Nature.com saytiga tashrif buyurganingiz uchun tashakkur.Siz foydalanayotgan brauzer versiyasi cheklangan CSS-ni qo'llab-quvvatlaydi.Eng yaxshi tajriba uchun yangilangan brauzerdan foydalanishni tavsiya qilamiz (yoki Internet Explorer-da Moslik rejimini o'chirib qo'ying).Shu bilan birga, doimiy qo'llab-quvvatlashni ta'minlash uchun biz saytni uslublarsiz va JavaScript-ni ishlatmasdan taqdim etamiz.
Suyuq biopsiya (LB) - bu biotibbiyot sohasida tez mashhurlik kasb etayotgan tushuncha.Ushbu bo'laklarning kichik bir qismi begona (begona) to'qimalar yoki organizmlardan kelib chiqadi.Joriy ishda biz ushbu tushunchani dengiz suvini yuqori filtrlash qobiliyati bilan mashhur bo'lgan midiya turlariga qo'lladik.Natijalarimiz shuni ko'rsatadiki, midiya gemolimfasida kattaligi 1 dan 5 kb gacha bo'lgan DNK bo'laklari mavjud.O'q otish qurollari ketma-ketligi shuni ko'rsatdiki, ko'p sonli DNK bo'laklari begona mikroblardan kelib chiqqan.
Iqlim o'zgarishining (CC) dengiz ekotizimlarining biologik xilma-xilligiga ta'siri tez o'sib borayotgan tadqiqot sohasidir.Global isish nafaqat muhim fiziologik stresslarni keltirib chiqarmoqda, balki dengiz organizmlarining termal barqarorligining evolyutsion chegaralarini oshirib, bir qator turlarning yashash muhitiga ta'sir qiladi va ularni yanada qulayroq sharoitlarni izlashga undaydi [1, 2].Metazoanlarning biologik xilma-xilligiga ta'sir qilishdan tashqari, CC mezbon-mikrobial o'zaro ta'sirlarning nozik muvozanatini buzadi.Ushbu mikrobial disbakterioz dengiz ekotizimlari uchun jiddiy xavf tug'diradi, chunki u dengiz organizmlarini yuqumli patogenlarga ko'proq moyil qiladi [3, 4].SS global dengiz ekotizimlarini boshqarish uchun jiddiy muammo bo'lgan ommaviy o'limda muhim rol o'ynaydi, deb ishoniladi [5, 6].Bu ko'plab dengiz turlarining iqtisodiy, ekologik va ozuqaviy ta'sirini hisobga olgan holda muhim masala.Bu, ayniqsa, qutbli hududlarda yashovchi ikki pallalilar uchun to'g'ri keladi, bu erda CK ta'siri tezroq va kuchliroqdir [6, 7].dengiz ekotizimlarida CC ta'sirini kuzatish uchun keng qo'llaniladi.Ajablanarli emaski, ularning sog'lig'ini kuzatish uchun nisbatan ko'p sonli biomarkerlar ishlab chiqilgan bo'lib, ular ko'pincha fermentativ faollik yoki hujayra hayotiyligi va fagotsitar faollik kabi hujayra funktsiyalariga asoslangan funktsional biomarkerlarni o'z ichiga olgan ikki bosqichli yondashuvdan foydalanadilar [8].Ushbu usullar, shuningdek, ko'p miqdorda dengiz suvi so'rilganidan keyin yumshoq to'qimalarda to'plangan maxsus bosim ko'rsatkichlarining kontsentratsiyasini o'lchashni o'z ichiga oladi.Shu bilan birga, ikki pallalilarning yuqori filtrlash qobiliyati va yarim ochiq qon aylanish tizimi bemorlarni boshqarishda oddiy va minimal invaziv yondashuv bo'lgan suyuq biopsiya (LB) kontseptsiyasidan foydalangan holda yangi gemolimfa biomarkerlarini ishlab chiqish imkoniyatini beradi.Qon namunalari [9, 10].Inson LBda aylanma molekulalarning bir nechta turlarini topish mumkin bo'lsa-da, bu kontseptsiya birinchi navbatda plazmadagi aylanma hujayradan tashqari DNK (ccfDNA) bo'laklarining DNK ketma-ketligini tahlil qilishga asoslangan.Darhaqiqat, inson plazmasida aylanma DNK mavjudligi 20-asrning o'rtalaridan beri ma'lum bo'lgan [11], lekin faqat so'nggi yillarda yuqori o'tkazuvchanlik sekvensiyasi usullarining paydo bo'lishi ccfDNKga asoslangan klinik tashxisga olib keldi.Ushbu aylanma DNK fragmentlarining mavjudligi qisman hujayra o'limidan so'ng genomik DNKning (yadro va mitoxondrial) passiv chiqishi bilan bog'liq. chàngāng yāngī, ccfdna yāngāng yīng yīng (<10 ng/ml) 5-10 qān, mīngčičičičičičičičičičičičičić Sog'lom odamlarda ccfDNA kontsentratsiyasi odatda past (<10 ng / ml), lekin turli patologiyalar yoki stressli bemorlarda 5-10 barobar ko'payishi mumkin, bu esa to'qimalarning shikastlanishiga olib keladi.[12].O'z-o'zidan olingan ccfDNK tahlili, ya'ni normal yoki o'zgartirilgan xost hujayralaridan ccfDNK, yadro va/yoki mitoxondriyal genomda mavjud bo'lgan genetik va epigenetik o'zgarishlarni aniqlash uchun ishlatilishi mumkin va shu bilan klinisyenlarga maxsus molekulyar maqsadli terapiyani tanlashda yordam beradi [13].ccfDNK, shuningdek, infektsion agentning (chet el) nuklein kislotalari mavjudligini aniqlash uchun muhim ma'lumot manbai bo'lib, bu qon madaniyati bilan aniqlanmagan keng tarqalgan infektsiyalarni invaziv bo'lmagan holda aniqlashga, infektsiyalangan to'qimalarning invaziv biopsiyasidan qochishga imkon beradi [18].So'nggi tadqiqotlar shuni ko'rsatdiki, inson qoni virusli va bakterial patogenlarni aniqlash uchun ishlatilishi mumkin bo'lgan boy ma'lumot manbasini o'z ichiga oladi va inson plazmasida topilgan ccfDNK ning taxminan 1% begona kelib chiqishi [19].Ushbu tadqiqotlar organizmning aylanma mikrobiomasining biologik xilma-xilligini ccfDNK tahlili yordamida baholash mumkinligini ko'rsatadi.Biroq, yaqin vaqtgacha bu tushuncha faqat odamlarda va kamroq darajada boshqa umurtqali hayvonlarda qo'llanilgan [20, 21].
