Nature.com saytiga tashrif buyurganingiz uchun tashakkur.Siz cheklangan CSS-ni qo'llab-quvvatlaydigan brauzer versiyasidan foydalanmoqdasiz.Eng yaxshi tajriba uchun yangilangan brauzerdan foydalanishni tavsiya qilamiz (yoki Internet Explorer-da Moslik rejimini o'chirib qo'ying).Bundan tashqari, doimiy qo'llab-quvvatlashni ta'minlash uchun biz saytni uslublar va JavaScriptlarsiz ko'rsatamiz.
Bir vaqtning o'zida uchta slayddan iborat karuselni ko'rsatadi.Bir vaqtning o'zida uchta slayd bo'ylab harakatlanish uchun "Oldingi" va "Keyingi" tugmalaridan foydalaning yoki bir vaqtning o'zida uchta slayd bo'ylab harakatlanish uchun oxiridagi slayder tugmalaridan foydalaning.
Qon-miya to'sig'i va qon-miya to'sig'i bioterapevtik vositalarning markaziy asab tizimida o'z maqsadlariga erishishiga to'sqinlik qiladi va shu bilan nevrologik kasalliklarni samarali davolashga to'sqinlik qiladi.In vivo yangi miya tashuvchilarni kashf qilish uchun biz T7 fag peptid kutubxonasini va kalamushlarning kanullangan ongli katta hovuz modelidan foydalangan holda ketma-ket to'plangan qon va miya omurilik suyuqligini (CSF) taqdim etdik.Maxsus fag klonlari to'rtta tanlovdan so'ng CSFda yuqori darajada boyitilgan.Ayrim nomzod peptidlarni sinovdan o'tkazish CSFning 1000 martadan ko'proq boyilishini aniqladi.Miyaga peptid vositasida etkazib berishning bioaktivligi aniqlangan yangi tranzit peptid bilan bog'langan BACE1 peptid inhibitori yordamida miya omurilik suyuqligidagi amiloid-b darajasining 40% ga kamayishi bilan tasdiqlandi.Ushbu natijalar in vivo fag tanlash usullari bilan aniqlangan peptidlar terapevtik ta'sirga ega bo'lgan miyaga makromolekulalarni tizimli etkazib berish uchun foydali vositalar bo'lishi mumkinligini ko'rsatadi.
Markaziy asab tizimining (CNS) maqsadli terapiyasi bo'yicha tadqiqotlar asosan miyaga faol dori etkazib berish mexanizmlarini kashf qilish uchun kamroq kuch sarflagan holda, CNS-ni maqsadli xususiyatga ega bo'lgan optimallashtirilgan dorilar va agentlarni aniqlashga qaratilgan.Bu hozir o'zgara boshladi, chunki dori vositalarini etkazib berish, ayniqsa katta molekulalar, zamonaviy nevrologiya dori vositalarini ishlab chiqishning ajralmas qismidir.Markaziy asab tizimining muhiti qon-miya to'sig'i (BBB) ​​va qon-miya to'sig'i (BCBB) 1 dan iborat serebrovaskulyar to'siq tizimi tomonidan yaxshi himoyalangan, bu esa miyaga dorilarni etkazib berishni qiyinlashtiradi1,2.Taxminlarga ko'ra, deyarli barcha yirik molekulali dorilar va kichik molekulali dorilarning 98% dan ortig'i miyadan chiqariladi3.Shuning uchun terapevtik dori-darmonlarni CNS 4,5 ga samarali va aniq etkazib berishni ta'minlaydigan yangi miya transport tizimlarini aniqlash juda muhimdir.Biroq, BBB va BCSFB, shuningdek, dori vositalarini yuborish uchun ajoyib imkoniyatni taqdim etadi, chunki ular miyaning barcha tuzilmalariga uning keng tomirlari orqali kirib boradi.Shunday qilib, miyaga etkazib berishning invaziv bo'lmagan usullarini qo'llash bo'yicha hozirgi sa'y-harakatlar asosan endogen BBB6 retseptorlari yordamida retseptorlar vositachiligidagi transport (PMT) mexanizmiga asoslangan.Transferrin retseptorlari yo'lidan7,8 foydalanadigan so'nggi muhim yutuqlarga qaramay, yaxshilangan xususiyatlarga ega yangi etkazib berish tizimlarini yanada rivojlantirish talab etiladi.Shu maqsadda bizning maqsadimiz CSF transportida vositachilik qila oladigan peptidlarni aniqlash edi, chunki ular printsipial ravishda makromolekullarni CNSga etkazish yoki yangi retseptor yo'llarini ochish uchun ishlatilishi mumkin edi.Xususan, serebrovaskulyar tizimning o'ziga xos retseptorlari va tashuvchilari (BBB va BSCFB) bioterapevtik preparatlarni faol va o'ziga xos etkazib berish uchun potentsial maqsadlar bo'lib xizmat qilishi mumkin.Miya omurilik suyuqligi (BOS) xoroid pleksusning (KS) sekretsiya mahsuloti bo'lib, subaraknoid bo'shliq va qorincha bo'shlig'i orqali miyaning interstitsial suyuqligi bilan bevosita aloqada bo'ladi4.So'nggi paytlarda subaraknoid miya omurilik suyuqligi miyaning interstitiumiga haddan tashqari diffuziyalanishi ko'rsatildi9.Biz parenxima bo'shlig'iga ushbu subaraknoid oqim yo'li orqali yoki to'g'ridan-to'g'ri BBB orqali kirishga umid qilamiz.Bunga erishish uchun biz ushbu ikkita alohida yo'ldan biri orqali tashiladigan peptidlarni ideal tarzda aniqlaydigan in vivo faglarni tanlashning mustahkam strategiyasini amalga oshirdik.
Endi biz eng yuqori kutubxona xilma-xilligi bilan dastlabki tanlov davrlarini kuzatish uchun yuqori o'tkazuvchanlik ketma-ketligi (HTS) bilan birlashtirilgan CSF namunalarini olish bilan ketma-ket in vivo fajlarni ko'rsatish skrining usulini tasvirlaymiz.Qonning ifloslanishini oldini olish uchun doimiy ravishda implantatsiya qilingan katta sisterna (CM) kanülli ongli kalamushlarda skrining o'tkazildi.Muhimi, bu yondashuv miyani nishonga olish va serebrovaskulyar to'siq bo'ylab transport faolligi bilan peptidlarni tanlaydi.Biz T7 faglarini kichik o'lchamlari (~ 60 nm) 10 tufayli ishlatdik va ular endotelial va / yoki epiteliya-medulla to'sig'ini transcellular kesib o'tishga imkon beruvchi vesikulalarni tashish uchun mos ekanligini taklif qildik.To'rtta turdan so'ng fag populyatsiyalari ajratildi, ular in vivo jonli ravishda CSFni boyitish va miya mikrotomirlari assotsiatsiyasini ko'rsatdi.Eng muhimi, afzal qilingan va kimyoviy jihatdan sintez qilingan eng yaxshi nomzod peptidlar oqsil yukini miya omurilik suyuqligiga tashishga qodir ekanligini ko'rsatish orqali biz topilmalarimizni tasdiqlashga muvaffaq bo'ldik.Birinchidan, markaziy asab tizimining farmakodinamik ta'siri etakchi tranzit peptidni BACE1 peptid inhibitori bilan birlashtirish orqali o'rnatildi.In vivo funktsional skrining strategiyalari yangi miya transport peptidlarini samarali protein yuk tashuvchisi sifatida aniqlashi mumkinligini ko'rsatishdan tashqari, shunga o'xshash funktsional tanlash yondashuvlari miyaning yangi transport yo'llarini aniqlashda ham muhim bo'lishini kutamiz.
