Nature.com پر جانے کا شکریہ۔ آپ جس براؤزر کا ورژن استعمال کر رہے ہیں اسے محدود CSS سپورٹ حاصل ہے۔ بہترین تجربے کے لیے، ہم تجویز کرتے ہیں کہ آپ ایک اپ ڈیٹ شدہ براؤزر استعمال کریں (یا انٹرنیٹ ایکسپلورر میں مطابقت موڈ کو غیر فعال کریں)۔ اس دوران، مسلسل تعاون کو یقینی بنانے کے لیے، ہم سائٹ کو بغیر اسٹائل اور جاوا اسکرپٹ کے رینڈر کریں گے۔
ایک قابل اعتماد ان وٹرو سسٹم کی ضرورت ہے جو منشیات کی جانچ کے لیے دل کے جسمانی ماحول کو درست طریقے سے دوبارہ تیار کر سکے۔ انسانی دل کے ٹشو کلچر کے نظام کی محدود دستیابی نے دل کی دوائیوں کے اثرات کی غلط تشریح کی ہے۔ یہاں، ہم نے کارڈیک ٹشو کلچر ماڈل (CTCM) تیار کیا ہے جو الیکٹرو مکینیکل طور پر دل کے ٹکڑوں کو متحرک کرتا ہے اور کارڈیک سائیکل کے سسٹولک اور ڈائیسٹولک مراحل کے دوران جسمانی کھینچا تانی سے گزرتا ہے۔ 12 دن کی ثقافت کے بعد، اس نقطہ نظر نے دل کے حصوں کی عملداری کو جزوی طور پر بہتر کیا، لیکن ان کی ساختی سالمیت کو مکمل طور پر محفوظ نہیں رکھا۔ لہذا، چھوٹے مالیکیول اسکریننگ کے بعد، ہم نے پایا کہ ہمارے میڈیم میں 100 nM triiodothyronine (T3) اور 1 μM dexamethasone (Dex) کے اضافے نے حصوں کے مائیکرو اسٹرکچر کو 12 دن تک برقرار رکھا۔ T3/Dex علاج کے ساتھ مل کر، CTCM سسٹم نے 12 دنوں تک ٹرانسکرپشن پروفائلز، قابل عملیت، میٹابولک سرگرمی، اور ساختی سالمیت کو اسی سطح پر برقرار رکھا جس سطح پر دل کے تازہ ٹشو ہیں۔ اس کے علاوہ، کلچر میں کارڈیک ٹشو کی ضرورت سے زیادہ کھینچنا ہائپر ٹرافک کارڈیک سگنلنگ کو اکساتا ہے، جو کارڈیک اسٹریچ سے پیدا ہونے والے ہائپر ٹرافک حالات کی نقل کرنے کے لیے CTCM کی صلاحیت کا ثبوت فراہم کرتا ہے۔ آخر میں، CTCM دل کی فزیالوجی اور پیتھو فزیالوجی کو طویل عرصے تک ثقافت میں ماڈل بنا سکتا ہے، جس سے منشیات کی قابل اعتماد اسکریننگ ممکن ہو سکتی ہے۔
طبی تحقیق سے پہلے، قابل اعتماد ان وٹرو سسٹمز کی ضرورت ہوتی ہے جو انسانی دل کے جسمانی ماحول کو درست طریقے سے دوبارہ پیدا کر سکیں۔ اس طرح کے نظاموں کو تبدیل شدہ مکینیکل اسٹریچ، دل کی دھڑکن اور الیکٹرو فزیولوجیکل خصوصیات کی نقل کرنی چاہیے۔ جانوروں کے ماڈلز کو عام طور پر کارڈیک فزیالوجی کے اسکریننگ پلیٹ فارم کے طور پر استعمال کیا جاتا ہے جس میں انسانی دل میں دوائیوں کے اثرات کی عکاسی کرنے میں محدود بھروسا ہوتا ہے۔ بالآخر، آئیڈیل کارڈیک ٹشو کلچر تجرباتی ماڈل (CTCM) ایک ایسا ماڈل ہے جو انتہائی حساس اور مختلف علاج اور فارماسولوجیکل مداخلتوں کے لیے مخصوص ہے، جو انسانی دل کی فزیالوجی اور پیتھوفیسولوجی کو درست طریقے سے دوبارہ تیار کرتا ہے۔ اس طرح کے نظام کی عدم موجودگی دل کی ناکامی کے نئے علاج کی دریافت کو محدود کرتی ہے 4,5 اور مارکیٹ سے باہر نکلنے کی ایک بڑی وجہ کے طور پر منشیات کے کارڈیوٹوکسائٹی کا باعث بنی ہے۔
پچھلی دہائی کے دوران، آٹھ غیر قلبی ادویات کو طبی استعمال سے واپس لے لیا گیا ہے کیونکہ وہ QT وقفہ کو طول دینے کا باعث بنتی ہیں جس کی وجہ سے وینٹریکولر اریتھمیا اور اچانک موت ہوتی ہے۔ اس طرح، قلبی افادیت اور زہریلے پن کا اندازہ لگانے کے لیے قابل اعتماد preclinical اسکریننگ کی حکمت عملیوں کی بڑھتی ہوئی ضرورت ہے۔ منشیات کی اسکریننگ اور زہریلے پن کی جانچ میں انسانی حوصلہ افزائی شدہ pluripotent اسٹیم سیل سے ماخوذ کارڈیو مایوسائٹس (hiPS-CM) کا حالیہ استعمال اس مسئلے کا جزوی حل فراہم کرتا ہے۔ تاہم، hiPS-CMs کی ناپختہ نوعیت اور کارڈیک ٹشو کی کثیر خلوی پیچیدگی کی کمی اس طریقہ کار کی بڑی حدود ہیں۔ حالیہ مطالعات سے پتہ چلتا ہے کہ اس حد کو جزوی طور پر ابتدائی hiPS-CM کا استعمال کرتے ہوئے کارڈیک ٹشو ہائیڈروجلز کی تشکیل کے لیے خود بخود سنکچن کے آغاز کے فوراً بعد اور وقت کے ساتھ ساتھ بتدریج برقی محرک میں اضافہ کر کے دور کیا جا سکتا ہے۔ تاہم، ان hiPS-CM مائکرو ٹِشوز میں بالغ مایوکارڈیم کی پختہ الیکٹرو فزیولوجیکل اور سنکچن خصوصیات کی کمی ہے۔ اس کے علاوہ، انسانی قلبی بافتوں کی ساخت زیادہ پیچیدہ ہوتی ہے، جس میں مختلف قسم کے خلیات کا ایک متفاوت مرکب ہوتا ہے، بشمول اینڈوتھیلیل سیل، نیوران، اور اسٹروومل فائبرو بلاسٹس، جو ایکسٹرا سیلولر میٹرکس پروٹین کے مخصوص سیٹوں سے جڑے ہوتے ہیں۔ بالغ ممالیہ کے دل میں غیر کارڈیو مایوسائٹ کی آبادی 11,12,13 کی یہ متفاوت انفرادی سیل کی اقسام کا استعمال کرتے ہوئے کارڈیک ٹشو کی ماڈلنگ میں ایک بڑی رکاوٹ ہے۔ یہ بڑی حدود جسمانی اور پیتھولوجیکل حالات کے تحت برقرار مایوکارڈیل ٹشو کی ثقافت کے طریقوں کو تیار کرنے کی اہمیت پر زور دیتی ہیں۔
انسانی دل کے مہذب پتلے (300 µm) حصے برقرار انسانی مایوکارڈیم کا ایک امید افزا نمونہ ثابت ہوئے ہیں۔ یہ طریقہ انسانی دل کے بافتوں کی طرح ایک مکمل 3D کثیر خلوی نظام تک رسائی فراہم کرتا ہے۔ تاہم، 2019 تک، کلچرڈ دل کے حصوں کا استعمال مختصر (24 گھنٹے) ثقافت کی بقا سے محدود تھا۔ یہ متعدد عوامل کی وجہ سے ہے جس میں جسمانی میکینیکل اسٹریچ کی کمی، ایئر مائع انٹرفیس، اور سادہ میڈیا کا استعمال جو کارڈیک ٹشو کی ضروریات کو پورا نہیں کرتے ہیں۔ 2019 میں، کئی تحقیقی گروپوں نے یہ ظاہر کیا کہ کارڈیک ٹشو کلچر سسٹم میں مکینیکل عوامل کو شامل کرنے سے کلچر لائف کو بڑھایا جا سکتا ہے، کارڈیک ایکسپریشن کو بہتر بنایا جا سکتا ہے، اور کارڈیک پیتھالوجی کی نقل کی جا سکتی ہے۔ دو خوبصورت مطالعات 17 اور 18 سے پتہ چلتا ہے کہ غیر محوری مکینیکل لوڈنگ کا ثقافت کے دوران کارڈیک فینوٹائپ پر مثبت اثر پڑتا ہے۔ تاہم، ان مطالعات میں کارڈیک سائیکل کی متحرک تین جہتی فزیکو مکینیکل لوڈنگ کا استعمال نہیں کیا گیا، کیونکہ دل کے حصے یا تو isometric tensile فورسز 17 یا لکیری auxotonic loading 18 سے بھرے ہوئے تھے۔ ٹشو اسٹریچنگ کے ان طریقوں کے نتیجے میں بہت سے کارڈیک جینز کو دبایا گیا یا غیر معمولی اسٹریچ ردعمل سے وابستہ جینوں کا زیادہ اظہار۔ خاص طور پر، Pitoulis et al. 19 نے کارڈیک سائیکل کی تعمیر نو کے لیے ایک متحرک ہارٹ سلائس کلچر غسل تیار کیا جس میں فورس ٹرانسڈیوسر فیڈ بیک اور ٹینشن ڈرائیوز کا استعمال کیا گیا۔ اگرچہ یہ نظام وٹرو کارڈیک سائیکل ماڈلنگ میں زیادہ درست ہونے کی اجازت دیتا ہے، لیکن طریقہ کار کی پیچیدگی اور کم تھرو پٹ اس سسٹم کے اطلاق کو محدود کرتا ہے۔ ہماری لیبارٹری نے حال ہی میں برقی محرک کا استعمال کرتے ہوئے ایک آسان ثقافتی نظام تیار کیا ہے اور پورسین اور انسانی دل کے بافتوں کی 6 دن تک عملداری کو برقرار رکھنے کے لیے ایک بہترین ذریعہ بنایا ہے۔
موجودہ مخطوطہ میں، ہم پورسین دل کے حصوں کا استعمال کرتے ہوئے ایک کارڈیک ٹشو کلچر ماڈل (CTCM) کی وضاحت کرتے ہیں جس میں کارڈیک سائیکل کے دوران تین جہتی کارڈیک فزیالوجی اور پیتھوفزیولوجیکل ڈسٹنشن کو دوبارہ بیان کرنے کے لیے مزاحیہ اشارے شامل کیے گئے ہیں۔ یہ CTCM پری کلینیکل دوائیوں کی پیشن گوئی کی درستگی کو اس سطح تک بڑھا سکتا ہے جو پہلے کبھی حاصل نہیں کیا گیا تھا، ایک لاگت سے موثر، درمیانی تھرو پٹ کارڈیک سسٹم فراہم کر کے جو ممالیہ کے دل کی فزیالوجی/پیتھوفیسولوجی کی نقل کرتا ہے۔
ہیموڈینامک مکینیکل سگنلز وٹرو 22,23,24 میں کارڈیو مایوسائٹ فنکشن کو برقرار رکھنے میں اہم کردار ادا کرتے ہیں۔ موجودہ مخطوطہ میں، ہم نے ایک CTCM (شکل 1a) تیار کیا ہے جو جسمانی تعدد (1.2 ہرٹج، 72 دھڑکن فی منٹ) پر برقی اور مکینیکل دونوں محرکات پیدا کرکے بالغ قلبی ماحول کی نقل کرسکتا ہے۔ ڈائیسٹول کے دوران بافتوں کے زیادہ کھنچاؤ سے بچنے کے لیے، ٹشو کے سائز میں 25% اضافہ کرنے کے لیے ایک 3D پرنٹنگ ڈیوائس استعمال کی گئی تھی (تصویر 1b)۔ C-PACE سسٹم کے ذریعہ الیکٹریکل پیسنگ کو کارڈیک سائیکل کو مکمل طور پر دوبارہ تیار کرنے کے لئے ڈیٹا کے حصول کے نظام کا استعمال کرتے ہوئے سسٹول سے پہلے 100 ms شروع کرنے کا وقت مقرر کیا گیا تھا۔ ٹشو کلچر سسٹم ایک قابل پروگرام نیومیٹک ایکچیویٹر (LB انجینئرنگ، جرمنی) کا استعمال کرتا ہے تاکہ اوپری چیمبر میں دل کے ٹکڑوں کو پھیلانے کے لیے ایک لچکدار سلیکون جھلی کو چکرا کر پھیلایا جا سکے۔ سسٹم کو پریشر ٹرانسڈیوسر کے ذریعے ایک بیرونی ایئر لائن سے منسلک کیا گیا تھا، جس سے پریشر (± 1 mmHg) اور وقت (± 1 ms) (تصویر 1c) کو درست طریقے سے ایڈجسٹ کرنا ممکن ہوا۔
a آلے کے کلچر چیمبر کے اندر، نیلے رنگ میں دکھائے گئے 7 ملی میٹر سپورٹ رنگ کے ساتھ ٹشو سیکشن منسلک کریں۔ ثقافتی چیمبر کو ایک پتلی لچکدار سلیکون جھلی کے ذریعے ایئر چیمبر سے الگ کیا جاتا ہے۔ رساو کو روکنے کے لیے ہر چیمبر کے درمیان ایک گسکیٹ رکھیں۔ ڈیوائس کے ڈھکن میں گریفائٹ الیکٹروڈ ہوتے ہیں جو برقی محرک فراہم کرتے ہیں۔ b بڑے ٹشو ڈیوائس، گائیڈ کی انگوٹی اور سپورٹ کی انگوٹی کی اسکیمیٹک نمائندگی۔ ٹشو سیکشنز (براؤن) بڑے سائز کے آلے پر گائیڈ کی انگوٹھی کے ساتھ آلے کے بیرونی کنارے پر نالی میں رکھے جاتے ہیں۔ گائیڈ کا استعمال کرتے ہوئے، کارڈیک ٹشو کے حصے پر ٹشو ایکریلک چپکنے والی لیپت والی سپورٹ کی انگوٹھی کو احتیاط سے رکھیں۔ c گراف ایک پروگرام ایبل نیومیٹک ایکچیویٹر (PPD) کے ذریعے کنٹرول شدہ ایئر چیمبر پریشر کے کام کے طور پر برقی محرک کا وقت دکھا رہا ہے۔ پریشر سینسر کا استعمال کرتے ہوئے برقی محرک کو ہم آہنگ کرنے کے لیے ڈیٹا کے حصول کا آلہ استعمال کیا گیا تھا۔ جب کلچر چیمبر میں دباؤ مقررہ حد تک پہنچ جاتا ہے، تو ایک پلس سگنل C-PACE-EM کو برقی محرک کو متحرک کرنے کے لیے بھیجا جاتا ہے۔ d انکیوبیٹر شیلف پر رکھے گئے چار CTCMs کی تصویر۔ نیومیٹک سرکٹ کے ذریعے چار آلات ایک پی پی ڈی سے منسلک ہوتے ہیں، اور نیومیٹک سرکٹ میں دباؤ کی نگرانی کے لیے ہیموسٹیٹک والو میں پریشر سینسر داخل کیے جاتے ہیں۔ ہر ڈیوائس میں چھ ٹشو سیکشن ہوتے ہیں۔
