Nature.com saytiga tashrif buyurganingiz uchun tashakkur. Siz foydalanayotgan brauzer versiyasi CSS-ni cheklangan darajada qo‘llab-quvvatlaydi. Eng yaxshi tajriba uchun yangilangan brauzerdan foydalanishni tavsiya qilamiz (yoki Internet Explorer-da moslik rejimini o‘chirib qo‘ying). Ayni paytda qo‘llab-quvvatlashning davom etishini ta’minlash uchun biz saytni uslublar va JavaScript-larsiz ko‘rsatamiz.
Inson ichak morfogenezi 3D epiteliy mikroarxitekturasi va fazoviy tashkilotning kript-villus xususiyatlarini o'rnatadi. Bu noyob tuzilma bazal kriptdagi ildiz hujayra bo'shlig'ini ekzogen mikrob antigenlari va ularning metabolitlaridan himoya qilish orqali ichak gomeostazini saqlab turish uchun talab qilinadi. ichak shilliq qavatidagi to'siq. Shuning uchun 3D epiteliy tuzilmalarini qayta yaratish in vitro ichak modellarini qurish uchun juda muhimdir. Ta'kidlash joizki, organik mimetik ichak mikrosxemasi ichak epiteliysining o'z-o'zidan 3D morfogenezini qo'zg'atishi mumkin, biz biofizikani yaxshilaydi va uni ta'minlaymiz. Mikrosuyuqlik chipida, shuningdek Transwell o'rnatilgan gibrid chipida ichakda ichak morfogenezini ishonchli tarzda induktsiya qilish uchun takrorlanadigan protokol. Biz qurilma ishlab chiqarish, Caco-2 yoki ichak organoid epitelial hujayralarini an'anaviy sharoitlarda, shuningdek, mikro3D platformasida etishtirishning batafsil usullarini tasvirlab beramiz. morfogenez va o'rnatilgan 3D epiteliyaning bir nechta tasvirlash usullaridan foydalangan holda tavsifi .Ushbu protokol 5 kun davomida bazolateral suyuqlik oqimini nazorat qilish orqali funktsional ichak mikroarxitekturasini qayta tiklashga erishadi. Bizning in vitro morfogenez usulimiz fiziologik jihatdan tegishli siljish stressini va mexanik harakatni qo'llaydi va mavjud bo'lishi mumkin bo'lgan murakkab mexanizmlarni ishlab chiqarish yoki boshqa mexanizmlarni ishlab chiqarishni talab qilmaydi. Bizning taklif qilgan protokolimiz biotibbiyot, klinik va farmatsevtika dasturlari uchun in vitro 3D ichak epiteliya qatlamlarini qayta tiklash usulini taqdim etuvchi biotibbiyot tadqiqot hamjamiyatiga keng ta'sir ko'rsatishi mumkinligini tasavvur qiling.
Tajribalar shuni ko'rsatadiki, chip-on-a-chip1,2,3,4,5 yoki ikki qatlamli mikrosuyuqlik qurilmalarida yetishtirilgan ichak epitelial Kako-2 hujayralari asosiy mexanizmni aniq tushunmasdan, in vitroda spontan 3D morfogenezga o'tishi mumkin. Caco-2 va bemordan olingan ichak organoidlari tomonidan ko'rsatilgan in vitro 3D epiteliya morfogenezini qo'zg'atish uchun zarur va etarli. Epiteliya hujayralari tekshirildi. Ushbu tadqiqotda biz kuchli Wnt antagonisti Dickkopf-1 (DKK-1) ning hujayra ishlab chiqarilishi va kontsentratsiyasining tarqalishiga alohida e'tibor qaratdik. Chip ichidagi ichakka 1-repressor, ajraladigan jingalak bilan bog'liq protein 1 yoki Soggy-1) morfogenezni inhibe qiladi yoki oldindan tuzilgan 3D epiteliya qatlamini buzadi, bu madaniyat paytida antagonistik stress ichak morfogenezi uchun mas'ul ekanligini ko'rsatadi in vitro. Bazolateral bo'linmadagi Wnt antagonistlari darajasini faol yuvish (masalan, chip ustidagi ichak yoki gibrid-chip platformalarida) yoki diffuziya orqali olib tashlash yoki minimal darajada ushlab turishdir.
Ushbu protokolda biz polidimetilsiloksan (PDMS) asosidagi g'ovakli membranalarda (6A, 7A, 8, 9 B bosqichlari yoki poliester membranalarida) ichak epitelial hujayralarini etishtirish uchun chip-on-a-chip mikroqurilmalari va Transwell-insertable gibrid chiplarini (1-5-bosqichlar) ishlab chiqarishning batafsil usulini taqdim etamiz. 7B, 8, 9) va induksiyalangan 3D morfogenez in vitro (10-qadam). Shuningdek, biz bir nechta tasvirlash usullarini qo'llash orqali to'qimalarga xos gistogenez va naslga bog'liq hujayra farqlanishini ko'rsatadigan uyali va molekulyar xususiyatlarni aniqladik (11-24-bosqichlar). yoki ichak organoidlari, texnik tafsilotlari bilan ikkita madaniyat formatida, shu jumladan g'ovakli membranalarning sirtini o'zgartirish, 2D monoqatlamlarni yaratish va ichak biokimyoviy va biomexanik mikro muhitni ko'paytirish.in vitro. 2D epiteliya monoqatlamlaridan 3D morfogenezni qo'zg'atish uchun biz morfogen va lateral oqimlarni hosil qiluvchi muhitga morfogen va lateral oqim hosil qilgan holda olib tashladik. Nihoyat, biz morfogenga bog'liq epiteliy o'sishi, uzunlamasına xost-mikrobioma ko-kulturalari, patogen infektsiya, yallig'lanish shikastlanishi, epitelial to'siq disfunktsiyasi va probiotik.infunktsiyaga asoslangan probiyotika.infunktsiyasini modellashtirish uchun ishlatilishi mumkin bo'lgan qayta tiklanadigan 3D epiteliy qatlamining foydali imkoniyatlarini taqdim etamiz.
