Nature.com پر جانے کے لیے آپ کا شکریہ۔ آپ جو براؤزر ورژن استعمال کر رہے ہیں اس میں CSS کے لیے محدود سپورٹ ہے۔ بہترین تجربے کے لیے، ہم تجویز کرتے ہیں کہ آپ ایک اپ ڈیٹ شدہ براؤزر استعمال کریں (یا انٹرنیٹ ایکسپلورر میں کمپیٹیبلٹی موڈ آف کریں)۔ اس دوران، مسلسل سپورٹ کو یقینی بنانے کے لیے، ہم اس سائٹ کو اسٹائلز اور جاوا اسکرپٹ کے بغیر ڈسپلے کریں گے۔
غیر محفوظ سلکا کے ذرات کو میکروپورس پارٹیکلز حاصل کرنے کے لیے کچھ ترامیم کے ساتھ سول-جیل کے طریقہ کار سے تیار کیا گیا تھا۔ ان ذرات کو N-phenylmaleimide-methylvinylisocyanate (PMI) کے ساتھ ریورس ایبل اضافی فریگمینٹیشن چین ٹرانسفر (RAFT) پولیمرائزیشن کے ذریعے اخذ کیا گیا تھا تاکہ N-phenylmaleimide-methylvinylisocyanate (PMI) اور styrene کے ذریعے تیار کیا جا سکے۔ دوبارہ سٹینلیس سٹیل کے کالم (100 × 1.8 ملی میٹر id) سلری پیکنگ کے ذریعے پیک کیے گئے تھے۔ پانچ پیپٹائڈز (Gly-Tyr, Gly-Leu-Tyr, Gly-Gly-Tyr-Arg, lerograph-en-Gly-Tyr-Arg, en-Gly-Gly-Tyr-Arg-en-Gly-Gly-Tyr-Arg-en-Gly-Gly-Tyr-Arg, en-Gly-Gly-Tyr-Arg-, پر مشتمل پیپٹائڈ مرکب کی پی ایم پی کالم علیحدگی کا اندازہ کیا گیا ہے۔ ic کارکردگی) اور انسانی سیرم البومین (HAS) کا ٹرپسن ہاضمہ۔ زیادہ سے زیادہ اخراج کے حالات میں، پیپٹائڈ مرکب کی نظریاتی پلیٹ کا شمار زیادہ سے زیادہ 280,000 پلیٹس/m² ہے۔ ترقی یافتہ کالم کی علیحدگی کی کارکردگی کا تجارتی Ascentis Express RP-Amide کالم میں مشاہدہ کیا گیا تھا کہ کمرشل کالم کی کارکردگی کا مشاہدہ کیا گیا تھا۔ علیحدگی کی کارکردگی اور حل کی شرائط۔
حالیہ برسوں میں، بائیو فارماسیوٹیکل انڈسٹری مارکیٹ شیئر میں خاطر خواہ اضافے کے ساتھ ایک پھیلتی ہوئی عالمی مارکیٹ بن گئی ہے۔ بائیو فارماسیوٹیکل انڈسٹری 1,2,3 کی دھماکہ خیز نمو کے ساتھ، پیپٹائڈز اور پروٹینز کا تجزیہ انتہائی مطلوب ہے۔ ہدف پیپٹائڈ کے علاوہ، کئی نجاستیں پیدا ہوتی ہیں، پیپٹائڈس کے دوران پیپٹائڈس کو ریگولیٹ کرنے کے لیے پیپٹائڈس کو ریگولیٹ کیا جاتا ہے۔ مطلوبہ پاکیزگی کا۔ جسمانی رطوبتوں، بافتوں اور خلیوں میں پروٹین کا تجزیہ اور خصوصیت ایک ہی نمونے میں بڑی تعداد میں ممکنہ طور پر قابل شناخت انواع کی وجہ سے ایک انتہائی مشکل کام ہے۔ اگرچہ ماس اسپیکٹرو میٹری پیپٹائڈ اور پروٹین کی ترتیب کے لیے ایک موثر ذریعہ ہے، اگر ایسے نمونے ایک بڑے پیمانے پر داخل کیے جائیں تو اس پر عمل درآمد کرنے سے کوئی مسئلہ نہیں ہو سکتا۔ ایم ایس تجزیہ سے پہلے مائع کرومیٹوگرافی (LC) کی علیحدگی، جو ایک مقررہ وقت پر ماس اسپیکٹرومیٹر میں داخل ہونے والے تجزیہ کاروں کی تعداد کو کم کرے گی 4,5,6۔ اس کے علاوہ، مائع مرحلے کی علیحدگی کے دوران، تجزیہ کاروں کو تنگ علاقوں میں مرکوز کیا جا سکتا ہے، اس طرح ان تجزیوں کو مرتکز کیا جا سکتا ہے اور ایل سی ایم ایس کا پتہ لگانے میں نمایاں بہتری آئی ہے۔ گزشتہ دہائی کے دوران اور پروٹومک تجزیہ7,8,9,10 میں ایک مقبول تکنیک بن گئی ہے۔
ریورسڈ فیز مائع کرومیٹوگرافی (RP-LC) بڑے پیمانے پر پیپٹائڈ مکسچر کو صاف کرنے اور علیحدگی کے لیے آکٹیڈیسیل موڈیفائیڈ سلیکا (ODS) کو اسٹیشنری فیز کے طور پر استعمال کیا جاتا ہے۔ تاہم، RP اسٹیشنری فیز تسلی بخش علیحدگی فراہم نہیں کرتے ہیں۔ پہلے، قطبی اور غیر قطبی موئٹیز کے ساتھ پیپٹائڈس اور پروٹینز کا تجزیہ کرنے کے لیے خصوصی طور پر ڈیزائن کیے گئے اسٹیشنری مراحل کی ضرورت ہوتی ہے تاکہ ان تجزیہ کاروں کے ساتھ تعامل اور اسے برقرار رکھا جاسکے۔ ان مراحل سے بھرے ہوئے پیپٹائڈ اور پروٹین کی علیحدگی کے لیے استعمال کیے گئے ہیں 17,18,19,20,21۔ مخلوط موڈ اسٹیشنری مراحل (WAX/RPLC, HILIC/RPLC, polar intercalation/RPLC) قطبی اور غیر قطبی دونوں گروپوں کی موجودگی کی وجہ سے پیپٹائڈ اور پروٹین کی علیحدگی کے لیے موزوں ہیں۔ ہم آہنگی سے بندھے ہوئے قطبی گروپوں کے ساتھ کیلٹنگ اسٹیشنری مراحل قطبی اور غیر قطبی تجزیہ کاروں کے لیے علیحدگی کی اچھی طاقت اور منفرد انتخاب کو ظاہر کرتے ہیں، کیونکہ علیحدگی تجزیہ کار اور اسٹیشنری مرحلے کے درمیان تعامل پر منحصر ہے۔ملٹی موڈل تعاملات 29, 30, 31, 32. حال ہی میں, Zhang et al.30 نے ڈوڈیسائل سے ختم شدہ پولیمین اسٹیشنری مرحلہ تیار کیا اور ہائیڈرو کاربن، اینٹی ڈپریسنٹس، فلیوونائڈز، نیوکلیوسائڈز، ایسٹروجن اور کئی دوسرے تجزیہ کاروں کو کامیابی سے الگ کیا۔ پولر انٹرکلیٹر میں قطبی اور غیر قطبی دونوں گروپ ہوتے ہیں، اس لیے اسے پیپٹائڈس اور پروٹین کو الگ کرنے کے لیے استعمال کیا جا سکتا ہے جو کہ ہائیڈرو کاربن، اینٹی ڈپریسنٹس، فلیوونائڈز، نیوکلیوسائیڈز، ایسٹروجن، دونوں کو الگ کر سکتے ہیں۔ مثال کے طور پر، امائیڈ-ایمبیڈڈ C18 کالم) تجارتی طور پر Ascentis Express RP-Amide کالمز کے تجارتی نام سے دستیاب ہیں، لیکن یہ کالم صرف amine 33 کے تجزیہ کے لیے استعمال کیے جاتے ہیں۔
موجودہ مطالعہ میں، ایک پولر ایمبیڈڈ سٹیشنری فیز (N-phenylmaleimide-embedded polystyrene) تیار کیا گیا تھا اور HSA کے پیپٹائڈس اور ٹرپسن ڈائجسٹوں کو الگ کرنے کے لیے اس کا جائزہ لیا گیا تھا۔ اسٹیشنری فیز کو درج ذیل حکمت عملی کا استعمال کرتے ہوئے تیار کیا گیا تھا۔ غیر محفوظ سلیکا ذرات ہماری پچھلی اشاعت میں دیے گئے طریقہ کار کے مطابق تیار کیے گئے تھے۔ (پی ای جی)، ٹی ایم او ایس، واٹر ایسٹک ایسڈ کو بڑے تاکنے والے سائز کے ساتھ سلیکا کے ذرات تیار کرنے کے لیے ایڈجسٹ کیا گیا تھا۔ دوسرا، ایک نیا لیگنڈ، فینائلمالیمائیڈ-میتھائل ونائل آئوسیانیٹ، ترکیب کیا گیا تھا اور اسے پولر ایمبیڈڈ سٹیشنری فیز تیار کرنے کے لیے سلکا کے ذرات کو اخذ کرنے کے لیے استعمال کیا گیا۔ آپٹمائزڈ پیکنگ اسکیم۔ کالم کی پیکنگ کو مکینیکل کمپن کے ساتھ مدد کی جاتی ہے تاکہ یہ یقینی بنایا جا سکے کہ کالم کے اندر ایک یکساں بیڈ بنتا ہے۔(Gly-Tyr, Gly-Leu-Tyr, Gly-Gly-Tyr-Arg, Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg, Leucine Enkephalin) اور ہیومن سیرم البومین (HAS) کا ٹرپسن ڈائجسٹ۔ HSA کے پیپٹائڈ مکسچر اور ٹرپسن ڈائجسٹ کو اچھی ریزولیوشن کے ساتھ الگ کرنے کے لیے دیکھا گیا۔ PMP کی کارکردگی کے ساتھ مطابقت پذیری اور کارکردگی کا موازنہ کیا گیا۔ -امائڈ کالم۔ پی ایم پی کالم پر پیپٹائڈس اور پروٹین دونوں کو اچھی طرح سے حل اور موثر دیکھا گیا، جو ایسنٹیس ایکسپریس RP-امائڈ کالم سے زیادہ موثر تھا۔
PEG (Polyethylene Glycol)، Urea، Acetic Acid، Trimethoxy Orthosilicate (TMOS)، Trimethyl Chlorosilane (TMCS)، Trypsin، ہیومن سیرم البومین (HSA)، امونیم کلورائیڈ، یوریا، Hexane Methyldisilazane (HMDS)، Methacryloyl Chloride (Benycryloyl Chloride)، Benemcryloyl-Methyldisilazane (HMDS) (BPO)، HPLC گریڈ Acetonitrile (ACN)، Methanol، 2-Propanol، اور Acetone Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA) سے خریدا گیا۔
