Nature.com saytiga tashrif buyurganingiz uchun tashakkur. Siz foydalanayotgan brauzer versiyasi CSS-ni cheklangan darajada qo‘llab-quvvatlaydi. Eng yaxshi tajriba uchun yangilangan brauzerdan foydalanishni tavsiya qilamiz (yoki Internet Explorer-da moslik rejimini o‘chirib qo‘ying). Ayni paytda qo‘llab-quvvatlashning davom etishini ta’minlash uchun biz saytni uslublar va JavaScript-larsiz ko‘rsatamiz.
Inson ichak morfogenezi 3D epiteliy mikroarxitekturasi va fazoviy tashkilotning kript-villus xususiyatlarini o'rnatadi. Bu noyob tuzilma bazal kriptdagi ildiz hujayra bo'shlig'ini ekzogen mikrob antigenlari va ularning metabolitlaridan himoya qilish orqali ichak gomeostazini saqlab turish uchun zarurdir. Ichak shilliq qavati yuzasi. Shuning uchun 3D epiteliy tuzilmalarini qayta yaratish in vitro ichak modellarini yaratish uchun juda muhimdir. Ta'kidlash joizki, chipdagi organik mimetik ichak ichak epiteliysining o'z-o'zidan 3D morfogenezini qo'zg'atishi mumkin. Ichakdagi ichak morfogenezini mikrosuyuqlik chipida, shuningdek, Transwell o'rnatilgan gibrid chipida ko'rsating. Biz qurilma ishlab chiqarish, Caco-2 yoki ichak organoid epitelial hujayralarini an'anaviy sharoitlarda, shuningdek, mikrosuyuq platformada o'stirish, ko'p epimorfogenez va ko'p epimorfogenezni induktsiyalash, o'rnatilgan epimorfogenez3D yordamida ko'plab usullarni tasvirlab beramiz. .Ushbu protokol 5 kun davomida bazolateral suyuqlik oqimini nazorat qilish orqali ichakning funktsional mikroarxitekturasini qayta tiklashga erishadi. In vitro morfogenez usulimiz fiziologik jihatdan tegishli siljish kuchlanishini va mexanik harakatni qo'llaydi va murakkab hujayra muhandisligi yoki manipulyatsiyasini talab qilmaydi, bu boshqa mavjud usullardan ustun bo'lishi mumkin. biotibbiyot, klinik va farmatsevtika ilovalari uchun in vitro 3D ichak epiteliya qatlamlarini yedi.
Tajribalar shuni ko'rsatadiki, ichak epiteliysidagi kako-2 hujayralari yoki ikki qatlamli mikrosuyuqlik qurilmalarida 6,7 ​​o'stirilgan ichak epitelial hujayralari asosiy mexanizmni aniq tushunmasdan turib, in vitroda spontan 3D morfogenezga o'tishi mumkin. in vitroda 3D epiteliya morfogenezini keltirib chiqaradi, bu Caco-2 va bemordan olingan ichak organoidlari tomonidan ko'rsatilgan.Epiteliya hujayralari tekshirildi. Ushbu tadqiqotda biz kuchli Wnt antagonisti Dickkopf-1 (DKK-1) ning hujayra hosil bo'lishi va kontsentratsiyasining taqsimlanishiga alohida e'tibor qaratdik. "Gibrid chip" deb ataladigan Transwell qo'shimchalarini o'z ichiga olgan modifikatsiyalangan mikrosuyuq qurilmalarda. 1, chig'anoq bilan bog'liq bo'lgan oqsil 1 yoki Soggy-1) morfogenezni inhibe qiladi yoki oldindan tuzilgan 3D epiteliya qatlamini buzadi, bu madaniyat paytida antagonistik stress ichak morfogenezi uchun mas'ul ekanligini ko'rsatadi. nt antagonistlari bazolateral bo'linmada faol yuvish (masalan, chipda ichak yoki gibrid-chip platformalarida) yoki diffuziya .Bazolateral muhitda (masalan, Transwell qo'shimchalaridan quduqlardagi katta bazolateral rezervuarlarga).
Ushbu protokolda biz polidimetilsiloksan (PDMS) asosidagi g'ovakli membranalarda (6A, 7A, 8, 8, 6B membranalar, polyester 69-bandlar) ichak epitelial hujayralarini etishtirish uchun chip-on-a-chip mikroqurilmalari va Transwell-insertatsiya qilinadigan gibrid chiplarni (1-5-bosqichlar) ishlab chiqarishning batafsil usulini taqdim etamiz. , 9) va induktsiyalangan 3D morfogenez in vitro (10-bosqich). Shuningdek, biz bir nechta tasvirlash usullarini qo'llash orqali to'qimalarga xos gistogenez va naslga bog'liq hujayra farqlanishini ko'rsatadigan uyali va molekulyar xususiyatlarni aniqladik (11-24-bosqichlar). texnik tafsilotlari bilan kultura formatlari, shu jumladan g'ovakli membranalarning sirtini o'zgartirish, 2D mono qatlamlarini yaratish va ichak biokimyoviy va biomexanik mikro muhitni ko'paytirish.in vitro. 2D epiteliya monoqatlamlaridan 3D morfogenezni qo'zg'atish uchun biz morfogen antagonistlarini olib tashladik, kulturaning har ikkala shaklini ham lateral tarzda ifodalash orqali madaniyatli muhitni aks ettiramiz. Morfogenga bog'liq epiteliy o'sishi, uzunlamasına xost-mikrobioma ko-kulturalari, patogen infektsiya, yallig'lanish shikastlanishi, epitelial to'siq disfunktsiyasi va probiyotiklarga asoslangan terapiyani modellashtirish uchun ishlatilishi mumkin bo'lgan qayta tiklanadigan 3D epiteliya qatlamining foydasi.