Protokolimiz asosiy (masalan, ichak shilliq qavati biologiyasi, ildiz hujayralari biologiyasi va rivojlanish biologiyasi) va amaliy tadqiqotlar (masalan, klinikadan oldingi dori sinovlari, kasalliklarni modellashtirish, toʻqimalar muhandisligi va gastroenterologiya) keng taʼsir koʻrsatadigan keng doiradagi olimlar uchun foydali boʻlishi mumkin. epithelium in vitro, biz texnik strategiyamiz ichak rivojlanishi, regeneratsiya yoki gomeostaz davrida hujayra signalizatsiyasi dinamikasini o'rganuvchi auditoriyaga tarqatilishi mumkinligini tasavvur qilamiz .Bundan tashqari, bizning protokolimiz Norovirus 8, Og'ir o'tkir respirator sindrom (CRSSA-CoV-2triicium) kabi turli yuqumli agentlar ostida infektsiyani so'roq qilish uchun foydalidir. Salmonella Typhimurium 9 yoki Vibrio cholerae. Kasallik patologiyasi va patogenezini tinglovchilar ham foydalidir. Chipdagi ichak mikrofiziologiyasi tizimidan foydalanish uzunlamasına ko-kultura 10 va keyinchalik xost mudofaasini, immun javoblarini va oshqozon-ichak traktida (GI) patogen bilan bog'liq jarohatlarni tuzatishni baholashga imkon beradi 11 . Boshqa oshqozon-ichak kasalliklari, sindrolaktik kasalliklar, sindirim kasalligi, glikemiya bilan bog'liq. Yarali kolit, pouchit yoki irritabiy ichak sindromi bemorning 3D ichak epitelial qatlamlari yordamida 3D ichak epiteliya qatlamlari tayyorlanganda taqlid qilinishi mumkin, bu kasalliklarga villöz atrofiya, kript qisqarishi, shilliq qavatning shikastlanishi yoki epitelial hujayralar to'sig'ining buzilishi kiradi. organoidlar12,13.Kasallik muhitining yuqori murakkabligini yaxshiroq modellashtirish uchun o'quvchilar 3D ichak villus-kriptli mikroarxitekturasini o'z ichiga olgan modellarga bemorning periferik qon mononuklear hujayralari (PBMCs) kabi kasallik bilan bog'liq hujayra turlarini qo'shishni ko'rib chiqishlari mumkin. to'qimalarga xos immun hujayralari, 5.
3D epiteliya mikrotuzilmasini kesish jarayonisiz tuzatish va vizualizatsiya qilish mumkin bo'lganligi sababli, fazoviy transkriptomika va yuqori aniqlikdagi yoki o'ta aniqlikdagi tasvirlar ustida ishlayotgan tomoshabinlar epiteliya bo'shliqlaridagi genlar va oqsillarning fazoviy-vaqt dinamikasini xaritalashimizga qiziqishi mumkin. Texnologiyaga qiziqaman.Mikrobial yoki immun stimullarga javob. Bundan tashqari, ichak gomeostazini muvofiqlashtiruvchi uzunlamasına xost-mikrobioma oʻzaro aloqasi 3D ichak shilliq qavatida turli mikrob turlarini, mikrobial jamoalarni yoki najas mikrobiotalarini birgalikda oʻstirish orqali 10, 14 oʻrnatilishi mumkin. Platformada.Bu yondashuv, ayniqsa, shilliq qavat immunologiyasi, gastroenterologiya, inson mikrobiomasi, kulturomika va klinik mikrobiologiyani oʻrganuvchi auditoriya uchun jozibador boʻlib, ilgari oʻstirilmagan ichak mikrobiotasini laboratoriyada etishtirishga intilmoqda.Agar bizning in vitro morfogenez protokolimiz keng koʻlamli formatlarga moslashtirilishi mumkin boʻlsa24, Bazolateral bo'linmalarni doimiy ravishda to'ldiradigan 384 quduq plitalari, protokol oziq-ovqat sanoati uchun farmatsevtika, biotibbiyot yoki yuqori o'tkazuvchanlik skrining yoki tekshirish platformalarini ishlab chiquvchilarga ham tarqatilishi mumkin. Prinsipning isboti sifatida biz yaqinda multipleks yuqori o'tkazuvchanlikka ega plastinalar formatini qo'shish imkoniyatini ko'rsatdik. Bir nechta organ-on-a-chip mahsulotlari tijoratlashtirildi16,17,18.Shuning uchun in vitro morfogenez usulimizni tekshirishni tezlashtirish va ko'plab tadqiqot laboratoriyalari, sanoat yoki hukumat va tartibga solish idoralari tomonidan in vitro ichak morfogenezini hujayrali qayta dasturlashni tushunish uchun tezlashtirilishi mumkin. nomzodlar ichak morfogenezi jarayonining takrorlanuvchanligini baholash uchun 3D ichak surrogatlari yoki maxsus yoki tijorat organ-on-a-chip modellari yordamida baholandi.
Ichak epitelial morfogenezini o'rganish uchun cheklangan miqdordagi insonga tegishli eksperimental modellardan foydalanilgan, bu asosan in vitroda 3D morfogenezni qo'zg'atish uchun amalga oshiriladigan protokollarning yo'qligi bilan bog'liq.Aslida, ichak morfogenezi haqidagi hozirgi ma'lumotlarning aksariyati hayvonlarni o'rganishga asoslangan (masalan, zebra balig'i yoki sichqonlar, tovuqlar va sichqonlar). xarajat talab qiladigan, axloqiy jihatdan shubhali bo'lishi mumkin va eng muhimi, insonning rivojlanish jarayonlarini aniq belgilamaydi.Ushbu modellar, shuningdek, ko'p tomonlama miqyosli tarzda sinovdan o'tish qobiliyatida juda cheklangan.Shuning uchun in vitro 3D to'qimalarining tuzilmalarini qayta tiklash bo'yicha protokolimiz in vivo jonli hayvonlar modellaridan, shuningdek, boshqa an'anaviy hujayra madaniyatini tasvirlangan u2D modellaridan ustundir. 3D epiteliy tuzilmalari turli shilliq qavat yoki immun stimullarga javoban kript-villus o‘qidagi differentsiatsiyalangan hujayralarning fazoviy joylashuvini o‘rganishga imkon berdi. 3D epiteliya qatlamlari mikrobial hujayralar fazoviy bo‘shliqlarni hosil qilish uchun qanday raqobatlashayotganini va xost omillariga javoban ekologik evolyutsiyani o‘rganish uchun bo‘sh joy berishi mumkin (masalan, ichki shilliq qavat va mikroorganizmlarga qarshi peptidlar).Bundan tashqari, 3D epiteliya morfologiyasi bizga ichak mikrobiotasi o'z jamoalarini qanday qurishini va sinergik ravishda mikrobial metabolitlarni (masalan, qisqa zanjirli yog 'kislotalari) ishlab chiqarishini tushunishga imkon beradi, ular hujayra tuzilishini va bazal kriptlarda ildiz hujayra bo'shliqlarini shakllantiradi.
3D ichak epitelial tuzilmalarini yaratish usulimizga qo'shimcha ravishda bir nechta in vitro usullari mavjud. Ichak organoidlari madaniyati ichak ildiz hujayralarini o'ziga xos morfogen sharoitlarda etishtirishga asoslangan zamonaviy to'qimalar muhandislik texnikasi23,24,25. Biroq, 3D organoid yoki xost modellaridan foydalanish ko'pincha kro-mikrobikulturani tahlil qilish uchun ko'pincha kro-organoidlarni tahlil qilishdir. chunki ichak lümeni organoid ichiga o'ralgan va shuning uchun mikrob hujayralari yoki ekzogen antijenler kabi luminal komponentlarning kiritilishi cheklangan. Organoid lumenlarga kirish mikroinjektor yordamida yaxshilanishi mumkin,26,27, ammo bu usul invaziv va mehnat talab qiladi va uni bajarish uchun maxsus bilimlarni talab qiladi.Bundan tashqari, statik sharoitlarda gidrogel iskalalarida saqlanadigan an'anaviy organoid madaniyatlar faol in vivo biomexanikani to'g'ri aks ettirmaydi.
