Nature.com پر جانے کا شکریہ۔آپ جس براؤزر کا ورژن استعمال کر رہے ہیں اسے محدود CSS سپورٹ حاصل ہے۔بہترین تجربے کے لیے، ہم تجویز کرتے ہیں کہ آپ ایک اپ ڈیٹ شدہ براؤزر استعمال کریں (یا انٹرنیٹ ایکسپلورر میں مطابقت موڈ کو غیر فعال کریں)۔اس دوران، مسلسل تعاون کو یقینی بنانے کے لیے، ہم سائٹ کو بغیر اسٹائل اور جاوا اسکرپٹ کے رینڈر کریں گے۔
مائع بایپسی (LB) ایک ایسا تصور ہے جو بائیو میڈیکل فیلڈ میں تیزی سے مقبولیت حاصل کر رہا ہے۔یہ تصور بنیادی طور پر گردش کرنے والے ایکسٹرا سیلولر DNA (ccfDNA) کے ٹکڑوں کی کھوج پر مبنی ہے، جو بنیادی طور پر مختلف ٹشوز میں خلیوں کی موت کے بعد چھوٹے ٹکڑوں کے طور پر جاری ہوتے ہیں۔ان ٹکڑوں کا ایک چھوٹا سا حصہ غیر ملکی (غیر ملکی) ٹشوز یا جانداروں سے نکلتا ہے۔موجودہ کام میں، ہم نے اس تصور کو mussels پر لاگو کیا ہے، یہ ایک سنٹینیل پرجاتی ہے جو ان کی اعلی سمندری پانی کی فلٹریشن صلاحیت کے لیے مشہور ہے۔ہم سمندری ساحلی ماحولیاتی نظام کی حیاتیاتی تنوع کے بارے میں معلومات فراہم کرنے کے لیے مختلف ذرائع سے ماحولیاتی ڈی این اے کے ٹکڑوں کو حاصل کرنے کے لیے قدرتی فلٹر کے طور پر کام کرنے کے لیے mussels کی صلاحیت کا استعمال کرتے ہیں۔ہمارے نتائج سے پتہ چلتا ہے کہ mussel hemolymph میں DNA کے ٹکڑے ہوتے ہیں جو 1 سے 5 kb تک سائز میں بہت مختلف ہوتے ہیں۔شاٹ گن کی ترتیب سے پتہ چلتا ہے کہ ڈی این اے کے ٹکڑوں کی ایک بڑی تعداد غیر ملکی مائکروبیل کی ہے۔ان میں، ہمیں بیکٹیریا، آثار قدیمہ اور وائرس سے ڈی این اے کے ٹکڑے ملے، جن میں وائرس بھی شامل ہیں جو عام طور پر ساحلی سمندری ماحولیاتی نظاموں میں پائے جانے والے متعدد میزبانوں کو متاثر کرتے ہیں۔آخر میں، ہمارا مطالعہ یہ ظاہر کرتا ہے کہ mussels پر لاگو LB کا تصور سمندری ساحلی ماحولیاتی نظام میں مائکروبیل تنوع کے بارے میں علم کا ایک بھرپور لیکن ابھی تک غیر دریافت شدہ ذریعہ کی نمائندگی کرتا ہے۔
سمندری ماحولیاتی نظام کی حیاتیاتی تنوع پر موسمیاتی تبدیلی (CC) کے اثرات تحقیق کا ایک تیزی سے بڑھتا ہوا علاقہ ہے۔گلوبل وارمنگ نہ صرف اہم جسمانی دباؤ کا باعث بنتی ہے بلکہ سمندری جانداروں کے تھرمل استحکام کی ارتقائی حدود کو بھی دھکیلتی ہے، جس سے متعدد انواع کے مسکن کو متاثر کیا جاتا ہے، اور انہیں مزید سازگار حالات کی تلاش پر آمادہ کیا جاتا ہے [1، 2]۔میٹازوئنز کی حیاتیاتی تنوع کو متاثر کرنے کے علاوہ، CC میزبان مائکروبیل تعاملات کے نازک توازن میں خلل ڈالتا ہے۔یہ مائکروبیل ڈس بیکٹیریوسس سمندری ماحولیاتی نظام کے لیے ایک سنگین خطرہ ہے کیونکہ یہ سمندری حیاتیات کو متعدی پیتھوجینز کے لیے زیادہ حساس بناتا ہے [3، 4]۔یہ خیال کیا جاتا ہے کہ ایس ایس بڑے پیمانے پر ہونے والی اموات میں ایک اہم کردار ادا کرتا ہے، جو کہ عالمی سمندری ماحولیاتی نظام کے انتظام کے لیے ایک سنگین مسئلہ ہے [5، 6]۔بہت سے سمندری انواع کے اقتصادی، ماحولیاتی اور غذائی اثرات کے پیش نظر یہ ایک اہم مسئلہ ہے۔یہ خاص طور پر قطبی خطوں میں رہنے والے دوائیوں کے لیے سچ ہے، جہاں CK کے اثرات زیادہ فوری اور شدید ہوتے ہیں [6, 7]۔درحقیقت، بائیوالس جیسے Mytilus spp.سمندری ماحولیاتی نظام پر CC کے اثرات کی نگرانی کے لیے وسیع پیمانے پر استعمال ہوتے ہیں۔حیرت کی بات نہیں، ان کی صحت کی نگرانی کے لیے نسبتاً بڑی تعداد میں بائیو مارکر تیار کیے گئے ہیں، اکثر انزیمیٹک سرگرمی یا سیلولر فنکشنز جیسے سیل وابستگی اور فاگوسائٹک سرگرمی پر مبنی دو درجے کے نقطہ نظر کا استعمال کرتے ہوئے [8]۔ان طریقوں میں مخصوص دباؤ کے اشارے کے ارتکاز کی پیمائش بھی شامل ہے جو سمندر کے پانی کی بڑی مقدار کو جذب کرنے کے بعد نرم بافتوں میں جمع ہوتے ہیں۔تاہم، ہائی فلٹریشن کی صلاحیت اور بائیوالز کا نیم کھلا گردشی نظام مائع بایپسی (LB) کے تصور کو استعمال کرتے ہوئے نئے ہیمولیمف بائیو مارکر تیار کرنے کا موقع فراہم کرتا ہے، جو کہ مریض کے انتظام کے لیے ایک سادہ اور کم سے کم حملہ آور طریقہ ہے۔خون کے نمونے [9، 10]۔اگرچہ انسانی LB میں کئی قسم کے گردش کرنے والے مالیکیولز پائے جا سکتے ہیں، لیکن یہ تصور بنیادی طور پر پلازما میں گردش کرنے والے ایکسٹرا سیلولر DNA (ccfDNA) کے ٹکڑوں کے DNA کی ترتیب کے تجزیہ پر مبنی ہے۔درحقیقت، انسانی پلازما میں گردش کرنے والے ڈی این اے کی موجودگی 20 ویں صدی کے وسط سے معلوم ہوتی ہے [11]، لیکن یہ صرف حالیہ برسوں میں ہی ہے کہ ہائی تھرو پٹ سیکوینسنگ طریقوں کی آمد نے ccfDNA کی بنیاد پر طبی تشخیص کی ہے۔ان گردش کرنے والے ڈی این اے کے ٹکڑوں کی موجودگی سیل کی موت کے بعد جینومک ڈی این اے (جوہری اور مائٹوکونڈریل) کی غیر فعال رہائی کی وجہ سے ہے۔ صحت مند افراد میں، ccfDNA کا ارتکاز عام طور پر کم ہوتا ہے (<10 ng/mL) لیکن مختلف پیتھالوجیز میں مبتلا یا تناؤ کا شکار مریضوں میں 5-10 گنا بڑھایا جا سکتا ہے، جس کے نتیجے میں ٹشو کو نقصان ہوتا ہے۔ صحت مند افراد میں، ccfDNA کا ارتکاز عام طور پر کم ہوتا ہے (<10 ng/mL) لیکن مختلف پیتھالوجیز میں مبتلا یا تناؤ کا شکار مریضوں میں 5-10 گنا بڑھایا جا سکتا ہے، جس کے نتیجے میں ٹشو کو نقصان ہوتا ہے۔ У здоровых людей концентрация вккДНК в норме низкая (<10 нг/мл)، но может повышаться в 5–10 раз у больный низкая ергающихся стрессу، приводящему к повреждению тканей. صحت مند لوگوں میں، cccDNA کا ارتکاز عام طور پر کم ہوتا ہے (<10 ng/mL)، لیکن یہ مختلف پیتھالوجیز یا تناؤ کے شکار مریضوں میں 5-10 گنا بڑھ سکتا ہے جو ٹشو کو نقصان پہنچاتا ہے۔在健康个体中，ccfDNA 的浓度通常较低（<10 ng/mL），但在患有各种病理或承受压力渂理或各种病理或承受压力渂从而导致组织损伤.在 健康 个体 中 ， ccfdna 的 浓度 较 低 （（<10 ng/ml） 但 在 各 种 病理 或 承受 兞叀叀承受 厗5-10 倍, 从而 组织.。 损伤 损伤 损伤 损伤 损伤 损伤 损伤 损伤 损伤Концентрации ccfDNA обычно низкие (<10 нг/мл) у здоровых людей, но могут быть увеличены в 5-10 раз у павцимантогимостомотогода или стрессом, что приводит к повреждению тканей. صحت مند افراد میں ccfDNA کا ارتکاز عام طور پر کم ہوتا ہے (<10 ng/ml) لیکن مختلف پیتھالوجیز یا تناؤ والے مریضوں میں 5-10 گنا بڑھایا جا سکتا ہے جس کے نتیجے میں بافتوں کو نقصان ہوتا ہے۔ccfDNA ٹکڑوں کا سائز وسیع پیمانے پر مختلف ہوتا ہے، لیکن عام طور پر 150 سے 200 bp تک ہوتا ہے۔[12]۔خود ماخوذ ccfDNA کا تجزیہ، یعنی، ccfDNA نارمل یا تبدیل شدہ میزبان خلیوں سے، جوہری اور/یا مائٹوکونڈریل جینوم میں موجود جینیاتی اور ایپی جینیٹک تبدیلیوں کا پتہ لگانے کے لیے استعمال کیا جا سکتا ہے، اس طرح معالجین کو مخصوص مالیکیولر ٹارگٹڈ علاج منتخب کرنے میں مدد ملتی ہے [13]۔تاہم، ccfDNA غیر ملکی ذرائع سے حاصل کیا جا سکتا ہے جیسے ccfDNA حمل کے دوران جنین کے خلیوں سے یا ٹرانسپلانٹ شدہ اعضاء [14,15,16,17] سے۔ccfDNA ایک متعدی ایجنٹ (غیر ملکی) کے نیوکلک ایسڈ کی موجودگی کا پتہ لگانے کے لیے معلومات کا ایک اہم ذریعہ بھی ہے، جو خون کی ثقافتوں کے ذریعے شناخت نہ ہونے والے وسیع پیمانے پر انفیکشنز کی غیر جارحانہ شناخت کی اجازت دیتا ہے، متاثرہ ٹشو کی ناگوار بایپسی سے گریز کرتا ہے [18]۔حالیہ مطالعات نے واقعی یہ ظاہر کیا ہے کہ انسانی خون میں معلومات کا ایک بھرپور ذریعہ ہوتا ہے جسے وائرل اور بیکٹیریل پیتھوجینز کی شناخت کے لیے استعمال کیا جا سکتا ہے، اور انسانی پلازما میں پائے جانے والے ccfDNA کا تقریباً 1% غیر ملکی ہے [19]۔یہ مطالعات یہ ظاہر کرتے ہیں کہ ایک حیاتیات کے گردش کرنے والے مائکرو بایوم کی حیاتیاتی تنوع کا اندازہ ccfDNA تجزیہ کے ذریعے کیا جا سکتا ہے۔تاہم، کچھ عرصہ پہلے تک، یہ تصور خاص طور پر انسانوں میں استعمال ہوتا تھا اور، کچھ حد تک، دوسرے فقاریوں میں [20، 21]۔