Protokolimiz asosiy (masalan, ichak shilliq qavati biologiyasi, ildiz hujayralari biologiyasi va rivojlanish biologiyasi) va amaliy tadqiqotlar (masalan, klinikadan oldingi dori sinovlari, kasalliklarni modellashtirish, to‘qimalar muhandisligi va gastroenterologiya) bo‘yicha keng miqyosdagi olimlar uchun foydali bo‘lishi mumkin. Protokolimizdagi epimoritogenezning takrorlanishi va mustahkamligi tufayli. vitro, biz texnik strategiyamiz ichak rivojlanishi, regeneratsiyasi yoki gomeostazi davrida hujayra signalizatsiyasi dinamikasini o‘rganuvchi auditoriyaga tarqatilishi mumkinligini tasavvur qilamiz. Bundan tashqari, bizning protokolimiz Norovirus 8, Og‘ir o‘tkir nafas yo‘llari sindromi Coronavirus 2 (SARSfflostriicium V-2 (SARSfflostriicium)) kabi turli yuqumli agentlar ostida infektsiyani tekshirish uchun foydalidir. Vibrion vabosi.Kasallikning patologiyasi va patogenezini tinglovchilar ham foydalidir. Chipdagi ichak mikrofiziologiyasi tizimidan foydalanish uzunlamasına ko-kultura 10 va keyinchalik xost mudofaasini, immun javoblarini va oshqozon-ichak traktida (GI) patogen bilan bog'liq jarohatlarni tuzatishni baholashga imkon beradi 11 . Boshqa oshqozon-ichak kasalliklari, sindrolaktik kasalliklar, sindrolaktik kasalliklar, glikemiya bilan bog'liq. kolit, pouchit yoki irritabiy ichak sindromi bemorning 3D ichak epiteliy qatlamlari yordamida 3D ichak epiteliya qatlamlari tayyorlanganda taqlid qilinishi mumkin, bu kasalliklarga villöz atrofiya, kript qisqarishi, shilliq qavatning shikastlanishi yoki epiteliya to'sig'ining buzilishi kiradi. kasallik muhitining murakkabligi sababli, o'quvchilar 3D ichak villus-kriptli mikroarxitekturasini o'z ichiga olgan modellarga bemorning periferik qon mononuklear hujayralari (PBMCs) kabi kasallik bilan bog'liq hujayra turlarini qo'shishni ko'rib chiqishlari mumkin.to'qimalarga xos immunitet hujayralari, 5.
3D epiteliya mikrotuzilmasini kesish jarayonisiz tuzatish va vizualizatsiya qilish mumkin bo'lganligi sababli, fazoviy transkriptomika va yuqori aniqlikdagi yoki o'ta aniqlikdagi tasvirlar ustida ishlayotgan tomoshabinlar epiteliya bo'shliqlaridagi genlar va oqsillarning fazoviy-vaqt dinamikasini xaritalashimizga qiziqishi mumkin.Texnologiyaga qiziqaman.Mikrobial yoki immun stimullarga javob. Bundan tashqari, ichak gomeostazini muvofiqlashtiruvchi uzunlamasına xost-mikrobioma oʻzaro aloqasi 3D ichak shilliq qavatida turli mikrob turlarini, mikrobial jamoalarni yoki najas mikrobiotalarini birgalikda oʻstirish orqali 10, 14 oʻrnatilishi mumkin.Platformada.Bu yondashuv, ayniqsa, shilliq qavat immunologiyasi, gastroenterologiya, inson mikrobiomasi, kulturomika va klinik mikrobiologiyani oʻrganuvchi auditoriya uchun jozibador boʻlib, ilgari oʻstirilmagan ichak mikrobiotasini laboratoriyada etishtirishga intilmoqda.Agar bizning in vitro morfogenez protokolimiz koʻp qirrali kultura formatlariga moslashtirilishi mumkin boʻlsa294, Bazolateral bo'linmalarni doimiy ravishda to'ldirib turadigan s, protokol oziq-ovqat sanoati uchun farmatsevtika, biotibbiyot yoki yuqori o'tkazuvchanlik skrining yoki tekshirish platformalarini ishlab chiquvchilarga ham tarqatilishi mumkin. Prinsipning isboti sifatida biz yaqinda multipleks yuqori o'tkazuvchanlik qobiliyatini ko'rsatdik. 16,17,18. Shuning uchun in vitro morfogenez usulimizni tekshirish tezlashtirilishi va ko'plab tadqiqot laboratoriyalari, sanoat yoki hukumat va nazorat idoralari tomonidan in vitro ichak morfogenezini transkriptomik darajada hujayrali qayta dasturlashni tushunish uchun qabul qilinishi mumkin. ichak morfogenezi jarayonining takrorlanishini baholash uchun maxsus yoki tijorat organ-on-a-chip modellari.
Ichak epitelial morfogenezini o'rganish uchun cheklangan miqdordagi insonga tegishli eksperimental modellardan foydalanilgan, bu asosan in vitroda 3D morfogenezni qo'zg'atish uchun amalga oshiriladigan protokollarning yo'qligi bilan bog'liq.Aslida, ichak morfogenezi haqidagi hozirgi ma'lumotlarning ko'p qismi hayvonlarni o'rganishga asoslangan (masalan, zebra baliqlari, tovuqlar va tovuqlar) axloqiy jihatdan shubhali bo'lishi va eng muhimi, insonning rivojlanish jarayonlarini aniq belgilab qo'ymaydi.Ushbu modellar, shuningdek, ko'p tomonlama miqyosda sinovdan o'tish qobiliyatida juda cheklangan.Shuning uchun in vitro 3D to'qimalar tuzilmalarini qayta tiklash bo'yicha bizning protokolimiz in vivo jonli hayvonlar modellaridan, shuningdek, boshqa an'anaviy statik 2D hujayrali tuzilmalarni epitilizatsiya qilish uchun avvalgi epitilizatsiya qilingan 2D xujayra modellaridan ustundir. turli shilliq qavat yoki immun stimullarga javoban kript-villus o'qida differentsiatsiyalangan hujayralarning fazoviy joylashuvini amin. 3D epiteliy qatlamlari mikrob hujayralarining fazoviy bo'shliqlarni hosil qilish uchun qanday raqobatlashayotganini va xost omillariga javoban ekologik evolyutsiyani o'rganish uchun bo'sh joyni ta'minlashi mumkin (masalan, ichki va tashqi shilliq qavatlar, IgA3D pedimoral epiteliyaga qarshi va sekretsiyasi). Ushbu fan bizga ichak mikrobiotasi o'z jamoalarini qanday qurishini va sinergik tarzda mikrobial metabolitlarni (masalan, qisqa zanjirli yog 'kislotalari) ishlab chiqarishini tushunishga imkon beradi, ular hujayra tuzilishini va bazal kriptlarda ildiz hujayra bo'shliqlarini shakllantiradi. Bu xususiyatlarni faqat 3D epiteliya qatlamlari in vitro o'rnatilganda ko'rsatish mumkin.
3D ichak epitelial tuzilmalarini yaratish usuliga qo'shimcha ravishda, bir nechta in vitro usullari mavjud. Ichak organoidlari madaniyati ichak ildiz hujayralarini o'ziga xos morfogen sharoitlarda etishtirishga asoslangan zamonaviy to'qimalar muhandislik texnikasi23,24,25. Biroq, 3D organoid yoki xost modellaridan foydalanish, chunki ko'pincha char-organoid-modellarni ko'pincha ko'p mikrobikulyar tahlil qilish uchun mo'ljallangan. al lümen organoid ichiga o'ralgan va shuning uchun mikrob hujayralari yoki ekzogen antijenler kabi luminal komponentlarning kiritilishi cheklangan.Organoid lumenlarga kirish mikroinjektor yordamida yaxshilanishi mumkin,26,27, ammo bu usul invaziv va mehnat talab qiladi va uni bajarish uchun maxsus bilimlarni talab qiladi.Bundan tashqari, statik sharoitlarda gidrogel iskalalarida saqlanadigan an'anaviy organoid madaniyatlar faol in vivo biomexanikani to'g'ri aks ettirmaydi.
