر سے الگ کی گئی دو تصاویر کا اوسط لگایا گیا۔
نمونہ جمع کرنے سے ایک ہفتہ قبل، ایچ سی او ٹرانسپلانٹ جانوروں (تقریباً 8 ماہ کی تفریق) کو ایک تاریک کمرے میں رکھیں جس میں حسی محرک کو کم سے کم کرنے کے لیے تراشے ہوئے سرگوشیاں ہوں۔ نیوکلی کو الگ تھلگ کیا گیا جیسا کہ پہلے بیان کیا گیا ہے، کچھ ترمیم کے ساتھ۔ مختصراً، t-hCO اور hCO کو ڈٹرجنٹ مکینیکل سیل لیسز اور 2 ملی لیٹر گلاس ٹشو گرائنڈر (D8938، سگما-الڈرچ/KIMBLE) کا استعمال کرتے ہوئے تباہ کر دیا گیا۔ اس کے بعد خام نیوکلی کو 40 µm فلٹر کا استعمال کرتے ہوئے فلٹر کیا گیا اور سوکروز کثافت میلان کو انجام دینے سے پہلے 4 ° C پر 10 منٹ کے لئے 320 g پر سینٹرفیوج کیا گیا۔ سینٹرفیوگریشن مرحلہ (4°C پر 20 منٹ کے لیے 320 جی) کے بعد، نمونے 0.04% BSA/PBS میں µl-1 RNase inhibitor (40 u µl-1, AM2682، Ambion) کے 0.2 یونٹوں کے اضافے کے ساتھ دوبارہ معطل کیے گئے اور ایک µm4 میٹر فلو سے گزرے۔ اس کے بعد منقطع نیوکلی کو PBS میں دوبارہ معطل کیا گیا جس میں 0.02% BSA تھا اور اسے کرومیم سنگل سیل 3′ چپ پر لاد دیا گیا (فی لین میں 8,000 خلیات کی تخمینہ وصولی)۔ snRNA-seq لائبریریوں کو کرومیم سنگل سیل 3′ GEM، لائبریری اور جیل بیڈ کٹ v3 (10x جینومکس) کے ساتھ تیار کیا گیا تھا۔ snRNA-seq لائبریریوں کو کرومیم سنگل سیل 3′ GEM، لائبریری اور جیل بیڈ کٹ v3 (10x جینومکس) کے ساتھ تیار کیا گیا تھا۔ Библиотеки snRNA-seq были приготовлены с помощью Chromium Single cell 3′ GEM, Library & Gel Bead Kit v3 (10x جینومکس)۔ snRNA-seq لائبریریوں کو کرومیم سنگل سیل 3′ GEM، لائبریری اور جیل بیڈ کٹ v3 (10x جینومکس) کا استعمال کرتے ہوئے تیار کیا گیا تھا۔ snRNA-seq 文库是使用Chromium Single cell 3′ GEM 、Library & Gel Bead Kit v3 (10x جینومکس) 制备的. snRNA-seq 文库是使用Chromium Single cell 3′ GEM 、Library & Gel Bead Kit v3 (10x جینومکس) 制备的. Библиотеку snRNA-seq готовили с использованием Chromium Single Cell 3′ GEM, Library & Gel Bead Kit v3 (10x جینومکس)۔ snRNA-seq لائبریری کو کرومیم سنگل سیل 3′ GEM، لائبریری اور جیل بیڈ کٹ v3 (10x جینومکس) کا استعمال کرتے ہوئے تیار کیا گیا تھا۔Admera Health کے ذریعہ NovaSeq S4 (Illumina) پر مختلف نمونوں کی لائبریریوں کو جمع اور ترتیب دیا گیا تھا۔
10x جینومکس سیل رینجر تجزیہ سافٹ ویئر پیکج (ورژن 6.1.2) کا استعمال کرتے ہوئے ہر پوٹیٹیو نیوکلیئر بارکوڈ کے لیے جین کے اظہار کی سطحوں کی مقدار درست کی گئی۔ خاص طور پر، ریڈز کو انسانی (GRCh38, Ensemble, version 98) اور چوہا (Rnor_6.0, Ensemble, version 100) حوالہ جینوم کے ساتھ ملایا گیا تھا جو mkref کمانڈ کے ساتھ بنایا گیا تھا اور -include-introns=TRUE کمانڈ کے ساتھ شمار کا استعمال کرتے ہوئے کوانٹیٹیشن کے لیے ریجن میں ریڈنگز شامل ہیں۔ t-hCO نمونوں کے لیے، انسانی مرکزے کی شناخت قدامت پسندی کی ضرورت کی بنیاد پر کی گئی تھی کہ کم از کم 95% میپ شدہ ریڈز انسانی جینوم سے مماثل ہوں۔ بعد کے تمام تجزیے R پیکیج (ورژن 4.1.2) سیرت (ورژن 4.1.1) 32 کا استعمال کرتے ہوئے سیل رینجر سے فلٹر شدہ بارکوڈ اری آؤٹ پٹ پر کیے گئے۔