Blyashka hosil qiluvchi birliklarga (PFU) asoslanib, faglarni qadoqlash bosqichidan so'ng, taxminan 109 xilma-xillikka ega tasodifiy 12-mer chiziqli T7 fag peptidlari kutubxonasi ishlab chiqilgan va yaratilgan (Materiallar va usullarga qarang).Shuni ta'kidlash kerakki, biz ushbu kutubxonani in vivo panoramadan oldin sinchkovlik bilan tahlil qildik.O'zgartirilgan primerlar yordamida fag kutubxonasi namunalarini PCR bilan kuchaytirish HTS uchun to'g'ridan-to'g'ri qo'llaniladigan amplikonlarni hosil qildi (Qo'shimcha rasm 1a).A) HTS11 ketma-ketlik xatolari, b) primerlarning sifatiga ta'siri (NNK) 1-12 va c) kutish kutubxonasida yovvoyi tipdagi (og'irlik) fag (skelet qo'shimchalari) mavjudligi sababli, faqat tasdiqlangan ketma-ketlik ma'lumotlarini olish uchun ketma-ketlikni filtrlash jarayoni amalga oshirildi (Qo'shimcha rasm. 1b).Ushbu filtrlash bosqichlari barcha HTS ketma-ketlik kutubxonalariga tegishli.Standart kutubxona uchun jami 233 868 ta o'qish olindi, ulardan 39% filtr mezonlaridan o'tdi va keyingi bosqichlar uchun kutubxona tahlili va tanlash uchun foydalanildi (Qo'shimcha rasm 1c-e).O'qishlar asosan uzunligi 3 ta asosiy juftlikdan iborat bo'lib, cho'qqisi 36 nukleotidda (Qo'shimcha 1c-rasm) kutubxona dizaynini (NNK) 1-12 tasdiqlaydi.Shunisi e'tiborga loyiqki, kutubxona a'zolarining taxminan 11% 12 o'lchovli yovvoyi turdagi (og'irlik) magistral PAGISRELVDKL qo'shimchasini o'z ichiga olgan va ketma-ketliklarning deyarli yarmi (49%) qo'shish yoki o'chirishni o'z ichiga olgan.Kutubxona kutubxonasi HTS kutubxonadagi peptidlarning xilma-xilligini tasdiqladi: peptidlar ketma-ketligining 81% dan ortig'i faqat bir marta topilgan va faqat 1,5% ≥4 nusxada bo'lgan (Qo'shimcha rasm 2a).Repertuardagi barcha 12 pozitsiyada aminokislotalarning chastotalari (aa) degeneratsiyalangan NKK repertuarida hosil bo'lgan kodonlar soni uchun kutilgan chastotalar bilan yaxshi bog'liq edi (Qo'shimcha rasm. 2b).Ushbu qo'shimchalar tomonidan kodlangan aa qoldiqlarining kuzatilgan chastotasi hisoblangan chastota (r = 0,893) bilan yaxshi bog'liq edi (Qo'shimcha rasm 2c).Fag kutubxonalarini in'ektsiya uchun tayyorlash endotoksinni kuchaytirish va olib tashlash bosqichlarini o'z ichiga oladi.Bu ilgari fag kutubxonalarining xilma-xilligini kamaytirishi ko'rsatilgan edi12,13.Shuning uchun biz endotoksinni olib tashlashdan o'tgan plastinka bilan kuchaytirilgan fag kutubxonasini ketma-ketlashtirdik va AA chastotasini baholash uchun uni asl kutubxona bilan taqqosladik.Dastlabki hovuz va kuchaytirilgan va tozalangan hovuz o'rtasida kuchli bog'liqlik (r = 0,995) kuzatildi (Qo'shimcha rasm. 2d), bu T7 fag yordamida plitalarda kuchaytirilgan klonlar o'rtasidagi raqobat katta noaniqlikka olib kelmasligini ko'rsatadi.Ushbu taqqoslash har bir kutubxonadagi tripeptid motivlarining chastotasiga asoslanadi, chunki kutubxonalarning xilma-xilligini (~ 109) hatto HTS bilan ham to'liq yozib bo'lmaydi.Har bir pozitsiyada aa chastotasi tahlili kiritilgan repertuarning oxirgi uchta pozitsiyasida kichik pozitsiyaga bog'liq bo'lgan moyillikni aniqladi (Qo'shimcha rasm 2e).Xulosa qilib aytganda, kutubxonaning sifati va xilma-xilligi maqbul bo'lganligi va fag kutubxonalarini tanlashning bir necha bosqichlari o'rtasida kuchaytirish va tayyorlash tufayli xilma-xillikda faqat kichik o'zgarishlar kuzatilgan degan xulosaga keldik.
Miya omurilik suyuqligidan ketma-ket namuna olish BBB va/yoki BCSFB orqali tomir ichiga yuborilgan (iv) T7 fagini aniqlashni osonlashtirish uchun ongli kalamushlarning CM siga kanülni jarrohlik yo'li bilan implantatsiya qilish orqali amalga oshirilishi mumkin (1a-b-rasm).In vivo tanlovning dastlabki uch bosqichida ikkita mustaqil tanlov qo'lini (A va B qo'llari) ishlatdik (1c-rasm).Biz tanlovning dastlabki uchta bosqichida kiritilgan faglarning umumiy miqdorini kamaytirish orqali tanlovning qattiqligini bosqichma-bosqich oshirdik.Panoramaning to'rtinchi bosqichi uchun biz A va B filiallaridan namunalarni birlashtirdik va uchta qo'shimcha mustaqil tanlovni amalga oshirdik.Ushbu modeldagi T7 fag zarralarining in vivo xususiyatlarini o'rganish uchun yovvoyi tipdagi fag (PAGISRELVDKL master insert) quyruq venasi orqali kalamushlarga yuborildi.Faglarning miya omurilik suyuqligidan va qondan turli vaqtlarda tiklanishi nisbatan kichik T7 ikozahedral faglarning qon bo'limidan tez dastlabki tozalash bosqichiga ega ekanligini ko'rsatdi (3-rasm).Qo'llanilgan titrlarga va kalamushlarning qon hajmiga asoslanib, biz og'irlikning atigi 1% ekanligini hisobladik.vena ichiga yuborilgandan 10 minut o'tgach qonda yuborilgan dozadan fag aniqlangan.Ushbu dastlabki tez pasayishdan so'ng, sekinroq birlamchi klirens 27,7 daqiqalik yarimparchalanish davri bilan o'lchandi.Muhimi, CSF bo'linmasidan juda oz sonli faglar olindi, bu yovvoyi tipdagi faglarning CSF bo'limiga ko'chishi uchun past fonni ko'rsatadi (qo'shimcha 3-rasm).O'rtacha, butun namuna olish davrida (0-250 minut) miya omurilik suyuqligida qonda atigi 1 x 10-3% T7 fag titri va dastlab kiritilgan faglarning 4 x 10-8% aniqlangan.Shunisi e'tiborga loyiqki, miya omurilik suyuqligidagi yovvoyi tipdagi fagning yarimparchalanish davri (25,7 minut) qonda kuzatilganiga o'xshash edi.Ushbu ma'lumotlar shuni ko'rsatadiki, CSF bo'linmasini qondan ajratib turuvchi to'siq CM-kanullangan kalamushlarda buzilmagan bo'lib, qondan CSF bo'limiga osonlik bilan o'tkaziladigan klonlarni aniqlash uchun fag kutubxonalarini in vivo tanlash imkonini beradi.
(a) Katta hovuzdan miya omurilik suyuqligidan (BOS) qayta namuna olish usulini o'rnatish.(b) markaziy asab tizimi (CNS) to'sig'ining hujayra joylashuvi va qon-miya to'sig'i (BBB) ​​va qon-miya to'sig'ini kesib o'tuvchi peptidlarni aniqlash uchun ishlatiladigan tanlash strategiyasi ko'rsatilgan diagramma.(c) In vivo fag displey skrining sxemasi.Tanlovning har bir bosqichida faglar (o'qlar ichidagi hayvonlarning identifikatorlari) tomir ichiga yuborildi.Ikki mustaqil muqobil filiallar (A, B) tanlovning 4-bosqichiga qadar alohida saqlanadi.Tanlovning 3 va 4-raundlari uchun CSF dan olingan har bir fag kloni qo'lda ketma-ketlashtirildi.(d) T7 peptid kutubxonasini (2 x 1012 fag / hayvon) tomir ichiga yuborishdan so'ng ikkita kanullangan kalamushda tanlovning birinchi bosqichida qon (qizil doiralar) va miya omurilik suyuqligidan (yashil uchburchaklar) ajratilgan fag kinetikasi.Moviy kvadratchalar qondagi fagning o'rtacha boshlang'ich kontsentratsiyasini ko'rsatadi, bu qonning umumiy hajmini hisobga olgan holda AOK qilingan fag miqdoridan hisoblanadi.Qora kvadratchalar qon faglari kontsentratsiyasidan ekstrapolyatsiya qilingan y chizig'ining kesishish nuqtasini ko'rsatadi.(e,f) Peptidda topilgan barcha mumkin bo'lgan bir-biriga o'xshash tripeptid motivlarining nisbiy chastotasi va tarqalishini taqdim eting.1000 ta o'qishda topilgan motivlar soni ko'rsatilgan.Sezilarli darajada (p <0,001) boyitilgan motiflar qizil nuqta bilan belgilangan.(e) AOK qilingan kutubxonaning tripeptid motivining nisbiy chastotasini №1.1 va №1.2 hayvonlardan olingan qon faglari bilan taqqoslaydigan korrelyatsiya scatterplot.(f) Qon va miya omurilik suyuqligida ajratilgan №1.1 va №1.2 hayvonlar faglari tripeptidi motiflarining nisbiy chastotalarini solishtiruvchi korrelyatsiya scatterplot.(g, h) Har ikki hayvonda in vivo tanlovdan so'ng qon bilan boyitilgan fag (g) va in'ektsiya qilingan kutubxonalar va CSF bilan boyitilgan fag (h) qonga nisbatan ketma-ketlik identifikatori.Bir harfli kodning o'lchami aminokislotalarning o'sha holatda qanchalik tez-tez paydo bo'lishini ko'rsatadi.Yashil = qutb, binafsha = neytral, ko'k = asosiy, qizil = kislotali va qora = hidrofobik aminokislotalar.Shakl 1a, b Eduard Urich tomonidan ishlab chiqilgan va ishlab chiqarilgan.