Bir nechta tadqiqot guruhlari tomonidan qo'llaniladigan boshqa yondashuvlar gel yuzasida izolyatsiya qilingan inson ichak hujayralarini o'stirish orqali ichak epiteliya tuzilishiga taqlid qilish uchun oldindan tuzilgan 3D gidrogel iskalalaridan foydalanadi. 3D-bosma, mikro-frezeleme yoki litografik tarzda ishlab chiqarilgan qoliplar yordamida gidrogel iskalalarini yasash. stroma hujayralarini iskala ichiga qo'shish orqali yuqori nisbatli epiteliya tuzilishi va stroma-epitelial o'zaro bog'liqlikni o'rnatadigan fiziologik jihatdan mos keladigan morfogen gradientlari. Biroq, oldindan tuzilgan iskalalarning tabiati o'z-o'zidan morfogenetik jarayonning o'zini ko'rsatishiga to'sqinlik qilishi mumkin. Bu modellar, shuningdek, suyuqlikning interstili yoki dinamik oqimining etishmasligini ta'minlamaydi. ichak hujayralari morfogenezdan o'tishi va fiziologik funktsiyaga ega bo'lishi kerak.Yaqinda o'tkazilgan yana bir tadqiqotda mikrosuyuq platformada gidrojel iskalalari va lazer bilan qirqish usullaridan foydalangan holda naqshli ichak epitelial tuzilmalari ishlatilgan.Sichqoncha ichak organoidlari ichak naychali tuzilmalarini hosil qilish uchun chizilgan naqshlarga amal qiladi va intraluminal suyuqlik yordamida mikrosuyuqlik bilan o'ralgan bo'lishi mumkin. modul.Biroq, bu model na o'z-o'zidan morfogenetik jarayonlarni ko'rsatmaydi, na ichakning mexanobiologik harakatlarini o'z ichiga olmaydi. Xuddi shu guruhdagi 3D bosib chiqarish texnikasi o'z-o'zidan morfogenetik jarayonlarga ega miniatyura ichak naychalarini yaratishga muvaffaq bo'ldi. Naycha ichida turli xil ichak segmentlarining murakkab ishlab chiqarilishiga qaramay, bu model suyuqlik oqimini mexanik ravishda yo'q qilish qobiliyatiga ega emas. cheklangan, ayniqsa bioprinting jarayoni tugagandan so'ng, bezovta qiluvchi eksperimental sharoitlar yoki hujayralar o'rtasidagi o'zaro ta'sir. Buning o'rniga, bizning taklif qilingan protokolimiz ichakning o'z-o'zidan morfogenezini, fiziologik jihatdan tegishli siljish stressini, ichak harakatini taqlid qiluvchi biomexanikani, mustaqil apikal va bazolateral bo'linmalarga kirish imkoniyatini, komplekslarning biologik mikrokrelarligini ta'minlaydi. bizning in vitro 3D morfogenez protokolimiz mavjud usullarning qiyinchiliklarini yengish uchun qo'shimcha yondashuvni taqdim etishi mumkin.
Bizning protokolimiz butunlay 3D epitelial morfogenezga qaratilgan bo'lib, madaniyatda faqat epitelial hujayralar mavjud va mezenxima hujayralari, endotelial hujayralar va immun hujayralar kabi boshqa turdagi hujayralar yo'q. Yuqorida ta'riflanganidek, bizning protokolimizning o'zagi epitelial morfogenezni induktsiya qilishdan iborat. Bizning ichak-chip va gibrid-chipning mustahkam modulligi bizga to'lqinli 3D epiteliya qatlamini qayta yaratishga imkon bersa-da, epiteliya-mezenxima o'zaro ta'siri33,34, hujayradan tashqari matritsa (ECM) yotqizish 35, hujayra konstruktsiyalari kabi qo'shimcha biologik murakkabliklar va bizning hujayra konstruksiyalari xususiyatlari. bazal kriptlarda ko'proq ko'rib chiqilishi kerak. Mezenximadagi stromal hujayralar (masalan, fibroblastlar) ECM oqsillarini ishlab chiqarishda va ichak morfogenezini tartibga solishda asosiy rol o'ynaydi 35,37,38. Bizning modelimizga mezenxima hujayralarining qo'shilishi morfogenetik jarayonni va hujayraning endothelia qatlamini (ie endothelilya qatlami) o'ynash samaradorligini oshirdi. ichak mikromuhitida molekulyar transport39 va immun hujayralar to'plamini40 tartibga solishda muhim rol o'ynaydi.Bundan tashqari, to'qimalar modellari ko'p a'zolarning o'zaro ta'sirini ko'rsatish uchun mo'ljallangan bo'lsa, to'qimalar modellari o'rtasida bog'lanishi mumkin bo'lgan qon tomir komponentlari zaruriy shartdir.Shuning uchun, endotelial hujayralar modelga aniqroq organ-fiziologik xususiyatlarga ega bo'lishi kerak bo'lishi mumkin. rezolyutsiya.Bemordan olingan immun hujayralari, shuningdek, ichak kasalliklarini taqlid qilish kontekstida tug'ma immun javoblari, antigen taqdimoti, tug'ma adaptiv immun o'zaro bog'liqlik va to'qimalarga xos immunitetni ko'rsatish uchun juda muhimdir.
Gibrid chiplardan foydalanish ichakdagi chipga qaraganda ancha sodda, chunki qurilmani sozlash osonroq va Transwell qo'shimchalaridan foydalanish ichak epiteliysining kengaytirilishi mumkin bo'lgan ekin ekish imkonini beradi. Biroq, poliester membranali sotuvda mavjud bo'lgan Transwell qo'shimchalari elastik emas va peristaltikaga o'xshash harakatlarni taqlid qila olmaydi. Bundan tashqari, transvell qo'shimchalarini chipd bo'limiga o'rnatadi. apikal tomonda siljish stressisiz statsionar bo'lib qoldi. Shubhasiz, apikal bo'linmadagi statik xususiyatlar gibrid chiplarda uzoq muddatli bakterial kokulturani kamdan-kam hollarda qo'llab-quvvatlaydi. Gibrid chiplardan foydalanganda Transwell qo'shimchalarida 3D morfogenezni mustahkam tarzda qo'zg'atishimiz mumkin bo'lsa-da, suyuqlikning taqchilligi fiziologik va biomexanik jihatdan tegishli suyuqlik oqimini cheklashi mumkin. potentsial ilovalar uchun gibrid chip platformalari.