اس بات کو یقینی بنانے کے لیے کہ بعد کے تجزیے میں صرف اعلیٰ معیار کے مرکزے شامل کیے گئے ہیں، ہر نمونے کے لیے ایک تکراری فلٹرنگ کا عمل لاگو کیا گیا تھا۔ سب سے پہلے، 1000 سے کم منفرد جینز کے ساتھ کم معیار کے مرکزے پائے گئے اور کل مائٹوکونڈریا کے 20% سے زیادہ کی شناخت اور ہٹا دی گئی۔ اس کے بعد، خام جین نمبر میٹرکس کو sctransform(vst.flavor=”v2″) فنکشن کا استعمال کرتے ہوئے ریگولرائزڈ منفی binomial regression کے ذریعے معمول بنایا گیا، جس نے ڈیفالٹ پیرامیٹرز کا استعمال کرتے ہوئے 3000 انتہائی متغیر جینوں کی بھی نشاندہی کی۔ 30 کا طول و عرض مقرر کریں (گھٹنے کی جگہوں کے بصری معائنے کی بنیاد پر dims = 30 کا انتخاب کیا گیا تھا اور اسے تمام نمونوں اور جوڑ کے تجزیوں کے لیے استعمال کیا گیا تھا) اس کے بعد ہم نے غیر معمولی کم جین کی گنتی کی بنیاد پر جینوں کی درجہ بندی کرنے کے لیے تکراری کلسٹرنگ (ریزولوشن = 1) کی کارکردگی کا مظاہرہ کیا، اوسط درجے کی کم تعداد (10 فیصد سے زیادہ)۔ 95 پرسنٹائل) کم کوالٹی کے کلسٹرز اور/یا مشتبہ جڑواں بچوں کے اعلی تناسب کو شناخت کرنے کے لیے (یعنی 95ویں پرسنٹائل سے زیادہ ڈبل فائنڈر کا اسکور) مربوط ڈیٹا سیٹ کی فلٹرنگ کی گئی جیسا کہ اوپر بیان کیا گیا ہے۔
کم معیار کے کرنل کو ہٹانے کے بعد، مربوط ڈیٹاسیٹ کو گروپ کیا گیا (ریزولوشن = 0.5) اور UMAP34 ویژولائزیشن کے مقاصد کے لیے ایمبیڈ کیا گیا۔ ہر کلسٹر کے لیے مارکر جینز کا تعین فائنڈ مارکرز فنکشن کا استعمال کرتے ہوئے طے شدہ پیرامیٹرز کے ساتھ کیا گیا تھا جس کا حساب نارملائزڈ جین ایکسپریشن ڈیٹا سے کیا گیا تھا۔ ہم جنین اور بالغ کارٹیکل ریفرنس ڈیٹاسیٹس کو مارکر جین ایکسپریشن 19,20,21,35 اور تشریح کے ساتھ ملا کر بڑے سیل کلاسوں کی شناخت اور درجہ بندی کرتے ہیں۔ خاص طور پر، گردش کرنے والے پیش رو کی شناخت MKI67 اور TOP2A کے اظہار سے ہوئی۔ پروجینیٹر کلسٹرز کی تعریف مائٹوٹک ٹرانسکرپٹس کی عدم موجودگی، لیٹ میٹا فیز فیٹل کارٹیکس میں بیان کردہ ملٹی پوٹینٹ گلیل پروجینیٹر کلسٹرز کے ساتھ ہائی اوورلیپ، اور EGFR اور OLIG1 اظہار سے کی گئی تھی۔ ہم astrocyte کی اصطلاح کا استعمال astrocyte تفریق کی کئی ریاستوں کو شامل کرنے کے لیے کرتے ہیں، دیر سے ریڈیل گلیا سے لے کر astrocytes کی پختگی تک۔ Astrocyte کلسٹرز SLC1A3 اور AQP4 کی اعلی سطح کا اظہار کرتے ہیں اور انہیں برانن ریڈیل گلیا اور/یا بالغ ایسٹروسائٹس کی ذیلی قسموں کے ساتھ نقشہ بناتے ہوئے دکھایا گیا ہے۔ OPCs PDGFRA اور SOX10 کا اظہار کرتے ہیں جبکہ oligodendrocytes مائیلینیشن مارکر (MOG اور MYRF) کا اظہار کرتے ہیں۔ گلوٹامیٹرجک نیوران کی شناخت نیورونل ٹرانسکرپٹس (SYT1 اور SNAP25) کی موجودگی، GABAergic مارکر (GAD2) کی عدم موجودگی، اور NEUROD6، SLC17A7، BCL11B، یا SATB2 کے اظہار سے ہوئی۔ GluN نیوران کو مزید اوپری (SATB2 اظہار اور BCL11B کا نقصان) اور گہری (BCL11B اظہار) ذیلی طبقات میں تقسیم کیا گیا تھا۔ پوٹیٹیو سب پلیٹ (SP) نیوران گہرے GluN مارکر کے علاوہ SP18 کے معروف مارکر جیسے ST18 اور SORCS1 کا اظہار کرتے ہیں۔ کورائڈ پلیکسس نما خلیات کی شناخت ٹی ٹی آر اظہار کے ذریعہ کی گئی تھی، اور میننجیل نما خلیات نے ریفرینس ڈیٹا سیٹ کے فبروبلاسٹ سے وابستہ جینز اور میپڈ پیئل/ویسکولر سیلز کا اظہار کیا۔