یوریا (8 جی)، پولی تھیلین گلائکول (8 جی)، اور 0.01 این ایسٹک ایسڈ کے 8 ملی لیٹر کے مرکب کو 10 منٹ تک ہلایا گیا، اور پھر اس میں 24 ملی لیٹر ٹی ایم او ایس شامل کیا گیا، برف کے ٹھنڈے حالات میں۔ رد عمل کے مرکب کو 40 ڈگری سینٹی گریڈ پر 6 گھنٹے کے لیے گرم کیا گیا اور پھر 120 ڈگری سینٹی گریڈ پر بغیر اسٹیل پانی میں 120 ڈگری سینٹی گریڈ تک گرم کیا گیا۔ بقایا مواد کو 70 ° C پر 12 گھنٹے تک خشک کیا گیا تھا۔ خشک نرم ماس کو ایک تندور میں ہموار کیا گیا تھا اور 550 ° C پر 12 گھنٹے کے لئے کیلکائن کیا گیا تھا۔ ذرہ کے سائز، تاکنا کے سائز اور سطح کے رقبے میں تولیدی صلاحیت کو جانچنے کے لیے تین بیچ تیار کیے گئے تھے اور ان کی خصوصیات تھیں۔
پہلے سے ترکیب شدہ ligand phenylmaleimide-methylvinylisocyanate (PCMP) کے ساتھ سلکا کے ذرات کی سطح میں ترمیم کرکے اس کے بعد اسٹائرین کے ساتھ ریڈیل پولیمرائزیشن کے ذریعے، ایک قطبی گروپ پر مشتمل مرکب تیار کیا گیا۔ایگریگیٹس اور پولی اسٹیرین چینز کے لیے سٹیشنری مرحلہ۔ تیاری کا عمل ذیل میں بیان کیا گیا ہے۔
N-phenylmaleimide (200 mg) اور methyl vinyl isocyanate (100 mg) کو خشک ٹولوین میں تحلیل کیا گیا تھا، اور 2,2′-azoisobutyronitrile (AIBN) کا 0.1 mL phenylmaleimide-methyl-Methyl-Mythyl-Mythyl-Mythyl-Mythyl-Mythyl-mg-500000000000000000000000000000000000000000 روپے تک ملایا گیا تھا۔ 3 گھنٹے کے لیے 0 ° C، 3 گھنٹے کے لیے 40 ° C پر تندور میں فلٹر اور خشک کریں۔
خشک سلکا کے ذرات (2 جی) کو خشک ٹولوین (100 ملی لیٹر) میں منتشر کیا گیا، 10 منٹ تک 500 ملی لیٹر کے گول نیچے فلاسک میں ہلایا اور سونیکیٹ کیا گیا۔ PMCP (10 ملی گرام) کو ٹولوین میں تحلیل کیا گیا اور ڈراپنگ فنل کے ذریعے رد عمل کے فلاسک میں ڈراپ وائز شامل کیا گیا۔ مرکب کو 10 ڈگری سینٹی گریڈ پر 8 ڈگری سینٹی گریڈ کے ساتھ ریفل کیا گیا۔ ایسیٹون اور 60 ° C پر 3 گھنٹے تک خشک کیا گیا۔ پھر، PMCP بانڈڈ سلیکا کے ذرات (100 گرام) کو ٹولین (200 ملی لیٹر) میں تحلیل کیا گیا اور 4-ہائیڈروکسی-ٹیمپو (2 ملی لیٹر) کو 100 µL dibutyltin dilaurate کی موجودگی میں شامل کیا گیا، 50 °C پر کیٹیگری 8 سینٹی گریڈ فلٹر کیا گیا۔ 50 ° C پر 3 گھنٹے تک خشک کریں۔
Styrene (1 mL)، benzoyl peroxide BPO (0.5 mL)، اور TEMPO-PMCP سے منسلک سلیکا کے ذرات (1.5 جی) کو ٹولین میں منتشر کیا گیا اور نائٹروجن سے صاف کیا گیا۔ سٹائرین کا پولیمرائزیشن 100 ° C پر 12 گھنٹے تک کیا گیا تھا۔ اس کے نتیجے میں رات بھر میں 6 ڈگری سینٹی گریڈ کا ری ایکشن ہوا۔ شکل 1 میں دکھایا گیا ہے۔
10-3 ٹور سے کم کا بقایا دباؤ حاصل کرنے کے لیے نمونوں کو 1 گھنٹے کے لیے 393 K پر ہٹا دیا گیا۔ P/P0 = 0.99 کے رشتہ دار دباؤ پر جذب ہونے والی N2 کی مقدار کل تاکوں کے حجم کا تعین کرنے کے لیے استعمال کی گئی۔ جاپان)۔خشک نمونے (ننگے سلیکا اور لیگنڈ بانڈڈ سلیکا ذرات) کو ایلومینیم کے کالم پر چپکنے والی کاربن ٹیپ کا استعمال کرتے ہوئے رکھا گیا تھا۔ Q150T اسپٹر کوٹر کا استعمال کرتے ہوئے نمونوں پر گولڈ چڑھایا گیا تھا، اور نمونوں پر 5 nm Au تہہ ڈالی گئی تھی۔ ron (Waltham, MA, USA) Flash EA1112 عنصری تجزیہ کار عنصری تجزیہ کے لیے استعمال کیا گیا تھا۔ A Malvern (Worcestershire, UK) Mastersizer 2000 پارٹیکل سائز کا تجزیہ کار پارٹیکل سائز کی تقسیم حاصل کرنے کے لیے استعمال کیا گیا تھا۔ ننگے سلیگ پارٹیکلز (m5) میں سلیکا کے ذرّات اور m5 کے ٹکڑے ٹکڑے کیے گئے تھے۔ isopropanol، 10 منٹ کے لیے سونیکیٹڈ، 5 منٹ کے لیے گھماؤ، اور Mastersizer کے آپٹیکل بنچ پر رکھا گیا۔ تھرموگراومیٹریک تجزیہ 30 سے ​​800 °C درجہ حرارت کی حد میں 5 °C فی منٹ کی شرح سے کیا گیا۔