ایک نیومیٹک ایکچیویٹر کا استعمال کرتے ہوئے، ہم 4 CTCM ڈیوائسز کو کنٹرول کرنے میں کامیاب ہوئے، جن میں سے ہر ایک 6 ٹشو سیکشنز (تصویر 1d) رکھ سکتا ہے۔ CTCM میں، ہوا کے چیمبر میں ہوا کا دباؤ سیال چیمبر میں ہم آہنگی کے دباؤ میں تبدیل ہو جاتا ہے اور دل کے ٹکڑوں کی جسمانی توسیع کو آمادہ کرتا ہے (شکل 2a اور ضمنی فلم 1)۔ 80 ملی میٹر Hg پر ٹشو اسٹریچ کا اندازہ۔ فن ٹشو سیکشنز کو 25% تک کھینچنا دکھایا (تصویر 2b)۔ یہ فی صد کا تناسب عام کارڈیک سیکشن کے سنکچن 17,19,25 کے لیے 2.2–2.3 µm کی جسمانی سارکومیر کی لمبائی کے مساوی دکھایا گیا ہے۔ کسٹم کیمرہ سیٹنگز (ضمنی شکل 1) کا استعمال کرتے ہوئے ٹشو کی نقل و حرکت کا اندازہ لگایا گیا۔ بافتوں کی نقل و حرکت کا طول و عرض اور رفتار (تصویر 2c، d) کارڈیک سائیکل کے دوران کھینچنے اور سسٹول اور ڈائیسٹول (تصویر 2b) کے دوران وقت کے مساوی ہے۔ سنکچن اور آرام کے دوران کارڈیک ٹشو کی کھینچنا اور رفتار کلچر میں 12 دن تک مستقل رہی (تصویر 2 ایف)۔ ثقافت کے دوران سکڑاؤ پر برقی محرک کے اثر کا اندازہ کرنے کے لیے، ہم نے شیڈنگ الگورتھم (ضمنی شکل 2a،b) کا استعمال کرتے ہوئے فعال اخترتی کا تعین کرنے کے لیے ایک طریقہ تیار کیا اور برقی محرک کے ساتھ اور اس کے بغیر اخترتی کے درمیان فرق کرنے کے قابل تھے۔ دل کا ایک ہی حصہ (تصویر 2 ایف)۔ کٹ (R6-9) کے حرکت پذیر علاقے میں، برقی محرک کے دوران وولٹیج برقی محرک کی عدم موجودگی کے مقابلے میں 20% زیادہ تھا، جو کہ کنٹریکٹائل فنکشن میں برقی محرک کی شراکت کی نشاندہی کرتا ہے۔
ہوا کے چیمبر کے دباؤ، سیال چیمبر کے دباؤ، اور ٹشو کی نقل و حرکت کی پیمائش کے نمائندہ نشانات اس بات کی تصدیق کرتے ہیں کہ چیمبر کا دباؤ سیال چیمبر کے دباؤ کو تبدیل کرتا ہے، جس کی وجہ سے ٹشو سلائس کی حرکت ہوتی ہے۔ b ٹشو سیکشنز کے فیصد اسٹریچ (نیلے) کے نمائندہ نشانات جو فیصد اسٹریچ (نارنجی) سے مماثل ہیں۔ c کارڈیک سلائس کی پیمائش شدہ حرکت حرکت کی پیمائش کی گئی رفتار سے مطابقت رکھتی ہے۔ (d) دل کے ایک ٹکڑے میں چکراتی حرکت (نیلی لکیر) اور رفتار (نارنجی نقطے والی لکیر) کی نمائندہ رفتار۔ e سائیکل کے وقت کی مقدار (n = 19 سلائس فی گروپ، مختلف خنزیر سے)، سکڑنے کا وقت (n = 19 سلائس فی گروپ)، آرام کا وقت (n = 19 سلائس فی گروپ، مختلف خنزیر سے)، ٹشو کی حرکت (n = 25)۔ سلائسز)/مختلف خنزیروں سے گروپ)، چوٹی سیسٹولک رفتار (n = 24(D0)، 25(D12) سلائسیں/مختلف سوروں سے گروپ) اور چوٹی میں نرمی کی شرح (n=24(D0)، 25(D12) سلائسیں/مختلف سوروں سے گروپ)۔ دو دم والے طالب علم کے ٹی ٹیسٹ نے کسی بھی پیرامیٹر میں کوئی خاص فرق نہیں دکھایا۔ f (سرخ) اور بغیر (نیلے) برقی محرک کے ساتھ ٹشو سیکشنز کے نمائندہ تناؤ کا تجزیہ، اسی سیکشن سے ٹشو سیکشن کے دس علاقائی حصے۔ نیچے کے پینل مختلف حصوں سے دس علاقوں میں برقی محرک کے ساتھ اور اس کے بغیر ٹشو سیکشنز میں تناؤ میں فیصد فرق کی مقدار کو ظاہر کرتے ہیں۔ (n = 8 سلائسز/مختلف خنزیر سے گروپ، دو دم والے طالب علم کا ٹی ٹیسٹ کیا جاتا ہے؛ ****p <0.0001، **p <0.01، *p <0.05)۔ (n = 8 سلائسز/مختلف خنزیر سے گروپ، دو دم والے طالب علم کا ٹی ٹیسٹ کیا جاتا ہے؛ ****p <0.0001، **p <0.01، *p <0.05)۔ (n = 8 срезов/группу от разных свиней, проводится двусторонний t-критерий Стьюдента; ****p<0,0001, **p<0,01, *p<0,00,*p)۔ (n = مختلف خنزیروں سے 8 حصے/گروپ، دو دم والے طالب علم کا ٹی ٹیسٹ؛ ****p<0.0001، **p<0.01، *p<0.05)۔ （n = 8 片/组，来自不同的猪，进行双尾学生t 检验；**p <0.0001，**p <0.01,*p <0.05）۔ （n = 8 片/组，来自不同的猪，进行双尾学生t 检验；**p <0.0001，**p <0.01,*p <0.05）۔ (n = 8 срезов/группу, от разных свиней, двусторонний критерий Стьюдента; ****p <0,0001, **p <0,01, *p <0,05)۔ (n = 8 حصے/گروپ، مختلف خنزیر سے، دو دم والے طالب علم کا ٹی ٹیسٹ؛ ****p<0.0001، **p<0.01، *p<0.05)۔ایرر بارز اوسط ± معیاری انحراف کی نمائندگی کرتے ہیں۔
ہمارے پچھلے جامد بایومیمیٹک ہارٹ سلائس کلچر سسٹم [20، 21] میں، ہم نے برقی محرک کو لاگو کرکے اور درمیانی ساخت کو بہتر بنا کر 6 دن تک دل کے ٹکڑوں کی عملداری، فنکشن اور ساختی سالمیت کو برقرار رکھا۔ تاہم، 10 دن کے بعد، ان اعداد و شمار میں تیزی سے کمی آئی۔ ہم اپنے پچھلے جامد بایومیمیٹک کلچر سسٹم 20، 21 کنٹرول کنڈیشنز (Ctrl) میں کلچرڈ سیکشنز کا حوالہ دیں گے اور ہم بیک وقت مکینیکل اور برقی محرک (CTCM) کے تحت MC حالات اور کلچر کے طور پر اپنے پہلے سے بہتر شدہ میڈیم کا استعمال کریں گے۔ بلایا سب سے پہلے، ہم نے طے کیا کہ برقی محرک کے بغیر مکینیکل محرک 6 دن تک ٹشو کی عملداری کو برقرار رکھنے کے لیے ناکافی تھا (ضمیمہ تصویر 3a،b)۔ دلچسپ بات یہ ہے کہ، STCM کا استعمال کرتے ہوئے فزیو مکینیکل اور برقی محرک کے تعارف کے ساتھ، 12 دن کے دل کے حصوں کی عملداری MS کی حالتوں میں دل کے تازہ حصوں کی طرح ہی رہی، لیکن Ctrl کے حالات میں نہیں، جیسا کہ MTT تجزیہ (تصویر 1) سے دکھایا گیا ہے۔ 3a)۔ اس سے پتہ چلتا ہے کہ کارڈیک سائیکل کا مکینیکل محرک اور تخروپن ٹشو سیکشنز کو ہمارے پچھلے جامد کلچر سسٹم میں بتائے گئے دوگنا عرصے تک قابل عمل رکھ سکتا ہے۔ تاہم، کارڈیک ٹراپونن T اور کونیکسن 43 کی امیونو لیبلنگ کے ذریعے ٹشو سیکشنز کی ساختی سالمیت کا جائزہ ظاہر کرتا ہے کہ 12ویں دن ایم سی ٹشوز میں connexin 43 کا اظہار اسی دن کنٹرول کے مقابلے میں نمایاں طور پر زیادہ تھا۔ تاہم، یکساں کونیکسن 43 اظہار اور زیڈ ڈسک کی تشکیل کو مکمل طور پر برقرار نہیں رکھا گیا تھا (تصویر 3b)۔ ہم ایک مصنوعی ذہانت (AI) فریم ورک کا استعمال کرتے ہیں تاکہ ٹشو کی ساختی سالمیت کی مقدار درست ہو سکے26، ایک امیج پر مبنی گہری سیکھنے والی پائپ لائن جو ٹروپونن-T اور کونیکسن سٹیننگ 43 پر مبنی ہے جو کہ لوکلائزیشن کی مضبوطی کے لحاظ سے دل کے ٹکڑوں کی ساختی سالمیت اور فلوروسینس کو خود بخود مانتی ہے۔ یہ طریقہ ایک Convolutional Neural Network (CNN) اور ایک گہرے سیکھنے کے فریم ورک کا استعمال کرتا ہے تاکہ کارڈیک ٹشو کی ساختی سالمیت کو خودکار اور غیر جانبدارانہ انداز میں درست طریقے سے درست کیا جا سکے، جیسا کہ حوالہ میں بیان کیا گیا ہے۔ 26. MC ٹشو نے جامد کنٹرول سیکشنز کے مقابلے دن 0 میں ساختی مماثلت کو بہتر بنایا۔ اس کے علاوہ، میسن کے ٹرائیکروم سٹیننگ نے کلچر کے 12 ویں دن (تصویر 3c) کے کنٹرول کے حالات کے مقابلے میں MS کے حالات میں فائبروسس کی نمایاں طور پر کم فیصد کا انکشاف کیا۔ جب کہ CTCM نے دل کے ٹشو سیکشنز کی عملداری کو دن 12 میں دل کے تازہ ٹشو کی طرح بڑھایا، اس نے دل کے حصوں کی ساختی سالمیت میں خاطر خواہ بہتری نہیں کی۔
بار گراف تازہ دل کے ٹکڑوں (D0) یا ہارٹ سلائس کلچر کی 12 دنوں کے لیے ایم ٹی ٹی کے قابل عمل ہونے کی مقدار ظاہر کرتا ہے یا تو سٹیٹک کلچر (D12 Ctrl) یا CTCM (D12 MC) (n = 18 (D0)، 15 (D12 Ctrl)، 12 (Dlic 12 pigs سے مختلف ہے) D0 کے مقابلے ####p <0.0001 اور D12 Ctrl کے مقابلے **p <0.01)۔ ایک بار گراف تازہ دل کے سلائسز (D0) یا ہارٹ سلائس کلچر کی 12 دنوں کے لیے یا تو سٹیٹک کلچر (D12 Ctrl) میں یا CTCM (D12 MC) (n = 18 (D0)، 15 (D12 Ctrl)، 12 (D12 Ctrl)، 12 (D12) ٹیسٹ کے مختلف طریقوں سے ایم ٹی ٹی کی عملداری کو ظاہر کرتا ہے۔ D0 کے مقابلے ####p <0.0001 اور D12 Ctrl کے مقابلے **p <0.01) انجام دیا جاتا ہے۔ہسٹوگرام ایم ٹی ٹی کے تازہ دل کے حصوں (D0) یا دل کے حصوں کی کلچر کی 12 دنوں کے لیے جامد کلچر (D12 کنٹرول) یا CTCM (D12 MC) (n = 18 (D0) (n = 18 (D0)، 15 (D12 کنٹرول)، 12 (D12 MC) میں 12 دن کے لیے قابل عمل ہونے کی مقدار کو ظاہر کرتا ہے۔####p <0,0001 по сравнению с D0 اور **p <0,01 по сравнению с D12 Ctrl)۔ ####p <0.0001 D0 کے مقابلے اور **p <0.01 D12 Ctrl کے مقابلے)۔ a 条形图显示在静态培养(D12 Ctrl) 或CTCM (D12 MC) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl) 中新鲜心脏切)片或心脏切片培养12 天的MTT 活力的量化)，来自不同猪的12 (D12 MC)相比，####p <0.0001，与D12 Ctrl 相比，**p <0.01)۔ a 条形图显示在静态培养(D12 Ctrl) 或CTCM (D12 MC) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl) 中新鲜心脏切)片，来自不同猪的12 (D12 MC) 切片/组，进行单向ANOVA 测试；与D0 相比，###p <0.0001，CtrlD12，与p.ہسٹوگرام دل کے تازہ حصوں (D0) میں MTT کی قابل عملیت کی مقدار کو ظاہر کرتا ہے یا دل کے حصوں میں 12 دن تک جامد کلچر (D12 کنٹرول) یا CTCM (D12 MC) (n = 18 (D0)، 15 (D12 کنٹرول))، 12 (D12 MC) سیکشنز/گروپ مختلف ANO-ٹیسٹ، ون وے ٹیسٹ####p <0,0001 по сравнению с D0, **p <0,01 по сравнению с D12 Ctrl)۔ ####p <0.0001 D0 کے مقابلے، **p <0.01 مقابلے D12 Ctrl)۔b Troponin-T (سبز)، connexin 43 (سرخ) اور DAPI (نیلے) دل کے تازہ الگ تھلگ حصوں میں (D0) یا دل کے حصے جو جامد حالات (Ctrl) یا CTCM حالات (MC) کے تحت 12 دن تک) نمائندہ امیونو فلوروسینس امیجز (خالی پیمانہ = 100 µm) کے تحت مہذب ہوتے ہیں۔ دل کے بافتوں کی ساختی سالمیت کی مصنوعی ذہانت کی مقدار (n = 7 (D0)، 7 (D12 Ctrl)، 5 (D12 MC) سلائسز/گروپ ہر ایک مختلف سور سے، یک طرفہ ANOVA ٹیسٹ کیا جاتا ہے؛ ####p <0.0001 D0 اور D0r کے مقابلے میں <0.0001 کے مقابلے D0 اور D ***0*)۔ دل کے بافتوں کی ساختی سالمیت کی مصنوعی ذہانت کی مقدار (n = 7 (D0)، 7 (D12 Ctrl)، 5 (D12 MC) سلائسز/مختلف خنزیروں میں سے ہر ایک کا گروپ، یک طرفہ ANOVA ٹیسٹ کیا جاتا ہے؛ ####p <0.0001 D0 اور D0r کے مقابلے میں <0.0001 کے مقابلے D0 اور D0*** Количественная оценка структурной целостности сердечной ткани искусственным интеллектом (n = 7 (D0), 7 (D12 Ctrl), 5/12 MC разных свиней, проводится однофакторный тест انووا؛ ####p < 0,0001 по сравнению с D0 اور ****p <0,0001 по сравнению) مختلف خنزیروں کے مصنوعی ذہانت (n = 7 (D0)، 7 (D12 Ctrl)، 5 (D12 MC) سیکشنز/گروپس کے ذریعے کارڈیک ٹشو کی ساختی سالمیت کی مقدار کا تعین، یک طرفہ ANOVA ٹیسٹ کیا گیا؛ ####p <0.0001 بمقابلہ D0*0 اور D0 کے مقابلے Ctrl)۔人工智能量化心脏组织结构完整性（n = 7 (D0), 7 (D12 Ctrl), 5 (D12 MC) سلائسز/گروپ مختلف سور میں سے ہر ایک، یک طرفہ ANOVA ٹیسٹ۔相比，****p <0.0001 与D12 Ctrl 相比）۔人工智能量化心脏组织结构完整性（n = 7 (D0), 7 (D12 Ctrl), 5 (D12 MC) سلائسز/گروپ مختلف سوروں میں سے ہر ایک، یک طرفہ ANOVA test.