Biz fag peptid kutubxonasini ikkita CM asbob kalamushiga (A va B sinflari) va miya omurilik suyuqligi va qondan ajratilgan fagga AOK qildik (1d-rasm).Kutubxonaning dastlabki tez tozalanishi yovvoyi turdagi fag bilan solishtirganda kamroq aniq edi.Ikkala hayvonda ham AOK qilingan kutubxonaning o'rtacha yarimparchalanish davri qonda 24,8 minut, yovvoyi tipdagi fagga o'xshash va CSFda 38,5 minutni tashkil etdi.Har bir hayvondan olingan qon va miya omurilik suyuqligi fag namunalari HTSga o'tkazildi va barcha aniqlangan peptidlar qisqa tripeptid motivi mavjudligi uchun tahlil qilindi.Tripeptid motivlari tanlangan, chunki ular strukturaning shakllanishi va peptid-oqsil o'zaro ta'siri uchun minimal asos yaratadi14,15.Biz in'ektsiya qilingan fag kutubxonasi va ikkala hayvonning qonidan olingan klonlar o'rtasida motiflarning taqsimlanishida yaxshi korrelyatsiyani topdik (1e-rasm).Ma'lumotlar shuni ko'rsatadiki, kutubxona tarkibi faqat qon bo'limida ozgina boyitilgan.Aminokislotalar chastotalari va konsensus ketma-ketligi Weblogo16 dasturining moslashuvi yordamida har bir pozitsiyada qo'shimcha tahlil qilindi.Qizig'i shundaki, biz qondagi glitsin qoldiqlarida kuchli boyitishni topdik (1g-rasm).Qonni CSF dan tanlangan klonlar bilan taqqoslaganda, kuchli tanlov va motivlarning ba'zi tanlovi kuzatildi (1f-rasm) va ma'lum aminokislotalar 12-a'zoda oldindan belgilangan pozitsiyalarda afzallik bilan mavjud edi (1h-rasm).Shunisi e'tiborga loyiqki, individual hayvonlar miya omurilik suyuqligida sezilarli darajada farq qilgan, holbuki ikkala hayvonda qon glitsin bilan boyitish kuzatilgan (Qo'shimcha 4a-j-rasm).№1.1 va №1.2 hayvonlarning miya omurilik suyuqligidagi ketma-ketlik ma'lumotlarini qat'iy filtrlashdan so'ng jami 964 va 420 ta noyob 12-mer peptidlari olindi (Qo'shimcha rasm. 1d-e).Izolyatsiya qilingan fag klonlari kuchaytirildi va in vivo tanlovning ikkinchi bosqichidan o'tkazildi.Tanlovning ikkinchi bosqichidan olingan faglar har bir hayvonda HTSga duchor qilindi va barcha aniqlangan peptidlar tripeptid motivlarining paydo bo'lishini tahlil qilish uchun motifni aniqlash dasturiga kirish sifatida foydalanildi (2a, b, ef-rasm).CSFdan olingan fagning birinchi tsikli bilan solishtirganda, biz A va B shoxlarida CSFdagi ko'plab motivlarning keyingi tanlanishi va tanlanmaganligini kuzatdik (2-rasm).Tarmoqni identifikatsiya qilish algoritmi ular izchil ketma-ketlikning turli naqshlarini ifodalashini aniqlash uchun qo'llanildi.CSF tomonidan qayta tiklangan 12 o'lchovli ketma-ketliklar A muqobil sinfida (2c-rasm, d) va B sinfida (2g, h-rasm) aniq o'xshashlik kuzatildi.Har bir filialda birlashtirilgan tahlil 12-mer peptidlar uchun turli xil tanlov profillarini aniqladi (Qo'shimcha rasm. 5c, d) va tanlovning ikkinchi bosqichidan so'ng birlashtirilgan klonlar uchun vaqt o'tishi bilan CSF/qon titri nisbati tanlovning birinchi bosqichiga nisbatan oshgan (Qo'shimcha rasm 5e).).
Miya omurilik suyuqligidagi motivlar va peptidlarni in vivo funktsional fag ko'rsatish tanlovining ikkita ketma-ket bosqichi bilan boyitish.
Har bir hayvonning birinchi raundidan olingan barcha miya omurilik suyuqligi faglari (hayvonlar №1.1 va №1.2) birlashtirildi, kuchaytirildi, HT-ketma-ketlashtirildi va birgalikda qayta yuborildi (2 x 1010 fag / hayvon) 2 SM kanullangan kalamush (№ 1.1 → #).2.1 va 2.2, 1.2 → 2.3 va 2.4).(a, b, e, f) Birinchi va ikkinchi tanlov bosqichlarida barcha CSFdan olingan faglarning tripeptid motivlarining nisbiy chastotasini taqqoslaydigan korrelyatsiya scatterplots.Ikkala yo'nalishdagi peptidlarda joylashgan barcha mumkin bo'lgan bir-biriga o'xshash tripeptidlarni ifodalovchi motivlarning nisbiy chastotasi va taqsimoti.1000 ta o'qishda topilgan motivlar soni ko'rsatilgan.Taqqoslangan kutubxonalardan birida sezilarli darajada (p <0,001) tanlangan yoki chiqarib tashlangan motivlar qizil nuqta bilan ta'kidlangan.(c, d, g, h) In vivo tanlovning 2 va 1-raundlariga asoslangan barcha CSFga boy 12 aminokislota uzunlikdagi ketma-ketlik logotipi.Bir harfli kodning o'lchami aminokislotalarning o'sha holatda qanchalik tez-tez paydo bo'lishini ko'rsatadi.Logotipni ko'rsatish uchun ikkita tanlov bosqichi o'rtasida alohida hayvonlardan olingan CSF ketma-ketliklarining chastotasi taqqoslanadi va ikkinchi turda boyitilgan ketma-ketliklar ko'rsatiladi: (c) #1.1–#2.1 (d) #1.1–#2.2 (g) #1.2–#2.3 va (h) #1.2–#2.4.(c, d) hayvonlarda ma'lum bir pozitsiyada eng ko'p boyitilgan aminokislotalar №.2.1 va yo'q.2.2 yoki (g, h) hayvonlarda №.2.3 va yo'q.2.4 rangda ko'rsatilgan.Yashil = qutb, binafsha = neytral, ko'k = asosiy, qizil = kislotali va qora = hidrofobik aminokislotalar.
Tanlovning uchinchi bosqichidan so'ng biz ikkita hayvondan ajratilgan 332 ta CSF bilan qayta tiklangan fag klonlaridan 124 ta noyob peptid ketma-ketligini (№ 3.1 va № 3.2) aniqladik (Qo'shimcha rasm 6a).LGSVS (18,7%) ketma-ketligi eng yuqori nisbiy nisbatga ega bo'ldi, undan keyin PAGISRELVDKL (8,2%), MRWFFSHASQGR (3%), DVAKVS (3%), TWLFSLG (2,2%) va SARGSWREIVSLS (2,2%) yovvoyi turdagi qo'shimchalar.Yakuniy to'rtinchi turda biz uchta alohida hayvondan ikkita mustaqil tanlangan filialni birlashtirdik (1c-rasm).CSFdan olingan 925 ta ketma-ket fag klonlaridan to'rtinchi raundda biz 64 ta noyob peptid ketma-ketligini topdik (Qo'shimcha rasm. 6b), ular orasida yovvoyi tipdagi fagning nisbiy ulushi 0,8% gacha kamaydi.To‘rtinchi raundda eng keng tarqalgan CSF klonlari LYVLHSRGLWGFKLAAALE (18%), LGSVS (17%), GFVRFRLSNTR (14%), KVAWRVFSLFWK (7%), SVHGV (5%), GRPQKINGARVC (3,6%) va RLSSVD3,%CSG (%) edi.%)).Tanlangan peptidlarning uzunlik diapazoni NNK kutubxonasi dizayni uchun degeneratsiyalangan kodonlardan foydalanganda kutubxona primerlarida nukleotidlarni kiritish/oʻchirish yoki muddatidan oldin toʻxtash kodonlari bilan bogʻliq.Erta to'xtash kodonlari qisqaroq peptidlarni hosil qiladi va ular qulay aa motivini o'z ichiga olganligi sababli tanlanadi.Uzunroq peptidlar sintetik kutubxonalarning primerlariga qo'shish/o'chirish natijasida paydo bo'lishi mumkin.Bu mo'ljallangan to'xtash kodonini ramkadan tashqariga joylashtiradi va quyi oqimda yangi to'xtash kodon paydo bo'lguncha uni o'qiydi.Umuman olganda, biz kirish ma'lumotlarini namunaviy chiqish ma'lumotlari bilan taqqoslash orqali barcha to'rtta tanlov bosqichi uchun boyitish omillarini hisobladik.Skrining birinchi bosqichida biz o'ziga xos bo'lmagan fon ma'lumotnomasi sifatida yovvoyi tipdagi fag titrlaridan foydalandik.Qizig'i shundaki, salbiy fag tanlovi birinchi CSF siklida juda kuchli edi, lekin qonda emas (3a-rasm), bu peptidlar kutubxonasining aksariyat a'zolarining CSF bo'linmasiga passiv diffuziya ehtimoli pastligi yoki nisbiy faglarning bakterioplarga qaraganda samaraliroq saqlanishi yoki qon oqimidan olib tashlanishiga bog'liq bo'lishi mumkin.Biroq, panning ikkinchi bosqichida ikkala kladada CSFda faglarning kuchli tanlovi kuzatildi, bu avvalgi turda CSFni qabul qilishni rag'batlantiradigan peptidlarni ko'rsatadigan faglar bilan boyitilganligini ko'rsatadi (3a-rasm).Shunga qaramay, qonni sezilarli darajada boyitmasdan.Shuningdek, uchinchi va to'rtinchi turlarda fag klonlari CSFda sezilarli darajada boyitilgan.Har bir noyob peptid ketma-ketligining nisbiy chastotasini tanlovning oxirgi ikki bosqichi o'rtasida taqqoslab, biz tanlovning to'rtinchi bosqichida ketma-ketliklar yanada boyitilganligini aniqladik (3b-rasm).Ikkala peptid yo'nalishidan foydalangan holda barcha 64 noyob peptid ketma-ketligidan jami 931 ta tripeptid motivlari olingan.To'rtinchi turda eng boyitilgan motivlar AOK qilingan kutubxonaga (kesish: 10% boyitish) nisbatan barcha turlar bo'ylab boyitish profillari bo'yicha batafsilroq tekshirildi (Qo'shimcha rasm. 6c).Tanlovning umumiy qonuniyatlari shuni ko'rsatdiki, o'rganilgan motivlarning aksariyati ikkala tanlov tarmog'ining oldingi barcha bosqichlarida boyitilgan.Biroq, ba'zi motivlar (masalan, SGL, VSG, LGS GSV) asosan muqobil A sinfidan olingan bo'lsa, boshqalari (masalan, FGW, RTN, WGF, NTR) muqobil B sinfida boyitilgan.
CSF bilan boyitilgan fag ko'rsatilgan peptidlar va streptavidin yuklari bilan konjugatsiyalangan biotinillangan etakchi peptidlarning CSF transportini tekshirish.