شیشے کی لکیر والے سٹینلیس سٹیل کے تنگ بور کالموں کے طول و عرض (100 × 1.8 ملی میٹر id) سلری پیکنگ کے طریقہ کار کا استعمال کرتے ہوئے پیک کیے گئے تھے، اسی طریقہ کار کو ریف میں استعمال کیا گیا تھا۔31.A سٹینلیس سٹیل کا کالم (شیشے کی لکیر والا، 100 × 1.8 ملی میٹر id) ایک آؤٹ لیٹ فٹنگ کے ساتھ جس میں 1 µm فرٹ ایک سلری پیکر (Alltech Deerfield, IL, USA) سے جڑا ہوا تھا۔ ایک سٹیشنری فیز سلوری تیار کریں اور سٹیشنری فیز سلری کو معطل کر کے سٹیشنری فیز سلری کو 150 میٹر سے 150 میٹر فیز سٹوریج میں بھیجیں۔ .میتھانول کو سلری سالوینٹ کے ساتھ ساتھ پروپیلنگ سالوینٹ کے طور پر بھی استعمال کیا جاتا تھا۔ 10 منٹ کے لیے 100 MP، 15 منٹ کے لیے 80 MP، اور 30 ​​منٹ کے لیے 60 MP کا دباؤ لگا کر ترتیب وار کالم کو پُر کریں۔ پیکنگ کے دوران، مکینیکل وائبریشن کا اطلاق دو GC فیلڈ، شیل، یو ایس اے آئی ایل کے کالم کے ساتھ کیا گیا تھا۔ کالم۔ سلری پیکر کو بند کریں اور کالم کے اندر کسی بھی نقصان کو روکنے کے لیے آہستہ آہستہ دباؤ چھوڑیں۔ کالم کو سلری پیکنگ یونٹ سے منقطع کریں اور اس کی کارکردگی کو چیک کرنے کے لیے ایک اور فٹنگ کو انلیٹ اور ایل سی سسٹم سے جوڑیں۔
ایک LC پمپ (10AD Shimadzu, Japan)، انجیکٹر (Valco (USA) C14 W.05) 50nL انجیکشن لوپ کے ساتھ، جھلی ڈیگاسر (Shimadzu DGU-14A)، UV-VIS کیپلیری ونڈو کو خصوصی µLC ڈیوائس ڈیٹیکٹر (UV-20-2075) سے منسلک کیا گیا تھا اور مائیکرو کولنسر سے منسلک کیا گیا تھا۔ اضافی کالم بینڈ کو وسیع کرنے کے اثر کو بہتر بنائیں۔ پیکیجنگ کے بعد، کیپلیریاں (50 μm id 365 اور reducing Union capillaries (50 μm) کو کم کرنے والی یونین کے 1/16″ آؤٹ لیٹ پر نصب کیا گیا تھا۔ ڈیٹا اکٹھا کرنے اور کرومیٹوگرافک پروسیسنگ کا استعمال کرتے ہوئے Multichro 200m 2000 50000 سافٹ ویئر کے لیے Monito. اوریجن پرو 8 (نارتھمپٹن، ایم اے) کے ذریعے کرومیٹوگرافک ڈیٹا کا تجزیہ کیا گیا۔
انسانی سیرم سے البومین، لائوفیلائزڈ پاؤڈر، ≥ 96% (ایگروز جیل الیکٹروفورسس) 3 ملی گرام ٹرپسن (1.5 ملی گرام)، 4.0 ایم یوریا (1 ملی لیٹر)، اور 0.2 ایم امونیم بائ کاربونیٹ (1 ملی لیٹر)۔ محلول کو 10 منٹ کے لیے ہلایا گیا اور پھر 3 ملی میٹر پانی کے ساتھ 3 ڈگری سینٹی گریڈ پر رکھا گیا۔ 0.1% TFA۔ محلول کو فلٹر کریں اور 4 °C سے نیچے اسٹور کریں۔
پیپٹائڈ مکسچر اور HSA ٹرپسن ڈائجسٹ کی علیحدگی کا PMP کالموں پر الگ سے جائزہ لیا گیا۔ PMP کالم کے ذریعے HSA کے پیپٹائڈ مکسچر اور ٹرپسن ڈائجسٹ کی علیحدگی کو چیک کریں اور نتائج کا موازنہ Ascentis Express RP-Amide کالم سے کریں۔ نظریاتی پلیٹ نمبر مندرجہ ذیل ہے:
ننگے سلیکا ذرات اور لیگنڈ بانڈڈ سلیکا ذرات کی SEM تصاویر تصویر میں دکھائی گئی ہیں۔2 .ننگے سلیکا ذرات (A,B) کی SEM تصاویر سے پتہ چلتا ہے کہ، ہمارے پچھلے مطالعات کے برعکس، یہ ذرات کروی ہوتے ہیں جن میں ذرات لمبے ہوتے ہیں یا ان میں فاسد ہم آہنگی ہوتی ہے۔ ligand-bonded سلیکا ذرات (C, D) کی سطح اس سے زیادہ ہموار ہوتی ہے جس کی وجہ سے سلیکا کی سطح پر پولی اسٹائل کا حصہ بن سکتا ہے۔ ica ذرات
ننگے سلیکا ذرات (A, B) اور ligand-bonded سلیکا ذرات (C, D) کی الیکٹران مائکروسکوپ کی تصاویر کو اسکین کرنا۔
ننگے سلیکا پارٹیکلز اور لیگنڈ بانڈڈ سلیکا پارٹیکلز کی پارٹیکل سائز ڈسٹری بیوشن کو شکل 3(A) میں دکھایا گیا ہے۔ والیوم پر مبنی پارٹیکل سائز ڈسٹری بیوشن کروز سے پتہ چلتا ہے کہ سیلیکا پارٹیکلز کے سائز میں کیمیائی ترمیم کے بعد اضافہ ہوا ہے۔ PMP کا le سائز، d(0.5) 3.36 μm ہے، ہمارے پچھلے مطالعہ کے مقابلے میں اشتہار (0.5) قدر 3.05 μm (پولیسٹیرین سے منسلک سلیکا ذرات) 34۔ اس بیچ میں ہمارے پچھلے مطالعہ کے مقابلے میں ایک تنگ ذرہ سائز کی تقسیم تھی جس کی وجہ PEG کے مختلف تناسب، PEG اور miuretic ایسڈ کے سائز میں PEG اور miuretic ایسڈ۔ MP فیز پولی اسٹیرین سے منسلک سلیکا پارٹیکل فیز سے تھوڑا بڑا ہے جس کا ہم نے پہلے مطالعہ کیا تھا۔ اس کا مطلب ہے کہ اسٹائرین کے ساتھ سلیکا پارٹیکلز کی سطح کی فنکشنلائزیشن نے سیلیکا کی سطح پر صرف پولی اسٹیرین کی پرت (0.97 µm) جمع کی، جب کہ PMP فیز میں پرت کی موٹائی 1.38 µm تھی۔