##0p.与D0相比，****p <0.0001 与D12 Ctrl 相比）۔ Искусственный интеллект для количественной оценки структурной целостности сердечной ткани (n = 7 (D0), 7 (D12 Ctrl/D05)، каждой из разных свиней, односторонний тест ANOVA; ####p <0,0001 بمقابلہ D0 Для сравнения ****p < 0,0001 по сравнению сrl2)۔ مصنوعی ذہانت کارڈیک ٹشو (n = 7 (D0)، 7 (D12 Ctrl)، 5 (D12 MC) سیکشنز/گروپ مختلف سوروں میں سے ہر ایک کی ساختی سالمیت کا تعین کرنے کے لیے، ایک طرفہ ANOVA ٹیسٹ؛ ####p<0.0001 بمقابلہ .D0 D0 کے مقابلے D0*0 <1 کے مقابلے Ctrl)۔ c نمائندہ تصاویر (بائیں) اور میسن کے ٹرائیکروم داغ سے داغے ہوئے دل کے ٹکڑوں کے لیے مقدار (دائیں) D12 Ctrl)۔ c نمائندہ تصویریں (بائیں) اور مقدار (دائیں) میسن کے ٹرائیکروم داغ سے داغے ہوئے دل کے ٹکڑوں کے لیے (اسکیل بیئر = 500 µm) (n = 10 سلائسز/مختلف خنزیروں سے ہر ایک گروپ، ایک طرفہ ANOVA ٹیسٹ کیا جاتا ہے؛ #### p <0. ***0 کے مقابلے میں #### p <0. ***0 <1 <0 کے مقابلے D12 Ctrl)۔ c Репрезентативные изображения (слева) и количественная оценка (справа) срезов сердца, окрашенных трихромным красибаслева покрытия = 500 мкм) (n = 10 срезов/группу от разных свиней, выполняется односторонний тест ANOVA؛ #### p < 0,000p *** D 0,0001 0,001 по сравнению с D12 Ctrl)۔ c دل کے حصوں کی نمائندہ تصاویر (بائیں) اور مقدار کا تعین (دائیں) میسن کے ٹرائیکروم اسٹین (غیر کوٹیڈ اسکیل = 500 µm) (n = 10 حصے/گروپ مختلف خنزیروں سے، یک طرفہ ANOVA ٹیسٹ کیا گیا؛ #### p <0 .0001 D کے مقابلے D ***01 کے مقابلے D ***01 Ctrl)۔ c 用Masson 三色染料染色的心脏切片的代表性图像（左）和量化（右）（裸尺剉（0¼n0m0µ=个切片/组，每组来自不同的猪，进行单向ANOVA 测试；#### p < 0.0001 与D0 相比，***p <0.0.相比). C 用 masson 三 色 染料 的 心脏 切片 的 代表性 （左 左） 量化 （右） 裸尺度度度带裸度裸尺度 = 500 µm） （n = 10 个 切片 组 每 组 来自 不同 猪 ， 进行 单向 单勛 单向 单勐 انووا 0.0001 与D0 相比，***p <0.001 与D12 Ctrl 相比）۔ c Репрезентативные изображения (слева) и количественный анализ (справа) срезов сердца, окрашенных трихромным (слева) = 500 мкм) (n = 10 срезов/группа, каждый от другой свиньи, протестировано с помощью однофакторного дисперсионного ####### 0,0001 по сравнению с D0, ***p <0,001 по сравнению с D12 Ctrl)۔ c دل کے حصوں کی نمائندہ تصاویر (بائیں) اور مقدار (دائیں) میسن کے ٹرائیکروم اسٹین (خالی = 500 µm) (n = 10 حصے/گروپ، ہر ایک مختلف سور سے، تغیر کے یک طرفہ تجزیے کے ذریعے جانچا گیا؛ ### # p <0. ***0 کے مقابلے میں <1 <0. ***0 کے مقابلے میں۔ D12 Ctrl)۔ایرر بارز اوسط ± معیاری انحراف کی نمائندگی کرتے ہیں۔
ہم نے قیاس کیا کہ کلچر میڈیم میں چھوٹے مالیکیولز کو شامل کرکے، کارڈیو مایوسائٹ کی سالمیت کو بہتر بنایا جا سکتا ہے اور CTCM کلچر کے دوران فبروسس کی نشوونما کو کم کیا جا سکتا ہے۔ لہذا ہم نے الجھنے والے عوامل کی کم تعداد کی وجہ سے اپنے جامد کنٹرول کلچرز 20,21 کا استعمال کرتے ہوئے چھوٹے مالیکیولز کی اسکریننگ کی۔ Dexamethasone (Dex)، triiodothyronine (T3)، اور SB431542 (SB) اس اسکرین کے لیے منتخب کیے گئے تھے۔ یہ چھوٹے مالیکیولز پہلے hiPSC-CM ثقافتوں میں sarcomere کی لمبائی، T-tubeles، اور ترسیل کی رفتار کو بڑھا کر کارڈیو مایوسائٹس کی پختگی کو دلانے کے لیے استعمال ہوتے رہے ہیں۔ اس کے علاوہ، ڈیکس (ایک گلوکوکورٹیکائیڈ) اور ایس بی دونوں 29,30 سوزش کو دبانے کے لیے جانے جاتے ہیں۔ لہذا، ہم نے جانچ کی کہ آیا ان چھوٹے مالیکیولز کا ایک یا ان کا مجموعہ دل کے حصوں کی ساختی سالمیت کو بہتر بنائے گا۔ ابتدائی اسکریننگ کے لیے، ہر مرکب کی خوراک کا انتخاب سیل کلچر ماڈلز (1 μM Dex27، 100 nM T327، اور 2.5 μM SB31) میں عام طور پر استعمال ہونے والے ارتکاز کی بنیاد پر کیا گیا تھا۔ 12 دن کی ثقافت کے بعد، T3 اور Dex کے امتزاج کے نتیجے میں زیادہ سے زیادہ کارڈیو مایوسائٹ کی ساختی سالمیت اور کم سے کم ریشے والی دوبارہ تشکیل (ضمنی اعداد و شمار 4 اور 5) نکلی۔ اس کے علاوہ، T3 اور Dex کے ان ارتکاز کو دوگنا یا دوگنا استعمال کرنے سے عام ارتکاز کے مقابلے میں نقصان دہ اثرات پیدا ہوئے (ضمیمہ تصویر 6a،b)۔
ابتدائی اسکریننگ کے بعد، ہم نے 4 ثقافتی حالات (شکل 4a) کا سر سے موازنہ کیا: Ctrl: ہمارے بہتر میڈیم کا استعمال کرتے ہوئے ہمارے پہلے بیان کردہ جامد کلچر میں کلچرڈ دل کے حصے؛ 20.21 TD: T3 اور Ctrl s بدھ کو ڈیکس شامل کیا گیا؛ MC: ہمارے پہلے سے بہتر کردہ میڈیم کا استعمال کرتے ہوئے CTCM میں دل کے حصوں کی ثقافت؛ اور MT: T3 اور Dex کے ساتھ CTCM میڈیم میں شامل کیا گیا۔ 12 دن کی کاشت کے بعد، MS اور MT ٹشوز کی قابل عملیت وہی رہی جو تازہ ٹشوز میں MTT پرکھ (تصویر 4b) کے ذریعے تشخیص کی گئی تھی۔ دلچسپ بات یہ ہے کہ ٹرانس ویل کلچرز (TD) میں T3 اور Dex کے اضافے کے نتیجے میں Ctrl حالات کے مقابلے میں قابل عمل بہتری نہیں آئی، جو دل کے حصوں کی عملداری کو برقرار رکھنے میں مکینیکل محرک کے اہم کردار کی نشاندہی کرتی ہے۔
ایک تجرباتی ڈیزائن کا خاکہ جس میں 12 دنوں کے لیے درمیانے درجے پر مکینیکل محرک اور T3/Dex سپلیمنٹیشن کے اثرات کا جائزہ لینے کے لیے استعمال ہونے والی ثقافت کی چار حالتوں کو دکھایا گیا ہے۔ b بار گراف تازہ دل کے ٹکڑوں (D0) (n = 18 (D0)، 15 (D12 Ctrl، D12 TD اور D12 MT) کے مقابلے 4 ثقافتی حالات (Ctrl، TD، MC، اور MT) میں کلچر کے بعد 12 دن کے بعد کی قابل عملیت کی مقدار کو ظاہر کرتا ہے، 12 (D12 pisways/mc سے مختلف ہے۔ انجام دیا گیا؛ ####p <0.0001، ###p <0.001 D0 کے مقابلے اور **p <0.01 D12 Ctrl کے مقابلے)۔ b بار گراف تازہ دل کے ٹکڑوں (D0) (n = 18 (D0)، 15 (D12 Ctrl، D12 TD اور D12 MT) کے مقابلے 4 ثقافتی حالات (Ctrl، TD، MC، اور MT) میں کلچر کے بعد 12 دن کے بعد کی قابل عملیت کی مقدار کو ظاہر کرتا ہے، 12 (D12 pisways/mc سے مختلف ہے۔ انجام دیا گیا؛ ####p <0.0001، ###p <0.001 D0 کے مقابلے اور **p <0.01 D12 ctrl کے مقابلے)۔ b Гистограмма показывает количественную оценку жизнеспособности через 12 дней после культивирования во всех 4 усеховирования (کونٹرول، TD، MC اور MT) по сравнению со свежими срезами сердца (D0) (n = 18 (D0)، 15 (D12 Ctrl, D12 TD اور D12 MT)، 12 (12) разных свиней, проводится односторонний тест انووا؛ ####p <0,0001, ###p <0,001 по сравнению с D0 اور **p <0,01 D0,01 D b بار گراف تازہ دل کے حصوں (D0) (n = 18 (D0)، 15 (D12 Ctrl، D12 TD، اور D12 MT)، 12 (D12 pigss، 12 (D12 pigs/mc سے مختلف ٹیسٹ)، 12 (D12 pigs/mc) کے مقابلے میں تمام 4 ثقافتی حالات (کنٹرول، TD، MC، اور MT) میں کلچر کے بعد 12 دنوں میں قابل عمل ہونے کی مقدار کو ظاہر کرتا ہے۔ ####p <0.0001، ###p <0.001 بمقابلہ D0 اور **p <0.01 بذریعہ D12 Ctrl)۔ b 条形图显示所有4 种培养条件（Ctrl、TD、MC 和MT）与新鲜心脏切片、D0) (n = 18 (D10) TD 和D12 MT)，来自不同猪的12 (D12 MC) 切片/组，进行单向ANOVA 测试；####p <0.0001，###p <0p <0.** 0.01 与D12控制)۔b 4 12 (D12 MC) b Гистограмма, показывающая все 4 условия культивирования (control, TD, MC и MT) по сравнению со свежими срезами (серзами) 15 (D12 Ctrl, D12 TD اور D12 MT), от разных свиней 12 (D12 MC) срезы/группа, односторонний тест ANOVA; ####p <0,0001,0001 D0، **p <0,01 по сравнению с контролем D12)۔ b ہسٹوگرام تمام 4 ثقافتی حالات (کنٹرول، TD، MC اور MT) دکھا رہا ہے جو دل کے تازہ حصوں (D0) (n = 18 (D0) کے مقابلے میں، 15 (D12 Ctrl، D12 TD اور D12 MT)، مختلف خنزیروں کے 12 (D12 MC) سیکشنز/گروپ، یک طرفہ ANOVA ٹیسٹ؛ #00p؛ ##0؛ ##0۔ ###p<0.001 بمقابلہ D0، **p<0.01 بمقابلہ کنٹرول D12)۔ c بار گراف تمام 4 کلچر حالات (Ctrl، TD، MC، اور MT) میں کلچر کے بعد گلوکوز کی مقدار کو ظاہر کرتا ہے (Ctrl, TD, MC, اور MT) تازہ دل کے ٹکڑوں (D0) (n = 6 سلائسس/مختلف خنزیروں سے گروپ، یک طرفہ ANOVA ٹیسٹ کیا جاتا ہے؛ ###p <0.00 کے مقابلے میں ***1، <0.00 اور ***1 کے مقابلے D12 Ctrl)۔ c بار گراف تمام 4 کلچر حالات (Ctrl، TD، MC، اور MT) میں کلچر کے بعد گلوکوز کی مقدار کو ظاہر کرتا ہے (Ctrl, TD, MC, اور MT) تازہ دل کے ٹکڑوں (D0) (n = 6 سلائسس/مختلف خنزیروں سے گروپ، یک طرفہ ANOVA ٹیسٹ کیا جاتا ہے؛ ###p <0.00 کے مقابلے میں ***1، <0.00 اور ***1 کے مقابلے D12 Ctrl)۔ c Гистограмма показывает количественную оценку потока глюкозы через 12 дней после культивирования во всех 4 усех усеховирования (کونٹرول، ٹی ڈی، ایم سی اور ایم ٹی) انووا؛ ###p <0,001 по сравнению с D0 اور ***p <0,001 по сравнению с D12 Ctrl)۔ c ہسٹوگرام تمام 4 ثقافتی حالات (کنٹرول، TD، MC اور MT) کے تحت کلچر کے بعد 12 دن کے بعد گلوکوز کے بہاؤ کی مقدار کو ظاہر کرتا ہے دل کے تازہ حصوں (D0) کے مقابلے میں (n = 6 حصے/گروپ مختلف خنزیروں سے، یک طرفہ ANOVA ٹیسٹ کیا گیا؛ ###p <0.001 D0 اور D0r کے مقابلے C***1 <0.001)۔ c 条形图显示所有4 种培养条件（Ctrl、TD、MC 和MT）与新鲜心脏切片(D0) 相比养切片天的葡萄糖通量定量（n = 6 片/组，来自不同猪，单向执行انووا 测试；###p <0.001，.0p <0p <0.001，.与D12 Ctrl 相比)۔ C 条形图 显示 所有 4 种 条件 （（ctrl 、 td 、 mc 和 mt） 新鲜 心脏 切片 切片戇片培养 后 12 天 的 通量 定量 （n = 6 片/组 ， 来自 猪 ， ， ， ， ， ， ， A 猪单吡 VA测试；###p <0.001，与D0 相比，***p <0.001 与D12 Ctrl 相比）۔ c Гистограмма, показывающая количественную оценку потока глюкозы через 12 дней после культивирования для всеховирования для всеховирования (CONTROL, TD, MC и MT) по сравнению со свежими срезами сердца (D0) (n = 6 срезов/группа, от разных свиней, одроных свиней, одроных свиней тесты ANOVA ; c ہسٹوگرام تمام 4 ثقافتی حالات (کنٹرول، TD، MC، اور MT) کے لیے کلچر کے بعد 12 دن میں گلوکوز کے بہاؤ کی مقدار کو ظاہر کرتا ہے جو دل کے تازہ حصوں (D0) (n = 6 حصے/گروپ، مختلف خنزیروں سے، یکطرفہ ANOVA ٹیسٹ کیے گئے تھے، ###p <0.00، ***1 p <0.00، ***1 کے مقابلے D0.00 کے مقابلے میں۔ (کنٹرول)d تازہ (نیلے)، دن 12 ایم سی (سبز)، اور دن 12 ایم ٹی (سرخ) ٹشوز کے دس علاقائی ٹشو سیکشن پوائنٹس (n = 4 سلائسز/گروپ، یک طرفہ ANOVA ٹیسٹ؛ گروپوں کے درمیان کوئی خاص فرق نہیں تھا) کے تناؤ کا تجزیہ۔ e آتش فشاں پلاٹ جو دل کے تازہ حصوں (D0) میں 10-12 دنوں کے لیے جامد حالات (Ctrl) یا MT حالات (MT) کے تحت کلچر کیے گئے دل کے حصوں کے مقابلے میں مختلف جینز دکھاتا ہے۔ f دل کے حصوں کے لیے سارکومیر جین کا ہیٹ میپ ہر ثقافتی حالات کے تحت مہذب۔ ایرر بارز اوسط ± معیاری انحراف کی نمائندگی کرتے ہیں۔