Bir nechta tadqiqot guruhlari tomonidan qo'llaniladigan boshqa yondashuvlar gel yuzasida izolyatsiya qilingan inson ichak hujayralarini o'stirish orqali ichak epiteliya tuzilishiga taqlid qilish uchun oldindan tuzilgan 3D gidrogel iskalalaridan foydalanadi. 3D-bosma, mikro-frezeleme yoki litografik tarzda ishlab chiqarilgan qoliplar yordamida gidrogel iskalalarini yasash. morfogen gradientlar, yuqori nisbatli epiteliya tuzilishi va stroma-epitelial o'zaro bog'lanishni stromal hujayralarni iskala ichiga qo'shish orqali o'rnatadi. Biroq, oldindan tuzilgan iskalalarning tabiati o'z-o'zidan morfogenetik jarayonning namoyon bo'lishiga to'sqinlik qilishi mumkin. Bu modellar, shuningdek, hujayralararo suyuqlikning dinamik oqimini ta'minlamaydi. genezis va fiziologik funktsiyani qo'lga kiritadi. Yana bir yaqinda o'tkazilgan tadqiqotda mikrosuyuqlik platformasida gidrogel iskalalari va naqshli ichak epitelial tuzilmalari lazer bilan qirqish usullaridan foydalangan. Sichqoncha ichak organoidlari ichak quvurli tuzilmalarini hosil qilish uchun chizilgan naqshlarga amal qiladi va intraluminal suyuqlik oqimi bu mikrosuyuqlik moduli yordamida takrorlanishi mumkin. morfogenetik jarayonlar va ichakning mexanobiologik harakatlarini o'z ichiga olmaydi. Xuddi shu guruhdagi 3D bosib chiqarish texnikasi o'z-o'zidan morfogenetik jarayonlarga ega miniatyura ichak naychalarini yaratishga muvaffaq bo'ldi. Naycha ichida turli xil ichak segmentlarining murakkab ishlab chiqarilishiga qaramay, bu modelda luminal suyuqlik oqimi va mexanik deformatsiya ham yo'q. Bundan tashqari, modelning ishlashi, ayniqsa biohujayraning to'liq bosilishidan so'ng cheklangan bo'lishi mumkin. o'zaro ta'sirlar. Buning o'rniga, bizning taklif etayotgan protokolimiz ichakning o'z-o'zidan morfogenezini, fiziologik jihatdan tegishli siljish stressini, ichak harakatini taqlid qiluvchi biomexanikani, mustaqil apikal va bazolateral bo'linmalardan foydalanish imkoniyatini va modulli murakkab biologik mikro muhitni qayta yaratishni ta'minlaydi. mavjud usullar.
Bizning protokolimiz butunlay 3D epitelial morfogenezga qaratilgan bo'lib, madaniyatda faqat epitelial hujayralar va boshqa turdagi mezenximal hujayralar, endotelial hujayralar va immun hujayralar kabi atrofdagi hujayralar yo'q. Yuqorida aytib o'tilganidek, bizning protokolimizning o'zagi epitelial morfogenezning induktsiyasidan iborat bo'lib, u yon tomondagi morfogenezni inhibe qilgan rotobusni olib tashlashdan iborat. Chip ustidagi ichak va gibrid-chipning modulliligi bizga to'lqinli 3D epiteliy qatlamini, epiteliya-mezenximal o'zaro ta'sirlar33,34 kabi qo'shimcha biologik murakkabliklarni, hujayradan tashqari matritsa (ECM) yotqizilishi 35 va bizning modelimizda ko'rib chiqiladigan hujayra konstruksiyalari xususiyatlariga ko'ra ko'proq kripto-vilkalarni qayta tiklashga imkon beradi. mezenximadagi tromal hujayralar (masalan, fibroblastlar) ECM oqsillarini ishlab chiqarishda va in vivo ichak morfogenezini tartibga solishda asosiy rol o'ynaydi35,37,38. Bizning modelimizga mezenxima hujayralarining qo'shilishi morfogenetik jarayonni va hujayra biriktirilishi samaradorligini oshirdi. Endotelial qatlam (ya'ni, fibroblastlar) hujayralarni qayta tashuvchi va immunogulyarlarni qayta tashuvchi muhim rol o'ynaydi. ichak mikro muhitida ishga qabul qilish40. Bundan tashqari, to'qima modellari ko'p a'zolarning o'zaro ta'sirini ko'rsatish uchun mo'ljallangan bo'lsa, to'qimalar modellari o'rtasida bog'lanishi mumkin bo'lgan qon tomir komponentlari zaruriy shartdir. Shuning uchun endotelial hujayralar organ darajasidagi aniqroq fiziologik xususiyatlarni modellashtirish uchun qo'shilishi kerak bo'lishi mumkin. tug'ma adaptiv immun o'zaro bog'liqlik va ichak kasalliklarini taqlid qilish kontekstida to'qimalarga xos immunitet.
Gibrid mikrosxemalar yordamida chig‘anoqli chiplardan foydalanish ancha sodda, chunki qurilmani sozlash oddiyroq va Transwell qo‘shimchalaridan foydalanish ichak epiteliysining keng ko‘lamli madaniyatini yaratish imkonini beradi. Biroq, sotuvda mavjud bo‘lgan poliester membranali Transwell qo‘shimchalari elastik emas va peristaltikaga o‘xshash harakatlarni taqlid qila olmaydi. Bundan tashqari, transvell qo‘shimchalari stansiyada chipli o‘rin qolmagan. apikal tomonda siljish kuchlanishi. Shubhasiz, apikal bo'linmadagi statik xususiyatlar gibrid chiplarda uzoq muddatli bakterial hamkorlikni kamdan-kam hollarda qo'llab-quvvatlaydi. Gibrid chiplardan foydalanganda Transwell qo'shimchalarida 3D morfogenezni mustahkam tarzda qo'zg'atishimiz mumkin bo'lsa-da, fiziologik jihatdan mos keladigan mikrosxemalar taqchilligi va platformaning potentsial suyuqlik oqimini cheklashi mumkin.
Chip ustidagi ichak va gibrid-chip kulturalarida inson kripti-villus o‘qini to‘liq miqyosda qayta qurish ishlari to‘liq o‘rnatilmagan. Morfogenez epiteliy monoqatlamidan boshlanganligi sababli, 3D mikroarxitekturasi bizdagi kriptovalyutaviy xarakterga yaqin morfologik o‘xshashlikni ta’minlay olmaydi. Mikroinjiniylashtirilgan 3D epiteliy, kript va villous hududlar aniq chegaralanmagan. Chipdagi yuqori kanallar mikroinjeneriya epiteliysining balandligini oshirishga olib kelgan bo'lsa-da, maksimal balandlik hali ham ~300–400 mkm bilan cheklangan. Inson ichaklarining haqiqiy chuqurligi kichik va yirik sinovlarga nisbatan ~30 mkm ni tashkil qiladi. ly, ingichka ichak villi balandligi esa ~600 mkm41.