Chipdagi ichak va gibrid-chip kulturalarida inson kripti-villus o‘qini to‘liq miqyosda rekonstruksiya qilish to‘liq o‘rnatilmagan. Morfogenez epiteliy monoqatlamidan boshlanganligi sababli, 3D mikroarxitekturasi biz hujayralardagi protsessual xarakterga morfologik o‘xshashlikni ta’minlay olmaydi. Mikroinjiniylashtirilgan 3D epiteliyda bazal kript sohasi, kript va villous hududlar aniq chegaralanmagan. Chipdagi yuqori kanallar mikroinjeneriya epiteliysining balandligini oshirishga olib kelgan bo'lsa-da, maksimal balandlik hali ham ~300–400 mkm bilan cheklangan. Odamning ichak ichaklari va yirik ichaklaridagi haqiqiy chuqurligi ~3 mkm. va mos ravishda ~400 mkm, ingichka ichak villi balandligi esa ~600 mkm41.
Tasvirlash nuqtai nazaridan, 3D mikroarxitekturasini in situ o'ta aniqlikdagi tasviri chipdagi ichak bilan cheklanishi mumkin, chunki ob'ektiv linzadan epiteliya qatlamigacha bo'lgan talab qilinadigan ish masofasi bir necha millimetrga teng. Ushbu muammoni bartaraf etish uchun uzoqdan ob'ektiv talab qilinishi mumkin. PDMS.Bundan tashqari, chipdagi ichakning qatlam-qatlam mikrofabrikasiyasi har bir qatlam orasidagi doimiy yopishishni o'z ichiga olganligi sababli, epiteliya qatlamining sirt tuzilishini tekshirish uchun yuqori qatlamni ochish yoki olib tashlash juda qiyin. Masalan, skanerlash elektron mikroskop (SEM) yordamida.
PDMS ning hidrofobikligi hidrofobik kichik molekulalar bilan bog'liq mikrosuyuqlikka asoslangan tadqiqotlarda cheklovchi omil bo'lib kelgan, chunki PDMS bunday hidrofobik molekulalarni o'ziga xos tarzda adsorbsiyalashi mumkin. PDMSga alternativa boshqa polimerik materiallar bilan ko'rib chiqilishi mumkin. glikol) 43 ) hidrofobik molekulalarning adsorbsiyasini minimallashtirish uchun hisoblanishi mumkin.
Nihoyat, bizning usulimiz yuqori mahsuldorlikka ega bo‘lgan skrining yoki “bir o‘lchamli” foydalanuvchilarga qulay tajriba platformasini ta’minlash nuqtai nazaridan unchalik tavsiflanmagan. Joriy protokol CO2 inkubatorida joy egallagan va keng ko‘lamli eksperimentlarning oldini oladigan har bir mikroqurilma uchun shprits nasosini talab qiladi. Bazolateral muhitni doimiy ravishda to'ldirish va olib tashlash imkonini beruvchi 96-quduq yoki 384-quduqli gözenekli qo'shimchalar).
In vitroda inson ichak epiteliysining 3D morfogenezini qo'zg'atish uchun biz ikkita parallel mikrokanal va ular orasidagi elastik g'ovakli membranani o'z ichiga olgan mikrosuyuqlik chipli ichak qurilmasidan foydalandik. Shuningdek, biz bir kanalli mikrofluidik qurilmadan foydalanishni ham ko'rsatamiz. Transwell qo'shimchalarida o'stirilgan epiteliya qatlamlari. Har ikkala platformada ham inson ichak epiteliya hujayralarining morfogenezini bazolateral bo'limdan morfogen antagonistlarini olib tashlash uchun oqimning yo'nalishli manipulyatsiyasini qo'llash orqali ko'rsatish mumkin. Butun eksperimental protsedura (1-rasm) besh qismdan iborat: (i) transvell mikrosxemasidagi mikrosxemalar chipi. (1-5 bosqichlar; 1-band), (ii) ichak epitelial hujayralarini (Caco-2 hujayralari) yoki inson ichak organoidlarini tayyorlash; 2-5 qutilar), (iii) ichak chiplari yoki gibrid chiplaridagi ichak epitelial hujayralarining madaniyati (6-9-bosqichlar), (iv) in vitro 3D morfogenez induktsiyasi (10-bosqich) va (v) ) 3D epiteliya mikro tuzilishini tavsiflash uchun (tegishli nazorat guruhi, 24-bosqichlar). Quyida) epitelial morfogenezni fazoviy, vaqtinchalik, shartli yoki protsessual nazorat bilan solishtirish orqali in vitro morfogenez samaradorligini tasdiqlash uchun mo'ljallangan.
Biz ikki xil madaniyat platformasidan foydalandik: to‘g‘ri kanalli yoki chiziqli bo‘lmagan burilish kanallari bo‘lgan chip-on-a-chip yoki 1-bo‘limda tavsiflanganidek ishlab chiqarilgan mikrosuyuqlik qurilmasiga Transwell (TW) qo‘shimchalarini o‘z ichiga olgan gibrid chiplar va 1-5-bosqichlar. “Qurilmani ishlab chiqarish” bitta chip yoki insoniy test gibridli epitelli mikrosxemani yaratishning asosiy bosqichlarini ko‘rsatadi. Hujayralar ”hujayra manbasini (Kako-2 yoki inson ichak organoidlari) va ushbu protokolda qo'llaniladigan madaniyat jarayonini tushuntiradi. “In vitro morfogenez” Kako-2 yoki organoiddan olingan epiteliya hujayralari ichak chipida yoki Transwell qo'shimchalarida ekilgan gibrid morfogenez va keyinchalik gibridlangan chiplarning hosil bo'lishining umumiy bosqichlarini ko'rsatadi. epiteliy tuzilmasi. Dastur qadam raqami yoki quti raqami har bir oʻq ostida koʻrsatiladi. Ilovada ichak epiteliya qatlamlaridan qanday foydalanish mumkinligi misollari keltirilgan, masalan, hujayralarni farqlashda, ichak fiziologiyasini oʻrganishda, xost-mikrobioma ekotizimlarini oʻrnatishda va kasalliklarni modellashtirishda. ichak chipida hosil bo'lgan 3D Caco-2 epiteliy qatlamida ifodalangan.MUC2 signalizatsiyasi goblet hujayralarida va shilliq qavat yuzalaridan ajralib chiqadigan shilimshiqlarda mavjud. Ichak fiziologiyasidagi lyuminestsent tasvirlarda sial kislotasi va N-atsetilglyukozamin qoldiqlari uchun bo'yash natijasida hosil bo'lgan shilimshiq flüoresanli tasvirlar yordamida ko'rsatilgan. "Mezbon-Mikroblar birgalikda madaniyatlari" chipda ichakdagi xost-mikrobioma ko-kulturalarini ko'rsatadi. Chap panelda mikromuhandislik 3D Caco-2 epiteliy hujayralari bilan yashil floresan oqsilni (GFP) ifodalovchi E. coli ko-kulturasi ko'rsatilgan. O'ng panelda GFP E. Caco-2 epitelial hujayralari bilan ko-kulturasi ko'rsatilgan. keyin F-aktin (qizil) va yadrolar (ko'k) bilan immunofluoressensiya bo'yaladi. Kasallikni modellashtirish bakterial antigenlar (masalan, lipopolisakkarid, LPS) va immun hujayralar (masalan, PBMC-3D epidermisi yashil hujayralarini o'rnatish) bilan fiziologik ta'sir ostida ichak yallig'lanish chiplaridagi sog'lom va oqadigan ichakni ko'rsatadi. qatlam. Masshtab satri, 50 mkm. Pastki qatordagi tasvirlar: ma'lumotnoma ruxsati bilan moslashtirilgan "hujayralarni farqlash".2. Oksford universiteti matbuoti; Ref.5 ruxsati bilan qayta ishlab chiqarilgan. NAS; Ref.3 ruxsati bilan moslashtirilgan “Mezbon-Mikrob hamkorlik”. NAS; Ma'lumotnoma ruxsati bilan moslashtirilgan "Kasalliklarni modellashtirish".5. NAS.