میٹابولک انحصار فیٹی ایسڈ آکسیڈیشن سے گلائکولائسز کی طرف سوئچ پر کارڈیو مایوسائٹ کی تفریق کا خاصہ ہے۔ نادان کارڈیو مایوسائٹس بنیادی طور پر اے ٹی پی کی پیداوار کے لیے گلوکوز کا استعمال کرتے ہیں اور ان میں کچھ کرسٹی 5,32 کے ساتھ ہائپو پلاسٹک مائٹوکونڈریا ہوتا ہے۔ گلوکوز کے استعمال کے تجزیوں سے پتہ چلتا ہے کہ MC اور MT حالات میں، گلوکوز کا استعمال دن 0 کے ٹشوز (شکل 4c) کی طرح تھا۔ تاہم، Ctrl کے نمونوں نے تازہ بافتوں کے مقابلے میں گلوکوز کے استعمال میں نمایاں اضافہ دکھایا۔ اس سے ظاہر ہوتا ہے کہ CTCM اور T3/Dex کا امتزاج ٹشو کی قابل عملیت کو بڑھاتا ہے اور 12 دن کے مہذب دل کے حصوں کے میٹابولک فینوٹائپ کو محفوظ رکھتا ہے۔ اس کے علاوہ، تناؤ کے تجزیے سے پتہ چلتا ہے کہ MT اور MS کے حالات (تصویر 4d) کے تحت 12 دنوں تک دل کے تازہ بافتوں میں تناؤ کی سطح وہی رہی۔
کارڈیک سلائس ٹشو کے عالمی ٹرانسکرپشنی لینڈ اسکیپ پر CTCM اور T3/Dex کے مجموعی اثرات کا تجزیہ کرنے کے لیے، ہم نے چاروں مختلف ثقافتی حالات (ضمنی ڈیٹا 1) سے کارڈیک سلائسز پر RNAseq کا مظاہرہ کیا۔ دلچسپ بات یہ ہے کہ ایم ٹی سیکشنز نے دل کے تازہ بافتوں سے اعلی نقلی مماثلت ظاہر کی، جس میں 13,642 جینوں میں سے صرف 16 کا فرق ظاہر کیا گیا۔ تاہم، جیسا کہ ہم نے پہلے دکھایا، Ctrl سلائسز نے ثقافت میں 10-12 دنوں کے بعد 1229 مختلف جین ظاہر کیے (تصویر 4e)۔ ان اعداد و شمار کی تصدیق دل اور فبروبلاسٹ جینز کے qRT-PCR سے ہوئی (ضمنی شکل 7a-c)۔ دلچسپ بات یہ ہے کہ Ctrl سیکشنز نے کارڈیک اور سیل سائیکل جینز کی کمی اور سوزش والے جین پروگراموں کو چالو کرنے کو دکھایا۔ یہ اعداد و شمار بتاتے ہیں کہ تفریق، جو عام طور پر طویل مدتی کلچرنگ کے بعد ہوتی ہے، مکمل طور پر MT حالات (ضمنی شکل 8a،b) کے تحت کم ہوتی ہے۔ سارکومیر جینز کے بغور مطالعہ سے پتہ چلتا ہے کہ صرف MT حالات میں سارکومیر (تصویر 4f) اور آئن چینل (ضمنی شکل 9) کو انکوڈنگ کرنے والے جین محفوظ ہیں، جو انہیں Ctrl، TD، اور MC حالات میں دبانے سے بچاتے ہیں۔ یہ اعداد و شمار ظاہر کرتے ہیں کہ مکینیکل اور مزاحیہ محرک (T3/Dex) کے امتزاج کے ساتھ، دل کا ٹکڑا ٹرانسکرپٹوم کلچر میں 12 دن کے بعد دل کے تازہ ٹکڑوں کی طرح رہ سکتا ہے۔
ان نقلی نتائج کی تائید اس حقیقت سے ہوتی ہے کہ دل کے حصوں میں کارڈیو مایوسائٹس کی ساختی سالمیت کو MT حالات میں 12 دن کے لیے بہترین طور پر محفوظ کیا جاتا ہے، جیسا کہ برقرار اور مقامی کنکسین 43 (تصویر 5a) سے دکھایا گیا ہے۔ اس کے علاوہ، MT کے حالات میں دل کے حصوں میں فائبروسس Ctrl کے مقابلے میں نمایاں طور پر کم ہوا اور دل کے تازہ حصوں کی طرح (تصویر 5b)۔ یہ اعداد و شمار ظاہر کرتے ہیں کہ مکینیکل محرک اور T3/Dex علاج کا امتزاج کلچر میں دل کے حصوں میں قلبی ساخت کو مؤثر طریقے سے محفوظ رکھتا ہے۔
دل کے تازہ الگ تھلگ حصوں (D0) میں ٹراپونن-T (سبز)، کونیکسن 43 (سرخ) اور DAPI (نیلے) کی نمائندہ امیونو فلوروسینس امیجز یا دل کے چاروں حصے کلچر کی حالتوں میں 12 دن کے لیے کلچرڈ (اسکیل بار = 100 µm)۔ )۔ دل کے بافتوں کی ساختی سالمیت کی مصنوعی ذہانت کی مقدار (n = 7 (D0 اور D12 Ctrl)، 5 (D12 TD، D12 MC اور D12 MT) مختلف خنزیروں کے سلائسز/گروپ، یک طرفہ ANOVA ٹیسٹ کیا جاتا ہے؛ ####p <0.00p <*p <*000 اور ****5 کے مقابلے میں۔ D12 Ctrl کے مقابلے میں 0.0001)۔ دل کے بافتوں کی ساختی سالمیت کی مصنوعی ذہانت کی مقدار (n = 7 (D0 اور D12 Ctrl)، 5 (D12 TD، D12 MC اور D12 MT) مختلف خنزیروں کے سلائسز/گروپ، یک طرفہ ANOVA ٹیسٹ کیا جاتا ہے؛ #### p <0.00p <*000 اور ****p <*000 کے مقابلے میں۔ D12 Ctrl کے مقابلے میں 0.0001)۔ Количественная оценка структурной целостности ткани сердца с помощью искусственного интеллекта (n = 7 (D0 اور D12 Ctrl12)، DMCTD12 (D5D12) م сравнению с D12 Ctrl)۔ مصنوعی ذہانت (n = 7 (D0 اور D12 Ctrl)، 5 (D12 TD، D12 MC اور D12 MT) سیکشنز/گروپ کا استعمال کرتے ہوئے دل کے بافتوں کی ساختی سالمیت کی مقدار مختلف خنزیروں سے، ایک طرفہ ANOVA ٹیسٹ کیا گیا؛ #### p <0.0001 کے مقابلے D12 Ctrl کے مقابلے میں 0.0001)۔对不同猪的心脏组织结构完整性（n = 7（D0 和D12 Ctrl）、5（D12 TD、D12 MC 和D12 MT）切片/组）进行人工智能量化，进行单向ANOVA 测试；#### p < 0.0001 与D0 和*p <0.0001 与D0 和*p <0.0.** 0.0001 与D12 Ctrl 相比）۔对 不同 猪 的 心脏 结构 完整性 （n = 7 （d0 和 d12 ctrl） （5 （d12 td 、 d12 mc 12 mc人工 智能量 化 进行 单向 单向 单向 测试 ； ########## p < 0.0001 与D0 和*p <0.0001 与D0 和*p <0.0001 0.0001 与D12 Ctrl 相比）۔مختلف خنزیروں (n = 7 (D0 اور D12 Ctrl)، 5 (D12 TD، D12 MC اور D12 MT) سیکشنز/گروپ) میں ایک طرفہ ANOVA ٹیسٹ کے ساتھ مصنوعی ذہانت کا استعمال کرتے ہوئے کارڈیک ٹشو کی ساختی سالمیت کی مقدار کا تعین؛#### p <0,0001 по сравнению с D0 اور *p < 0,05 یا ****p < 0,0001 по сравнению с D12 Ctrl)۔ #### p <0.0001 D0 کے مقابلے میں اور *p <0.05 یا ****p <0.0001 D12 Ctrl کے مقابلے)۔ b میسن کے ٹرائیکروم اسٹین (اسکیل بار = 500 µm) (n = 10 (D0, D12 Ctrl, D12 TD, اور D12 MC) سے داغے ہوئے دل کے سلائسز کے لیے نمائندہ تصویریں اور مقدار کا تعین، 9 (D12 MT) سلائسز پرفارم کیا گیا ہے؛ AVA/ٹیسٹ سے مختلف ہے؛ VA سے مختلف ہے ####p <0.0001 D0 کے مقابلے میں اور ***p <0.001، یا ****p <0.0001 D12 Ctrl کے مقابلے)۔ b میسن کے ٹرائیکروم اسٹین (اسکیل بار = 500 µm) (n = 10 (D0, D12 Ctrl, D12 TD, اور D12 MC) سے داغے ہوئے دل کے سلائسز کے لیے نمائندہ تصویریں اور مقدار کا تعین، 9 (D12 MT) سلائسز پرفارم کیا گیا ہے؛ AVA/ٹیسٹ سے مختلف ہے؛ VA سے مختلف ہے ####p <0.0001 D0 کے مقابلے میں اور ***p <0.001، یا ****p <0.0001 D12 Ctrl کے مقابلے)۔ b Репрезентативные изображения и количественная оценка срезов сердца, окрашенных трихромным красителем Массона (= мкм) (n = 10 (D0, D12 Ctrl, D12 TD и D12 MC), 9 (D12 MT) срезов/группу от разных свиней, выполняется односторон; по сравнению с D0 اور ***p <0,001 یا ****p <0,0001 по сравнению с D12 Ctrl)۔ b میسن کے ٹرائیکروم اسٹین (اسکیل بار = 500 µm) (n = 10 (D0, D12 Ctrl, D12 TD اور D12 MC) سے داغے ہوئے دل کے حصوں کی نمائندہ تصاویر اور مقدار کا تعین، 9 (D12 MT) سیکشن/گروپ مختلف خنزیر سے ایک گروپ - <#### پرفارم کیا گیا- ANO. 0.0001 بمقابلہ D0 اور ***p < 0.001 یا ****p < 0.0001 بمقابلہ D12 Ctrl)۔ b 用Masson 三色染料染色的心脏切片的代表性图像和量化（比例尺=500 µm）（n = 10D CTRL相比,***p <0.001,或****p <0.0001 与D12 Ctrl 相比）۔ b 用 میسن 三 色 染料 的 心脏 切片 的 代表性 和 量化 （比例 尺 尺 尺 = 500 µm） = 0 d0m） d12 ctrl 、 d12 td 和 d12 mc） 来自 不同 的 9 个 d12 mt 切片 切片 切片 切片 切片 切片 切片切片 切片 切片 切片 切片 切片 切片 切片 切片 切片 切片/组，进行单因片 切片与D0 相比，***p <0.001，或****p <0.0001 与D12 Ctrl 相比）۔ b Репрезентативные изображения и количественная оценка срезов сердца, окрашенных трихромом Массона (масштабная =0манкая =0mn) (D0, D12 Ctrl, D12 TD اور D12 MC), 9 (D12 MT) срезов от разных свиней / группы, один- способ ANOVA; 0,001 یا ****p < 0,0001 по сравнению с D12 Ctrl)۔ b میسن کے ٹرائیکروم (اسکیل بار = 500 µm) (n = 10 (D0, D12 Ctrl, D12 TD اور D12 MC) سے داغے ہوئے دل کے حصوں کی نمائندہ تصاویر اور مقدار کا تعین، مختلف خنزیروں/گروپ کے 9 (D12 MT) حصے، ایک DNOVA کے مقابلے؛ ###0p. ***p <0.001 یا ****p <0.0001 D12 Ctrl کے مقابلے)۔ایرر بارز اوسط ± معیاری انحراف کی نمائندگی کرتے ہیں۔
آخر میں، کارڈیک ہائپر ٹرافی کی نقل کرنے کے لئے CTCM کی صلاحیت کا اندازہ کارڈیک ٹشو اسٹریچ کو بڑھا کر لگایا گیا۔ CTCM میں، چوٹی ایئر چیمبر پریشر 80 mmHg سے 80 mmHg تک بڑھ گیا۔ فن (عام اسٹریچ) 140 mmHg آرٹ تک۔ (تصویر 6a)۔ یہ اسٹریچ (تصویر 6b) میں 32 فیصد اضافے کے مساوی ہے، جو پہلے دل کے حصوں کے لیے ضروری تناسب کے تناسب کے طور پر دکھایا گیا تھا جو کہ ہائپر ٹرافی میں نظر آنے والی سارکومیر لمبائی حاصل کرنے کے لیے درکار ہے۔ سنکچن اور نرمی کے دوران کارڈیک ٹشو کی کھینچنا اور رفتار ثقافت کے چھ دنوں کے دوران مستقل رہی (تصویر 6c)۔ MT حالات سے کارڈیک ٹشو کو چھ دنوں تک نارمل اسٹریچ (MT (نارمل)) یا اوور اسٹریچ کنڈیشنز (MT (OS)) کا نشانہ بنایا گیا۔ کلچر میں پہلے ہی چار دنوں کے بعد، ہائپر ٹرافک بائیو مارکر NT-ProBNP کو MT (OS) حالات میں MT (عام) حالات (تصویر 7a) کے مقابلے درمیانے درجے میں نمایاں طور پر بلند کیا گیا تھا۔ اس کے علاوہ، کلچرنگ کے چھ دنوں کے بعد، MT (OS) (تصویر 7b) میں سیل کے سائز میں MT دل کے حصوں (عام) کے مقابلے میں نمایاں اضافہ ہوا۔ اس کے علاوہ، این ایف اے ٹی سی 4 جوہری نقل مکانی کو اوور سٹریچڈ ٹشوز (تصویر 7 سی) میں نمایاں طور پر بڑھایا گیا تھا۔ یہ نتائج ہائپر ڈسٹینشن کے بعد پیتھولوجیکل ریموڈلنگ کی ترقی پسند ترقی کو ظاہر کرتے ہیں اور اس تصور کی حمایت کرتے ہیں کہ CTCM ڈیوائس کو اسٹریچ انڈسڈ کارڈیک ہائپر ٹرافی سگنلنگ کا مطالعہ کرنے کے لیے پلیٹ فارم کے طور پر استعمال کیا جا سکتا ہے۔