موجودہ مقالے میں، ہم ایل بی پوٹینشل کا استعمال Aulacomya atra کے ccfDNA کا تجزیہ کرنے کے لیے کرتے ہیں، ایک جنوبی انواع جو عام طور پر subantarctic Kerguelen جزائر میں پائی جاتی ہے، ایک بڑے سطح مرتفع کے اوپر جزائر کا ایک گروپ جو 35 ملین سال پہلے تشکیل پایا تھا۔آتش فشاں پھٹنا.ایک ان وٹرو تجرباتی نظام کا استعمال کرتے ہوئے، ہم نے پایا کہ سمندری پانی میں موجود ڈی این اے کے ٹکڑے جلدی سے مسلز لے جاتے ہیں اور ہیمولیمف کمپارٹمنٹ میں داخل ہو جاتے ہیں۔شاٹگن کی ترتیب سے یہ ظاہر ہوا ہے کہ mussel hemolymph ccfDNA میں DNA کے ٹکڑے اس کی اپنی اور غیر خود ساختہ ہیں، بشمول symbiotic بیکٹیریا اور DNA کے ٹکڑے سرد آتش فشاں سمندری ساحلی ماحولیاتی نظام کے مخصوص بائیومز سے۔Hemolymph ccfDNA میں مختلف میزبان رینج والے وائرسوں سے اخذ کردہ وائرل تسلسل بھی شامل ہیں۔ہمیں کثیر خلوی جانوروں سے بھی ڈی این اے کے ٹکڑے ملے جیسے کہ بونی مچھلی، سمندری انیمونز، طحالب اور حشرات۔آخر میں، ہمارا مطالعہ یہ ظاہر کرتا ہے کہ ایل بی کا تصور کامیابی کے ساتھ سمندری غیر فقاری جانوروں پر لاگو کیا جا سکتا ہے تاکہ سمندری ماحولیاتی نظام میں ایک بھرپور جینومک ذخیرہ تیار کیا جا سکے۔
بالغ (55-70 ملی میٹر لمبا) Mytilus platensis (M. platensis) اور Aulacomya atra (A. atra) پورٹ-او-فرانس (049°21.235 S, 070°13.490 E.) کے سمندری چٹانی ساحلوں سے جمع کیے گئے تھے۔کرگولین جزائر دسمبر 2018 میں۔ دیگر بالغ نیلے رنگ کے mussels (Mytilus spp.) ایک تجارتی سپلائر (PEI Mussel King Inc., Prince Edward Island, Canada) سے حاصل کیے گئے تھے اور درجہ حرارت پر قابو پانے والے (4°C) ہوا والے ٹینک میں رکھا گیا تھا جس میں 32‰ مصنوعی نمکین کا 10-20 L ہوتا ہے۔(مصنوعی سمندری نمک ریف کرسٹل، فوری اوقیانوس، ورجینیا، امریکہ)۔ہر تجربے کے لیے، انفرادی گولوں کی لمبائی اور وزن کی پیمائش کی گئی۔
اس پروگرام کے لیے ایک مفت اوپن ایکسیس پروٹوکول آن لائن دستیاب ہے (https://doi.org/10.17504/protocols.io.81wgb6z9olpk/v1)۔مختصراً، LB hemolymph اغوا کرنے والے پٹھوں سے جمع کیا گیا جیسا کہ بیان کیا گیا ہے [22]۔ہیمولیمف کو سنٹرفیوگریشن کے ذریعے 1200×g پر 3 منٹ کے لیے واضح کیا گیا تھا، سپرنٹنٹ کو استعمال تک منجمد (-20°C) کر دیا گیا تھا۔سی ایف ڈی این اے کو الگ تھلگ کرنے اور صاف کرنے کے لیے، مینوفیکچرر کی ہدایات کے مطابق نمونے (1.5-2.0 ملی لیٹر) کو نیوکلیو اسنیپ cfDNA کٹ (Macherey-Nagel، Bethlehen، PA) کا استعمال کرتے ہوئے پگھلا کر پروسیس کیا گیا۔مزید تجزیہ تک ccfDNA کو -80 ° C پر ذخیرہ کیا گیا تھا۔کچھ تجربات میں، ccfDNA کو QIAamp DNA Investigator Kit (QIAGEN، ٹورنٹو، اونٹاریو، کینیڈا) کا استعمال کرتے ہوئے الگ تھلگ اور پاک کیا گیا تھا۔پیوریفائیڈ ڈی این اے کو معیاری پیکو گرین پرکھ کا استعمال کرتے ہوئے مقدار درست کی گئی۔الگ تھلگ ccfDNA کے ٹکڑے کی تقسیم کا تجزیہ کیپلیری الیکٹروفورسس کے ذریعہ ایک Agilent 2100 bioanalyzer (Agilent Technologies Inc.، Santa Clara, CA) کے ذریعے ایک اعلی حساسیت DNA کٹ کا استعمال کرتے ہوئے کیا گیا۔پرکھ کارخانہ دار کی ہدایات کے مطابق ccfDNA نمونے کے 1 µl کا استعمال کرتے ہوئے کی گئی تھی۔
ہیمولیمف ccfDNA کے ٹکڑوں کی ترتیب کے لیے، Génome Québec (Montreal, Quebec, Canada) نے Illumina MiSeq PE75 کٹ کی Illumina DNA مکس کٹ کا استعمال کرتے ہوئے شاٹگن لائبریریاں تیار کیں۔ایک معیاری اڈاپٹر (BioO) استعمال کیا گیا تھا۔خام ڈیٹا فائلیں NCBI Sequence Read Archive (SRR8924808 اور SRR8924809) سے دستیاب ہیں۔FastQC کا استعمال کرتے ہوئے بنیادی پڑھنے کے معیار کا اندازہ لگایا گیا [23]۔Trimmomatic [24] کلپنگ اڈاپٹر اور خراب معیار کے پڑھنے کے لئے استعمال کیا گیا ہے.جوڑے والے سروں کے ساتھ شاٹگن ریڈز کو FLASH کو لمبے سنگل ریڈز میں ضم کر دیا گیا تھا جس میں کم از کم 20 bp کے اوورلیپ کے ساتھ مماثلت نہیں تھی [25]۔ ضم شدہ ریڈز کو BLASTN کے ساتھ ایک bivalve NCBI Taxonomy ڈیٹا بیس (e value <1e−3 اور 90% homology) کا استعمال کرتے ہوئے تشریح کی گئی تھی، اور DUST [26] کا استعمال کرتے ہوئے کم پیچیدگی کے سلسلے کی ماسکنگ کی گئی تھی۔ ضم شدہ ریڈز کو BLASTN کے ساتھ ایک bivalve NCBI Taxonomy ڈیٹا بیس (e value <1e−3 اور 90% homology) کا استعمال کرتے ہوئے تشریح کی گئی تھی، اور DUST [26] کا استعمال کرتے ہوئے کم پیچیدگی کے سلسلے کی ماسکنگ کی گئی تھی۔ Объединенные чтения были аннотированы с помощью BLASTN с использованием базы данных таксономии двустворчатевых اور 90% гомологии), а маскирование последовательностей низкой сложности было выполнено с использованием DUST [26]۔ پولڈ ریڈز کو BLASTN کے ساتھ NCBI bivalve ٹیکونومی ڈیٹا بیس (e value <1e-3 اور 90% homology) کا استعمال کرتے ہوئے تشریح کیا گیا تھا، اور DUST [26] کا استعمال کرتے ہوئے کم پیچیدگی کی ترتیب ماسکنگ کی گئی تھی۔使用双壳类NCBI 分类数据库（e 值< 1e-3 和90% 同源性）用BLASTN 注释合并的读俶释合并的读俶释合并的读俶]复杂度序列的掩蔽.使用 双 壳类 ncbi 分类 （（（<1e-3 和 90% 同源） 用 用 注释 合并 读湰 茡类复杂度 序列 的..。 掩蔽掩蔽Объединенные чтения были аннотированы с помощью BLASTN с использованием таксономической базы данных были -3 اور 90% гомологии), а маскирование последовательностей низкой сложности было выполнено с использованием DUST [26]۔ پولڈ ریڈز کو NCBI bivalve ٹیکونومک ڈیٹا بیس (e value <1e-3 اور 90% homology) کا استعمال کرتے ہوئے BLASTN کے ساتھ تشریح کیا گیا تھا، اور DUST [26] کا استعمال کرتے ہوئے کم پیچیدگی کی ترتیب ماسکنگ کی گئی تھی۔