پارٹیکل سائز ڈسٹری بیوشن (A) اور پور سائز ڈسٹری بیوشن (B) ننگے سلکا پارٹیکلز اور لیگنڈ باؤنڈ سلکا پارٹیکلز۔
موجودہ مطالعہ کے سیلیکا ذرات کا تاکنا سائز، تاکنا حجم اور سطح کا رقبہ جدول 1(B) میں دیا گیا ہے۔ ننگے سلیکا ذرات اور ligand-bonded سلیکا ذرات کے PSD پروفائلز کو شکل 3(B) میں دکھایا گیا ہے۔ نتائج ہمارے پچھلے مطالعے کے مقابلے ہیں۔ کیمیائی ترمیم کے بعد re سائز میں 69 کی کمی واقع ہوتی ہے، جیسا کہ جدول 1(B) میں دکھایا گیا ہے، اور وکر کی تبدیلی تصویر 3(B) میں دکھائی گئی ہے۔ اسی طرح، کیمیائی ترمیم کے بعد سلیکا کے ذرات کا تاکنا حجم 0.67 سے 0.58 cm3/g تک کم ہو گیا۔ 24 m2/g۔ جیسا کہ جدول 1(B) میں دکھایا گیا ہے، سیلیکا ذرات کی سطح کا رقبہ (m2/g) بھی کیمیائی ترمیم کے بعد 116 m2/g سے کم ہو کر 105 m2/g ہو گیا۔
اسٹیشنری فیز کے ابتدائی تجزیہ کے نتائج ٹیبل 2 میں دکھائے گئے ہیں۔ موجودہ اسٹیشنری فیز کی کاربن لوڈنگ 6.35% ہے، جو کہ ہمارے پچھلے اسٹڈی کی کاربن لوڈنگ سے کم ہے (پولیسٹیرین بانڈڈ سلیکا پارٹیکلز، بالترتیب 7.93%35 اور 10.21%) کیونکہ موجودہ اسٹیشنری فیز کی تیاری میں کاربن کی لوڈنگ 42، ایس پی کی موجودہ تیاری میں کم ہے۔ اسٹائرین کے علاوہ، کچھ قطبی لیگنڈز جیسے phenylmaleimide-methylvinylisocyanate (PCMP) اور 4-hydroxy-TEMPO استعمال کیے گئے تھے۔ موجودہ اسٹیشنری مرحلے کا نائٹروجن وزن فیصد 2.21% ہے، اس کے مقابلے میں 0.1735 اور 0.85% ہے، اس کا مطلب یہ ہے کہ پچھلے مطالعات میں نائٹروجن کا وزن بالترتیب زیادہ ہے۔ فینیلمالیمائیڈ کی وجہ سے مرحلہ۔ اسی طرح، مصنوعات (4) اور (5) کی کاربن لوڈنگ بالترتیب 2.7% اور 2.9% تھی، جب کہ حتمی مصنوعہ (6) کی کاربن لوڈنگ 6.35% تھی، جیسا کہ جدول 2 میں دکھایا گیا ہے۔ وزن میں کمی کو PMP اسٹیشنری مرحلے کے ساتھ چیک کیا گیا، اور TGA کے وزن میں کمی کو ظاہر کیا گیا ہے۔ ، جو کاربن لوڈنگ (6.35%) کے ساتھ اچھے معاہدے میں ہے کیونکہ لیگنڈس میں نہ صرف C بلکہ N، O، اور H بھی ہوتے ہیں۔
phenylmaleimide-methylvinylisocyanate ligand کو سلیکا ذرات کی سطح میں ترمیم کے لیے منتخب کیا گیا تھا کیونکہ اس میں قطبی phenylmaleimide گروپس اور vinylisocyanate گروپس ہوتے ہیں۔ Vinyl isocyanate گروپس زندہ ریڈیکل پولیمرائزیشن کے ذریعے اسٹائرین کے ساتھ مزید رد عمل ظاہر کرسکتے ہیں۔ دوسری وجہ یہ ہے کہ ایک گروپ کو داخل کرنا ہے جو کہ الیکٹرو سٹینائیٹ کے درمیان تعامل اور اعتدال پسندی کے درمیان کوئی رابطہ نہیں رکھتا۔ ary فیز، چونکہ phenylmaleimide moiety پر عام pH پر کوئی ورچوئل چارج نہیں ہوتا ہے۔ اسٹیشنری فیز کی polarity کو اسٹائرین کی زیادہ سے زیادہ مقدار اور فری ریڈیکل پولیمرائزیشن کے ری ایکشن ٹائم سے کنٹرول کیا جا سکتا ہے۔ ری ایکشن کا آخری مرحلہ (فری ریڈیکل پولیمرائزیشن) اہم ہے اور سٹیشنری سٹیشن کی پولرٹی کو تبدیل کر سکتا ہے۔ یہ دیکھا گیا کہ اسٹائرین کی مقدار میں اضافہ اور رد عمل کے وقت نے اسٹیشنری فیز کی کاربن لوڈنگ میں اضافہ کیا اور اس کے برعکس۔ اسٹائرین کے مختلف ارتکاز کے ساتھ تیار کردہ ایس پیز میں مختلف کاربن لوڈنگ ہوتی ہے۔ ایک بار پھر، ان اسٹیشنری فیزز کو سٹینلیس سٹیل کے کالموں میں لوڈ کریں اور ان کی کرومیٹوگرافک کارکردگی کو چیک کریں (انتخاب، ریزولیوشن، ریزولیوشن وغیرہ کے لیے منتخب کردہ فارمولیشن، این بی اے کی تیاری)۔ PMP اسٹیشنری مرحلہ کنٹرول شدہ قطبیت اور اچھی تجزیہ کار برقرار رکھنے کو یقینی بنانے کے لیے۔