ہوا کے چیمبر کے دباؤ، سیال چیمبر کے دباؤ، اور ٹشو کی نقل و حرکت کی پیمائش کے نمائندہ نشانات اس بات کی تصدیق کرتے ہیں کہ چیمبر کا دباؤ سیال چیمبر کے دباؤ کو تبدیل کرتا ہے، جس کی وجہ سے ٹشو سلائس کی حرکت ہوتی ہے۔ b عام طور پر پھیلے ہوئے (نارنجی) اور زیادہ اسٹریچڈ (نیلے) ٹشو سیکشنز کے لیے نمائندہ اسٹریچ فیصد اور اسٹریچ ریٹ کے منحنی خطوط۔ c بار گراف سائیکل کا وقت دکھا رہا ہے (n = 19 سلائس فی گروپ، مختلف خنزیروں سے)، سنکچن کا وقت (n = 18-19 سلائسس فی گروپ، مختلف سوروں سے)، آرام کا وقت (n = 19 سلائس فی گروپ، مختلف سوروں سے))، ٹشو کی حرکت کا طول و عرض (n = 14 سلائسس، مختلف پگس، گروپ سے مختلف قسم) مختلف خنزیروں سے 14 سلائسز/گروپ) اور چوٹی میں نرمی کی شرح (n = 14 (D0)، 15 (D6) ) سیکشنز/گروپس) مختلف خنزیروں سے)، دو دم والے طالب علم کے ٹی ٹیسٹ نے کسی بھی پیرامیٹر میں کوئی خاص فرق نہیں دکھایا، جس سے ظاہر ہوتا ہے کہ یہ پیرامیٹرز اوور وولٹیج کے ساتھ کلچر کے 6 دنوں کے دوران مستقل رہے۔ ایرر بارز اوسط ± معیاری انحراف کی نمائندگی کرتے ہیں۔
MT نارمل اسٹریچ (نارم) یا اوور اسٹریچنگ (OS) کنڈیشنز (n = 4 (D2 MTNorm)، 3 (D2 MTOS، D4 MTNorm، اور D4 MTOS) ہارٹ سلائسز سے کلچر میڈیا میں NT-ProBNP کے ارتکاز کی بار گراف کی مقدار کا تعین، A-Group/Group سے مختلف ہے عام اسٹریچ کے مقابلے میں 0.01)۔ MT نارمل اسٹریچ (نارم) یا اوور اسٹریچنگ (OS) حالات (n = 4 (D2 MTNorm)، 3 (D2 MTOS، D4 MTNorm، اور D4 MTOS) کے ٹکڑوں سے کلچر میڈیا میں NT-ProBNP ارتکاز کے بار گراف کی مقدار کا تعین دل کے ٹکڑوں سے کیا گیا ہے عام اسٹریچ کے مقابلے میں 0.01)۔عام MT اسٹریچ (معمول) یا اوور اسٹریچ (OS) (n = 4 (D2 MTNorm)، 3 (D2 MTOS، D4 MTNorm، اور D4) کے حالات کے تحت کلچرڈ دل کے سلائسز سے ثقافت میڈیم میں NT-ProBNP کے ارتکاز کا مقداری ہسٹوگرام۔ انجام دیا**p < 0,01 по сравнению с нормальным растяжением)۔ **p <0.01 عام اسٹریچ کے مقابلے)۔ a 在MT 正常拉伸(Norm) 或过度拉伸(OS) 条件下培养的心脏切片培养基中NT-ProBNP 浓度離4 (D2 MTNorm) 、3（D2 MTOS、D4 MTNorm 和D4 MTOS）来自不同猪的切片/组，进行双向方差分析；**与正常拉伸相比,p <0.01）۔ MT نارمل اسٹریچ (نارم) یا اوور اسٹریچ (OS) کے حالات (n = 4 (D2 MTNorm)، 3 (D2 MTOS، D4 MTNorm猪的切片/组，可以双向方方发发动; **عام کھینچنے کے مقابلے، p <0.01)۔ہسٹوگرام دل کے ٹکڑوں میں NT-ProBNP کی تعداد کی مقدار جو نارمل MT اسٹریچ (نارم) یا اوور اسٹریچ (OS) (n = 4 (D2 MTNorm)، 3 (D2 MTOS، D4 MTNorm) اور D4 MTOS) سلائسس/گروپ کے مختلف خنزیروں کے دو طرفہ سے،**p < 0,01 по сравнению с нормальным растяжением)۔ **p <0.01 عام اسٹریچ کے مقابلے)۔ b دل کے ٹکڑوں کے لیے نمائندہ تصاویر جو ٹروپونن-T اور WGA (بائیں) سے داغے ہوئے ہیں اور سیل کے سائز کی مقدار (دائیں) (n = 330 (D6 MTOS)، 369 (D6 MTNorm) خلیات/گروپ مختلف خنزیروں کے 10 مختلف سلائسوں سے، دو دم والے طالب علم کی کارکردگی کے مقابلے میں۔ کھینچنا)۔ b ٹروپونن-T اور WGA (بائیں) سے داغے ہوئے دل کے ٹکڑوں کے لیے نمائندہ تصاویر اور سیل کے سائز کی مقدار (دائیں) (n = 330 (D6 MTOS)، 369 (D6 MTNorm) خلیات/گروپ مختلف خنزیروں کے 10 مختلف سلائسوں سے، دو دم والے طالب علم کی کارکردگی کے مقابلے میں سب سے عام t*0. کھینچنا)۔ b Репрезентативные изображения срезов сердца, окрашенных тропонином-Т и АЗП (слева) и количественного определения (расления) = 330 (D6 MTOS)، 369 (D6 MTNorm) клеток/группу из 10 разных срезов от разных свиней, два- проводится хвостовой;*** Свостовой;*** 0,0001 по сравнению с нормальным растяжением)۔ b دل کے حصوں کی نمائندہ تصاویر جو ٹروپونن-T اور AZP (بائیں) سے داغدار ہیں اور سیل کے سائز کی مقدار (دائیں) (n = 330 (D6 MTOS)، 369 (D6 MTNorm) خلیات/گروپ مختلف خنزیروں کے 10 مختلف حصوں سے، دو دم والے طالب علم کی کارکردگی کا موازنہ t-0p سے کیا گیا۔ تناؤ)۔ b 用肌钙蛋白-T 和WGA（左）和细胞大小量化（右）染色的心脏切片的代表性图n MTOS），来自不同猪的10 个不同切片的369（D6 MTNorm）细胞/组，两进行有尾学生t检验；与正常拉伸相比،****p <0.0001）۔ b calcarein-T اور WGA (بائیں) اور سیل سائز (دائیں) (n = 330 (D6 MTOS) سے داغے ہوئے دل کے ٹکڑوں کی نمائندہ تصاویر، 10 مختلف سلائسوں سے 369 (D6 MTNorm)) سیلز/组，两方法孕有 نارمل ٹیسٹ کے ساتھ اسٹریچنگ،****p <0.0001)۔ b Репрезентативные изображения срезов сердца, окрашенных тропонином-Т и АЗП (слева) и количественная оценка размента (36) MTOS), 369 (D6 MTNorm) из 10 различных срезов от разных свиней Клетки/группа, двусторонние критерий Стьюдента, ***0*p0p нормальным растяжением)۔ b دل کے حصوں کی نمائندہ تصاویر جو ٹروپونن-T اور AZP (بائیں) سے داغدار ہیں اور سیل کے سائز کی مقدار (دائیں) (n = 330 (D6 MTOS)، 369 (D6 MTNorm) مختلف خنزیروں کے 10 مختلف حصوں سے) خلیات/گروپ، دو دم والے طالب علم کا معیار؛ ****p <0.0001 عام تناؤ کے مقابلے)۔ c دن 0 اور دن 6 کے MTOS دل کے سلائسز کے لیے نمائندہ تصاویر جو ٹروپونن-T اور NFATC4 کے لیے امیونو لیبل لگائے گئے ہیں اور NFATC4 کے CMs (n = 4 (D0)، 3 (D6 MTOS) سلائسس/گروپ کے CMs کے مرکز میں نقل کی مقدار درست ہے 0.05)۔ c دن 0 اور دن 6 کے MTOS دل کے سلائسز کے لیے نمائندہ تصاویر جو ٹروپونن-T اور NFATC4 کے لیے امیونو لیبل لگا ہوا ہے اور NFATC4 کے CMs (n = 4 (D0)، 3 (D6 MTOS) سلائسس/گروپ کے CMs (n = 4 (D0) کے مرکز میں نقل مکانی کی مقدار درست ہے 0.05)۔ c Репрезентативные изображения для срезов сердца 0 اور 6 دن MTOS، иммуномеченых для тропонина-Т и NFATC4, и конячения TRANSLOKACII NFATC4 в ядра кавернозных клеток (n = 4 (D0) , 3 (D6 MTOS) срезов/группу от разных свиней , выполняевитерийство свиней سٹیوڈینٹا؛ *p <0,05)۔ c 0 اور 6 دن کے MTOS پر دل کے حصوں کے لیے نمائندہ تصاویر، troponin-T اور NFATC4 کے لیے امیونو لیبل لگا ہوا، اور NFATC4 ٹرانسلوکیشن کی مقدار cavernous خلیات کے مرکزے میں (n = 4 (D0)، 3 (D6 MTOS) سلائسز/گروپ دو مختلف خنزیروں سے انجام دیے گئے طالب علم؛ *p <0.05)۔ c 用于肌钙蛋白-T 和NFATC4 免疫标记的第0 天和第6 天MTOS心脏切片的代表性图像，以及来自不同猪的NFATC4 易位至CM 细胞核的量化（n = 4 (D0) 3 (D0)进行双尾学生t 检验；*p <0.05)۔ c مختلف NFATC4 易位至CM سیل نیوکلئس 的 مقدار 化 (n = 4 (D0) 化 (n = 4 (D0) 廤/3 化 天和第6天MTOS دل کے ٹکڑوں، اور NFATC4 کی نمائندہ تصاویر۔时间双尾学生et 电影；*p <0.05)۔ c Репрезентативные изображения срезов сердца MTOS на 0 и 6 день для иммуномаркировки тропонином-T اور NFATC4 и конличецевести TRANSLOKACII NFATC4 ядра CM от разных свиней (n = 4 (D0), 3 (D6 MTOS) срез/группа, два- хвостатый t-критерий Сть;0puyud. c مختلف خنزیروں (n = 4 (D0)، 3 (D6 MTOS) سلائسس/گروپ، 2-pcriter'، 3 (D6 MTOS) سلائسس/گروپ سے ٹروپونن-T اور NFATC4 امیونو لیبلنگ اور NFATC4 ٹرانسلوکیشن کی مقدار درست کرنے کے لیے دن 0 اور 6 پر MTOS دل کے ٹکڑوں کی نمائندہ تصاویر۔خرابی کی سلاخیں اوسط ± معیاری انحراف کی نمائندگی کرتی ہیں۔
مترجم قلبی تحقیق کے لیے ایسے سیلولر ماڈلز کی ضرورت ہوتی ہے جو قلبی ماحول کو درست طریقے سے دوبارہ پیش کریں۔ اس مطالعہ میں، ایک CTCM آلہ تیار کیا گیا تھا اور اس کی خصوصیات تھی جو دل کے انتہائی پتلی حصوں کو متحرک کرسکتی ہے۔ CTCM نظام میں جسمانی طور پر مطابقت پذیر الیکٹرو مکینیکل محرک اور T3 اور Dex سیال کی افزودگی شامل ہے۔ جب پورکین دل کے حصوں کو ان عوامل کا سامنا کرنا پڑا تو، ان کی قابل عملیت، ساختی سالمیت، میٹابولک سرگرمی، اور نقلی اظہار وہی رہا جیسا کہ 12 دن کی ثقافت کے بعد دل کے تازہ ٹشو میں ہوتا ہے۔ اس کے علاوہ، کارڈیک ٹشو کو زیادہ کھینچنا hyperextension کی وجہ سے دل کی ہائپر ٹرافی کا سبب بن سکتا ہے۔ مجموعی طور پر، یہ نتائج ایک عام کارڈیک فینوٹائپ کو برقرار رکھنے میں جسمانی ثقافت کے حالات کے اہم کردار کی حمایت کرتے ہیں اور منشیات کی اسکریننگ کے لیے ایک پلیٹ فارم فراہم کرتے ہیں۔
بہت سے عوامل کارڈیو مایوسائٹس کے کام کرنے اور بقا کے لیے ایک بہترین ماحول پیدا کرنے میں معاون ہیں۔ ان میں سے سب سے زیادہ واضح عوامل کا تعلق (1) انٹر سیلولر تعاملات، (2) الیکٹرو مکینیکل محرک، (3) مزاحیہ عوامل، اور (4) میٹابولک سبسٹریٹس سے ہے۔ جسمانی خلیے سے خلیے کے تعاملات کے لیے متعدد سیل اقسام کے پیچیدہ تین جہتی نیٹ ورکس کی ضرورت ہوتی ہے جس کی حمایت ایکسٹرا سیلولر میٹرکس سے ہوتی ہے۔ اس طرح کے پیچیدہ سیلولر تعاملات کو وٹرو میں انفرادی سیل کی اقسام کی مشترکہ ثقافت کے ذریعے دوبارہ تشکیل دینا مشکل ہے، لیکن دل کے حصوں کی آرگن ٹائپک نوعیت کا استعمال کرتے ہوئے آسانی سے حاصل کیا جا سکتا ہے۔
کارڈیک فینوٹائپ 33,34,35 کو برقرار رکھنے کے لئے کارڈیو مایوسائٹس کی مکینیکل اسٹریچ اور برقی محرک اہم ہیں۔ اگرچہ مکینیکل محرک کو hiPSC-CM کنڈیشنگ اور پختگی کے لیے بڑے پیمانے پر استعمال کیا گیا ہے، حال ہی میں کئی خوبصورت مطالعات نے غیر محوری لوڈنگ کا استعمال کرتے ہوئے ثقافت میں دل کے ٹکڑوں کے مکینیکل محرک کی کوشش کی ہے۔ ان مطالعات سے پتہ چلتا ہے کہ ثقافت کے دوران 2D غیر محوری مکینیکل لوڈنگ کا دل کے فینو ٹائپ پر مثبت اثر پڑتا ہے۔ ان مطالعات میں، دل کے حصوں کو یا تو isometric tensile Forces17، linear auxotonic loading18 سے بھرا گیا تھا، یا پھر کارڈیک سائیکل کو فورس ٹرانسڈیوسر فیڈ بیک اور ٹینشن ڈرائیوز کا استعمال کرتے ہوئے دوبارہ بنایا گیا تھا۔ تاہم، یہ طریقے ماحولیاتی اصلاح کے بغیر غیر محوری ٹشو اسٹریچ کا استعمال کرتے ہیں، جس کے نتیجے میں بہت سے کارڈیک جینز کو دبانا پڑتا ہے یا غیر معمولی اسٹریچ ردعمل سے وابستہ جینوں کا زیادہ اظہار ہوتا ہے۔ یہاں بیان کردہ CTCM ایک 3D الیکٹرو مکینیکل محرک فراہم کرتا ہے جو سائیکل کے وقت اور جسمانی اسٹریچ (25% اسٹریچ، 40% سسٹول، 60% ڈائیسٹول، اور 72 دھڑکن فی منٹ) کے لحاظ سے قدرتی کارڈیک سائیکل کی نقل کرتا ہے۔ اگرچہ یہ تین جہتی مکینیکل محرک صرف بافتوں کی سالمیت کو برقرار رکھنے کے لیے کافی نہیں ہے، لیکن T3/Dex کا استعمال کرتے ہوئے مزاحیہ اور مکینیکل محرک کا مجموعہ بافتوں کی عملداری، کام اور سالمیت کو مناسب طریقے سے برقرار رکھنے کے لیے ضروری ہے۔