Tasvirlash nuqtai nazaridan, 3D mikroarxitekturasini in situ o'ta aniqlikdagi tasviri chipdagi ichak bilan chegaralanishi mumkin, chunki ob'ektiv linzadan epiteliya qatlamigacha bo'lgan talab qilinadigan ish masofasi bir necha millimetrga teng. Ushbu muammoni bartaraf etish uchun uzoqdan ob'ektiv talab qilinishi mumkin. Bundan tashqari, chipdagi ichakning qatlam-qatlam mikrofabrikasiyasi har bir qatlam orasidagi doimiy yopishishni o'z ichiga olganligi sababli, epiteliya qatlamining sirt tuzilishini tekshirish uchun yuqori qatlamni ochish yoki olib tashlash juda qiyin. Masalan, skanerlash elektron mikroskop (SEM) yordamida.
PDMS ning hidrofobikligi hidrofobik kichik molekulalar bilan bog'liq mikrosuyuqlikka asoslangan tadqiqotlarda cheklovchi omil bo'lib kelgan, chunki PDMS bunday hidrofobik molekulalarni o'ziga xos tarzda adsorbsiyalashi mumkin. PDMSga alternativa boshqa polimerik materiallar bilan ham ko'rib chiqilishi mumkin. Shu bilan bir qatorda, PDMS ning sirt modifikatsiyasi (masalan, g2443) ) hidrofobik molekulalarning adsorbsiyasini minimallashtirish uchun hisoblanishi mumkin.
Nihoyat, bizning usulimiz yuqori mahsuldorlikka ega bo‘lgan skrining yoki “bir o‘lchamli” foydalanuvchilarga qulay tajriba platformasini ta’minlash nuqtai nazaridan unchalik tavsiflanmagan. Joriy protokol CO2 inkubatorida joy egallagan va keng ko‘lamli eksperimentlarni o‘tkazmaydigan har bir mikroqurilma uchun shprits nasosini talab qiladi. Bazolateral muhitni doimiy ravishda to'ldirish va olib tashlash imkonini beruvchi 384-quduqli gözenekli qo'shimchalar).
In vitroda inson ichak epiteliysining 3D morfogenezini induktsiya qilish uchun biz ikkita parallel mikrokanal va ularning orasidagi elastik g'ovakli membranani o'z ichiga olgan mikrosuyuqlik chipli ichak qurilmasidan foydalandik. Biz shuningdek, bir kanalli mikrofluidik qurilmadan foydalanishni ko'rsatamiz. Transwell qo'shimchalarida.Ikkala platformada ham inson ichak epiteliya hujayralarining morfogenezini bazolateral bo'limdan morfogen antagonistlarini olib tashlash uchun oqimning yo'naltirilgan manipulyatsiyasini qo'llash orqali ko'rsatish mumkin. Butun eksperimental protsedura (1-rasm) besh qismdan iborat: (i) ichak mikrofabrikasiyasi (i) ichak mikrofabrikasiyasi (1-rasm); ) ichak epiteliy hujayralarini (Caco-2 hujayralari) yoki inson ichak organoidlarini tayyorlash;2-5 qutilar), (iii) ichak chiplari yoki gibrid chiplaridagi ichak epitelial hujayralarining madaniyati (6-9-bosqichlar), (iv) in vitro 3D morfogenezning induktsiyasi (10-bosqich) va (v) ) 3D epiteliya mikro tuzilishini tavsiflash uchun (quyida tegishli bo'lgan nazorat guruhi (2-bosqichlar) 11-ga muvofiq ishlab chiqilgan). epitelial morfogenezni fazoviy, vaqtinchalik, shartli yoki protsessual nazorat bilan solishtirish orqali in vitro morfogenez samaradorligini tanovul qildi.
Biz ikki xil madaniyat platformasidan foydalandik: to‘g‘ri kanalli yoki chiziqli bo‘lmagan burilish kanallari yoki 1-qismda ko‘rsatilganidek ishlab chiqarilgan Transwell (TW) qo‘shimchalarini o‘z ichiga olgan gibrid chiplar. hujayra manbai (Caco-2 yoki inson ichak organoidlari) va ushbu protokolda qo'llaniladigan madaniyat usuli. "In vitro morfogenez" Kako-2 yoki organoiddan olingan epiteliya hujayralari ichak chipida yoki gibrid chipning Transwell qo'shimchalarida o'stirilishining umumiy bosqichlarini ko'rsatadi, so'ngra dasturning epimorfogenezi sonining induktsiyasi yoki epimorfogenezning 3D-raqamli tuzilishi. Har bir oʻq ostida koʻrsatiladi. Ilovada ichak epitelial qatlamlarini hujayralar differensiatsiyasini aniqlashda, ichak fiziologiyasini oʻrganishda, xost-mikrobioma ekotizimlarini oʻrnatishda va kasalliklarni modellashtirishda qanday foydalanish mumkinligiga misollar keltirilgan. “Hujayra farqlanishi”dagi immunofluoressensiya tasvirlari epiteliy hujayralarining epiteliy qatlamini va M2-D ni ifodalovchi epiteliy hujayralarini ifodalaydi, ichak chipida.MUC2 signalizatsiyasi goblet hujayralarida va shilliq qavat yuzalaridan ajralib chiqadigan shilimshiqlarda mavjud. Ichak fiziologiyasidagi lyuminestsent tasvirlarda bug'doy urug'ining floresan aglutinini yordamida sial kislotasi va N-atsetilglyukozamin qoldiqlarini bo'yash natijasida hosil bo'lgan shilimshiq ko'rsatilgan. Ikkita bir-biriga o'xshash xossa-mikrobikulyar tasvirlar ko'rsatilgan. s chipdagi ichakda. Chap panelda yashil floresan oqsilni (GFP) ifodalovchi E. coli ning mikromuhandislik 3D Caco-2 epiteliy hujayralari bilan birgalikda madaniyati ko‘rsatilgan. O‘ng panelda 3D Caco-2 epitelial hujayralari va nufuzli qizil rangli modellar (- nufuzli qizil rangli modellar) bilan birgalikda o‘stirilgan GFP E. coli lokalizatsiyasi ko‘rsatilgan. ing bakterial antijenler (masalan, lipopolisakkarid, LPS) va immun hujayralar (masalan, PBMC) bilan fiziologik ta'sir ostida ichak yallig'lanish chiplaridagi sog'lom va oqayotgan ichakni tasvirlaydi;yashil).Kako-2 hujayralari 3D epiteliy qatlamini yaratish uchun ekilgan. Masshtab satri, 50 mkm. Pastki qatordagi rasmlar: “Hujayralarning farqlanishi” maʼlumotnoma ruxsati bilan moslashtirilgan.2.Oksford universiteti matbuoti;Ref.5 ruxsati bilan qayta ishlab chiqarilgan.NAS;Ref.3 ruxsati bilan moslashtirilgan “Mezbon-Mikrob hamkorlik”.NAS;Ma'lumotnoma ruxsati bilan moslashtirilgan "Kasalliklarni modellashtirish".5.NAS.