T-hCO اور hCO ذیلی طبقات کے درمیان جین کے اظہار کا امتیازی تجزیہ لیبرا R پیکیج (ورژن 1.0.0) کا استعمال کرتے ہوئے لاگو کردہ نمونوں میں دوبارہ تیار کردہ سیوڈو بیچ کے طریقہ کار کا استعمال کرتے ہوئے کیا گیا تھا۔ خاص طور پر، edgeR لاگ امکانی ٹیسٹ (ورژن 3.36.0، پیکیج R) گروپوں کے لیے ہر نمونے کی نقل کے لیے دیے گئے سیل کلاس کے لیے خلیوں میں جینوں کی تعداد کا خلاصہ کرتے ہوئے کیے گئے تھے۔ ہیٹ میپ ویژولائزیشن کے لیے، edgeR (cpm() فنکشن) اور اسکیلڈ (مطلب = 0، معیاری انحراف = 1 حاصل کرنے کے لیے) کا استعمال کرتے ہوئے نارملائزڈ فی ملین (CPM) اقدار کی گنتی کی جاتی ہے۔ جین اونٹولوجی (GO) نمایاں طور پر اپ گریڈ شدہ t-hCO GluN جینوں کی افزودگی کا تجزیہ کیا گیا تھا (Benjamini-Hochberg نے 0.05 سے کم کی P ویلیو کو درست کیا جس کا اظہار کم از کم 10% t-hCO GluN خلیوں میں ہوا اور کم از کم 2 گنا تبدیلی میں اضافہ ہوا)۔ ToppGene Suite (https://toppgene.cchmc.org/)37 کا استعمال کرتے ہوئے انجام دیا گیا۔ ہم ToppFun ایپ کو ڈیفالٹ پیرامیٹرز کے ساتھ استعمال کرتے ہیں اور GO- تشریح شدہ ہائپر جیومیٹرک ٹیسٹوں سے حساب کی گئی بینجمینی-ہچبرگ کی درست کردہ P- اقدار کی اطلاع دیتے ہیں۔
ہمارے snRNA-seq کلسٹرز کو پرائمری سنگل سیل RNA-seq یا بالغ snRNA-seq19,20,21,22 کے حوالہ جات سے تشریح شدہ سیل کلسٹرز کے ساتھ ملانے کے لیے، ہم نے جوڑا ڈیٹاسیٹ انضمام کا طریقہ استعمال کیا۔ ہم نے ڈیٹاسیٹس کے درمیان کلسٹر اوورلیپ کو ضم کرنے اور موازنہ کرنے کے لیے Seurat میں SCTransform (v2) نارملائزیشن ورک فلو کا استعمال کیا (اوپر کی طرح وہی پیرامیٹرز استعمال کرتے ہوئے)۔ کمپیوٹیشنل کارکردگی کے لیے انفرادی ڈیٹاسیٹس کو تصادفی طور پر 500 سیلز یا کور فی اصل کلسٹر تک سب سیٹ کیا گیا تھا۔ اسی طرح کے نقطہ نظر کا استعمال کرتے ہوئے جیسا کہ پہلے بیان کیا گیا ہے، کلسٹر اوورلیپ کو ہر پولڈ کلسٹر میں خلیات یا نیوکلی کے تناسب کے طور پر بیان کیا گیا تھا جو حوالہ کلسٹر کے لیبل کے ساتھ اوورلیپ ہوتا ہے۔ GluNs کو مزید درجہ بندی کرنے کے لیے، ہم نے اپنے GluN سیلز کو حوالہ ڈیٹاسیٹ لیبل تفویض کرنے کے لیے GluN سب سیٹ ڈیٹا کے لیے Seurat's TransferData ورک فلو کا استعمال کیا۔
t-hCO اور hCO نمونوں کے عالمی ٹرانسکرپٹوم کی پختگی کی حیثیت کا اندازہ لگانے کے لیے، ہم نے اپنے سیوڈو بلک نمونوں کا موازنہ BrainSpan/psychENCODE23 سے کیا، جو انسانی دماغ کی نشوونما پر محیط ایک بڑے RNA ترتیب پر مشتمل ہے۔ ہم نے حاملہ ہونے کے 10 ہفتوں بعد کارٹیکل نمونوں سے مشترکہ پیٹرن-نارملائزڈ جین ایکسپریشن میٹرکس پر PCA انجام دیا اور بعد میں، 5567 جینوں میں (ہمارے ڈیٹا کے ساتھ) جن کی پہلے برین اسپین کارٹیکل نمونوں میں فعال کے طور پر شناخت کی گئی تھی (جس کی وضاحت عمر کے مختلف تغیرات میں 50 فیصد سے زیادہ کے طور پر کی گئی تھی۔ اس کے علاوہ، ہم نے غیر منفی میٹرکس فیکٹرائزیشن کا استعمال کرتے ہوئے نیورو ڈیولپمنٹ کے بڑے ٹرانسکرپٹوم دستخطوں سے وابستہ جین اخذ کیے جیسا کہ پہلے بیان کیا گیا ہے۔ غیر منفی میٹرکس فیکٹرائزیشن کے طریقہ کار کا استعمال کرتے ہوئے شمار کیے گئے نمونے کے وزن کو انجیر میں ترتیب دیا گیا ہے۔ Zhu et al.38 کے ذریعہ بیان کردہ پانچ دستخطوں میں سے ہر ایک کے لئے توسیع شدہ ڈیٹا کے ساتھ 5b۔ ایک بار پھر، سرگرمی پر منحصر ٹرانسکرپشن مارکر پہلے شائع شدہ مطالعات سے اخذ کیے گئے تھے۔ خاص طور پر، ERG اور LRG کو سپلیمنٹری ٹیبل 3 Hrvatin et al.16 سے بصری محرک کے بعد ماؤس ویژول کارٹیکس snRNA-seq کلیکشن کے ذریعے شناخت شدہ گلوٹامیٹرجک نیوران میں نمایاں طور پر اپ ریگولیٹ کیا گیا تھا۔ انسانی افزودہ LRGs KCl سے متحرک انسانی برانن دماغی ثقافتوں سے حاصل کیے گئے تھے اور محرک کے بعد 6 گھنٹے کی کٹائی کی گئی تھی، اور فلٹر شدہ جین کو انسانوں میں نمایاں طور پر اپ گریڈ کیا گیا تھا لیکن چوہوں میں نہیں (ضمنی جدول 4)۔ ان جین سیٹوں کا استعمال کرتے ہوئے جین سیٹ افزودگی کا تجزیہ ایک طرفہ فشر کے عین مطابق ٹیسٹ کا استعمال کرتے ہوئے کیا گیا۔
چوہوں کو isoflurane کے ساتھ بے ہوشی کریں، دماغ کو ہٹا دیں اور سردی میں رکھیں (تقریباً 4°C) آکسیجن والے (95% O2 اور 5% CO2) سوکروز کے محلول پر مشتمل حصوں کے لیے: 234 mM سوکروز، 11 mM گلوکوز، 26 mM NaHCO3، 2.5 mC 2.5 mC KM۔ NaH2PO4، 10 mM MgSO4 اور 0.5 mM CaCl2 (تقریباً 310 mOsm)۔ چوہے کے دماغی کورونل سیکشنز (300–400 µm) جس میں t-hCO شامل ہیں ایک Leica VT1200 وائبریٹوم کا استعمال کرتے ہوئے بنائے گئے تھے جیسا کہ پہلے بیان کیا گیا ہے۔ اس کے بعد حصوں کو ایک سیکشننگ چیمبر میں منتقل کیا گیا جس میں کمرے کے درجہ حرارت کی مسلسل آکسیجنیشن ACSF پر مشتمل ہے جس سے تیار کیا گیا ہے: 10 mM گلوکوز، 26 mM NaHCO3، 2.5 mM KCl، 1.25 mM NaHPO4، 1 mM MgSO4، 2 mM CaCl2 اور 126 mCs (126 mCs NaHCO3)۔ ریکارڈنگ سے کم از کم 45 منٹ پہلے۔ حصوں کو ایک ڈوبے ہوئے چیمبر میں ریکارڈ کیا گیا تھا جہاں انہیں اے سی ایس ایف (95٪ O2 اور 5٪ CO2 شیشی) کے ساتھ مستقل طور پر پرفیوز کیا گیا تھا۔ تمام ڈیٹا کمرے کے درجہ حرارت پر ریکارڈ کیا گیا۔ t-hCO نیورونز کو بوروسیلیکیٹ شیشے کے پائپیٹ کے ساتھ ختم کیا گیا جس میں 127 mM پوٹاشیم گلوکوونیٹ، 8 mM NaCl، 4 mM میگنیشیم ATP، 0.3 mM سوڈیم GTP، 10 mM HEPES، اور 0.6 mM EGTA، pH20 اندرونی حل کے ساتھ بھرا ہوا تھا mOsm)۔ صحت یاب ہونے کے لیے، بایوکیٹن (0.2%) ریکارڈنگ حل میں شامل کیا گیا۔
ڈیٹا ملٹی کلیمپ 700B ایمپلیفائر (مالیکیولر ڈیوائسز) اور ڈیجیڈیٹا 1550B ڈیجیٹائزر (مالیکیولر ڈیوائسز) کا استعمال کرتے ہوئے حاصل کیا گیا، 2 کلو ہرٹز پر کم پاس فلٹر کیا گیا، 20 کلو ہرٹز پر ڈیجیٹائز کیا گیا، اور کلیمپفٹ (مالیکیولر ڈیوائسز) کا استعمال کرتے ہوئے تجزیہ کیا گیا۔ 2021b، اوریجن لیب)۔ اور اپنی مرضی کے مطابق MATLAB فنکشنز (میتھ ورک)۔ جنکشن پوٹینشل کا حساب JPCalc کا استعمال کرتے ہوئے کیا گیا تھا اور اندراجات کو -14 mV کی حسابی قدر میں ایڈجسٹ کیا گیا تھا۔ آپریشن IV 10-25 پی اے مراحل میں موجودہ مراحل کی ایک سیریز پر مشتمل ہے، -250 سے 750 پی اے تک۔
تھیلامس، سفید مادہ، اور S1 افرینٹ کو تھیلاموکارٹیکل سلائسس میں ایچ سی او نیوران کی پیچ کلیمپ ریکارڈنگ کے دوران برقی طور پر متحرک کیا گیا تھا، جیسا کہ پہلے بیان کیا گیا ہے۔ مختصراً، دماغ کو 3D پرنٹنگ ٹیبل پر 10° کے زاویے پر جھکا کر رکھا گیا تھا، اور دماغ کا اگلا حصہ 35° کے زاویے پر کاٹا گیا تھا۔ اس کے بعد دماغ کو کٹی ہوئی سطح پر چپکا دیا گیا اور تھیلاموکارٹیکل پھیلے ہوئے محوروں کو محفوظ کرتے ہوئے سیکشن کیا گیا۔ بائپولر ٹنگسٹن الیکٹروڈس (0.5 MΩ) کو دوسرے مائکرو مینیپولیٹر پر نصب کیا گیا تھا اور فی سیل کے چار علاقوں (اندرونی کیپسول، سفید مادہ، S1 اور hCO) کو متحرک کرنے کے لیے حکمت عملی کے ساتھ پوزیشن میں رکھی گئی تھی۔ 0.03–0.1 ہرٹز پر 300 µA فاسک محرک کے بعد Synaptic ردعمل ریکارڈ کریں۔