مزاحیہ عوامل بالغ دل کے فینوٹائپ کو ماڈیول کرنے میں اہم کردار ادا کرتے ہیں۔ یہ HiPS-CM مطالعات میں نمایاں کیا گیا تھا جس میں T3 اور Dex کو کلچر میڈیا میں شامل کیا گیا تھا تاکہ سیل کی پختگی کو تیز کیا جا سکے۔ T3 سیل کی جھلیوں میں امینو ایسڈ، شکر اور کیلشیم کی نقل و حمل کو متاثر کر سکتا ہے۔ اس کے علاوہ، T3 MHC-α اظہار اور MHC-β ڈاؤن ریگولیشن کو فروغ دیتا ہے، جنین کے CM میں سست مروڑ myofibrils کے مقابلے بالغ کارڈیو مایوسائٹس میں تیز مروڑ myofibrils کی تشکیل کو فروغ دیتا ہے۔ ہائپوٹائیرائڈ کے مریضوں میں T3 کی کمی کے نتیجے میں myofibrillar بینڈز ختم ہو جاتے ہیں اور لہجے کی نشوونما میں کمی واقع ہوتی ہے۔ ڈیکس گلوکوکورٹیکائیڈ ریسیپٹرز پر کام کرتا ہے اور اسے الگ تھلگ پرفیوزڈ دلوں میں مایوکارڈیل سکڑاؤ کو بڑھاتا دکھایا گیا ہے۔ 38 اس بہتری کا تعلق کیلشیم ڈپازٹ سے چلنے والے اندراج (SOCE) 39,40 پر اثر سے سمجھا جاتا ہے۔ اس کے علاوہ، ڈیکس اپنے ریسیپٹرز سے منسلک ہوتا ہے، جس سے ایک وسیع انٹرا سیلولر ردعمل ہوتا ہے جو مدافعتی افعال اور سوزش کو دباتا ہے۔
ہمارے نتائج بتاتے ہیں کہ جسمانی مکینیکل محرک (MS) نے Ctrl کے مقابلے کلچر کی مجموعی کارکردگی کو بہتر کیا، لیکن کلچر میں 12 دنوں کے دوران عملداری، ساختی سالمیت، اور قلبی اظہار کو برقرار رکھنے میں ناکام رہا۔ Ctrl کے مقابلے میں، CTCM (MT) ثقافتوں میں T3 اور Dex کے اضافے سے عملداری میں بہتری آئی اور 12 دنوں تک دل کے تازہ بافتوں کے ساتھ اسی طرح کے ٹرانسکرپشن پروفائلز، ساختی سالمیت اور میٹابولک سرگرمی کو برقرار رکھا گیا۔ اس کے علاوہ، ٹشو اسٹریچ کی ڈگری کو کنٹرول کرتے ہوئے، STCM کا استعمال کرتے ہوئے ایک ہائپر ایکسٹینشن-حوصلہ افزائی کارڈیک ہائپر ٹرافی ماڈل بنایا گیا، جو STCM نظام کی استعداد کو واضح کرتا ہے۔ واضح رہے کہ اگرچہ کارڈیک ریموڈلنگ اور فبروسس میں عام طور پر ایسے اعضاء شامل ہوتے ہیں جن کے گردش کرنے والے خلیے مناسب سائٹوکائنز کے ساتھ ساتھ فگوسائٹوسس اور دیگر دوبارہ تشکیل دینے والے عوامل فراہم کر سکتے ہیں، لیکن دل کے حصے اب بھی تناؤ اور صدمے کے جواب میں فائبروٹک عمل کی نقل کر سکتے ہیں۔ myofibroblasts میں. اس کا پہلے کارڈیک سلائس ماڈل میں جائزہ لیا جا چکا ہے۔ واضح رہے کہ CTCM پیرامیٹرز کو دباؤ/برقی طول و عرض اور فریکوئنسی کو تبدیل کرکے متعدد حالات جیسے کہ ٹکی کارڈیا، بریڈی کارڈیا، اور مکینیکل گردشی معاونت (مکینیکل ان لوڈڈ ہارٹ) کی تقلید کے ذریعے ماڈیول کیا جا سکتا ہے۔ یہ نظام کو منشیات کی جانچ کے لیے درمیانے درجے کا ذریعہ بناتا ہے۔ CTCM کی زیادہ مشقت سے متاثر کارڈیک ہائپر ٹرافی کو ماڈل بنانے کی صلاحیت اس نظام کو ذاتی نوعیت کے علاج کے لیے جانچنے کی راہ ہموار کرتی ہے۔ آخر میں، موجودہ مطالعہ یہ ظاہر کرتا ہے کہ مکینیکل اسٹریچ اور مزاحیہ محرک کارڈیک ٹشو سیکشنز کی ثقافت کو برقرار رکھنے کے لیے اہم ہیں۔
اگرچہ یہاں پیش کردہ اعداد و شمار بتاتے ہیں کہ CTCM برقرار مایوکارڈیم کی ماڈلنگ کے لیے ایک بہت ہی امید افزا پلیٹ فارم ہے، اس ثقافت کے طریقہ کار کی کچھ حدود ہیں۔ سی ٹی سی ایم کلچر کی بنیادی حد یہ ہے کہ یہ سلائسوں پر مسلسل متحرک مکینیکل دباؤ ڈالتا ہے، جو ہر سائیکل کے دوران کارڈیک سلائس کے سنکچن کو فعال طور پر مانیٹر کرنے کی صلاحیت کو روکتا ہے۔ اس کے علاوہ، کارڈیک سیکشنز (7 ملی میٹر) کے چھوٹے سائز کی وجہ سے، روایتی قوت کے سینسر کا استعمال کرتے ہوئے کلچر سسٹم سے باہر سسٹولک فنکشن کا جائزہ لینے کی صلاحیت محدود ہے۔ موجودہ مخطوطہ میں، ہم آپٹیکل وولٹیج کو کنٹریکٹائل فنکشن کے اشارے کے طور پر جانچ کر اس حد کو جزوی طور پر دور کرتے ہیں۔ تاہم، اس حد کو مزید کام کی ضرورت ہوگی اور مستقبل میں ثقافت میں دل کے ٹکڑوں کے فنکشن کی نظری نگرانی کے طریقے متعارف کروا کر حل کیا جا سکتا ہے، جیسے کیلشیم اور وولٹیج سے حساس رنگوں کا استعمال کرتے ہوئے آپٹیکل میپنگ۔ سی ٹی سی ایم کی ایک اور حد یہ ہے کہ ورکنگ ماڈل جسمانی تناؤ (پری لوڈ اور آفٹر لوڈ) میں ہیرا پھیری نہیں کرتا ہے۔ سی ٹی سی ایم میں، بہت بڑے ٹشوز میں ڈائیسٹول (مکمل اسٹریچ) اور سسٹول (برقی محرک کے دوران سنکچن کی لمبائی) میں 25 فیصد جسمانی اسٹریچ کو دوبارہ پیدا کرنے کے لیے مخالف سمتوں میں دباؤ ڈالا گیا۔ اس حد کو مستقبل کے CTCM ڈیزائنوں میں دونوں طرف سے کارڈیک ٹشو پر مناسب دباؤ اور دل کے چیمبرز میں ہونے والے دباؤ کے حجم کے عین مطابق تعلقات کو لاگو کرکے ہٹایا جانا چاہیے۔
اس مخطوطہ میں اطلاع دی گئی اوور اسٹریچ-حوصلہ افزائی کی دوبارہ تشکیل صرف ہائپر ٹرافک ہائپر اسٹریچ سگنل کی نقل کرنے تک محدود ہے۔ اس طرح، یہ ماڈل مزاحیہ یا اعصابی عوامل (جو اس نظام میں موجود نہیں ہے) کی ضرورت کے بغیر اسٹریچ انڈسڈ ہائپر ٹرافک سگنلنگ کے مطالعہ میں مدد کرسکتا ہے۔ CTCM کی کثرت کو بڑھانے کے لیے مزید مطالعات کی ضرورت ہے، مثال کے طور پر، مدافعتی خلیوں کے ساتھ مل کر ثقافت، گردش کرنے والے پلازما مزاحیہ عوامل، اور اعصابی خلیات کے ساتھ ہم آہنگی کے دوران CTCM کے ساتھ بیماری کی ماڈلنگ کے امکانات کو بہتر بنائیں گے۔
اس تحقیق میں تیرہ خنزیر استعمال کیے گئے۔ جانوروں کے تمام طریقہ کار ادارہ جاتی رہنما خطوط کے مطابق انجام دیئے گئے تھے اور ان کی منظوری یونیورسٹی آف لوئس ول انسٹیٹیوشنل اینیمل کیئر اینڈ یوز کمیٹی نے دی تھی۔ aortic arch clamped کیا گیا تھا اور دل کو 1 L جراثیم سے پاک کارڈیوپلجیا (110 mM NaCl, 1.2 mM CaCl2, 16 mM KCl, 16 mM MgCl2, 10 mM NaHCO3, 5 U/mL ہیپرین, pH تک) سے خوشبو لگا دی گئی تھی۔ دلوں کو برف کے ٹھنڈے کارڈیوپلیجک محلول میں محفوظ رکھا گیا تھا جب تک کہ برف پر لیبارٹری میں منتقل نہیں کیا جاتا جو عام طور پر <10 منٹ ہوتا ہے۔ دلوں کو برف کے ٹھنڈے کارڈیوپلیجک محلول میں محفوظ رکھا گیا تھا جب تک کہ برف پر لیبارٹری میں منتقل نہیں کیا جاتا جو عام طور پر <10 منٹ ہوتا ہے۔ сердца хранили в ледяном кардиоплегическом растворе до транспортировки в лабораторию на льду, что обычно занимает <10 мин. دلوں کو برف کے ٹھنڈے کارڈیوپلجک محلول میں محفوظ کیا جاتا تھا جب تک کہ برف پر لیبارٹری تک نقل و حمل نہیں کیا جاتا، جس میں عام طور پر <10 منٹ لگتے ہیں۔将心脏保存在冰冷的心脏停搏液中，直到冰上运送到实验室，通常<10分钟.将心脏保存在冰冷的心脏停搏液中，直到冰上运送到实验室，通常<10分钟. Держите сердца в ледяной кардиоплегии до транспортировки в лабораторию на льду, обычно <10 min. دلوں کو آئس کارڈیوپلجیا پر رکھیں جب تک کہ برف پر لیبارٹری میں منتقل نہ ہو جائے، عام طور پر <10 منٹ۔
CTCM ڈیوائس کو SolidWorks کمپیوٹر ایڈیڈ ڈیزائن (CAD) سافٹ ویئر میں تیار کیا گیا تھا۔ کلچر چیمبرز، ڈیوائیڈرز اور ایئر چیمبر CNC واضح ایکریلک پلاسٹک سے بنے ہیں۔ 7 ملی میٹر قطر کی بیک اپ انگوٹھی مرکز میں ہائی ڈینسٹی پولی تھیلین (HDPE) سے بنی ہے اور نیچے میڈیا کو سیل کرنے کے لیے استعمال ہونے والے سلیکون او-رنگ کو ایڈجسٹ کرنے کے لیے اس میں او-رنگ گروو ہے۔ ایک پتلی سیلیکا جھلی کلچر چیمبر کو علیحدگی کی پلیٹ سے الگ کرتی ہے۔ سلیکون جھلی 0.02″ موٹی سلیکون شیٹ سے لیزر کاٹی گئی ہے اور اس کی سختی 35A ہے۔ نیچے اور اوپر والی سلیکون گسکیٹ 1/16″ موٹی سلیکون شیٹ سے لیزر کٹ ہیں اور ان کی سختی 50A ہے۔ 316L سٹینلیس سٹیل کے پیچ اور ونگ نٹس کو بلاک کو مضبوط کرنے اور ایک ہوا بند مہر بنانے کے لیے استعمال کیا جاتا ہے۔
ایک سرشار پرنٹ شدہ سرکٹ بورڈ (PCB) کو C-PACE-EM سسٹم کے ساتھ مربوط کرنے کے لیے ڈیزائن کیا گیا ہے۔ پی سی بی پر سوئس مشین کنیکٹر ساکٹ گریفائٹ الیکٹروڈ سے سلور چڑھایا تانبے کی تاروں اور کانسی کے 0-60 سکرو کے ذریعے الیکٹروڈ میں جڑے ہوئے ہیں۔ پرنٹ شدہ سرکٹ بورڈ 3D پرنٹر کے کور میں رکھا گیا ہے۔
CTCM ڈیوائس کو ایک پروگرام ایبل نیومیٹک ایکچویٹر (PPD) کے ذریعے کنٹرول کیا جاتا ہے جو کارڈیک سائیکل کی طرح ایک کنٹرول شدہ گردشی دباؤ بناتا ہے۔ جیسے جیسے ایئر چیمبر کے اندر دباؤ بڑھتا ہے، لچکدار سلیکون جھلی اوپر کی طرف پھیلتی ہے، ٹشو سائٹ کے نیچے میڈیم کو مجبور کرتی ہے۔ اس کے بعد ٹشو کے علاقے کو سیال کے اس اخراج سے پھیلایا جائے گا، ڈائیسٹول کے دوران دل کی جسمانی توسیع کی نقل کرتے ہوئے. نرمی کے عروج پر، گریفائٹ الیکٹروڈ کے ذریعے برقی محرک کا اطلاق کیا گیا، جس سے ہوا کے چیمبر میں دباؤ کم ہوا اور ٹشو سیکشنز کے سکڑنے کا سبب بنے۔ پائپ کے اندر ہوا کے نظام میں دباؤ کا پتہ لگانے کے لیے پریشر سینسر کے ساتھ ایک ہیموسٹیٹک والو ہے۔ پریشر سینسر کے ذریعے محسوس ہونے والا دباؤ لیپ ٹاپ سے منسلک ڈیٹا کلیکٹر پر لگایا جاتا ہے۔ یہ گیس چیمبر کے اندر دباؤ کی مسلسل نگرانی کی اجازت دیتا ہے۔ جب زیادہ سے زیادہ چیمبر پریشر تک پہنچ گیا (معیاری 80 mmHg، 140 mmHg OS)، ڈیٹا ایکوزیشن ڈیوائس کو C-PACE-EM سسٹم کو 2 ms کے لیے بائفاسک وولٹیج سگنل بنانے کے لیے ایک سگنل بھیجنے کا حکم دیا گیا، جو 4 V پر سیٹ کیا گیا۔
دل کے حصے حاصل کیے گئے اور 6 کنوؤں میں کلچر کے حالات اس طرح انجام دیے گئے: کٹے ہوئے دلوں کو منتقلی کے برتن سے ایک ٹرے میں منتقل کریں جس میں سردی (4° C.) کارڈیوپلجیا ہو۔ بائیں ویںٹرکل کو جراثیم سے پاک بلیڈ سے الگ کیا گیا تھا اور اسے 1-2 سینٹی میٹر کے ٹکڑوں میں کاٹا گیا تھا۔ یہ ٹشو بلاکس ٹشو سپورٹ کے ساتھ ٹشو چپکنے والے کے ساتھ منسلک تھے اور ٹائروڈ کے محلول پر مشتمل ایک ہلتے مائیکروٹوم ٹشو غسل میں رکھے گئے تھے اور مسلسل آکسیجن (3 g/L 2,3-butanedione monooxime (BDM)، 140 mM NaCl (8.18 g)، g10m40 (m40)، m40m. mM D-گلوکوز (1.86 g)، 10 mM HEPES (2.38 g)، 1 mM MgCl2 (1 ml 1 M محلول)، 1.8 mM CaCl2 ( 1.8 ml 1 M محلول)، 1 L ddH2O تک)۔ وائبریٹنگ مائیکروٹوم کو 80 Hz کی فریکوئنسی پر 300 µm موٹی سلائسیں کاٹنے کے لیے سیٹ کیا گیا تھا، افقی کمپن کا طول و عرض 2 ملی میٹر، اور پیشگی شرح 0.03 ملی میٹر فی سیکنڈ۔ محلول کو ٹھنڈا رکھنے کے لیے ٹشو غسل برف سے گھرا ہوا تھا اور درجہ حرارت 4 ° C پر برقرار رکھا گیا تھا۔ ٹشو سیکشنز کو مائیکروٹوم غسل سے انکیوبیشن غسل میں منتقل کریں جس میں برف پر مسلسل آکسیجن ٹائروڈ محلول موجود ہو جب تک کہ ایک کلچر پلیٹ کے لیے کافی حصے حاصل نہ ہوجائیں۔ ٹرانس ویل کلچرز کے لیے، ٹشو سیکشنز جراثیم سے پاک 6 ملی میٹر چوڑے پولیوریتھین سپورٹ کے ساتھ منسلک کیے گئے تھے اور 6 ملی لیٹر آپٹمائزڈ میڈیم (199 میڈیم، 1x ITS سپلیمنٹ، 10% FBS، 5 ng/ml VEGF، 10 ng/ml FGF-alkaline اور antiifantifant-2)۔ برقی محرک (10 V، فریکوئنسی 1.2 Hz) C-Pace کے ذریعے ٹشو سیکشنز پر لاگو کیا گیا تھا۔ TD حالات کے لیے، تازہ T3 اور Dex کو ہر درمیانی تبدیلی پر 100 nM اور 1 μM پر شامل کیا گیا۔ دن میں 3 بار متبادل سے پہلے میڈیم آکسیجن سے سیر ہوتا ہے۔ ٹشو سیکشنز کو انکیوبیٹر میں 37 ° C اور 5% CO2 پر کلچر کیا گیا تھا۔