Ushbu maqolada biz LB potentsialidan 35 million yil oldin shakllangan katta plato tepaligidagi orollar guruhi bo'lgan, subantarktikadagi Kerguelen orollarida keng tarqalgan janubiy turdagi Aulakomya atraning ccfDNKsini tahlil qilish uchun foydalanamiz.vulqon otilishi.In vitro eksperimental tizimdan foydalanib, biz dengiz suvidagi DNK parchalari midiya tomonidan tezda olib ketilishi va gemolimfa bo'linmasiga kirishini aniqladik.O'q otish quroli ketma-ketligi midiya gemolimfa ccfDNK ning o'ziga xos va o'ziga xos bo'lmagan DNK bo'laklarini, jumladan, simbiotik bakteriyalarni va sovuq vulqon dengiz qirg'oq ekotizimlariga xos bo'lgan biomlarning DNK qismlarini o'z ichiga olishini ko'rsatdi.Xulosa qilib aytganda, bizning tadqiqotimiz shuni ko'rsatadiki, LB kontseptsiyasi dengiz ekotizimlarida boy genomik repertuar yaratish uchun dengiz umurtqasizlariga muvaffaqiyatli qo'llanilishi mumkin.
(sun'iy dengiz tuzi Reef Crystal, Instant Ocean, Virjiniya, AQSh).Har bir tajriba uchun alohida qobiqlarning uzunligi va og'irligi o'lchandi.
CfDNKni izolyatsiya qilish va tozalash uchun namunalar (1,5-2,0 ml) ishlab chiqaruvchining ko'rsatmalariga muvofiq NucleoSnap cfDNA to'plami (Macherey-Nagel, Bethlehen, PA) yordamida eritildi va qayta ishlandi.Izolyatsiya qilingan ccfDNKning fragmentlar taqsimoti kapillyar elektroforez orqali Agilent 2100 bioanalizatori (Agilent Technologies Inc., Santa Clara, CA) yordamida yuqori sezuvchanlik DNK to'plami yordamida tahlil qilindi.Tahlil ishlab chiqaruvchining ko'rsatmalariga muvofiq ccfDNK namunasining 1 µl yordamida amalga oshirildi.
Gemolimfa ccfDNK fragmentlarini ketma-ketlashtirish uchun Génome Québec (Monreal, Kvebek, Kanada) Illumina MiSeq PE75 to'plamining Illumina DNK Mix to'plamidan foydalangan holda ov miltig'i kutubxonalarini tayyorladi.Raw ma'lumotlar fayllari NCBI Sequence Read Archive (SRR8924808 va SRR8924809) dan mavjud. ① ② ncbi 分类 ((<1e-3 和 9 和 90% ③ ④ ③ ↑ 使用 使用 ↑ 使用 ↑ 使用 ↑ 掩蔽 ↑ NCBI Bativekon taksonomik ma'lumotlar bazasidan foydalangan holda basseyn qilingan o'quvchilar portlash bilan izohlanadi (E fund <1-19-19 va 90% gootologiya) va murakkablik sofligi niqobi chang yordamida amalga oshirildi [26].O'qishlar ikki guruhga bo'lingan: ikki pallali ketma-ketliklar bilan bog'liq (bu erda o'z-o'zidan o'qiladi) va aloqasiz (o'z-o'zidan o'qilmagan).Kontiglarni yaratish uchun MEGAHIT yordamida ikkita guruh alohida yig'ildi [27].Shu bilan birga, begona mikrobioma o'qishlarining taksonomik taqsimoti Kraken2 [28] yordamida tasniflangan va Galaxy [29, 30] da Krona doiraviy diagrammasi bilan grafik tarzda ifodalangan.Bizning dastlabki tajribalarimiz natijasida optimal kmerlar kmer-59 ekanligi aniqlandi. Zatem sobstvennye konti byli identifikatsiyalash putem soposstavleniya s BLASTN (baza dannyx dvustvorchatyx mollyuskov NCBI, znachenie e <1e-10 va gomologiya 60%) uchun okonchatelnoy annotatsii. ① ② plast (双壳贝类 NCBI 数据库, E 值 <1e-10 √ ③ ③ ③ ③ 60% ③ ↑ Zatem byli identifisirovani sobstvennye kontiqi uchun okonchatelnoy annotatsii putem soposstavleniya s BLASTN (baza dannyx NCBI dlya dvustvorchatyh mollyuskov, znachenie e <1e-10 va gomologiya 60%). Keyinchalik BLASTN (NCBI ikki pallali ma'lumotlar bazasi, e qiymati <1e-10 va 60% homologiya) ga mos kelish orqali yakuniy izoh uchun o'z-o'zini tutashuvlar aniqlandi. Bunga parallel ravishda, BLASTN (nt NCBI ma'lumotlar bazasi, e qiymati <1e−10 va 60% homologiya) bilan o'z-o'zidan bo'lmagan guruh kontiglari izohlangan. Bunga parallel ravishda, BLASTN (nt NCBI ma'lumotlar bazasi, e qiymati <1e−10 va 60% homologiya) bilan o'z-o'zidan bo'lmagan guruh kontiglari izohlangan. Parallno chujerodnye grupovye byli antoriyovany s pomoshchyu (baza dannyx ntbi, znachenie e <1-10 i gomomol) 60%). Bunga parallel ravishda, xorijiy guruh kontiglari BLASTN (NT NCBI ma'lumotlar bazasi, e