hChR2-اظہار کرنے والے hCO نیوران کو 480 nm پر چالو کیا گیا تھا اور LED (Prizmatix) کے ذریعے پیدا ہونے والی ہلکی دالیں ایک × 40 مقصد (0.9 NA؛ Olympus) کے ذریعے خلیات کے قریب hChR2 اظہار کو ریکارڈ کرنے کے لیے لگائی گئی تھیں۔ روشن فیلڈ کا قطر تقریباً 0.5 ملی میٹر ہے اور کل پاور 10-20 میگاواٹ ہے۔ نبض کی چوڑائی 10 ایم ایس پر سیٹ کی گئی تھی، جو رویے سے متعلق سیکھنے کے تجربے کے دوران دی گئی نبض کے مساوی ہے۔ 1 سے 20 ہرٹز تک مختلف محرک تعدد کا استعمال کیا گیا، لیکن مقدار کے لیے سیریز کی صرف پہلی نبض استعمال کی گئی۔ ٹرینوں کے درمیان وقفہ عام طور پر 30 سیکنڈ سے زیادہ ہوتا ہے تاکہ Synaptic inhibitory یا سہولت فراہم کرنے والے راستوں پر اثر کو کم کیا جا سکے۔ یہ جانچنے کے لیے کہ آیا hChR2 کا ردعمل monosynaptic تھا، ہم نے غسل میں TTX (1 μM) لگایا جب تک کہ EPSC رد عمل غائب نہ ہو جائے، اور پھر 4-aminopyridine (4-AP؛ 100 μM) لگایا۔ عام طور پر، LED فائرنگ اور EPSC جنریشن کے درمیان قدرے زیادہ تاخیر کے ساتھ، چند منٹوں میں جواب واپس کر دیا جاتا ہے۔ NBQX (10 μM) کو جانچنے کے لئے استعمال کیا گیا تھا کہ آیا جواب AMPA ریسیپٹرز کے ذریعہ چلتا ہے۔
تیز hCO حصے بنائے گئے تھے جیسا کہ پہلے بیان کیا گیا ہے۔ مختصراً، hCO حصے 4% agarose میں سرایت کیے گئے تھے اور 126 mM NaCl، 2.5 mM KCl، 1.25 mM NaH2PO4، 1 mM MgSO4، 2 mM CaCl2، 26 mM NaHCO3 اور 10 mM پر مشتمل خلیوں میں منتقل کیے گئے تھے۔ Leica VT1200 وائبریٹر کا استعمال کرتے ہوئے کمرے کے درجہ حرارت پر 200–300 µm اور کمرے کے درجہ حرارت پر ASF میں ذخیرہ کیا جاتا ہے۔ اس کے بعد، پورے خلیوں کی پیچ-کیمپ ریکارڈنگ ایچ سی او سیکشنز پر براہ راست سلائس اسکوپ مائکروسکوپ (سائنٹیفیکا) کے تحت کی گئی۔ حصوں کو aCSF (95% O2 اور 5% CO2) کے ساتھ پرفیوز کیا گیا تھا اور کمرے کے درجہ حرارت پر سیل سگنل ریکارڈ کیے گئے تھے۔ hCO نیورونز کا اطلاق بوروسیلیکیٹ شیشے کے پائپیٹ کا استعمال کرتے ہوئے کیا گیا تھا جس میں 127 mM پوٹاشیم گلوکوونیٹ، 8 mM NaCl، 4 mM میگنیشیم ATP، 0.3 mM سوڈیم GTP، 10 mM HEPES، اور 0.6 mM EGTA، اندرونی pH 90mo2 کے ساتھ ایڈجسٹ کیا گیا تھا۔ بحالی کے مقاصد کے لیے، اندرونی محلول میں 0.2% Biocytin شامل کریں۔
ڈیٹا Clampex (Clampex 11.1، مالیکیولر ڈیوائسز) کے ذریعے ایک MultiClamp 700B یمپلیفائر (Molecular Devices) اور ایک Digidata 1550B digitizer (Molecular Devices) کا استعمال کرتے ہوئے حاصل کیا گیا تھا، 2 kHz پر کم پاس فلٹر کیا گیا، 2 kHz پر ڈیجیٹائز کیا گیا، اور 20kHz پر ڈیجیٹائز کیا گیا۔ 10.6) تجزیہ، مالیکیولر ڈیوائسز) اور کسٹم میٹلیب فنکشنز (MATLAB 2019b، Mathworks) کے لیے۔ JPCalc کا استعمال کرتے ہوئے جنکشن پوٹینشل کا حساب لگایا گیا اور اندراجات کو -14 mV کے حسابی جنکشن پوٹینشل میں ایڈجسٹ کیا گیا۔ آپریشن IV موجودہ مراحل کی ایک سیریز پر مشتمل ہے جو کہ 5-10 پی اے مراحل میں -50 سے 250 پی اے تک ہے۔