CTCM ثقافتوں کے لیے، ٹشو سیکشنز کو اپنی مرضی کے مطابق 3D پرنٹر پر پیٹری ڈش میں رکھا گیا تھا جس میں ترمیم شدہ ٹائروڈ کا محلول تھا۔ ڈیوائس کو اس لیے ڈیزائن کیا گیا ہے کہ دل کے ٹکڑے کے سائز کو سپورٹ رِنگ کے رقبے کے 25 فیصد تک بڑھایا جائے۔ ایسا اس لیے کیا جاتا ہے تاکہ ٹائروڈ کے محلول سے میڈیم میں منتقل ہونے کے بعد اور ڈائیسٹول کے دوران دل کے حصے نہ کھنچ جائیں۔ ہسٹو ایکریلک گلو کا استعمال کرتے ہوئے، 300 µm موٹی حصے سپورٹ رنگ 7 ملی میٹر قطر پر طے کیے گئے تھے۔ ٹشو سیکشنز کو سپورٹ رِنگ میں جوڑنے کے بعد، ٹشو کے اضافی حصے کاٹ دیں اور منسلک ٹشو سیکشنز کو واپس ٹائروڈ سلوشن کے غسل میں برف (4°C) پر رکھیں جب تک کہ ایک ڈیوائس کے لیے کافی حصے تیار نہ ہو جائیں۔ تمام آلات کے لیے کل پروسیسنگ کا وقت 2 گھنٹے سے زیادہ نہیں ہونا چاہیے۔ 6 ٹشو سیکشنز ان کے سپورٹ رِنگز سے منسلک ہونے کے بعد، CTCM ڈیوائس کو اسمبل کیا گیا۔ CTCM کلچر چیمبر 21 ملی لیٹر پری آکسیجن میڈیم سے پہلے سے بھرا ہوا ہے۔ ٹشو سیکشنز کو کلچر چیمبر میں منتقل کریں اور احتیاط سے کسی بھی ہوا کے بلبلوں کو پائپیٹ سے ہٹا دیں۔ اس کے بعد ٹشو سیکشن کو سوراخ میں لے جایا جاتا ہے اور آہستہ سے جگہ پر دبایا جاتا ہے۔ آخر میں، الیکٹروڈ کیپ کو ڈیوائس پر رکھیں اور ڈیوائس کو انکیوبیٹر میں منتقل کریں۔ پھر CTCM کو ایئر ٹیوب اور C-PACE-EM سسٹم سے جوڑیں۔ نیومیٹک ایکچیویٹر کھلتا ہے اور ایئر والو سی ٹی سی ایم کو کھولتا ہے۔ C-PACE-EM سسٹم کو 2 ms کے لیے biphasic pacing کے دوران 1.2 Hz پر 4 V فراہم کرنے کے لیے ترتیب دیا گیا تھا۔ میڈیم کو دن میں دو بار تبدیل کیا گیا اور الیکٹروڈز پر گریفائٹ کے جمع ہونے سے بچنے کے لیے دن میں ایک بار تبدیل کیا گیا۔ اگر ضروری ہو تو، ٹشو سیکشنز کو ان کے کلچر کے کنوؤں سے ہٹایا جا سکتا ہے تاکہ ان کے نیچے گرے ہوئے کسی بھی ہوا کے بلبلے کو باہر نکالا جا سکے۔ MT علاج کے حالات کے لیے، T3/Dex کو 100 nM T3 اور 1 μM Dex کے ساتھ ہر درمیانی تبدیلی کے ساتھ تازہ شامل کیا گیا۔ CTCM ڈیوائسز کو انکیوبیٹر میں 37 ° C اور 5% CO2 پر کلچر کیا گیا تھا۔
دل کے ٹکڑوں کی کھینچی ہوئی رفتار کو حاصل کرنے کے لیے، ایک خصوصی کیمرہ سسٹم تیار کیا گیا تھا۔ ایک SLR کیمرہ (Canon Rebel T7i, Canon, Tokyo, Japan) Navitar Zoom 7000 18-108mm میکرو لینس (Navitar, San Francisco, CA) کے ساتھ استعمال کیا گیا تھا۔ میڈیم کو تازہ میڈیم سے تبدیل کرنے کے بعد کمرے کے درجہ حرارت پر تصور کیا گیا۔ کیمرہ 51° زاویہ پر کھڑا ہے اور ویڈیو 30 فریم فی سیکنڈ پر ریکارڈ کی جاتی ہے۔ سب سے پہلے، اوپن سورس سافٹ ویئر (MUSCLEMOTION43) کو Image-J کے ساتھ دل کے ٹکڑوں کی حرکت کی مقدار معلوم کرنے کے لیے استعمال کیا گیا۔ ماسک کو MATLAB (MathWorks, Natick, MA, USA) کا استعمال کرتے ہوئے بنایا گیا تھا تاکہ شور سے بچنے کے لیے دل کے ٹکڑوں کو دھڑکنے کے لیے دلچسپی کے علاقوں کی وضاحت کی جا سکے۔ دستی طور پر منقسم ماسک ایک فریم ترتیب میں تمام تصاویر پر لاگو ہوتے ہیں اور پھر MUSCLEMOTION پلگ ان میں بھیجے جاتے ہیں۔ پٹھوں کی حرکت ہر فریم میں پکسلز کی اوسط شدت کا استعمال کرتی ہے تاکہ اس کی نقل و حرکت کو حوالہ فریم کے نسبت سے درست کیا جا سکے۔ ڈیٹا کو ریکارڈ کیا گیا، فلٹر کیا گیا اور سائیکل کے وقت کی مقدار درست کرنے اور کارڈیک سائیکل کے دوران ٹشو اسٹریچ کا اندازہ لگانے کے لیے استعمال کیا گیا۔ ریکارڈ شدہ ویڈیو کو پہلے آرڈر کے زیرو فیز ڈیجیٹل فلٹر کا استعمال کرتے ہوئے پوسٹ پروسیس کیا گیا تھا۔ ٹشو اسٹریچ (چوٹی سے چوٹی) کی مقدار درست کرنے کے لیے، ریکارڈ شدہ سگنل میں چوٹیوں اور گرتوں کے درمیان فرق کرنے کے لیے چوٹی سے چوٹی کا تجزیہ کیا گیا۔ اس کے علاوہ، سگنل ڈرفٹ کو ختم کرنے کے لیے 6 ویں آرڈر کے کثیر نام کا استعمال کرتے ہوئے ڈیٹرینڈنگ کی جاتی ہے۔ پروگرام کا کوڈ MATLAB میں عالمی ٹشو موشن، سائیکل ٹائم، آرام کا وقت، اور سنکچن کے وقت کا تعین کرنے کے لیے تیار کیا گیا تھا (ضمنی پروگرام کوڈ 44)۔
تناؤ کے تجزیے کے لیے، میکینیکل اسٹریچ اسسمنٹ کے لیے بنائی گئی اسی ویڈیوز کا استعمال کرتے ہوئے، ہم نے سب سے پہلے MUSCLEMOTION سافٹ ویئر کے مطابق حرکت کی چوٹیوں (اعلیٰ ترین (اوپری) اور سب سے کم (نچلے) پوائنٹس) کی نمائندگی کرنے والی دو تصاویر کا سراغ لگایا۔ اس کے بعد ہم نے بافتوں کے علاقوں کو منقسم کیا اور منقسم ٹشو (ضمنی شکل 2a) پر شیڈنگ الگورتھم کی شکل کا اطلاق کیا۔ اس کے بعد منقسم ٹشو کو دس ذیلی سطحوں میں تقسیم کیا گیا، اور ہر سطح پر دباؤ کا حساب درج ذیل مساوات کا استعمال کرتے ہوئے کیا گیا: Strain = (Sup-Sdown)/Sdown، جہاں Sup اور Sdown بالترتیب کپڑے کے اوپر اور نیچے کے سائے سے شکل کے فاصلے ہیں (ضمیمہ تصویر۔ .2b)۔
دل کے حصے 48 گھنٹے کے لیے 4% پیرافارمیلڈہائیڈ میں طے کیے گئے تھے۔ فکسڈ ٹشوز کو 1 گھنٹے کے لیے 10% اور 20% سوکروز میں پانی کی کمی ہوئی، پھر راتوں رات 30% سوکروز میں۔ اس کے بعد حصوں کو زیادہ سے زیادہ کٹنگ ٹمپریچر کمپاؤنڈ (OCT کمپاؤنڈ) میں سرایت کر دیا گیا اور آہستہ آہستہ آئسوپینٹین/خشک برف کے غسل میں منجمد کر دیا گیا۔ OCT ایمبیڈنگ بلاکس کو الگ ہونے تک -80 °C پر اسٹور کریں۔ سلائیڈیں 8 μm کی موٹائی والے حصوں کے طور پر تیار کی گئیں۔
دل کے حصوں سے OCT کو ہٹانے کے لیے، سلائیڈز کو ہیٹنگ بلاک پر 95 °C پر 5 منٹ کے لیے گرم کریں۔ ہر سلائیڈ میں 1 ملی لیٹر پی بی ایس شامل کریں اور کمرے کے درجہ حرارت پر 30 منٹ تک انکیوبیٹ کریں، پھر کمرے کے درجہ حرارت پر 15 منٹ کے لیے پی بی ایس میں 0.1٪ ٹریٹن-ایکس سیٹ کرکے حصوں کو گھلائیں۔ غیر مخصوص اینٹی باڈیز کو نمونے کے پابند ہونے سے روکنے کے لیے، سلائیڈوں میں 3% BSA محلول کا 1 ملی لیٹر شامل کریں اور کمرے کے درجہ حرارت پر 1 گھنٹے تک انکیوبیٹ کریں۔ اس کے بعد BSA کو ہٹا دیا گیا اور سلائیڈوں کو PBS سے دھویا گیا۔ ہر نمونے کو پنسل سے نشان زد کریں۔ پرائمری اینٹی باڈیز (1% BSA میں 1:200 کو پتلا کیا گیا) (connexin 43 (Abcam؛ #AB11370)، NFATC4 (Abcam؛ #AB99431) اور ٹروپونن-T (تھرمو سائنٹیفک؛ #MA5-12960) کو 90 منٹ میں شامل کیا گیا، پھر 1٪ BSA میں اینٹی باڈیز شامل کی گئیں۔ ماؤس الیکسا فلور 488 (تھرمو سائنٹیفک؛ #A16079) کے خلاف، خرگوش کے خلاف Alexa Fluor 594 (Thermo Scientific؛ #T6391) PBS کے ساتھ 3 بار دھویا گیا، پس منظر سے ہدف کے داغ کو الگ کرنے کے لیے، ہم نے صرف ثانوی اینٹی باڈی کا استعمال کیا، جوہری طور پر فین ڈی اے کو کنٹرول کیا گیا تھا۔ ایک ویکٹشیلڈ (ویکٹر لیبارٹریز) میں اور نیل پالش -x میگنیفیکیشن) اور 40x میگنیفیکیشن کے ساتھ کینس مائکروسکوپ۔
WGA-Alexa Fluor 555 (Thermo Scientific; #W32464) PBS میں 5 μg/ml پر WGA سٹیننگ کے لیے استعمال کیا گیا اور کمرے کے درجہ حرارت پر 30 منٹ کے لیے مقررہ حصوں پر لگایا گیا۔ اس کے بعد سلائیڈوں کو پی بی ایس سے دھویا گیا اور ہر سلائیڈ میں سوڈان بلیک شامل کیا گیا اور 30 ​​منٹ تک انکیوبیٹ کیا گیا۔ پھر سلائیڈوں کو پی بی ایس سے دھویا گیا اور ویکٹشیلڈ ایمبیڈنگ میڈیم شامل کیا گیا۔ سلائیڈز کو کینس مائکروسکوپ پر 40x میگنیفیکیشن پر دیکھا گیا۔
جیسا کہ اوپر بیان کیا گیا ہے OCT کو نمونوں سے ہٹا دیا گیا تھا۔ OCT کو ہٹانے کے بعد، سلائیڈوں کو بوئن کے محلول میں رات بھر ڈبو دیں۔ اس کے بعد سلائیڈوں کو 1 گھنٹہ کے لیے ڈسٹل پانی سے دھویا گیا اور پھر ببرچ ایلو ایسڈ فوچسن محلول میں 10 منٹ کے لیے رکھا گیا۔ پھر سلائیڈوں کو آست پانی سے دھویا گیا اور 5% فاسفومولیبڈینم/5% فاسفوٹونگسٹک ایسڈ کے محلول میں 10 منٹ کے لیے رکھا گیا۔ کلی کیے بغیر، سلائیڈز کو 15 منٹ کے لیے براہ راست اینلین بلیو محلول میں منتقل کریں۔ پھر سلائیڈوں کو آست پانی سے دھویا گیا اور 2 منٹ کے لیے 1% ایسٹک ایسڈ محلول میں رکھا گیا۔ سلائیڈوں کو 200 N ایتھنول میں خشک کر کے زائلین میں منتقل کر دیا گیا۔ داغدار سلائیڈوں کو 10x مقصد کے ساتھ کینس مائکروسکوپ کا استعمال کرتے ہوئے تصور کیا گیا تھا۔ کینس اینالائزر سافٹ ویئر کا استعمال کرتے ہوئے فبروسس ایریا فی صد کی مقدار درست کی گئی۔
CyQUANT™ MTT Cell Viability Assay (Invitrogen, Carlsbad, CA)، کیٹلاگ نمبر V13154، کچھ ترامیم کے ساتھ مینوفیکچرر کے پروٹوکول کے مطابق۔ خاص طور پر، ایم ٹی ٹی تجزیہ کے دوران یکساں ٹشو سائز کو یقینی بنانے کے لیے 6 ملی میٹر قطر کے ساتھ ایک سرجیکل پنچ استعمال کیا گیا تھا۔ مینوفیکچرر کے پروٹوکول کے مطابق MTT سبسٹریٹ پر مشتمل 12 کنویں پلیٹ کے کنوؤں میں ٹشوز کو انفرادی طور پر چڑھایا گیا تھا۔ حصوں کو 37 ° C. پر 3 گھنٹے تک انکیوبیٹ کیا جاتا ہے اور زندہ ٹشو ایم ٹی ٹی سبسٹریٹ کو میٹابولائز کرتا ہے تاکہ جامنی رنگ کا فارمازان مرکب بن سکے۔ ایم ٹی ٹی محلول کو 1 ملی لیٹر DMSO سے بدلیں اور دل کے حصوں سے جامنی رنگ کے فارمازان کو نکالنے کے لیے 15 منٹ کے لیے 37 ° C پر انکیوبیٹ کریں۔ نمونوں کو DMSO میں 96 اچھی طرح سے صاف نیچے والی پلیٹوں میں 1:10 پتلا کیا گیا تھا اور سائیٹیشن پلیٹ ریڈر (BioTek) کا استعمال کرتے ہوئے جامنی رنگ کی شدت 570 nm پر ماپا گیا تھا۔ پڑھنے کو دل کے ہر ٹکڑے کے وزن کے مطابق معمول بنایا گیا تھا۔