qiymati <1e-10 va 60% homologiya) bilan izohlangan.BLASTN（nt NCBI lēngčiči，e máng< 1e-10 60% língíngíngíníngīngīngBLASTN（nt NCBI lēngčiči，e máng< 1e-10 60% língíngíngíníngīngīng Parallelno kontiqi, ne otnosyashchiesya k sobstvennoy gruppe, byli annotrovany s pomoshchyu BLASTN (baza dannyx nt NCBI, znachenie e <1e-10 va gomologiya 60%). Parallel ravishda o'z-o'zidan guruh konteynerlari portlash bilan (NT NCBI ma'lumotlar bazasi, e <1e-10 va 60% homololi) bilan izohlandi. BLASTX, shuningdek, nr va RefSeq protein NCBI ma'lumotlar bazalari (e qiymati <1e−10 va 60% homologiya) yordamida o'z-o'zidan bo'lmagan kontiglar ustida o'tkazildi. BLASTX, shuningdek, nr va RefSeq protein NCBI ma'lumotlar bazalari (e qiymati <1e−10 va 60% homologiya) yordamida o'z-o'zidan bo'lmagan kontiglar ustida o'tkazildi. BLASTX ham nesamostoyatelnyx kontigax s ispolzovaniem baz dannyx belka nr va RefSeq NCBI (znachenie e <1e-10 va gomologiya 60%). Shuningdek, portlashlar NR va Refl-NCBI oqsil NCBI protein ma'lumotlar bazalarini (EX <1e-10 va 60% homololi) yordamida o'z-o'zidan bo'lmagan shaxslar tomonidan ijro etilmagan.♪ ♪ nr 和 REFBR REFBR NCBI 对 对 对 对 对 对 对 对 对 对 对 对 对 对 对 对 对 对 对 对 对 对 对 对 对 对 对 对 对 对 对 对 对 对 对 对 了 对 对 对 对 对 对 对 对 对 对 对 对 了 对 对 了 对 对 对 对 对 了 了 了 了 了 了 了 了 对 了 了 了 了 了 对 对 了 对 对 了 对 对 对 对 了 对 对 了 对 对 了 了 对 了 了 对 了 对 cháng♪ ♪ nr 和 REFBR REFBR NCBI 对 对 对 对 对 对 对 对 对 对 对 对 对 对 对 对 对 对 对 对 对 对 对 对 对 对 对 对 对 对 对 对 对 对 对 对 了 对 对 对 对 对 对 对 对 对 对 对 对 了 对 对 了 对 对 对 对 对 了 了 了 了 了 了 了 了 对 了 了 了 了 了 对 对 了 对 对 了 对 对 对 对 了 对 对 了 对 对 了 了 对 了 了 对 了 对 cháng BLASTX shuningdek vypolnyali na nesamostoyatelnyx kontigax s ispolzovanie baz dannyx belka nr va RefSeq NCBI (znachenie e <1e-10 va gomologiya 60%). BLASTX, shuningdek, nr va RefSeq NCBI protein ma'lumotlar bazalari (e qiymati <1e-10 va 60% homologiya) yordamida o'z-o'zidan bo'lmagan kontiglarda ham amalga oshirildi.Blast va BlastXx-ning o'ziga xos bo'lmagan basseynlari yakuniy attik tomograflarni anglatadi (qo'shimcha faylga qarang).
Taq DNK polimeraza (Bio Basic Canada, Markham, ON) ccfDNA maqsadli genlarini kuchaytirish uchun ishlatilgan.Quyidagi reaktsiya shartlari qo'llanildi: 95 ° C da 3 daqiqa davomida denatürasyon, 1 daqiqa davomida 95 ° C, 1 daqiqa davomida o'rnatilgan tavlanish harorati, 72 ° C da 1 daqiqa davomida cho'zish, 35 tsikl va nihoyat 10 daqiqa ichida 72 ° C..PCR mahsulotlari Azaroz gelsidagi (1,5%) (1,5%), 95 Vilda joylashgan SYBTTM-ni (Insonith, Burlington, Kanada) o'z ichiga olgan elektoforezlar bilan ajratilgan.
Missel (MyTilus SPPInson galektin-7 cDNK ketma-ketligini (NCBI kirish raqami L07769) kodlovchi qo'shimchani o'z ichiga olgan plazmid DNK flakonga yakuniy 190 mkg/mkl konsentratsiyasida qo'shildi.Dengiz suvidagi DNK sifati, dengiz suvi namunalari (20 mk, uchta takrorlash) belgilangan vaqtda olingan.Plazmid DNKning kuzatilishi uchun LB midiyasi ko'rsatilgan vaqtlarda yig'ib olindi va qPCR va ddPCR tomonidan tahlil qilindi.
Raqamli tomchi PCR (ddPCR) BioRad QX200 protokoli (Missisauga, Ontario, Kanada) yordamida amalga oshirildi.Optimal haroratni aniqlash uchun harorat profilidan foydalaning (S1 jadval).Tomchilar Qx200 drop generator (BiorD) yordamida yaratildi.DDPCR quyidagicha amalga oshirildi: 9 minut uchun 95 ° C, 30 s va 72 ° C uchun 30 s, 4 ° C dan 5 minut ichida 95 ° C gacha.Tomchilar soni va ijobiy reaktsiyalar (nusxalar soni/ml) QX200 tomchi o'quvchi (BioRad) yordamida o'lchandi.
qPCR Rotor-Gene® 3000 (Corbett Research, Sidney, Avstraliya) va LGALS7 maxsus primerlari yordamida amalga oshirildi.Barcha miqdoriy PCRlar QuantiFast SYBR Green PCR Kit (QIAGEN) yordamida 20 mklda bajarildi.Erkinlik egrilar ketma-ket o'lchash 95 ° C uchun 5 s, 65 ° C uchun QTRCR oxirida 97 ° C uchun yaratildi.Har bir qPCR uch nusxada amalga oshirildi, nazorat namunalari bundan mustasno.