Chip-on-chip va gibrid mikrosxemalar PDMS nusxalari yordamida ishlab chiqarilgan, ular yumshoq litografiya1,44 yo'li bilan kremniy qoliplaridan demorfed qilingan va SU-8 bilan naqshlangan. Har bir chipdagi mikrokanallarning dizayni siljish kuchlanishi va gidrodinamik bosim kabi gidrodinamikani hisobga olgan holda aniqlanadi1,4,12. Ikki yonma-yon joylashgan parallel to'g'ri mikrokanallardan iborat bo'lib, u murakkab ichak-chipga aylandi (Kengaytirilgan ma'lumotlar 1b-rasm), bu suyuqlikning yashash muddatini, chiziqli bo'lmagan oqim shakllarini va ekilgan hujayralarning ko'p o'qli deformatsiyasini induktsiya qilish uchun bir juft kavisli mikrokanallarni o'z ichiga oladi (212-rasmga ko'proq biochanika kerak). qayta yaratilgan, murakkab gut-on-a-chiplarni tanlash mumkin. Biz konvolyutsiyalangan Gut-Chip ham xuddi shunday vaqt oralig'ida 3D morfogenezni kuchli tarzda induktsiya qilishini ko'rsatdik, ekilgan hujayra turidan qat'i nazar, epiteliy o'sish darajasi o'xshash bo'ladi. bir-birini almashtirish mumkin. SU-8 naqshlari bilan kremniy qoliplarida davolangan PDMS nusxalari demoldingdan so'ng salbiy xususiyatlarni ta'minladi (2a-rasm). Chipdagi ichakni ishlab chiqarish uchun tayyorlangan yuqori PDMS qatlami ketma-ket gözenekli PDMS plyonkasi bilan bog'langan va keyin pastki PDMS qatlami bilan qaytarilmas mato ishlov berish orqali hizalangan. gibrid chiplar, davolangan PDMS replikalari Transwell qo'shimchalarini joylashtirishi mumkin bo'lgan bir kanalli mikrosuyuqlik qurilmalarini yaratish uchun shisha slaydlarga yopishtirilgan (2h-rasm va kengaytirilgan ma'lumotlar-rasm 2). Bog'lanish jarayoni PDMS replikasi va shishaning sirtlarini ishlov berish orqali amalga oshiriladi. silikon naycha, qurilma o'rnatish ichak epiteliysining 3D morfogenezini amalga oshirishga tayyor edi (2g-rasm).
a, SU-8 naqshli kremniy qoliplaridan PDMS qismlarini tayyorlashning sxematik tasviri. Qattiqlashtirilmagan PDMS eritmasi kremniy qolipga (chapda) quyildi, 60 °C da (o'rtada) quritildi va qolipdan chiqarildi (o'ngda). Qolipdan chiqarilgan PDMS bo'laklarga bo'lindi va keyingi foydalanish uchun tozalandi.b, PDMS fotosurati silisini tayyorlash uchun ishlatilgan. PDMS g'ovakli membranasini ishlab chiqarish uchun ishlatiladigan kremniy qolip.d, Yuqori va pastki PDMS komponentlari va yig'ilgan chipdagi ichak qurilmasining bir qator fotosuratlari.e, Yuqori, membrana va pastki PDMS komponentlarini tekislash sxemasi. Har bir qatlam plazma yoki toj bilan ishlov berish bilan qaytarib bo'lmaydigan tarzda bog'langan. bir-birining ustiga qo'yilgan konvolyutsiyalangan mikrokanallar va vakuum kameralari.g, Mikrosuyuq hujayra madaniyati uchun chipdagi ichakni o'rnatish.Silikon naycha va shprits bilan yig'ilgan chipdagi ishlab chiqarilgan ichak qopqoq ustiga qo'yilgan. gibrid chiplar yordamida gibrid chip ishlab chiqarish va 3D morfogenez suratlari. Ichak epiteliya hujayralarining 2D monoqatlamlari madaniyati uchun mustaqil ravishda tayyorlangan transvell qo'shimchalari Ichakning 3D morfogenezini induktsiya qilish uchun gibrid chipga kiritilgan. Muhit mikrokanal ichidagi mikrokanal orqali o'rnatiladi. bar, 1 sm.soat Ma'lumotnoma ruxsati bilan qayta nashr etilgan.4. Elsevier.
Ushbu protokolda Caco-2 hujayra liniyasi va ichak organoidlari epiteliya manbalari sifatida ishlatilgan (3a-rasm). Ikkala turdagi hujayralar ham mustaqil ravishda ekilgan (2-quti va 5-quti) va chip ichidagi ichak yoki Transwell qo'shimchalarining ECM bilan qoplangan mikrokanallarini ekish uchun ishlatilgan. T-kolbalardagi kako-2 hujayralari (10 dan 50 gacha) tripsinatsiya suyuqligi (quti 2) orqali dissotsilangan hujayra suspenziyalarini tayyorlash uchun yig'iladi. Ichak biopsiyalari yoki jarrohlik rezeksiyalaridan olingan inson ichak organoidlari 24 quduqli mikrostruktiv plastinalarni o'z ichiga olgan asosiy mikrostruktiv plastinalarni qo'llab-quvvatlash uchun Matrigel iskala gumbazlarida o'stirildi. morfogenlar (masalan, Wnt, R-spondin va Noggin) va organoidlar diametri ~ 500 mkm gacha o'sguncha, 3-qutida ta'riflanganidek tayyorlangan o'sish omillari har kuni to'ldirilib turiladi. To'liq o'sgan organoidlar yig'ib olinadi va ichakka yoki Transwell qo'shimchalariga ekish uchun bitta hujayralarga ajratiladi (avvalgi bo'limlarda turli xil bo'lishi mumkin). kasallik turi 12,13 (masalan, yarali kolit, Kron kasalligi, yo'g'on ichak saratoni yoki oddiy donor), lezyon joyi (masalan, lezyon bilan zararlanmagan hudud) va oshqozon-ichak traktidagi joylashuvi (masalan, o'n ikki barmoqli ichak, jejunum, yon ichak, ko'richak, yo'g'on ichak yoki to'g'ri ichak). (koloidlar), odatda ingichka ichak organoidlariga qaraganda morfogenlarning yuqori konsentratsiyasini talab qiladi.