ریڈز کو دو گروپوں میں تقسیم کیا گیا تھا: بائیوالو تسلسل سے متعلق (یہاں خود پڑھنا کہا جاتا ہے) اور غیر متعلقہ (غیر خود پڑھنا)۔کونٹیگس پیدا کرنے کے لئے میگاہٹ کا استعمال کرتے ہوئے دو گروپوں کو الگ الگ جمع کیا گیا تھا [27]۔دریں اثنا، اجنبی مائکرو بایوم ریڈز کی درجہ بندی کی درجہ بندی کریکن 2 کا استعمال کرتے ہوئے کی گئی تھی [28] اور تصویری طور پر گلیکسی [29، 30] پر کرونا پائی چارٹ کے ذریعے نمائندگی کی گئی تھی۔ہمارے ابتدائی تجربات سے زیادہ سے زیادہ kmers-59 ہونے کا عزم کیا گیا تھا۔ اس کے بعد حتمی تشریح کے لیے BLASTN (bivalve NCBI ڈیٹا بیس، e قدر <1e−10 اور 60% homology) کے ساتھ صف بندی کے ذریعے سیلف کنٹیگز کی شناخت کی گئی۔ اس کے بعد حتمی تشریح کے لیے BLASTN (bivalve NCBI ڈیٹا بیس، e قدر <1e−10 اور 60% homology) کے ساتھ صف بندی کے ذریعے سیلف کنٹیگز کی شناخت کی گئی۔ Затем собственные контиги были идентифицированы путем сопоставления с BLASTN (база данных двустворчатых , e омология 60%) для окончательной аннотации. اس کے بعد حتمی تشریح کے لیے BLASTN (NCBI bivalve ڈیٹا بیس، e قدر <1e-10 اور 60% homology) کے ساتھ ملاپ کے ذریعے سیلف کنٹیگز کی شناخت کی گئی۔然后通过与BLASTN（双壳贝类NCBI 数据库，e 值< 1e-10终注释.然后通过与BLASTN（双壳贝类NCBI 数据库，e 值<1e-10 和60% Затем были идентифицированы собственные контиги для окончательной аннотации путем сопоставления с BLASTN (bazat моллюсков, значение e <1e-10 и гомология 60%)۔ اس کے بعد BLASTN (NCBI bivalve ڈیٹا بیس، e ویلیو <1e-10 اور 60% homology) کے خلاف میچ کرکے حتمی تشریح کے لیے سیلف کنٹیگس کی شناخت کی گئی۔ متوازی طور پر، بلاسٹن (nt NCBI ڈیٹا بیس، e قدر <1e−10 اور 60% homology) کے ساتھ نون سیلف گروپ کنٹیگس کی تشریح کی گئی۔ متوازی طور پر، بلاسٹن (nt NCBI ڈیٹا بیس، e قدر <1e−10 اور 60% homology) کے ساتھ نون سیلف گروپ کنٹیگس کی تشریح کی گئی۔ Параллельно чужеродные групповые контиги были аннотированы с помощью BLASTN (база данных nt NCBI، значение e <1e-10 %06могоим) متوازی طور پر، غیر ملکی گروپ کنٹیگس کو BLASTN (NT NCBI ڈیٹا بیس، e قدر <1e-10 اور 60% homology) کے ساتھ تشریح کیا گیا تھا۔平行地，用BLASTN（nt NCBI 数据库，e 值< 1e-10 和60% 同源性）注释非自身组重叠群.平行地，用BLASTN（nt NCBI 数据库，e 值< 1e-10 和60% 同源性）注释非自身组重叠群. Параллельно контиги, не относящиеся к собственной группе, были аннотированы с помощью BLASTN (база данных nt NCBI, 60%)۔ متوازی طور پر، نان سیلف گروپ کنٹیگس کو BLASTN (nt NCBI ڈیٹا بیس، e ویلیو <1e-10 اور 60% ہومولوجی) کے ساتھ بیان کیا گیا تھا۔ BLASTX کو nr اور RefSeq پروٹین NCBI ڈیٹا بیس (e قدر <1e−10 اور 60% homology) کا استعمال کرتے ہوئے نون سیلف کانٹیگس پر بھی کیا گیا تھا۔ BLASTX کو nr اور RefSeq پروٹین NCBI ڈیٹا بیس (e قدر <1e−10 اور 60% homology) کا استعمال کرتے ہوئے نون سیلف کانٹیگس پر بھی کیا گیا تھا۔ BLASTX TACKJе был проведен на несамостоятельных контигах с использованием баз данных белка nr и RefSeq NCBI (<%1-e BLASTX کو nr اور RefSeq NCBI پروٹین ڈیٹا بیس (e value <1e-10 اور 60% homology) کا استعمال کرتے ہوئے نان سیلف کنٹیگس پر بھی کیا گیا تھا۔还使用nr 和RefSeq 蛋白NCBI 数据库对非自身重叠群进行了BLASTX（e 值< 1e-10 和60%.还使用nr 和RefSeq 蛋白NCBI 数据库对非自身重叠群进行了BLASTX（e 值< 1e-10 和60%. BLASTX также выполняли на несамостоятельных контигах с использованием баз данных белка nr и RefSeq NCBI BLASTX کو nr اور RefSeq NCBI پروٹین ڈیٹا بیس (e ویلیو <1e-10 اور 60% homology) کا استعمال کرتے ہوئے نان سیلف کنٹیگس پر بھی انجام دیا گیا تھا۔نان سیلف کونٹیگس کے BLASTN اور BLASTX پولز حتمی contigs کی نمائندگی کرتے ہیں (ضمنی فائل دیکھیں)۔
پی سی آر کے لیے استعمال ہونے والے پرائمر ٹیبل S1 میں درج ہیں۔Taq DNA پولیمریز (Bio Basic Canada, Markham, ON) کا استعمال ccfDNA ٹارگٹ جینز کو بڑھانے کے لیے کیا گیا تھا۔مندرجہ ذیل رد عمل کی شرائط استعمال کی گئیں: 3 منٹ کے لیے 95 ° C پر ڈینیچریشن، 1 منٹ کے لیے 95 ° C، 1 منٹ کے لیے اینیلنگ کا درجہ حرارت مقرر کریں، 1 منٹ کے لیے 72 ° C پر لمبا ہونا، 35 سائیکل، اور آخر میں 10 منٹ کے اندر اندر 72 ° C۔.PCR مصنوعات کو الیکٹروفورسس کے ذریعے ایگروز جیل (1.5%) میں الگ کیا گیا تھا جس میں SYBRTM سیف ڈی این اے جیل اسٹین (انویٹروجن، برلنگٹن، آن، کینیڈا) 95 V پر تھا۔
Mussels (Mytilus spp.) کو 500 ملی لیٹر آکسیجن والے سمندری پانی (32 PSU) میں 24 گھنٹے کے لیے 4 ° C پر رکھا گیا تھا۔پلاسمڈ ڈی این اے جس میں ہیومن گیلیکٹن-7 سی ڈی این اے سیکوینس (NCBI الحاق نمبر L07769) کو انکوڈنگ کرنے والا ایک انسرٹ شامل کیا گیا تھا اسے شیشی میں 190 μg/μl کی حتمی حراستی میں شامل کیا گیا تھا۔ڈی این اے کے اضافے کے بغیر انہی حالات میں انکیوبیٹ شدہ مسلز کنٹرول تھے۔تیسرا کنٹرول ٹینک بغیر پٹیوں کے ڈی این اے پر مشتمل تھا۔سمندری پانی میں ڈی این اے کے معیار کی نگرانی کے لیے ہر ٹینک سے سمندری پانی کے نمونے (20 μl؛ تین تکرار) لیے گئے تھے۔پلاسمڈ ڈی این اے ٹریس ایبلٹی کے لئے، ایل بی مسلز کو اشارے کے اوقات میں کاٹا گیا اور کیو پی سی آر اور ڈی ڈی پی سی آر کے ذریعہ تجزیہ کیا گیا۔سمندری پانی میں نمک کی مقدار زیادہ ہونے کی وجہ سے، تمام پی سی آر اسسیس سے پہلے پی سی آر کوالٹی پانی (1:10) میں ایلی کوٹس کو پتلا کر دیا گیا تھا۔
ڈیجیٹل ڈراپلیٹ PCR (ddPCR) BioRad QX200 پروٹوکول (Mississauga, Ontario, Canada) کا استعمال کرتے ہوئے انجام دیا گیا۔زیادہ سے زیادہ درجہ حرارت کا تعین کرنے کے لیے درجہ حرارت کا پروفائل استعمال کریں (ٹیبل S1)۔قطرے QX200 ڈراپ جنریٹر (BioRad) کا استعمال کرتے ہوئے تیار کیے گئے تھے۔ddPCR کو اس طرح انجام دیا گیا: 5 منٹ کے لیے 95 ° C، 30 s کے لیے 95 ° C کے 50 چکر اور 1 منٹ کے لیے دیا گیا اینیلنگ درجہ حرارت اور 30 ​​s کے لیے 72 ° C، 5 منٹ کے لیے 4 ° C اور 5 منٹ کے اندر اندر 90 ° C۔قطروں کی تعداد اور مثبت رد عمل (کاپیوں کی تعداد/µl) کی پیمائش QX200 ڈراپ ریڈر (BioRad) کے ذریعے کی گئی۔10,000 سے کم بوندوں والے نمونے مسترد کر دیے گئے۔جب بھی ddPCR چلایا جاتا تھا پیٹرن کنٹرول نہیں کیا جاتا تھا۔
qPCR کو Rotor-Gene® 3000 (Corbett Research, Sydney, Australia) اور LGALS7 مخصوص پرائمر کا استعمال کرتے ہوئے انجام دیا گیا۔تمام مقداری PCRs کوانٹی فاسٹ SYBR گرین پی سی آر کٹ (QIAGEN) کا استعمال کرتے ہوئے 20 μl میں انجام دیا گیا تھا۔کیو پی سی آر کا آغاز 95 ° C پر 15 منٹ کے انکیوبیشن کے ساتھ کیا گیا تھا جس کے بعد 40 سائیکل 95 ° C پر 10 سیکنڈ اور 60 ° C پر 60 سیکنڈ کے لیے ایک ڈیٹا اکٹھا کیا گیا تھا۔پگھلنے کے منحنی خطوط 5 s کے لیے 95 ° C، 60 s کے لیے 65 ° C، اور qPCR کے آخر میں 97 ° C پر یکے بعد دیگرے پیمائش کا استعمال کرتے ہوئے پیدا کیے گئے۔کنٹرول کے نمونوں کے علاوہ ہر کیو پی سی آر کو سہ رخی میں انجام دیا گیا تھا۔