(a) AOK qilingan (kirish = I) fag (PFU) titrlari va aniqlangan CSF fag titrlari (chiqish = O) asosida barcha to'rt turda (R1-R4) hisoblangan boyitish nisbatlari.Oxirgi uch raund uchun boyitish omillari (R2-R4) oldingi tur va birinchi davra (R1) bilan solishtirganda vazn ma'lumotlari bilan hisoblab chiqilgan.Ochiq barlar miya omurilik suyuqligi, soyali chiziqlar plazmadir.(***p<0,001, Studentning t-testi asosida).(b) Tanlovning 4-raundidan keyin CSFda to'plangan barcha faglarga nisbatan nisbati bo'yicha tartiblangan eng ko'p fag peptidlari ro'yxati.Oltita eng keng tarqalgan fag klonlari rang bilan ajratilgan, raqamlangan va tanlovning 3 va 4-bosqichlari (insets) oralig'ida ularning boyitish omillari.(c, d) 4-raunddagi oltita eng boyitilgan fag klonlari, bo'sh fag va ota-ona fag peptid kutubxonalari CSF namunasi modelida alohida tahlil qilindi.BOS va qon namunalari ko'rsatilgan vaqt nuqtalarida to'plangan.(c) Teng miqdorda 6 ta nomzod fag klonlari (2 x 1010 fag/hayvon), bo'sh faglar (№ 1779) (2 x 1010 fag/hayvon) va stok fag peptid kutubxonasi (2 x 1012 fag/hayvon) Hayvonga kamida 3-3 dona dumli tomir ichiga yuboriladi.Vaqt o'tishi bilan AOK qilingan har bir fag kloni va fag peptid kutubxonasining CSF farmakokinetikasi ko'rsatilgan.(d) namuna olish vaqtida barcha tiklangan faglar/ml uchun o'rtacha CSF/qon nisbatini ko'rsatadi.(e) To'rtta sintetik etakchi peptid va bitta shifrlangan nazorat biotin bilan N-terminali (tetramer displey) orqali streptavidin bilan bog'langan, so'ngra in'ektsiya (quyruq venasi iv, 10 mg streptavidin/kg).Kamida uchta intubatsiya qilingan kalamush (N = 3).).CSF namunalari ko'rsatilgan vaqt nuqtalarida to'plangan va streptavidin kontsentratsiyasi CSF anti-streptavidin Elishay tomonidan o'lchangan (nd = aniqlanmagan).(*p<0,05, **p<0,01, ***p<0,001, ANOVA testi asosida).(f) 2002-sonli eng boyitilgan fag peptid klonining (binafsha rang) aminokislotalar ketma-ketligini tanlashning 4-raundidan boshqa tanlangan fag peptid klonlari bilan taqqoslash.Bir xil va o'xshash aminokislotalar bo'laklari rangli kodlangan.
To'rtinchi turda barcha boyitilgan faglardan (3b-rasm), CSF namuna olish modelida keyingi individual tahlil qilish uchun oltita nomzod klon tanlangan.Teng miqdorda oltita nomzod faj, bo'sh fag (qo'shimchasi yo'q) va profag peptid kutubxonalari uchta kanulyatsiyalangan CM hayvonlariga AOK qilindi va farmakokinetikasi CSF (3c-rasm) va qon (qo'shimcha 7-rasm) tahlillarida aniqlandi.Sinovdan o'tkazilgan barcha fag klonlari CSF bo'linmasini bo'sh nazorat fagidan (№ 1779) 10-1000 baravar yuqori darajada nishonga oldi.Masalan, №2020 va №2077 klonlar nazorat fagiga qaraganda taxminan 1000 baravar yuqori CSF titrlariga ega edi.Har bir tanlangan peptidning farmakokinetik profili har xil, ammo ularning barchasi yuqori CSF homing qobiliyatiga ega.№ 1903 va № 2011 klonlar uchun vaqt o'tishi bilan doimiy pasayish kuzatildi, № 2077, № 2002 va № 2009 klonlar uchun esa birinchi 10 daqiqa davomida o'sish faol transportni ko'rsatishi mumkin, ammo tekshirilishi kerak.№2020, №2002 va №2077 klonlar yuqori darajada barqarorlashdi, 2009-sonli klonning CSF konsentratsiyasi esa dastlabki o'sishdan keyin asta-sekin pasaydi.Keyin har bir CSF nomzodining nisbiy chastotasini uning qon kontsentratsiyasi bilan solishtirdik (3d-rasm).Har bir CSF nomzodining o'rtacha titrining uning qon titri bilan barcha namuna olish vaqtidagi o'zaro bog'liqligi olti nomzoddan uchtasi qon CSF bilan sezilarli darajada boyitilganligini ko'rsatdi.Qizig'i shundaki, №2077 klon yuqori qon barqarorligini ko'rsatdi (qo'shimcha 7-rasm).Peptidlarning o'zlari fag zarralaridan tashqari yuklarni faol ravishda CSF bo'limiga tashishga qodirligini tasdiqlash uchun biz peptidlar fag zarrachasiga biriktirilgan N-terminusda biotin bilan hosil qilingan to'rtta etakchi peptidni sintez qildik.Biotinlangan peptidlar (2002, 2009, 2020 va 2077) streptavidin (SA) bilan birlashtirilib, fag geometriyasini biroz taqlid qiluvchi multimerik shakllarni olishdi.Ushbu format, shuningdek, yuk tashuvchi protein peptidlari sifatida qon va miya omurilik suyuqligidagi SA ta'sirini o'lchash imkonini berdi.Muhimi, sintetik peptidlar ushbu SA-konjugatsiyalangan formatda qo'llanilganda fag ma'lumotlari ko'pincha takrorlanishi mumkin edi (3e-rasm).Shifrlangan peptidlar kamroq boshlang'ich ta'sirga ega va 48 soat ichida aniqlanmaydigan darajada tezroq CSF klirensiga ega edi.Ushbu peptid fag klonlarining CSF bo'shlig'iga etkazib berish yo'llari haqida tushunchaga ega bo'lish uchun biz in vivo jonli ravishda tomir ichiga yuborilganidan 1 soat o'tgach fag zarralarini to'g'ridan-to'g'ri aniqlash uchun immunohistokimyo (IHC) yordamida individual fag peptidlari xitlarining lokalizatsiyasini tahlil qildik.Ta'kidlash joizki, № 2002, № 2077 va № 2009 klonlarni miya kapillyarlarida kuchli bo'yash orqali aniqlash mumkin edi, nazorat fag (# 1779) va № 2020 klon esa aniqlanmadi (8-rasm).Bu shuni ko'rsatadiki, bu peptidlar BBB ni kesib o'tish orqali miyaga ta'sir qilishiga hissa qo'shadi.Ushbu gipotezani sinab ko'rish uchun qo'shimcha batafsil tahlil talab qilinadi, chunki BSCFB marshruti ham ishtirok etishi mumkin.Eng ko'p boyitilgan klonning (№ 2002) aminokislotalar ketma-ketligini boshqa tanlangan peptidlar bilan solishtirganda, ularning ba'zilari o'xshash aminokislota kengaytmalariga ega ekanligi qayd etildi, bu xuddi shunday transport mexanizmini ko'rsatishi mumkin (3f-rasm).
Noyob plazma profili va vaqt o'tishi bilan CSFning sezilarli o'sishi tufayli №2077 fag displey kloni 48 soatlik uzoqroq vaqt davomida o'rganildi va barqaror SA darajalari bilan bog'liq holda kuzatilgan CSFning tez o'sishini takrorlay oldi (4a-rasm).Boshqa aniqlangan fag klonlariga kelsak, №2077 miya kapillyarlari uchun kuchli bo'yalgan va yuqori aniqlikda ko'rilganda kapillyar marker lektin bilan sezilarli kolokalizatsiyani va parenximal bo'shliqda biroz bo'yashni ko'rsatdi (4b-rasm).CNSda peptid vositachiligidagi farmakologik ta'sirlarni olish mumkinligini tekshirish uchun biz tajriba o'tkazdik, unda i) №2077 tranzit peptid va ii) BACE1 inhibitori peptidining biotinlangan versiyalari ikki xil nisbatda SA bilan aralashtirilgan.Bitta kombinatsiya uchun biz faqat BACE1 peptid inhibitoridan foydalandik, ikkinchisi uchun biz BACE1 peptid inhibitori №2077 peptidga 1:3 nisbatda ishlatdik.Ikkala namuna ham vena ichiga yuborildi va vaqt o'tishi bilan beta-amiloid peptid 40 (Abeta40) qon va miya omurilik suyuqligi darajasi o'lchandi.Abeta40 CSFda o'lchandi, chunki u miya parenximasida BACE1 inhibisyonunu aks ettiradi.Kutilganidek, ikkala kompleks ham Abeta40 ning qon darajasini sezilarli darajada kamaytirdi (4c, d-rasm).Biroq, faqat peptid no aralashmasini o'z ichiga olgan namunalar.2077 va SA ga konjugatsiyalangan BACE1 peptidining inhibitori miya omurilik suyuqligida Abeta40 ning sezilarli pasayishiga olib keldi (4c-rasm).Ma'lumotlar shuni ko'rsatadiki, peptid raqami.2077 60 kDa SA oqsilini markaziy asab tizimiga tashishga qodir va shuningdek, BACE1 peptidining SA-konjugatsiyalangan inhibitörleri bilan farmakologik ta'sir ko'rsatadi.