a, Ichak chipida ichak morfogenezini induktsiya qilish uchun ish oqimi. Caco-2 inson ichak epiteliysi va ichak organoidlari ushbu protokolda 3D morfogenezini ko'rsatish uchun ishlatiladi. Izolyatsiya qilingan epiteliya hujayralari tayyorlangan ichak-chipnce qurilmasiga ekilgan (chiplangan hujayralar) va biriktirilgan. (biriktirilgan) kuni 0 (D0) kuni PDMS gözenekli membrana, apikal (AP) oqimi boshlangan va birinchi 2 kun davomida saqlanadi (oqim, AP, D0-D2) .Bazolateral (BL) oqimi ham tsiklik cho'zish harakatlari (cho'zish, oqim, AP va BL) bilan birga boshlanadi to'liq test 2D morogenezi 3D inlayer. 5 kunlik mikrosuyuqlik kulturasidan so'ng (morfogenez, D5) o'z-o'zidan paydo bo'ldi. Fazali kontrastli tasvirlar har bir tajriba bosqichida yoki vaqt nuqtasida Caco-2 hujayralarining reprezentativ morfologiyasini ko'rsatadi (bar grafik, 100 mkm). To'rtta sxematik diagramma ichak morfogenezining mos keladigan kaskadlarini ko'rsatadi (o'ng tomonda joylashgan suyuqlik sxemasi). flow.b, o'rnatilgan 3D Caco-2 epiteliysining sirt topologiyasini ko'rsatadigan SEM tasviri (chapda). Kattalashtirilgan maydonni ta'kidlaydigan ichki qism (oq chiziqli quti) 3D Caco-2 qatlamida (o'ngda) qayta tiklangan mikrovilluslarni ko'rsatadi (o'ngda).c, O'rnatilgan Caco-2 3D gorizontal frontal ko'rinishi, klaudin (ZO yorlig'i) uzluksiz membranali cho'tkasi, qizil (ZO yorliqli) cho'tkasi. va yadrolari (ko'k) Immunofluoresans konfokal ko'rish epiteliy hujayralari ichak chips.O'rta sxemasiga ishora strelkalar har bir konfokal ko'rinish uchun fokus tekisligi joylashuvini ko'rsatadi.d, Fazali kontrast mikroskop tomonidan olingan bir chip ustida o'stirilgan organoidlarda morfologik o'zgarishlar Time kursi, 9, to'plam 13, 13-kunlar). taqdim etilgan tasvirning yuqori kattalashishini ko‘rsatadi.e, 7.f kuni olingan bo‘lakda ichakda o‘rnatilgan organoid 3D epiteliyning DIC fotomikrografi, Ildiz hujayralari (LGR5; magenta), goblet hujayralari (MUC2; yashil), F-aktin (kulrang) va o‘sadigan kunlar uchun yadrolar uchun markerlarni ko‘rsatadigan qoplangan immunofluoresans tasvirlari. Epiteliya qatlamidagi (chapda) va 13 kunlik (o'rtada) organoidlar. Shuningdek, MUC2 signalizatsiyasisiz LGR5 signalizatsiyasini ta'kidlaydigan kengaytirilgan ma'lumotlar 3-rasmga qarang. Ichakda o'rnatilgan 3D organoid epiteliyning epiteliy mikrostrukturasini (o'ngda) ko'rsatadigan floresan tasvirlar (o'ngda C) membranani C3 membranasi bilan bo'yash orqali Madaniyat. Masshtab satri 50 mkm, agar boshqacha ko'rsatilmagan bo'lsa.b Ma'lumotnoma ruxsati bilan qayta chop etilgan.2. Oksford universiteti matbuoti; c Ma'lumotnoma ruxsati bilan moslashtirilgan.2. Oksford universiteti matbuoti; e va f ma'lumotnoma bo'yicha ruxsatnoma bilan moslashtirilgan.12 Creative Commons License CC BY 4.0 ostida.
Muvaffaqiyatli ECM qoplamasi uchun chipdagi ichakda PDMS g'ovakli membranasining hidrofobik yuzasini o'zgartirish kerak. Ushbu protokolda biz PDMS membranalarining hidrofobikligini o'zgartirish uchun ikki xil usulni qo'llaymiz. Caco-2 hujayralarini etishtirish uchun faqat UV / ozon bilan ishlov berish orqali sirt faollashuvining o'zi etarli edi. PDMS membranasi. Biroq, organoid epiteliyning mikrosuyuqlik madaniyati polietilenimin (PEI) va glutaraldegidni PDMS mikrokanallariga ketma-ket qo'llash orqali ECM oqsillarini samarali cho'ktirishga erishish uchun kimyoviy asosda sirt funksionalizatsiyasini talab qiladi. Sirt o'zgartirilgandan so'ng, ECM oqsillari PDMSni qoplash uchun yotqizildi va funksionallashtirilgan organoidlangan sirtga kiritiladi. epiteliy. Hujayralar biriktirilgandan so'ng, mikrosuyuqlik hujayra madaniyati hujayralar to'liq monoqatlam hosil bo'lgunga qadar faqat muhitni yuqori mikrokanalga perfuziya qilish orqali boshlanadi, pastki mikrokanal esa statik sharoitlarni saqlaydi. Sirt faollashuvi va ECM qoplamasi uchun bu optimallashtirilgan usul PMSD morfogenez yuzasida organoid epiteliyning biriktirilishiga imkon beradi.
Transwell madaniyatlari, shuningdek, hujayra ekishdan oldin ECM qoplamasini talab qiladi; ammo Transwell kulturalari g'ovakli qo'shimchalar yuzasini faollashtirish uchun murakkab dastlabki ishlov berish bosqichlarini talab qilmaydi. Transwell qo'shimchalarida Caco-2 hujayralarini o'stirish uchun g'ovakli qo'shimchalardagi ECM qoplamasi dissotsiatsiyalangan Kako-2 hujayralarining biriktirilishini tezlashtiradi (<1 soat) va qattiq bog'lanish to'sig'ining shakllanishi (<1-2 kun). qo'shimchalar, membrana yuzasiga biriktirilgan (<3 h) va organoidlar to'siq yaxlitligi bilan to'liq monolayer hosil bo'lguncha saqlanadi .Transwell madaniyatlari gibrid chiplardan foydalanmasdan 24 quduqli plitalarda amalga oshiriladi.