موبائل فیز کا استعمال کرتے ہوئے پی ایم پی کالم کا استعمال کرتے ہوئے پانچ پیپٹائڈ مرکبات (گلی-ٹائر، گلی-لیو-ٹائر، گلی-گلی-ٹائر-آرگ، ٹائر-آئی-گلی-سیر-آرگ، لیوسین اینکیفالن) کا بھی جائزہ لیا گیا۔80 μL/min کی بہاؤ کی شرح پر 60/40 (v/v) acetonitrile/water (0.1% TFA)۔ زیادہ سے زیادہ اخراج کے حالات کے تحت، نظریاتی پلیٹ نمبر (N) فی کالم (100 × 1.8 mm id) 20,000 ہے ± 0,00m/T² کے لیے قابل قدر پلا (302 میٹر) 20,000 ہے۔ پی ایم پی کالم اور کرومیٹوگرامس کو شکل 5A میں دکھایا گیا ہے۔ تیز بہاؤ کی شرح (700 μL/min) پر ایک PMP کالم پر تیز تجزیہ، ایک منٹ کے اندر پانچ پیپٹائڈز کو خارج کر دیا گیا، N کی قدریں بہت اچھی تھیں، 13,500 ± 330 فی کالم (10.180 × 1000/m/1000 کورپونڈیس) m (شکل 5B)۔ تین یکساں سائز کے کالم (100 × 1.8 ملی میٹر id) تین مختلف لاٹ PMP سٹیشنری فیز سے بھرے ہوئے تھے تاکہ تولیدی صلاحیت کو چیک کیا جا سکے۔ ہر کالم کے لیے تجزیہ کرنے والے ارتکاز کو زیادہ سے زیادہ اخراج کے حالات اور نظریاتی پلیٹوں کی تعداد کو استعمال کرتے ہوئے ریکارڈ کیا گیا تھا۔ lumns جدول 4 میں دکھائے گئے ہیں۔ PMP کالم کی تولیدی صلاحیت بہت کم %RSD اقدار کے ساتھ اچھی طرح سے منسلک ہے، جیسا کہ جدول 3 میں دکھایا گیا ہے۔
PMP کالم (B) اور Ascentis Express RP-Amide کالم (A) پر پیپٹائڈ مرکب کی علیحدگی؛موبائل فیز 60/40 ACN/H2O (TFA 0.1%)، PMP کالم کے طول و عرض (100 × 1.8 ملی میٹر id)؛تجزیاتی مرکبات کے اخراج کی ترتیب: 1 (Gly-Tyr)، 2 (Gly-Leu-Tyr)، 3 (Gly-Gly-Tyr-Arg)، 4 (Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg) اور 5 (leucine) acid enkephalin))۔
ایک PMP کالم (100 × 1.8 ملی میٹر id) کو ہائی پرفارمنس مائع کرومیٹوگرافی میں انسانی سیرم البومین کے ٹرپٹک ڈائجسٹوں کی علیحدگی کے لیے جانچا گیا تھا۔ شکل 6 میں کرومیٹوگرام ظاہر کرتا ہے کہ نمونہ اچھی طرح سے الگ ہے اور ریزولوشن بہت اچھا ہے۔ HSA ڈائجسٹ کا تجزیہ کیا گیا تھا 00/0 ٹن /00 منٹ فیز فیز کا استعمال کرتے ہوئے rile/water اور 0.1% TFA۔ جیسا کہ کرومیٹوگرام (شکل 6) میں دکھایا گیا ہے، HSA کے عمل انہضام کو 17 پیپٹائڈس کے مساوی 17 چوٹیوں میں تقسیم کیا گیا ہے۔ HSA ڈائجسٹ میں ہر چوٹی کی علیحدگی کی کارکردگی کا حساب لگایا گیا تھا اور قدریں Table 5 میں دی گئی ہیں۔
PMP کالم پر HSA (100 × 1.8 mm id) کا ٹرپٹک ڈائجسٹ الگ کیا گیا تھا۔بہاؤ کی شرح (100 µL/منٹ)، موبائل فیز 60/40 acetonitrile/water 0.1% TFA کے ساتھ۔
جہاں L کالم کی لمبائی ہے، η موبائل فیز کی viscosity ہے، ΔP کالم کا بیک پریشر ہے، اور u موبائل فیز کی لکیری رفتار ہے۔ PMP کالم کی پارگمیتا 2.5 × 10-14 m2 تھی، بہاؤ کی شرح 25 μL/min تھی، اور 60/40 AC/40MP کی column/400m کی پارگمیتا تھی۔ 0 × 1.8 ملی میٹر id) ہمارے پچھلے مطالعہ Ref.34 سے ملتا جلتا تھا۔ سطحی طور پر غیر محفوظ ذرات سے بھرے کالم کی پارگمیتا یہ ہے: 1.7 μm ذرات کے لیے 1.7 × 10-15، 1.7 μm ذرات کے لیے 3.1 × 10-15 اور 1.7 μm کے ذرات کے لیے 3.1 × 10-15 اور .251 × 201، .6 μm ذرات 5 μm ذرات کے لیے 43. اس لیے، PMP مرحلے کی پارگمیتا 5 μm کور شیل ذرات کی طرح ہے۔