Missellar o'zlarining yuqori filtrlash tezligi bilan tanilganligi sababli, biz avval dengiz suvidagi DNK parchalarini filtrlash va saqlab qolish yoki saqlab qolish-qilmasliklarini tekshirdik.Shuningdek, biz bu parchalar yarim ochiq limfa tizimida to'planishi bilan qiziqdik.Biz ko'k massivlar uchun qo'shilgan eriydigan DNK parchalarini kuzatib, biz ushbu masalani eksperimentik ravishda hal qilamiz.DNK parchalarini kuzatish uchun biz Inson Galektin-7 geni bo'lgan plazmid DNKni chet el (o'zini emas) ishlatdik.ddPCR dengiz suvi va midiyadagi plazmid DNK parchalarini izlaydi.Bizning natijalarimiz shuni ko'rsatadiki, agar Missallar bo'lmasa, vaqt o'tishi bilan DNK parchalari nisbatan doimiy ravishda qolsa (7 kungacha) 8 soat ichida deyarli yo'q bo'lib ketdi (1a-rasm).Ekzogen DNKning bo'laklari 15 daqiqa ichida intravalvular suyuqlik va gemolimfada osongina aniqlandi (1c-rasm).Ushbu parchalar ta'sir qilishdan keyin 4 soatgacha aniqlanishi mumkin.Ushbu filtrlash faoliyati DNK parchalari bilan bog'liq bakteriyalar va yosunlarning filtrlash faoliyati bilan taqqoslanadi [31].Ushbu natijalar shuni ko'rsatadiki, midslar o'zlarining suyuqlik joylarida chet el derasini filtrlash va to'plashlari mumkin.
DDPCR tomonidan o'lchanadigan midiyalar mavjudligida (a) yoki Missels (b) ning (B) ning (B) ning (B) ning (B) ning nisbiy kontsentratsiyasi.A ichida natijalar foiz hisobida, 75-chi, 75-chi foiz ko'rsatilgan qutilarning chegaralari bilan ifodalanadi.Natijalar mutlaqo nusxalangan / ml (± S) sifatida taqdim etiladi.
Keyinchalik, biz "Anergeelen orollari", antropogen ta'sirli orollarning masofaviy guruhi, CCFDE-dagi CCFDE-ning kelib chiqishi, antropogen ta'sirli orollarning masofaviy guruhi tekshirdik.Biz mitselda o'rtacha gemmolimfad ccfdna konsentratsiyasi ml gemolimp diaperga nisbatan past mikrogramlarda (S2-jadval, qo'shimcha ma'lumotlar) mavjudligini aniqladik.Konsentratsiyalarning ushbu kontsentratsiyalari sog'lom odamlarga nisbatan ancha katta, ammo kamdan-kam hollarda, saraton kasalligida, CCFDNA darajasi bir millimiterga bir nechta mikrogramga etkazishi mumkin [34, 35].5000 BP gacha (2-rasm).Shunga o'xshash natijalarga ko'ra, sud-tibbiyot fanidan foydalaniladigan silika asosida asoslangan Qieamp tergovchi to'plamidan foydalangan DNK namunalari, shu jumladan CCFDNA [36].
Mussel gemolimphe vakili CCFDNA elektrofografiyasi.Nukleosnalap plazma to'plami (tepasi) va qialamp DNK tergovchi to'plamini olish.B skripka fitnasi Misselda gemolimpda kontsentratsiyasini (± ST) tarqatishni ko'rsatadi.Qora va qizil chiziqlar mos ravishda mediani va birinchi va uchinchi kvartirani anglatadi.
Ikki pallalilarning yarim ochiq qon aylanish tizimini, mikroblarga boy dengiz suvini va midiya ccfDNK ning o'lchamlarini hisobga olgan holda, biz midiya gemolimfa ccfDNK mikrobial DNKning boy va xilma-xil hovuzini o'z ichiga olishi mumkinligini taxmin qildik.Ushbu gipotezani sinab ko'rish uchun biz Kerguelen orollaridan to'plangan "Auacomya" namunalari ketma-ket bo'lib, 10 milliondan ortiq o'qiydi, ularning 97,6 foizi sifat nazorati o'tkazildi.Keyinchalik o'qishlar blastik va NCBI Bivalek ma'lumotlar bazalaridan foydalanib o'z-o'zini va o'z-o'zidan bo'lmagan manbalarga muvofiq tasniflandi (S1-rasm, qo'shimcha ma'lumotlar).
Odamlarda ham yadro, ham mitoxondrial DNK qon oqimiga chiqarilishi mumkin [38].Biroq, hozirgi tadqiqotda, Midselsning yadro genomiyali DNKni batafsil tasvirlash mumkin emas edi, chunki A. Atra genomi aniqlanmagan yoki tavsiflanmagan.Biroq, biz bo-yil kutubxonasidan foydalangan holda o'z daromadimizning bir qator CCFDN qismini aniqlay olmadik (S2-rasm, qo'shimcha ma'lumotlar).Shuningdek, biz o'zingizning kelib chiqishimizning PCC-ni o'rnatilgan A.TRA genlarining izlanishiga yo'naltirilgan DNK parchalarini tasdiqladik (3-rasm).Shunga o'xshab, A.TRA A.TRAning ommaviy ma'lumotlar bazalarida mavjudligini hisobga olgan holda, A. ATRA A.TRA xemravfadagi mitoxondriya parchalari mavjudligi uchun dalil topishi mumkin.Mitochordrial DNK parchalarining mavjudligi PCC ning kuchaytirilganligi tasdiqlandi (3-rasm).
PCR bilan kuchaytirilgan A. atra (qizil nuqta - stok raqami: SRX5705969) va M. platensis (ko'k nuqta - stok raqami: SRX5705968) gemolimfasida turli mitoxondriyal genlar mavjud edi.