In vitro 3D morfogenezni o'rnatilgan epiteliya qatlamining bazolateral tomoniga suyuqlik oqimini qo'llash orqali boshlash mumkin. Chipdagi ichakda epiteliya morfogenezi muhit yuqori va pastki mikrokanallarga o'tkazilgandan so'ng boshlangan (3a-rasm). Yuqorida ta'riflanganidek, suyuqlik oqimini (yanal-kompleks) doimiy ravishda qayta tiklash uchun muhim ahamiyatga ega. yo'nalishli ajratilgan morfogen ingibitorlari. G'ovakli membranalar bilan bog'langan hujayralarni etarli miqdorda ozuqa moddalari va sarum bilan ta'minlash va luminal siljish kuchlanishini yaratish uchun biz odatda chipda ichakdagi ikki tomonlama oqimni qo'llaymiz. Gibrid chiplarda epiteliya monoqatlamlarini o'z ichiga olgan Transwell qo'shimchalari gibrid chiplarga kiritilgan. So'ngra, transvelal zardobning porlateral tomoniga o'rnatilgan. mikrokanal.Ichak morfogenezi ikkala madaniyat platformasida bazolateral oqim boshlanganidan 3-5 kun o'tgach sodir bo'ldi.
Mikromuhandislik 3D epiteliya qatlamlarining morfologik xususiyatlarini turli tasvirlash usullarini qo'llash orqali tahlil qilish mumkin, jumladan, fazali kontrastli mikroskopiya, differentsial interferentsiyali kontrastli (DIC) mikroskopiya, SEM yoki immunofloresan konfokal mikroskopiya (3 va 4-rasmlar). 3D epiteliya qatlamlari. PDMS va polyester plyonkalarning optik shaffofligi tufayli, chip-on-a-chip va gibrid chip platformalari qurilmani qismlarga ajratish yoki qismlarga ajratish zaruratisiz real vaqt rejimida in situ tasvirni ta'minlashi mumkin. Immunofluoresans ko'rishni amalga oshirayotganda (1-rasm, 1-rasm va xujayralar bilan), 4% (og'irlik/hajm) paraformaldegid (PFA), undan keyin Triton X-100 va 2% (wt/vol)) sigir zardobi albumini (BSA). Hujayra turiga qarab, turli fiksatorlar, o'tkazgichlar va blokirovka qiluvchi vositalardan foydalanish mumkin. yadro (masalan, 4′,6-diamidino-2-fenilen) indol, DAPI) yoki F-aktin (masalan, lyuminestsent yorliqli phalloidin) ga yo'naltirilgan qarama-qarshi bo'yoq bilan birga ikkilamchi antikorlar va undan keyin ikkilamchi antikorlar. fiziologiya”), mikrob hujayralarining tasodifiy kolonizatsiyasi (1-rasm, “Mezbon-mikrob ko-kulturasi”), immun hujayralarni jalb qilish (1-rasm, “Kasalliklarni modellashtirish”) yoki 3D epiteliya morfologiyasining konturlari (3c,f va 4b,c-rasm) pastki qatlamni yuqori qatlamdan ajratish uchun). mikrokanal qatlami, ref.2 da ko'rsatilganidek, 3D epiteliya morfologiyasi hamda apikal cho'tka chegarasidagi mikrovilluslar SEM orqali ko'rsatilishi mumkin (3b-rasm). Differensiatsiya belgilarining ifodasi miqdoriy PCR5 yoki bir hujayrali RNK ketma-ketligini bajarish orqali baholanishi mumkin. gibrid chiplar tripsinlash yo'li bilan yig'ib olinadi va keyin molekulyar yoki genetik tahlil uchun ishlatiladi.
a, Gibrid chipda ichak morfogenezini induktsiya qilish uchun ish jarayoni. Ushbu protokolda gibrid chip platformasida 3D morfogenezni ko'rsatish uchun Caco-2 va ichak organoidlari qo'llaniladi. Ajratilgan epiteliya hujayralari tayyorlangan Transwell qo'shimchalariga urug'langan (TW tayyor hujayralar va quyida ko'rsatilgan) rasmga qarang). Transwell qo'shimchalarida polyester membranalar, barcha hujayralar statik sharoitda (TW madaniyati) ekilgan. 7 kundan so'ng, epiteliya hujayralarining 2D monoqatlamini o'z ichiga olgan bitta Transwell qo'shimchasi gibrid chipga birlashtirilib, bazolateral oqimni (Flow, BL) kiritdi, bu oxir-oqibatda 3D mikroemorogenez konstruksiya qatlami (3D epitelizasi) hosil bo'lishiga olib keldi. har bir tajriba bosqichida yoki vaqt nuqtasida oddiy donordan (C103 chizig'i) ko'tarilgan yo'g'on ichakdan olingan inson organi epitelial hujayralarining morfologik xususiyatlarini ko'rsatadi. Yuqori qatlamlardagi sxemalar har bir bosqich uchun eksperimental konfiguratsiyani ko'rsatadi.b, Gibrid chiplar (chapdagi sxema) 3D morfogenezga olib kelishi mumkin. pozitsiyalar (yuqori, o'rta va pastki; o'ngdagi sxematik va mos keladigan nuqta chiziqlarga qarang). yaqqol morfologik xususiyatlarni ko'rsatdi.F-aktin (ko'k), yadro (kulrang).c, statik Transwellda (TW; oq chiziqli quti ichiga o'rnatilgan) ekilgan organoid kelib chiqqan epiteliya hujayralarining floresan konfokal mikrografigi (3D burchakli ko'rinish) gibrid chip (eng katta to'liq tortishish) bilan solishtirganda pa2D. 2D vertikal koʻndalang koʻrinishlar (yuqori oʻng burchakda joylashgan; “XZ”) ham 2D ​​va 3D funksiyalarini koʻrsatadi. Masshtab paneli, 100 mkm.c Maʼlumotnoma ruxsati bilan qayta chop etilgan.4. Elsevier.
Boshqaruv elementlarini an'anaviy statik ekish sharoitida bir xil hujayralarni (Kako-2 yoki ichak organoid epitelial hujayralari) ikki o'lchovli mono qatlamlarga o'stirish orqali tayyorlash mumkin. Ta'kidlash joizki, mikrokanallarning cheklangan hajm sig'imi tufayli ozuqa moddalarining kamayishi yuzaga kelishi mumkin (ya'ni, asl ichak-chip dizayni bo'yicha yuqori kanalda ~ 4 µL), epitelial epiteliyadan oldin va bazal qo'llanilishidan keyin. oqimini ham solishtirish mumkin.
Yumshoq litografiya jarayoni toza xonada amalga oshirilishi kerak. Chipdagi har bir qatlam (yuqori va pastki qatlamlar va membranalar) va gibrid chiplar uchun turli xil fotomaskalar ishlatilgan va alohida kremniy gofretlarda ishlab chiqarilgan, chunki mikrokanallarning balandligi har xil edi. Chipdagi ichakning yuqori va pastki mikrokanallarining maqsadli balandligi 500 mkm, maqsadli kanal balandligi 500 mkm. gibrid chip 200 mkm.
3 dyuymli kremniy gofretni aseton solingan idishga soling. Plastinani 30 soniya davomida muloyimlik bilan aylantiring, so'ng gofretni havoda quriting. Gofretni IPA bilan plastinkaga o'tkazing, so'ngra tozalash uchun plastinkani 30 soniya davomida aylantiring.