پنچڈ نیورونز کی مورفولوجیکل تعمیر نو کے لیے، اندرونی محلول میں 0.2% بایو سائیٹن (سگما-الڈرچ) شامل کیا گیا۔ سیلز کو ہیک کرنے کے بعد کم از کم 15 منٹ تک پرائم کیا جاتا ہے۔ پھر پپیٹ کو آہستہ آہستہ 1-2 منٹ تک کھینچا جاتا ہے جب تک کہ رجسٹرڈ جھلی مکمل طور پر سیل نہ ہوجائے۔ سیکشن فزیالوجی کے طریقہ کار کے بعد، سیکشنز کو راتوں رات 4° C. پر 4% PFA میں طے کیا گیا، PBS X3 سے دھویا گیا، اور 1:1000 پر اسٹریپٹاویڈن کنجوگیٹڈ DyLight 549 یا DyLight 405 (ویکٹر لیبز) کے ساتھ ملایا گیا۔ بائیو سائیٹین سے بھرے خلیات (2٪؛ سگما-الڈرچ) کو کمرے کے درجہ حرارت پر 2 گھنٹے تک پیچ کلیمپ ریکارڈنگ کے دوران لیبل لگایا گیا تھا۔ اس کے بعد حصوں کو ایکواماؤنٹ (تھرمو سائنٹیفک) کا استعمال کرتے ہوئے مائکروسکوپی سلائیڈوں پر نصب کیا گیا اور اگلے دن لائیکا TCS SP8 کنفوکل مائکروسکوپ پر عددی یپرچر × 40 1.3، میگنیفیکیشن × 0.9–1.0، xy کے ساتھ آئل وسرجن مقصد کا استعمال کرتے ہوئے تصور کیا گیا۔ نمونے لینے کی شرح تقریباً 7 پکسلز فی مائکرون ہے۔ 1 µm وقفوں پر Z-stacks کو سلسلہ وار حاصل کیا گیا تھا، اور Z-stack mosaics اور Leica-based auto-stitching ہر نیوران کے پورے ڈینڈریٹک درخت کو ڈھانپنے کے لیے انجام دیا گیا تھا۔ پھر نیو ٹیوب 40 انٹرفیس کا استعمال کرتے ہوئے نیوران کو نیم دستی طور پر ٹریک کیا گیا اور SWC فائلیں تیار کی گئیں۔ اس کے بعد فائلوں کو SimpleNeuriteTracer41 Fiji پلگ ان (ImageJ، ورژن 2.1.0؛ NIH) پر اپ لوڈ کیا گیا۔
اسٹینفورڈ یونیورسٹی کے ادارہ جاتی جائزہ بورڈ کے منظور کردہ پروٹوکول کے مطابق انسانی کارٹیکل ٹشو باخبر رضامندی کے ساتھ حاصل کیا گیا تھا۔ انسانی نفلی ٹشو کے دو نمونے (3 اور 18 سال کی عمر کے) فرنٹل کورٹیکس (درمیانی فرنٹل گائرس) کو ریفریکٹری مرگی کے لیے سرجری کے حصے کے طور پر حاصل کیے گئے تھے۔ ریسیکشن کے بعد، برف سے ٹھنڈے ہوئے NMDG-aCSF میں ٹشو کی کٹائی کریں جس میں: 92 mM NMDG، 2.5 mM KCl، 1.25 mM NaH2PO4، 30 mM NaHCO3، 20 mM HEPES، 25 mM گلوکوز، 2 mM mM 5mM thourea، soium 3 mM پائروویٹ، 0.5 mM CaCl2 4H2O اور 10 mM MgSO4 7H2O۔ مرتکز ہائیڈروکلورک ایسڈ کے ساتھ پی ایچ 7.3-7.4 تک ٹائٹریٹ کریں۔ ٹشوز کو 30 منٹ کے اندر لیبارٹری میں پہنچا دیا گیا اور اوپر بیان کردہ طریقہ کار کے مطابق کورونل سیکشنز لیے گئے۔
تمام جانوروں کے طریقہ کار اسٹینفورڈ یونیورسٹی APLAC سے منظور شدہ جانوروں کی دیکھ بھال کے رہنما خطوط کے مطابق انجام دیئے گئے تھے۔ چوہوں (پیوند کاری کے بعد 140 دن سے زیادہ) کو 5% isoflurane اینستھیزیا کے ساتھ حوصلہ افزائی کی گئی اور 1-3% isoflurane intraoperatively کے ساتھ بے ہوشی کی گئی۔ جانوروں کو ایک سٹیریوٹیکسک فریم (Kopf) میں رکھا گیا تھا اور مستقل رہائی والی بیوپرینورفائن (SR) کو ذیلی طور پر انجکشن لگایا گیا تھا۔ کھوپڑی کو بے نقاب کیا جاتا ہے، صاف کیا جاتا ہے اور 3-5 ہڈیوں کے پیچ ڈالے جاتے ہیں۔ t-hCO کو نشانہ بنانے کے لیے، ہم نے MRI امیجز سے سٹیریوٹیکسک کوآرڈینیٹس بنائے۔ دلچسپی کی جگہ پر ایک گڑ کا سوراخ کیا گیا تھا اور ریشوں (400 µm قطر، NA 0.48، Doric) کو hCO سطح سے 100 µm نیچے اتارا گیا تھا اور UV- قابل علاج ڈینٹل سیمنٹ (Relyx) کے ساتھ کھوپڑی میں محفوظ کیا گیا تھا۔