چونکہ mussels ان کی اعلی فلٹریشن کی شرح کے لئے جانا جاتا ہے، ہم نے پہلے تحقیق کی کہ آیا وہ سمندری پانی میں موجود ڈی این اے کے ٹکڑوں کو فلٹر اور برقرار رکھ سکتے ہیں۔ہم اس میں بھی دلچسپی رکھتے تھے کہ آیا یہ ٹکڑے ان کے نیم کھلے لیمفیٹک نظام میں جمع ہوتے ہیں۔ہم نے اس مسئلے کو تجرباتی طور پر حل کرنے والے ڈی این اے کے ٹکڑوں کی قسمت کا پتہ لگا کر حل کیا جو نیلے رنگ کے مسل ٹینک میں شامل کیے گئے تھے۔ڈی این اے کے ٹکڑوں سے باخبر رہنے کی سہولت کے لیے، ہم نے غیر ملکی (خود نہیں) پلاسمڈ ڈی این اے کا استعمال کیا جس میں انسانی گیلیکٹن 7 جین ہوتا ہے۔ڈی ڈی پی سی آر سمندری پانی اور مسلز میں پلاسمڈ ڈی این اے کے ٹکڑوں کا سراغ لگاتا ہے۔ہمارے نتائج سے پتہ چلتا ہے کہ اگر سمندری پانی میں ڈی این اے کے ٹکڑوں کی مقدار وقت کے ساتھ ساتھ (7 دن تک) mussels کی غیر موجودگی میں نسبتاً مستحکم رہی، تو mussels کی موجودگی میں یہ سطح تقریباً 8 گھنٹے کے اندر تقریباً ختم ہو جاتی ہے (تصویر 1a،b)۔خارجی ڈی این اے کے ٹکڑوں کا آسانی سے 15 منٹ کے اندر اندر انٹراوالولر سیال اور ہیمولیمف (تصویر 1 سی) میں پتہ چلا۔ان ٹکڑوں کو نمائش کے بعد بھی 4 گھنٹے تک دریافت کیا جا سکتا ہے۔ڈی این اے کے ٹکڑوں کے حوالے سے یہ فلٹرنگ سرگرمی بیکٹیریا اور طحالب کی فلٹرنگ سرگرمی سے موازنہ ہے [31]۔یہ نتائج بتاتے ہیں کہ mussels فلٹر کر سکتے ہیں اور اپنے سیال کے حصوں میں غیر ملکی DNA جمع کر سکتے ہیں۔
سمندری پانی میں پلاسمڈ DNA کی نسبتی ارتکاز (A) یا مسلز کی غیر موجودگی (B) میں، جس کی پیمائش ddPCR سے ہوتی ہے۔A میں، نتائج کو فیصد کے طور پر ظاہر کیا جاتا ہے، جس میں بکس کی سرحدیں 75ویں اور 25ویں فیصد کی نمائندگی کرتی ہیں۔لگے ہوئے لوگارتھمک وکر کو سرخ رنگ میں دکھایا گیا ہے، اور بھوری رنگ میں سایہ دار علاقہ 95% اعتماد کے وقفے کی نمائندگی کرتا ہے۔B میں، سرخ لکیر وسط کی نمائندگی کرتی ہے اور نیلی لکیر ارتکاز کے لیے 95% اعتماد کے وقفے کی نمائندگی کرتی ہے۔C پلازمڈ ڈی این اے کے اضافے کے بعد مختلف اوقات میں مسلز کے ہیمولیمف اور والوولر سیال میں پلازمڈ ڈی این اے کا جمع ہونا۔نتائج کا پتہ چلا مکمل کاپیاں/mL (±SE) کے طور پر پیش کیا جاتا ہے۔
اس کے بعد، ہم نے کیرگولین جزائر پر mussels کے بستروں سے جمع شدہ mussels میں ccfDNA کی اصل کی تحقیقات کی، جو جزیروں کا ایک دور دراز گروپ ہے جس کا انسانی اثر محدود ہے۔اس مقصد کے لیے، mussel hemolymphs سے cccDNA کو ان طریقوں سے الگ تھلگ اور پاک کیا گیا تھا جو عام طور پر انسانی cccDNA کو پاک کرنے کے لیے استعمال ہوتے ہیں [32، 33]۔ہم نے پایا کہ مسلز میں اوسط ہیمولیمف ccfDNA ارتکاز کم مائکروگرامس فی ملی لیٹر ہیمولیمف رینج میں ہے (ٹیبل S2، ضمنی معلومات دیکھیں)۔ارتکاز کی یہ حد صحت مند لوگوں کے مقابلے میں بہت زیادہ ہے (کم نینوگرام فی ملی لیٹر)، لیکن غیر معمولی معاملات میں، کینسر کے مریضوں میں، ccfDNA کی سطح کئی مائیکروگرام فی ملی لیٹر تک پہنچ سکتی ہے [34, 35]۔ہیمولیمف ccfDNA کے سائز کی تقسیم کے تجزیہ سے پتہ چلتا ہے کہ یہ ٹکڑے سائز میں بہت مختلف ہوتے ہیں، 1000 bp سے 1000 bp تک۔5000 bp تک (تصویر 2)۔اسی طرح کے نتائج سلیکا پر مبنی QIAamp انویسٹی گیٹر کٹ کا استعمال کرتے ہوئے حاصل کیے گئے، یہ طریقہ عام طور پر فرانزک سائنس میں استعمال کیا جاتا ہے تاکہ کم ارتکاز والے DNA کے نمونوں سے جینومک DNA کو تیزی سے الگ اور صاف کیا جا سکے، بشمول ccfDNA [36]۔
نمائندہ سی سی ایف ڈی این اے الیکٹروفورگرام مسل ہیمولیمف۔نیوکلیو اسنیپ پلازما کٹ (اوپر) اور QIAamp DNA تفتیشی کٹ کے ساتھ نکالا گیا۔بی وائلن پلاٹ جس میں مسلز میں ہیمولیمف ccfDNA ارتکاز (±SE) کی تقسیم دکھائی جاتی ہے۔سیاہ اور سرخ لکیریں بالترتیب میڈین اور پہلے اور تیسرے چوتھائی کی نمائندگی کرتی ہیں۔
انسانوں اور پریمیٹ میں تقریبا 1٪ ccfDNA کا غیر ملکی ذریعہ ہے [21، 37]۔بائیوالز کے نیم کھلے گردشی نظام، مائکروبیل سے بھرپور سمندری پانی، اور mussel ccfDNA کے سائز کی تقسیم کو دیکھتے ہوئے، ہم نے یہ قیاس کیا کہ mussel hemolymph ccfDNA میں مائکروبیل DNA کا ایک بھرپور اور متنوع پول ہو سکتا ہے۔اس مفروضے کو جانچنے کے لیے، ہم نے کرگولین جزائر سے اکٹھے کیے گئے Aulacomya atra کے نمونوں سے hemolymph ccfDNA کو ترتیب دیا، جس سے 10 ملین سے زیادہ پڑھے گئے، جن میں سے 97.6 فیصد نے کوالٹی کنٹرول پاس کیا۔اس کے بعد ریڈنگز کو BLASTN اور NCBI بائیوالو ڈیٹا بیس (تصویر S1، ضمنی معلومات) کا استعمال کرتے ہوئے خود اور غیر خود ذرائع کے مطابق درجہ بندی کیا گیا۔
انسانوں میں، نیوکلیئر اور مائٹوکونڈریل ڈی این اے دونوں کو خون کے دھارے میں چھوڑا جا سکتا ہے [38]۔تاہم، موجودہ مطالعے میں، مسلز کے جوہری جینومک ڈی این اے کو تفصیل سے بیان کرنا ممکن نہیں تھا، اس لیے کہ A. ایٹرا جینوم کو ترتیب یا بیان نہیں کیا گیا ہے۔تاہم، ہم بائیوالو لائبریری (تصویر S2، ضمنی معلومات) کا استعمال کرتے ہوئے اپنی اصلیت کے متعدد ccfDNA ٹکڑوں کی شناخت کرنے میں کامیاب رہے۔ہم نے اپنی اصل کے ڈی این اے کے ٹکڑوں کی موجودگی کی تصدیق بھی ان A. ایٹرا جینوں کی ہدایت کردہ پی سی آر ایمپلیفیکیشن کے ذریعے کی ہے جو ترتیب وار تھے (تصویر 3)۔اسی طرح، یہ دیکھتے ہوئے کہ A. atra کا mitochondrial جینوم عوامی ڈیٹا بیس میں دستیاب ہے، A. atra کے hemolymph میں mitochondrial ccfDNA کے ٹکڑوں کی موجودگی کا ثبوت مل سکتا ہے۔مائٹوکونڈریل ڈی این اے کے ٹکڑوں کی موجودگی کی تصدیق پی سی آر ایمپلیفیکیشن (تصویر 3) سے ہوئی۔
A. atra (سرخ نقطے - اسٹاک نمبر: SRX5705969) اور M. platensis (نیلا نقطے - اسٹاک نمبر: SRX5705968) کے ہیمولیمف میں مختلف مائٹوکونڈریل جینز PCR کے ذریعے بڑھائے گئے تھے۔Breton et al.، 2011 B A. Atra سے FTA پیپر پر ذخیرہ شدہ ہیمولیمف سپرناٹینٹ کی افزائش سے اخذ کردہ شکل۔پی سی آر مکس والی پی سی آر ٹیوب میں براہ راست شامل کرنے کے لیے 3 ملی میٹر کا پنچ استعمال کریں۔