جہاں Wx کلوروفارم سے بھرے کالم کا وزن ہے، Wy میتھانول سے بھرے کالم کا وزن ہے، اور ρ سالوینٹ کی کثافت ہے۔ میتھانول (ρ = 0.7866) اور کلوروفارم (ρ = 1.484) کی کثافت ہے۔ ) 34 اور C18-یوریا کالم 31 جن کا ہم نے پہلے مطالعہ کیا تھا وہ بالترتیب 0.63 اور 0.55 تھے۔ اس کا مطلب یہ ہے کہ یوریا لیگنڈز کی موجودگی سٹیشنری مرحلے کی پارگمیتا کو کم کرتی ہے۔ دوسری طرف، PMP کالم کی کل پورسٹی (100 × 1.8 mm. idm.6MP column کے مقابلے میں کم ہے)۔ C18 بانڈڈ سلیکا ذرات سے بھرا ہوا ہے کیونکہ C18 قسم کے اسٹیشنری مراحل میں C18 ligands سلیکا کے ذرات سے لکیری زنجیروں کے طور پر جڑے ہوتے ہیں، جبکہ پولی اسٹیرین قسم کے اسٹیشنری مراحل میں، ایک نسبتاً موٹی پولیمر پرت اس کے ارد گرد بنتی ہے۔
شکل 7A,B PMP کالم (100 × 1.8 mm id) اور Ascentis Express RP-Amide کالم (100 × 1.8 mm id) کو اسی اخراج کے حالات (یعنی 60/40 ACN/H2O اور 0.1% TFA) کا استعمال کرتے ہوئے دکھاتا ہے۔) وین ڈیمٹر پلاٹ کا۔منتخب پیپٹائڈ مرکب (Gly-Tyr, Gly-Leu-Tyr, Gly-Gly-Tyr-Arg, Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg, Leucine Enkephalin) 20 µL میں تیار کیے گئے تھے/ دونوں کالموں کے لیے کم از کم بہاؤ کی شرح 800 µminL/min umtHE کی قدر ہے (umt 800 µminL/min. L/min) PMP کالم اور Ascentis Express RP-Amide کالم کے لیے بالترتیب 2.6 µm اور 3.9 µm تھے۔ HETP قدریں اس بات کی نشاندہی کرتی ہیں کہ PMP کالم (100 × 1.8 mm id) کی علیحدگی کی کارکردگی اس سے کہیں زیادہ بہتر ہے جو کہ RP-10mm کے تجارتی طور پر دستیاب ہے۔ تصویر 7(A) میں وین ڈیمٹر پلاٹ ظاہر کرتا ہے کہ بڑھتے ہوئے بہاؤ کے ساتھ N قدر میں کمی ہمارے پچھلے مطالعہ کے مقابلے میں اہم نہیں ہے۔ Ascentis Express RP-Amide کالم کے مقابلے PMP کالم (100 × 1.8 mm id) کی اعلی علیحدگی کی استعداد کار میں بہتری پر مبنی ہے۔
(A) وین ڈیمٹر پلاٹ (HETP بمقابلہ موبائل فیز لکیری رفتار) PMP کالم (100 × 1.8 mm id) کا استعمال کرتے ہوئے 60/40 ACN/H2O میں 0.1% TFA کے ساتھ حاصل کیا گیا ہے۔ .8 ملی میٹر id) 60/40 ACN/H2O میں 0.1% TFA کے ساتھ۔
ایک قطبی ایمبیڈڈ پولی اسٹیرین سٹیشنری مرحلہ تیار کیا گیا تھا اور مصنوعی پیپٹائڈ مرکب کی علیحدگی اور ہائی پرفارمنس مائع کرومیٹوگرافی میں ہیومن سیرم البومین (HAS) کے ٹرپسن ڈائجسٹوں کو الگ کرنے کے لیے جانچا گیا تھا۔ پیپٹائڈ مکسچر کے لیے پی ایم پی کالموں کی کرومیٹوگرافک کارکردگی PMP کالموں کی کارکردگی کو الگ کرنے کے لیے بہترین ہے۔ s، جیسے سیلیکا ذرات کے ذرہ کا سائز اور تاکنا سائز، اسٹیشنری مرحلے کی کنٹرول شدہ ترکیب، اور پیچیدہ کالم پیکنگ۔ اعلی علیحدگی کی کارکردگی کے علاوہ، ہائی بہاؤ کی شرح پر کم کالم بیک پریشر اس سٹیشنری مرحلے کا ایک اور فائدہ ہے۔ اس کالم کو قدرتی مصنوعات، دواؤں کے پودوں سے بایو ایکٹیو مرکبات اور مائع کرومیٹوگرافی میں فنگس کے عرقوں کی علیحدگی کے لیے استعمال کریں۔ مستقبل میں، PMP کالموں کو پروٹین اور مونوکلونل اینٹی باڈیز کی علیحدگی کے لیے بھی جانچا جائے گا۔
فیلڈ، جے کے، یوربی، ایم آر، لاؤ، جے، تھیگرسن، ایچ اور پیٹرسن، پی. ریورسڈ فیز کرومیٹوگرافی کے ذریعے پیپٹائڈ سیپریشن سسٹمز پر تحقیق حصہ I: ایک کالم کریکٹرائزیشن پروٹوکول کی ترقی۔Chromatography.1603, 113–129.https://doi.org/10.1016/j.chroma.2019.05.038 (2019)۔
Gomez, B. et al. متعدی بیماریوں کے علاج کے لیے تیار کردہ فعال پیپٹائڈز کو بہتر بنایا گیا ہے۔ Biotechnology.Advanced.36(2), 415-429.https://doi.org/10.1016/j.biotechadv.2018.01.004 (2018)۔
Vlieghe, P., Lisowski, V., Martinez, J. & Khrestchatisky, M. Synthetic Therapeutic Peptides: Science and the market.drug discovery.15 (1-2) Today, 40-56.https://doi.org/10.1016/j.drudis.2009.02016.