Har ikki gut-on-chip va gibrid chiplar yumshoq litografi1,44 bilan kremniy qoliplardan demored qilingan va SU-8 bilan naqsh qilingan PDMS nusxalari yordamida ishlab chiqarilgan. Har bir chipdagi mikrokanallarning dizayni kesish kuchlanishi va gidrodinamik bosim kabi gidrodinamikani hisobga olgan holda aniqlanadi1,4,12. parallel to'g'ri mikrokanallarni qo'ygan, murakkab ichak-chipga aylangan (Kengaytirilgan ma'lumotlar 1b-rasm), bu bir juft kavisli mikrokanallarni o'z ichiga oladi, bu suyuqlikning yashash vaqtining ko'payishi, chiziqli bo'lmagan oqim naqshlari va ekilgan hujayralarning ko'p o'qli deformatsiyasi (2a-f-rasm) murakkab biokaniklarni qayta tiklash uchun g'ayrioddiy bo'lishi kerak. tanlanishi mumkin. Biz konvolyutsiyalangan Gut-Chip ham xuddi shunday vaqt oralig'ida 3D morfogenezni kuchli induktsiya qilishini ko'rsatdik, ekilgan hujayra turidan qat'i nazar, asl Gut-Chip bilan solishtirganda xuddi shunday epiteliya o'sishi bilan. SU-8 naqshli ds qolipdan so'ng salbiy xususiyatlarni taqdim etdi (1-rasm).2a).Ichakni chipda ishlab chiqarish uchun tayyorlangan yuqori PDMS qatlami ketma-ket gözenekli PDMS plyonkasi bilan bog'langan va keyin pastki PDMS qatlami bilan korona davolovchi yordamida qaytarilmas bog'lanish orqali hizalangan (2b-f-rasm). Gibrid chiplarni ishlab chiqarish uchun, davolangan PDMS replikalari bitta shisha-kanalli qurilmalarni yaratishi mumkin edi. quduq qo'shimchalari (2h-rasm va kengaytirilgan ma'lumotlar-shakl 2). Bog'lanish jarayoni PDMS replikasi va shisha sirtlarini kislorod plazmasi yoki korona bilan davolash orqali amalga oshiriladi.Silikon trubkaga biriktirilgan mikrofabrikali qurilma sterilizatsiya qilingandan so'ng, qurilmani o'rnatish 3D morfogenezini (intestinal 2-intestinal) bajarishga tayyor edi.
a, SU-8 naqshli kremniy qoliplaridan PDMS qismlarini tayyorlashning sxematik tasviri. Qattiqlashtirilmagan PDMS eritmasi kremniy qolipga (chapda) quyildi, 60 °C da (o'rtada) quritildi va qolipdan chiqarildi (o'ngda). Qolipdan chiqarilgan PDMS bo'laklarga bo'lindi va keyingi foydalanish uchun tozalandi.b, Silisni tayyorlash uchun PDMS fotografi, ishlatilgan sili. PDMS g'ovakli membranasini ishlab chiqarish uchun ishlatiladi.d, Yuqori va pastki PDMS komponentlari va yig'ilgan chipdagi ichak qurilmasining bir qator fotosuratlari.e, Yuqori, membrana va pastki PDMS komponentlarini tekislash sxemasi. Har bir qatlam plazma yoki korona bilan ishlov berish bilan qaytarib bo'lmaydigan tarzda bog'langan. s va vakuum kameralari.g, Mikrosuyuq hujayra madaniyati uchun ichak-chipni o'rnatish.Silikon naycha va shprits bilan yig'ilgan chipdagi ishlab chiqarilgan ichak qopqoq ustiga qo'yildi.Chip qurilmasi ishlov berish uchun 150 mm Petri idishining qopqog'iga o'rnatildi.Birlashtiruvchi mato chipslarini yopish uchun ishlatiladi. gibrid chiplar yordamida morfogenez. Ichak epiteliya hujayralarining 2D monoqatlamlari madaniyati uchun mustaqil ravishda tayyorlangan Transwell qo'shimchalari ichak 3D morfogenezini qo'zg'atish uchun gibrid chipga kiritilgan. Muhit Transwell insertida o'rnatilgan hujayra qatlami ostidagi mikrokanallar orqali perfuziya qilinadi.Elsevier.
Ushbu protokolda Caco-2 hujayra liniyasi va ichak organoidlari epiteliya manbalari sifatida ishlatilgan (3a-rasm). Ikkala turdagi hujayralar ham mustaqil ravishda ekilgan (2-quti va 5-quti) va chipdagi ichak yoki Transvel qo'shimchalarining ECM bilan qoplangan mikrokanallarini ekish uchun ishlatilgan. 10 va 50-bo'laklar) tripsinizatsiya suyuqligi yordamida dissotsilangan hujayra suspenziyalarini tayyorlash uchun T-kolbalarda yig'iladi (2-quti). Ichak biopsiyalari yoki jarrohlik rezeksiyalaridan olingan inson ichak organoidlari Matrigel iskala gumbazlarida 24 quduqli plastinkalarda o'stirildi. spondin va Noggin) va o'sish omillari 3-qutida ta'riflanganidek, organoidlar diametri ~500 mkm gacha o'sguncha har kuni to'ldirilib turiladi. To'liq o'sgan organoidlar yig'ib olinadi va ichakka yoki Transvell qo'shimchalariga ekish uchun bitta hujayralarga ajratiladi (5-quti). Avval xabar qilganimizdek, Croulceritis 13 turiga ko'ra har xil bo'lishi mumkin. n kasalligi, yo'g'on ichak saratoni yoki oddiy donor), lezyon joyi (masalan, lezyon bilan zararlanmagan hudud) va oshqozon-ichak traktidagi joylashuvi (masalan, o'n ikki barmoqli ichak, jejunum, yonbosh ichak, ko'richak, yo'g'on ichak yoki to'g'ri ichak). Biz 5-qutida yo'g'on ichakdagi organoidlarning kichik kontsentratsiyasini talab qiladigan kichik organmoroidlarni etishtirish uchun optimallashtirilgan protokolni taqdim etamiz. s.