(a) T7 fagining klonal in'ektsiyasi (2 × 10 fag / hayvon) CSF peptid № 2077 (RLSSVDSDLSGC) va in'ektsiya qilinmagan nazorat fagining (# 1779) uzoq muddatli farmakokinetik profilini ko'rsatadigan kamida uchta CM intubatsiya qilingan kalamushlarda.(b) № 2077 peptid va tomirlarning (lektin) qarshi bo'yashini ko'rsatadigan fagli kalamushlarda (2 × 10 10 fag / hayvon) vakili kortikal mikrotomirlarning konfokal mikroskopik tasviri.Ushbu fag klonlari 3 ta kalamushga yuborildi va perfuziyadan oldin 1 soat davomida aylanishiga ruxsat berildi.Miyalar bo'lingan va T7 fag kapsidiga qarshi poliklonal FITC etiketli antikorlar bilan bo'yalgan.Perfuziya va keyingi fiksatsiyadan o'n daqiqa oldin, DyLight594 etiketli lektin tomir ichiga yuborildi.Kapillyarlar va perivaskulyar miya to'qimalarining lümeninde mikrotomirlar va faglarning (yashil) luminal tomonining lektin bo'yalganini (qizil) ko'rsatadigan lyuminestsent tasvirlar.O'lchov paneli 10 mikronga to'g'ri keladi.(c, d) Biotinillangan BACE1 inhibitör peptidining yakka o'zi yoki biotinlangan tranzit peptid №2077 bilan birgalikda streptavidin bilan birlashtirildi, so'ngra kamida uchta kanullangan CM kalamush (10 mg streptavidin/kg) vena ichiga yuborildi.BACE1 peptid inhibitori vositachiligida AB40dagi pasayish ko'rsatilgan vaqt nuqtalarida qonda (qizil) va miya omurilik suyuqligida (to'q sariq) Ab1-40 Elishay tomonidan o'lchandi.Aniqroq bo'lishi uchun grafikda 100% masshtabda nuqta chiziq chiziladi.(c) 3:1 nisbatda tranzit peptid №2077 va BACE1 inhibitör peptidiga konjugatsiyalangan streptavidin bilan davolash qilingan kalamushlarda qondagi (qizil uchburchaklar) va miya omurilik suyuqligidagi (to'q sariq uchburchaklar) Aβ40 miqdorining foiz kamayishi.(d) Faqat BACE1 inhibitör peptidiga qo'shilgan streptavidin bilan davolash qilingan kalamushlarda qon Aβ40 (qizil doiralar) va miya omurilik suyuqligi (to'q sariq doiralar) ning foiz kamayishi.Nazoratdagi Ab kontsentratsiyasi 420 pg / ml ni tashkil etdi (standart og'ish = 101 pg / ml).
Fage displey biotibbiyot tadqiqotlarining bir qancha sohalarida muvaffaqiyatli qo'llanilgan17.Bu usul in vivo tomirlar xilma-xilligini o'rganish18,19, shuningdek, miya tomirlariga qaratilgan tadqiqotlar20,21,22,23,24,25,26 uchun ishlatilgan.Ushbu tadqiqotda biz ushbu tanlov usulini qo'llashni nafaqat miya tomirlariga qaratilgan peptidlarni to'g'ridan-to'g'ri aniqlash, balki qon-miya to'sig'ini kesib o'tish uchun faol transport xususiyatlariga ega nomzodlarni topish uchun ham kengaytirdik.Endi biz CM intubatsiya qilingan kalamushlarda in vivo tanlash protsedurasining rivojlanishini tasvirlaymiz va uning CSF homing xususiyatlariga ega peptidlarni aniqlash potentsialini namoyish qilamiz.12-mer tasodifiy peptidlar kutubxonasini ko'rsatadigan T7 fagidan foydalanib, biz T7 fagining qon-miya to'sig'iga moslashish uchun etarlicha kichik (diametri taxminan 60 nm)10 ekanligini va shu bilan qon-miya to'sig'ini yoki xoroid pleksusni to'g'ridan-to'g'ri kesib o'tishini ko'rsata oldik.Biz kanullangan CM kalamushlaridan CSF yig'ish yaxshi nazorat qilinadigan in vivo funktsional skrining usuli ekanligini va ekstrakte qilingan fag nafaqat qon tomirlari bilan bog'langanligini, balki qon-miya to'sig'i orqali tashuvchi sifatida ham ishlaganligini kuzatdik.Bundan tashqari, bir vaqtning o'zida qon to'plash va CSF va qondan olingan faglarga HTSni qo'llash orqali biz CSFni tanlashimizga qonni boyitish yoki tanlov raundlari orasidagi kengayish uchun yaroqlilik ta'sir qilmaganligini tasdiqladik.Biroq, qon bo'limi tanlov jarayonining bir qismidir, chunki CSF bo'limiga etib borishga qodir bo'lgan faglar miyada o'zlarini boyitish uchun etarlicha uzoq vaqt yashashi va qon oqimida aylanishi kerak.Xom HTS ma'lumotlaridan ishonchli ketma-ketlik ma'lumotlarini olish uchun biz tahlil ish jarayonidagi platformaga xos ketma-ketlik xatolariga moslashtirilgan filtrlarni joriy qildik.Skrining usuliga kinetik parametrlarni kiritish orqali biz yovvoyi tipdagi T7 faglarining tezkor farmakokinetikasini (t½ ~ 28 min) qonda tasdiqladik24, 27, 28 va shuningdek, miya omurilik suyuqligida yarim yemirilish davrini (minutiga t½ ~ 26 min) aniqladik).Qon va CSFdagi o'xshash farmakokinetik profillarga qaramay, qonda fag konsentratsiyasining atigi 0,001% ni aniqlash mumkin edi, bu qon-miya to'sig'i bo'ylab yovvoyi tipdagi T7 fagning past fon harakatchanligini ko'rsatadi.Bu ish in vivo panning strategiyalarini qo'llashda birinchi tur tanlovining muhimligini ta'kidlaydi, ayniqsa, aylanishdan tezda tozalanadigan fag tizimlari uchun, chunki bir nechta klonlar CNS bo'limiga etib borishi mumkin.Shunday qilib, birinchi bosqichda kutubxona xilma-xilligining qisqarishi juda katta edi, chunki bu juda qattiq CSF modelida faqat cheklangan miqdordagi klonlar to'plangan.Ushbu in vivo panning strategiyasi CSF bo'linmasida faol to'planishi, qon bo'linmasida klonlarning omon qolishi va dastlabki 10 daqiqa ichida qondan T7 fag klonlarini tezda olib tashlash kabi bir nechta tanlash bosqichlarini o'z ichiga oladi (1d-rasm va qo'shimcha rasm. 4M).).Shunday qilib, birinchi turdan so'ng, CSFda turli xil fag klonlari aniqlandi, garchi bir xil boshlang'ich hovuz alohida hayvonlar uchun ishlatilgan bo'lsa ham.Bu shuni ko'rsatadiki, ko'p sonli kutubxona a'zolariga ega bo'lgan manba kutubxonalari uchun bir nechta qat'iy tanlash bosqichlari xilma-xillikning sezilarli darajada qisqarishiga olib keladi.Shuning uchun tasodifiy hodisalar dastlabki tanlov jarayonining ajralmas qismiga aylanadi va natijaga katta ta'sir qiladi.Ehtimol, asl kutubxonadagi ko'plab klonlar CSFni boyitish moyilligiga juda o'xshash.Biroq, bir xil eksperimental sharoitlarda ham, tanlov natijalari boshlang'ich hovuzdagi har bir alohida klonning kichik soni tufayli farq qilishi mumkin.
CSFda boyitilgan motiflar qondagilardan farq qiladi.Qizig'i shundaki, biz alohida hayvonlarning qonida glitsinga boy peptidlar tomon birinchi siljishni qayd etdik.(1g-rasm, qo'shimcha 4e, 4f-rasm).Glitsin peptidlarini o'z ichiga olgan faglar barqarorroq bo'lishi mumkin va qon aylanishidan chiqarib yuborilishi ehtimoli kamroq.Biroq, bu glitsinga boy peptidlar miya omurilik suyuqligi namunalarida aniqlanmadi, bu kuratorlangan kutubxonalar ikki xil tanlov bosqichidan o'tganligini ko'rsatadi: biri qonda, ikkinchisi miya omurilik suyuqligida to'planishiga imkon berdi.Tanlovning to'rtinchi bosqichidan olingan CSF bilan boyitilgan klonlar keng qamrovli sinovdan o'tkazildi.Deyarli barcha individual sinovdan o'tgan klonlar bo'sh nazorat fagiga nisbatan CSFda boyitilganligi tasdiqlandi.Bir peptid zarbasi (№ 2077) batafsilroq ko'rib chiqildi.U boshqa xitlarga nisbatan uzoqroq plazma yarimparchalanish davrini ko'rsatdi (3d-rasm va qo'shimcha rasm 7) va qiziq tomoni shundaki, bu peptid C-terminalida sistein qoldig'ini o'z ichiga olgan.Yaqinda sisteinning peptidlarga qo'shilishi albumin 29 bilan bog'lanib, ularning farmakokinetik xususiyatlarini yaxshilashi mumkinligi ko'rsatildi.Bu hozircha №2077 peptid uchun noma'lum va qo'shimcha o'rganishni talab qiladi.Ba'zi peptidlar CSFni boyitishda valentlikka bog'liqligini ko'rsatdi (ma'lumotlar ko'rsatilmagan), bu T7 kapsidining ko'rsatilgan sirt geometriyasi bilan bog'liq bo'lishi mumkin.Biz foydalangan T7 tizimi har bir fag zarrachasiga har bir peptidning 5-15 nusxasini ko'rsatdi.IHC kalamushlarning miya yarim korteksiga tomir ichiga yuborilgan nomzod qo'rg'oshin fag klonlarida o'tkazildi (Qo'shimcha 8-rasm).Ma'lumotlar shuni ko'rsatdiki, kamida uchta klon (№ 2002, № 2009 va № 2077) BBB bilan o'zaro aloqada bo'lgan.Ushbu BBB o'zaro ta'siri CSF to'planishiga yoki bu klonlarning to'g'ridan-to'g'ri BCSFBga harakatlanishiga olib keladimi yoki yo'qligini aniqlash kerak.Muhimi, biz tanlangan peptidlar sintezlanganda va oqsil yuki bilan bog'langanda o'zlarining CSF tashish qobiliyatini saqlab qolishlarini ko'rsatamiz.N-terminal biotinillangan peptidlarning SA bilan bog'lanishi asosan qon va miya omurilik suyuqligidagi tegishli fag klonlari bilan olingan natijalarni takrorlaydi (3e-rasm).Nihoyat, biz №2077 qo'rg'oshin peptidining SA bilan konjugatsiyalangan BACE1 biotinillangan peptid inhibitori miya ta'sirini kuchaytirishga qodir ekanligini ko'rsatamiz, bu esa CSFdagi Abeta40 darajasini sezilarli darajada kamaytirish orqali CNSda aniq farmakodinamik ta'sirlarni keltirib chiqaradi (4-rasm).Biz barcha xitlarni peptidlar ketma-ketligi homologiyasi bo'yicha qidirish orqali ma'lumotlar bazasida biron bir gomologni aniqlay olmadik.Shuni ta'kidlash kerakki, T7 kutubxonasining o'lchami taxminan 109, 12-mers uchun nazariy kutubxona hajmi esa 4 x 1015. Shuning uchun biz 12-mer peptid kutubxonasi xilma-xilligining kichik bir qismini tanladik, bu qo'shni identifikatsiyalangan ketma-ketliklarni baholash orqali yanada optimallashtirilgan peptidlarni aniqlash mumkinligini anglatishi mumkin.Gipotetik nuqtai nazardan, biz ushbu peptidlarning tabiiy gomologlarini topa olmasligimizning sabablaridan biri, evolyutsiya jarayonida ba'zi peptid motivlarining miyaga nazoratsiz kirishiga yo'l qo'ymaslik uchun tanlovni bekor qilish bo'lishi mumkin.