ہارٹ سلائس میڈیا کو 1 μCi/ml [5-3H]-گلوکوز (Moravek Biochemicals, Brea, CA, USA) پر مشتمل میڈیا کے ساتھ تبدیل کیا گیا تھا جیسا کہ پہلے بیان کیا گیا ہے گلوکوز کے استعمال پرکھ کے لیے۔ انکیوبیشن کے 4 گھنٹے بعد، 100 µl میڈیم کو ایک کھلی مائکرو سینٹری فیوج ٹیوب میں شامل کریں جس میں 100 µl 0.2 N HCl ہو۔ پھر ٹیوب کو ایک سنٹیلیشن ٹیوب میں رکھا گیا تھا جس میں 500 μl dH2O ہوتا تھا تاکہ 37 ° C پر 72 گھنٹوں کے لیے [3H]2O بخارات بن سکے۔ اس کے بعد سنٹیلیشن ٹیوب سے مائیکرو سینٹرفیوج ٹیوب کو ہٹا دیں اور 10 ملی لیٹر سنٹیلیشن فلوئڈ شامل کریں۔ سنٹیلیشن کی گنتی ٹرائی کارب 2900TR مائع سنٹیلیشن تجزیہ کار (پیکارڈ بائیو سائنس کمپنی، میریڈن، سی ٹی، یو ایس اے) کا استعمال کرتے ہوئے کی گئی۔ اس کے بعد گلوکوز کے استعمال کا حساب [5-3H] - گلوکوز کی مخصوص سرگرمی، نامکمل توازن اور پس منظر، [5-3H] - بغیر لیبل والے گلوکوز میں کمی، اور سنٹیلیشن کاؤنٹر کی کارکردگی کو مدنظر رکھتے ہوئے کیا گیا۔ اعداد و شمار کو دل کے حصوں کے بڑے پیمانے پر معمول بنایا جاتا ہے۔
Trizol میں بافتوں کی ہم آہنگی کے بعد، مینوفیکچرر کے پروٹوکول کے مطابق Qiagen miRNeasy مائیکرو کٹ #210874 کا استعمال کرتے ہوئے RNA کو دل کے حصوں سے الگ کر دیا گیا۔ RNAsec لائبریری کی تیاری، ترتیب اور ڈیٹا کا تجزیہ اس طرح کیا گیا:
RNA لائبریری کی تیاری کے لیے 1 μg RNA فی نمونہ ابتدائی مواد کے طور پر استعمال کیا گیا تھا۔ ترتیب دینے والی لائبریریاں NEBNext UltraTM RNA Library Preparation Kit for Illumina (NEB, USA) کا استعمال کرتے ہوئے مینوفیکچرر کی سفارشات کے بعد تیار کی گئیں، اور انڈیکس کوڈز کو ہر نمونے کے لیے خصوصیت کی ترتیب میں شامل کیا گیا۔ مختصراً، پولی-T اولیگونوکلیوٹائڈس کے ساتھ منسلک مقناطیسی موتیوں کا استعمال کرتے ہوئے mRNA کو کل RNA سے پاک کیا گیا تھا۔ NEBNext First Strand Synthesis Reaction Buffer (5X) میں اعلی درجہ حرارت پر divalent cations کا استعمال کرتے ہوئے فریگمنٹیشن کی جاتی ہے۔ پہلے اسٹرینڈ سی ڈی این اے کو بے ترتیب ہیکسامر پرائمر اور M-MuLV ریورس ٹرانسکرپٹیس (RNase H-) کا استعمال کرتے ہوئے ترکیب کیا گیا تھا۔ دوسرا اسٹرینڈ cDNA پھر DNA پولیمریز I اور RNase H کا استعمال کرتے ہوئے ترکیب کیا جاتا ہے۔ بقیہ اوور ہینگز exonuclease/polymerase سرگرمی کے ذریعے کند سروں میں تبدیل ہو جاتے ہیں۔ ڈی این اے فریگمنٹ کے 3′ سرے کی ایڈنیلیشن کے بعد، ہائبرڈائزیشن کے لیے تیار کرنے کے لیے ایک NEBNext اڈاپٹر اس کے ساتھ منسلک ہوتا ہے۔ ترجیحی لمبائی 150-200 bp کے cDNA ٹکڑوں کے انتخاب کے لیے۔ لائبریری کے ٹکڑوں کو AMPure XP سسٹم (بیک مین کولٹر، بیورلی، USA) کا استعمال کرتے ہوئے پاک کیا گیا تھا۔ اس کے بعد، 3 μl USER Enzyme (NEB، USA) سائز کے لیے منتخب کردہ cDNA کے ساتھ ایک اڈاپٹر کے ساتھ ligated 37 ° C پر 15 منٹ اور پھر PCR سے پہلے 95 ° C پر 5 منٹ کے لیے استعمال کیا گیا۔ پی سی آر کو پھر فیوژن ہائی فیڈیلیٹی ڈی این اے پولیمریز، یونیورسل پی سی آر پرائمر، اور انڈیکس (X) پرائمر کا استعمال کرتے ہوئے انجام دیا گیا۔ آخر میں، PCR مصنوعات کو صاف کیا گیا (AMPure XP سسٹم) اور لائبریری کے معیار کا جائزہ Agilent Bioanalyzer 2100 سسٹم پر کیا گیا۔ اس کے بعد سی ڈی این اے لائبریری کو نووسیق سیکوینسر کا استعمال کرتے ہوئے ترتیب دیا گیا تھا۔ Illumina سے خام تصویری فائلوں کو CASAVA بیس کالنگ کا استعمال کرتے ہوئے خام پڑھنے میں تبدیل کیا گیا تھا۔ خام ڈیٹا کو FASTQ(fq) فارمیٹ فائلوں میں محفوظ کیا جاتا ہے جس میں پڑھنے کی ترتیب اور متعلقہ بنیادی خصوصیات ہوتی ہیں۔ Sscrofa11.1 حوالہ جینوم سے فلٹر شدہ ترتیب پڑھنے کے لیے HISAT2 کو منتخب کریں۔ عام طور پر، HISAT2 کسی بھی سائز کے جینوم کو سپورٹ کرتا ہے، بشمول 4 بلین بیس سے بڑے جینوم، اور زیادہ تر پیرامیٹرز کے لیے ڈیفالٹ ویلیوز سیٹ کی جاتی ہیں۔ RNA Seq ڈیٹا سے پڑھے جانے والے پڑھنے کو HISAT2 کا استعمال کرتے ہوئے مؤثر طریقے سے منسلک کیا جا سکتا ہے، جو اس وقت دستیاب سب سے تیز ترین نظام ہے، کسی بھی دوسرے طریقہ سے یکساں یا بہتر درستگی کے ساتھ۔
نقلوں کی کثرت براہ راست جین کے اظہار کی سطح کی عکاسی کرتی ہے۔ جین کے اظہار کی سطحوں کا اندازہ جینوم یا ایکسونز سے وابستہ نقلوں کی کثرت (سلسلہ شماری) سے کیا جاتا ہے۔ پڑھنے کی تعداد جین کے اظہار کی سطح، جین کی لمبائی، اور ترتیب کی گہرائی کے متناسب ہے۔ FPKM (ٹرانسکرپٹ کے فی ہزار بیس جوڑوں کے ٹکڑے فی ملین بیس جوڑوں کی ترتیب) کا حساب لگایا گیا اور DESeq2 پیکیج کا استعمال کرتے ہوئے تفریق اظہار کی P-values ​​کا تعین کیا گیا۔ اس کے بعد ہم نے بلٹ ان R-فنکشن "p.adjust" کی بنیاد پر بنجمینی-ہوکبرگ طریقہ9 کا استعمال کرتے ہوئے ہر P قدر کے لیے غلط دریافت کی شرح (FDR) کا حساب لگایا۔
تھرمو (تھرمو، بلی نمبر 11756050) سے سپر اسکرپٹ IV Vilo ماسٹر مکس کا استعمال کرتے ہوئے دل کے حصوں سے الگ تھلگ RNA کو 200 ng/μl کے ارتکاز پر cDNA میں تبدیل کیا گیا۔ مقداری RT-PCR ایک اپلائیڈ بایو سسٹم اینڈورا پلیٹ مائیکرو ایمپ 384 اچھی طرح سے شفاف ری ایکشن پلیٹ (تھرمو، کیٹ نمبر 4483319) اور مائیکرو ایمپ آپٹیکل چپکنے والی (تھرمو، بلی نمبر 4311971) کا استعمال کرتے ہوئے انجام دیا گیا۔ رد عمل کا مرکب 5 µl Taqman Fast Advanced Master Mix (Thermo, cat # 4444557)، 0.5 µl Taqman پرائمر اور 3.5 µl H2O فی کنواں ملا ہوا تھا۔ معیاری qPCR سائیکل چلائے گئے تھے اور CT کی قدروں کی پیمائش ایک Applied Biosystems Quantstudio 5 ریئل ٹائم PCR انسٹرومنٹ (384-well ماڈیول؛ پروڈکٹ #A28135) کا استعمال کرتے ہوئے کی گئی تھی۔ Taqman پرائمر Thermo (GAPDH (Ss03375629_u1)، PARP12 (Ss06908795_m1)، PKDCC (Ss06903874_m1)، CYGB (Ss06900188_m1)، RGL1 (Ss086m1)، RGL1 (Ss086m1)، PARP12 سے خریدے گئے تھے۔ (Ss01009508_mH)، GATA4 (Ss03383805_u1)، GJA1 (Ss03374839_u1)، COL1A2 (Ss03375009_u1 ) , COL3A1 (Ss04323794_m1)، The ACTA5m (ss04323794_m1)، The ACTA5m تمام نمونوں کو ہاؤس کیپنگ جین GAPDH میں معمول بنایا گیا تھا۔
مینوفیکچرر کے پروٹوکول کے مطابق NT-ProBNP کی میڈیا ریلیز کا اندازہ NT-ProBNP کٹ (سور) (Cat. No. MBS2086979، MyBioSource) کا استعمال کرتے ہوئے کیا گیا۔ مختصراً، 250 µl ہر نمونے اور معیار کو ہر کنویں میں ڈپلیکیٹ میں شامل کیا گیا۔ نمونہ شامل کرنے کے فوراً بعد، ہر کنویں میں 50 µl Assay Reagent A ڈالیں۔ آہستہ سے پلیٹ کو ہلائیں اور سیلنٹ کے ساتھ سیل کریں۔ پھر گولیاں 37 ° C پر 1 گھنٹہ تک سینک دی گئیں۔ پھر محلول کو ایسپریٹ کریں اور 350 µl 1X واش محلول کے ساتھ کنویں کو 4 بار دھوئیں، ہر بار 1-2 منٹ تک واش محلول کو انکیوبیٹ کریں۔ پھر 100 µl Assay Reagent B فی کنواں ڈالیں اور پلیٹ سیلنٹ کے ساتھ سیل کریں۔ گولی کو آہستہ سے ہلایا گیا اور 37 ° C پر 30 منٹ تک سینک دیا گیا۔ محلول کو اسپائریٹ کریں اور 350 µl 1X واش محلول کے ساتھ 5 بار کنویں دھویں۔ ہر کنویں میں 90 µl سبسٹریٹ محلول شامل کریں اور پلیٹ کو سیل کریں۔ پلیٹ کو 37 ڈگری سینٹی گریڈ پر 10-20 منٹ تک سینکیں۔ ہر کنویں میں 50 µl اسٹاپ سلوشن شامل کریں۔ پلیٹ کو فوری طور پر 450 nm پر سیٹیشن (BioTek) پلیٹ ریڈر کا استعمال کرتے ہوئے ماپا گیا۔
گروپ کے سائز کو منتخب کرنے کے لیے پاور تجزیے کیے گئے جو 5% ٹائپ I کی غلطی کی شرح کے ساتھ پیرامیٹر میں 10% مطلق تبدیلی کا پتہ لگانے کے لیے >80% پاور فراہم کرے گا۔ گروپ کے سائز کو منتخب کرنے کے لیے پاور تجزیے کیے گئے جو 5% ٹائپ I کی غلطی کی شرح کے ساتھ پیرامیٹر میں 10% مطلق تبدیلی کا پتہ لگانے کے لیے >80% پاور فراہم کرے گا۔ Анализ мощности был выполнен для выбора размеров групп, которые обеспечат >80% мощности для обнаружения 10% абнаружения PARAMETRA с 5% частотой ошибок TIPA I. پاور تجزیہ گروپ کے سائز کو منتخب کرنے کے لیے انجام دیا گیا تھا جو 5% قسم I غلطی کی شرح کے ساتھ 10% مطلق پیرامیٹر تبدیلی کا پتہ لگانے کے لیے >80% پاور فراہم کرے گا۔进行功效分析以选择将提供>进行功效分析以选择将提供> Был проведен анализ мощности для выбора размера группы, который обеспечил бы > 80% мощности для обнаружения 10% параметров и 5% частоты ошибок typa I. ایک گروپ کے سائز کو منتخب کرنے کے لیے پاور تجزیہ کیا گیا جو 10% مطلق پیرامیٹر تبدیلی اور 5% قسم I غلطی کی شرح کا پتہ لگانے کے لیے >80% پاور فراہم کرے گا۔تجربے سے پہلے ٹشو سیکشن تصادفی طور پر منتخب کیے گئے تھے۔ تمام تجزیے کنڈیشن بلائنڈ تھے اور تمام ڈیٹا کا تجزیہ کرنے کے بعد ہی نمونے ڈی کوڈ کیے گئے تھے۔ گراف پیڈ پرزم سافٹ ویئر (سان ڈیاگو، سی اے) تمام شماریاتی تجزیے کرنے کے لیے استعمال کیا گیا تھا۔ تمام اعدادوشمار کے لیے، p-values ​​کو قدروں <0.05 پر اہم سمجھا جاتا تھا۔ تمام اعدادوشمار کے لیے، p-values ​​کو قدروں <0.05 پر اہم سمجھا جاتا تھا۔ Для всей статистики p-значения считались значимыми при значениях <0,05. تمام اعدادوشمار کے لیے، p-values ​​کو قدروں <0.05 پر اہم سمجھا جاتا تھا۔对于所有统计数据،p 值在值<0.05 时被认为是显着的.对于所有统计数据،p 值在值<0.05 时被认为是显着的. Для всей статистики p-значения считались значимыми при значениях <0,05. تمام اعدادوشمار کے لیے، p-values ​​کو قدروں <0.05 پر اہم سمجھا جاتا تھا۔دو دم والے طالب علم کا ٹی ٹیسٹ ڈیٹا پر صرف 2 موازنہ کے ساتھ کیا گیا تھا۔ ایک طرفہ یا دو طرفہ انووا کا استعمال متعدد گروپوں کے درمیان اہمیت کا تعین کرنے کے لیے کیا گیا تھا۔ پوسٹ ہاک ٹیسٹ کرتے وقت، ٹکی کی تصحیح کا اطلاق متعدد موازنہ کے حساب سے کیا جاتا تھا۔ FDR اور p.adjust کا حساب لگاتے وقت RNAsec ڈیٹا میں خاص شماریاتی تحفظات ہوتے ہیں جیسا کہ طریقوں کے سیکشن میں بیان کیا گیا ہے۔
مطالعہ کے ڈیزائن کے بارے میں مزید معلومات کے لیے، اس مضمون سے منسلک نیچر ریسرچ رپورٹ کا خلاصہ دیکھیں۔