سمندری پانی میں وافر مائکروبیل مواد کو دیکھتے ہوئے، ہم نے ابتدائی طور پر ہیمولیمف میں مائکروبیل ڈی این اے کی ترتیب کی خصوصیات پر توجہ مرکوز کی۔ایسا کرنے کے لیے، ہم دو مختلف حکمت عملی استعمال کرتے ہیں۔پہلی حکمت عملی میں Kraken2 کا استعمال کیا گیا، ایک الگورتھم پر مبنی ترتیب کی درجہ بندی کا پروگرام جو BLAST اور دیگر ٹولز کے مقابلے میں درستگی کے ساتھ مائکروبیل ترتیبوں کی شناخت کر سکتا ہے [28]۔6719 سے زیادہ ریڈز بیکٹیریل ہونے کا تعین کیا گیا، جب کہ 124 اور 64 بالترتیب آثار قدیمہ اور وائرس سے تھے (تصویر 4)۔سب سے زیادہ پائے جانے والے بیکٹیریل ڈی این اے کے ٹکڑے فرمیکیٹس (46%)، پروٹو بیکٹیریا (27%)، اور بیکٹیرائڈائٹس (17%) (تصویر 4a) تھے۔یہ تقسیم میرین بلیو mussel microbiome [39، 40] کے پچھلے مطالعات کے مطابق ہے۔گاما پروٹو بیکٹیریا پروٹوبیکٹیریا (44%) کی مرکزی کلاس تھی، جس میں بہت سے وائبرونیلز (تصویر 4b) شامل ہیں۔ddPCR طریقہ نے A. atra hemolymph (Fig. 4c) [41] کے ccfDNA میں Vibrio DNA کے ٹکڑوں کی موجودگی کی تصدیق کی۔ccfDNA کے بیکٹیریا کی اصل کے بارے میں مزید معلومات حاصل کرنے کے لیے، ایک اضافی طریقہ اختیار کیا گیا (تصویر S2، ضمنی معلومات)۔ اس صورت میں، وہ ریڈز جو اوورلیپڈ کو پیئر اینڈ ریڈز کے طور پر جمع کیا گیا تھا اور BLASTN اور 1e−3 کی e قدر اور >90% homology کے ساتھ کٹ آف کا استعمال کرتے ہوئے خود (bivalves) یا nonself origin کے طور پر درجہ بندی کی گئی تھی۔ اس صورت میں، وہ ریڈز جو اوورلیپڈ کو پیئر اینڈ ریڈز کے طور پر جمع کیا گیا تھا اور BLASTN اور 1e−3 کی e قدر اور >90% homology کے ساتھ کٹ آف کا استعمال کرتے ہوئے خود (bivalves) یا nonself origin کے طور پر درجہ بندی کی گئی تھی۔ В этом случае перекрывающиеся чтения были собраны как чтения с парными концами и были классифицированы как собраны как собраны ски) или чужие по происхождению с использованием BLASTN и значения e 1e-3 и отсечения с гомологией> 90%۔ اس معاملے میں، اوورلیپنگ ریڈز کو جوڑا ختم شدہ ریڈز کے طور پر جمع کیا گیا تھا اور BLASTN اور 1e-3 کی e ویلیو کا استعمال کرتے ہوئے مقامی (bivalve) یا غیر اصلی کے طور پر درجہ بندی کیا گیا تھا اور >90% homology کے ساتھ کٹ آف کیا گیا تھا۔在这种情况下，重叠的读数组装为配对末端读数，并使用BLASTN 和1e-3 的e 值和>90% 吪吀为自身（双壳类）或非自身来源.在 这 种 情况 下 ， 重叠 读数 组装 为 配 末端 读数 ， 使用 的 使用 的 使用 使用 和1和 和1 使用 بلاسٹ源性 的 分类 自身 （双 壳类） 非 自身。 .. . . . . В этом случае перекрывающиеся чтения были собраны как чтения с парными концами и классифицированы как собствения или несобственные по происхождению с использованием значений e BLASTN и 1e-3 اور порога гомологии> 90%۔ اس معاملے میں، اوورلیپنگ ریڈز کو پیئرڈ اینڈ ریڈز کے طور پر اکٹھا کیا گیا اور e BLASTN اور 1e-3 اقدار اور ہومولوجی تھریشولڈ>90% کا استعمال کرتے ہوئے اپنے (bivalves) یا غیر اصلی کے طور پر درجہ بندی کی گئی۔چونکہ اے ایٹرا جینوم کو ابھی تک ترتیب نہیں دیا گیا ہے، اس لیے ہم نے میگاہٹ نیکسٹ جنریشن سیکوینسنگ (این جی ایس) اسمبلر کی ڈی نوو اسمبلی حکمت عملی کا استعمال کیا۔مجموعی طور پر 147,188 کانٹیگس کی شناخت اصل کے منحصر (bivalves) کے طور پر کی گئی ہے۔اس کے بعد BLASTN اور BLASTX کا استعمال کرتے ہوئے 1e-10 کی ای-ویلیوز کے ساتھ یہ کونٹیگز پھٹ گئے۔اس حکمت عملی نے ہمیں A. atra ccfDNA میں موجود 482 نان بائلو ٹکڑوں کی شناخت کرنے کی اجازت دی۔ان ڈی این اے کے نصف سے زیادہ (57%) ٹکڑے بیکٹیریا سے حاصل کیے گئے تھے، خاص طور پر گل کی علامتوں سے، بشمول سلفوٹروفک سمبیونٹس، اور گل سمبیونٹس سولیمیا ویلم (تصویر 5) سے۔
قسم کی سطح پر رشتہ دار کثرت۔B دو اہم فائیلا (Firmicutes اور Proteobacteria) کا مائکروبیل تنوع۔ڈی ڈی پی سی آر سی وبریو ایس پی پی کی نمائندہ پرورش۔A. 16S rRNA جین (نیلے) کے تین ایٹرا ہیمولیمفس میں ٹکڑے۔
مجموعی طور پر 482 جمع شدہ کانٹیگز کا تجزیہ کیا گیا۔میٹجینومک کانٹیگ تشریحات (پروکیریٹس اور یوکرائٹس) کی ٹیکسونومک تقسیم کا عمومی پروفائل۔B BLASTN اور BLASTX کے ذریعے شناخت شدہ بیکٹیریل DNA کے ٹکڑوں کی تفصیلی تقسیم۔
کریکن 2 کے تجزیے نے یہ بھی ظاہر کیا کہ mussel ccfDNA میں قدیم ڈی این اے کے ٹکڑے شامل ہیں، بشمول یوریارچیوٹا (65%)، کرینارچیوٹا (24%)، اور تھورمارچیوٹا (11%) (تصویر 6a) کے ڈی این اے کے ٹکڑے۔Euryarchaeota اور Crenarchaeota سے اخذ کردہ DNA کے ٹکڑوں کی موجودگی، جو پہلے کیلیفورنیا کے mussels کی مائکروبیل کمیونٹی میں پائی جاتی تھی، حیرانی کی بات نہیں ہونی چاہیے [42]۔اگرچہ Euryarchaeota اکثر انتہائی حالات سے منسلک ہوتا ہے، لیکن اب یہ تسلیم کیا گیا ہے کہ Euryarchaeota اور Crenarcheota دونوں سمندری کرائیوجینک ماحول میں سب سے زیادہ عام پروکیریٹس میں سے ہیں [43، 44]۔کیرگولین سطح مرتفع [45] پر نچلے حصے سے میتھین کے اخراج کی حالیہ رپورٹوں اور جزائر کیرگولین کے ساحل پر ممکنہ مائکروبیل میتھین کی پیداوار کا مشاہدہ کرتے ہوئے، mussels میں میتھانوجینک مائکروجنزموں کی موجودگی حیران کن نہیں ہے [46]۔
اس کے بعد ہماری توجہ ڈی این اے وائرس سے پڑھنے کی طرف مبذول ہو گئی۔ہمارے بہترین علم کے مطابق، یہ mussels کے وائرس کے مواد کا پہلا آف ٹارگٹ مطالعہ ہے۔جیسا کہ توقع کی گئی تھی، ہمیں بیکٹیریوفیجز (Caudovirales) (تصویر 6b) کے ڈی این اے کے ٹکڑے ملے۔تاہم، سب سے عام وائرل ڈی این اے نیوکلیو سائیٹو وائرسز کے فیلم سے آتا ہے، جسے نیوکلیئر سائٹوپلاسمک لارج ڈی این اے وائرس (NCLDV) بھی کہا جاتا ہے، جس میں کسی بھی وائرس کا سب سے بڑا جینوم ہوتا ہے۔اس فیلم کے اندر، ڈی این اے کی زیادہ تر ترتیب خاندانوں Mimimidoviridae (58%) اور Poxviridae (21%) سے تعلق رکھتی ہے، جن کے قدرتی میزبانوں میں کشیرکا جانور اور آرتھروپوڈ شامل ہیں، جبکہ ان DNA کی ترتیب کا ایک چھوٹا سا حصہ معروف وائرولوجیکل الجی سے تعلق رکھتا ہے۔سمندری یوکرائیوٹک طحالب کو متاثر کرتا ہے۔یہ ترتیب پنڈورا وائرس سے بھی حاصل کی گئی تھی، یہ دیو ہیکل وائرس جس میں کسی بھی معروف وائرل نسل سے بڑا جینوم سائز ہوتا ہے۔دلچسپ بات یہ ہے کہ وائرس سے متاثر ہونے والے میزبانوں کی حد، جیسا کہ hemolymph ccfDNA کی ترتیب سے طے ہوتا ہے، نسبتاً بڑا تھا (شکل S3، ضمنی معلومات)۔اس میں وہ وائرس شامل ہیں جو کیڑے مکوڑوں کو متاثر کرتے ہیں جیسے Baculoviridae اور Iridoviridae، نیز وہ وائرس جو امیبا، طحالب اور کشیرکا کو متاثر کرتے ہیں۔ہمیں Pithovirus sibericum genome سے ملنے والی ترتیب بھی ملی۔Pitoviruses (جنہیں "زومبی وائرس" بھی کہا جاتا ہے) سب سے پہلے سائبیریا میں 30,000 سال پرانے پرما فراسٹ سے الگ تھلگ کیا گیا تھا [47]۔اس طرح، ہمارے نتائج پچھلی رپورٹوں سے مطابقت رکھتے ہیں جو یہ ظاہر کرتے ہیں کہ ان وائرسوں کی تمام جدید نسلیں ناپید نہیں ہیں [48] اور یہ کہ یہ وائرس دور دراز کے سبارکٹک سمندری ماحولیاتی نظام میں موجود ہو سکتے ہیں۔