فائبر فوٹوومیٹرک ریکارڈنگ کی گئی تھی جیسا کہ پہلے بیان کیا گیا ہے42۔ بے ساختہ سرگرمی کو ریکارڈ کرنے کے لیے، چوہوں کو ایک صاف پنجرے میں رکھا گیا اور فائبر آپٹک فوٹوومیٹرک ڈیٹا کے حصول کے نظام سے منسلک 400 µm قطر والی فائبر آپٹک پیچ کیبل (Doric) کو امپلانٹڈ فائبر آپٹک کیبل سے جوڑا گیا۔ موٹر سرگرمی کی 10 منٹ کی ریکارڈنگ کے دوران، جانور پنجرے کو تلاش کرنے کے لیے آزاد تھے۔ پیدا ہونے والی سرگرمی کو ریکارڈ کرنے کے لیے، چوہوں کو (پیوند کاری کے 140 دن بعد) شامل کرنے کے لیے 5% isoflurane اور دیکھ بھال کے لیے 1-3% isoflurane کے ساتھ بے ہوشی کی گئی۔ جانور کو ایک سٹیریوٹیکٹک فریم (Kopf) میں رکھیں اور t-hCO کے مخالف سمت میں سرگوشیوں کو تقریباً 2 سینٹی میٹر تک تراشا جاتا ہے اور پیزو الیکٹرک ایکچیویٹر (PI) سے جڑے میش سے گزرتا ہے۔ ایک 400 µm فائبر آپٹک پیچ کیبل (Doric) امپلانٹڈ فائبر سے منسلک تھی اور ڈیٹا کے حصول کے نظام سے منسلک تھی۔ t-hCO کے مخالف سمت میں موجود سرگوشیوں کو پھر 20 منٹ کی ریکارڈنگ کی مدت میں پیزو الیکٹرک ڈرائیو کے ذریعے بے ترتیب اوقات میں 50 بار (20 Hz پر 2 ملی میٹر، 2 s فی پریزنٹیشن) سے ہٹایا گیا۔ اپنی مرضی کے MATLAB کوڈ کے ساتھ ڈیفلیکشن ٹائم کو کنٹرول کرنے کے لیے Arduino MATLAB سپورٹ پیکیج کا استعمال کریں۔ ٹرانزسٹر-ٹرانزسٹر لاجک (TTL) دالوں کا استعمال کرتے ہوئے واقعات کو ڈیٹا ایکوزیشن سافٹ ویئر کے ساتھ ہم آہنگ کیا جاتا ہے۔
چوہوں (پیوند کاری کے بعد 140 دن سے زیادہ) کو 5% isoflurane اینستھیزیا کے ساتھ حوصلہ افزائی کی گئی اور 1-3% isoflurane intraoperatively کے ساتھ بے ہوشی کی گئی۔ جانوروں کو سٹیریوٹیکسک فریم (Kopf) میں رکھا گیا تھا اور buprenorphine SR اور dexamethasone کو subcutaneously انجکشن لگایا گیا تھا۔ کھوپڑی کو بے نقاب کیا جاتا ہے، صاف کیا جاتا ہے اور 3-5 ہڈیوں کے پیچ ڈالے جاتے ہیں۔ t-hCO کو نشانہ بنانے کے لیے، ہم نے MRI امیجز سے سٹیریوٹیکسک کوآرڈینیٹس بنائے۔ ایک سرکلر کرینیوٹومی (تقریباً 1 سینٹی میٹر قطر) ایک تیز رفتار ڈرل کے ساتھ براہ راست ٹرانسپلانٹڈ ایچ سی او پر کی گئی۔ ایک بار جب ہڈی ممکن حد تک پتلی ہو جائے، لیکن پوری ہڈی میں سوراخ کرنے سے پہلے، اندرونی ٹی ایچ سی او کو ظاہر کرنے کے لیے باقی برقرار شرونیی ڈسک کو ہٹانے کے لیے فورسپس کا استعمال کریں۔ کرینیوٹومی جراثیم سے پاک نمکین سے بھری ہوئی تھی، اور یووی کیورڈ ڈینٹل سیمنٹ (ریلیکس) کے ساتھ کھوپڑی کے ساتھ ایک کور سلپ اور ایک خاص ہیڈ پن منسلک تھا۔
Nikon LWD (×16, 0.8 NA) مقصد کے ساتھ بروکر ملٹی فوٹون مائکروسکوپ کا استعمال کرتے ہوئے دو فوٹون امیجنگ کی گئی۔ GCaMP6 امیجنگ 920 nm پر 1.4x سنگل z-plane magnification اور 8x اوسط 7.5 fps کے ساتھ کی گئی۔ چوہوں کو 5% isoflurane اینستھیزیا کے ساتھ حوصلہ افزائی کی گئی اور 1-3% isoflurane کے ساتھ برقرار رکھا گیا۔ چوہوں کو اپنی مرضی کے مطابق ہیڈ فکسچر میں رکھا گیا تھا اور عینک کے نیچے رکھا گیا تھا۔ موٹر سرگرمی کی 3 منٹ کی پس منظر کی ریکارڈنگ حاصل کی گئی۔ 20 منٹ کی ریکارڈنگ کے دوران، 50 پف (ہر پریزنٹیشن 100 ایم ایس لمبا) تصادفی طور پر ایک پکوسپرائسر کا استعمال کرتے ہوئے t-hCO کے مخالف وسکر پیڈ پر پہنچایا گیا۔ کسٹم میٹلیب کوڈ کے ساتھ برسٹ ٹائم کو کنٹرول کرنے کے لیے Arduino MATLAB سپورٹ پیکیج کا استعمال کریں۔ TTL دالوں کا استعمال کرتے ہوئے ڈیٹا ایکوزیشن سافٹ ویئر (PrairieView 5.5) کے ساتھ ایونٹس کو سنکرونائز کریں۔ تجزیہ کے لیے، فجی میں شروع کیے گئے MoCo پروگرام میں affine تصحیح کا استعمال کرتے ہوئے تصاویر کو xy موشن کے لیے درست کیا گیا تھا۔ CNMF-E43 کا استعمال کرتے ہوئے انفرادی خلیوں سے فلوروسینٹ نشانات کا اخراج۔ دلچسپی کے ہر علاقے کے لیے فلوروسینس نکالا گیا، dF/F منحنی خطوط میں تبدیل کیا گیا، اور پھر z-اسکورز میں تبدیل کر دیا گیا۔