a, Ichak chipida ichak morfogenezini induktsiya qilish uchun ish oqimi. Ushbu protokolda 3D morfogenezni ko'rsatish uchun Caco-2 inson ichak epiteliysi va ichak organoidlari qo'llaniladi. Izolyatsiya qilingan epiteliya hujayralari tayyorlangan ichak-chipnce qurilmasiga ekilgan (hujayralarga biriktirilgan) va biriktirilgan. MS g'ovakli membranasi 0 (D0) kunida, apikal (AP) oqimi boshlanadi va dastlabki 2 kun davomida saqlanadi (oqim, AP, D0-D2). Bazolateral (BL) oqim ham tsiklik cho'zish harakatlari (cho'zish, oqim, AP va BL) bilan birga boshlanadi, qachonki to'liq 2D monoqatlami hosil bo'lgandan so'ng 2D mikrotestogens3Influon 5 kundan keyin paydo bo'ladi. idik madaniyat (morfogenez, D5). Fazali kontrastli tasvirlar har bir tajriba bosqichida yoki vaqt nuqtasida Caco-2 hujayralarining reprezentativ morfologiyasini ko'rsatadi (bar grafik, 100 mkm). Ichak morfogenezining tegishli kaskadlarini ko'rsatadigan to'rtta sxematik diagramma (yuqori o'ngda). Chiziqli strelkalar S suyuqlik oqimining yuqori yo'nalishini ko'rsatadi3D. -2 epiteliya (chapda). Kattalashtirilgan maydonni ajratib ko'rsatadigan ichki qism (oq chiziqli quti) 3D Caco-2 qatlamida qayta tiklangan mikrovilluslarni ko'rsatadi (o'ngda).c, O'rnatilgan Caco-2 3D ning gorizontal old ko'rinishi, klaudin (ZO-1, qizil) va F-aktin (yashil) hujayralarning epiteliysi (yashil) va vizual konsentratsiyasining uzluksiz cho'tkasi chegarasi membranalari. ichak chiplarida.O'rta sxemaga ishora qiluvchi o'qlar har bir konfokal ko'rinish uchun fokus tekisligining joylashishini ko'rsatadi.d, 3, 7, 9, 11 va 13-kunlarda fazali kontrastli mikroskop yordamida olingan chipda o'stirilgan organoidlarda morfologik o'zgarishlarning vaqt kursi. Ichkarida (yuqori o'ngda) D organoidning yuqori kattalikdagi tasvirini ko'rsatadi. 7.f kuni olingan bo'lakdagi ichak, Ildiz hujayralari uchun markerlarni ko'rsatadigan ustki immunofluoresans tasvirlari (LGR5;qirmizi), goblet hujayralari (MUC2; yashil), F-aktin (kulrang) va yadrolar (koʻk) 3 kun davomida ichak chiplarida oʻsadi, mos ravishda (chapda) va 13 kunlik (oʻrtada) organoidlar epiteliy qatlamida. Shuningdek, kengaytirilgan maʼlumotlar 3-rasmga qarang. Bunda LGR5 signali MUC2 yoki oʻngdagi mikrostrukturali signallarni koʻrsatmaydi. Madaniyatning 13-kunida plazma membranasini CellMask bo'yog'i (o'ngda) bilan bo'yash orqali chipda ichakda o'rnatilgan 3D organoid epiteliy. Agar boshqacha ko'rsatilmagan bo'lsa, masshtab chizig'i 50 mkm.b Ma'lumotnoma ruxsati bilan qayta chop etilgan.2.Oksford universiteti matbuoti;c Ma'lumotnoma ruxsati bilan moslashtirilgan.2.Oksford universiteti matbuoti;e va f ma'lumotnoma bo'yicha ruxsatnoma bilan moslashtirilgan.12 Creative Commons License CC BY 4.0 ostida.
Chipdagi ichakda, muvaffaqiyatli ECM qoplamasi uchun PDMS g'ovakli membranasining hidrofobik yuzasini o'zgartirish kerak. Ushbu protokolda biz PDMS membranalarining hidrofobikligini o'zgartirish uchun ikki xil usulni qo'llaymiz. Caco-2 hujayralarini etishtirish uchun faqat UV / ozon bilan ishlov berish orqali sirt faollashishi, PCM2 membranasining hidrofobikligini va PCM2 membranasining hidrofobikligini kamaytirish uchun etarli edi. .Biroq, organoid epiteliyning mikrosuyuqlik madaniyati polietilenimin (PEI) va glutaraldegidni PDMS mikrokanallariga ketma-ket qo'llash orqali ECM oqsillarini samarali cho'ktirishga erishish uchun kimyoviy asosda sirt funksionalizatsiyasini talab qiladi. Sirt o'zgartirilgandan so'ng, ECM oqsillari yotqizildi. suyuq hujayra madaniyati hujayralar to'liq monoqatlam hosil bo'lgunga qadar yuqori mikrokanalga faqat muhitni perfuziya qilishdan boshlanadi, pastki mikrokanal esa statik sharoitlarni saqlaydi. Sirt faollashuvi va ECM qoplamasi uchun bu optimallashtirilgan usul PDMS yuzasida 3D morfogenezni qo'zg'atish uchun organoid epiteliyning biriktirilishiga imkon beradi.
Transwell madaniyatlari, shuningdek, hujayra ekishdan oldin ECM qoplamasini talab qiladi;ammo Transwell kulturalari g'ovakli qo'shimchalar yuzasini faollashtirish uchun murakkab dastlabki ishlov berish bosqichlarini talab qilmaydi. Transwell qo'shimchalarida Caco-2 hujayralarini o'stirish uchun g'ovakli qo'shimchalardagi ECM qoplamasi dissotsiatsiyalangan Kako-2 hujayralarining biriktirilishini (<1 soat) va qattiq birikma to'sig'ining shakllanishini (<1-2 kun) tezlashtiradi). membrana yuzasiga ed (<3 h) va organoidlar to'siq yaxlitligi bilan to'liq monoqatlam hosil bo'lgunga qadar saqlanadi .Transwell kulturalari gibrid chiplardan foydalanmasdan 24 quduqli plitalarda amalga oshiriladi.
In vitro 3D morfogenez suyuqlik oqimini oʻrnatilgan epiteliya qatlamining bazolateral tomoniga qoʻllash orqali boshlanishi mumkin. Chipdagi ichakda epiteliya morfogenezi muhit yuqori va pastki mikrokanallarga perfuziya qilinganda boshlangan (3a-rasm). Yuqorida taʼriflanganidek, suyuqlik oqimini (yanal yoʻnalishini) yoki sekretsiyaning doimiy yoʻnalishini kiritish uchun muhim ahamiyatga ega. morfogen ingibitorlari. G'ovakli membranalar bilan bog'langan hujayralarni etarli miqdorda ozuqa moddalari va sarum bilan ta'minlash va luminal kesish stressini yaratish uchun biz odatda chipda ichakda ikki tomonlama oqimni qo'llaymiz. Gibrid chiplarda, gibrid chiplarga epiteliya monoqatlamlarini o'z ichiga olgan Transwell qo'shimchalari kiritilgan. Keyin, transvell qo'shimchalari gibrid mikrosxemalar ichiga kiritilgan. ikkala madaniyat platformasida bazolateral oqim boshlanganidan 3-5 kun o'tgach sodir bo'ldi.