آخر میں، ہم نے یہ دیکھنے کے لیے جانچ کی کہ کیا ہم دوسرے کثیر خلوی جانوروں سے ڈی این اے کے ٹکڑے تلاش کر سکتے ہیں۔BLASTN اور BLASTX نے nt, nr اور RefSeq لائبریریوں (جینومک اور پروٹین) کے ساتھ کل 482 غیر ملکی کنٹیگس کی شناخت کی۔ہمارے نتائج سے پتہ چلتا ہے کہ کثیر خلوی جانوروں کے ccfDNA کے غیر ملکی ٹکڑوں میں بونی ہڈیوں کا DNA غالب ہے (تصویر 5)۔کیڑوں اور دیگر انواع سے ڈی این اے کے ٹکڑے بھی ملے ہیں۔ڈی این اے کے ٹکڑوں کے نسبتاً بڑے حصے کی شناخت نہیں ہوسکی ہے، ممکنہ طور پر زمینی پرجاتیوں کے مقابلے جینومک ڈیٹا بیس میں سمندری پرجاتیوں کی ایک بڑی تعداد کی کم نمائندگی کی وجہ سے [49]۔
موجودہ مقالے میں، ہم ایل بی کے تصور کو مسلز پر لاگو کرتے ہیں، یہ دلیل دیتے ہوئے کہ ہیمولیمف سی سی ایف ڈی این اے شاٹ سیکوینسنگ سمندری ساحلی ماحولیاتی نظام کی ساخت کے بارے میں بصیرت فراہم کر سکتی ہے۔خاص طور پر، ہم نے پایا کہ 1) mussel hemolymph میں نسبتاً زیادہ ارتکاز (مائکروگرام کی سطح) نسبتاً بڑے (~1-5 kb) گردش کرنے والے DNA کے ٹکڑے ہوتے ہیں۔2) یہ ڈی این اے کے ٹکڑے آزاد اور غیر آزاد دونوں ہیں 3) ان ڈی این اے کے ٹکڑوں کے غیر ملکی ذرائع میں، ہم نے بیکٹیریل، آرکیئل اور وائرل ڈی این اے کے ساتھ ساتھ دوسرے کثیر خلوی جانوروں کا ڈی این اے پایا۔4) ہیمولیمف میں ان غیر ملکی ccfDNA کے ٹکڑوں کا جمع ہونا تیزی سے ہوتا ہے اور مسلز کی اندرونی فلٹرنگ سرگرمی میں حصہ ڈالتا ہے۔آخر میں، ہمارا مطالعہ یہ ظاہر کرتا ہے کہ LB کا تصور، جو اب تک بنیادی طور پر بائیو میڈیسن کے شعبے میں لاگو ہوتا رہا ہے، علم کے ایک بھرپور لیکن غیر دریافت شدہ ذریعہ کو انکوڈ کرتا ہے جسے سنٹینل پرجاتیوں اور ان کے ماحول کے درمیان تعامل کو بہتر طور پر سمجھنے کے لیے استعمال کیا جا سکتا ہے۔
پرائمیٹ کے علاوہ، ممالیہ جانوروں میں ccfDNA تنہائی کی اطلاع دی گئی ہے، بشمول چوہوں، کتے، بلیوں اور گھوڑے [50، 51، 52]۔تاہم، ہمارے علم کے مطابق، ہمارا مطالعہ پہلا ہے جس نے سمندری پرجاتیوں میں کھلے گردشی نظام کے ساتھ ccfDNA کی کھوج اور ترتیب کی اطلاع دی ہے۔یہ جسمانی خصوصیت اور مسلز کی فلٹرنگ کی صلاحیت، کم از کم جزوی طور پر، دیگر پرجاتیوں کے مقابلے میں گردش کرنے والے DNA کے ٹکڑوں کی مختلف سائز کی خصوصیات کی وضاحت کر سکتی ہے۔انسانوں میں، خون میں گردش کرنے والے ڈی این اے کے زیادہ تر ٹکڑے چھوٹے ٹکڑے ہوتے ہیں جن کا سائز 150 سے 200 bp تک ہوتا ہے۔167 bp کی زیادہ سے زیادہ چوٹی کے ساتھ [34, 53]۔ڈی این اے کے ٹکڑوں کا ایک چھوٹا لیکن اہم حصہ سائز میں 300 اور 500 bp کے درمیان ہے، اور تقریباً 5% 900 bp سے لمبا ہے۔[54]۔اس سائز کی تقسیم کی وجہ یہ ہے کہ پلازما میں ccfDNA کا بنیادی ذریعہ سیل کی موت کے نتیجے میں ہوتا ہے، یا تو سیل کی موت کی وجہ سے یا صحت مند افراد میں گردش کرنے والے hematopoietic خلیات کے necrosis کی وجہ سے یا کینسر کے مریضوں میں ٹیومر خلیوں کے apoptosis کی وجہ سے (جسے ٹیومر DNA کہا جاتا ہے)۔، ctDNA)۔ہیمولیمف ccfDNA کی جسامت کی تقسیم جو ہم نے mussels میں پائی وہ 1000 سے 5000 bp کے درمیان ہے، جس سے پتہ چلتا ہے کہ mussel ccfDNA کی اصل الگ ہے۔یہ ایک منطقی مفروضہ ہے، کیونکہ مسلز کا نیم کھلا عروقی نظام ہوتا ہے اور وہ سمندری آبی ماحول میں رہتے ہیں جس میں مائکروبیل جینومک ڈی این اے کی زیادہ مقدار ہوتی ہے۔درحقیقت، exogenous DNA کا استعمال کرتے ہوئے ہمارے لیبارٹری کے تجربات سے پتہ چلتا ہے کہ mussels DNA کے ٹکڑوں کو سمندری پانی میں جمع کرتے ہیں، کم از کم چند گھنٹوں کے بعد وہ سیلولر اپٹیک کے بعد انحطاط پذیر ہو جاتے ہیں اور/یا جاری ہو جاتے ہیں اور/یا مختلف تنظیموں میں محفوظ ہو جاتے ہیں۔خلیات کی نایابیت کو دیکھتے ہوئے (دونوں پروکریوٹک اور یوکریوٹک)، انٹراوالولر کمپارٹمنٹس کا استعمال خود ذرائع کے ساتھ ساتھ غیر ملکی ذرائع سے ccfDNA کی مقدار کو کم کر دے گا۔بائیوالو فطری قوت مدافعت کی اہمیت اور گردش کرنے والی فاگوسائٹس کی بڑی تعداد پر غور کرتے ہوئے، ہم نے مزید یہ قیاس کیا کہ غیر ملکی ccfDNA بھی گردش کرنے والی فاگوسائٹس میں افزودہ ہوتا ہے جو مائکروجنزموں اور/یا سیلولر ملبے کے ادخال پر غیر ملکی DNA جمع کرتے ہیں۔ایک ساتھ مل کر، ہمارے نتائج ظاہر کرتے ہیں کہ بائیوالو ہیمولیمف سی سی ایف ڈی این اے مالیکیولر معلومات کا ایک منفرد ذخیرہ ہے اور ایک سنٹینل پرجاتی کے طور پر ان کی حیثیت کو تقویت دیتا ہے۔
ہمارے اعداد و شمار سے پتہ چلتا ہے کہ بیکٹیریا سے ماخوذ ہیمولیمف ccfDNA کے ٹکڑوں کی ترتیب اور تجزیہ میزبان بیکٹیریل فلورا اور ارد گرد کے سمندری ماحولیاتی نظام میں موجود بیکٹیریا کے بارے میں کلیدی معلومات فراہم کر سکتا ہے۔شاٹ سیکوینسنگ کی تکنیکوں نے کامنسل بیکٹیریا A. ایٹرا گل کے ایسے سلسلے کا انکشاف کیا ہے جو ایک حوالہ لائبریری تعصب کی وجہ سے، اگر روایتی 16S rRNA شناخت کے طریقے استعمال کیے جاتے تو یاد نہیں آتے۔درحقیقت، Kerguelen میں ایک ہی mussel کی تہہ میں M. platensis سے جمع کیے گئے LB ڈیٹا کے ہمارے استعمال نے ظاہر کیا کہ گل سے وابستہ بیکٹیریل علامتوں کی ساخت دونوں mussel انواع کے لیے یکساں تھی (تصویر S4، ضمنی معلومات)۔دو جینیاتی طور پر مختلف mussels کی یہ مماثلت کیرگولین [55, 56, 57, 58] کے سرد، گندھک اور آتش فشاں کے ذخائر میں بیکٹیریل کمیونٹیز کی ساخت کی عکاسی کر سکتی ہے۔بائیوٹربیٹڈ ساحلی علاقوں [59]، جیسے پورٹ-او-فرانس کے ساحل سے mussels کی کٹائی کرتے وقت سلفر کو کم کرنے والے مائکروجنزموں کی اعلی سطح کو اچھی طرح سے بیان کیا گیا ہے۔ایک اور امکان یہ ہے کہ کامنسل میوسل فلورا افقی ٹرانسمیشن [60، 61] سے متاثر ہوسکتا ہے۔سمندری ماحول، سمندری سطح کی سطح، اور mussels میں symbiotic بیکٹیریا کی ساخت کے درمیان ارتباط کا تعین کرنے کے لیے مزید تحقیق کی ضرورت ہے۔یہ مطالعات فی الحال جاری ہیں۔