چوہوں (پیوند کاری کے بعد 140 دن سے زیادہ) کو 5% isoflurane اینستھیزیا کے ساتھ حوصلہ افزائی کی گئی اور 1-3% isoflurane intraoperatively کے ساتھ بے ہوشی کی گئی۔ جانوروں کو سٹیریوٹیکسک فریم (Kopf) میں رکھا گیا تھا اور buprenorphine SR اور dexamethasone کو subcutaneously انجکشن لگایا گیا تھا۔ t-hCO کے مخالف سمت میں سرگوشیوں کو تقریبا 2 2 سینٹی میٹر تک کاٹا گیا تھا اور پیزو الیکٹرک ایکچیویٹر سے منسلک میش کے ذریعے تھریڈ کیا گیا تھا۔ کھوپڑی کو بے نقاب اور صاف کیا جاتا ہے۔ کھوپڑی کے ساتھ سٹینلیس سٹیل کا گراؤنڈ سکرو منسلک ہے۔ t-hCO کو نشانہ بنانے کے لیے، ہم نے MRI امیجز سے سٹیریوٹیکسک کوآرڈینیٹس بنائے۔ ٹی ایچ سی او کے بالکل اوپر تیز رفتار ڈرل کے ساتھ ایک سرکلر کرینیوٹومی (تقریباً 1 سینٹی میٹر قطر) انجام دیں۔ ایک بار جب ہڈی ممکن حد تک پتلی ہو جائے، لیکن پوری ہڈی میں سوراخ کرنے سے پہلے، اندرونی ٹی ایچ سی او کو ظاہر کرنے کے لیے باقی برقرار شرونیی ڈسک کو ہٹانے کے لیے فورسپس کا استعمال کریں۔ انفرادی خلیات کو 32-چینل یا 64-چینل ہائی ڈینسٹی سلیکون پروبس (کیمبرج نیوروٹیک) کا استعمال کرتے ہوئے ریکارڈ کیا گیا جو زمینی پیچ پر گراؤنڈ کیا گیا اور RHD ایمپلیفائرز (انٹان) کے ساتھ پہلے سے بڑھا دیا گیا۔ کرینیوٹومی کے ذریعے الیکٹروڈ کو ٹارگٹ سائٹ تک کم کرنے کے لیے مینیپلیٹر کا استعمال کریں، جو جراثیم سے پاک نمکین سے بھرا ہوا ہے۔ Open Ephys ڈیٹا ایکوزیشن سسٹم کا استعمال کرتے ہوئے 30 kHz کی فریکوئنسی پر ڈیٹا اکٹھا کیا گیا۔ ریکارڈنگ صرف اس وقت جاری رہی جب ہم نے 10 سے زیادہ چینلز میں انتہائی باہم مربوط تال کی اچانک سرگرمی کا پتہ لگایا، جس سے یہ معلوم ہوتا ہے کہ الیکٹروڈ گرافٹ میں موجود تھے (دو فوٹون کیلشیم امیجنگ ڈیٹا پر مبنی)۔ موٹر سرگرمی کی 10 منٹ کی پس منظر کی ریکارڈنگ حاصل کی گئی۔ t-hCO کے مخالف سمت میں موجود سرگوشیوں کو پھر 20 منٹ کی ریکارڈنگ کی مدت میں پیزو الیکٹرک ڈرائیو کے ذریعے بے ترتیب اوقات میں 50 بار (20 Hz پر 2 ملی میٹر، 2 s فی پریزنٹیشن) سے ہٹایا گیا۔ Arduino (MATLAB 2019b) کے لیے MATLAB سپورٹ پیکیج کا استعمال کرتے ہوئے، اپنی مرضی کے MATLAB کوڈ کے ساتھ ڈیفلیکشن ٹائم کو کنٹرول کریں۔ ڈیٹا ایکوزیشن سافٹ ویئر کے ساتھ ایونٹس کو سنکرونائز کرنے کے لیے TTL دالیں استعمال کریں۔
آپٹیکل مارکنگ کے تجربات کے لیے، 473 nm لیزر (Omicron) سے منسلک 200 µm آپٹیکل پیچ کی ہڈی (Doric) کو کرینیوٹومی کے اوپر رکھے گئے 200 µm آپٹیکل فائبر سے جوڑا گیا تھا۔ اس سے فوراً پہلے، جمپر پاور کو 20 میگاواٹ پر ایڈجسٹ کریں۔ کرینیوٹومی کے ذریعے الیکٹروڈ کو ٹارگٹ سائٹ تک کم کرنے کے لیے مینیپلیٹر کا استعمال کریں، جو جراثیم سے پاک نمکین سے بھرا ہوا ہے۔ ریکارڈنگ کے آغاز میں، روشنی 473 nm (فریکوئنسی 2 Hz، نبض کا دورانیہ 10 ms) کی دس دالیں خارج ہوئیں۔ فوٹو حساس خلیوں کی تعریف ایسے خلیوں کے طور پر کی گئی تھی جو 70٪ یا اس سے زیادہ آزمائشوں میں 10 ایم ایس روشنی کے اندر اسپائک ردعمل کی نمائش کرتے ہیں۔