Silikon gofret yuzasidan organik qoldiqlarni maksimal darajada olib tashlash uchun ixtiyoriy ravishda piranha eritmasi (vodorod periks va konsentrlangan sulfat kislota aralashmasi, 1:3 (hajm/hajm)) ishlatilishi mumkin.
Piranha eritmasi o‘ta korroziy va issiqlik hosil qiladi. Qo‘shimcha xavfsizlik choralarini ko‘rish zarur. Chiqindilarni utilizatsiya qilish uchun eritma sovib, toza, quruq chiqindi idishiga o‘tkazing. Ikkilamchi idishlardan foydalaning va chiqindi idishlarini to‘g‘ri belgilang. Batafsilroq protseduralar uchun muassasaning xavfsizlik ko‘rsatmalariga amal qiling.
Gofretlarni 10 daqiqa davomida 200 °C issiq plastinka ustiga qo'yish orqali quriting. Suvsizlanishdan so'ng gofret sovutish uchun havoda besh marta chayqatildi.
Tozalangan kremniy gofretning oʻrtasiga ~10 g fotorezist SU-8 2100 toʻkib tashlang. Fotorezistni gofretga bir tekis yoyish uchun cımbızlardan foydalaning. Fotorezistni kamroq yopishqoq va oson yoyilishi uchun gofretni vaqti-vaqti bilan 65°C issiq plastinka ustiga qoʻying. Gofretni toʻgʻridan-toʻgʻri issiq plastinka ustiga qoʻymang.
SU-8 aylantiruvchi qoplama yordamida gofret ustida bir tekis taqsimlandi. SU-8ning kiruvchi aylanishini 5-10 soniya davomida 100 rpm/s tezlanishda 500 rpm tezlikda tarqalish uchun dasturlash. Chipdagi ichakning yuqori qatlami uchun 500 mkm balandlik; quyidagi "Muhim qadamlar" ga qarang) 300 rpm / s tezlashtirishda 30 soniyada 1200 rpm.
Asosiy aylanish tezligi silikon gofretdagi SU-8 naqshining maqsadli qalinligiga qarab sozlanishi mumkin.
Chipdagi ichakning yuqori qatlami uchun balandligi 500 mkm bo'lgan SU-8 naqshlarini yaratish uchun ushbu qutining aylanish qoplamasi va yumshoq pishirish bosqichlari (7 va 8-bosqichlar) ketma-ket takrorlandi (9-bosqichga qarang) 250 mkm bo'lgan ikkita qatlam hosil qilish uchun SU-8 qalin qatlami, bu qatlam bilan birlashtirilishi va UV qutisiga birlashtirilishi mumkin. 500 mkm balandlikda.
Gofretlarni 65 °C haroratda 5 daqiqa davomida issiq plastinkaga ehtiyotkorlik bilan qo'yib, SU-8 bilan qoplangan gofretlarni yumshoq pishiring, so'ngra sozlamani 95 °C ga o'tkazing va qo'shimcha 40 daqiqa davomida inkubatsiya qiling.
Yuqori mikrokanalda SU-8 naqshining 500 mkm balandligiga erishish uchun 250 mkm qalinlikdagi ikkita SU-8 qatlamini yaratish uchun 7 va 8-bosqichlarni takrorlang.
UV niqobini tekislash vositasidan foydalanib, gofretning ta'sir qilish vaqtini hisoblash uchun ishlab chiqaruvchining ko'rsatmalariga muvofiq chiroq sinovini o'tkazing.(ta'sir qilish vaqti, milodiy) = (ta'sir qilish dozasi, mJ/sm2)/(chiroq quvvati, mVt/sm2).
Ta'sir qilish vaqtini aniqlagandan so'ng, fotoniqobni UV niqobi alignerining niqob ushlagichiga qo'ying va fotoniqobni SU-8 bilan qoplangan gofretga joylashtiring.
Fotomaskaning bosilgan yuzasini to'g'ridan-to'g'ri kremniy gofretning SU-8 bilan qoplangan tomoniga UV tarqalishini minimallashtirish uchun joylashtiring.
SU-8 bilan qoplangan gofret va fotoniqobni vertikal ravishda 260 mJ/sm2 ultrabinafsha nuriga oldindan belgilangan taʼsir qilish vaqti uchun qoʻying (ushbu qutining 10-bosqichiga qarang).
UV ta'siridan so'ng, SU-8 bilan qoplangan kremniy gofretlari 200 mkm balandlikdagi naqshlarni tayyorlash uchun har bir issiq plastinkada 65 ° C da 5 daqiqa va 95 ° C da 15 daqiqa davomida pishirildi. 50 mkm balandlikdagi naqshlarni tayyorlash uchun pishirishdan keyingi vaqtni 95 ° C da 30 daqiqaga uzaytiring.
Ishlab chiquvchi shisha idishga quyiladi va pishirilgan gofret idishga joylashtiriladi. SU-8 ishlab chiqaruvchisining hajmi shisha plastinka hajmiga qarab farq qilishi mumkin. SU-8 ni to'liq olib tashlash uchun etarli miqdorda SU-8 ishlab chiqaruvchisidan foydalanganingizga ishonch hosil qiling. vaqti-vaqti bilan yumshoq aylanish bilan 25 daqiqa davomida.
Ishlab chiqilgan qolipni ~ 10 ml yangi ishlab chiquvchi bilan yuvib tashlang, so'ngra IPA bilan eritmani pipetka yordamida püskürtün.
Gofretni plazma tozalagichga joylashtiring va 1,5 daqiqa davomida kislorod plazmasiga (atmosfera gazi, maqsadli bosim 1 × 10−5 Torr, quvvat 125 Vt) ta'sir qiling.
Gofretni ichkarida shisha slayd bilan vakuumli quritgichga joylashtiring.Vafferlar va slaydlar yonma-yon joylashtirilishi mumkin.Agar vakuumli quritgich plastinka orqali bir necha qatlamlarga bo'lingan bo'lsa, slaydlarni pastki kameraga va gofretlarni yuqori kameraga qo'ying. 2H-perftoroktil)silan eritmasi shisha slaydga qo'yiladi va silanizatsiya uchun vakuum qo'llaniladi.
Muzlatilgan Caco-2 xujayralari flakonini 37°C suv hammomida eritib oling, so'ngra eritilgan hujayralarni 15 ml 37°C oldindan isitiladigan Caco-2 muhiti bo'lgan T75 kolbasiga o'tkazing.
Kako-2 hujayralarini ~ 90% qo'shilishda o'tkazish uchun avval iliq Caco-2 muhiti, PBS va 0,25% tripsin/1 mM EDTA 37 ° C suv hammomida.
Vakuum aspiratsiyasi orqali muhitni aspiratsiya qiling. Vakuum aspiratsiyasini takrorlash va yangi PBS qo'shish orqali 5 ml iliq PBS bilan hujayralarni ikki marta yuving.