ہیمولیمف ccfDNA کی لمبائی اور ارتکاز، اس کی صاف کرنے میں آسانی، اور تیز رفتار شاٹگن کی ترتیب کی اجازت دینے کے لیے اعلیٰ معیار سمندری ساحلی ماحولیاتی نظام میں حیاتیاتی تنوع کا اندازہ لگانے کے لیے mussel ccfDNA کے استعمال کے بہت سے فوائد میں سے کچھ ہیں۔یہ نقطہ نظر مخصوص ماحولیاتی نظام میں وائرل کمیونٹیز (وائرومز) کی خصوصیت کے لیے خاص طور پر موثر ہے [62، 63]۔بیکٹیریا، آثار قدیمہ اور یوکرائیوٹس کے برعکس، وائرل جینوم میں فائیلوجنیٹک طور پر محفوظ جینز جیسے 16S کی ترتیب نہیں ہوتی ہے۔ہمارے نتائج سے پتہ چلتا ہے کہ اشارے پرجاتیوں سے مائع بایپسی کا استعمال ccfDNA وائرس کے ٹکڑوں کی نسبتاً بڑی تعداد کی شناخت کے لیے کیا جا سکتا ہے جو عام طور پر ساحلی سمندری ماحولیاتی نظاموں میں رہنے والے میزبانوں کو متاثر کرتے ہیں۔اس میں وہ وائرس شامل ہیں جو پروٹوزوا، آرتھروپوڈس، کیڑے مکوڑے، پودے، اور بیکٹیریل وائرس (مثلاً، بیکٹیریوفیجز) کو متاثر کرتے ہیں۔اسی طرح کی تقسیم اس وقت پائی گئی جب ہم نے Kerguelen (ٹیبل S2، ضمنی معلومات) میں ایک ہی mussel کی تہہ میں جمع کیے گئے نیلے mussels (M. platensis) کے hemolymph ccfDNA virome کی جانچ کی۔ccfDNA کی شاٹ گن کی ترتیب درحقیقت انسانوں یا دیگر پرجاتیوں کے وائروم کے مطالعہ میں رفتار حاصل کرنے والا ایک نیا نقطہ نظر ہے [21، 37، 64]۔یہ نقطہ نظر خاص طور پر ڈبل پھنسے ہوئے ڈی این اے وائرس کے مطالعہ کے لیے مفید ہے، کیونکہ تمام ڈبل پھنسے ہوئے ڈی این اے وائرسز میں کوئی ایک جین محفوظ نہیں ہے، جو بالٹیمور میں سب سے متنوع اور وسیع طبقے کے وائرس کی نمائندگی کرتا ہے [65]۔اگرچہ ان میں سے زیادہ تر وائرس غیر درجہ بند رہتے ہیں اور ان میں وائرل دنیا کے مکمل طور پر نامعلوم حصے کے وائرس شامل ہو سکتے ہیں [66]، ہم نے پایا کہ مسلز A. atra اور M. platensis کے وائرسز اور میزبان رینج دو انواع کے درمیان آتے ہیں۔اسی طرح (شکل S3 دیکھیں، اضافی معلومات)۔یہ مماثلت حیران کن نہیں ہے، کیونکہ یہ ماحول میں موجود ڈی این اے کے اخراج میں انتخابی صلاحیت کی کمی کو ظاہر کر سکتی ہے۔پیوریفائیڈ آر این اے کا استعمال کرتے ہوئے مستقبل کے مطالعے کی فی الحال آر این اے وائروم کی خصوصیت کے لیے ضرورت ہے۔
ہمارے مطالعے میں، ہم نے کووارسکی اور ساتھیوں [37] کے کام سے ڈھلنے والی ایک بہت ہی سخت پائپ لائن کا استعمال کیا، جس نے مقامی ccfDNA کی اسمبلی سے پہلے اور بعد میں پولڈ ریڈز اور کونٹیگس کو دو قدمی ڈیلیٹ کرنے کا استعمال کیا، جس کے نتیجے میں غیر میپ شدہ ریڈز کا زیادہ تناسب ہوتا ہے۔اس لیے، ہم اس بات کو مسترد نہیں کر سکتے کہ ان میں سے کچھ بغیر نقشے کے ریڈز کی اب بھی اپنی اصلیت ہو سکتی ہے، بنیادی طور پر اس لیے کہ ہمارے پاس اس mussel انواع کے لیے کوئی حوالہ جینوم نہیں ہے۔ہم نے اس پائپ لائن کو بھی استعمال کیا کیونکہ ہم خود اور غیر خود پڑھنے کے درمیان chimeras اور Illumina MiSeq PE75 کے ذریعہ تیار کردہ پڑھنے کی لمبائی کے بارے میں فکر مند تھے۔غیر متزلزل ریڈنگز کی اکثریت کی ایک اور وجہ یہ ہے کہ زیادہ تر سمندری جرثومے، خاص طور پر دور دراز علاقوں جیسے کیرگولین میں، تشریح نہیں کی گئی ہے۔ہم نے Illumina MiSeq PE75 استعمال کیا، یہ فرض کرتے ہوئے کہ ccfDNA ٹکڑے کی لمبائی انسانی ccfDNA کی طرح ہے۔مستقبل کے مطالعے کے لیے، ہمارے نتائج کو دیکھتے ہوئے کہ ہیمولیمف ccfDNA انسانوں اور/یا ستنداریوں کے مقابلے میں زیادہ پڑھتا ہے، ہم تجویز کرتے ہیں کہ لمبے ccfDNA ٹکڑوں کے لیے زیادہ موزوں ترتیب دینے والا پلیٹ فارم استعمال کریں۔اس مشق سے گہرے تجزیہ کے لیے مزید اشارے کی شناخت کرنا بہت آسان ہو جائے گا۔فی الحال غیر دستیاب مکمل A. atra جوہری جینوم کی ترتیب کو حاصل کرنے سے ccfDNA کے خود اور غیر خود ذرائع سے امتیازی سلوک کو بھی بہت آسان بنایا جائے گا۔یہ دیکھتے ہوئے کہ ہماری تحقیق نے مائع بایپسی کے تصور کو mussels پر لاگو کرنے کے امکان پر توجہ مرکوز کی ہے، ہم امید کرتے ہیں کہ جیسا کہ اس تصور کو مستقبل کی تحقیق میں استعمال کیا جائے گا، نئے ٹولز اور پائپ لائنز تیار کیے جائیں گے تاکہ اس طریقہ کار کی صلاحیت کو بڑھانے کے لیے mussels کے مائکروبیل تنوع کا مطالعہ کیا جا سکے۔سمندری ماحولیاتی نظام
ایک غیر ناگوار کلینیکل بائیو مارکر کے طور پر، سی سی ایف ڈی این اے کے بلند انسانی پلازما کی سطح مختلف بیماریوں، ٹشو کو پہنچنے والے نقصان، اور تناؤ کی حالتوں سے وابستہ ہیں [67,68,69]۔یہ اضافہ بافتوں کو پہنچنے والے نقصان کے بعد اس کی اپنی اصل کے ڈی این اے کے ٹکڑوں کی رہائی سے وابستہ ہے۔ہم نے اس مسئلے کو شدید گرمی کے تناؤ کا استعمال کرتے ہوئے حل کیا ، جس میں پٹھوں کو مختصر طور پر 30 ° C کے درجہ حرارت کا سامنا کرنا پڑا۔ہم نے یہ تجزیہ تین آزاد تجربوں میں تین مختلف قسم کے مسلز پر کیا۔تاہم، ہمیں شدید گرمی کے دباؤ کے بعد ccfDNA کی سطح میں کوئی تبدیلی نہیں ملی (دیکھیں شکل S5، اضافی معلومات)۔یہ دریافت، کم از کم جزوی طور پر، اس حقیقت کی وضاحت کر سکتی ہے کہ mussels میں ایک نیم کھلا گردشی نظام ہوتا ہے اور ان کی زیادہ فلٹرنگ سرگرمی کی وجہ سے بڑی مقدار میں غیر ملکی DNA جمع ہوتے ہیں۔دوسری طرف، mussels، بہت سے invertebrates کی طرح، کشیدگی کی حوصلہ افزائی ٹشو نقصان کے لئے زیادہ مزاحم ہو سکتا ہے، اس طرح ان کے hemolymph میں ccfDNA کی رہائی کو محدود کر دیتا ہے [70, 71]۔
آج تک، آبی ماحولیاتی نظام میں حیاتیاتی تنوع کے DNA تجزیہ نے بنیادی طور پر ماحولیاتی DNA (eDNA) میٹا بار کوڈنگ پر توجہ مرکوز کی ہے۔تاہم، یہ طریقہ عام طور پر حیاتیاتی تنوع کے تجزیہ میں محدود ہوتا ہے جب پرائمر استعمال کیے جاتے ہیں۔شاٹ گن کی ترتیب کا استعمال پی سی آر کی حدود اور پرائمر سیٹ کے متعصب انتخاب کو روکتا ہے۔اس طرح، ایک لحاظ سے، ہمارا طریقہ حال ہی میں استعمال ہونے والے ہائی تھرو پٹ ای ڈی این اے شاٹگن کی ترتیب کے طریقہ کار کے قریب تر ہے، جو براہ راست بکھرے ہوئے ڈی این اے کو ترتیب دینے اور تقریباً تمام جانداروں کا تجزیہ کرنے کے قابل ہے [72، 73]۔تاہم، بہت سے بنیادی مسائل ہیں جو LB کو معیاری eDNA طریقوں سے ممتاز کرتے ہیں۔بلاشبہ، eDNA اور LB کے درمیان بنیادی فرق قدرتی فلٹر ہوسٹس کا استعمال ہے۔ای ڈی این اے کا مطالعہ کرنے کے لیے ایک قدرتی فلٹر کے طور پر سمندری پرجاتیوں جیسے سپنج اور بائیوال (Dresseina spp.) کے استعمال کی اطلاع دی گئی ہے [74، 75]۔تاہم، Dreissena کی تحقیق میں ٹشو بایپسی کا استعمال کیا گیا جس سے DNA نکالا گیا تھا۔LB سے ccfDNA کے تجزیے کے لیے ٹشو بایپسی، مخصوص اور بعض اوقات مہنگے آلات اور eDNA یا ٹشو بایپسی سے وابستہ لاجسٹکس کی ضرورت نہیں ہوتی ہے۔درحقیقت، ہم نے حال ہی میں اطلاع دی ہے کہ LB سے ccfDNA کو کولڈ چین کو برقرار رکھے بغیر FTA سپورٹ کے ساتھ ذخیرہ اور تجزیہ کیا جا سکتا ہے، جو دور دراز کے علاقوں میں تحقیق کے لیے ایک بڑا چیلنج ہے [76]۔مائع بایپسی سے ccfDNA نکالنا بھی آسان ہے اور شاٹ گن کی ترتیب اور PCR تجزیہ کے لیے اعلیٰ معیار کا DNA فراہم کرتا ہے۔ای ڈی این اے تجزیہ [77] سے وابستہ کچھ تکنیکی حدود کو دیکھتے ہوئے یہ ایک بہت بڑا فائدہ ہے۔نمونے لینے کے طریقہ کار کی سادگی اور کم قیمت بھی خاص طور پر طویل مدتی نگرانی کے پروگراموں کے لیے موزوں ہے۔ان کی اعلیٰ فلٹرنگ کی صلاحیت کے علاوہ، بائیوالوز کی ایک اور معروف خصوصیت ان کے بلغم کی کیمیائی میوکوپولیساکرائیڈ مرکب ہے، جو وائرس کے جذب کو فروغ دیتی ہے [78، 79]۔یہ حیاتیاتی تنوع اور آب و ہوا کے ماحولیاتی نظام میں موسمیاتی تبدیلی کے اثرات کو نمایاں کرنے کے لیے بائیوالز کو ایک مثالی قدرتی فلٹر بناتا ہے۔