Birgalikda bizning natijalarimiz in vivo jonli ravishda serebrovaskulyar to'siqning transport tizimlarini aniqlash va tavsiflash bo'yicha kelajakdagi ishlar uchun asos bo'lib xizmat qiladi.Ushbu usulning asosiy o'rnatilishi nafaqat miya tomirlarini bog'lash xususiyatiga ega bo'lgan klonlarni aniqlabgina qolmay, balki muvaffaqiyatli klonlar in vivo jonli ravishda CNS bo'limiga biologik to'siqlarni kesib o'tish uchun ichki faollikka ega bo'lgan muhim bosqichni o'z ichiga olgan funktsional tanlash strategiyasiga asoslanadi.bu peptidlarni tashish mexanizmini va ularning miya mintaqasiga xos mikrovaskulatura bilan bog'lanish afzalligini tushuntirishdan iborat.Bu BBB va retseptorlarni tashish uchun yangi yo'llarning ochilishiga olib kelishi mumkin.Biz aniqlangan peptidlar serebrovaskulyar retseptorlarga yoki BBB yoki BCSFB orqali tashiladigan aylanma ligandlarga bevosita bog'lanishini kutamiz.Ushbu ishda topilgan CSF transport faolligi bo'lgan peptid vektorlari qo'shimcha ravishda o'rganiladi.Hozirda biz ushbu peptidlarning BBB va/yoki BCSFB ni kesib o'tish qobiliyati uchun miya o'ziga xosligini tekshirmoqdamiz.Ushbu yangi peptidlar yangi retseptorlar yoki yo'llarni potentsial kashf qilish va biologik moddalar kabi makromolekulalarni miyaga etkazish uchun yangi yuqori samarali platformalarni ishlab chiqish uchun juda qimmatli vositalar bo'ladi.
Oldin tasvirlangan usulning modifikatsiyasidan foydalanib, katta sisternani (CM) kanulatsiya qiling.Anesteziya qilingan Wistar kalamushlari (200-350 g) stereotaksik apparatga o'rnatildi va bosh suyagini ochish uchun soqollangan va aseptik tarzda tayyorlangan bosh terisi ustida median kesma qilingan.Yuqori qanot zonasida ikkita teshik qazing va mahkamlash vintlarini teshiklarga mahkamlang.Zanglamaydigan po'latdan yasalgan kanülni CM ichiga stereotaktik yo'naltirish uchun lateral oksipital tepada qo'shimcha teshik ochildi.Kanül atrofida tish tsementini qo'llang va vintlar bilan mahkamlang.Fotosurat va tsement qotib qolgandan so'ng, terining yarasi 4/0 supramid tikuv bilan yopildi.Kanülni to'g'ri joylashtirish miya omurilik suyuqligining (CSF) o'z-o'zidan oqishi bilan tasdiqlanadi.Sichqonchani stereotaksik apparatdan olib tashlang, operatsiyadan keyingi tegishli parvarish va og'riqni davolashni oling va miya omurilik suyuqligida qon belgilari kuzatilgunga qadar kamida bir hafta davomida tiklanishiga imkon bering.Wistar kalamushlari (Crl:WI/Han) Charlz daryosidan (Fransiya) olingan.Barcha kalamushlar maxsus patogensiz sharoitlarda saqlangan.Hayvonlar ustida o‘tkazilgan barcha tajribalar Shveytsariyaning Bazel shahri veterinariya idorasi tomonidan tasdiqlangan va 2474-sonli Hayvon litsenziyasiga (Miya omurilik suyuqligi va kalamush miyasida terapevtik nomzodlar darajasini o‘lchash yo‘li bilan faol miya transportini baholash) muvofiq amalga oshirilgan.
Sichqonchani qo'lida CM kanülü bilan sekin hushyor tuting.Daturani kanüldan olib tashlang va 10 mkl o'z-o'zidan oqadigan miya omurilik suyuqligini to'plang.Kanulaning o'tkazuvchanligi oxir-oqibat buzilganligi sababli, ushbu tadqiqotga faqat qonning ifloslanishi yoki rangi o'zgarganligi isbotlanmagan shaffof miya omurilik suyuqligi namunalari kiritilgan.Bunga parallel ravishda, dumning uchidagi kichik kesmadan geparin (Sigma-Aldrich) bo'lgan naychalarga taxminan 10-20 mkl qon olindi.CSF va qon T7 fagni tomir ichiga yuborishdan keyin turli vaqt nuqtalarida to'plangan.Har bir CSF namunasini olishdan oldin taxminan 5-10 mkl suyuqlik tashlandi, bu kateterning o'lik hajmiga to'g'ri keladi.
Kutubxonalar T7Select tizim qo'llanmasida ta'riflanganidek T7Select 10-3b vektori yordamida yaratilgan (Novagen, Rosenberg va boshq., InNovations 6, 1-6, 1996).Qisqacha aytganda, tasodifiy 12-mer DNK qo'shimchasi quyidagi formatda sintez qilindi:
NNK kodoni qo'shilishda ikki marta to'xtash kodonlari va aminokislotalarning haddan tashqari ko'payishini oldini olish uchun ishlatilgan.N - har bir nukleotidning qo'lda aralashtirilgan ekvimolyar nisbati va K - adenin va sitozin nukleotidlarining qo'lda aralashtirilgan ekvimolyar nisbati.Bir qatorli hududlar Klenow buferida (New England Biolabs) 37°C da 3 soat davomida dNTP (Novagen) va Klenow fermenti (New England Biolabs) bilan qo'shimcha inkubatsiya qilish orqali ikki zanjirli DNKga aylantirildi.Reaksiyadan so'ng, ikki zanjirli DNK EtOH cho'kmasi bilan tiklandi.Olingan DNK EcoRI va HindIII (ikkalasi ham Rochedan) cheklovchi fermentlar bilan hazm qilingan.Yirtilgan va tozalangan (QIAquick, Qiagen) qo'shimchasi (T4 ligaza, Nyu-England Biolabs) 10B kapsid genining 348-aminokislotasidan so'ng oldindan ajratilgan T7 vektoriga ramka ichida bog'langan.Ligatsiya reaktsiyalari in vitro qadoqlashdan oldin 18 soat davomida 16 ° C da inkubatsiya qilindi.In vitroda fajlarni qadoqlash T7Select 10-3b klonlash to'plami (Novagen) bilan ta'minlangan ko'rsatmalarga muvofiq amalga oshirildi va qadoqlash eritmasi Escherichia coli (BLT5615, Novagen) yordamida lizis uchun bir marta kuchaytirildi.Lizatlar santrifüj qilingan, titrlangan va -80 ° C da glitserinning bir zaxira eritmasi sifatida muzlatilgan.
Xususiy 454/Roche-amplikon termoyadroviy primerlari yordamida bulyon yoki plastinkada kuchaytirilgan fag o'zgaruvchan hududlarini to'g'ridan-to'g'ri PCR bilan kuchaytirish.Oldinga termoyadroviy astar o'zgaruvchan mintaqani (NNK) 12 (shablonga xos), GS FLX Titanium Adapter A va to'rtta asosli kutubxona kalitlari ketma-ketligini (TCAG) o'z ichiga oladi (qo'shimcha rasm 1a):
Teskari termoyadroviy astar shuningdek, boncuklar uchun biriktirilgan biotinni va emulsiya PCR paytida klonal kuchaytirish uchun zarur bo'lgan GS FLX Titanium Adapter B ni o'z ichiga oladi:
Keyin amplikonlar 454 GS-FLX Titanium protokoliga muvofiq 454/Roche pyrosequencingga duchor qilindi.Qo'lda Sanger sekvensiyasi uchun (Applied Biosystems Hitachi 3730 xl DNK Analyzer) T7 fag DNKsi PCR orqali kuchaytirildi va quyidagi primer juftlari bilan ketma-ketlashtirildi:
Alohida plaketlardan olingan qo'shimchalar Roche Fast Start DNK polimeraza to'plamidan foydalangan holda PCR kuchaytirilishiga duchor bo'ldi (ishlab chiqaruvchining ko'rsatmalariga muvofiq).Issiq startni (95 °C da 10 minut) va 35 ta kuchaytirish tsiklini (95 °C da 50 s, 50 °C da 1 daqiqa va 72 °C da 1 minut) bajaring.