Xie, F., Smith, RD & Shen, Y. Advanced Proteomic Liquid Chromatography.J.Chromatography.A 1261, 78–90 (2012)۔
Liu, W. et al.Advanced liquid chromatography-mas spectrometry وسیع پیمانے پر ہدف شدہ میٹابولومکس اور proteomics.anus.Chim.Acta 1069, 89–97 (2019) کو شامل کرنے کے قابل بناتی ہے۔
Chesnut, SM & Salisbury, JJ منشیات کی نشوونما میں UHPLC کا کردار۔Sci.30 (8)، 1183-1190 (2007) ستمبر۔
وو، این اور کلازن، اے ایم تیز رفتار علیحدگی کے لیے الٹرا ہائی پریشر مائع کرومیٹوگرافی کے بنیادی اور عملی پہلو۔ جے۔ستمبر Sci.30(8), 1167-1182.https://doi.org/10.1002/jssc.200700026 (2007)۔
Wren, SA & Tchelitcheff, P. منشیات کی نشوونما میں الٹرا ہائی پرفارمنس مائع کرومیٹوگرافی کی درخواست۔Chromatography.1119(1-2), 140-146.https://doi.org/10.1016/j.chroma.2006.02.052 (2006)۔
Gu, H. et al.Enteroviruses.Chemical.Britain.J. کی موثر صاف کرنے کے لیے تیل میں پانی کے اعلی اندرونی مرحلے کے ایمولشن سے تیار کردہ مونولیتھک میکروپورس ہائیڈروجلز۔401، 126051 (2020)۔
Shi, Y., Xiang, R. Horváth, C. & Wilkins, JA پروٹومکس میں مائع کرومیٹوگرافی کا کردار۔Chromatography.A 1053(1-2)، 27-36 (2004)۔
Fekete, S., Veuthey, J.-L.& Guillarme, D. علاجی پیپٹائڈس اور پروٹین کے الٹ فیز مائع کرومیٹوگرافی علیحدگی میں ابھرتے ہوئے رجحانات: تھیوری اور ایپلی کیشنز۔ جے۔فارمیسی.بایومیڈیکل سائنس.anus.69, 9-27 (2012)۔
Gilar, M., Olivova, P., Daly, AE & Gebler, JC پہلی اور دوسری علیحدگی کے طول و عرض میں مختلف pH اقدار کا استعمال کرتے ہوئے RP-RP-HPLC نظام کا استعمال کرتے ہوئے پیپٹائڈس کی دو جہتی علیحدگی۔Sci.28 (14)، 1694-1703 (2005) ستمبر۔
Feletti, S. et al. C18 ذیلی 2 μm مکمل اور سطحی طور پر غیر محفوظ ذرات سے بھرے اعلی کارکردگی والے کرومیٹوگرافک کالموں کی بڑے پیمانے پر منتقلی کی خصوصیات اور حرکی کارکردگی کی چھان بین کی گئی۔Sci.43 (9-10)، 1737-1745 (2020) ستمبر۔
Piovesana, S. et al. پلانٹ بائیو ایکٹیو پیپٹائڈس کی تنہائی، شناخت اور توثیق میں حالیہ رجحانات اور تجزیاتی چیلنجز
Mueller, JB et al.The proteomic landscape of the kingdom of life.Nature 582(7813), 592-596.https://doi.org/10.1038/s41586-020-2402-x (2020)۔
DeLuca, C. et al. تیاری کے مائع کرومیٹوگرافی کے ذریعہ علاج کے پیپٹائڈس کی ڈاؤن اسٹریم پروسیسنگ۔ مالیکیول (بیسل، سوئٹزرلینڈ) 26(15)، 4688(2021)۔
یانگ، وائی اور گینگ، ایکس مکسڈ موڈ کرومیٹوگرافی اور بائیو پولیمر پر اس کا اطلاق۔Chromatography.A 1218(49), 8813–8825 (2011)۔
Zhao, G., Dong, X.-Y.& Sun, Y. Ligands for mixed-mode protein chromatography: اصول، خصوصیت، اور ڈیزائن.J.بایو ٹیکنالوجی.144(1)، 3-11 (2009)۔