اگرچہ میزبان سے ماخوذ ڈی این اے کے ٹکڑوں کی موجودگی کو ای ڈی این اے کے مقابلے طریقہ کار کی ایک حد کے طور پر دیکھا جا سکتا ہے، لیکن ای ڈی این اے کے مقابلے اس طرح کے مقامی ccfDNA رکھنے سے وابستہ لاگت صحت کے مطالعے کے لیے دستیاب معلومات کی وسیع مقدار کے لیے بیک وقت قابل فہم ہے۔آفسیٹ میزبان.اس میں میزبان میزبان کے جینوم میں مربوط وائرل ترتیب کی موجودگی شامل ہے۔bivalves میں افقی طور پر منتقل ہونے والے لیوکیمک ریٹرو وائرس کی موجودگی کو دیکھتے ہوئے یہ خاص طور پر mussels کے لیے اہم ہے [80، 81]۔ای ڈی این اے پر ایل بی کا ایک اور فائدہ یہ ہے کہ یہ ہیمولیمف میں گردش کرنے والے خون کے خلیات کی فاگوسائٹک سرگرمی کا استحصال کرتا ہے، جو مائکروجنزموں (اور ان کے جینوم) کو گھیر لیتا ہے۔Phagocytosis bivalves میں خون کے خلیوں کا بنیادی کام ہے [82]۔آخر میں، یہ طریقہ مسلز (اوسط 1.5 لیٹر فی گھنٹہ سمندری پانی) کی اعلی فلٹرنگ صلاحیت اور دو دن کی گردش کا فائدہ اٹھاتا ہے، جو سمندری پانی کی مختلف تہوں کے اختلاط کو بڑھاتا ہے، جس سے ہیٹرولوگس ای ڈی این اے کو پکڑنے کی اجازت ملتی ہے۔[83، 84]۔اس طرح، mussel ccfDNA تجزیہ ایک دلچسپ ذریعہ ہے جس میں mussels کے غذائیت، اقتصادی اور ماحولیاتی اثرات کو دیکھتے ہوئے.انسانوں سے جمع کیے گئے ایل بی کے تجزیے کی طرح، یہ طریقہ بھی خارجی مادوں کے جواب میں میزبان ڈی این اے میں جینیاتی اور ایپی جینیٹک تبدیلیوں کی پیمائش کے امکان کو کھولتا ہے۔مثال کے طور پر، نینو پور کی ترتیب کا استعمال کرتے ہوئے مقامی ccfDNA میں جینوم وسیع میتھیلیشن تجزیہ کرنے کے لیے تیسری نسل کی ترتیب سازی کی ٹیکنالوجیز کا تصور کیا جا سکتا ہے۔اس عمل کو اس حقیقت سے سہولت فراہم کی جانی چاہئے کہ کستوری سی سی ایف ڈی این اے کے ٹکڑوں کی لمبائی طویل پڑھنے والے تسلسل پلیٹ فارم کے ساتھ مثالی طور پر مطابقت رکھتی ہے جو کیمیائی تبدیلیوں کی ضرورت کے بغیر ایک ہی ترتیب سے جینوم وسیع ڈی این اے میتھیلیشن تجزیہ کی اجازت دیتا ہے۔لہذا، یہ آب و ہوا کی تبدیلی یا آلودگیوں کی نمائش کے بعد ردعمل کو کنٹرول کرنے والے بنیادی میکانزم کے بارے میں قیمتی بصیرت فراہم کر سکتا ہے [87]۔تاہم، ایل بی کا استعمال حدود کے بغیر نہیں ہے.یہ کہنے کی ضرورت نہیں کہ اس کے لیے ماحولیاتی نظام میں اشارے پرجاتیوں کی موجودگی کی ضرورت ہے۔جیسا کہ اوپر ذکر کیا گیا ہے، کسی دیے گئے ماحولیاتی نظام کی حیاتیاتی تنوع کا اندازہ لگانے کے لیے LB کا استعمال کرنے کے لیے بھی ایک سخت بایو انفارمیٹکس پائپ لائن کی ضرورت ہوتی ہے جو کہ ماخذ سے DNA کے ٹکڑوں کی موجودگی کو مدنظر رکھے۔ایک اور بڑا مسئلہ سمندری انواع کے لیے حوالہ جینوم کی دستیابی ہے۔امید کی جاتی ہے کہ میرین میمل جینوم پروجیکٹ اور حال ہی میں قائم کردہ Fish10k پروجیکٹ [88] جیسے اقدامات مستقبل میں اس طرح کے تجزیہ کو آسان بنائیں گے۔سمندری فلٹر پلانے والے جانداروں پر LB تصور کا اطلاق ترتیب دینے والی ٹیکنالوجی میں جدید ترین پیشرفت کے ساتھ بھی مطابقت رکھتا ہے، جس سے یہ ماحولیاتی تناؤ کے جواب میں سمندری رہائش گاہوں کی صحت کے بارے میں اہم معلومات فراہم کرنے کے لیے کثیر اوہم بائیو مارکر کی ترقی کے لیے موزوں ہے۔
جینوم کی ترتیب کا ڈیٹا بائیو پروجیکٹ SRR8924808 کے تحت NCBI سیکوینس ریڈ آرکائیو https://www.ncbi.nlm.nih.gov/sra/SRR8924808 میں جمع کر دیا گیا ہے۔
بریرلی اے ایس، کنگز فورڈ ایم جے سمندری زندگی اور ماحولیاتی نظام پر موسمیاتی تبدیلی کا اثر۔کول بیالوجی۔2009;19: P602–P614۔
Gissi E, Manea E, Mazaris AD, Fraschetti S, Almpanidou V, Bevilacqua S, et al.آب و ہوا کی تبدیلی اور سمندری ماحول پر دیگر مقامی دباؤ کے مشترکہ اثرات پر غور کریں۔عمومی سائنسی ماحول2021؛755:142564۔
Carella F, Antuofermo E, Farina S, Salati F, Mandas D, Prado P, et al.)۔پہلی مارچ کی سائنس۔2020؛ 7:48۔
Seront L, Nicastro CR, Zardi GI, Goberville E. بار بار گرمی کے تناؤ کے حالات میں گرمی کی برداشت میں کمی نیلی جھلیوں کی موسم گرما میں زیادہ اموات کی وضاحت کرتی ہے۔سائنسی رپورٹ 2019؛9:17498۔
Fey SB, Siepielski AM, Nussle S, Cervantes-Yoshida K, Hwan JL, Huber ER, et al.جانوروں کی اموات کی تعدد، اسباب اور حد میں حالیہ تبدیلیاں۔Proc Natl Acad Sci USA۔2015؛ 112:1083-8۔
Scarpa F, Sanna D, Azzena I, Mughetti D, Cerruti F, Hosseini S, et al.متعدد غیر پرجاتیوں کے مخصوص پیتھوجینز پینا نوبیلیس کی بڑے پیمانے پر اموات کا سبب بن سکتے ہیں۔زندگی.2020؛ 10:238۔
بریڈلی ایم، کوٹس ایس جے، جینکنز ای، اوہارا ٹی ایم۔آرکٹک زونوٹک بیماریوں پر موسمیاتی تبدیلی کے ممکنہ اثرات۔انٹر جے سرکمپولر ہیلتھ۔2005;64:468–77۔
Beyer J., Greene NW, Brooks S., Allan IJ, Ruus A., Gomez T. et al.ساحلی آلودگی کی نگرانی میں سگنل حیاتیات کے طور پر نیلے مسلز (مائٹیلس ایڈولس ایس پی پی): ایک جائزہ۔Mar Environ Res 2017;130:338-65۔
Siravegna G, Marsoni S, Siena S, Bardelli A. کینسر کے علاج میں مائع بایپسی کا انٹیگریشن۔نیٹ ریو کلین آنکول۔2017;14:531–48۔
Wan JCM، Massie C، Garcia-Corbacho J، Mouliere F، Brenton JD، Caldas C، et al.مائع بایپسی میچوریشن: ٹیومر ڈی این اے کو گردش کرنے دیتا ہے۔نیٹ ریو کینسر۔2017؛ 17:223–38۔
مینڈیل P.، Metais P. انسانی پلازما میں نیوکلک ایسڈ۔Soc Biol کے ذیلی اداروں کی میٹنگ منٹس۔1948;142:241-3۔
Bronkhorst AJ, Ungerer W, Holdenrieder S. کینسر کے علاج کے لیے مالیکیولر مارکر کے طور پر سیل فری DNA کے لیے ایک نیا کردار۔بائیومولر تجزیہ کی مقدار2019؛ 17:100087۔
Ignatiadis M., Sledge GW, Jeffrey SS Liquid biopsy کلینک میں داخل - نفاذ کے مسائل اور مستقبل کے چیلنجز۔نیٹ ریو کلین آنکول۔2021;18:297–312۔
Lo YM، Corbetta N.، Chamberlain PF، Rai W.، Sargent IL، Redman CW اور دیگر۔جنین کا ڈی این اے زچگی کے پلازما اور سیرم میں موجود ہوتا ہے۔لینسیٹ1997;350:485-7۔
Mufarray MN, Wong RJ, Shaw GM, Stevenson DK, Quake SR حمل کے دوران اور اس کی پیچیدگیوں کا مطالعہ حمل کے دوران خواتین کے خون میں گردش کرنے والے ایکسٹرا سیلولر RNA کا استعمال کرتے ہوئے۔ڈوپیڈیاٹرکس۔2020؛ 8:605219۔
Ollerich M, Sherwood K, Keown P, Schütz E, Beck J, Stegbauer J, et al.مائع بایپسی: ڈونر سیل فری ڈی این اے کو گردے کے گرافٹ میں اللوجینک گھاووں کا پتہ لگانے کے لیے استعمال کیا جاتا ہے۔نیٹ ریو نیفرول۔2021;17:591–603۔
جوآن ایف سی، قبل از پیدائش کی تشخیص میں Lo YM اختراعات: زچگی کے پلازما جینوم کی ترتیب۔انا ایم ڈی۔2016؛ 67:419-32۔
Gu W, Deng X, Lee M, Sucu YD, Arevalo S, Stryke D, et al.متاثرہ جسمانی رطوبتوں کی اگلی نسل کی میٹاجینومک ترتیب کے ساتھ تیز رفتار پیتھوجین کا پتہ لگانا۔نیٹ میڈیسن۔2021؛ 27:115-24۔