Kutubxonalardagi fag, yovvoyi tipdagi fag, CSF va qondan qutqarilgan fag yoki alohida klonlar Escherichia coli BL5615 da TB bulonida (Sigma Aldrich) yoki 500 sm2 idishlarda (Thermo Scientific) 37 ° C da 4 soat davomida kuchaytirildi.Plitalardan fajlar Tris-EDTA buferi (Fluka Analytical) bilan chayish yoki steril pipetka uchlari bilan plastinkalarni yig'ish yo'li bilan ajratilgan.Faglar polietilen glikol (PEG 8000) cho'kmasi (Promega)ning bir turi bilan madaniyat supernatantidan yoki ekstraktsiya tamponidan ajratildi va Tris-EDTA buferida qayta suspenziya qilindi.
Kuchaytirilgan fag vena ichiga (IV) yuborishdan oldin (500 mkl/hayvonga) endotoksinni olib tashlash boncuklari (Miltenyi Biotec) yordamida endotoksinni olib tashlashning 2-3 bosqichidan o'tkazildi.Birinchi turda 2 × 1012 faglar kiritildi;ikkinchisida 2×1010 faglar;uchinchi va to‘rtinchi saralash bosqichlarida har bir hayvonga 2×109 fag.Ko'rsatilgan vaqt nuqtalarida to'plangan CSF va qon namunalaridagi fag tarkibi ishlab chiqaruvchining ko'rsatmalariga (T7Select tizim qo'llanmasi) muvofiq blyashka hisoblash orqali aniqlandi.Fag tanlash tozalangan kutubxonalarni quyruq venasiga tomir ichiga yuborish yoki oldingi tanlov bosqichida CSF dan olingan fagni qayta yuborish yo'li bilan amalga oshirildi va keyingi yig'imlar mos ravishda 10 min, 30 min, 60 min, 90 min, 120 min, 180 daqiqa va qon namunalarida amalga oshirildi.In vivo panning jami to'rtta bosqichi o'tkazildi, unda ikkita tanlangan filial alohida saqlangan va tanlovning dastlabki uchta bosqichida tahlil qilingan.Tanlovning dastlabki ikki bosqichida CSF dan olingan barcha faj qo'shimchalari 454/Roche pyrosequencingdan o'tkazildi, shu bilan birga tanlovning so'nggi ikki bosqichida CSF dan olingan barcha klonlar qo'lda ketma-ketlikda bo'ldi.Tanlovning birinchi bosqichidagi barcha qon faglari ham 454/Roche pirosekvensiyasidan o'tkazildi.Fag klonlarini in'ektsiya qilish uchun tanlangan faglar E. coli (BL5615) da 500 sm2 plitalarda 37 ° C da 4 soat davomida kuchaytirildi.Individual tanlangan va qo'lda ketma-ketlashtirilgan klonlar sil kasalligi muhitida ko'paytirildi.Fag ekstraktsiyasi, tozalash va endotoksinni olib tashlashdan so'ng (yuqorida ta'riflanganidek), 300 mkl dagi 2 × 1010 fag / hayvon bitta quyruq venasiga tomir ichiga yuborildi.
Ketma-ket ma'lumotlarni oldindan qayta ishlash va sifatli filtrlash.Raw 454/Roche maʼlumotlari sotuvchi dasturiy taʼminotidan foydalangan holda ikkilik standart oqim xaritasi formatidan (sff) Pearson tomonidan oʻqilishi mumkin boʻlgan formatga (fasta) aylantirildi.Nukleotidlar ketma-ketligini keyingi qayta ishlash, quyida tavsiflanganidek, xususiy C dasturlari va skriptlari (chiqarmagan dasturiy ta'minot to'plami) yordamida amalga oshirildi.Birlamchi ma'lumotlarni tahlil qilish qat'iy ko'p bosqichli filtrlash protseduralarini o'z ichiga oladi.Yaroqli 12mer insert DNK ketma-ketligini o'z ichiga olmagan o'qishlarni filtrlash uchun o'qishlar ketma-ketlik bilan boshlash yorlig'iga (GTGATGTCGGGGATCCGAATTCT), to'xtash yorlig'iga (TAAGCTTGCGGCCGCACTCGAGTA) va fon qo'shimchasiga (CCCTGCAGGGATATCCCGGGAGCTCGW) moslashtirildi. Global test.har bir tekislashda 2 tagacha nomuvofiqlikka imkon beruvchi hizalama31.Shuning uchun, boshlang'ich va to'xtash teglarisiz o'qishlar va fon qo'shimchalarini o'z ichiga olgan o'qishlar, ya'ni ruxsat etilgan nomuvofiqliklar sonidan oshib ketadigan hizalamalar kutubxonadan olib tashlandi.Qolgan o'qishlarga kelsak, boshlang'ich belgisidan cho'zilgan va to'xtash belgisigacha tugaydigan N-mer DNK ketma-ketligi asl o'qish ketma-ketligidan chiqarib tashlandi va keyinchalik qayta ishlandi (keyingi o'rinlarda "qo'shish" deb yuritiladi).Qo'shimchani tarjima qilgandan so'ng, primerning 5' uchidagi birinchi to'xtash kodonidan keyingi qism qo'shimchadan chiqariladi.Bundan tashqari, primerning 3' uchida to'liq bo'lmagan kodonlarga olib keladigan nukleotidlar ham olib tashlandi.Faqat fon ketma-ketligini o'z ichiga olgan qo'shimchalarni istisno qilish uchun "PAG" aminokislota namunasi bilan boshlangan tarjima qilingan qo'shimchalar ham olib tashlandi.Post-translyatsiya uzunligi 3 dan kam aminokislotalarga ega bo'lgan peptidlar kutubxonadan olib tashlandi.Nihoyat, qo'shish hovuzidagi ortiqchalikni olib tashlang va har bir noyob qo'shimchaning chastotasini aniqlang.Ushbu tahlil natijalari nukleotidlar ketma-ketligi (qo'shimchalar) va ularning (o'qilgan) chastotalari ro'yxatini o'z ichiga oladi (qo'shimcha 1c va 2-rasmlar).
N-mer DNK qoʻshimchalarini ketma-ketlik oʻxshashligi boʻyicha guruhlash: 454/Rochega xos ketma-ketlik xatolarini (masalan, gomopolimer kengaytmalarini ketma-ketlashtirish bilan bogʻliq muammolar) bartaraf etish va unchalik muhim boʻlmagan ortiqchalarni olib tashlash uchun avval filtrlangan N-mer DNK ketma-ketlik qoʻshimchalari (qoʻshimchalar) oʻxshashlik boʻyicha saralanadi.qo'shishlar (2 tagacha mos kelmaydigan bazaga ruxsat beriladi) iterativ algoritm yordamida quyidagicha aniqlanadi: qo'shimchalar birinchi navbatda chastotasi bo'yicha (eng yuqoridan pastgacha) va agar ular bir xil bo'lsa, uzunligi bo'yicha ikkilamchi tartiblash bo'yicha (eng uzundan eng qisqagacha) tartiblanadi.Shunday qilib, eng tez-tez va eng uzun qo'shimchalar birinchi "guruh" ni belgilaydi.Guruh chastotasi asosiy chastotaga o'rnatiladi.Keyin tartiblangan ro'yxatda qolgan har bir qo'shimchani Needleman-Wunsch juftlik bilan moslashtirish orqali guruhga qo'shishga harakat qilindi.Agar hizalamadagi nomuvofiqliklar, qo'shishlar yoki o'chirishlar soni 2 chegaradan oshmasa, qo'shish guruhga qo'shiladi va umumiy guruh chastotasi kiritish qanchalik tez-tez qo'shilganiga qarab oshiriladi.Guruhga qo'shilgan qo'shimchalar ishlatilgan deb belgilanadi va keyingi qayta ishlashdan chiqarib tashlanadi.Agar qo'shish ketma-ketligini allaqachon mavjud bo'lgan guruhga qo'shib bo'lmasa, qo'shish ketma-ketligi tegishli qo'shish chastotasi bilan yangi guruh yaratish uchun ishlatiladi va ishlatilgan deb belgilanadi.Har bir qo'shish ketma-ketligi yangi guruh yaratish uchun ishlatilgan yoki allaqachon mavjud guruhga qo'shilishi mumkin bo'lsa, iteratsiya tugaydi.Axir, nukleotidlardan tashkil topgan guruhlangan qo'shimchalar oxir-oqibat peptid ketma-ketligiga (peptid kutubxonalariga) tarjima qilinadi.Ushbu tahlil natijasi ketma-ket o'qishlar sonini tashkil etuvchi qo'shimchalar to'plami va ularga mos keladigan chastotalardir (2-rasm).
Motif avlodi: Noyob peptidlar ro'yxatiga asoslanib, quyida ko'rsatilganidek, barcha mumkin bo'lgan aminokislota naqshlarini (aa) o'z ichiga olgan kutubxona yaratildi.Uzunligi 3 bo'lgan har bir mumkin bo'lgan naqsh peptiddan olingan va uning teskari namunasi barcha naqshlarni (tripeptidlarni) o'z ichiga olgan umumiy motif kutubxonasi bilan birga qo'shilgan.Juda takrorlanadigan motivlar kutubxonalari ketma-ketlashtirildi va ortiqcha narsalar olib tashlandi.Keyin, motivlar kutubxonasidagi har bir tripeptid uchun biz hisoblash vositalaridan foydalangan holda kutubxonada mavjudligini tekshirdik.Bunday holda, topilgan motivli tripeptidni o'z ichiga olgan peptidning chastotasi qo'shiladi va motivlar kutubxonasidagi motivga tayinlanadi ("motiflar soni").Motif yaratish natijasi o'qilganlar filtrlangan, guruhlangan va tarjima qilinganda mos motivga olib keladigan ketma-ket o'qishlar soni bo'lgan tripeptidlarning (motiflarning) barcha ko'rinishlarini va ularning tegishli qiymatlarini o'z ichiga olgan ikki o'lchovli massivdir.Yuqorida batafsil tavsiflangan ko'rsatkichlar.