Birinchi strategiya, "Portlash va boshqa vositalar bilan taqqoslanadigan aniqlik bilan mikrobial ketma-ketliklarni aniqlay oladigan" Algoritm "ketma-ketlik tasniflash dasturi.6719 dan ortiq o'qish bakterial kelib chiqishi uchun aniqlangan, 124 va 64 nafari mos ravishda (4-rasm).Bakterial DNK parchalari (46%), protexobakteriyalar (27%) va bakteridetlar (17%) (16a-rasm) edi. Bu holda, bir-biriga o'xshash o'qishlar juft uchli o'qishlar sifatida yig'ildi va BLASTN va e qiymati 1e−3 va >90% homologiyaga ega bo'lgan kesimdan foydalangan holda o'z-o'zidan (ikki pallali) yoki o'z-o'zidan kelib chiqishi sifatida tasniflandi. Bu holda, bir-biriga o'xshash o'qishlar juft uchli o'qishlar sifatida yig'ildi va BLASTN va e qiymati 1e−3 va >90% homologiyaga ega bo'lgan kesimdan foydalangan holda o'z-o'zidan (ikki pallali) yoki o'z-o'zidan kelib chiqishi sifatida tasniflandi. V etom sluchae perekryvayushchiesya chteniya byli sobrany kak chteniya s parnymi kontsami va byli klassisitsirovany ka sobstvennye (dvustvorchatye mollyuski) yoki chujie po proisxojdeniyu s ispolzovanyem BLASTN va znacheniya gomi e 190% oteychen>. Bunday holda, bir-biriga zid bo'lgan o'quvchilar unvonlar sifatida to'plangan va 1-chi (2 90% goologiyani kesishgan.① ② ③ ④ shūba - 和 使用 和 和 和 和 和 和 和 1-19-19-19 和 和 和 和 ↑ (↓ ↑) ↑ ↓ ↑ ↑. V ikm slucae perekryvayushchiesya chenniya byly kak chenniya s pardimi i klassifie i klassifie Molstvennye (dvustvorstvennye po nesobstvennye po nesobstvennye po nesobstvennye po nesobstvennye po proisxo Jdeniyu s ispolzovanim znacheniy esiz i 1e-3 i poroga gomomologi> 90%. Bunday holda, bir-biriga zid bo'lgan o'quvchilar juftlashtirilgan o'qiladi va asl (1E-3 qiymatlari va gootologiyani va gootologiyani va gootologiyani 90% dan ajratib olish uchun to'plangan.A. Atra genomi hali ketma-ket bo'lmaganligi sababli, biz Megahitites-ning keyingi avlod sekation (NGS) yig'imbozlik (NGS).Ushbu DNK parchalarining yarmidan ko'pi bakteriyalar, asosan gill suyaklari, shu jumladan sulfotrofik belgilar, shu jumladan sulfotrofik simbionlar, shu jumladan slulfotrofik simbilar va gill simlari Solemia velionsidan olingan bakteriyalardan olindi (5-rasm).
B Mikrobial xilma-xillik ikki asosiy fili (firmalar va proteobakteriyalar).ddPCR C Vibrio spp ning reprezentativ kuchaytirilishi.A. 16s RRNA genining (ko'k) uchta atral gemolilikda parchalari.

Kraken2 tahlili shuni ko'rsatdiki, midiya ccfDNA arxeal DNK bo'laklarini, jumladan Euryarchaeota (65%), Crenarchaeota (24%) va Thaurmarcheota (11%) DNK qismlarini o'z ichiga oladi (6a-rasm).Euryarchaeota ko'pincha ekstremal sharoitlar bilan bog'liq bo'lsa-da, endi Euryarchaeota ham, Crenarcheota ham dengiz kriyojenik muhitida eng keng tarqalgan prokaryotlar qatoriga kirishi tan olingan [43, 44].Kergelen platosida [45] ning pastki oqishidan [45] ning pastki oqishidan [45] ning pastki oqishidan kelib chiqqan holda, Kergelen orollari sohilidagi keng metan oqishi haqidagi xabarlar keltirilganligi ajablanarli emas [46].
Keyin DNK viruslaridan o'qishga e'tibor qaratdi.Bizning ma'lumotlarga ko'ra, bu midiya tarkibidagi viruslar bo'yicha birinchi maqsaddan tashqari tadqiqotdir.Kutilganidek, biz bakteriofaglarning (Caudovirales) DNK qismlarini topdik (6b-rasm).Ushbu flum doirasida eng ko'p DNK ketma-ketligi (58%) va uning tabiiy mezbonlariga bu DNKning umurtqali va ketma-ketlari kiradi.Shuningdek, uchastkalar, shuningdek, ma'lum bir virusli generalning eng katta genomi ulushi bo'lgan ulkan virusni ketma-ketlar olishdi.Unga Baculoviridae va Iridoviridae kabi hasharotlarni yuqtiruvchi viruslar, shuningdek, amyoba, suv o'tlari va umurtqali hayvonlarni yuqtiruvchi viruslar kiradi.Shuningdek, biz Pithovirus sibericum genomiga mos keladigan ketma-ketliklarni topdik.Pitoviruslar (shuningdek, "Zombi viruslari" deb nomlanadi) birinchi marta Sibirda 30,000 yoshli Servrafrdan ajratilgan [47].
Va nihoyat, biz boshqa ko'pgina hayvonlardan DNK parchalarini topa olishimizni ko'rdik.Hasharotlar va boshqa turlardan DNK parchalari ham topildi.DNKning nisbatan katta qismi aniqlanmagan, ehtimol, turli xil dengiz bazalarini er usti turlariga nisbatan eng ko'p ekstremal. [49].
Ushbu maqolada biz Missps-ning zarbasi ketma-ketligi dengiz qirg'oqlari ekotizimlarining tarkibini anglashi mumkinligini ta'kidlaymiz.Xususan, biz 1) Mussel gemolimf tarkibida DNK parchalanishining nisbatan yuqori kontsentratsiyasi (mikrogram) nisbatan yuqori konsentratsiyalar (mikrogram kuchi);2) Ushbu DNK parchalari bu DNKning xorijiy bo'lagidan ham mustaqil va mustaqil bo'lmagan 3). Biz bakterial, arxaeal va virusli DNKni, shuningdek, boshqa ko'p sonli hayvonlarning DNKi topdik;4) ushbu xorijiy CCFDNA-ning gemolimfadagi bo'laklarini yig'ish tezda uchraydi va MUSSES ichki filtrlash faoliyatiga yordam beradi.Xulosa qilib, bizning tadqiqotimiz shuni ko'rsatadiki, Biomatik, ammo o'rganilmagan bilim manbai, boy, ammo o'rganilmagan bilim manbai, Sentinel turlari va ularning atrof-muhiti o'rtasidagi o'zaro ta'sirni yaxshiroq tushunish uchun ishlatilishi mumkin bo'lgan bilim manbai.