Mikromuhandislik 3D epiteliy qatlamlarining morfologik xususiyatlarini turli tasvirlash usullarini qo'llash orqali tahlil qilish mumkin, jumladan fazali kontrastli mikroskopiya, differensial interferentsiyali kontrast (DIC) mikroskopiya, SEM yoki immunofluoresan konfokal mikroskopiya (3 va 4-rasmlar). Fazali kontrastni yoki DICni istalgan vaqtda epitruzalash yoki DIC shaklini osongina kuzatish mumkin. telial qatlamlar. PDMS va polyester plyonkalarning optik shaffofligi tufayli, chip-on-a-chip va gibrid chip platformalari qurilmani qismlarga ajratish yoki qismlarga ajratish zaruratisiz real vaqt rejimida in situ tasvirni ta'minlashi mumkin. Immunofluoresans tasvirni amalga oshirayotganda (odatda 1, 4b-rasm, fvolt, xujayralar bilan fiksatsiyalangan) aldegid (PFA), undan keyin Triton X-100 va 2% (wt/vol) ) sigir zardobi albumini (BSA), tartibda. Hujayra turiga qarab, turli fiksatorlar, o'tkazgichlar va blokirovka qiluvchi vositalardan foydalanish mumkin. Naslga bog'liq hujayra yoki mintaqaga qaratilgan birlamchi antikorlar, ikkinchi darajali antikorli hujayralar bilan birga yuqori yorug'lik antikorlari bilan birga ishlatiladi. Yadro (masalan, 4′,6-diamidino-2-fenilen) indol, DAPI) yoki F-aktin (masalan, floresan yorliqli phalloidin) ga qaratilgan dog 'bo'yog'i. Balg'am hosil bo'lishini aniqlash uchun floresanga asoslangan jonli tasvirlash ham in situ amalga oshirilishi mumkin (Fig.1, "Hujayralarning differentsiatsiyasi" va "Ichak fiziologiyasi"), mikrob hujayralarining tasodifiy kolonizatsiyasi (1-rasm, "Mezbon-mikrob ko-kulturasi"), immun hujayralarni jalb qilish (1-rasm, "Kasalliklarni modellashtirish") yoki 3D epiteliya morfologiyasi konturlari (Fig 3b), chiplarni o'zgartirish, W3b. yuqori qatlamni pastki mikrokanal qatlamidan ajratish uchun, ref.2 da ko'rsatilganidek, 3D epiteliya morfologiyasi, shuningdek, apikal cho'tka chegarasidagi mikrovilluslar SEM orqali ko'rsatilishi mumkin (3b-rasm). Differensiatsiya belgilarining ifodasi miqdoriy PCR5 yoki bitta hujayrali RNA hujayralarini o'stirish orqali baholanishi mumkin. s yoki gibrid chiplar tripsinlash yo'li bilan yig'iladi va keyin molekulyar yoki genetik tahlil uchun ishlatiladi.
a, Gibrid chipda ichak morfogenezini induktsiya qilish uchun ish oqimi. Ushbu protokolda gibrid chip platformasida 3D morfogenezni ko'rsatish uchun Caco-2 va ichak organoidlari qo'llaniladi. Ajratilgan epiteliya hujayralari tayyorlangan Transwell qo'shimchalarida urug'langan (TW translatsiya qilingan hujayralar) va poliesterlarga biriktirilgan hujayralar quyida ko'rsatilgan). quduq qo'shimchalari, barcha hujayralar statik sharoitda (TW madaniyati) yetishtirildi. 7 kundan so'ng, epiteliya hujayralarining 2D monoqatlamini o'z ichiga olgan bitta Transwell inserti gibrid chipga birlashtirilib, bazolateral oqimni (Flow, BL) kiritdi, bu oxir-oqibatda 3D epiteliya qatlamining mikroorganik epiteliya konsentratsiyasini ko'rsatishga olib keldi (Oqim, BL). har bir tajriba bosqichida yoki vaqt nuqtasida oddiy donordan (C103 chizig'i) ko'tarilgan yo'g'on ichakdan olingan lial hujayralar. Yuqori qatlamlardagi sxemalar har bir bosqich uchun eksperimental konfiguratsiyani ko'rsatadi.b, Gibrid chiplar (chap sxema) organoid epiteliy hujayralarining 3D morfogeneziga olib kelishi mumkin (, yuqoridan pastga qarab turli xil mikroskopik ko'rinishlar olingan, o'rtada mikroskopik konfosu;o'ngdagi sxematik va mos keladigan nuqta chiziqlarga qarang).yaqqol morfologik xususiyatlarni ko'rsatdi. F-aktin (ko'k), yadro (kulrang).c, statik Transwellda (TW; oq chiziqli quti ichiga o'rnatilgan) ekilgan organoiddan olingan epiteliy hujayralarining floresan konfokal mikrografigi (3D burchakli ko'rinish) gibrid chipga (eng katta to'liq tortishish) nisbatan pa2D, pa2Dga nisbatan. vertikal kesma ko‘rinishlar (yuqori o‘ng burchakda joylashgan; “XZ”) ham 2D ​​va 3D funksiyalarini ko‘rsatadi. Masshtab paneli, 100 mkm.c Ma’lumotnoma ruxsati bilan qayta chop etilgan.4.Elsevier.
Boshqaruv elementlarini an'anaviy statik madaniyat sharoitida bir xil hujayralarni (Kako-2 yoki ichak organoid epitelial hujayralari) ikki o'lchovli mono qatlamlarga o'stirish orqali tayyorlash mumkin. Ta'kidlash joizki, mikrokanallarning cheklangan hajm sig'imi tufayli ozuqa moddalarining kamayishi yuzaga kelishi mumkin (ya'ni, asl ichak-chip dizayni bo'yicha yuqori kanalda ~ 4 mL), shuningdek, epiteli epiteliyaning dastlabki qo'llanilishidan oldin). solishtirildi.
Yumshoq litografiya jarayoni toza xonada amalga oshirilishi kerak. Chipdagi har bir qatlam (yuqori va pastki qatlamlar va membranalar) va gibrid chiplar uchun turli xil fotomaskalar ishlatilgan va alohida kremniy gofretlarda ishlab chiqarilgan, chunki mikrokanallarning balandligi har xil edi. Chipdagi ichakning yuqori va pastki mikrokanallarining maqsadli balandligi 500 mkm, maqsadli kanal balandligi 500 mkm ni tashkil qiladi. chip 200 mikron.
3 dyuymli kremniy gofretni aseton solingan idishga soling. Plastinani 30 soniya davomida muloyimlik bilan aylantiring, so'ng gofretni havoda quriting. Gofretni IPA bilan plastinkaga o'tkazing, so'ngra tozalash uchun plastinkani 30 soniya davomida aylantiring.