Motiflar sonini va mos keladigan tarqalish uchastkalarini normallashtirish: Har bir namuna uchun motiflar soni normallashtirildi.
bu erda ni - i mavzusini o'z ichiga olgan o'qishlar soni.Shunday qilib, vi namunadagi i motifini o'z ichiga olgan o'qishlar (yoki peptidlar) foiz chastotasini ifodalaydi.Normallashtirilmagan motivlar soni uchun P-qiymatlari Fisherning aniq testi yordamida hisoblab chiqilgan.Motivlar sonining korrelogrammalariga kelsak, Spirmanning korrelyatsiyalari R bilan normallashtirilgan motivlar sonidan foydalangan holda hisoblangan.
Peptidlar kutubxonasidagi har bir pozitsiyada aminokislotalarning tarkibini tasavvur qilish uchun 32, 33 (http://weblogo.threeplusone.com) veb-logogrammalar yaratildi.Birinchidan, 12-mer peptidning har bir pozitsiyasidagi aminokislotalarning tarkibi 20 × 12 matritsada saqlanadi.Keyin, har bir pozitsiyada bir xil nisbiy aminokislotalar tarkibini o'z ichiga olgan 1000 ta peptidlar to'plami tezkor ketma-ketlik formatida yaratiladi va har bir pozitsiyada nisbiy aminokislotalar tarkibining grafik tasvirini yaratadigan 3-web logotipiga kirish sifatida taqdim etiladi.berilgan peptid kutubxonasi uchun.Ko'p o'lchovli ma'lumotlar to'plamini vizualizatsiya qilish uchun R-da ichki ishlab chiqilgan vosita (biosHeatmap, hali chiqarilmagan R paketi) yordamida issiqlik xaritalari yaratilgan.Issiqlik xaritalarida keltirilgan dendrogrammalar Uordning ierarxik klasterlash usuli yordamida Evklid masofasi ko'rsatkichi bilan hisoblab chiqilgan.Motif baholash ma'lumotlarini statistik tahlil qilish uchun Fisherning aniq testi yordamida normallashtirilmagan ball uchun P qiymatlari hisoblab chiqilgan.Boshqa ma'lumotlar to'plamlari uchun P-qiymatlari Student's t-test yoki ANOVA yordamida R da hisoblab chiqilgan.
Tanlangan fag klonlari va qo'shimchalari bo'lmagan faglar quyruq venasi orqali tomir ichiga yuborildi (300 mkl PBSda 2 × 1010 fag / hayvon).Perfuziya va keyingi fiksatsiyadan 10 daqiqa oldin xuddi shu hayvonlarga vena ichiga 100 mkl DyLight594 etiketli lektin (Vector Laboratories Inc., DL-1177) yuborildi.Fag in'ektsiyasidan 60 minut o'tgach, kalamushlar yurak orqali 50 ml PBS, so'ngra 50 ml 4% PFA / PBS bilan perfuziya qilindi.Miya namunalari qo'shimcha ravishda bir kechada 4% PFA / PBS da o'rnatildi va 4 ° C da bir kechada 30% sukrozda namlandi.Namunalar OCT aralashmasida tez muzlatiladi.Muzlatilgan namunalarning immunohistokimyoviy tahlili xona haroratida 1% BSA bilan bloklangan va T7 fagiga (Novus NB 600-376A) qarshi poliklonal FITC etiketli antikorlar bilan inkubatsiya qilingan 30 mkm kriyoseksiyalarda 4 °C da o'tkazildi.Bir kechada inkubatsiya qiling.Nihoyat, bo'limlar PBS bilan 3 marta yuvildi va konfokal lazer mikroskopi (Leica TCS SP5) bilan tekshirildi.
Minimal tozaligi 98% bo'lgan barcha peptidlar GenScript USA tomonidan sintez qilingan, biotinlangan va liyofillangan.Biotin N-terminusda qo'shimcha uch glitsinli ajratgich orqali bog'lanadi.Mass-spektrometriya yordamida barcha peptidlarni tekshiring.
Streptavidin (Sigma S0677) biotinlangan peptidning 5 baravar ekvimolyar ortiqcha miqdori, biotinlangan BACE1 inhibitör peptid yoki biotinlangan BACE1 inhibitör peptid va BACE1 inhibitör peptidining 5-10% PBS/inkubbatida 5-10% birikmasi (3:1 nisbatda) bilan aralashtirildi.In'ektsiyadan oldin xona haroratida 1 soat.Streptavidin bilan konjugatsiyalangan peptidlar miya bo'shlig'i bo'lgan kalamushlarning quyruq tomirlaridan biriga 10 mg / kg dozada tomir ichiga yuborildi.
Streptavidin-peptid komplekslarining kontsentratsiyasi Elishay tomonidan baholandi.Nunc Maxisorp mikrotiter plitalari (Sigma) 4 ° C da 1,5 mkg / ml sichqoncha anti-streptavidin antikori (Thermo, MA1-20011) bilan bir kechada qoplangan.Xona haroratida 2 soat davomida blokirovka qilingandan so'ng (blokirovka buferi: 140 nM NaCL, 5 mM EDTA, 0,05% NP40, 0,25% jelatin, 1% BSA), plastinkani 0,05% Tween-20/PBS (yuvish buferi) bilan yuving va 3 soniya davomida plastmalab qo'shilgan namunalar qo'shildi. 1:10 000, CSF 1:115).Keyin plastinka aniqlovchi antikor (1 mkg/ml, anti-streptavidin-HRP, Novus NB120-7239) bilan 4°C da tun davomida inkubatsiya qilindi.Uchta yuvish bosqichidan so'ng, streptavidin TMB substrat eritmasida (Roche) 20 daqiqagacha inkubatsiya yo'li bilan aniqlandi.1M H2SO4 bilan rang rivojlanishini to'xtatgandan so'ng, absorbansni 450 nm da o'lchang.
Streptavidin-peptid-BACE1 inhibitör kompleksining funktsiyasi ishlab chiqaruvchining protokoliga (Wako, 294-64701) muvofiq Ab (1-40) Elishay tomonidan baholandi.Qisqacha aytganda, CSF namunalari standart seyrelticide (1:23) suyultirildi va BNT77 ushlash antikori bilan qoplangan 96 quduqli plastinkalarda bir kechada 4 ° C da inkubatsiya qilindi.Besh yuvish bosqichidan so'ng, HRP-konjugatsiyalangan BA27 antikori qo'shildi va 2 soat davomida 4 ° C da inkubatsiya qilindi, so'ngra beshta yuvish bosqichi amalga oshirildi.Ab (1-40) xona haroratida 30 daqiqa davomida TMB eritmasida inkubatsiya yo'li bilan aniqlandi.Rang rivojlanishi to'xtatilgan eritma bilan to'xtatilgandan so'ng, absorbansni 450 nm da o'lchang.Plazma namunalari Ab (1-40) Elishaydan oldin qattiq fazali ekstraktsiyaga duchor qilindi.Plazma 96-quduqli plitalardagi 0,2% DEA (Sigma) ga qo'shildi va xona haroratida 30 daqiqa davomida inkubatsiya qilindi.SPE plitalarini (Oasis, 186000679) suv va 100% metanol bilan ketma-ket yuvgandan so'ng, plazma namunalari SPE plitalariga qo'shildi va barcha suyuqliklar olib tashlandi.Namunalar yuvildi (avval 5% metanol, keyin 30% metanol) va 2% NH4OH/90% metanol bilan elutildi.Eluatni 55 ° C da 99 daqiqa davomida doimiy N2 oqimida quritgandan so'ng, namunalar standart seyrelticilarda kamaytirildi va yuqorida aytib o'tilganidek, Ab (1-40) o'lchandi.
Ushbu maqolani qanday keltirish mumkin: Urich, E. va boshqalar.Vivo jonli ravishda aniqlangan tranzit peptidlar yordamida miyaga yuk etkazib berish.fan.5, 14104;doi: 10.1038/srep14104 (2015).
Likhota J., Skjorringe T., Tomsen LB va Moos T. Maqsadli terapiya yordamida miyaga makromolekulyar dorilarni etkazib berish.Neyrokimyo jurnali 113, 1-13, 10.1111 / j.1471-4159.2009.06544.x (2010).
Brasnjevic, I., Steinbusch, HW, Schmitz, C. va Martinez-Martinez, P. Peptid va protein preparatlarini qon-miya to'sig'i orqali etkazib berish.Prog Neurobiol 87, 212-251, 10.1016/j.pneurobio.2008.12.002 (2009).
Pardridge, V.M. Qon-miya to'sig'i: miya dori rivojlanishidagi qiyinchilik.NeuroRx 2, 3-14, 10.1602/neurorx.2.1.3 (2005).
Yoxanson, KE, Dunkan, JA, Stopa, EG va Byrd, A. Koroid pleksus-CSF yo'li orqali miyaga dori ta'minotini yaxshilash va maqsadli yo'naltirish istiqbollari.Farmatsevtika tadqiqotlari 22, 1011-1037, 10.1007 / s11095-005-6039-0 (2005).
Pardridge, WM. Miya yetkazib berish uchun molekulyar troyan otlari bilan biofarmatsevtikani modernizatsiya qilish.Bioconjug Chem 19, 1327–1338, 10.1021/bc800148t (2008).
Pardridge, qon-miya to'sig'i orqali WM retseptorlari vositasida peptid tashish.Endocr Rev. 7, 314–330 (1986).
Niewoehner, J. va boshqalar.Bir valentli molekulyar moki yordamida terapevtik antikorlarning miyaga kirib borishini va samaradorligini oshiring.Neyron 81, 49-60, 10.1016/j.neuron.2013.10.061 (2014).
Bien-Li, N. va boshqalar.Transferrin retseptorlari (TfR) transporti miya TfR antikorlarining yaqinlik variantlarini qabul qilishni aniqlaydi.J Exp Med 211, 233–244, 10.1084/jem.20131660 (2014).