Primatlardan tashqari, CCFDNASNASASIYASI SIKASLAR, IT, itlar, mushuklar va otlar va otlar [50, 51, 52] deb xabar berildi [50, 51, 52].Ushbu anatomik xususiyat va midiyalarning filtrlash qobiliyati, hech bo'lmaganda, boshqa turlarga nisbatan aylanma DNK parchalarining turli xil xususiyatlarini tushuntirishi mumkin.Odamlarda, qonda muomalada bo'lgan DNKning aksariyat qismlari, 150 dan 200 so'mgacha kichik bo'laklar.DNK parchalarining kichik, ammo sezilarli qismi 300 dan 500 BP gacha, va taxminan 5% 900 dan ortiq., CTDNA).Bu mantiqiy gipotezadir, chunki Missels yarim ochiq qon tomir tizimiga ega va mikrobial insomik DNKning yuqori konsentratsiyasini o'z ichiga olgan dengiz suvli suv muhitida yashaydi.Aslida, bizning laboratoriya tajribamiz Ekzogen DNKdan foydalangan holda, musaliyatda bir necha soatdan keyin dengiz suvi va / yoki turli tashkilotlarda chiqargan va / yoki boshqa tashkilotlarda buzilishganligini ko'rsatdi.
Bizning ma'lumotlarimiz shuni ko'rsatadiki, bakterialsiz olingan gemolimf ccfdna parchalari mezbon bakterial flora va atrofdagi dengiz ekotizimidagi bakteriyalar haqida asosiy ma'lumotlarni taqdim etishi mumkin.Aslida, bizning Kergeuelendagi Mseysuelendan to'plangan LB ma'lumotlaridan foydalanishimiz, Gilli Bakterial Symbions tarkibi ikkala midel turlari uchun ham bir xil edi (s4-rasm, qo'shimcha ma'lumotlar).Ikkala genetik jihatdan turli xil midiyalarning o'xshashligi sovuq, sulfurus va vulkanik konlarda bakterial jamoalar tarkibini aks ettirishi mumkin [55, 56, 57, 58].Oltingugurtni kamaytiruvchi mikroorganizmlarning yuqori darajalari Port-o-Frans qirg'oqlari kabi bioturbatsiyalangan qirg'oq hududlarida [59] midiya yig'ishda yaxshi tasvirlangan.Yana bir imkoniyat, gorizontal translyatsiyadan [60, 61] dabdabali midiya florasi ta'sir qilishi mumkin.Dengiz muhiti, dengiz tubi yuzasi va midiyadagi simbiotik bakteriyalar tarkibi o'rtasidagi bog'liqlikni aniqlash uchun ko'proq tadqiqotlar talab etiladi.
EmpDfdna uzunligi va kontsentratsiyasi, tez tozalashning qulayligi, tez tibbiyotning tezligi, tezlikning tezligi, dengiz qirg'oqlarida biologik xilma-xil ekotizimlarda biologik xilma-xillikni baholashning ko'plab afzalliklari.Ushbu yondashuv, ayniqsa, virusli jamoalarni (viruslarni) aniqlash uchun samarali ekotizimga [62, 63].Bakteriyalar, arxea va eukaryotlardan farqli o'laroq, virojenetik ravishda saqlanadigan genlar, 16S ketma-ketligi kabi fitojenetik ravishda saqlanadigan genlar mavjud emas.Natijalarimiz shuni ko'rsatadiki, midiya kabi indikator turlaridan suyuq biopsiya odatda qirg'oq dengiz ekotizimlarida yashaydigan xostlarni yuqtirishi ma'lum bo'lgan nisbatan ko'p miqdordagi ccfDNA virus fragmentlarini aniqlash uchun ishlatilishi mumkin.Bunga protozoa, artropodlar, hasharotlar, o'simliklar va bakterial viruslar (masalan, bakteriofaglar) kiradi.Xuddi shunday taqsimot biz Kerguelenda bir xil midiya qatlamida to'plangan ko'k midiya (M. platensis) gemolimfa ccfDNK viromini tekshirganimizda topildi (jadval S2, qo'shimcha ma'lumot).CCFDNA-ning ShotGun peshqadamligi haqiqatan ham odamlar yoki boshqa turlarning virusini o'rganishda katta yondashuvdir [21, 37, 64].Ushbu yondashuv, ayniqsa, ikki zanjirli DNK viruslarini o'rganish uchun foydalidir, chunki Baltimordagi eng xilma-xil va keng viruslar sinfini ifodalovchi barcha ikki zanjirli DNK viruslari orasida bitta gen saqlanmaydi [65].Garchi bu viruslarning aksariyati tasniflanmagan boʻlib qolsa va virus dunyosining mutlaqo nomaʼlum qismidagi viruslarni oʻz ichiga olishi mumkin [66], biz A. atra va M. platensis midiyasining viromlari va xost diapazonlari ikki tur oʻrtasida joylashganligini aniqladik.Shunga o'xshab (S3 rasm, qo'shimcha ma'lumotlarga qarang).Ushbu o'xshashlik ajablanarli emas, chunki u atrof-muhitda DNKni bezatishda tanlanganlikning etishmasligi.Tozalangan RNK yordamida kelajakda o'qish RNN Viromini tavsiflash uchun zarurdir.