Silikon gofret yuzasidan organik qoldiqlarni maksimal darajada olib tashlash uchun ixtiyoriy ravishda piranha eritmasi (vodorod periks va konsentrlangan sulfat kislota aralashmasi, 1:3 (hajm/hajm)) ishlatilishi mumkin.
Piranha eritmasi o‘ta korroziy va issiqlik hosil qiladi. Qo‘shimcha xavfsizlik choralarini ko‘rish zarur. Chiqindilarni utilizatsiya qilish uchun eritma sovib, toza, quruq chiqindi idishiga o‘tkazing. Ikkilamchi idishlardan foydalaning va chiqindi idishlarini to‘g‘ri belgilang. Batafsilroq protseduralar uchun muassasaning xavfsizlik ko‘rsatmalariga amal qiling.
Gofretlarni 10 daqiqa davomida 200 °C issiq plastinka ustiga qo'yish orqali quriting. Suvsizlanishdan so'ng gofret sovutish uchun havoda besh marta chayqatildi.
Tozalangan kremniy gofretning oʻrtasiga ~10 g fotorezist SU-8 2100 toʻkib tashlang. Fotorezistni gofretga bir tekis yoyish uchun cımbızlardan foydalaning. Fotorezistni kamroq yopishqoq va oson yoyilishi uchun gofretni vaqti-vaqti bilan 65°C issiq plastinka ustiga qoʻying. Gofretni toʻgʻridan-toʻgʻri issiq plastinka ustiga qoʻymang.
SU-8 aylantiruvchi qoplama yordamida gofret ustida bir tekis taqsimlandi. SU-8ning kiruvchi aylanishini 5-10 soniya davomida 100 rpm/s tezlanishda 500 rpm tezlikda tarqalish uchun dasturlash. chipdagi ichakning yuqori qatlami uchun m balandligi; quyida "Muhim qadamlar" ga qarang) 300 rpm / s tezlashtirishda 30 soniya 1200 aylanish tezligida o'rnatiladi.
Asosiy aylanish tezligi silikon gofretdagi SU-8 naqshining maqsadli qalinligiga qarab sozlanishi mumkin.
Chipdagi ichakning yuqori qatlami uchun balandligi 500 mkm bo'lgan SU-8 naqshlarini yaratish uchun ushbu qutining aylanish qoplamasi va yumshoq pishirish bosqichlari (7 va 8-bosqichlar) ketma-ket takrorlandi (9-bosqichga qarang) 250 mkm lik ikkita qatlam hosil qilish uchun Qalin SU-8 qatlami, bu qatlam bilan qatlamlanishi va birlashtirilishi mumkin U2 mkm balandlikdagi qatlam 5 mkm. .
Gofretlarni 65 °C haroratda 5 daqiqa davomida issiq plastinkaga ehtiyotkorlik bilan qo'yib, SU-8 bilan qoplangan gofretlarni yumshoq pishiring, so'ngra sozlamani 95 °C ga o'tkazing va qo'shimcha 40 daqiqa davomida inkubatsiya qiling.
Yuqori mikrokanalda SU-8 naqshining 500 mkm balandligiga erishish uchun 250 mkm qalinlikdagi ikkita SU-8 qatlamini yaratish uchun 7 va 8-bosqichlarni takrorlang.
UV niqobini tekislash vositasidan foydalanib, gofretning ta'sir qilish vaqtini hisoblash uchun ishlab chiqaruvchining ko'rsatmalariga muvofiq chiroq sinovini o'tkazing.(ta'sir qilish vaqti, milodiy) = (ta'sir qilish dozasi, mJ/sm2)/(chiroq quvvati, mVt/sm2).
Ta'sir qilish vaqtini aniqlagandan so'ng, fotoniqobni UV niqobi alignerining niqob ushlagichiga qo'ying va fotoniqobni SU-8 bilan qoplangan gofretga joylashtiring.
Fotomaskaning bosilgan yuzasini to'g'ridan-to'g'ri kremniy gofretning SU-8 bilan qoplangan tomoniga UV tarqalishini minimallashtirish uchun joylashtiring.
SU-8 bilan qoplangan gofret va fotoniqobni vertikal ravishda 260 mJ/sm2 ultrabinafsha nuriga oldindan belgilangan taʼsir qilish vaqti uchun qoʻying (ushbu qutining 10-bosqichiga qarang).
UV ta'siridan so'ng, SU-8 bilan qoplangan kremniy gofretlari 200 mkm balandlikdagi naqshlarni tayyorlash uchun har bir issiq plastinkada 65 ° C da 5 daqiqa va 95 ° C da 15 daqiqa davomida pishirildi. 50 mkm balandlikdagi naqshlarni tayyorlash uchun pishirishdan keyingi vaqtni 95 ° C da 30 daqiqaga uzaytiring.
Ishlab chiquvchi shisha idishga quyiladi va pishirilgan gofret idishga joylashtiriladi. SU-8 ishlab chiqaruvchisining hajmi shisha plastinka hajmiga qarab farq qilishi mumkin. SU-8 ni to'liq olib tashlash uchun etarli miqdorda SU-8 ishlab chiqaruvchisidan foydalanganingizga ishonch hosil qiling. Masalan, 150 mm diametrli shisha idishni 1 L sig'imga ega bo'lgan holda ishlating. vaqti-vaqti bilan yumshoq aylanish bilan.
Ishlab chiqilgan qolipni ~ 10 ml yangi ishlab chiquvchi bilan yuvib tashlang, so'ngra IPA bilan eritmani pipetka yordamida püskürtün.
Gofretni plazma tozalagichga joylashtiring va 1,5 daqiqa davomida kislorod plazmasiga (atmosfera gazi, maqsadli bosim 1 × 10−5 Torr, quvvat 125 Vt) ta'sir qiling.
Gofretni ichi shisha slayd bilan vakuumli quritgichga joylashtiring.Vaffli va slaydlar yonma-yon joylashtirilishi mumkin.Agar vakuumli quritgich plastinka orqali bir necha qatlamlarga bo'lingan bo'lsa, slaydlarni pastki kameraga va gofretlarni yuqori kameraga qo'ying. 100 mkL trichlorooc,H1H2ty, (H,H2ty) tomizing. e eritmasini shisha slaydga qo'ying va silanizatsiya uchun vakuumni qo'llang.
Muzlatilgan Caco-2 xujayralari flakonini 37°C suv hammomida eritib oling, so'ngra eritilgan hujayralarni 15 ml 37°C oldindan isitiladigan Caco-2 muhiti bo'lgan T75 kolbasiga o'tkazing.
Kako-2 hujayralarini ~ 90% qo'shilishda o'tkazish uchun avval iliq Caco-2 muhiti, PBS va 0,25% tripsin/1 mM EDTA 37 ° C suv hammomida.
Vakuum aspiratsiyasi orqali muhitni aspiratsiya qiling. Vakuum aspiratsiyasini takrorlash va yangi PBS qo'shish orqali 5 ml iliq PBS bilan hujayralarni ikki marta yuving.