Bizning tadqiqotimizda biz Kovarski va uning hamkasblari [37] ishlariga moslashtirilgan juda qattiq quvur liniyasidan foydalandik, ular mahalliy ccfDNK yig'ilishidan oldin va keyin yig'ilgan o'qish va kontiglarni ikki bosqichli o'chirishdan foydalangan, natijada xaritalanmagan o'qishlarning yuqori ulushi paydo bo'ldi.Shuning uchun biz ushbu yozilmagan o'qiyotganlarning ba'zilari hali ham o'z kelib chiqishi, birinchi navbatda, biz bu myamel turlari uchun mos yozuvlar genomini yo'qligini istismiz.Shuningdek, biz ushbu quvurdan foydalanganmiz, chunki biz o'z-o'zini va o'z-o'zini o'qiyotgan va o'qilgan uzunliklar o'rtasidagi xiyeras va ildizming uzunligi o'rtasidagi chimeralar haqida tashvishlandik.Ko'pgina aniqlanmagan o'qishlarning yana bir sababi shundaki, dengiz mikroblarining ko'pchiligi, ayniqsa Kerguelen kabi chekka hududlarda izoh berilmagan.Biz Illumina Meising Pe 95-dan foydalandik, CCFDNa parchasini inson CCFDNaga o'xshaydi deb taxmin qildik.Bo'lajak tadqiqotlar uchun gemolimf Ccfdna odamlardan ko'ra ko'proq o'qiyotganligini ko'rsatmoqda, shunda odamlar va / yoki sutemizuvchilarga qaraganda o'qiladi, biz CCFDNA burilishlari uchun ko'proq mos keladigan ketma-ketlik platformasini tavsiya qilamiz.Ushbu amaliyot yanada chuqurroq tahlil qilish uchun ko'proq ko'rsatmalarni aniqlash juda osonlashadi.Hozirda mavjud bo'lmagan to'liq A. atra yadro genom ketma-ketligini olish, shuningdek, ccfDNKni o'z-o'zidan va o'z-o'zidan bo'lmagan manbalardan ajratishni sezilarli darajada osonlashtiradi.Tadqiqotlarimiz suyuq biopsiya kontseptsiyasini midiyalarga tatbiq etish imkoniyatlariga qaratilganligini inobatga olib, ushbu kontseptsiya kelajakdagi tadqiqotlarda qo'llanilganligi sababli midiyalarning mikrobial xilma-xilligini o'rganish uchun ushbu usulning imkoniyatlarini oshirish uchun yangi vositalar va quvurlar ishlab chiqilishiga umid qilamiz.dengiz ekotizimi.
Invaziv bo'lmagan klinik biomark sifatida, CCFDNA ning yuqori plazma darajasi turli kasalliklar, to'qima shikastlanishi va stress sharoitlari bilan bog'liq [67,68,69].Biroq, o'tkir issiqlik stressidan keyin CCFDNA darajasida hech qanday o'zgarish topmadik (S5 rasm, qo'shimcha ma'lumotlarga qarang).
Bugungi kunga qadar, suv ekotizimlarida biologik xilma-xillikni tahlil qilish asosan ekologik DNK (EDNA) metabartodga qaratilgan.Biroq, bu usul odatda, astar ishlatilganda biologik xilma-xillikni tahlil qilishda cheklangan.Shopgrun ketma-ket joylaridan foydalanish pcrity cheklovlarini va astar to'plamlarining tarafdorlari.Shunday qilib, qaysidir ma'noda bizning usulimiz yaqinda qo'llanilgan, parchalangan DNKni to'g'ridan-to'g'ri ketma-ketlashtirishga va deyarli barcha organizmlarni tahlil qilishga qodir bo'lgan yuqori samarali eDNK Shotgun sekvensiyasi usuliga yaqinroqdir [72, 73].Biroq, LBN ni EDNA usullaridan farqlaydigan bir qator fundamental muammolar mavjud.Albatta, Edna va LB o'rtasidagi asosiy farq tabiiy filtr xostlaridan foydalanishdir.Do'zaxlar va em-xashak kabi dengiz turlaridan foydalanish (libeina app.) Ma'ruza filtri sifatida ma'muriy filtr mavjud bo'lib, [74, 75].Biroq, Dreissena tadqiqotida DNK qazib olingan to'qima biopsuesidan foydalanilgan.LB dan ccfDNA tahlili to'qima biopsiyasi, maxsus va ba'zan qimmat uskunalar va eDNK yoki to'qimalar biopsiyasi bilan bog'liq logistika talab qilmaydi.Darhaqiqat, biz yaqinda LB dan olingan ccfDNKni sovuq zanjirni saqlamasdan FTA yordami bilan saqlanishi va tahlil qilinishi mumkinligini xabar qildik, bu uzoq hududlarda tadqiqot uchun katta muammo hisoblanadi [76].CCFDN ni suyuq biopseptsiyadan qazib olish ham sodda va ochkrun sonining yuqori sifatli DNKni taqdim etadi va PCR-sonli pccn tahlil qiladi.Bu Edna tahlili bilan bog'liq ba'zi texnik cheklovlar berilgan ba'zi texnik cheklovlar berilgan ba'zi texnik cheklovlar berilgan [77]Tanlov usulining soddaligi va arzonligi, shuningdek, uzoq muddatli monitoring dasturlari uchun mos keladi.Ularning yuqori filtrlash qobiliyatiga qo'shimcha ravishda, boshqa taniqli baytlarning o'ziga xos xususiyati ularning shilliqlarining kimyoviy tarkibini kimyoviy shilliqatchaning kimyoviy tarkibi hisoblanadi, bu esa viruslarning so'rilishini rag'batlantiradi [78, 79].Bu biologik o'zgarishlarni tavsiflovchi ideal filtrni va iqlim o'zgarishining ushbu suv ekotizimida tavsiflovchi ideal filtrni yaratadi.Garna bilan taqqoslaganda bunday mahalliy CCFDNega nisbatan xostlangan DNK parchalari Edna bilan taqqoslaganda, bu erda sog'liqni saqlash uchun mavjud bo'lgan ko'plab ma'lumotlar uchun juda ko'p tushunarli bo'ladi.Ofsetinchi xost.Bunga xost xostining genomiga qo'shilgan virusli ketma-ketlik mavjud.Bu, ayniqsa, midiya uchun juda muhim, chunki gorizontal ravishda uzatiladigan leykemiya retroviruslari ikki pallalilarda [80, 81].LB ning eDNKga nisbatan yana bir afzalligi shundaki, u mikroorganizmlarni (va ularning genomlarini) yutib yuboradigan gemolimfada aylanib yuruvchi qon hujayralarining fagotsitar faolligidan foydalanadi.Fagotsitoz - bu bid'atlardagi qon hujayralarining asosiy vazifasidir [82].Va nihoyat, usul midiyalarning yuqori filtrlash quvvati (dengiz suvi) va ikki kunlik tirajlilikdan foydalanib, u heterologik EDNAni qo'lga olishiga imkon beradigan ikki kunlik muomaladan foydalanadi.[83, 84].Shunday qilib, midiya ccfDNK tahlili midiyalarning ozuqaviy, iqtisodiy va atrof-muhitga ta'sirini hisobga olgan holda qiziqarli yo'ldir.Odamlardan to'plangan LB tahliliga o'xshash, bu usul, shuningdek, ekogen moddalarga javoban xandaq DNKda genetik va epigenetik o'zgarishlarni o'lchash imkoniyatini ochadi.Masalan, uchinchi avlodning ketma-ketligi texnologiyalari Nanopore-ketma-ketlikda nanopore-dagi genome-keng metilatsion tahlilni amalga oshirish uchun ko'zda tutilishi mumkin.Ushbu jarayonga kimyoviy transformatsiyalarga ehtiyoj sezmasdan, bir ketma-ketlik bilan ishlaydigan dna metilitatsiyalar bilan bog'liq bo'lgan uzoq vaqt davomida genom-kenglikdagi DNKYoratni keltirib chiqaradigan uzoq vaqt davomida mos keladigan bo'lishi mumkinligi aytilgan.Shuning uchun, bu iqlim o'zgarishi yoki ifloslantiruvchi moddalar ta'siridan so'ng, bu javobni tartibga soluvchi asosiy mexanizmlar to'g'risida qimmatli fikrlarni anglashi mumkin [87].Biroq, LB dan foydalanish cheklovlarsiz emas.Aytish kerakki, bu ekotizimda indikator turlarining mavjudligini talab qiladi.Yuqorida aytib o'tilganidek, LB-dan foydalanib, ushbu ekotizimning biologik xilma-xilligini baholash, shuningdek, manbaning manbasidan foydalanadigan DNK parchalarini hisobga oladigan qattiq bioinformatika quvurini talab qiladi.Yana bir yirik muammo - bu dengiz turlari uchun mos keladigan ko'rsatkichlarning mavjudligi.Marine sutemizuvchi genomlari loyihasi va yaqinda tashkil etilgan baliq 10k loyihasi kabi tashabbuslar kelajakda bunday tahlil qilishga yordam beradi.LB kontseptsiyasini dengiz filtrini boqish organizmlari uchun qo'llash, shuningdek, ko'p yillik biooomarklarning rivojlanishi uchun ekologik stressga javoban dengiz yashash joylari salomatligi to'g'risida muhim ma'lumotlarni taqdim etish uchun juda mos keladigan so'nggi yutuqlarga mos keladi.
NCBI ketma-ketligi arxivida NCTPS://www.ncbiih.gov/sara/srr8924808 bioprojekti ostida saqlanmoqda.
Breverli, Kingsford Mj Marine hayoti va ekotizimlariga iqlim o'zgarishining ta'siri.
2021; 755: 142564.
Carella f, antuofermo E, fareyf, namlik f, manmas d, prado p, va boshqalar.).2020; 7: 48.
Ilmiy hisobot 2019;9: 17498.
Fey SB, Siepielski AM, Nussle S, Servantes-Yoshida K, Xvan JL, Huber ER va boshqalar.Chastotalar, hayvonlar o'limi chastotasi, sabablari va darajasi."NATL akad" SCI AQSh.
Scanpa f, Sanna D, Azzena I, mugetti D, CRERUTI F, HOSSENIY S va boshqalar.Bir nechta turdagi turlarga xos bo'lmagan patogenlar PINNA DVILSning ommaviy o'limiga olib kelishi mumkin.
Arktik zoonotik kasalliklarga iqlim o'zgarishining mumkin bo'lgan ta'siri.2005 yil;64: 468-77.
Beyer j., Green Nw, Bruks S., Allan IJ, RUuus A., Gomez t. va boshqalar.Ko'k massivlar (MyTilus Edulis SPP) Sohil ifloslanishini nazorat qilish monitoringi: sharh.Marka atrof-muhit;130: 338-65.
Siravgna g Marsoni S, Siena S, Bardelli A. Saraton kasalligini davolashda suyuq biopsiyani birlashtirish.Nat Ras Conkol.2017 yil;14: 531-48.
Wan jcm, massari c, Garsiya-Corbacho J, Mouliere F, Brenton Jud, Caldas C, va boshqalar.Suyuq biopsiya kifoyalari: o'sma DNKni aylantirishga imkon beradi.
Mandel P., Metais P. Psetleik kislotalar inson plazmaidagi nuklein kislotalari.COLE Biol shoulari.1948 yil;
Bronxorst AJ, Uzarbayder V, Holdeneder S. Saraton kasalligini davolash uchun molekulyar marker sifatida hujayrali DNK uchun yangi rol o'ynaydi.2019; 17: 100087.
Ignatiadiadis M., SHFORD GW, Jeffri Speed ​​Biopsiya klinika - ijro etish masalalari va kelajakdagi muammolarga kiradi.NAT A Oncol.18: 297-312.
Lo, corborta n., Chamerlen PF, Rai W., Sargent Il, Redman CW va boshqalar.Xomilalik DNK onaning plazmasi va zardobida mavjud.Lanset.1997 yil;350: 485-7.

Ollerich M, Sherwood K, Keown P, Schütz E, Beck J, Stegbauer J va boshqalar.Suyuq biopsiya: donor hujayrasiz DNK buyrak greftidagi allogen lezyonlarni aniqlash uchun ishlatiladi.Nat R re nefrol.2021 yil17: 591-603.
Xuan FC, Lo YM Prenatal diagnostikadagi innovatsiyalar: ona plazmasi genomini ketma-ketlashtirish.
Gu, deng x, le m, ARU YD, AREALO S, Stribe D va boshqalar.Infektsiyalangan tana suyuqliklarining keyingi avlod metagenomik ketma-ketligi bilan patogenni tezda aniqlash.2021; 27: 115-24.